JP5633075B2 - 多能性幹細胞作成用ベクター材料及びこれを用いた多能性幹細胞作成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、多能性幹細胞作成用ベクター材料及びこれを用いた多能性幹細胞作成方法に関する。
高齢化社会の急速な展開に伴い、組織変性や障害を原因とする疾患が急激に増加している。該疾患として、例えば、メタボリック症候群に起因して加齢と共に発症頻度が高くなる脳梗塞・心筋梗塞・腎不全や、加齢に伴う組織の変性に起因するアルツハイマー病・パーキンソン病・骨粗鬆症などが挙げられる。また、Ｉ型糖尿病・多発性硬化症・慢性関節リューマチや、外傷による熱傷や脊椎損傷、さらには先天的な遺伝情報の異常が原因である遺伝子病も、組織の変性や障害によって引き起こされる疾患である。これらの疾患を治療するための手段として、現在、さまざまな再生医療が開発されている。
再生医療は、患者の組織に存在する組織幹細胞をさまざまな方法で賦活化する再生誘導の方法と、幹細胞や幹細胞から誘導した体細胞や組織を移植する細胞補充療法に大別される。しかし、多くの場合、組織幹細胞の再生能力には限界があり、再生医療の実用化には細胞補充療法の開発が不可欠である。また遺伝子病の場合は体外で遺伝子の修復や補充を行った細胞を使って細胞補充療法を実施することが考えられる。
再生医療は、患者の組織に存在する組織幹細胞をさまざまな方法で賦活化する再生誘導の方法と、幹細胞や幹細胞から誘導した体細胞や組織を移植する細胞補充療法に大別される。しかし、多くの場合、組織幹細胞の再生能力には限界があり、再生医療の実用化には細胞補充療法の開発が不可欠である。また遺伝子病の場合は体外で遺伝子の修復や補充を行った細胞を使って細胞補充療法を実施することが考えられる。
組織の変性や障害によって引き起こされる疾患を細胞補充療法で治療するためには、大量の幹細胞あるいは幹細胞から誘導される体細胞を必要とする。そのため、長期にわたり自己複製可能で、かつさまざまな組織に分化可能な多能性幹細胞が、細胞補充療法の開発には不可欠である。この条件を満たす細胞として、初期胚に由来する胚性幹細胞（ES細胞）や始原生殖細胞に由来するEG細胞などの多能性幹細胞が報告されている。しかし、患者と同一のゲノム情報を持たない細胞に対しては移植拒絶が起こるので、そのままでは細胞補充療法に使うことができない。
このため、細胞補充療法を安全かつ効率的に実施するためには、移植時の免疫拒絶を回避することができる患者と同一のゲノム情報を持つ多能性幹細胞が必要となる。該多能性幹細胞は、患者の組織細胞から、何らかの方法でその性質を変化させて作成することが考えられる。この組織細胞は手術等の人体に強い侵襲を与える方法を使わずに採取できることが望ましく、また一度に採取可能な最小数の組織細胞を使って速やかに該多能性幹細胞を作成できることが望まれる。強い侵襲を与えずに採取でき、かつ患者と同一の遺伝情報を保持している細胞材料としては、皮膚線維芽細胞・口腔粘膜細胞・毛根上皮細胞が考えられる。生体に強い侵襲を与えずに採取できるこれらの細胞の数は104個程度であることから、該多能性幹細胞は104個の正常組織細胞から樹立できることが望ましい。
また、ヒトES細胞の研究から、多能性幹細胞を長期にわたって培養を続けると染色体の欠失・増幅・転座等の異常が高頻度で観察されることが知られている。もし、樹立した多能性幹細胞の性質が不揃いであれば、必要とされる機能を持った多能性幹細胞を多数の細胞株から選び出す時間が必要となり、その過程で染色体異常が生じる可能性が大幅に上昇する。そのため、該多能性幹細胞を作製する方法としては、性質の均一な多能性幹細胞を常に再現性良く作製できることが求められる。多能性幹細胞の性質の均一性を示す指標としては、例えば細胞株間の遺伝子発現の相関係数が1に近く、望ましくは0.98以上であることが挙げられる。
また、患者の組織細胞から樹立した新規細胞株が多能性幹細胞であるかどうかは、さまざまな組織に分化する能力（多分化能）に基づいて検証する必要がある。多能性の証明法としては、in vitroでの分化法や免疫不全動物への移植による分化法が知られている。しかし、これらはいずれも悪性腫瘍であるテラトカルシノーマ（teratocarcinoma、悪性奇形腫）細胞でも観察される現象であり、樹立した細胞が再生医療の素材として使用可能な安全性の高い多能性幹細胞である証拠として必要であるが、それだけでは不十分である（非特許文献１８）。
マウス等の実験動物では、安全性が高く悪性腫瘍になりにくい多能性幹細胞と、分化能を持つが悪性腫瘍であるテラトカルシノーマを区別する方法として、該多能性幹細胞由来の組織を持つキメラ動物がその子孫に該多能性幹細胞由来の遺伝情報を伝える生殖細胞伝播（germ-line transmission）を検討する方法が知られている。この方法を使うと、安全性が高く悪性腫瘍になりにくい多能性幹細胞では生殖細胞伝播が観察できるが、悪性腫瘍となるテラトカルシノーマでは観察されない。しかしヒトでこの証明を実施することは不可能であり、ヒトで安全性の高い多能性幹細胞を樹立する方法としては、該方法を使って実験動物から多能性幹細胞を樹立し、この細胞を使って生殖細胞伝播を証明することが求められる。
そのため、多能性幹細胞を樹立する方法は、ヒトだけでは無く、ヒト以外の動物（望ましくは生殖工学の手法が確立しているマウス）の組織細胞からも多能性幹細胞を樹立できる方法であって、その動物を使って生殖細胞伝播の証明ができることが求められる。
マウス等の実験動物では、安全性が高く悪性腫瘍になりにくい多能性幹細胞と、分化能を持つが悪性腫瘍であるテラトカルシノーマを区別する方法として、該多能性幹細胞由来の組織を持つキメラ動物がその子孫に該多能性幹細胞由来の遺伝情報を伝える生殖細胞伝播（germ-line transmission）を検討する方法が知られている。この方法を使うと、安全性が高く悪性腫瘍になりにくい多能性幹細胞では生殖細胞伝播が観察できるが、悪性腫瘍となるテラトカルシノーマでは観察されない。しかしヒトでこの証明を実施することは不可能であり、ヒトで安全性の高い多能性幹細胞を樹立する方法としては、該方法を使って実験動物から多能性幹細胞を樹立し、この細胞を使って生殖細胞伝播を証明することが求められる。
そのため、多能性幹細胞を樹立する方法は、ヒトだけでは無く、ヒト以外の動物（望ましくは生殖工学の手法が確立しているマウス）の組織細胞からも多能性幹細胞を樹立できる方法であって、その動物を使って生殖細胞伝播の証明ができることが求められる。
以上のことから、再生医療等に応用可能なヒト多能性幹細胞を作製する方法としては、１）樹立したヒト多能性幹細胞が患者と同一のゲノム情報を保持していること、２）104個以下の細胞からヒト多能性幹細胞を樹立できること、３）樹立したヒト多能性幹細胞の性質が十分に均一であること、４）ヒト以外の動物に適用して樹立した多能性幹細胞に由来するキメラ動物で生殖細胞伝播が確認できること、が要求される。
患者と同一のゲノムを持つ多能性幹細胞を作成する手法として、レトロウイルスベクターを使ってヒト正常組織細胞に遺伝子を導入し、これら遺伝子を強制発現することでヒトES細胞に極めて類似したヒト人工多能性幹細胞（ヒトiPS細胞）を作成する技術が知られている。例えば、皮膚由来ヒト正常線維芽細胞にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの４遺伝子をレトロウイルスベクターやレンチウイルスで導入して発現させヒトiPS細胞を作成する方法（非特許文献１参照）や、皮膚由来ヒト正常線維芽細胞にOct3/4、Sox2、Nanog、LIN28の４遺伝子をレンチウイルスベクターで導入して発現させヒトiPS細胞を作成する方法（非特許文献２参照）が報告されている。
また、これらの４遺伝子の１つあるいは２つを低分子化合物で置き換える方法でもヒトiPS細胞を作成することができる。例えば、皮膚由来ヒト正常線維芽細胞にOct3/4、Sox2の2遺伝子をレトロウイルスベクター導入して発現させると同時にヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理してヒトiPS細胞を作成する方法（非特許文献３参照）が報告されている。
しかし、これらの方法ではいずれの場合も、組織細胞に導入された遺伝子は誘導されたiPS細胞の染色体の不特定位置に挿入されて残っており、該iPS細胞のゲノム情報は元の組織細胞のゲノム情報と完全に同一では無い。つまり、これらの手法で作成されたiPS細胞は細胞補充療法で必要とされる「患者と同一のゲノム情報を持つ多能性幹細胞」の条件を満たしていない。
しかし、これらの方法ではいずれの場合も、組織細胞に導入された遺伝子は誘導されたiPS細胞の染色体の不特定位置に挿入されて残っており、該iPS細胞のゲノム情報は元の組織細胞のゲノム情報と完全に同一では無い。つまり、これらの手法で作成されたiPS細胞は細胞補充療法で必要とされる「患者と同一のゲノム情報を持つ多能性幹細胞」の条件を満たしていない。
また、この遺伝子挿入現象は、細胞補充療法の安全性確保において以下の問題点を惹起する。すなわち、外部から導入された遺伝子が染色体の不特定位置に挿入されると、挿入部位近傍の遺伝子を異常に活性化して細胞のガン化等の副作用を引き起こす可能性がある。例えば、長期にわたり自己複製能を維持しているヒト骨髄幹細胞の染色体の不特定位置にレトロウイルスベクターを使って遺伝子を挿入すると、挿入された外来遺伝子の影響により正常細胞では転写が抑制されている発ガン遺伝子が異常に活性化されて、高頻度に細胞のガン化が起こることが知られている（非特許文献４参照）。
さらに、この遺伝子挿入現象は、細胞補充療法の安全性確保において以下の問題点を惹起する。すなわち、染色体に外来遺伝子を挿入して作製したiPS細胞では、未分化状態が維持されている間は該外来遺伝子の発現は抑制されているが、組織細胞に分化した場合にその発現が誘導されて該細胞がガン化する可能性がある。例えば、皮膚由来正常線維芽細胞にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの4遺伝子をレトロウイルスベクターで導入して作成したマウスiPS細胞由来のマウス個体は、外部から導入したc-Myc遺伝子の再活性化により高頻度でガンを発症することが知られている（非特許文献５参照）。また、c-Myc以外にもKlf4やOct3/4遺伝子の発現も同様に細胞のガン化につながる可能性が指摘されている（非特許文献６）。
このような染色体への遺伝子挿入に起因する諸問題を解決するために、外来遺伝子を一過性に発現するプラスミドDNAを細胞に導入して、体細胞からiPS細胞を作成する方法が報告されている。例えば、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの４遺伝子を搭載したプラスミドDNAをマウス皮膚由来正常線維芽細胞にリポフェクション法で導入すると、染色体に外来遺伝子が挿入されていないマウスiPS細胞が作成できることが報告されている（非特許文献７参照）。しかしながら、この方法で作成したマウスiPS細胞の75%には導入した遺伝子の染色体への挿入があることから、この方法は、作成したiPS細胞に外来遺伝子の挿入が起こらないことを必ずしも担保するものではない。また、この方法を使って染色体に外来遺伝子を挿入することなくヒトiPS細胞を作成できたという報告は無い。
また、染色体への遺伝子挿入に起因する諸問題を解決するために、染色体に挿入することなく外来遺伝子を一過性に発現できるアデノウイルスベクターを使って、体細胞からiPS細胞を作成する方法が報告されている。例えば、アデノウイルスベクターにOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの４遺伝子を別々に搭載し、マウス肝臓由来正常肝細胞に同時に導入するとマウスiPS細胞が作成できることが報告されている（非特許文献８参照）。しかしながら、アデノウイルスベクターを使用した遺伝子導入では、有意な頻度で導入した遺伝子が染色体の不特定部位に挿入されることが報告されている（非特許文献９参照）ため、この方法も、作成したiPS細胞に外来遺伝子の挿入が起こらないことを完全に担保するものではない。また、この方法を使って染色体に外来遺伝子を挿入することなくマウス由来正常線維芽細胞やヒト由来細胞からiPS細胞を作成できたという報告は無い。
さらに、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの４遺伝子を染色体にランダムに挿入してiPS細胞を作製後、挿入した遺伝子を除去できることが報告されている（非特許文献１０参照）。iPS細胞の作製に使用したOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの４遺伝子を外部からCre recombinaseを導入することにより染色体から除去する場合（非特許文献１１参照）は、これらの遺伝子を発現させるために必要なプロモーター領域は染色体上に残るため、作製されたiPS細胞のゲノム情報は正常細胞のゲノム情報と完全に同一では無く、さらには挿入変異が生じる可能性は否定できない。また、該遺伝子をトランスポゾン（transposon）に載せて染色体に挿入する方法でマウスiPS細胞を作製した場合は、トランスポザーゼ（transposase）という酵素を発現させてトランスポゾンを完全に除去できることが報告されている（非特許文献１２参照）。しかし、除去できる確率は作製された全iPS細胞の0.001%程度と効率が悪く、ヒト細胞での実施例は示されていない。なお、Woltjenらの報告によれば、トランスポゾン除去後に４塩基の人工的な挿入が残る例も存在し、この場合は挿入変異が残る可能性を否定できない。さらに、トランスポゾンの除去に使うトランスポザーゼは、染色体からのトランスポゾンの切り出し（除去）活性と染色体への挿入活性を併せ持つ酵素であり、理論的には挿入部位からいったん切り出されたトランスポゾンが染色体上の別の部位へ再挿入されることが予想されるため、再挿入が起きていないことを作製したすべてのiPS細胞において確認する必要がある。
また、Yuらは、Epstein-Barrウイルス（EBV）の複製起点とEBNA1遺伝子を持ち染色体外で複製可能な環状DNAベクター（EBVベクター）を使って、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、LIN28、SV40・T抗原の７つの遺伝子をヒト正常線維芽細胞で同時に発現させた後、ベクターの自然脱落を利用して外来遺伝子を全く含まないヒトiPS細胞を作成できたことを報告している（非特許文献１３参照）。これは現在のところ唯一の体細胞と同一の遺伝情報を持った多能性幹細胞作成の報告であるが、効率は0.0003から0.0006%程度であり、iPS細胞を樹立するためには少なくとも3x105個の細胞を必要とする。また、EBVのゲノムDNAは染色体外で複製するだけでなく、高頻度で染色体に挿入されることが知られており（非特許文献１４参照）、この方法も、作成したiPS細胞に外来遺伝子の挿入が起こらないことを完全に担保するものでは無く、作成したヒトiPS細胞に外来遺伝子が含まれていないことをすべての細胞について確認する必要がある。
この他に、成体組織細胞と同一のゲノム情報を持つ多能性幹細胞を作成する方法としては、組織細胞の核を脱核した未受精卵に移植する方法（非特許文献１５参照）と、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの４つのタンパク質に細胞膜を通過するペプチドを付与して細胞外から導入する方向（非特許文献１６参照）が報告されている。しかし、これらの方法でヒト多能性幹細胞が作成できたという報告は無い。
また最近、房木らは、外来遺伝子を染色体に挿入することなく発現できるセンダイウイルスをベクターとして使ってOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc遺伝子をヒト皮膚由来線維芽細胞で発現し、多能性幹細胞を作製する方法を報告している（非特許文献１６，特許文献１参照）。この方法では、４つの初期化遺伝子を別々のベクターに搭載して混合感染し、最高1%の効率で多能性幹細胞が樹立できたとされている。しかしながら、樹立された細胞の均質性についての言及は無く、半定性的なRT-PCR（逆転写-polymerase chain reaction）法で示されている遺伝子発現の解析結果から樹立された細胞の性質が不揃いであることは明らかである。さらに実施例はヒト細胞のみであり、この手法が他の動物種でも有効であること、及びヒト以外の動物に適用して樹立した多能性幹細胞に由来するキメラ動物で生殖細胞伝播が確認できることは証明されていない。
また最近、房木らは、外来遺伝子を染色体に挿入することなく発現できるセンダイウイルスをベクターとして使ってOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc遺伝子をヒト皮膚由来線維芽細胞で発現し、多能性幹細胞を作製する方法を報告している（非特許文献１６，特許文献１参照）。この方法では、４つの初期化遺伝子を別々のベクターに搭載して混合感染し、最高1%の効率で多能性幹細胞が樹立できたとされている。しかしながら、樹立された細胞の均質性についての言及は無く、半定性的なRT-PCR（逆転写-polymerase chain reaction）法で示されている遺伝子発現の解析結果から樹立された細胞の性質が不揃いであることは明らかである。さらに実施例はヒト細胞のみであり、この手法が他の動物種でも有効であること、及びヒト以外の動物に適用して樹立した多能性幹細胞に由来するキメラ動物で生殖細胞伝播が確認できることは証明されていない。
従って、再生医療等に要求されるヒト多能性幹細胞の樹立法であって、１）樹立したヒト多能性幹細胞が患者と同一のゲノム情報を保持していること、２）104個以下の細胞からヒト多能性幹細胞を樹立できること、３）樹立したヒト多能性幹細胞の性質が十分に均一であること（具体的には遺伝子発現の相関係数が0.98以上であること）、４）ヒト以外の動物に適用して樹立した多能性幹細胞に由来するキメラ動物で生殖細胞伝播が確認できること、の４つの条件をすべて備えた方法は報告されていない。
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中西真人、再生医療、印刷中、2010
従って、本発明が解決しようとする課題は、移植細胞の免疫拒絶や染色体への外来遺伝子の挿入による腫瘍化の可能性を回避するために、患者のゲノム情報と同一のゲノム情報を持ち、かつES細胞と近似した性質を有する、誘導多能性幹細胞（以下、iPS細胞という場合がある。）を、0.01%以上の効率で、ヒト正常組織細胞から樹立することである。
該課題は、組換え・挿入・修復等の相互作用によりヒトゲノムを改変する活性を持たない遺伝子発現系を用いることで、解決できる。本発明者らは、初期化遺伝子である、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの各ヒト遺伝子産物をコードする遺伝子を持続発現型センダイウイルスベクター（特許第4478788号、及びPCT/JP2008/057212）に搭載して、動物分化細胞に導入することにより、極めて効率的に上記分化細胞の初期化が行えることを見いだした。上記初期化遺伝子搭載ベクターは、外来遺伝子を染色体に組み込むことなく、しかも、該ベクターは初期化後siRNAにより容易かつ速やかに除去でき、安全性の高い、分化細胞の提供個体と同一のゲノム情報を持つ誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を樹立できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の少なくとも一つが欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とをゲノムとして有することを特徴とする初期化遺伝子搭載センダイウイルス。
（２）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の全てが欠損していることを特徴とする、上記（1）に記載のセンダイウイルス。
（３）ウイルス粒子であることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のセンダイウイルス。
（４）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子の各機能の欠損が、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子に対する初期化遺伝子および／またはマーカー遺伝子の挿入あるいは置換によるものであることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のセンダイウイルス。
（５）初期化遺伝子がOct3/4、Sox2及びKlf4あるいはOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの各組み合わせからなることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のセンダイウイルス。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のセンダイウイルスからなる、誘導多能性細胞作成用初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のセンダイウイルスからなり、誘導多能性幹細胞の作製において使用する分化細胞の発現マイクロRNAに対する標的配列をゲノム上に持つ、誘導多能性細胞作成用初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター。
（８）ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子のからなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の少なくとも一つが欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が、Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とがクローニングベクターに挿入されていることを特徴とする、初期化遺伝子搭載センダイウイルス作成用鋳型ベクター。
（９）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の全てが欠損していることを特徴とする、上記（８）に記載の鋳型ベクター。
（１０）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子の各機能の欠損が、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子に対する初期化遺伝子および／またはマーカー遺伝子の挿入あるいは置換によるものであることを特徴とする、上記（８）または（９）に記載の鋳型ベクター。
（１１）クローニングベクターがファージベクターであることを特徴とする、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の鋳型ベクター。
（１２）ファージベクターがλファージベクターであることを特徴とする、上記（１１）に記載の鋳型ベクター。
（１３）初期化遺伝子がOct3/4、Sox2及びKlf4あるいはOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの各組み合わせからなることを特徴とする、上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の鋳型ベクター。
