TWI696700B - 使用具有匿跡性之ｒｎａ的基因表現系統及含有該ｒｎａ的基因導入、表現載體 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的係提供一種技術，其係在包含人類細胞之動物細胞中，使用該細胞具有之先天免疫機制無法辨識之結構經最佳化的核糖核酸，而可同時且安定地表現複數個例如6個以上任意的外來基因之技術。
本發明係藉由使用匿跡型RNA基因表現系統而可解決上述課題，該匿跡型RNA基因表現系統係不使先天免疫機制被活化之複合體，其係包含：含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)、與單股RNA結合之蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)。
(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域之源自在動物細胞表現的mRNA之RNA序列、 (3)前述RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號序列、(4)該酵素辨識之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白質的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列。

Description

使用具有匿跡性之RNA的基因表現系統及含有該RNA的基因導入、表現載體
本發明係關於一種用於在動物細胞中導入且持續表現外來基因的載體。
在包含人類細胞的動物細胞中自外部導入任意的基因並且於該細胞中持續地表現之技術，係在使用生物科.技的各種產業中所必須的技術。例如，為了大量生產產業用之作為醫藥品被使用的人類/單株抗體，必須有使免疫球蛋白的H鏈及L鏈基因持續表現相同程度之技術。又在先天性代謝疾病的基因治療中，必須有將治療用基因導入人類的組織細胞中，並且在體內長期間安定表現之技術。
1. 關於細胞重編程(reprogramming)技術
近年來，使用基因進行正常組織細胞的性質轉換而作出有用的細胞之細胞重編程技術受到注目，然而在動物細胞中導入基因並且持續表現之技術，即使在細胞重編程中亦是不可缺少的基礎技術。例如，將稱為OCT4、SOX2、 KLF4、c-MYC或OCT4、SOX2、NANOG、LIN28之4個基因組合並且導入人類正常纖維母細胞中，使該基因持續表現歷時21日而可製作出人類誘導多能性幹細胞(iPS細胞，induced pluripotent stem cell)(專利文獻1、專利文獻2、非專利文獻1、非專利文獻2)。又，在人類的纖維母細胞中導入稱為FOXA3、HNF1A、HNF4A之3個基因並且使其持續表現14日而可製作出肝細胞(非專利文獻3)。進一步，亦有報告指出在人類的纖維母細胞中導入稱為ASCL1、BRN2、MYT1L、LMX1A、FOXA2之5個基因並且使其持續表現24日，可製作出多巴胺生成神經元(dopaminergic neuron)(非專利文獻4)。因此，在各種細胞重編程中同時導入複數個基因且表現，並且在重編程的必要期間內維持其表現之技術為必要。
已知在生體內亦可誘導細胞重編程。例如，由於已有報告指出在老鼠的心肌梗塞模式中，對梗塞部位進行GATA4、MEF2C、TBX5等3個基因、或者是GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5等4個基因投藥後，浸潤之纖維母細胞轉換成心肌細胞(非專利文獻5、非專利文獻6)，因此細胞重編程技術係被期待在將來成為心肌梗塞或脊髓損傷等再生醫療的基礎。
2. 細胞重編程之效率提升
再者，假定將體外的細胞重編程使用於醫療中，作為材料的細胞係被期望可以不侵入人體之方式進行採取，並且可在不被體外的微生物汙染的狀態下進行採取。滿足該 等條件的細胞幾乎限定為末梢血液中的單核細胞，因此期望有適用於該等細胞之基因導入載體。
一般而言，動物細胞藉由自外部導入之基因而被重編程之效率非常低，惟該等基因皆搭載於1個載體上，並以一次導入細胞中並使其表現之方式可提高重編程之效率(專利文獻3、專利文獻4、非專利文獻7、非專利文獻8)。
又，已知增加在細胞重編程中使用之基因數，可提升其效率。例如，已知將老鼠纖維母細胞轉換成誘導多能性幹細胞(iPS細胞)之技術中，以在OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC之4個基因中追加BRG1及BAF155之2個基因總共使用6個基因之方式，轉換效率可提升5倍(專利文獻9)。又，已知將人類纖維母細胞重編程為運動神經之技術中，在稱為LHX3、ASCL1、BRN2、MYT1L之4個基因中追加稱為HB9、ISL1、NGN2之3個基因總共使用7個基因之方式下，重編程的效率可提升100倍(非專利文獻10)。
若在細胞重編程中使用之基因數增加，則必須搭載的基因尺寸亦增大。以製作iPS細胞之情況為例，KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC之4個基因共4,774個鹼基對，然而追加上述之BRG1(5,040個鹼基對)及BAF155(3,318個鹼基對)2個基因時，總計成為13,132個鹼基對(非專利文獻9)。又，在KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC之4個基因中追加編碼有染色質重塑(Chromatin remodeling)因子之CHD1基因(5,133個鹼基對)時，該基因在胚胎幹細胞中有特異表現而 預測將加速iPS細胞的初期化，總計成為9,907個鹼基對，追加編碼有DNA去甲基化酵素之TET1基因(6,429個鹼基對)時，總計成為11,203個鹼基對。又，在人類纖維母細胞重編程為運動神經之技術中所使用之LHX3、ASCL1、BRN2、MYT1L、HB9、ISL1、NGN2的7個基因總計為9,887個鹼基對(非專利文獻10)。
因此，為了提升細胞重編程的效率，期望使用至少6個以上的基因，並且期望將該等基因全部一次搭載的載體。又，導入之外來基因的尺寸總計為5,000個鹼基以上，故期望的是即使鹼基為8,000個以上亦能表現之載體。
再者，本說明書中所謂之載體係指以含有外來基因之核酸作為成分，將該核酸導入動物細胞中可表現該核酸，並且為基因重組病毒或非病毒性的核酸/高分子物質複合體者。
又，使外來基因表現而進行動物細胞的重編程時，已知該基因的表現程度對藉由重編程而製作之細胞性質有巨大的影響。例如，使OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC等4個基因在老鼠纖維母細胞表現時，已知相對於該等基因表現弱時產生之iPS細胞，該等基因表現強時將產生與iPS細胞幾乎不同性質的細胞(非專利文獻11)。因此，對在包含人類細胞的動物細胞中使自外部導入之基因進行重編程的技術而言，必須有經設定為使該等基因的表現為符合目的的最佳程度之載體。
3. 重編程用基因的去除
進一步，為了使藉由自外部導入的基因進行細胞重編程而製作之細胞能完全地發揮其功能，必須將該等重編程用基因自該細胞中完全地去除。又，製作之人類細胞作為再生醫療的材料使用時，亦為了確保安全性，必須將該等基因自該細胞中完全地去除。例如，使用OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC之4個基因製作的誘導多能性幹細胞(iPS細胞)中，由於該等4個基因仍舊表現時無法發揮多能性，相較於至少完全地抑制該等基因的表現，更期望的是必須將該等基因自細胞完全地去除(專利文獻1、專利文獻2、專利文獻3、非專利文獻1、非專利文獻2、非專利文獻7)。又，若製作iPS細胞時使用之c-MYC基因殘留於該iPS細胞中時，已知將使該iPS細胞再分化而製作之組織細胞以高機率癌化(非專利文獻12)。因此，為了確保安全性，必須將該c-MYC基因自iPS細胞完全地去除。
據此，在細胞重編程中必要的基因表現技術，係必須兼具有一方面為了重編程的達成而期望有持續最佳程度的基因表現，另一方面亦要求一旦重編程完成時可簡單且完全地去除該基因如此矛盾之性質。
4. 迴避先天免疫機制的活化之重要性
現在，在動物細胞中使用之基因導入/表現載體幾乎皆係以感染動物的病毒或使用大腸桿菌等微生物製造之質體(plasmid)DNA作為材料使用。然而，動物細胞係為了擊退自外部侵入的病原體而具備有先天免疫機制(非專利文獻13)，自細胞外導入之源自病毒或微生物的核酸係作為異物 被辨識而活化先天免疫機制。由於超過先天免疫機制活化程度之等級時，將藉由細胞凋亡(apoptosis)誘導細胞死亡，造成重編程的效率降低。又，藉由先天免疫機制的活化而誘導干擾素或發炎型細胞激素的表現時，在生體內引起炎症。為了防止上述不期望的反應發生，進行細胞重編程之基因的導入/表現技術係被要求迴避先天免疫機制的活化。對於在前述1.所述之含有在生體內的細胞重編程之再生醫療的應用上，此性質特別重要。
5. 作為理想的細胞重編程之基因導入/表現系統
由以上的檢討，為了使用基因進行包含人類細胞的動物細胞重編程之技術進一步改良而應用於產業上，如上述1.至4.所檢討，基因導入/表現技術係必須至少滿足下述5個條件。
(1)可高效率地將外來基因導入至包含人類末梢血液細胞之動物細胞。
(2)該基因可在必要的任意期間持續地表現。
(3)該基因表現之際可迴避細胞具有之先天免疫機制。
(4)即使導入之外來基因長總計為5,000個鹼基以上，期望為8,000個鹼基以上仍可表現。
(5)至少6個，期望為8個以上的該基因可同時表現。
此外，更強烈期望可進一步達成以下點。
(6)可調節該等基因的表現程度。特別是導入基因為 複數個時，較佳為各基因的表現程度可個別調節。
又，特別是將基因導入細胞應用於移植技術時，下述點亦成為極重要之點。
(7)當該基因成為不要時，可以簡單的方法去除。
6. 對動物細胞之複數個基因導入技術
在包含人類細胞的動物細胞中自外部導入複數個基因並且在該細胞中持續地表現之技術，已被報告可在細胞重編程中使用之技術已知有下述3個：
(1)將該基因插入至細胞核內的基因體DNA之方法，
(2)在細胞核內將該基因搭載於可獨立於基因體DNA且安全地存在的DNA之方法，
(3)將該基因搭載於存在於細胞質的RNA之方法。
6-1. 將複數個基因插入至細胞核內的基因體DNA之方法
使用慢病毒載體(lentiviral vector)(非專利文獻8、非專利文獻14)/跳躍子(transposon)(非專利文獻15、非專利文獻16)/非同源重組/同源重組等將外來基因插入至細胞核內之基因體DNA中，該基因係可與基因體DNA同等且安定地存在。然而，該基因一旦被插入基因體DNA後，為了選擇性地僅將該基因自基因體DNA去除，除了必須有導入序列特異性重組酵素至細胞等繁雜的作業之外，並非可確實地將該基因在全部的細胞中去除(非專利文獻15)。再者，由於對基因體DNA插入外來基因係使宿主細胞的DNA複製成為必須，對血液細胞等增殖能力低的細胞進行基因導入 之效率極低。進一步，由於將外來基因以隨機方式插入基因體DNA中，已知有引起宿主的基因破壞及異常活化之稱為「插入變異」現象，為了醫療應用係存在有安全性的疑慮(非專利文獻17)。
6-2. 在細胞核內將複數個基因搭載於與基因體DNA為獨立且安全地存在的DNA之方法
作為在細胞核內將外來基因搭載於可獨立於基因體DNA且安全地存在的DNA之方法，已知使用搭載有EB疱疹病毒(Epstein-Barr virus)之基因體複製起點的環狀DNA之方法(非專利文獻18)，以及使用含有直鏈狀巨大DNA之人造染色體之方法(非專利文獻19)。該等DNA分子係在人類細胞的細胞核內持續複製且安定地維持，惟該機制係依賴於宿主細胞的基因體DNA之複製機制。因此，不能僅特定阻礙搭載有外來基因之DNA的複製，並且尚未報告有將該DNA自細胞積極地去除之技術。再者，由於為了將該DNA分子導入至細胞核內必須有宿主細胞的分裂，因此對血液細胞等增殖能力低的細胞進行基因導入之效率極低。又，由於細胞核內的環狀DNA已知有高機率合併入該細胞的基因體DNA，故無法排除插入變異的危險性(非專利文獻20)。
6-3. 自同一個載體DNA表現複數個基因之技術
再者，使用將上述6-1.及6-2.中記載之DNA進行基因表現的平台時，自同一個載體DNA表現複數個基因之技術 成為必須。作為該技術已知有3個方法：1)將複數個獨立的基因單純地連結後表現之方法、2)使用稱為內核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)之RNA結構，自一股傳訊RNA(mRNA)表現複數個蛋白質之方法、3)將以2A胜肽連結複數個蛋白質之融合蛋白表現之方法。
將複數個獨立的基因連結之方法係已知由於基因間的相互干涉而強力抑制基因的表現(非專利文獻21)。為了防止上述之情況，必須在基因間插入稱為絕緣子(insulator)之結構，將使載體DNA的尺寸變大同時結構亦變複雜。此方法雖報告有使1個DNA分子搭載有4個基因之例(非專利文獻22)，惟尚未報告有將5個以上基因同時表現之例。
使用IRES序列，自一股傳訊RNA(mRNA)表現複數個蛋白質之方法，相較於被設置於IRES序列上游之蛋白質的轉譯效率，被設置於IRES序列下流之蛋白質的轉譯效率較低，並且有成為10%以下之情形(非專利文獻23)。再者，由於IRES序列的尺寸相對較大且結構複雜，使用IRES序列之方法主要用於同時表現2個蛋白質。
2A胜肽係在正單股RNA病毒中發現之包含18至22個胺基酸殘基之結構，以2A胜肽連結有複數個蛋白質之融合蛋白係在合成時被自動切斷，分解為原本的複數個蛋白質。在此技術中，切斷後產生之各個蛋白質的N端殘留有1個脯胺酸，C端殘留有17至21個胺基酸殘基，該等多餘的胺基酸殘基可能對該蛋白基功能產生影響(非 專利文獻24)。再者，由於2A胜肽部位的切斷效率受到融合蛋白結構的巨大影響，為了製作高效率的複數個蛋白質必須要努力地進行試誤(非專利文獻25)。以2A胜肽連結複數個蛋白質之方法係報告有同時表現4個蛋白質之例(非專利文獻8)以及同時表現5個蛋白質之例(非專利文獻16)。又，亦報告有將IRES序列與2A胜肽組合而表現4個蛋白質之例(非專利文獻14)。
6-4. 將複數個基因搭載於存在於細胞質的RNA之方法
如前述6-1.至6-3.所記載，作為DNA基因表現平台所使用之目前的基因導入/表現技術係報告有使用4至5個基因之細胞重編程。惟，作為DNA基因表現平台的使用限制，無法容易地同時搭載6個以上基因以及無法容易地以簡單的方法達成基因的去除，亦尚未報告有可令前述5.所示之理想的重編程中所要求之5個條件全部滿足之技術。
另一方面，將RNA作為平台，將複數個基因自外部導入至包含人類細胞的動物細胞並表現，而作為細胞重編程技術係已報告有使用正股RNA之技術(非專利文獻26、非專利文獻27)，以及使用負股RNA之技術(專利文獻3、專利文獻4、專利文獻5、專利文獻6、專利文獻7、非專利文獻28、非專利文獻29、非專利文獻30)。
6-4-1. 使用正股RNA之方法
使用可在細胞質安定存在之正股RNA作為細胞重編程技術已報告有使用源自委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis，VEEV)的正單股RNA之技術(非專利文獻26)。此技術係藉由將VEEV的基因體RNA 3’端的結構基因替換成編碼有以2A胜肽連結蛋白質之基因，而實現4個蛋白質的表現。此系統係引起非常強的干擾素表現誘導，故必須與抗干擾素物質(源自牛痘病毒(Cowpox virus)的B18R蛋白質)組合。再者，基因導入的效率係依賴於組合的基因導入試劑，重編程的可能性被限定於纖維母細胞等黏著性的細胞。由於搭載外來基因的RNA不安定，B18R蛋白質被自培養基去除而消失。