（１４）ＤＮＡからなることを特徴とする、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の鋳型ベクター。
（１５）上記（１４）に記載の鋳型ベクターであって、誘導多能性幹細胞の作製において使用する分化細胞の発現マイクロRNAに対する標的配列に相補的な配列を有する鋳型ベクター。
（１６）上記（８）〜（１５）に記載の鋳型ベクターが導入されていることを特徴とする細胞。
（１７）さらに、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子のうち機能を欠損させた遺伝子が少なくとも導入されているか、あるいはさらにＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子が導入されていることを特徴とする、上記（１６）に記載の細胞。
（１８）T7 RNA polymeraseが発現していることを特徴とする、上記（１７）に記載の細胞。
（１９）上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することにより、ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の少なくとも一つが欠損し、かつ、L遺伝子が Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とをゲノムとして有するセンダイウイルス粒子を採取することを特徴とする、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの製造方法。
（２０）上記（６）に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、次いで該ベクターに対するsiRNAを作用させて、該細胞から初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
（２１）上記siRNAが、センダイウイルスのＬタンパク質を標的とすることを特徴とする、上記（２０）に記載の製造方法。
（２２）センダイウイルスのＬタンパク質を標的とするsiRNA。
（２３）上記（２２）に記載のsiRNAからなる、分化細胞初期化後の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの除去用試薬
（２４）上記（７）に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターをを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、誘導多能性幹細胞を形成後、がい初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを自動的に除去する誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記分化細胞がマイクロRNA発現細胞であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
（２５）上記（６）または（７）に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、次いで高温条件で培養して、該細胞からの初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター除去を促進することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
（１）ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の少なくとも一つが欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とをゲノムとして有することを特徴とする初期化遺伝子搭載センダイウイルス。
（２）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の全てが欠損していることを特徴とする、上記（1）に記載のセンダイウイルス。
（３）ウイルス粒子であることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のセンダイウイルス。
（４）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子の各機能の欠損が、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子に対する初期化遺伝子および／またはマーカー遺伝子の挿入あるいは置換によるものであることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のセンダイウイルス。
（５）初期化遺伝子がOct3/4、Sox2及びKlf4あるいはOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの各組み合わせからなることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のセンダイウイルス。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のセンダイウイルスからなる、誘導多能性細胞作成用初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のセンダイウイルスからなり、誘導多能性幹細胞の作製において使用する分化細胞の発現マイクロRNAに対する標的配列をゲノム上に持つ、誘導多能性細胞作成用初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター。
（８）ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子のからなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の少なくとも一つが欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が、Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とがクローニングベクターに挿入されていることを特徴とする、初期化遺伝子搭載センダイウイルス作成用鋳型ベクター。
（９）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の全てが欠損していることを特徴とする、上記（８）に記載の鋳型ベクター。
（１０）Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子の各機能の欠損が、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子に対する初期化遺伝子および／またはマーカー遺伝子の挿入あるいは置換によるものであることを特徴とする、上記（８）または（９）に記載の鋳型ベクター。
（１１）クローニングベクターがファージベクターであることを特徴とする、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の鋳型ベクター。
（１２）ファージベクターがλファージベクターであることを特徴とする、上記（１１）に記載の鋳型ベクター。
（１３）初期化遺伝子がOct3/4、Sox2及びKlf4あるいはOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの各組み合わせからなることを特徴とする、上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の鋳型ベクター。
（１４）ＤＮＡからなることを特徴とする、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の鋳型ベクター。
（１５）上記（１４）に記載の鋳型ベクターであって、誘導多能性幹細胞の作製において使用する分化細胞の発現マイクロRNAに対する標的配列に相補的な配列を有する鋳型ベクター。
（１６）上記（８）〜（１５）に記載の鋳型ベクターが導入されていることを特徴とする細胞。
（１７）さらに、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子のうち機能を欠損させた遺伝子が少なくとも導入されているか、あるいはさらにＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子が導入されていることを特徴とする、上記（１６）に記載の細胞。
（１８）T7 RNA polymeraseが発現していることを特徴とする、上記（１７）に記載の細胞。
（１９）上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することにより、ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の少なくとも一つが欠損し、かつ、L遺伝子が Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子とをゲノムとして有するセンダイウイルス粒子を採取することを特徴とする、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの製造方法。
（２０）上記（６）に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、次いで該ベクターに対するsiRNAを作用させて、該細胞から初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
（２１）上記siRNAが、センダイウイルスのＬタンパク質を標的とすることを特徴とする、上記（２０）に記載の製造方法。
（２２）センダイウイルスのＬタンパク質を標的とするsiRNA。
（２３）上記（２２）に記載のsiRNAからなる、分化細胞初期化後の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの除去用試薬
（２４）上記（７）に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターをを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、誘導多能性幹細胞を形成後、がい初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを自動的に除去する誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記分化細胞がマイクロRNA発現細胞であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
（２５）上記（６）または（７）に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、次いで高温条件で培養して、該細胞からの初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター除去を促進することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
本発明のセンダイウイルスベクターは、複数の初期化遺伝子を一つのベクターに搭載して同一細胞で一度に発現できるため、分化細胞を初期化するための操作が極めて簡便、かつ効率的であり、また、本発明の初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターは、細胞質に持続安定的に保持されて初期化遺伝子を発現するため、染色体に外来遺伝子を挿入する恐れがなく、このため細胞をガン化することなく極めて安全である。さらに、本発明のベクターを使用すれば、患者のゲノム情報と同一のゲノム情報を持ちかつES細胞と近似した多能性を有する誘導多能性幹細胞（以下、iPS細胞という場合がある。）を、104個以下のヒト正常組織細胞からでも、多能性幹細胞の樹立効率が少なくとも0，01％以上、1%超で樹立可能であり、しかも、樹立した多能性幹細胞の性質が遺伝子発現の相関係数で0.98以上と極めて均質であり、誘導多能性幹細胞の長期培養による悪性腫瘍化を回避できる。さらに、本発明のセンダイウイルスベクターを用いて得られた多能性幹細胞については、マウス等の実験動物で生殖細胞伝播も確認されており、安全性が高く悪性腫瘍になりにくいものといえ、これらの点からヒトに対しても適用が大いに期待できる。
また、初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターは、細胞質において持続的に初期化遺伝子を発現して組織細胞を多能性幹細胞に変化させた後、siRNAを使用することにより極めて容易に細胞から除去することができる。その結果、安全性がさらに高まるとともに、分化細胞提供個体と全く同一のゲノム情報を有するiPS細胞が得られる。さらに、多能性幹細胞で発現しているマイクロＲＮＡの標的配列を組み込んだセンダイウイルスベクターを使うことで、細胞初期化後のベクター除去を自動化することもできる。また、高温条件で培養してベクターの除去を促進することもできる。
また、センダイウイルスの幅広い種特異性・細胞特異性を活かして、ヒト以外の動物由来の細胞や、線維芽細胞以外のヒト組織細胞（特に血液細胞）から多能性幹細胞を樹立することができる。その結果、ヒト以外の動物を使って多能性幹細胞の機能を検証することが可能である。
したがって、本願発明によれば、従来、iPS細胞作成に用いられているアデノウイルスベクター・EBVベクターその他のDNAベクターや従来型センダイウイルスベクターを使用する場合に比べ、iPS細胞の作成を極めて効率的かつ簡便に再現性良く行うことができると共に、作成したiPS細胞の安全性が格段に向上する。これにより、再生医療（特に細胞補充療法や遺伝子治療）、さまざまな遺伝的背景を持った患者由来のiPS細胞を使った創薬研究、ヒト細胞を使ったバイオ医薬品製造、ガンや難治疾患の原因の解明や治療法の開発など、幅広い技術分野の発展に大いに貢献するものである。
したがって、本願発明によれば、従来、iPS細胞作成に用いられているアデノウイルスベクター・EBVベクターその他のDNAベクターや従来型センダイウイルスベクターを使用する場合に比べ、iPS細胞の作成を極めて効率的かつ簡便に再現性良く行うことができると共に、作成したiPS細胞の安全性が格段に向上する。これにより、再生医療（特に細胞補充療法や遺伝子治療）、さまざまな遺伝的背景を持った患者由来のiPS細胞を使った創薬研究、ヒト細胞を使ったバイオ医薬品製造、ガンや難治疾患の原因の解明や治療法の開発など、幅広い技術分野の発展に大いに貢献するものである。
本発明における、誘導多能性幹細胞を製造するために使用する初期化遺伝子を搭載するベクターは、センダイウイルス由来のＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子およびＬ遺伝子を有し、同ウイルスのＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子機能の少なくとも一つ欠損させたセンダイウイルス粒子（以下、センダイウイルスベクターという。）である。
なお、本願明細書において、遺伝子あるいは遺伝子材料というとき、マイナス鎖RNAまたはcDNA、及びこれと相補のプラス鎖RNAまたはcDNAを含む。すなわち転写あるいは逆転写により、上記いずれかの遺伝子あるいは遺伝子材料を合成しうるものは本発明に含まれる。
なお、本願明細書において、遺伝子あるいは遺伝子材料というとき、マイナス鎖RNAまたはcDNA、及びこれと相補のプラス鎖RNAまたはcDNAを含む。すなわち転写あるいは逆転写により、上記いずれかの遺伝子あるいは遺伝子材料を合成しうるものは本発明に含まれる。
また、本明細書において誘導多能性幹細胞(iPS細胞)というとき、胚性幹細胞（ES細胞）と類似した形態と胚性幹細胞特異的なマーカーを発現していて、試験管内での自己複製能を有する細胞を意味する。該細胞は、動物生体内あるいは試験管内での三胚葉への分化能を有することが知られている。また、マーカーとしてはNanog・Oct4・アルカリフォスファターゼ・SSEA-1・SSEA-4等が知られている。
〔センダイウイルスベクターの構成材料〕
センダイウイルスベクターは、センダイウイルスのゲノムに任意の遺伝子を挿入するか、センダイウイルスの遺伝子を任意の遺伝子と置き換えることによって、該遺伝子を発現させることができる遺伝子導入・発現ベクターである。センダイウイルスはＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｆ、Ｍ、ＨＮ及びＬの各遺伝子を有し、同ウイルスのＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ遺伝子はセンダイウイルスの転写、複製に関与する遺伝子であり、一方、Ｆ、Ｍ、ＮＨ遺伝子は、ウイルス粒子形成に関与する遺伝子である。したがって、Ｆ、Ｍ、ＮＨ遺伝子の機能を欠損させたセンダイウイルスベクターは、細胞に感染した後に単独では新規のウイルス粒子を形成できず、非伝播性となる。
センダイウイルスベクターは、センダイウイルスのゲノムに任意の遺伝子を挿入するか、センダイウイルスの遺伝子を任意の遺伝子と置き換えることによって、該遺伝子を発現させることができる遺伝子導入・発現ベクターである。センダイウイルスはＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｆ、Ｍ、ＨＮ及びＬの各遺伝子を有し、同ウイルスのＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ遺伝子はセンダイウイルスの転写、複製に関与する遺伝子であり、一方、Ｆ、Ｍ、ＮＨ遺伝子は、ウイルス粒子形成に関与する遺伝子である。したがって、Ｆ、Ｍ、ＮＨ遺伝子の機能を欠損させたセンダイウイルスベクターは、細胞に感染した後に単独では新規のウイルス粒子を形成できず、非伝播性となる。
本発明のベクターを構成するＬ遺伝子としては、Ｌ遺伝子がコードするＬタンパク質の１６１８番目がバリンである遺伝子が用いられる。この変異は、センダイウイルスＣｌ．１５１株由来のＬタンパク質のアミノ酸配列から見いだされたものである。センダイウイルスＣｌ．１５１株は温度感受性の増殖をすることが知られており、３８℃でウイルス粒子をほとんど産生せず、３２℃では複製サイクルが働き、ウイルス粒子を産生する。このようなセンダイウイルスＣｌ．１５１株は、吉田哲也博士らによって１９７９年に報告されているものである（Yoshida, et al. (1979) Virology, 92, 139-154）。
上記Lタンパク質の１６１８番目がバリンである遺伝子を有するセンダイウイルスＣｌ．１５１株は、インターフェロン誘導能が低下するため、細胞傷害性がなく、持続感染能を有し、外来遺伝子を担持させれば、細胞内で長期間該遺伝子の発現が維持される。このＬ遺伝子としては、例えば非持続感染株であるセンダイウイルス名古屋株のＬタンパク質の１６１８番目のロイシンをバリンになるように変異させた変異Ｌ遺伝子を用いてもよい。以下、Ｌタンパク質の１６１８番目がバリンであるＬタンパク質を変異Ｌタンパク質、変異Ｌタンパク質をコードする遺伝子を変異Ｌ遺伝子という場合がある。
したがって、本発明のセンダイウイルスベクターの構成遺伝子であるＮＰ、Ｃ／ＰおよびＬ遺伝子は、Ｌ遺伝子が上記変異を有する限り、センダイウイルスＣｌ．１５１株の塩基配列に限らず、例えば、センダイウイルス名古屋株あるいはZ株等の細胞傷害性を有し持続感染能を有しない株の塩基配列を有していてもよい。
したがって、本発明のセンダイウイルスベクターの構成遺伝子であるＮＰ、Ｃ／ＰおよびＬ遺伝子は、Ｌ遺伝子が上記変異を有する限り、センダイウイルスＣｌ．１５１株の塩基配列に限らず、例えば、センダイウイルス名古屋株あるいはZ株等の細胞傷害性を有し持続感染能を有しない株の塩基配列を有していてもよい。
また、leader RNAの３’末端に、人工的にセンダイウイルスの転写終結配列を挿入させれば、アンチゲノムRNAのコピー数を低下させ、インターフェロン誘導能をさらに、減弱させることもできる。
さらに、センダイウイルスが動物細胞で持続感染するためには、上記変異Ｌ遺伝子を持つことに加えて、Ｆ、Ｍ、ＨＮ遺伝子がすべてＣｌ．１５１株由来でなければならない。そのため、上記変異L遺伝子とＣｌ．１５１株由来のＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子を同時に持つセンダイウイルスベクターは細胞傷害性がなく、持続感染能を有し、外来遺伝子を担持させれば、細胞内で長期間該遺伝子の発現が維持される。またこのＣｌ．１５１株を基に作成したセンダイウイルスベクターでは、ベクターに搭載した遺伝子を長期持続発現する能力を損なうこと無く、Ｃｌ．１５１株由来のＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子の機能のうち一つまたは複数（全てを含む）を欠損させることが可能である。また、これら遺伝子の機能はその一つの欠損でもベクターの伝播性を顕著に抑制することが可能ではあるが、完全に抑制するためにはＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子の各機能の全てを欠損させることが好ましい。Ｆ、Ｍ、ＨＮ遺伝子機能のうち１つまたは複数を欠損させる方法としては、単純にこれら各遺伝子の全部またはその一部を欠失させても良いし、任意の外来遺伝子の挿入あるいは置換によってもよい。
上記センダイウイルスＣｌ．１５１株の全長遺伝子ｃDNAは、GenBankに登録済みである（Accession Number AB275416）。
さらに、センダイウイルスが動物細胞で持続感染するためには、上記変異Ｌ遺伝子を持つことに加えて、Ｆ、Ｍ、ＨＮ遺伝子がすべてＣｌ．１５１株由来でなければならない。そのため、上記変異L遺伝子とＣｌ．１５１株由来のＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子を同時に持つセンダイウイルスベクターは細胞傷害性がなく、持続感染能を有し、外来遺伝子を担持させれば、細胞内で長期間該遺伝子の発現が維持される。またこのＣｌ．１５１株を基に作成したセンダイウイルスベクターでは、ベクターに搭載した遺伝子を長期持続発現する能力を損なうこと無く、Ｃｌ．１５１株由来のＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子の機能のうち一つまたは複数（全てを含む）を欠損させることが可能である。また、これら遺伝子の機能はその一つの欠損でもベクターの伝播性を顕著に抑制することが可能ではあるが、完全に抑制するためにはＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子の各機能の全てを欠損させることが好ましい。Ｆ、Ｍ、ＨＮ遺伝子機能のうち１つまたは複数を欠損させる方法としては、単純にこれら各遺伝子の全部またはその一部を欠失させても良いし、任意の外来遺伝子の挿入あるいは置換によってもよい。
上記センダイウイルスＣｌ．１５１株の全長遺伝子ｃDNAは、GenBankに登録済みである（Accession Number AB275416）。