使用正股RNA作為細胞重編程技術亦報告有使用化學合成之傳訊RNA(mRNA)之技術(非專利文獻27)。此先前技術係將最多5個外來基因分別搭載於複數個mRNA並混合之後使用基因導入試劑導入細胞中，由於基因表現是短暫性的，故必須每日重新導入基因至該細胞中。再者，基因導入的可能性係限定於纖維母細胞等黏著性細胞。由於此技術亦強力活化先天免疫機制，故必須與抗干擾素物質(源自牛痘病毒的B18R蛋白質)組合(非專利文獻27)。
6-4-2. 使用負股RNA之方法
使用負股RNA作為細胞重編程之技術已報告有在一種副黏液病毒(Paramyxovirus)之仙台病毒(Sendai virus)野生種中混合分別搭載有外來基因的載體之使用方法(專利文獻5、非專利文獻28、非專利文獻29)，或同時搭載有3個基因之方法(專利文獻6、非專利文獻30)作為先前技術。 該等使用負股RNA之基因表現系統由於缺少F基因，因此野生型病毒的自主複製能力減弱，外來基因係各自作為單獨的基因表現匣被搭載。雖然沒有記載關於先天免疫機制的活化，惟已知作為素材的仙台病毒具有強干擾素誘導能力(非專利文獻31)，據此考量該載體亦具有先天免疫機制的活化能力。再者，亦報告有在野生型病毒的基因體中導入溫度感受性變異，使培養溫度上升而可去除載體(專利文獻6、非專利文獻29、非專利文獻30)。以野生型仙台病毒作為基礎之載體可表現的基因尺寸已報告有3078個鹼基對(大腸桿菌β-半乳糖苷酶(β-galactosidase))(非專利文獻32)至3450個鹼基對(KLF4、OCT4、SOX2之3個基因的總計)(專利文獻6、非專利文獻30)。
再者，使用負股RNA作為細胞重編程技術已報告有以持續感染變異的仙台病毒為基礎之技術(專利文獻3、專利文獻4、非專利文獻7)。此技術中，作為載體素材之病毒基因體中之與長期持續性相關的複數個點突變已被確認，該等變異顯示與迴避先天免疫機制的活化(干擾素的表現低下)相關。又，自病毒基因體去除3個基因後搭載新基因之方式可使4個外來基因同時地表現。進一步，報告有以小干擾片段RNA(short interfering RNA，siRNA)抑制編碼有RNA依賴性RNA合成酵素L基因的表現，而主動地將載體自細胞去除。以持續感染變異仙台病毒為基礎的載體亦報告可表現的基因尺寸為4,774個鹼基對(KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC之4個基因的總計)(專利文 獻3、專利文獻4、非專利文獻7)。
7. 複數個基因導入技術今後的課題
前述6-4.所述之將RNA作為基因表現平台使用之目前的基因導入/表現技術已報告有使用4個至5個基因的細胞重編程。該等之中，具有最佳性質的是前述6-4-2.所述之持續表現缺失型仙台病毒載體，惟已報告之可搭載之基因數為最多4個。再者，RNA病毒作為素材之技術中使基因表現的程度變化是困難的。
如前述6.所述，將複數個基因自外部導入至包含人類細胞的動物細胞並在該細胞中持續地表現之技術，係以使用基因進行正常組織細胞的性質轉換而做出有用細胞的細胞重編程並將其最佳化為目標，而進行各式改良。惟，如前述5.所述之可完全滿足對理想的重編程所要求的5個條件之技術到目前為止尚未被報告。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開WO 2007/069666
專利文獻2：國際公開WO 2008/118820
專利文獻3：國際公開WO 2010/134526
專利文獻4：國際公開WO 2012/063817
專利文獻5：國際公開WO 2010/008054
專利文獻6：國際公開WO 2012/029770
專利文獻7：美國專利第8,326,547號說明書
專利文獻8：美國專利第8,401,798號說明書
專利文獻9：美國專利第7,561,973號說明書
非專利文獻
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如上述，為了使用基因進行包含人類細胞之動物細胞重編程而被期望之基因導入/表現技術，本發明欲解決之一個課題係開發使用於該技術的載體。進一步，本發明提供之載體係不限定於重編程基因，可搭載全長為5,000個鹼基以上或至少6個以上的外來基因，並且不使動物細胞中的先天免疫機制活化且可持續表現的載體。再者，本發明亦提供可有效率地在載體上搭載6個以上外來基因之方法。
此外，本發明提供之基因導入/表現技術特別可滿足對於重編程技術而言所期望的下述(1)至(5)的條件，較佳為進一步提供可滿足包含(6)、(7)條件之技術。
(1)可高效率的導入外來基因至包含人類末梢血液細胞之動物細胞。
(2)該基因可在必要的任意期間持續地表現。
(3)該基因表現之際可迴避細胞具有之先天免疫機 制。
(4)即使導入之外來基因長總計為5,000個鹼基以上，期望為8,000個鹼基以上仍可表現。
(5)至少6個，期望為8個以上的該基因可同時表現。
(6)可調節該等基因的表現程度。特別是導入基因為複數個時，較佳為各基因的表現程度可個別調節。
又，特別是應用於移植技術時，下述點亦成為重要之點。
(7)當該基因成為不要時，可以簡單的方法去除基因表現系統。
如先前技術6-1.至6-3.所述，將DNA作為基因表現平台使用時，其係具備有本發明欲解決課題中所示之理想的重編程所要求的5個條件，更佳為全部7個條件，原理上而言極為困難。另一方面，如同6-4.所述，將RNA作為基因表現平台使用時，要如何將在同一個載體上可搭載的基因數上限提升為6個以上且全基因長為5,000個鹼基以上，並且如何迴避源自病毒的RNA所引起的細胞內先天免疫機制活化成為最大的課題。
在此，本發明係使用源自(亦即，由來自)不會活化先天免疫機制之動物細胞的RNA作為素材，首先設計出使該等RNA與RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號/轉錄終止訊號/複製起點組合的負單股RNA。接著，將編碼有RNA依賴性RNA合成酵素等轉錄與複製 所必須的4個蛋白質基因，以成為不被先天免疫機制辨識為異物之方式進行結構最佳化而搭載於此負單股RNA。進一步，開發一種使用5種限制酵素將經過設計之10個基因結合的新方法，將與此10個基因互補的cRNA搭載於上述之負單股RNA。
將藉由上述方法完成的負單股RNA作為基因表現平台使用時，成功搭載至少10個外來基因(總計尺寸為至少13.5千個鹼基)，並且不活化先天免疫機制下可長期間持續地表現。進一步，在改變基因表現所必須的N蛋白或C蛋白的表現效率下，搭載的基因表現可以最大為80倍的範圍進行調節。據此，盡可能排除具有源自病毒結構的RNA，成功地製造出一種新穎的基因表現系統，其大幅超過使用RNA病毒的基因體之先前的基因表現系統之能力界限。
進一步，在具有本發明所製造之搭載有外來基因之負單股RNA的細胞中，根據專利文獻3及非專利文獻33/非專利文獻7所記載之方法使副黏液病毒的外鞘蛋白與基質蛋白(matrix protein)表現下，將該RNA分子內封，並製作出具有導入至其它細胞的活性之粒子。此粒子係在包含人類血液細胞的各式各樣動物細胞中，將先天免疫機制的活化抑制為低，並且可持續地表現搭載於該RNA分子上的10個基因。更甚者，藉由將與該RNA分子所搭載之經結構最佳化的RNA依賴性RNA合成酵素基因互補的siRNA導入至該細胞，可將搭載有外來基因的RNA分子去除。藉由上述方法，除了[發明欲解決課題中]所示之(1) 至(5)的5個課題之外，亦包含前述較佳情況之課題(6)、(7)，確認可解決全部7個課題，進而完成本發明。
本發明中使用之RNA分子由於缺少作為先天免疫機制辨識所必須的「病原微生物相關分子型態(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)」，故該RNA顯示難以被先天免疫系統捕捉的「匿跡性」。因此，後述將該RNA分子稱為「具有匿跡性之RNA」，使用該RNA作為素材的基因表現系統稱為「匿跡型RNA基因表現系統」，具有將該表現系統內封並將該基因表現系統導入至動物細胞之活性的結構物稱為「匿跡型RNA載體」。
亦即，本發明係如下所述。
[1]一種匿跡型RNA基因表現系統，其係不使先天免疫機制活化的複合體，該複合體包含含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)、單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)：(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域之源自在動物細胞表現的mRNA之RNA序列、(3)前述RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號序列、(4)該酵素所辨識之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素的RNA序列，且為針對導入對象細 胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列。
此處，由於典型的導入對象細胞為人類細胞，較佳情形之態樣可如下述記載。
[1’]一種匿跡型RNA基因表現系統，其係不使先天免疫機制活化的複合體，該複合體包含含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)、單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)：(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域之源自人類mRNA之RNA序列、(3)前述RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號序列、(4)該酵素所辨識之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素之RNA序列，且為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列、 (8)編碼有前述單股RNA結合蛋白質的RNA序列，且為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列。
[2]如前述[1]記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(1)之目標RNA序列係含有至少6個基因，或全長為5,000個鹼基以上長度的RNA序列。
此處，目標RNA序列係可含有7至10個基因，或全長為5,000至15,000個鹼基長度之RNA序列。
[3]如前述[1]或[2]記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(2)之RNA序列係人類基因的mRNA序列中的5至49個鹼基長的RNA序列。
此處，作為前述人類基因的mRNA序列較佳為人類管家(House-keeping)基因的mRNA序列，更佳為人類管家基因的mRNA序列中的非編碼區域序列，例如可使用(表1)中記載的RNA序列，或其中連續的5至49個鹼基長的部分序列，又或者將其連結複數個。
[4]如前述[1]至[3]中任一項記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，包含相同或不同序列的前述(2)之RNA序列，其配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之各基因序列的3’末端側及/或5’末端側。
[5]如前述[1]至[4]中任一項記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(6)之RNA序列所編碼的RNA依賴性RNA合成酵素，其為源自屬於副黏液病毒科的RNA病毒之L蛋白質及P蛋白質、 前述(7)之RNA序列所編碼的調節該酵素活性之蛋白質，其為源自與該RNA病毒相同的病毒之C蛋白質、前述(8)之RNA序列所編碼的單股RNA結合蛋白質，其為源自與該RNA病毒相同的病毒之NP蛋白質，並且前述(3)至(5)之RNA序列均為源自與該RNA病毒相同的病毒之基因體序列中之含有轉錄起始訊號、轉錄終止訊號、以及複製起點之RNA序列。
[6]如前述[5]記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，編碼有前述L蛋白質、P蛋白質、C蛋白質以及NP蛋白質之RNA序列係針對人類細胞經最佳化者，並且該RNA序列的GC含量被調整為50至60%的範圍內。
[7]如前述[6]記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，屬於前述副黏液病毒科之RNA病毒為選自仙台病毒、人類副流感病毒(Human parainfluenza virus)、以及新城病病毒(Newcastle disease virus)中之任一種的RNA病毒。
[8]如前述[1]至[7]中任一項記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(3)之轉錄起始訊號序列為：3’-UCCCACUUUC-5’(序列編號1)、3’-UCCCUAUUUC-5’(序列編號2)、3’-UCCCACUUAC-5’(序列編號3)、3’-UCCUAAUUUC-5’(序列編號7)、以及3’-UGCCCAUCUUC-5’(序列編號9)任一者所示之RNA序列中選擇之RNA序列，前述(4)之轉錄終止訊號序列為：3-AAUUCUUUUU-5’(序列編號4)、3’-CAUUCUUUUU-5’(序列編號5)、3’-UAUUCUUUUU-5’(序列編號6)、以及 3’-UUAUUCUUUUU-5’(序列編號8)任一者所示之RNA序列中選擇之RNA序列。
[9]如前述[4]至[8]中任一項記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，包含相同或不同序列之前述(3)之轉錄起始訊號序列係配置為鄰接於前述(2)之RNA序列的更3’末端側，該前述(2)之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列中之各基因序列的3’末端側，並且，前述(4)之轉錄終止訊號序列係配置為鄰接於：被配置之RNA序列的更5’末端側，該被配置之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列中之各基因序列的5’末端側。
[10]如前述[7]至[9]中任一項記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(5)之含有複製起點之RNA序列含有下述序列：(a)3’-UGGUCUGUUCUC-5’(序列編號11)或3’-UGGUUUGUUCUC-5’(序列編號12)所示之RNA序列、(b)3’-GAGAACAGACCA-5’(序列編號13)或3’-GAGAACAAACCA-5’(序列編號14)所示之RNA序列、(c)3’-(CNNNNN)3-5’(序列編號15)所示之RNA序列、(d)3’-(NNNNNG)3-5’(序列編號16)所示之RNA序列。
[11]如前述[10]記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(a)之RNA序列係位於負單股RNA(A)之3’末端，並且前述(b)之RNA序列係位於5’末端。
[12]如前述[10]或[11]記載之匿跡型RNA基因表現系 統，其中，前述(c)之RNA序列為從負單股RNA(A)之3’末端算起第79個鹼基處開始，並且前述(d)之RNA序列為從負單股RNA(A)之5’末端算起第96個鹼基處開始。