〔初期化遺伝子〕
一方、初期化遺伝子は、本願発明のセンダイウイルスベクターに挿入するが、初期化遺伝子としては、ヒト・マウスあるいは任意の哺乳動物のOct3/4、Sox2、Klf4の各遺伝子の組み合わせ、及びさらにc-Myc遺伝子を加えた組み合わせ、あるいはNanog、Lin28、Esrrb、UTF1、TERT（テロメラーゼ触媒サブユニット）、SV40のT抗原の各遺伝子を加えた組み合わせが挙げられる。
一方、初期化遺伝子は、本願発明のセンダイウイルスベクターに挿入するが、初期化遺伝子としては、ヒト・マウスあるいは任意の哺乳動物のOct3/4、Sox2、Klf4の各遺伝子の組み合わせ、及びさらにc-Myc遺伝子を加えた組み合わせ、あるいはNanog、Lin28、Esrrb、UTF1、TERT（テロメラーゼ触媒サブユニット）、SV40のT抗原の各遺伝子を加えた組み合わせが挙げられる。
〔初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター作成用鋳型ベクター〕
本発明においては、センダイウイルスベクターの構成材料である上記ＮＰ、Ｐ／Ｃ、変異Ｌの各遺伝子を、上記初期化遺伝子とともにファージ等のクローニングベクターに挿入する。このとき初期化遺伝子は、必要とする複数の遺伝子の全てを挿入することが可能である。これにより、後述する初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、初期化に必要な遺伝子を全て含み、従来のように各初期化遺伝子をそれぞれ別のベクターに導入する必要がなく、極めて効率的に初期化が行える。
このようにして得られた組み換えベクターは、本発明の初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクター、すなわち初期化遺伝子を担持したセンダイウイルス粒子を作成するための鋳型となる。以下この組み換えベクターを鋳型ベクターという。
本発明においては、センダイウイルスベクターの構成材料である上記ＮＰ、Ｐ／Ｃ、変異Ｌの各遺伝子を、上記初期化遺伝子とともにファージ等のクローニングベクターに挿入する。このとき初期化遺伝子は、必要とする複数の遺伝子の全てを挿入することが可能である。これにより、後述する初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、初期化に必要な遺伝子を全て含み、従来のように各初期化遺伝子をそれぞれ別のベクターに導入する必要がなく、極めて効率的に初期化が行える。
このようにして得られた組み換えベクターは、本発明の初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクター、すなわち初期化遺伝子を担持したセンダイウイルス粒子を作成するための鋳型となる。以下この組み換えベクターを鋳型ベクターという。
この鋳型ベクターにおいて、ＮＰ、Ｐ／Ｃ、変異Ｌの各遺伝子及び初期化遺伝子は、NP−P/C―初期化遺伝子（あるいは、さらに、マーカー遺伝子を導入してもよい。）―変異Ｌ遺伝子の順でファージ等のベクターに組み込まれる。
この初期化遺伝子あるいはマーカー遺伝子は、センダイウイルスベクターにおけるＦ、Ｍ、ＮＨの各遺伝子に挿入あるいは該遺伝子の配列と置換させて、これらＦ、Ｍ、ＮＨの各遺伝子の機能を欠損させることに用いることもできる。
また、この鋳型ベクターにおいては、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子も挿入することができ、これにより鋳型ベクターあるいはセンダイウイルスベクターが挿入された標的細胞のスクリーニングが容易に行える。
この初期化遺伝子あるいはマーカー遺伝子は、センダイウイルスベクターにおけるＦ、Ｍ、ＮＨの各遺伝子に挿入あるいは該遺伝子の配列と置換させて、これらＦ、Ｍ、ＮＨの各遺伝子の機能を欠損させることに用いることもできる。
また、この鋳型ベクターにおいては、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子も挿入することができ、これにより鋳型ベクターあるいはセンダイウイルスベクターが挿入された標的細胞のスクリーニングが容易に行える。
具体的には、センダイウイルスベクターの上記各遺伝子からなる構成材料及び上記初期化遺伝子ｃDNAあるいはさらにマーカー遺伝子ｃDNAを、上記順序で、細胞内で（＋）鎖のゲノムRNAが形成されるように結合して、鋳型ベクターを作成する。例えば、上記構成材料cDNAをλDASHII等のクローニングベクターに組み込むとともに、組み込まれた全長cDNAの上流（ゲノムRNAにおける3’末端側）にT7プロモーター配列、3個のグアニジン残基をこの順で配置し、同全長cDNAの下流（ゲノムRNAにおける5’末端側）にタバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列、T7 RNA polymerase終止配列をこの順で配置する。
なお、T7プロモーター配列はT7 RNA polymeraseによってゲノムRNAにおける3’末端側から(＋)鎖ゲノムRNAが生合成されるように、3個のグアニジン残基はT7 RNA polymeraseによるRNA転写効率を上昇させるように（S. Leyrer et al. (1998) J. Virol. Methods 75; 47-58）、タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列は転写された(＋)鎖ゲノムRNAが末端で正確に切断されるように、T7 RNA polymerase終止配列はT7 RNA polymeraseによるRNA転写を正確に終結させるために付加するものである。
なお、T7プロモーター配列はT7 RNA polymeraseによってゲノムRNAにおける3’末端側から(＋)鎖ゲノムRNAが生合成されるように、3個のグアニジン残基はT7 RNA polymeraseによるRNA転写効率を上昇させるように（S. Leyrer et al. (1998) J. Virol. Methods 75; 47-58）、タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列は転写された(＋)鎖ゲノムRNAが末端で正確に切断されるように、T7 RNA polymerase終止配列はT7 RNA polymeraseによるRNA転写を正確に終結させるために付加するものである。
〔初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの作成〕
このように作成された初期化遺伝子を有する鋳型ベクターは、ウイルスベクター産生用細胞に導入して、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを作成することができる。
ウイルスベクター産生用細胞には、鋳型ベクターから（＋）鎖のアンチゲノムRNAを転写するためにT7 RNA polymeraseを供給する必要があり、ウイルスベクター産生用細胞として、例えば、T7 RNA polymerase発現ワクシニアウイルスを感染させた細胞を用いることもできるし、T7 RNA polymeraseを恒常的に発現するようにクローニングした細胞株を用いることもできる。
このように作成された初期化遺伝子を有する鋳型ベクターは、ウイルスベクター産生用細胞に導入して、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを作成することができる。
ウイルスベクター産生用細胞には、鋳型ベクターから（＋）鎖のアンチゲノムRNAを転写するためにT7 RNA polymeraseを供給する必要があり、ウイルスベクター産生用細胞として、例えば、T7 RNA polymerase発現ワクシニアウイルスを感染させた細胞を用いることもできるし、T7 RNA polymeraseを恒常的に発現するようにクローニングした細胞株を用いることもできる。
ヒト型T7 RNA polymeraseを恒常的に発現する細胞株（BHK/T7細胞）では従来のバクテリア型のT7 RNA polymeraseを発現する細胞株（BSR-T7-5細胞）と比較して、顕著にT7 RNA polymerase発現量が増加しており、この細胞を用いて組換えウイルスの産生を行った結果、効率良く組換えウイルスが回収された。すなわち、効率良く組換えウイルスを産生するためにT7 RNA polymerase発現量を増強させた細胞株を用いることが有効である。
上記鋳型ベクターが導入されたウイルスベクター産生細胞においては、鋳型ベクターDNAはT7 RNA polymeraseによってT7プロモーター以降がRNAに転写されるが、その際、産生するRNA分子はヘアピンリボザイム配列によって、それ以降の配列が切断されて削除され、鋳型ベクター中のNP遺伝子−P/C遺伝子−初期化遺伝子―変異Ｌ遺伝子をこの順で含むDNA部分、あるいはさらにマーカー遺伝子を含むDNA部分に対応する（＋）鎖のアンチゲノムRNA分子ができる。
上記鋳型ベクターが導入されたウイルスベクター産生細胞においては、鋳型ベクターDNAはT7 RNA polymeraseによってT7プロモーター以降がRNAに転写されるが、その際、産生するRNA分子はヘアピンリボザイム配列によって、それ以降の配列が切断されて削除され、鋳型ベクター中のNP遺伝子−P/C遺伝子−初期化遺伝子―変異Ｌ遺伝子をこの順で含むDNA部分、あるいはさらにマーカー遺伝子を含むDNA部分に対応する（＋）鎖のアンチゲノムRNA分子ができる。
また、T7 RNA polymeraseにより鋳型ベクターから転写された（＋）鎖のアンチゲノムRNAを持つウイルスベクター産生用細胞に、さらにＮＰ、Ｐ及びＬ遺伝子産物を産生するための発現ベクターを導入すると、上記（＋）鎖アンチゲノムRNAにＮＰ、Ｐ、Ｌ遺伝子産物が結合してRNP複合体（ヌクレオカプシド）が形成される。次にこのRNP複合体を鋳型として、ウイルス産生細胞中のRNAポリメラーゼにより（＋）鎖アンチゲノムRNAから（−）鎖ゲノムRNAが転写される。（−）鎖ゲノムRNAは、ウイルスベクター産生用細胞内のNP、Ｐ及び変異Ｌ遺伝子産物と結合して（−）鎖ゲノムRNAを含むRNP複合体を形成する。
上記使用した鋳型ベクターにおいては、非伝播性にするために、Ｃｌ．１５１株由来のＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子機能の１種以上を欠損させているため、これに基づき形成された上記RNP複合体は、組織細胞に感染させるために必要なウイルス粒子の形成が抑制されている。そこで、このようにして形成された（−）鎖ゲノムRNAを含むRNP複合体（ヌクレオカプシド）を持つウイルスベクター産生用細胞に、Ｆ、Ｍ、及びＨＮ遺伝子産物のうち、不足する遺伝子産物を発現することができる発現ベクターを導入し、ウイルス粒子産生温度である32℃で培養する。
上記使用した鋳型ベクターにおいては、非伝播性にするために、Ｃｌ．１５１株由来のＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子機能の１種以上を欠損させているため、これに基づき形成された上記RNP複合体は、組織細胞に感染させるために必要なウイルス粒子の形成が抑制されている。そこで、このようにして形成された（−）鎖ゲノムRNAを含むRNP複合体（ヌクレオカプシド）を持つウイルスベクター産生用細胞に、Ｆ、Ｍ、及びＨＮ遺伝子産物のうち、不足する遺伝子産物を発現することができる発現ベクターを導入し、ウイルス粒子産生温度である32℃で培養する。
これにより、（−）鎖ゲノムRNAを含むRNP複合体がウイルスベクター粒子に取り込まれ、初期化遺伝子を搭載したセンダイウイルス粒子が再構成される。上記したように、本発明においては、ウイルス粒子形成のために不足するＦ、Ｍ、ＨＮ遺伝子を搭載した発現ベクターを別途ウイルス産生用細胞に導入しているため、ベクター産生細胞の培養上清からウイルス粒子を回収することが可能になる。不足するＭ、ＦあるいはＨＮ遺伝子が複数の場合、発現系として、不足する遺伝子をそれぞれ導入した複数のベクターを使用してもよいし、またこれら不足する遺伝子を複数導入したベクターを使用しても良い。
また、このウイルス粒子の産生プロセスにおいては、ウイルスタンパク質の形成を補い、ウイルス粒子を効率的に産生させるために、上記欠損遺伝子に加え、さらに、ＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子、Ｌ遺伝子を有する発現ベクターを上記細胞に導入するのが好ましい。
また、このウイルス粒子の産生プロセスにおいては、ウイルスタンパク質の形成を補い、ウイルス粒子を効率的に産生させるために、上記欠損遺伝子に加え、さらに、ＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子、Ｌ遺伝子を有する発現ベクターを上記細胞に導入するのが好ましい。
なお、目的のウイルス産生細胞は、上記のように例えば薬剤耐性遺伝子を挿入することによって、薬剤導入培地で培養することにより選択が可能となるし、それ以外にも、EGFP遺伝子などのマーカー遺伝子を指標にして分取することも可能である。
以上のようにして得られた初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターはウイルス粒子の形態であり、分化細胞に持続感染可能である。しかし、該ベクターはＦ、Ｍ、ＨＮの各遺伝子機能の１以上を欠損しており、感染後において、感染のために必要なウイルス粒子の形成が抑制されているため、非伝播性である。また、該ベクターのＬ遺伝子はＬタンパク質の１６１８番目のロイシンがバリンになるよう変異させた遺伝子であり、インターフェロン誘導能を有しておらず、持続感染可能であり、長期間該、細胞に保持され、初期化遺伝子の持続発現が可能となる。
以上のようにして得られた初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターはウイルス粒子の形態であり、分化細胞に持続感染可能である。しかし、該ベクターはＦ、Ｍ、ＨＮの各遺伝子機能の１以上を欠損しており、感染後において、感染のために必要なウイルス粒子の形成が抑制されているため、非伝播性である。また、該ベクターのＬ遺伝子はＬタンパク質の１６１８番目のロイシンがバリンになるよう変異させた遺伝子であり、インターフェロン誘導能を有しておらず、持続感染可能であり、長期間該、細胞に保持され、初期化遺伝子の持続発現が可能となる。
〔分化細胞の初期化〕
上記で得られたウイルス粒子形態の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを、初期化の対象となる分化細胞に感染させる。この初期化の対象となる分化細胞としては、例えば、正常ヒト由来あるいは疾患を持つ患者由来の繊維芽細胞・口腔粘膜細胞・血球細胞・毛根上皮細胞、手術や組織検査により得られた肝細胞・大腸粘膜細胞・小腸粘膜細胞・肺上皮細胞等が挙げられるが、特にヒト細胞に限定されるものではなく、センダイウイルスが感染できることが知られているマウス・ラット・ハムスター・モルモット・ウサギ・イヌ・ネコ・サル・ウシ・ブタ・ヒツジ・ヤギ・ニワトリ等の動物の分化細胞であっても良い。これは、センダイウイルスが非常に幅広い動物種に由来するさまざまな細胞に感染できる能力を持っているためで、センダイウイルスが感染できない細胞としては、ウマ由来の細胞及びさまざまな動物種のＢリンパ球が知られているにすぎない。
上記で得られたウイルス粒子形態の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを、初期化の対象となる分化細胞に感染させる。この初期化の対象となる分化細胞としては、例えば、正常ヒト由来あるいは疾患を持つ患者由来の繊維芽細胞・口腔粘膜細胞・血球細胞・毛根上皮細胞、手術や組織検査により得られた肝細胞・大腸粘膜細胞・小腸粘膜細胞・肺上皮細胞等が挙げられるが、特にヒト細胞に限定されるものではなく、センダイウイルスが感染できることが知られているマウス・ラット・ハムスター・モルモット・ウサギ・イヌ・ネコ・サル・ウシ・ブタ・ヒツジ・ヤギ・ニワトリ等の動物の分化細胞であっても良い。これは、センダイウイルスが非常に幅広い動物種に由来するさまざまな細胞に感染できる能力を持っているためで、センダイウイルスが感染できない細胞としては、ウマ由来の細胞及びさまざまな動物種のＢリンパ球が知られているにすぎない。
この特徴は、現在までに誘導多能性幹細胞（iPS細胞）の作成に使われているレトロウイルスベクター・レンチウイルスベクター・アデノウイルスベクターのように宿主域が狭いウイルスベクターや、EBVベクターのようにヒト細胞でしか使えない遺伝子発現系、さらに物理的な遺伝子導入法と組み合わせる必要があるため導入できる細胞種が限られるプラスミドベクターやトランスポゾン・EBVベクターとは大きく異なる利点である。例えば、アデノウイルスベクターを使用した場合は、成熟マウス肝細胞において0.0005％以下の効率で初期化できるに過ぎず、マウス繊維芽細胞やヒト細胞は初期化できない。これに対して、本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、ヒト線維芽細胞以外にも、マウス線維芽細胞（実施例５）及びヒト血液単核球（実施例１８）を初期化することができた。また、本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを使って作製したマウス多能性幹細胞由来のキメラマウスが生殖細胞伝播をする能力を持つことから、本発明によって作製した細胞株が、悪性腫瘍になりにくく安全性が高い正常多能性幹細胞であることが確認された（実施例１０）。
本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、インターフェロン誘導活性を持たない変異Ｌ遺伝子を持ち、かつ野生型センダイウイルスのＭ、Ｆ、ＨＮ遺伝子を欠損しているため、細胞傷害性を持たず持続感染性を示し、分化細胞に感染後、該細胞の細胞質において、染色体と独立して安定的に存在し、細胞分裂後も維持される。これは変異Ｌ遺伝子を持たない、あるいは野生型センダイウイルスのＭ、Ｆ、ＨＮ遺伝子のいずれかを持つ他のセンダイウイルスベクターには見られない特徴である。したがって、本発明のセンダイウイルスベクターを使えば、１０日から２０日とされている初期化に必要な期間にわたって初期化遺伝子の発現を維持できるため、一度の遺伝子導入で初期化を行うことができる。これは一過性の遺伝子発現しかできないアデノウイルスベクターやプラスミドベクターでは得られない利点である。例えば、本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターにOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycを搭載した場合、ベクターを一度細胞に感染させるだけで、７日目〜１４日目にかけて、内因性の（つまりベクター由来では無く細胞由来の）上記初期化遺伝子と胚性多能性細胞（ES細胞）のマーカーであるアルカリホスファターゼを持続的に発現する細胞が出現する。
さらに、本発明のセンダイウイルスベクターを使えば、導入した遺伝子あるいはその一部が染色体の不特定部位に挿入されることは無い。このため、得られたiPS細胞はガン化を引き起こす恐れがなく、極めて安全である。これはレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクター・トランスポゾンのように染色体の不特定部位に遺伝子を挿入する系に比べて大きな利点である。さらに、染色体への遺伝子挿入を否定することが難しいアデノウイルスベクターやプラスミドベクター（EBVベクターを含む）を使用する場合に比べても大きな利点である。例えば、初期化遺伝子の中にはｃ-Myc、Oct4、Lin28は単独で細胞ガン化や異形性を引き起こすことが知られているが、本発明のセンダイウイルスベクターを使用すれば、これら遺伝子も安全に使用できる。
また、細胞の初期化に使うベクター系に求められる性質として、均一な性質を持った多能性幹細胞が再現性良く樹立できることが挙げられる。そのためには、複数（例えば４個）の初期化遺伝子を同一の細胞に一度に導入できるだけでなく、これらが常に一定の割合で発現することが求められる。複数の遺伝子をセンダイウイルスベクターで細胞に導入する場合、本発明の実施例で示したようにすべてを同一のベクターに搭載する方法と、非特許文献１７及び特許文献１に例示されているように個々の遺伝子を別々のベクターに搭載し、混合した上で細胞に感染させる方法の２つが考えられる。この２つの方法における遺伝子発現の違いを、Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)遺伝子とKusabira-Orange (KO)遺伝子を、同一のベクターに搭載した場合と、別々のベクターに搭載して混合した場合を比較して検証した。その結果、一定の比で再現性良く外来遺伝子を発現させるためには、複数の遺伝子を同一のベクター上に搭載する必要があることが明らかになった（実施例１５）。さらに高い効率でiPSマーカー発現細胞を誘導するためには、初期化遺伝子がすべて同一のベクター上に搭載されている必要があることも確認できた（実施例１６）。
本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターでは初期化用遺伝子をすべて同一のベクターに搭載しているため、これらを使用した場合のiPS細胞の出現効率（初期化効率）は極めて高い。例えばOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycを搭載した場合、最大で16.8％に達する（実施例５，実施例８）。これに対して、アデノウイルスベクターを使用した場合は、成熟マウス肝細胞において0.0005％以下の細胞を初期化できるにすぎない。また、現在までに外来遺伝子を含まないヒトiPS細胞の樹立が唯一報告されているEBVベクターでも、効率は0.0003から0.0006%程度にすぎない。
さらに、複数の初期化遺伝子を同一のベクターに搭載し常に一定の発現比で発現させることで、樹立した多能性幹細胞は非常に均一な性質を示す。例えば、本発明において樹立したヒト多能性幹細胞の遺伝子発現をDNAチップ法で解析すると、４つの異なった細胞株間の相関係数がすべて0.98以上となった（実施例１９）。これは、レトロウイルスベクターで樹立された多能性幹細胞の遺伝子発現が一般に非常に不均一で細胞株間の相関係数が0.95以下になる場合が多いことと対照的である（参考文献：Chin, et al.,
Cell Stem Cells, 5, 111-123, 2009）。
さらに、複数の初期化遺伝子を同一のベクターに搭載し常に一定の発現比で発現させることで、樹立した多能性幹細胞は非常に均一な性質を示す。例えば、本発明において樹立したヒト多能性幹細胞の遺伝子発現をDNAチップ法で解析すると、４つの異なった細胞株間の相関係数がすべて0.98以上となった（実施例１９）。これは、レトロウイルスベクターで樹立された多能性幹細胞の遺伝子発現が一般に非常に不均一で細胞株間の相関係数が0.95以下になる場合が多いことと対照的である（参考文献：Chin, et al.,
Cell Stem Cells, 5, 111-123, 2009）。
以上のことから、４個の初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載している本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを使えば、常に再現性良く、また非常に高い効率で、性質が均一な多能性幹細胞を樹立できることが明らかになった。