[13]如前述[10]至[12]中任一項記載之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(5)之含有複製起點之RNA序列進一步在負單股RNA(A)之3’末端算起第97至116個鹼基的位置進一步包含有(e)3’-AAAGAAACGACGGUUUCA-5’(序列編號17)之RNA序列或與上述(e)之RNA序列具有相同鹼基長度之18個鹼基長的RNA序列。
[14]一種不使先天免疫機制活化的匿跡型RNA載體，其係含有構成前述[1]至[13]記載之匿跡型RNA基因表現系統之複合體，並且具有將該複合體導入至動物細胞的活性之RNA載體。
[15]如前述[14]記載之匿跡型RNA載體，其係形成對動物細胞具有感染能力的病毒粒子。
[16]一種動物細胞，其係導入有如前述[14]或[15]記載之匿跡型RNA載體。
[17]一種匿跡型RNA，其係含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)，並且可與單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)一起形成不使先天免疫機制活化的複合體：(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域的先天免疫機制無法辨識之RNA 序列、(3)RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號序列、(4)該酵素所辨識之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素之RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白的RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列。
本發明亦可含有以下態樣。
[17’]一種匿跡型RNA，其係含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)，並且可與單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)一起形成不使先天免疫機制活化的複合體：(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域的源自在動物細胞中表現的mRNA之RNA序列、(3)前述RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號序列、 (4)該酵素所辨識之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素之RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白質的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列。
[17”]一種匿跡型RNA，其係含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)，並且可與單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)一起形成不使先天免疫機制活化的複合體：(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域之源自人類mRNA之RNA序列、(3)前述RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號序列、(4)該酵素所辨識之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素之RNA序列，且為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且 為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白質的RNA序列，且為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列。
[18]如前述[17]記載之匿跡型RNA，其中，於前述負單股RNA(A)之3’末端側及5’末端側係包含有：前述(5)之含有RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之複製起點的RNA序列，且為分別與3’末端側之RNA序列及5’末端側之RNA序列互補之RNA序列。
[19]如前述[17]或[18]記載之匿跡型RNA，其中，包含相同或不同序列之前述(3)之轉錄起始訊號序列係配置為鄰接於前述(2)之RNA序列的更3’末端側，該前述(2)之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各者的3’末端側，並且，前述(4)之轉錄終止訊號序列係配置為鄰接於：經配置之RNA序列的更5’末端側，該經配置之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各基因序列的5’末端側。
[20]如前述[17]至[19]中任一項記載之匿跡型RNA，其中，包含相同或不同序列之前述(3)之轉錄起始訊號序列係配置為鄰接於前述(2)之RNA序列的更3’末端側，該前述(2)之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各者的3’末端側，並且，前述(4)之轉錄終止訊號序列係配置為鄰接於經配置之RNA序列的更5’末端側，該經配置之RNA序列係經配置 為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各基因序列的5’末端側，進一步，在其兩端側以具有可藉由複數個限制酵素切斷的限制酵素切斷部位之匣結構構成，並且該匣結構係複數結合。
[21]一種再構成匿跡型RNA基因表現系統之方法，其係包含下述(1)至(5)步驟之方法：(1)準備表現T7 RNA聚合酶(polymerase)之大腸桿菌的步驟、(2)將搭載有外來基因RNA以及至少編碼有RNA依賴性RNA合成酵素與RNA結合活性蛋白質之RNA的大腸桿菌用載體，以及將編碼RNA結合活性蛋白質之DNA予以表現的大腸桿菌用載體導入至(1)之大腸桿菌宿主內之轉形(transformation)步驟、(3)在(2)的轉形大腸桿菌內，形成含有藉由T7 RNA聚合酶表現之外來基因RNA的負單股RNA、與RNA結合活性蛋白質的複合體的步驟、(4)準備表現RNA依賴性RNA合成酵素之動物細胞的步驟、(5)將(3)得到之負單股RNA與RNA結合活性蛋白質之複合體導入至(4)的動物細胞宿主內，而再構成由包含負單股RNA、RNA結合活性蛋白質及RNA依賴性RNA合成酵素之複合體所構成之匿跡型RNA基因表現系統的步驟。