〔初期化遺伝子の除去〕
本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、分化細胞に感染導入され、該細胞の細胞質内において初期化遺伝子は持続発現して該細胞を初期化する。初期化された後の細胞の遺伝情報を初期化前の細胞の遺伝情報と同一にするためには、不要となった初期化遺伝子を除去する必要があるが、本発明においてはsiRNAを使用して初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター全体を除去する。使用するsiRNAとしては、センダイウイルスベクターのＬ遺伝子を標的にして行う。本発明者の実験によれば、ＮＰ遺伝子やＰ遺伝子を標的にしてもある程度の除去は可能であるが、Ｌ遺伝子を標的にすれば完全に初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去できる。Ｌ遺伝子中のターゲット部位としては、例えば、Ｌタンパク質の５２７番目あるいは１９１３番目のヌクレオチド残基をコードする部分を含む領域が挙げられるが、特にこれらに限定されるわけではなく他の領域であっても良い。siRNAは、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させた後、５日間から２０日間後に該細胞に導入する。
本発明の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターは、分化細胞に感染導入され、該細胞の細胞質内において初期化遺伝子は持続発現して該細胞を初期化する。初期化された後の細胞の遺伝情報を初期化前の細胞の遺伝情報と同一にするためには、不要となった初期化遺伝子を除去する必要があるが、本発明においてはsiRNAを使用して初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター全体を除去する。使用するsiRNAとしては、センダイウイルスベクターのＬ遺伝子を標的にして行う。本発明者の実験によれば、ＮＰ遺伝子やＰ遺伝子を標的にしてもある程度の除去は可能であるが、Ｌ遺伝子を標的にすれば完全に初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去できる。Ｌ遺伝子中のターゲット部位としては、例えば、Ｌタンパク質の５２７番目あるいは１９１３番目のヌクレオチド残基をコードする部分を含む領域が挙げられるが、特にこれらに限定されるわけではなく他の領域であっても良い。siRNAは、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させた後、５日間から２０日間後に該細胞に導入する。
また、siRNAのかわりに細胞内に存在するmicroRNA（miRNA）を利用することも考えられる。miRNAは動物細胞のゲノムから転写される小さなRNAであって、DNA、mRNA、タンパク質と相互作用してその機能を調節している。mRNAとの相互作用では、mRNA上の標的配列に結合して、その分解を誘導もしくは翻訳を抑制することで遺伝子の発現を抑制する機構が存在している。この機構を利用して、ある遺伝子から転写されるmRNAのタンパク質非コード領域に特定のmiRNAの標的配列を人工的に挿入することにより、そのmiRNAが発現している細胞中で該遺伝子の発現を抑制できることが知られている。この機構を利用すれば、初期化された細胞でのみ出現するmiRNAの標的配列をセンダイウイルスベクターのＬ遺伝子、NP遺伝子あるいはＰ遺伝子の非コード領域に付加することにより、siRNAの場合と同様にＬ遺伝子、ＮＰ遺伝子あるいはＰ遺伝子の発現を抑制することによって初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することができる。
この目的で使用するmiRNAとしては、例えばヒトやマウスのES細胞で特異的に発現しているmir-302aが挙げられるが、このmiRNAに限定されるわけではない。miRNAを利用した初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの除去法の利点としては、外部からsiRNAを導入する必要が無く、センダイウイルスベクターの除去が自動化できることが挙げられる。さらにヒト細胞の場合は、高温（40°C）で培養することによりベクターの除去を促進することもできる。
このようにＬ遺伝子をターゲットにしたsiRNAや高温での培養、miRNA標的配列をＬ遺伝子、NP遺伝子あるいはＰ遺伝子の非コード領域に付加したセンダイウイルスベクターを使用して、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することにより、得られるiPS細胞は染色体に挿入された外来遺伝子を有せず、分化細胞の提供個体と全く同一のゲノム情報を有し。試験管内で長期の自己複製能を有する。
以下に、本発明の実施例を示す。但し本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
このようにＬ遺伝子をターゲットにしたsiRNAや高温での培養、miRNA標的配列をＬ遺伝子、NP遺伝子あるいはＰ遺伝子の非コード領域に付加したセンダイウイルスベクターを使用して、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することにより、得られるiPS細胞は染色体に挿入された外来遺伝子を有せず、分化細胞の提供個体と全く同一のゲノム情報を有し。試験管内で長期の自己複製能を有する。
以下に、本発明の実施例を示す。但し本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１
持続発現型センダイウイルスベクター再構成用細胞の作製
動物細胞での発現効率を向上させるためにコドンを最適化したT7 RNA polymeraseをコードするcDNA（配列表・配列番号1）をレトロウイルスベクター作成用プラスミドpCX4SRalpha-neoベクターにクローニングした。またセンダイウイルスCl151株Mタンパク質をコードするcDNAをレトロウイルスベクター作成用プラスミドpCX4SRalpha-puroベクターにクローニングした。PLAT-Eパッケージング細胞にLipofectamine 2000を用いてそれぞれ上記プラスミドDNAを導入し、培養上清にレトロウイルス（T7 RNA polymerase組み換えレトロウイルス、151M組み換えレトロウイルス）を得た。BHK-21細胞にT7 RNA polymerase組み換えレトロウイルスを感染させ、G418 800μg/mlと10% ウシ胎児血清（FCS）を含むDulbecco’s Modified Minimal Essential Medium (DMEM)に移しT7 RNA polymeraseを安定に発現するG418耐性細胞 (BHK/T7(SE)) を単離した。続いてBHK/T7(SE)細胞に151M組み換えレトロウイルスを感染させ、G418 800μg/ml、puromycin 15μg/ml、10%FCSを含むDMEM培地に移し、T7 RNA polymeraseとMタンパク質を安定に発現するG418＋puromycin耐性細胞 (BHK/T7/151M(SE))を単離した。
持続発現型センダイウイルスベクター再構成用細胞の作製
動物細胞での発現効率を向上させるためにコドンを最適化したT7 RNA polymeraseをコードするcDNA（配列表・配列番号1）をレトロウイルスベクター作成用プラスミドpCX4SRalpha-neoベクターにクローニングした。またセンダイウイルスCl151株Mタンパク質をコードするcDNAをレトロウイルスベクター作成用プラスミドpCX4SRalpha-puroベクターにクローニングした。PLAT-Eパッケージング細胞にLipofectamine 2000を用いてそれぞれ上記プラスミドDNAを導入し、培養上清にレトロウイルス（T7 RNA polymerase組み換えレトロウイルス、151M組み換えレトロウイルス）を得た。BHK-21細胞にT7 RNA polymerase組み換えレトロウイルスを感染させ、G418 800μg/mlと10% ウシ胎児血清（FCS）を含むDulbecco’s Modified Minimal Essential Medium (DMEM)に移しT7 RNA polymeraseを安定に発現するG418耐性細胞 (BHK/T7(SE)) を単離した。続いてBHK/T7(SE)細胞に151M組み換えレトロウイルスを感染させ、G418 800μg/ml、puromycin 15μg/ml、10%FCSを含むDMEM培地に移し、T7 RNA polymeraseとMタンパク質を安定に発現するG418＋puromycin耐性細胞 (BHK/T7/151M(SE))を単離した。
実施例２
hOct4,
hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターの作製
（１）ベクター作製用鋳型cDNAの構築
Avr II認識配列−ヒトOct4 ORF−センダイウイルス（SeV）ゲノムcDNA（6617-6666塩基）−ヒトSox2 ORF−Age I認識配列をこの順序で含む二本鎖DNA（配列表・配列番号2）を合成し 、プラスミドベクターpUC57にクローニングした（GenScript社に委託）（pUC57-OctSox）。pUC57-OctSoxからAvr II、Age Iで切断したDNA配列をプラスミドpMO078（pBluescript II SK(＋)（Agilent Technologies, Inc.）にCla I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（2871-3650塩基）−NotＩ認識配列−ブラストサイジンＳ耐性遺伝子−Mlu I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（4728-4828塩基）−AvrＩＩ認識配列−ヒト化クサビラオレンジ遺伝子−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（6617-6666塩基）−gp91phox遺伝子−Age I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（8442-10479塩基）をこの順序で挿入したプラスミドベクター：配列表・配列番号３）のAvr II−Age I間に挿入することによってプラスミドpMO084を得た（図1）。
hOct4,
hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターの作製
（１）ベクター作製用鋳型cDNAの構築
Avr II認識配列−ヒトOct4 ORF−センダイウイルス（SeV）ゲノムcDNA（6617-6666塩基）−ヒトSox2 ORF−Age I認識配列をこの順序で含む二本鎖DNA（配列表・配列番号2）を合成し 、プラスミドベクターpUC57にクローニングした（GenScript社に委託）（pUC57-OctSox）。pUC57-OctSoxからAvr II、Age Iで切断したDNA配列をプラスミドpMO078（pBluescript II SK(＋)（Agilent Technologies, Inc.）にCla I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（2871-3650塩基）−NotＩ認識配列−ブラストサイジンＳ耐性遺伝子−Mlu I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（4728-4828塩基）−AvrＩＩ認識配列−ヒト化クサビラオレンジ遺伝子−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（6617-6666塩基）−gp91phox遺伝子−Age I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（8442-10479塩基）をこの順序で挿入したプラスミドベクター：配列表・配列番号３）のAvr II−Age I間に挿入することによってプラスミドpMO084を得た（図1）。
Nhe I認識配列−ヒトKlf4 ORF−センダイウイルス転写終結配列−センダイウイルス転写開始配列−Not I認識配列をこの順序で含む二本鎖DNA（配列表・配列番号４）を合成し、プラスミドベクターpUC57にクローニングした（GenScript社に委託）（pUC57-KLF4）。pUC57-KLF4からNhe I、Not Iで切断したDNA配列をpNK154（pBluescript II SK(＋)（Agilent Technologies, Inc.）にSeV Nagoya株ゲノムcDNA（1-2871塩基）−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（2872-3656塩基）−NheI認識配列−Not I認識配列をこの順序で挿入したプラスミドベクター）（配列表・配列番号５）のNhe I−Not I間に挿入することによってプラスミドpMO085を得た（図1）。
以上によって得られた各プラスミドのうち、pMO085を制限酵素XhoI、NotIで切断したDNA断片（T7プロモーター配列とSeVゲノムcDNA（1-3655塩基）とヒトKlf4 cDNAを含む）、pMO084を制限酵素NotI-EcoRIで切断したDNA断片（ヒトOct4、ヒトSox2 cDNAを含む）、l/151（SeV Cl.151株ゲノム全長cDNAをクローニングしたラムダファージベクター。Nishimura, et al., J. Biol. Chem., 282, 27383-27391, 2007）のファージゲノムDNAをEcoR Iで切断したDNA断片（SeVゲノム10480-15384塩基に相補的なcDNA及びlDASHII right armを含む）を合わせてラムダファージベクターlDASHIIにクローニングし、l/SeVp (Mp+Klf4,＋M::Bsr,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)を作製した（図１）（hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターゲノム全長に相補的なcDNAは配列表・配列番号６に記載）。
以上によって得られた各プラスミドのうち、pMO085を制限酵素XhoI、NotIで切断したDNA断片（T7プロモーター配列とSeVゲノムcDNA（1-3655塩基）とヒトKlf4 cDNAを含む）、pMO084を制限酵素NotI-EcoRIで切断したDNA断片（ヒトOct4、ヒトSox2 cDNAを含む）、l/151（SeV Cl.151株ゲノム全長cDNAをクローニングしたラムダファージベクター。Nishimura, et al., J. Biol. Chem., 282, 27383-27391, 2007）のファージゲノムDNAをEcoR Iで切断したDNA断片（SeVゲノム10480-15384塩基に相補的なcDNA及びlDASHII right armを含む）を合わせてラムダファージベクターlDASHIIにクローニングし、l/SeVp (Mp+Klf4,＋M::Bsr,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)を作製した（図１）（hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターゲノム全長に相補的なcDNAは配列表・配列番号６に記載）。
（２）hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターの調製
BHK/T7/151M(SE)細胞を5 × 105 cells / wellで6-wellプレートに播種し、２４時間培養した後に洗浄した。l/SeVp (Mp＋Klf4,＋M::Bsr,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)ファージDNA、NPタンパク質発現プラスミドpGEM/NP、Pタンパク質発現プラスミドpGEM/P、Lタンパク質発現プラスミドpGEM/L、Fタンパク質発現プラスミドpSRD-FZmut、HNタンパク質発現プラスミドpMKIT-NaHNをそれぞれ2μg、1μg、1μg、1μg、1μg、1μgの量比でOptiMEM 300μLに懸濁し、10μLのLipofectamine 2000を含む300μLのOptiMEMと混合して２０分間室温放置した培地を、細胞に添加して４時間培養した。細胞を再度洗浄後、10%FCS含有DMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。その後、Blastcidin S 10μg/mLを含む10%FCS含有DMEM培地に細胞を移して培養を続け、ブラストサイジン耐性細胞をhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクター産生細胞（BHK/T7/151M/KBOS）として分離した。ベクターゲノムの再構成が起こったことは、センダイウイルスNPタンパク質に対する抗体、及び、hOct4, hSox2, hKlf4遺伝子産物に対する抗体を用いた蛍光抗体法により確認した。
BHK/T7/151M(SE)細胞を5 × 105 cells / wellで6-wellプレートに播種し、２４時間培養した後に洗浄した。l/SeVp (Mp＋Klf4,＋M::Bsr,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)ファージDNA、NPタンパク質発現プラスミドpGEM/NP、Pタンパク質発現プラスミドpGEM/P、Lタンパク質発現プラスミドpGEM/L、Fタンパク質発現プラスミドpSRD-FZmut、HNタンパク質発現プラスミドpMKIT-NaHNをそれぞれ2μg、1μg、1μg、1μg、1μg、1μgの量比でOptiMEM 300μLに懸濁し、10μLのLipofectamine 2000を含む300μLのOptiMEMと混合して２０分間室温放置した培地を、細胞に添加して４時間培養した。細胞を再度洗浄後、10%FCS含有DMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。その後、Blastcidin S 10μg/mLを含む10%FCS含有DMEM培地に細胞を移して培養を続け、ブラストサイジン耐性細胞をhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクター産生細胞（BHK/T7/151M/KBOS）として分離した。ベクターゲノムの再構成が起こったことは、センダイウイルスNPタンパク質に対する抗体、及び、hOct4, hSox2, hKlf4遺伝子産物に対する抗体を用いた蛍光抗体法により確認した。
5.0 x 105 個のBHK/T7/151M/KBOS細胞に対し、欠損遺伝子発現プラスミドであるpMKIT-151M、pSRD-ZFmut、pMKIT/NaHN各2・gをLipofectamine
2000を用いて導入し、４時間後に細胞を洗浄した後、10%FCS含有DMEM培地を加えてさらに32℃で４日間培養した。その後、hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターを含む培養上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過後、必要ならば超遠心法によりベクターを濃縮した。ベクター懸濁液は液体窒素にて急速冷凍し、-80℃にて保存した。
2000を用いて導入し、４時間後に細胞を洗浄した後、10%FCS含有DMEM培地を加えてさらに32℃で４日間培養した。その後、hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターを含む培養上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過後、必要ならば超遠心法によりベクターを濃縮した。ベクター懸濁液は液体窒素にて急速冷凍し、-80℃にて保存した。
実施例３
hOct4,
hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターの作製
（１）ベクターcDNAの作製
hKlf4遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCGCT-3’（ 配列表・配列番号７（N末端側））、5’-GGTCCACGCGTTTAAAAATGCCTCTTCATGTG-3’（ 配列表・配列番号８（C末端側））の２本のプライマーを用いてpUC57-KLF4上からヒトKlf4遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pMO026（pBluescript II SK(＋)にCla I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（2871-3650塩基）−NotＩ認識配列−Nhe I認識配列−ブラストサイジンＳ耐性遺伝子−Mlu I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（4728-5335塩基）をこの順番で挿入したプラスミドベクター）（配列表・配列番号９）のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pMO097を得た。さらにpMO097のCla I-Mlu I断片とpMO084のCla I-Mlu Iを結合することによりpMO099を得た（図２）。
hOct4,
hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターの作製
（１）ベクターcDNAの作製
hKlf4遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCAGTCTGACATGGCTGTCAGCGACGCGCT-3’（ 配列表・配列番号７（N末端側））、5’-GGTCCACGCGTTTAAAAATGCCTCTTCATGTG-3’（ 配列表・配列番号８（C末端側））の２本のプライマーを用いてpUC57-KLF4上からヒトKlf4遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pMO026（pBluescript II SK(＋)にCla I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（2871-3650塩基）−NotＩ認識配列−Nhe I認識配列−ブラストサイジンＳ耐性遺伝子−Mlu I認識配列−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（4728-5335塩基）をこの順番で挿入したプラスミドベクター）（配列表・配列番号９）のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pMO097を得た。さらにpMO097のCla I-Mlu I断片とpMO084のCla I-Mlu Iを結合することによりpMO099を得た（図２）。
hc-Myc遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCTTAGACGCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG-3’（ 配列表・配列番号１０（N末端側））、5’-GTCCGACGTCCTTACGCACAAGAGTTCCGT-3’（ 配列表・配列番号１１（C末端側））の２本のプライマーを用いてヒトc-Myc cDNA全長を含むプラスミドpJL1上からヒトc-Myc遺伝子をPCR法で増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Aat IIで切断し、pMO094(pBluescript II SK(＋)（Agilent Technologies, Inc.）にSeV Nagoya株ゲノムcDNA（1-43塩基）−センダイウイルス転写終結配列−SeV Nagoya株ゲノムcDNA（56-2870塩基）−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（2871-3656塩基）−NheI認識配列−ヒトKlf4 ORF−AatＩＩ認識配列−センダイウイルス転写終結配列−センダイウイルス転写開始配列−Not I認識配列をこの順序で挿入したプラスミドベクター：配列表・配列番号１２）のNhe I−Aat II間に挿入することによって、pMO103を得た（図２）。
以上によって得られた各プラスミドのうち、pMO103からT7プロモーター配列〜SeV:1−3655を、pMO099からSeV:3655−10480を切り出し、l/151をEcoR I切断することによって得た、SeV:10480−1538＋lDASHII right armのDNA断片と合わせてクローニングし、l/SeVp (Mp＋myc,＋M::Klf4,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)を作製した（図２）（h−cMyc, hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターゲノム全長に相補的なcDNAは配列表・配列番号１３）。
5’-ACTAGCTAGCTTAGACGCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG-3’（ 配列表・配列番号１０（N末端側））、5’-GTCCGACGTCCTTACGCACAAGAGTTCCGT-3’（ 配列表・配列番号１１（C末端側））の２本のプライマーを用いてヒトc-Myc cDNA全長を含むプラスミドpJL1上からヒトc-Myc遺伝子をPCR法で増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Aat IIで切断し、pMO094(pBluescript II SK(＋)（Agilent Technologies, Inc.）にSeV Nagoya株ゲノムcDNA（1-43塩基）−センダイウイルス転写終結配列−SeV Nagoya株ゲノムcDNA（56-2870塩基）−SeV Cl.151株ゲノムcDNA（2871-3656塩基）−NheI認識配列−ヒトKlf4 ORF−AatＩＩ認識配列−センダイウイルス転写終結配列−センダイウイルス転写開始配列−Not I認識配列をこの順序で挿入したプラスミドベクター：配列表・配列番号１２）のNhe I−Aat II間に挿入することによって、pMO103を得た（図２）。
以上によって得られた各プラスミドのうち、pMO103からT7プロモーター配列〜SeV:1−3655を、pMO099からSeV:3655−10480を切り出し、l/151をEcoR I切断することによって得た、SeV:10480−1538＋lDASHII right armのDNA断片と合わせてクローニングし、l/SeVp (Mp＋myc,＋M::Klf4,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)を作製した（図２）（h−cMyc, hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターゲノム全長に相補的なcDNAは配列表・配列番号１３）。
（２）hOct4,hSox2, hKlf4, hc−Myc持続発現用センダイウイルスベクターの調製
BHK/T7/151M(SE)細胞を5 × 105 cells / wellで6−wellプレートに播種し、24時間培養した後に洗浄した。l/SeVp (Mp＋myc,＋M::Klf4,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)ファージDNA、NPタンパク質発現プラスミドpGEM/NP、Pタンパク質発現プラスミドpGEM/P、Lタンパク質発現プラスミドpGEM/L、Fタンパク質発現プラスミドpSRD−FZmut、HNタンパク質発現プラスミドpMKIT−NaHNをそれぞれ2μg、1μg、1μg、1μg、1μg、1μgの量比でOptiMEM 300μLに懸濁し、10μLのLipofectamine 2000を含む300μLのOptiMEMと混合して２０分間室温放置した培地を、細胞に添加して４時間培養した。細胞を再度洗浄後、10%FCS含有DMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。さらに37℃で３日間培養後、センダイウイルスNPタンパク質に対する抗体、及び、hOct4, hSox2, hKlf4遺伝子産物に対する抗体を用いて蛍光抗体法で染色することにより、トランスフェクションした細胞中でベクターゲノムの再構成が起こったことを確認し、この細胞集団をこれ以上のクローニングせずにhOct4, hSox2, hKlf4, hc−Myc持続発現用センダイウイルスベクター産生細胞として用いた。
BHK/T7/151M(SE)細胞を5 × 105 cells / wellで6−wellプレートに播種し、24時間培養した後に洗浄した。l/SeVp (Mp＋myc,＋M::Klf4,＋F::Oct4,＋HN::Sox2)ファージDNA、NPタンパク質発現プラスミドpGEM/NP、Pタンパク質発現プラスミドpGEM/P、Lタンパク質発現プラスミドpGEM/L、Fタンパク質発現プラスミドpSRD−FZmut、HNタンパク質発現プラスミドpMKIT−NaHNをそれぞれ2μg、1μg、1μg、1μg、1μg、1μgの量比でOptiMEM 300μLに懸濁し、10μLのLipofectamine 2000を含む300μLのOptiMEMと混合して２０分間室温放置した培地を、細胞に添加して４時間培養した。細胞を再度洗浄後、10%FCS含有DMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。さらに37℃で３日間培養後、センダイウイルスNPタンパク質に対する抗体、及び、hOct4, hSox2, hKlf4遺伝子産物に対する抗体を用いて蛍光抗体法で染色することにより、トランスフェクションした細胞中でベクターゲノムの再構成が起こったことを確認し、この細胞集団をこれ以上のクローニングせずにhOct4, hSox2, hKlf4, hc−Myc持続発現用センダイウイルスベクター産生細胞として用いた。
5.0 x 105 個の hOct4, hSox2, hKlf4, hc−Myc持続発現用センダイウイルスベクター産生細胞に、欠損遺伝子発現プラスミドであるpMKIT−151M、pSRD−ZFmut、pMKIT/NaHN各2・gをLipofectamine 2000を用いて導入し、４時間後に細胞を洗浄した後、10%FCS含有DMEM培地を加えてさらに32℃で４−９日間培養した。その後、hOct4, hSox2, hKlf4, hc−Myc持続発現用センダイウイルスベクターを含む培養上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過後、必要ならば超遠心法によりベクターを濃縮した。ベクター懸濁液は液体窒素にて急速冷凍し、−80℃にて保存した。
実施例４
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの、siRNAを用いた細胞からの除去
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムを安定に保持している細胞からベクターゲノムを除去する目的で、ベクターが持続感染するために必要なRNA依存性RNAポリメラーゼのサブユニットをコードするＬ遺伝子の発現を抑制する2種類のshort interfering RNA（siRNA）を作製した（#1：センス鎖 5’-GGUUCAGCAUCAAAUAUGAAG-3’（配列表・配列番号１４）、アンチセンス鎖 5’-UCAUAUUUGAUGCUGAACCAU-3’ （配列表・配列番号１５）、#2：センス鎖 5’-GGUCCAGACAUGAAUUCAAAG-3’ （配列表・配列番号１６）、アンチセンス鎖 5’-UUGAAUUCAUGUCUGGACCAU-3’ （配列表・配列番号１７））。該siRNAによるベクターゲノム除去効果を調べるため、オワンクラゲ由来改良緑色蛍光タンパク質（Enhanced green fluorescent protein, EGFP. Clontech社）遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターのゲノムを安定に保持しているBHK/T7細胞を1.0 x 104 /wellになるように48 well プレートに播種し、翌日、最終濃度100 nMになるようにL遺伝子を標的としたsiRNAを導入した。導入から４日後にEGFPの蛍光を顕微鏡により観察した結果、Ｌ遺伝子を標的としたsiRNAを導入した細胞では、陰性対照として用いたホタル luciferase遺伝子を標的としたsiRNAを導入した細胞に比べ、EGFPの蛍光強度が大きく減少していることが分かった（図３Ａ）。
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの、siRNAを用いた細胞からの除去
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムを安定に保持している細胞からベクターゲノムを除去する目的で、ベクターが持続感染するために必要なRNA依存性RNAポリメラーゼのサブユニットをコードするＬ遺伝子の発現を抑制する2種類のshort interfering RNA（siRNA）を作製した（#1：センス鎖 5’-GGUUCAGCAUCAAAUAUGAAG-3’（配列表・配列番号１４）、アンチセンス鎖 5’-UCAUAUUUGAUGCUGAACCAU-3’ （配列表・配列番号１５）、#2：センス鎖 5’-GGUCCAGACAUGAAUUCAAAG-3’ （配列表・配列番号１６）、アンチセンス鎖 5’-UUGAAUUCAUGUCUGGACCAU-3’ （配列表・配列番号１７））。該siRNAによるベクターゲノム除去効果を調べるため、オワンクラゲ由来改良緑色蛍光タンパク質（Enhanced green fluorescent protein, EGFP. Clontech社）遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターのゲノムを安定に保持しているBHK/T7細胞を1.0 x 104 /wellになるように48 well プレートに播種し、翌日、最終濃度100 nMになるようにL遺伝子を標的としたsiRNAを導入した。導入から４日後にEGFPの蛍光を顕微鏡により観察した結果、Ｌ遺伝子を標的としたsiRNAを導入した細胞では、陰性対照として用いたホタル luciferase遺伝子を標的としたsiRNAを導入した細胞に比べ、EGFPの蛍光強度が大きく減少していることが分かった（図３Ａ）。
また、siRNAで処理した細胞の一部を12 wellプレートに再播種し、さらに6日間培養したところ、ほぼ全ての細胞でEGFPの蛍光が検出できないことから、EGFP蛍光強度の減少が一過的な遺伝子発現の抑制によるものではなく、ベクターのRNAゲノムが細胞から除去されたことに起因するものであることを確認した（図３Ｂ）。
実施例５
マウス胎児由来線維芽細胞からのマウスiPSマーカー発現細胞の誘導
（１）マウス胎児由来線維芽細胞の調製
妊娠１４日目のマウス（C57BL/6JもしくはNanog-EGFP（Enhanced Green Fluorescent
Protein）ノックインマウス（STOCK Tg(Nanog-GFP,Puro)1Yam））から胎児を摘出し、頭部、四肢、内蔵を除いた後細かく切り刻んでtrypLE Express（Invitrogen）で37℃３０分間処理した。細胞成分以外を沈殿させた後、上清中の細胞を10% ウシ胎児血清（FCS）含有Dulbecco’s Modified Minimal Essential
Medium (DMEM) で培養し、マウス胎児由来線維芽細胞（MEF）を得た。
マウス胎児由来線維芽細胞からのマウスiPSマーカー発現細胞の誘導
（１）マウス胎児由来線維芽細胞の調製
妊娠１４日目のマウス（C57BL/6JもしくはNanog-EGFP（Enhanced Green Fluorescent
Protein）ノックインマウス（STOCK Tg(Nanog-GFP,Puro)1Yam））から胎児を摘出し、頭部、四肢、内蔵を除いた後細かく切り刻んでtrypLE Express（Invitrogen）で37℃３０分間処理した。細胞成分以外を沈殿させた後、上清中の細胞を10% ウシ胎児血清（FCS）含有Dulbecco’s Modified Minimal Essential
Medium (DMEM) で培養し、マウス胎児由来線維芽細胞（MEF）を得た。
（２）マウスiPSマーカー発現細胞の誘導
MEFを12 well plateに1.0 x 105 cells/wellで培養し、翌日に実施例２で作製したhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクター、実施例３で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Myc持続発現用センダイウイルスベクター、及び実施例１２で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2をそれぞれ培地中に加え、室温で２時間感染後に37℃で一晩培養した。マイトマイシンC処理をしたMEFをフィーダー細胞として、ゼラチンコートしたディッシュに準備し、上記ベクター感染細胞を重層して、mouse ES medium（DMEM, 15% FCS, 0.1 mM nonessential amino acids, 0.55 mM 2-ME, 1000 U/ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF)）もしくはKSR medium（Knockout DMEM, 15% KnockOut Serum Replacement (KSR), 2 mM Glutamine, 0.1 mM nonessential amino acids, 0.55 mM 2-ME, 1000
U/ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF)）中で培養した。
MEFを12 well plateに1.0 x 105 cells/wellで培養し、翌日に実施例２で作製したhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクター、実施例３で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Myc持続発現用センダイウイルスベクター、及び実施例１２で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2をそれぞれ培地中に加え、室温で２時間感染後に37℃で一晩培養した。マイトマイシンC処理をしたMEFをフィーダー細胞として、ゼラチンコートしたディッシュに準備し、上記ベクター感染細胞を重層して、mouse ES medium（DMEM, 15% FCS, 0.1 mM nonessential amino acids, 0.55 mM 2-ME, 1000 U/ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF)）もしくはKSR medium（Knockout DMEM, 15% KnockOut Serum Replacement (KSR), 2 mM Glutamine, 0.1 mM nonessential amino acids, 0.55 mM 2-ME, 1000
U/ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF)）中で培養した。
hOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを感染後６日目から、アルカリフォスファターゼ活性陽性（後記（ｂ））のマウスES様細胞のコロニーの形成が確認された（図４）。また、Nanog-EGFPノックインマウス由来MEFを用いた場合にはNanog遺伝子の発現誘導を示すGFP陽性のコロニーが感染後８日目から確認された（図５）。また、RT−PCR（後記（ｃ））により、マウスiPS細胞のマーカーであるマウスNanogとOct4がこれらのコロニーを形成する細胞において誘導されていることを確認した（図６）。また、蛍光抗体法（後記（ａ））により、マウスiPS細胞のマーカーであるマウスSSEA−1が、これらのコロニーを形成する細胞において誘導されていることを確認した（図７）。さらに、ジェノタイピング（後記（ｄ））により、得られたマウスiPSマーカー発現細胞の遺伝子型が最初に遺伝子導入に用いたMEFの遺伝子型と一致する一方で、陽性対照として用いたマウスES細胞とは一致しないことを確認し、マウスiPSマーカー発現細胞がMEFへのhOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Mycの４遺伝子導入により出現したことを裏付けた（図８）。また、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2を用いても同様の結果が得られた。
（３）マウスiPSマーカー発現細胞の誘導効率の検定
持続発現型センダイウイルスベクターで遺伝子導入した細胞のベクターゲノムRNA保持率をNPタンパク質に対する蛍光抗体法（後記（ａ））によって定量し、アルカリフォスファターゼ活性陽性コロニー数（後記（ｂ））をベクター保持率で補正することによって、マウスiPSマーカー発現細胞の誘導効率を算出した結果を表１に示す。
持続発現型センダイウイルスベクターで遺伝子導入した細胞のベクターゲノムRNA保持率をNPタンパク質に対する蛍光抗体法（後記（ａ））によって定量し、アルカリフォスファターゼ活性陽性コロニー数（後記（ｂ））をベクター保持率で補正することによって、マウスiPSマーカー発現細胞の誘導効率を算出した結果を表１に示す。
表１の結果から明らかなように、これまで報告されているレトロウイルスベクター等によってhOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Mycの４遺伝子を導入したiPS細胞作製の報告よりも有意に高い効率でマウスiPSマーカー発現細胞が誘導できることが明らかになった。また、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2を用いても同様の結果が得られた。
実施例６
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの除去によるマウスiPS細胞の作製
実施例５で得たマウスiPSマーカー発現細胞からベクターのゲノムRNAを除去するために、実施例４に従ってＬ遺伝子に対するsiRNAをマウスiPSマーカー発現細胞に導入した。ベクター感染１週間後の植え継ぎ以降、植え継ぎするごとにlipofectamin2000とsiRNAの混合液を培養液中に加えることによってsiRNAを導入した。導入約１週間後には、実施例５に示したセンダイウイルスNPタンパク質に対する蛍光抗体染色（後記（ａ））でベクターのRNAゲノムが細胞中に残存していないコロニーの存在が確認された。さらにそのコロニーをクローニングし、NP遺伝子由来メッセンジャーRNA（mRNA）を検出するRT−PCR法（後記（ｃ））によって確認し、ベクターゲノムが残存していないマウスiPS細胞クローンを得た（図９Ａ）。また、RT−PCR法により（後記（ｃ））、マウスNanog遺伝子とマウスOct4遺伝子の発現を検討し、ベクターRNAを除去した後もこれらのiPS細胞マーカーの発現が持続的に維持されていることを確認した（図９Ｂ）。
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの除去によるマウスiPS細胞の作製
実施例５で得たマウスiPSマーカー発現細胞からベクターのゲノムRNAを除去するために、実施例４に従ってＬ遺伝子に対するsiRNAをマウスiPSマーカー発現細胞に導入した。ベクター感染１週間後の植え継ぎ以降、植え継ぎするごとにlipofectamin2000とsiRNAの混合液を培養液中に加えることによってsiRNAを導入した。導入約１週間後には、実施例５に示したセンダイウイルスNPタンパク質に対する蛍光抗体染色（後記（ａ））でベクターのRNAゲノムが細胞中に残存していないコロニーの存在が確認された。さらにそのコロニーをクローニングし、NP遺伝子由来メッセンジャーRNA（mRNA）を検出するRT−PCR法（後記（ｃ））によって確認し、ベクターゲノムが残存していないマウスiPS細胞クローンを得た（図９Ａ）。また、RT−PCR法により（後記（ｃ））、マウスNanog遺伝子とマウスOct4遺伝子の発現を検討し、ベクターRNAを除去した後もこれらのiPS細胞マーカーの発現が持続的に維持されていることを確認した（図９Ｂ）。
実施例７
マウスiPS細胞からのテラトーマ形成
実施例６で得られたマウスiPS細胞を1.0 x 106 cells/100μL PBS/匹になるように調製し、イソフルラン麻酔下でマウス（C.B17/Icr−scidJcl）の足の付け根の皮下に移植した。接種後２週間ほどたつと、肉眼で確認可能な奇形腫が形成され、移植３０日後に奇形腫を摘出した。ブアン固定液（75％飽和ピクリン酸、12％ホルマリン、3％酢酸）によって固定した後、70%エタノール（１時間）、90%エタノール（１時間）、100%エタノール（１時間、２回）、50%エタノール：50%２−ブタノール（１時間）、100%２−ブタノール（３０分を2回）の処理で脱水した。サンプルをパラフィン固定後、ミクロトームで厚さ6μmの切片を作製した。切片を脱パラフィン後、HE染色により観察した結果、三胚葉すべてへの分化が確認された（図９）。
マウスiPS細胞からのテラトーマ形成
実施例６で得られたマウスiPS細胞を1.0 x 106 cells/100μL PBS/匹になるように調製し、イソフルラン麻酔下でマウス（C.B17/Icr−scidJcl）の足の付け根の皮下に移植した。接種後２週間ほどたつと、肉眼で確認可能な奇形腫が形成され、移植３０日後に奇形腫を摘出した。ブアン固定液（75％飽和ピクリン酸、12％ホルマリン、3％酢酸）によって固定した後、70%エタノール（１時間）、90%エタノール（１時間）、100%エタノール（１時間、２回）、50%エタノール：50%２−ブタノール（１時間）、100%２−ブタノール（３０分を2回）の処理で脱水した。サンプルをパラフィン固定後、ミクロトームで厚さ6μmの切片を作製した。切片を脱パラフィン後、HE染色により観察した結果、三胚葉すべてへの分化が確認された（図９）。