[22]一種串聯型匣，其係具有2個選殖(cloning)部位A、B之DNA鹼基的串聯型， 該串聯型匣係藉由自5’末端側依序為(1)多聚化(multimerization)的部位A、(2)轉錄起始訊號A、(3)非編碼序列A1、(4)選殖部位A、(5)非編碼區域A2、(6)轉錄終止訊號A、(7)轉錄起始訊號B、(8)非編碼序列B1、(9)選殖部位B、(10)非編碼區域B2、(11)轉錄終止訊號B、以及(12)多聚化部位B被構成，前述(1)多聚化部位A、以及(12)多聚化部位B係各自包含限制酵素辨識序列及/或特定部位重組酵素辨識序列，並且彼此可為相同或不同之DNA，前述(2)轉錄起始訊號A、以及(7)轉錄起始訊號B係各自包含被轉錄為RNA時RNA依賴性RNA合成酵素辨識之轉錄起始訊號，並且彼此可為相同或不同DNA，前述(3)非編碼區域A1、(5)非編碼區域A2、(8)非編碼序列B1、以及(10)非編碼區域B2係分別成為被轉錄為RNA時不被宿主細胞的先天免疫機制辨識之RNA，並且彼此可為相同或不同DNA，前述(4)選殖部位(A)、以及(9)選殖部位B係分別包含1個以上的限制酵素辨識序列及/或特定部位重組酵素辨識序列，並且彼此可為相同或不同DNA，前述(6)轉錄終止訊號A、以及(11)轉錄終止訊號B係分別包含被轉錄為RNA時RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄終止訊號，並且彼此可為相同或不同DNA。
[23]如前述[22]記載之串聯型匣，其中，前述(4)選殖部位A自5’末端側係依序包含限制酵素A辨識序列、以 及限制酵素C辨識序列，前述(9)選殖部位B自5’末端側係依序包含限制酵素D辨識序列、以及限制酵素B辨識序列，此處限制酵素A與限制酵素D係產生相同序列的單股突出末端者，限制酵素C與限制酵素B係產生相同序列的單股突出末端者。
[24]如前述[22]或[23]記載之串聯型匣，其中，前述(1)多聚化部位A、以及(12)多聚化部位B係皆為包含產生以NN或NNN所示之任意序列的單股突出末端的限制酵素的辨識序列的DNA。
[25]如前述[22]至[24]中任一項記載之串聯型匣，其中，前述(3)非編碼序列A1、(5)非編碼序列A2、(8)非編碼序列B1、以及(10)非編碼區域B2分別為與源自分別以個別在動物細胞表現的mRNA之RNA序列的部分序列對應之相同或不同的cDNA，
前述(4)選殖部位A、以及(9)選殖部位B中係被插入相同或不同的源自人類的基因。
本發明之匿跡型RNA基因表現系統由於難以被先天免疫機制捕捉，細胞障礙性極低，且可搭載10個基因導入至各式各樣的組織細胞，並且可在必要的期間內始終持續地表現。又，本發明所謂可迴避先天免疫機制或不被免疫機制辨識時，係指經導入的基因或為此目的的載體等，不會實質上刺激宿主的先天免疫。具體而言，意指以 干擾素β誘導能力作為指標，將正常細胞中的IFN-β mRNA的表現量設為1.0時為30以下，較佳為20以下，更佳為10以下。
再者，匿跡型RNA基因表現系統為了在細胞質發揮功能，當該基因表現系統使用經內封之匿跡型RNA載體時，將該載體導入至不具有增殖能力且不進行細胞分裂的末梢血液細胞仍可表現所搭載之基因。進一步，可選擇表現強度最大為80倍幅度之不同基因表現系統，並且可在成為不需要時藉由抑制RNA依賴性RNA合成酵素的活性而簡單地去除。據此，本技術係使用到目前為止不可能之6個以上基因，並且在具有包含人類細胞的動物細胞性質中進行高效率重編程為目的之最適者。
例如，將人類末梢血液細胞作為材料，考量應用在所謂不含動物成分(Xeno-free)/不使用餵養細胞(Feeder-free)的困難條件下，以高效率製作在再生醫療臨床用中使用之高品質iPS細胞。又，使用6個以上基因亦可應用於稱為直接重編程(direct reprogramming)之技術而做出從人類的組織細胞(血液、皮膚、胎盤等)至神經細胞、神經幹細胞、幹細胞、胰臟β細胞等之有用的基因。進一步，由於引起細胞死亡或發炎反應的可能性低，亦被期待應用於利用包含巨大基因的各種基因之基因治療或利用生體內的重編程之再生醫療。
匿跡型RNA基因表現系統，係由於可同時搭載複數個基因並以特定的比例表現，在包含複數個次單元 (subunit)之生物醫藥品的製造中亦可發揮效果。例如，生產人類免疫球蛋白G時必須使各次單元在相同的細胞同時表現。此外，生產人類免疫球蛋白G時，H鏈及L鏈被期望以1：1之比例，而生產人類免疫球蛋白M時，H鏈：L鏈：μ鏈被期望以1：1：0.2之比例，在相同細胞被同時表現，而匿跡型RNA基因表現系統可容易地滿足這樣的要求。
進一步，由於匿跡型RNA基因表現系統可以改變基因表現的程度，而可容易地實現在生物醫藥品的製造上必須的強基因表現。到目前為止之使用動物細胞的生物醫藥品製造程序中，必須建立併入染色體之基因的複製數在被增幅後仍呈安定的細胞株，此為必須耗費龐大的時間及勞力的過程，然而若採用匿跡型RNA基因表現系統，則不需要耗費如此之勞力。
再者，匿跡型RNA基因表現系統亦可抑制在生物醫藥品的製造中成為問題的基因變異而發揮效果。近年來，引起RNA病毒的基因體變異之主因已報告為細胞質的腺核苷去胺酶(Adenosine deaminase acting on RNA、ADAR1)(非專利文獻39)。由於ADAR1係藉由先天免疫機制的活化而被誘導，匿跡型RNA基因表現系統可將ADAR1的誘導抑制至最小值進而抑制基因變異。
匿跡型RNA基因表現系統在包含複數個次單元之潛力標靶藥物蛋白質的表現上亦適用。例如，為了表現潛力標靶藥物酵素的NADPH氧化酵素(Nox2)，必須同時 地表現gp91phox、p22phox、Rac、p47phox、p67phox、p40phox之6個次單元，而匿跡型RNA基因表現系統可容易地實現。進一步，即使是在初代培養血管內皮細胞或神經細胞等不引發細胞分裂而使基因導入或表現呈困難的標靶細胞，若使用匿跡型RNA載體亦可使潛力標靶藥物蛋白質表現，進而容易地達成目的。
再者，匿跡型RNA基因表現系統或匿跡型RNA載體係由於引起細胞阻礙或發炎反應的可能性低，而可應用作為藉由生體內的基因表現得到治療效果的基因治療的平台。特別是，由於可搭載以往的基因導入表現載體為不可能之血友病A的致病基因產物之血液凝固第8因子的cDNA(7053個鹼基)或杜氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)的致病基因產物之肌肉萎縮蛋白(Dystrophin)的cDNA(11058個鹼基)等巨大基因並且可持續表現，故被期待應用為該等疾病的基因治療用載體。
進一步，本發明中為了在載體上搭載6個以上，較佳為8個以上的外來基因而開發出使用串聯型匣連結法的串聯型匣，其係以DNA鹼基構築，因此該方法不僅可用於本發明之匿跡型RNA載體，亦可廣泛應用於一般的DNA表現載體等。
第1圖表示負單股RNA分子之結構圖，該負單股RNA分子係將在動物細胞中表現之源自mRNA的RNA，與RNA 依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號、轉錄終止訊號、複製起點進行組合而製造者。
第2圖A及B表示負單股RNA分子的複製時必須核酸的3’末端與5’末端之結構圖。
第3圖表示負單股RNA分子的複製時必須核酸的3’末端之結構圖。
第4圖表示負單股RNA分子的複製時必須核酸的5’末端之結構圖。
第5圖係源自RNA病毒之mRNA中之密碼子適應指數的解析。
第6圖係源自RNA病毒之mRNA中GC含量的解析。
第7圖表示在匿跡型RNA基因表現系統中搭載外來基因cDNA的設計法圖。
第8圖表示將2個外來基因cDNA結合之方法圖。
第9圖表示將10個外來基因cDNA結合之方法圖。
第10圖表示用於製作搭載有10個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統的模板cDNA之構築方法圖。
第11圖表示自模板cDNA再構成匿跡型RNA基因表現系統之第1方法圖。
第12圖表示自模板cDNA再構成匿跡型RNA基因表現系統之第2方法圖。
第13圖表示搭載有10個外來基因cDNA的匿跡型RNA基因表現系統之基因體結構圖。
第14圖A至C表示搭載有10個外來基因cDNA的匿 跡型RNA基因表現系統之基因表現活性圖。
第15圖表示搭載有10個外來基因cDNA的匿跡型RNA基因表現系統之基因體結構圖，其係以與第12圖不同之方法將核酸的鹼基序列最佳化而製作者。
第16圖表示搭載有10個外來基因cDNA的匿跡型RNA基因表現系統之基因體結構圖，其係替換N、C、PolS(P)基因的配置而製作者。
第17圖表示匿跡型RNA載體的干擾素誘導活性。