実施例８
ヒト胎児由来線維芽細胞からのヒトiPSマーカー発現細胞の誘導
（１）ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導
ヒト胎児由来線維芽細胞であるTIG3細胞を12 well plateに1.0 x 105 cells/wellで播種し、翌日に実施例４で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクター、及び実施例１２で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2をそれぞれ培地中に加え、室温で２時間放置した後に37℃で一晩培養することによって感染させた。マイトマイシンC処理をしたMEFをフィーダー細胞として、ゼラチンコートしたディッシュ上に準備し、上記ベクター感染細胞をその上に蒔いて、hES medium（DMEM/F12, 20% KnockOut Serum Replacement(KSR), 0.1 mM nonessential amino acids, 0.55 mM 2-ME, 10 ng/ml bFGF）もしくは霊長類ES細胞用培地（ReproCELL）中で培養する。
ヒト胎児由来線維芽細胞からのヒトiPSマーカー発現細胞の誘導
（１）ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導
ヒト胎児由来線維芽細胞であるTIG3細胞を12 well plateに1.0 x 105 cells/wellで播種し、翌日に実施例４で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクター、及び実施例１２で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2をそれぞれ培地中に加え、室温で２時間放置した後に37℃で一晩培養することによって感染させた。マイトマイシンC処理をしたMEFをフィーダー細胞として、ゼラチンコートしたディッシュ上に準備し、上記ベクター感染細胞をその上に蒔いて、hES medium（DMEM/F12, 20% KnockOut Serum Replacement(KSR), 0.1 mM nonessential amino acids, 0.55 mM 2-ME, 10 ng/ml bFGF）もしくは霊長類ES細胞用培地（ReproCELL）中で培養する。
hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクター感染１０日後ほどからヒトES細胞様のコロニーの形成が確認され、アルカリフォスファターゼ活性（後記（ｂ））が確認された（図１１）。また、ＲT−PCR法（後記（ｃ）により、ヒトiPS細胞のマーカーであるヒトNanogが、これらのコロニーを形成する細胞において誘導されていることを確認した。（図１２）。また、蛍光抗体法（後記（ａ））により、ヒトiPS細胞のマーカーであるSSEA-4が、これらのコロニーを形成する細胞において誘導されていることを確認した（図１３）。また、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2を用いても同様の結果が得られた。
（２）ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導効率の検定
持続発現型センダイウイルスベクターで遺伝子導入した細胞のベクターゲノムRNA保持率をNPタンパク質に対する蛍光抗体法によって定量し、アルカリフォスファターゼ活性陽性コロニー数をベクター保持率で補正することによって、ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導効率を算出した。結果を表２に示す。
持続発現型センダイウイルスベクターで遺伝子導入した細胞のベクターゲノムRNA保持率をNPタンパク質に対する蛍光抗体法によって定量し、アルカリフォスファターゼ活性陽性コロニー数をベクター保持率で補正することによって、ヒトiPSマーカー発現細胞の誘導効率を算出した。結果を表２に示す。
[表２]
表２に示される結果から、これまで報告されているレトロウイルスベクターによってhOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Mycの４遺伝子を導入したiPS細胞作製の報告よりも有意に高い効率でヒトiPSマーカー発現細胞が誘導できることが明らかになった。また、hOct4, hSox2,hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2を用いても同様の結果が得られた。
（３）培養条件の違いによるヒトiPSマーカー発現細胞の誘導効率の変化
ヒト胎児由来線維芽細胞からiPS細胞を樹立する場合、37℃, 5%CO2という通常の培養条件では無く、40℃, 2%CO2で培養することにより、樹立効率が約10倍上昇することを見いだした。この現象はhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターと、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2に共通して観察される現象であるが、レトロウイルスベクターでは認められなかった（図１６）。
ヒト胎児由来線維芽細胞からiPS細胞を樹立する場合、37℃, 5%CO2という通常の培養条件では無く、40℃, 2%CO2で培養することにより、樹立効率が約10倍上昇することを見いだした。この現象はhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターと、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2に共通して観察される現象であるが、レトロウイルスベクターでは認められなかった（図１６）。
実施例９
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの除去によるヒトiPS細胞の作製
実施例８で得たヒトiPSマーカー発現細胞を継続して培養することによって、ベクター感染約１ヶ月後には、実施例５に示したセンダイウイルスNPタンパク質に対する蛍光抗体染色でベクターのRNAゲノムが細胞中に残存していないコロニーの存在が確認された。さらにそのコロニーをクローニングし、実施例７に示したNP遺伝子由来メッセンジャーRNA（mRNA）を検出するRT−PCR法によって確認し、ベクターゲノムが残存していないヒトiPS細胞クローンを得た（図１４Ａ）。また、RT−PCR法（後記（ｃ））によりベクターRNAを除去した後もiPS細胞マーカーであるヒトNanogの発現が持続的に維持されていることを確認した（図１４Ｂ）。また、蛍光抗体法（後記（ａ））により、ベクターRNAを除去した後もiPS細胞マーカーであるヒトSSEA-4とOct4の発現が持続的に維持されていることを確認した（図１５）。
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの除去によるヒトiPS細胞の作製
実施例８で得たヒトiPSマーカー発現細胞を継続して培養することによって、ベクター感染約１ヶ月後には、実施例５に示したセンダイウイルスNPタンパク質に対する蛍光抗体染色でベクターのRNAゲノムが細胞中に残存していないコロニーの存在が確認された。さらにそのコロニーをクローニングし、実施例７に示したNP遺伝子由来メッセンジャーRNA（mRNA）を検出するRT−PCR法によって確認し、ベクターゲノムが残存していないヒトiPS細胞クローンを得た（図１４Ａ）。また、RT−PCR法（後記（ｃ））によりベクターRNAを除去した後もiPS細胞マーカーであるヒトNanogの発現が持続的に維持されていることを確認した（図１４Ｂ）。また、蛍光抗体法（後記（ａ））により、ベクターRNAを除去した後もiPS細胞マーカーであるヒトSSEA-4とOct4の発現が持続的に維持されていることを確認した（図１５）。
また、ヒトiPSマーカー発現細胞を37℃, 5%CO2という通常の培養条件では無く、40℃, 2%CO2で継代することにより、ベクターの除去が促進される現象が見いだされた（図１７）。今回使用した持続発現型センダイウイルスベクターは高温（40℃）で遺伝子発現が低下する性質があり、L遺伝子を含むセンダイウイルス遺伝子の発現低下によりベクターの除去が促進された可能性が考えられた。
実施例１０
マウスiPS細胞からのキメラマウス作製
マウスiPS細胞は、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2（実施例１２）を用いて、Nanog-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）ノックインマウス（STOCK Tg(Nanog-GFP,Puro)1Yam））のMEFから、実施例5及び実施例６の方法によって樹立したiPS細胞株KOSM#24を使用した。キメラマウスの作製は参考文献の方法に準じて行った（参考文献：Manipulating
the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Third Edition (Nagy, A., 他著、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003)）。
妊娠2.5日目のICRマウス（メス、６〜８週齢）の子宮からM2 Mediumにより８細胞期胚を回収した。この胚をKSOM培地（Potasium Simplex Optimized Medium）中で、炭酸ガス培養器において1から2時間培養後、マイクロインジェクションに使用した。マウスiPS細胞はトリプシンにより分散させ、マイクロマニピュレーターを使って１０から１５個のiPS細胞を胚の透明帯に開けた小孔から導入した。その後、この胚をKSOM培地中で２４時間培養し、精管結索したオスマウスと交配したメスICRマウス（仮親マウス）の子宮に移植した。
出産後のマウスのキメリズムとその子供への生殖細胞伝播は、毛の色とiPS細胞だけが持つ遺伝子（EGFP）をPCRで検出することで判定し、高いキメリズムと生殖細胞伝播を確認した（図１８）
マウスiPS細胞からのキメラマウス作製
マウスiPS細胞は、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2（実施例１２）を用いて、Nanog-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）ノックインマウス（STOCK Tg(Nanog-GFP,Puro)1Yam））のMEFから、実施例5及び実施例６の方法によって樹立したiPS細胞株KOSM#24を使用した。キメラマウスの作製は参考文献の方法に準じて行った（参考文献：Manipulating
the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Third Edition (Nagy, A., 他著、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003)）。
妊娠2.5日目のICRマウス（メス、６〜８週齢）の子宮からM2 Mediumにより８細胞期胚を回収した。この胚をKSOM培地（Potasium Simplex Optimized Medium）中で、炭酸ガス培養器において1から2時間培養後、マイクロインジェクションに使用した。マウスiPS細胞はトリプシンにより分散させ、マイクロマニピュレーターを使って１０から１５個のiPS細胞を胚の透明帯に開けた小孔から導入した。その後、この胚をKSOM培地中で２４時間培養し、精管結索したオスマウスと交配したメスICRマウス（仮親マウス）の子宮に移植した。
出産後のマウスのキメリズムとその子供への生殖細胞伝播は、毛の色とiPS細胞だけが持つ遺伝子（EGFP）をPCRで検出することで判定し、高いキメリズムと生殖細胞伝播を確認した（図１８）
実施例１１
ヒトiPS細胞からのテラトーマ形成
実施例１４で得られたヒトiPS細胞を1.0 x 106 cells/40 μLHepes Buffered生理食塩水（HBSS）/匹になるように調整する。ネンブタール、イソフルラン麻酔下でマウス（C.B17/Icr-scidJcl）の精巣を露出させ、調整したiPS細胞を注入した後に縫合した。接種後約８週間で、肉眼で確認可能な奇形腫が形成され、移植６０日後に奇形腫を摘出した。ブアン固定液（75％飽和ピクリン酸、12％ホルマリン、3％酢酸）によって固定した後、70%エタノール（１時間）、90%エタノール（１時間）、100%エタノール（１時間、２回）、50%エタノール：50%２−ブタノール（１時間）、100%２−ブタノール（３０分を２回）の処理で脱水した。サンプルをパラフィン固定後、ミクロトームで厚さ６μmの切片を作製した。切片を脱パラフィン後、HE染色により観察した結果、三胚葉すべてへの分化が確認された（図１９）。
ヒトiPS細胞からのテラトーマ形成
実施例１４で得られたヒトiPS細胞を1.0 x 106 cells/40 μLHepes Buffered生理食塩水（HBSS）/匹になるように調整する。ネンブタール、イソフルラン麻酔下でマウス（C.B17/Icr-scidJcl）の精巣を露出させ、調整したiPS細胞を注入した後に縫合した。接種後約８週間で、肉眼で確認可能な奇形腫が形成され、移植６０日後に奇形腫を摘出した。ブアン固定液（75％飽和ピクリン酸、12％ホルマリン、3％酢酸）によって固定した後、70%エタノール（１時間）、90%エタノール（１時間）、100%エタノール（１時間、２回）、50%エタノール：50%２−ブタノール（１時間）、100%２−ブタノール（３０分を２回）の処理で脱水した。サンプルをパラフィン固定後、ミクロトームで厚さ６μmの切片を作製した。切片を脱パラフィン後、HE染色により観察した結果、三胚葉すべてへの分化が確認された（図１９）。
上記実施例５〜１１で用いた確認手段は以下のとおりである。
（ａ）間接蛍光抗体法による遺伝子発現の確認
各細胞におけるヒトOct4, ヒトSox2, ヒトKlf4, ヒト c-Myc, マウスSSEA-1, ヒトSSEA-4, センダイウイルス NP遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子産物に対する抗体を用いて蛍光抗体法で確認した。用いた一次抗体と希釈率は以下の通りである。ヒトOct4: rabbit anti-Oct4 polyclonal antibody (Abcam) [x100]；ヒトSox2: rabbit anti-Sox2 polyclonal antibody (Abcam) [x100]；ヒトKlf4: rabbit anti-Klf4 polyclonal antibody (CeMines) [x100]；ヒトc-Myc: rabbit anti-c-myc polyclonal antibody (Santa Cruz) [x100]；SSEA-1: マウスanti-SSEA-1 monoclonal antibody (Santa Cruz) [x200]；SSEA-4: マウスanti-SSEA-4 monoclonal antibody (Santa Cruz) [x200]；センダイウイルスNP:mouse anti-NP monoclonal antibody [x200]もしくはrabbit anti-NP polyclonal antibody [x1000]
（ａ）間接蛍光抗体法による遺伝子発現の確認
各細胞におけるヒトOct4, ヒトSox2, ヒトKlf4, ヒト c-Myc, マウスSSEA-1, ヒトSSEA-4, センダイウイルス NP遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子産物に対する抗体を用いて蛍光抗体法で確認した。用いた一次抗体と希釈率は以下の通りである。ヒトOct4: rabbit anti-Oct4 polyclonal antibody (Abcam) [x100]；ヒトSox2: rabbit anti-Sox2 polyclonal antibody (Abcam) [x100]；ヒトKlf4: rabbit anti-Klf4 polyclonal antibody (CeMines) [x100]；ヒトc-Myc: rabbit anti-c-myc polyclonal antibody (Santa Cruz) [x100]；SSEA-1: マウスanti-SSEA-1 monoclonal antibody (Santa Cruz) [x200]；SSEA-4: マウスanti-SSEA-4 monoclonal antibody (Santa Cruz) [x200]；センダイウイルスNP:mouse anti-NP monoclonal antibody [x200]もしくはrabbit anti-NP polyclonal antibody [x1000]
（ｂ）アルカリフォスファターゼ染色
培地を除去し、PBSで一回洗浄後、Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector社)を加えて室温で２０〜３０分反応させた。アルカリフォスファターゼ活性を有する細胞は赤色に染色された。
培地を除去し、PBSで一回洗浄後、Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector社)を加えて室温で２０〜３０分反応させた。アルカリフォスファターゼ活性を有する細胞は赤色に染色された。
（ｃ）逆転写Polymerase Chain Reaction法（RT-PCR法）によるマウスNanog, マウスOct 4, ヒトNanog,
センダイウイルスNP遺伝子発現の確認
細胞からISOGEN（Nippon Gene）を用いてtotal RNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型に用い、ランダムプライマーとSuperScript III First strand synthesis system（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した後、以下に示したプライマーを用いて標的となるcDNAをPCR法で増幅し、発現の確認を行った。マウスNanog: 5’-GGAAGCATCGAATTCTGGGA-3’（配列表・配列番号１８（センス鎖））、5’-CGGAGCAGCATTCCAAGGCT-3’（配列表・配列番号１９（アンチセンス鎖））;マウスOct4: 5’-TGAGCCGTCTTTCCACCAGG-3’（配列表・配列番号２０（センス鎖））、5’-ACATGGTCTCCAGACTCCAC-3’（配列表・配列番号２１（アンチセンス鎖））;ヒトNanog: 5’-AGCATCCGACTGTAAAGAAT-3’（配列表・配列番号２２（センス鎖））、5’-CCTCTCCACAGTTATAGAAG-3’（ 配列表・配列番号２３（アンチセンス鎖））;SeV NP: 5’-AGACCCTAAGAGGACGAAGA-3’（配列表・配列番号２４（センス鎖））、5’-ACTCCCATGGCGTAACTCCATAGTG-3’（配列表・配列番号２５（アンチセンス鎖））。
センダイウイルスNP遺伝子発現の確認
細胞からISOGEN（Nippon Gene）を用いてtotal RNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型に用い、ランダムプライマーとSuperScript III First strand synthesis system（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した後、以下に示したプライマーを用いて標的となるcDNAをPCR法で増幅し、発現の確認を行った。マウスNanog: 5’-GGAAGCATCGAATTCTGGGA-3’（配列表・配列番号１８（センス鎖））、5’-CGGAGCAGCATTCCAAGGCT-3’（配列表・配列番号１９（アンチセンス鎖））;マウスOct4: 5’-TGAGCCGTCTTTCCACCAGG-3’（配列表・配列番号２０（センス鎖））、5’-ACATGGTCTCCAGACTCCAC-3’（配列表・配列番号２１（アンチセンス鎖））;ヒトNanog: 5’-AGCATCCGACTGTAAAGAAT-3’（配列表・配列番号２２（センス鎖））、5’-CCTCTCCACAGTTATAGAAG-3’（ 配列表・配列番号２３（アンチセンス鎖））;SeV NP: 5’-AGACCCTAAGAGGACGAAGA-3’（配列表・配列番号２４（センス鎖））、5’-ACTCCCATGGCGTAACTCCATAGTG-3’（配列表・配列番号２５（アンチセンス鎖））。
（ｄ）マウス細胞のジェノタイピング
細胞を採取後、DNeasy Tissue Kit（QIAGEN）を用いてゲノムDNAを抽出した。抽出したDNAに対して、以下に示したプライマーを用いてPCRを行い、サイズの違いによって遺伝子型を判定した。D18Mit4: 5’-ACTGTTGCTGGGGAATGG-3’（ 配列表・配列番号２６（センス鎖））、5’-CCAAGTTCAAAGCTGCTGG-3’（配列表・配列番号２７（アンチセンス鎖）） 、D7Mit44: 5’-TTCTGGCCTCTGTGAAGTAGTG-3’（配列表・配列番号２８（センス鎖））、5’-GTGAAACCATGGTGCAGATG-3’（配列表・配列番号２９（アンチセンス鎖））、D4Mit15: 5’-AGGAATACTGAATGTGGACTTTCC-3’（配列表・配列番号３０（センス鎖））、5’-TCCCTTGATTAACAGAAGACCTG-3’（配列表・配列番号３１（アンチセンス鎖））
細胞を採取後、DNeasy Tissue Kit（QIAGEN）を用いてゲノムDNAを抽出した。抽出したDNAに対して、以下に示したプライマーを用いてPCRを行い、サイズの違いによって遺伝子型を判定した。D18Mit4: 5’-ACTGTTGCTGGGGAATGG-3’（ 配列表・配列番号２６（センス鎖））、5’-CCAAGTTCAAAGCTGCTGG-3’（配列表・配列番号２７（アンチセンス鎖）） 、D7Mit44: 5’-TTCTGGCCTCTGTGAAGTAGTG-3’（配列表・配列番号２８（センス鎖））、5’-GTGAAACCATGGTGCAGATG-3’（配列表・配列番号２９（アンチセンス鎖））、D4Mit15: 5’-AGGAATACTGAATGTGGACTTTCC-3’（配列表・配列番号３０（センス鎖））、5’-TCCCTTGATTAACAGAAGACCTG-3’（配列表・配列番号３１（アンチセンス鎖））
実施例１２．
hOct4,
hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2の作製
（１）ベクターcDNAの作製