第18圖表示為了完全地迴避先天免疫活性誘導能力，而搭載有追加因子的匿跡型RNA基因表現系統的基因體結構圖。
第19圖表示藉由搭載有追加因子之匿跡型RNA載體之干擾素誘導能力。
第20圖A及B表示具有不同基因表現程度的匿跡型RNA基因表現系統之結構圖(標示為正單股RNA)。
第21圖表示C基因缺失或轉譯經抑制的匿跡型RNA基因表現系統的基因體結構與基因表現圖。
第22圖表示匿跡型RNA基因表現系統的組裝訊號(packaging signal)活性圖。
第23圖表示自細胞去除匿跡型RNA基因表現系統圖。
第24圖表示目前為止所製作之匿跡型RNA載體的基因體結構圖。
第25圖(A)至(C)表示藉由搭載有6個初始化基因之匿跡型RNA載體而製作誘導多能性幹細胞(iPS細胞)之效率 圖。
第26圖(A)至(D)表示藉由匿跡型RNA基因表現系統之免疫球蛋白M之表現圖。
第27圖(A)至(D)表示藉由匿跡型RNA基因表現系統之雙重特異性抗體之表現圖。
1. 本發明之「匿跡型RNA基因表現系統」之構成要件
本發明使用之RNA分子顯示難以被先天免疫機制捕捉的「匿跡性」。因此，在本發明中，該RNA分子稱為「具有匿跡性之RNA」，使用該RNA作為素材的基因表現系統稱為「匿跡型RNA基因表現系統」，具有將該表現系統內封並且將該基因表現系統導入至動物細胞之活性的結構物稱為「匿跡型RNA載體」。
本發明所謂之匿跡型RNA基因表現系統係包括包含下列(1)至(8)之RNA序列的負單股RNA(A)、單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)，並且不使先天免疫機制活化的複合體。所謂匿跡型RNA載體係包含該複合體且具有將該複合體導入至動物細胞的活性的粒子。且，本發明中標示為負單股RNA的RNA序列時，若有編碼蛋白質之情形，係指反義股側的RNA序列。
(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域之先天免疫機制不能辨識之RNA 序列、(3)前述RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號序列、(4)該酵素所辨識之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素之RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白質的RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列。
(以下，基因RNA亦有簡稱為基因之情形)。
此處，(2)的RNA較佳為具有5至49個鹼基長，被配置到各個作為(1)的被導入外來基因RNA之各別的3’末端側及5’末端側的非編碼區域。又，(1)之導入的外來基因RNA個數即使未達6個，例如1至5個，或全鹼基長未達5,000個鹼基長當然皆可作為匿跡型RNA基因表現系統之功能，然而本發明之RNA基因表現系統特別係在包含外來基因RNA的個數為6個以上，較佳為8個以上，更佳為10個以上的基因，或者是包含全鹼基長為5,000個鹼基長，較佳為8,000個鹼基長，更佳為10,000個鹼基長的RNA之情形，本發明之RNA基因表現系統發揮顯著的效果。
再者，本說明書中稱為基因或基因材料時，係包含負股RNA或cDNA，以及與其互補的正股RNA或cDNA。亦即，藉由轉錄或逆轉錄，合成的上述任一基因或基因材料皆包含於本發明。
2. 本發明之匿跡型RNA表現系統的構成要件
2-1. 為了導入外來基因RNA之串聯型匣的作成
在本發明之匿跡型RNA基因表現系統中的外來基因RNA係在其3’末端及5’末端的非編碼區域中具有相同或不同的5至49個鹼基之「(1)不被先天免疫機制辨識之RNA」，在更外側的3’末端及5’末端分別設置(3)「轉錄起始訊號」及(4)「轉錄終止訊號」，在最外側的兩端設置多聚化部位而可匣化。
藉由使用下述顯示之DNA為主的串聯型匣，在本發明之匿跡型RNA基因表現系統中被使用的負單股RNA係可容易地構築。
本發明之串聯型匣係藉由自5’末端側依序為(1)多聚化部位A、(2)轉錄起始訊號A、(3)非編碼序列A1、(4)選殖部位A、(5)非編碼區域A2、(6)轉錄終止訊號A、(7)轉錄起始訊號B、(8)非編碼序列B1、(9)選殖部位B、(10)非編碼區域B2、(11)轉錄終止訊號B、以及(12)多聚化部位B之方式被構成者。作為將該串聯型匣之示意圖可例示第7圖的下圖。
上述多聚化部位A及B可相同亦可不同，該匣的多聚 化可使用任意序列，或者只要是可使用於和其他核酸結合之序列。作為多聚化部位之較佳例，可列舉限制酵素辨識序列、以及特定位重組酵素辨識序列。作為較佳限制酵素之例，可列舉具有在切斷面生成如NN或NNN樣式所示之任意序列的單股突出端之SapI、BbsI、BbvI、BcoDI、BfuAI、BsaI、BsmBI、BsmFI、BtgZI、EarI、FokI、HgaI、SfaNI。再者作為其他較佳例，可列舉具有在辨識序列的內部之不定形的序列之AlwNI、BglI、BstAPI、BstXI、DraIII、SfiI等。又，在利用相同重組時作為重組酵素之辨識序列，可列舉attB1及attB2等序列。進一步，在利用吉普生組裝系統(Gibson Assembly System)(New England Biolabs股份有限公司)時，使作為連結對象之其他串聯型匣的末端部與重疊(overlap)序列成為相同序列的前提下，作為多聚化部位可使用任意15個鹼基以上的序列。
轉錄起始訊號A及B彼此可為相同或不同，只要具有在RNA被轉錄時作為RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號的功能，則任何序列皆可。RNA依賴性RNA合成酵素所辨識的轉錄起始訊號之例係在下述的段落中具體記載。較佳者為列舉之序列編號1至3的序列。
非編碼序列A1、A2、B1及B2彼此可為相同或不同。只要在RNA被轉錄時為上述定義之「不被先天免疫機制辨識之RNA」則任何序列皆可，較佳例為揭示列舉於表1中之5至49個鹼基長之各序列。
選殖部位A及B只要是可被期望之外來基因插入者則 任何序列皆可。較佳係1個選殖部位含有1或2個以上的限制酵素辨識序列，或含有1或2個以上特定部位重組酵素之辨識序列。作為選殖部位之較佳例，可列舉包含Acc65I辨識部位與SalI辨識部位之序列、Acc65I辨識部位與XhoI辨識部位之序列、BsiWI辨識部位與SalI辨識部位之序列、以及BsiWI與XhoI辨識部位之序列。
轉錄終止訊號A及B彼此可為相同或不同，只要具有在RNA被轉錄時作為RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄終止訊號的功能，則任何序列皆可。RNA依賴性RNA合成酵素所辨識的轉錄終止訊號之例係在下述的段落中具體記載。較佳者為列舉之序列編號4至6的序列。
一個該串聯型匣係至少可使2個外來基因插入。使5個被插入2個外來基因之匣彼此連接之匣多聚體係成為承載有10個外來基因者。在下述實施例中，將如此之串聯型匣利用多聚化作成承載有4、6或10個外來基因的DNA片段，次選殖至質體。進一步藉由使該DNA片段與源自病毒的RNA依賴性RNA合成酵素基因及RNA結合蛋白基因組合，而構築成本發明所期望之RNA表現系統。
2-2. RNA依賴性RNA合成酵素與該酵素辨識之轉錄起始訊號及轉錄終止訊號
「RNA依賴性RNA合成酵素」與該酵素辨識之轉錄起始訊號及轉錄終止訊號較佳為選自源自相同負股RNA病毒之序列，典型的是源自屬於副黏液病毒科的病毒基因體的序列。屬於副黏液病毒科的病毒基因體之「RNA依賴性 RNA合成酵素」、「該酵素辨識之轉錄起始訊號」及「該酵素辨識之轉錄終止訊號」的組合係為了該等全部具有相同的基本結構，亦可使用源自任何病毒序列的組合。