hc-Myc遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCTTAGACGCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG-3’（配列表・配列番号３２（N末端側））、5’-GTCCACCGGTCTTACGCACAAGAGTTCCGT-3’（配列表・配列番号３３（C末端側））の２本のプライマーを用いてヒトc-Myc cDNA全長を含むプラスミドpJL1上からヒトc-Myc遺伝子をPCR法で増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、AgeIで切断し、実施例２で作製したpMO084のNheI-Age I間に挿入することによってプラスミドpMO118を得た（図２０）。
hSox2遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-AGTACCTAGGCGCATGTACAACATGATGGAGACGG-3’（配列表・配列番号３４（N末端側））、5’-GTCCGACGTCCTCACATGTGTGAGAGGGGCAGT-3’（配列表・配列番号３５（C末端側））の２本のプライマーを用いてpUC57-Sox2上からヒトSox2遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をAvr II、Aat IIで切断し、pMO118のAvr II-Aat II間に挿入することによって、pMO119を得た（図２０）。
hOct4,
hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2の作製
（１）ベクターcDNAの作製
hc-Myc遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCTTAGACGCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG-3’（配列表・配列番号３２（N末端側））、5’-GTCCACCGGTCTTACGCACAAGAGTTCCGT-3’（配列表・配列番号３３（C末端側））の２本のプライマーを用いてヒトc-Myc cDNA全長を含むプラスミドpJL1上からヒトc-Myc遺伝子をPCR法で増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、AgeIで切断し、実施例２で作製したpMO084のNheI-Age I間に挿入することによってプラスミドpMO118を得た（図２０）。
hSox2遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-AGTACCTAGGCGCATGTACAACATGATGGAGACGG-3’（配列表・配列番号３４（N末端側））、5’-GTCCGACGTCCTCACATGTGTGAGAGGGGCAGT-3’（配列表・配列番号３５（C末端側））の２本のプライマーを用いてpUC57-Sox2上からヒトSox2遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をAvr II、Aat IIで切断し、pMO118のAvr II-Aat II間に挿入することによって、pMO119を得た（図２０）。
hOct4遺伝子増幅用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCGGTTCCCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGG-3’（配列表・配列番３６（N末端側））、5’-GGTCCACGCGTTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCC-3’（配列表・配列番号３７（C末端側））の２本のプライマーを用いてpUC57-Oct4上からヒトOct4遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pMO097のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pMO116を得た。次に、pMO116のCla I-Cla Iフラグメントの向きを入れ替えてpMO120を得た。さらにpMO119のSal I-Mlu I断片とpMO120のSal I-Mlu Iを結合することによりpMO122を得た（図２０）。
5’-ACTAGCTAGCGGTTCCCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGG-3’（配列表・配列番３６（N末端側））、5’-GGTCCACGCGTTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCC-3’（配列表・配列番号３７（C末端側））の２本のプライマーを用いてpUC57-Oct4上からヒトOct4遺伝子をPCR法によって増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pMO097のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pMO116を得た。次に、pMO116のCla I-Cla Iフラグメントの向きを入れ替えてpMO120を得た。さらにpMO119のSal I-Mlu I断片とpMO120のSal I-Mlu Iを結合することによりpMO122を得た（図２０）。
以上によって得られた各プラスミドのうち、pMO085からT7プロモーター配列〜SeV:
1-3655を、pMO122からSeV: 3655-10480を切り出し、l/151をEcoR I切断することによって得たSeV:10480-1538＋lDASHII right armのDNA断片と合わせてクローニングし、l/SeVp (Mp＋Klf4,＋M::Oct4,＋F::Sox2,＋HN::c-Myc)を作製した（図２０）（hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2ゲノム全長に相補的なcDNAは配列表・配列番号３８）。
1-3655を、pMO122からSeV: 3655-10480を切り出し、l/151をEcoR I切断することによって得たSeV:10480-1538＋lDASHII right armのDNA断片と合わせてクローニングし、l/SeVp (Mp＋Klf4,＋M::Oct4,＋F::Sox2,＋HN::c-Myc)を作製した（図２０）（hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2ゲノム全長に相補的なcDNAは配列表・配列番号３８）。
（２）hOct4,
hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2の調製
上記hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2ゲノム全長に相補的なcDNAから、実施例３に記載の方法に従って、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2を調製した。
hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2の調製
上記hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2ゲノム全長に相補的なcDNAから、実施例３に記載の方法に従って、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 2を調製した。
実施例１３
iPS細胞から自動除去されるhOct4, hSox2, hKlf4,
hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3の作製
（１）ベクターcDNAの作製
ES細胞特異的miRNAであるmir-302aの標的配列を４つつなげた配列をクローニングするために、
5’-CCGGTTATCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCA
CTTAGGTACC-3’（配列表・配列番号３９）と
5’-TAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAA-3’
（配列表・配列番号４０）、
5’-TCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAA-3’（配列表・配列番号４１）と
5’-CCGGTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAGGTACC-3’（配列表・配列番号４２）、の２組のオリゴDNAをアニーリングさせた後にライゲーションし、Age Iで切断したpGL4.12（Promega Corp.）にクローニングしてpNK300を得た。
iPS細胞から自動除去されるhOct4, hSox2, hKlf4,
hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3の作製
（１）ベクターcDNAの作製
ES細胞特異的miRNAであるmir-302aの標的配列を４つつなげた配列をクローニングするために、
5’-CCGGTTATCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCA
CTTAGGTACC-3’（配列表・配列番号３９）と
5’-TAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAA-3’
（配列表・配列番号４０）、
5’-TCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAA-3’（配列表・配列番号４１）と
5’-CCGGTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAGGTACC-3’（配列表・配列番号４２）、の２組のオリゴDNAをアニーリングさせた後にライゲーションし、Age Iで切断したpGL4.12（Promega Corp.）にクローニングしてpNK300を得た。
pNK15 (pBluescript II SK(＋)（Agilent Technologies,Inc.）にSeV Cl.151株ゲノムcDNA（9014-15384塩基）−タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列−T7 RNA polymerase終止配列をこの順序で挿入したプラスミドベクター：配列表・配列番号４３)に対してXma I認識配列挿入部位作製用プライマーとして、5’- GACAGCTCGTAATCCCGGGTCCCTATCGTGC -3’（配列表・配列番号４４（センス鎖））5’- GCACGATAGGGACCCGGGATTACGAGCTGTC -3’（配列表・配列番号４５（アンチセンス鎖））を用いて、Quikchange Site-directed Mutagenesis II kit (Agilent Technologies,Inc.) によってXma I認識配列をSeV: 15244の後ろに挿入してpNK287を得た。pNK300をAgeIで切断した断片を、pNK287のXma I部位に挿入することによってプラスミドpNK309を得た（図２１）。
実施例３で作製したpMO103からT7プロモーター配列〜SeV:1-3655を、pMO099からSeV: 3655-10480を切り出し、pNK309からSeV: 9014-15384−ヘアピンリボザイム配列−T7 RNA polymerase終止配列を切り出し、lDASHII right arm、left armのDNA断片と合わせてクローニングし、l/SeVp (Mp＋myc,＋M::Klf4,＋F::Oct4,＋HN::Sox2, L＋mir302T4)を作製した（図２１）（hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3ゲノム全長に相補的なcDNAは配列表・配列番号４６）。
（２）hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3の調製
実施例３. （２）に記載の方法と同様の方法で、上記hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3ゲノム全長に相補的なcDNAから、実施例３に記載の方法でhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion
3を調製した。
実施例３. （２）に記載の方法と同様の方法で、上記hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3ゲノム全長に相補的なcDNAから、実施例３に記載の方法でhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion
3を調製した。
実施例１４
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの、siRNAを用いた細胞からの除去についての経時的検討
実施例４で示した持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムを安定に保持している細胞からsiRNAを用いてベクターゲノムを除去する方法について、さらに除去の経時変化を定量的に解析すると共に、siRNA処理を行った細胞にベクターゲノムが存在しないことを確認した。
持続発現型センダイウイルスベクターによる遺伝子発現のマーカーとして、不安定型ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（Luc2CP, Promega Corp.）と大腸菌ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（HygBpapertrou）を使用した。ルシフェラーゼ活性はゲノムRNAのコピー数を反映し、ハイグロマイシンＢ耐性細胞の数は持続発現型センダイウイルスベクターを保持している細胞の数を反映する。
持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムの、siRNAを用いた細胞からの除去についての経時的検討
実施例４で示した持続発現型センダイウイルスベクターのRNAゲノムを安定に保持している細胞からsiRNAを用いてベクターゲノムを除去する方法について、さらに除去の経時変化を定量的に解析すると共に、siRNA処理を行った細胞にベクターゲノムが存在しないことを確認した。
持続発現型センダイウイルスベクターによる遺伝子発現のマーカーとして、不安定型ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（Luc2CP, Promega Corp.）と大腸菌ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（HygBpapertrou）を使用した。ルシフェラーゼ活性はゲノムRNAのコピー数を反映し、ハイグロマイシンＢ耐性細胞の数は持続発現型センダイウイルスベクターを保持している細胞の数を反映する。
Luc2CP遺伝子とHygB遺伝子を搭載したKO/HygB/EGFP/Luc2CP搭載持続発現型センダイウイルスベクターは、実施例３で示したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターと同じ手法を用い、hOct4遺伝子をKusabira Orange（KO）遺伝子（Medical & Biological Laboratories, Co.Ltd.）で、hSox2遺伝子をHygB遺伝子で、hKlf4遺伝子をEnhanced Green Fluorescent Protein（EGFP）遺伝子で、hc-Myc遺伝子をLuc2CP遺伝子でそれぞれ置換して作製した。Ｌ遺伝子の発現を抑制する2種類のshort interfering RNA（siRNA）（#1：センス鎖 5’-GGUUCAGCAUCAAAUAUGAAG-3’（配列表・配列番号１４）、アンチセンス鎖 5’-UCAUAUUUGAUGCUGAACCAU-3’ （配列表・配列番号１５）は実施例４で使用したものと同じである。
陰性対照siRNAは使用したセンダイウイルスベクターゲノムの塩基配列と相同性が無いウミボタル・ルシフェラーゼ遺伝子（Promega Corp., Rluc）と相補性を持つsiRNAを用いた。
該siRNAによるベクターゲノム除去効果を調べるため、Luc2CP遺伝子とHygB遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターのゲノムを安定に保持しているHeLa細胞を、3x104個／0.4 mL培地（MEM, 10%ウシ胎児血清）／wellの濃度で24-wellプレートに播種した。siRNAは最終濃度40 nMになるようにOpti-MEMで希釈してLipofectamine RNAiMAX（Lifetechnologies, Inc.）1μLを加えて室温２０分反応後、上記細胞に加えた。以後、細胞を経時的に回収し、３日目と６日目に細胞を上記の条件で継代すると同時に、siRNAを上記の条件で細胞に導入した。その結果、細胞内のベクターの量の指標となるルシフェラーゼの活性は経時的に低下し、８日目以降はルシフェラーゼ活性が検出限界となった（図２２Ａ）。
該siRNAによるベクターゲノム除去効果を調べるため、Luc2CP遺伝子とHygB遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターのゲノムを安定に保持しているHeLa細胞を、3x104個／0.4 mL培地（MEM, 10%ウシ胎児血清）／wellの濃度で24-wellプレートに播種した。siRNAは最終濃度40 nMになるようにOpti-MEMで希釈してLipofectamine RNAiMAX（Lifetechnologies, Inc.）1μLを加えて室温２０分反応後、上記細胞に加えた。以後、細胞を経時的に回収し、３日目と６日目に細胞を上記の条件で継代すると同時に、siRNAを上記の条件で細胞に導入した。その結果、細胞内のベクターの量の指標となるルシフェラーゼの活性は経時的に低下し、８日目以降はルシフェラーゼ活性が検出限界となった（図２２Ａ）。
さらにsiRNAを３回導入した細胞を、siRNA非存在下で４週間培養し、次に104個の細胞を200μg/mLのハイグロマイシンＢを含む選択培地中に移してさらに１週間培養した。その結果、ハイグロマイシンＢ耐性クローンは出現せず、HygB遺伝子を搭載した持続発現型センダイウイルスベクターのゲノムを持つ細胞が存在しないことが示された（図２２Ｂ）。
実施例１５
持続発現型センダイウイルスベクターに搭載した２つの外来遺伝子の遺伝子発現様式の検討
iPS細胞の作製には４つの初期化遺伝子が同時に一つの細胞で発現する必要がある。また、４つの初期化遺伝子の発現の強さのバランスを変えることにより初期化効率が変化する（参考文献：Papapetrou, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 106, 12759-12764, 2009）だけでなく、iPS細胞に形態が似ていても多分化能を持たない質の低い細胞株が出現する可能性が指摘されている（参考文献：Chan, et al., Nat. Biotech., 27, 1034-1037, 2009）。そのため、iPS細胞を高効率でかつ再現性良く作製する方法は、１）４つの初期化遺伝子が同時に1個の細胞に導入されること、２）これら４つの遺伝子がすべての細胞で同じバランスで発現すること、の２点を満たす必要がある。持続発現型センダイウイルスベクターを使って４個の初期化遺伝子を細胞に導入する場合、本発明で例示しているようにすべての初期化遺伝子を１つのベクターに搭載して遺伝子導入する方法と、特許文献１、非特許文献１７で示されているように１〜３種類の初期化遺伝子を搭載したベクターを別々に作製してから混合して遺伝子導入する方法が考えられる。そこで、Kusabira Orange（KO）遺伝子とEnhanced Green Fluorescent Protein（EGFP）遺伝子の２つの遺伝子の発現を指標にして、上記の２つの方法における外来遺伝子の発現様式に違いがあるかどうかを検討した。
持続発現型センダイウイルスベクターに搭載した２つの外来遺伝子の遺伝子発現様式の検討
iPS細胞の作製には４つの初期化遺伝子が同時に一つの細胞で発現する必要がある。また、４つの初期化遺伝子の発現の強さのバランスを変えることにより初期化効率が変化する（参考文献：Papapetrou, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 106, 12759-12764, 2009）だけでなく、iPS細胞に形態が似ていても多分化能を持たない質の低い細胞株が出現する可能性が指摘されている（参考文献：Chan, et al., Nat. Biotech., 27, 1034-1037, 2009）。そのため、iPS細胞を高効率でかつ再現性良く作製する方法は、１）４つの初期化遺伝子が同時に1個の細胞に導入されること、２）これら４つの遺伝子がすべての細胞で同じバランスで発現すること、の２点を満たす必要がある。持続発現型センダイウイルスベクターを使って４個の初期化遺伝子を細胞に導入する場合、本発明で例示しているようにすべての初期化遺伝子を１つのベクターに搭載して遺伝子導入する方法と、特許文献１、非特許文献１７で示されているように１〜３種類の初期化遺伝子を搭載したベクターを別々に作製してから混合して遺伝子導入する方法が考えられる。そこで、Kusabira Orange（KO）遺伝子とEnhanced Green Fluorescent Protein（EGFP）遺伝子の２つの遺伝子の発現を指標にして、上記の２つの方法における外来遺伝子の発現様式に違いがあるかどうかを検討した。
KO遺伝子とEGFP遺伝子を同時に搭載したベクターとしては、実施例１４に記載されたKO/HygB/EGFP/Luc2CP搭載持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。また、KO遺伝子を搭載したベクターとしては、実施例２で記述したhOct4,hSox2,hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターからhKLF4遺伝子を除去し、Bsr遺伝子をゼオシン耐性（Zeo）遺伝子で、Oct4遺伝子をKO遺伝子で、Sox2遺伝子を分泌型ルシフェラーゼ（CLuc）遺伝子で置換したZeo/KO/CLuc搭載持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。またEGFP遺伝子を搭載したベクターとしては、実施例２で記述したhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターからhKLF4遺伝子を除去し、Oct4遺伝子をEGFP遺伝子で、Sox2遺伝子を慢性肉芽種症原因遺伝子（gp91phox）で置換したBsr/EGFP/gp91phox搭載持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。
サルLLCMK2細胞に、KO/HygB/EGFP/Luc2CP搭載ベクターを細胞あたり５ベクター粒子の条件で感染させ、ハイグロマイシンＢで選択して、KO/HygB/EGFP/Luc2CP搭載ベクターを保持する細胞プールLLCMK2(SeVdp/KO/HygB/EGFP/Luc2)を樹立した。また、同様にZeo/KO/CLuc搭載ベクターとBsr/EGFP/gp91phox搭載ベクターをベクター粒子比１：１で混合し、それぞれ細胞当たり５ベクター粒子の条件でLLCMK2細胞に感染させた後、ブラストサイジンＳとゼオシンで同時に選択して、この２つのベクターゲノムを同一の細胞中に持つ細胞プールLLCMK2(SeVdp/Zeo/KO/CLuc＋SeVdp/Bsr/EGFP/gp91phox)を樹立した。
この２つの細胞株を蛍光顕微鏡（Zeiss）で観察し、KOが発する蛍光に赤色の疑似カラーを、EGFPが発する蛍光に緑色の疑似カラーを割り当てて画像を重ねたところ、LLCMK2(SeVdp/KO/HygB/EGFP/Luc2)はすべてKOとEGFPが同時に発現していることを示す黄色の画像となったのに対し、LLCMK2(SeVdp/Zeo/KO/CLuc＋SeVdp/Bsr/EGFP/gp91phox)は赤色・黄色・緑色の細胞が混在しており、KOとEGFPの発現のバランスが細胞によって非常に異なっていることが示された（図２３Ａ）
この２つの細胞株を蛍光顕微鏡（Zeiss）で観察し、KOが発する蛍光に赤色の疑似カラーを、EGFPが発する蛍光に緑色の疑似カラーを割り当てて画像を重ねたところ、LLCMK2(SeVdp/KO/HygB/EGFP/Luc2)はすべてKOとEGFPが同時に発現していることを示す黄色の画像となったのに対し、LLCMK2(SeVdp/Zeo/KO/CLuc＋SeVdp/Bsr/EGFP/gp91phox)は赤色・黄色・緑色の細胞が混在しており、KOとEGFPの発現のバランスが細胞によって非常に異なっていることが示された（図２３Ａ）
さらにKOとEGFPの発現のバランスを定量的に解析するため、これらの細胞を蛍光細胞解析装置（Fluorescent-activated Cell Analyzer）（BD FACSCalibur、Becton, Dickinson and Company）で解析した。104個のLLCMK2(SeVdp/KO/HygB/EGFP/Luc2)およびLLCMK2(SeVdp/Zeo/KO/CLuc＋SeVdp/Bsr/EGFP/gp91phox)をそれぞれ２mLの生理的緩衝液に懸濁し、EGFPの蛍光強度（FL1）とKOの蛍光強度（FL2）を測定した。その結果、LLCMK2(SeVdp/KO/HygB/EGFP/Luc2)ではEGFPの蛍光強度とKOの蛍光強度の比が常に一定であるのに対し、LLCMK2(SeVdp/Zeo/KO/CLuc＋SeVdp/Bsr/EGFP/gp91phox)ではその比が非常に分散していることが示された（図２３Ｂ）。またFL1とFL2の比を解析すると、LLCMK2(SeVdp/KO/HygB/EGFP/Luc2)では50%以上の細胞が単一の比を示すのに対し、LLCMK2(SeVdp/Zeo/KO/CLuc＋SeVdp/Bsr/EGFP/gp91phox)では0%から100%の間に広く分布していた（図２３Ｃ）。
以上の結果から、２つ以上の遺伝子を細胞に同時に導入して同じ比率で発現させることは、本発明で実施する４つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載する方法では可能であるが、特許文献１、非特許文献１７で示されているような４つの初期化遺伝子を２つ以上のベクターに分けて別々に搭載する方法では不可能であることが示された。
実施例１６
初期化遺伝子を別々に搭載した持続発現型センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞誘導
本発明で実施している４つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載してiPS細胞を作製する方法と、特許文献１・非特許文献１７で示されているような４つの初期化遺伝子を２つ以上のベクター上に分けて搭載してiPS細胞を作製する方法について、iPS細胞の作製効率の比較を行った。４つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載したベクターとして、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いた。また、４つの初期化遺伝子を２つ以上のベクター上に分けて搭載したベクターとして、実施例２で示したhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターと、初期化遺伝子としてc-Mycだけを搭載したZeo/KO/hc-Myc持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。Zeo/KO/hc-Myc持続発現型センダイウイルスベクターは、hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターのOct4遺伝子をZeo遺伝子で、Sox2遺伝子をKO遺伝子で、Klf4遺伝子をc-Myc遺伝子でそれぞれ置換して作製した。
初期化遺伝子を別々に搭載した持続発現型センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞誘導
本発明で実施している４つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載してiPS細胞を作製する方法と、特許文献１・非特許文献１７で示されているような４つの初期化遺伝子を２つ以上のベクター上に分けて搭載してiPS細胞を作製する方法について、iPS細胞の作製効率の比較を行った。４つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載したベクターとして、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いた。また、４つの初期化遺伝子を２つ以上のベクター上に分けて搭載したベクターとして、実施例２で示したhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターと、初期化遺伝子としてc-Mycだけを搭載したZeo/KO/hc-Myc持続発現型センダイウイルスベクターを用いた。Zeo/KO/hc-Myc持続発現型センダイウイルスベクターは、hOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターのOct4遺伝子をZeo遺伝子で、Sox2遺伝子をKO遺伝子で、Klf4遺伝子をc-Myc遺伝子でそれぞれ置換して作製した。
マウス胎児由来線維芽細胞に、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクター単独、もしくはhOct4, hSox2, hKlf4持続発現用センダイウイルスベクターとZeo/KO/hc-Myc持続発現型センダイウイルスベクターをベクター粒子比１：１で混合したものを実施例５に従って感染させ、iPS細胞コロニーの出現をアルカリフォスファターゼ陽性の細胞コロニーの出現を指標に検定した。その結果、本発明で実施している４つの初期化遺伝子を同一のベクター上に搭載してiPS細胞を作製する方法は、４つの初期化遺伝子を２つのベクター上に分けて搭載してiPS細胞を作製する方法に比較してはるかにiPS細胞作製効率が高いことが示された（図２４）
実施例１７
hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を用いたiPS細胞誘導
TIG3細胞を12 well plateに1.0 x 105 cells/wellで播種し、翌日に実施例３で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Myc持続発現用センダイウイルスベクターもしくは実施例１３で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を培地中に加え、実施例８に従ってヒトiPS細胞を誘導した。
出現したコロニーを２回植え継いだ後の感染２４日後に、コロニーに対してNPタンパクに対する抗体を用いて蛍光染色したところ、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を用いた場合、多くのコロニーでベクターの除去が確認された（図２５）。それに対し、hOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いた場合はベクターがまだ残存していた。
以上の結果から、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を用いてヒトiPS細胞を誘導した場合、誘導されたiPS細胞で発現するmir-302aの働きによって自動的にベクターが除去されることが明らかになった。
hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を用いたiPS細胞誘導
TIG3細胞を12 well plateに1.0 x 105 cells/wellで播種し、翌日に実施例３で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Myc持続発現用センダイウイルスベクターもしくは実施例１３で作製したhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を培地中に加え、実施例８に従ってヒトiPS細胞を誘導した。
出現したコロニーを２回植え継いだ後の感染２４日後に、コロニーに対してNPタンパクに対する抗体を用いて蛍光染色したところ、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を用いた場合、多くのコロニーでベクターの除去が確認された（図２５）。それに対し、hOct4, hSox2, hKlf4, h-c-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いた場合はベクターがまだ残存していた。
以上の結果から、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターVersion 3を用いてヒトiPS細胞を誘導した場合、誘導されたiPS細胞で発現するmir-302aの働きによって自動的にベクターが除去されることが明らかになった。
実施例１８
ヒト末梢血単核細胞からのiPS細胞の樹立
成人の末梢血20mLをPBS(-) 20mLで希釈し、Lymphoprep 6mLに重層して1,800回転３０分の遠心で、血小板を含む上層、単核細胞を含む中間層、赤血球を含む下層に分離した。中間層をPBS(-)で洗浄してヒト末梢血単核細胞とした。この細胞を使い、実施例８の方法に従ってhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを感染させ培養したところ、アルカリフォスファターゼ陽性でヒトES細胞と同様の形態を持ったiPS細胞が出現した（図２６）。ベクターを感染させなかった陰性対照からは、このような細胞コロニーは出現しなかった。
ヒト末梢血単核細胞からのiPS細胞の樹立
成人の末梢血20mLをPBS(-) 20mLで希釈し、Lymphoprep 6mLに重層して1,800回転３０分の遠心で、血小板を含む上層、単核細胞を含む中間層、赤血球を含む下層に分離した。中間層をPBS(-)で洗浄してヒト末梢血単核細胞とした。この細胞を使い、実施例８の方法に従ってhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを感染させ培養したところ、アルカリフォスファターゼ陽性でヒトES細胞と同様の形態を持ったiPS細胞が出現した（図２６）。ベクターを感染させなかった陰性対照からは、このような細胞コロニーは出現しなかった。
実施例１９
持続発現型センダイウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞の遺伝子発現の比較
（１）解析用RNAサンプルの用意
実施例８の方法に従ってhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞を、フィーダー細胞を使わずに、MEF conditioned medium中でマトリゲル（Becton, Dickinson and Company）上に培養し、1.0 x 106細胞ずつ回収する。回収した細胞から、ISOGEN（Nippon Gene Co. Ltd.）を用いて全細胞RNAを抽出した。比較対照のために、京都大学再生医科学研究所で樹立されたヒトES細胞５株を同様に培養して全細胞RNAを抽出した。
持続発現型センダイウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞の遺伝子発現の比較
（１）解析用RNAサンプルの用意
実施例８の方法に従ってhOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞を、フィーダー細胞を使わずに、MEF conditioned medium中でマトリゲル（Becton, Dickinson and Company）上に培養し、1.0 x 106細胞ずつ回収する。回収した細胞から、ISOGEN（Nippon Gene Co. Ltd.）を用いて全細胞RNAを抽出した。比較対照のために、京都大学再生医科学研究所で樹立されたヒトES細胞５株を同様に培養して全細胞RNAを抽出した。
（２）遺伝子発現の解析
0.5μgの全細胞RNAをQuick Amp Labelng Kit（Agilent Technologies, Inc.）を用いてCy3で標識する。標識したRNAはGene Expression Hybridization Kit（Agilent Technologies, Inc.）を用いて、Whole Human Genome (4x44k) DNA array（Agilent Technologies,Inc.）にハイブリダイゼーションさせ、Agilent DNAマイクロアレイスキャナを用いてシグナルを取得する。取得したシグナルはGeneSpringGX10ソフトウェア（Agilent Technologies, Inc.）を用いて解析し、各細胞クローン間の遺伝子発現の相関係数を得た（図２７Ａ）。その結果、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞の遺伝子発現は、その相関係数が0.98以上と極めて近似しており、本発明による方法によって極めて均質なiPS細胞が樹立できることがわかった。さらに、今回解析したヒトiPS細胞はすべて、ヒトES細胞で強く発現しているマーカー遺伝子を、ES細胞と同様に強く発現しており（図２７Ｂ）、ヒトES細胞の遺伝子発現との相関も非常に高かった（図２７Ｃ）。
0.5μgの全細胞RNAをQuick Amp Labelng Kit（Agilent Technologies, Inc.）を用いてCy3で標識する。標識したRNAはGene Expression Hybridization Kit（Agilent Technologies, Inc.）を用いて、Whole Human Genome (4x44k) DNA array（Agilent Technologies,Inc.）にハイブリダイゼーションさせ、Agilent DNAマイクロアレイスキャナを用いてシグナルを取得する。取得したシグナルはGeneSpringGX10ソフトウェア（Agilent Technologies, Inc.）を用いて解析し、各細胞クローン間の遺伝子発現の相関係数を得た（図２７Ａ）。その結果、hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc持続発現用センダイウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞の遺伝子発現は、その相関係数が0.98以上と極めて近似しており、本発明による方法によって極めて均質なiPS細胞が樹立できることがわかった。さらに、今回解析したヒトiPS細胞はすべて、ヒトES細胞で強く発現しているマーカー遺伝子を、ES細胞と同様に強く発現しており（図２７Ｂ）、ヒトES細胞の遺伝子発現との相関も非常に高かった（図２７Ｃ）。
Claims (21)
- ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の全てが欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycとをゲノムとして有することを特徴とする初期化遺伝子搭載センダイウイルス。
- ウイルス粒子であることを特徴とする、請求項１に記載のセンダイウイルス。
- Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子の各機能の欠損が、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子に対する初期化遺伝子および／またはマーカー遺伝子の挿入あるいは置換によるものであることを特徴とする、請求項１または２に記載のセンダイウイルス。
- 請求項１〜３のいずれかに記載のセンダイウイルスからなる、誘導多能性細胞作成用初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター。
- 請求項１〜３のいずれかに記載のセンダイウイルスからなり、誘導多能性幹細胞の作製において使用する分化細胞の発現マイクロRNAmir-302aの標的配列をゲノム上に持つ、誘導多能性細胞作成用初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター。
- ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子のからなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の全てが欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が、Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycとがクローニングベクターに挿入されていることを特徴とする、初期化遺伝子搭載センダイウイルス作成用鋳型ベクター。
- Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子の各機能の欠損が、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子あるいはＨＮ遺伝子に対する初期化遺伝子および／またはマーカー遺伝子の挿入あるいは置換によるものであることを特徴とする、請求項６に記載の鋳型ベクター。
- クローニングベクターがファージベクターであることを特徴とする、請求項６または７に記載の鋳型ベクター。
- ファージベクターがλファージベクターであることを特徴とする、請求項８に記載の鋳型ベクター。
- ＤＮＡからなることを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載の鋳型ベクター。
- 請求項１０に記載の鋳型ベクターであって、誘導多能性幹細胞の作製において使用する分化細胞の発現マイクロRNAmir-302aの標的配列に相補的な配列を有する鋳型ベクター。
- 請求項６〜１１のいずれかに記載の鋳型ベクターが導入されていることを特徴とする細胞。
- さらに、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子が少なくとも導入されているか、あるいはさらにＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子が導入されていることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞。
- T7 RNA polymeraseが発現していることを特徴とする、請求項１３に記載の細胞。
- 請求項１２〜１４のいずれかに記載の細胞を培地に培養することにより、ＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬの各遺伝子からなるセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子がセンダイウイルスＣｌ．１５１株由来の遺伝子であって、該Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能の全てが欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が Ｌタンパク質における１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列をコードする遺伝子であるセンダイウイルス遺伝子と、初期化遺伝子Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycとをゲノムとして有するセンダイウイルス粒子を採取することを特徴とする、初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの製造方法。
- 請求項４に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、次いで該ベクターに対する、配列番号１４のセンス鎖及び配列番号１５のアンチセンス鎖、又は、配列番号１６のセンス鎖及び配列番号１７のアンチセンス鎖から構成されるsiRNAを作用させて、該細胞から初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを除去することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 上記siRNAが、センダイウイルスのＬタンパク質を標的とすることを特徴とする、請求項１６に記載の製造方法。
- 配列番号１４のセンス鎖及び配列番号１５のアンチセンス鎖、又は、配列番号１６のセンス鎖及び配列番号１７のアンチセンス鎖から構成される、センダイウイルスのＬタンパク質を標的とするsiRNA。
- 請求項１８に記載のsiRNAからなる、分化細胞初期化後の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターの除去用試薬。
- 請求項５に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、誘導多能性幹細胞を形成後、該初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを自動的に除去する誘導多能性幹細胞の製造方法であって、上記分化細胞がマイクロRNAmir-302aを発現する細胞であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 請求項４または５に記載の初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクターを分化細胞に感染させ、分化細胞の初期化を行い、次いで４０℃、２％ＣＯ２の条件で培養して、該細胞からの初期化遺伝子搭載センダイウイルスベクター除去を促進することを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
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