在本發明之實施例中，選擇仙台病毒的L蛋白質(RNA合成酵素之大次單元、PolL)與P蛋白質(RNA合成酵素之小次單元、PolS)之組合作為「RNA依賴性RNA合成酵素」、選擇「3’-UCCCACUUUC-5’(序列編號1)」作為「RNA依賴性RNA合成酵素辨識之轉錄起始訊號」、選擇「3’-AAUUCUUUUU-5’(序列編號4)」作為「RNA依賴性RNA合成酵素辨識之轉錄終止訊號」，轉錄起始訊號與轉錄終止訊號分別配置於各基因的3’側及5’側(第1圖)。此外，作為「調節RNA合成酵素活性之蛋白質」係使用仙台病毒的C蛋白質(C)，又，作為「單股RNA結合蛋白」係使用仙台病毒的NP蛋白質(N)。
再者，在本說明書中揭示之技術，係以RNA為負單股RNA之態樣為主而使用，只要沒有特別限制，RNA序列係由3’末端側開始揭示作為負股之序列資訊。惟，構成本說明書之一部分序列表的序列資訊係由5’末端側開始指引記載。
選擇仙台病毒的L蛋白質與P蛋白質的組合作為「RNA依賴性RNA合成酵素」時，作為轉錄起始訊號除了「3’-UCCCACUUUC-5’(序列編號1)」、「3’-UCCCUAUUUC-5’(序列編號2)」、「3’-UCCCACUUAC-5’(序列編號3)」之外，可使用與 該等序列具有同等功能之RNA。又，針對轉錄終止訊號同樣地除了「3’-AAUUCUUUUU-5’(序列編號4)」「3’-CAUUCUUUUU-5’(序列編號5)」、「3’-UAUUCUUUUU-5’(序列編號6)」之外，可使用與該等序列具有同等功能之RNA。又，選擇人類副流感病毒第3型之L蛋白質與P蛋白質的組合作為「RNA依賴性RNA合成酵素」時，作為轉錄起始訊號可使用「3’-UCCUAAUUUC-5’(序列編號7)」或具有同等功能之RNA，作為轉錄終止訊號可使用「3’-UUAUUCUUUUU-5’(序列編號8)」或具有同等功能之RNA。進一步，選擇新城病病毒之L蛋白質與P蛋白質的組合作為「RNA依賴性RNA合成酵素」時，作為轉錄起始訊號可使用「3’-UGCCCAUCUUC-5’(序列編號9)」或具有同等功能之RNA，作為轉錄終止訊號可使用「3’-AAUCUUUUUU-5’(序列編號10)」或具有同等功能之RNA。
2-3. 為了本發明之匿跡型RNA表現系統複製功能的要件
作為本發明之匿跡型RNA基因表現系統的複製功能之必須要件，係序列具有RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之複製起點以及3’末端側的(CNNNNN)3-及5’末端側的(NNNNNG)3-之結構。
在本發明的實施例中，由於選擇仙台病毒的L蛋白質與P蛋白質的組合作為「RNA依賴性RNA合成酵素」，因此選擇存在於仙台病毒基因體3’末端之114個鹼基的 RNA，以及存在於仙台病毒基因體5’末端之96個鹼基的RNA作為「含有RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之複製起點的RNA」。在此結構中，對於匿跡型RNA基因表現系統的複製功能必須的是如下所述(參照第2、3、4圖)。
(1)存在於基因體3’末端的「3’-UGGUCUGUUCUC-5’(序列編號11)」或具有同等功能之12個鹼基的RNA序列(例如，「3’-UGGUUUGUUCUC-5’(序列編號12)」)。
(2)存在於基因體5’末端的「3’-GAGAACAGACCA-5’(序列編號13)」或具有同等功能之12個鹼基的RNA序列(例如，「3’-GAGAACAAACCA-5’(序列編號14)」)。
(3)具有從基因體3’末端第79個鹼基開始之「3’-(CNNNNN)3-5’(序列編號15)」之結構之18個鹼基的RNA序列。
(4)具有從基因體5’末端第96個鹼基開始之「3’-(NNNNNG)3-5’(序列編號16)」之結構之18個鹼基的RNA序列。
其中，(1)與(2)係相互互補的序列，由於基因體RNA之3’末端與反義基因體RNA(與基因體互補的RNA)之3’末端相同，被考量為RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之複製起點。又，(3)與(4)雖然功能不明，但已知係在藉由RNA依賴性RNA合成酵素的單股RNA複製中之必須序列(非專利文獻42)。
2-4. 在負單股RNA粒子化中必須的組裝訊號領域
又，在本發明中，首次將作為負單股RNA的粒子化用的組裝訊號之區域，確定為從基因體3’末端第96個鹼基至第114個鹼基之區域。
如實施例18(參照第22圖)所示，若將該區域(標示為「序列D」)全部去除，得到雖然不會影響在組裝細胞內的基因表現，然所得結果為匿跡型RNA載體的粒子化效率變為非常低下。
此顯示，該18個鹼基之序列或該18個鹼基長區域或是其一部分係為了取入至類病毒粒子所必須的序列或區域。
此處，進一步將此18個鹼基序列以由下述(表1)列舉源自管家基因mRNA之部分序列任意選擇者置換(第3圖之(5)，序列編號75)，確認到粒子化的效率不會變化。
據此，從基因體3’末端第97至114個鹼基為止的18個鹼基長或其一部分長度的區域，被考量為在負單股RNA粒子化的組裝中所必須。亦即，在以負單股RNA為模板之轉錄與複製中，該區域雖然不是必須，然而為了將匿跡型RNA基因表現系統組入至類病毒粒子，該區域可說是必須的「組裝訊號區域」。
(5)對應於從基因體3’末端第97至114個鹼基的「3’-AAAGAAACGACGGUUUCA-5’(序列編號17)」的18個鹼基長之RNA，或者是該RNA之至少連續8個鹼基以 上、較佳為10個鹼基以上、更佳為15個鹼基以上長度的任意RNA。
缺少上述(5)之18個鹼基長或其一部分區域的匿跡型RNA基因表現系統，即使宿主細胞經同種或不同種病毒感染，進而導致產生包含該匿跡型RNA基因表現系統之類病毒粒子的可能性極低。
因此，將本發明之匿跡型RNA基因表現系統作為感染性粒子、作為匿跡型RNA基因表現載體使用之情形，該18個鹼基長或其一部分區域係必須的區域，惟在盡可能排除類病毒粒子混入而經確保安全性的生物醫藥品製造中，寧可成為應該排除的序列
2-5. 負單股RNA基因表現系統模板的構築
組合有「RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄起始訊號的RNA」、「RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄終止訊號的RNA」以及存在於負單股RNA的3’末端與5’末端的「包含RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之轉錄複製起點的RNA」，並在轉錄起始訊號與轉錄終止訊號之間搭載有任意的外來基因之RNA分子，已知在被反式供給的源自病毒的RNA依賴性RNA合成酵素等必須因子的存在下，成為轉錄及複製的模板(非專利文獻43、非專利文獻44、非專利文獻45)。例如，組合有源自仙台病毒的轉錄起始訊號、轉錄終止訊號與複製起點，並搭載有大腸桿菌的氯黴素乙醯轉移酶(Chloramphenicol acetyltransferase，CAT)基因之具有上述結構之負單股RNA，顯示在經仙台 病毒感染的細胞中成為轉錄與複製的模板，製造CAT(非專利文獻43、非專利文獻44)。又，在安定地表現仙台病毒的NP(單股RNA結合蛋白質)、P(RNA依賴性RNA合成酵素的小次單元)以及L(RNA依賴性RNA合成酵素的大次單元)蛋白質的細胞中，具有同樣結構的負單股RNA係顯示可持續地複製(非專利文獻45)。
該等報告顯示本發明所製作的負單股RNA成為基因表現的模板，然而由於此模具的轉錄及複製活性係依賴於從含有病毒基因的細胞進行反式供給的NP、P、L蛋白質，故不能成為在任意細胞中皆可進行基因表現的廣用型基因表現系統。於是接著嘗試具有在前述2-3.(參照第1圖)所示之結構、由不被先天免疫機制辨識之成分所構成的RNA分子中搭載轉錄與複製所必須之基因。
3. 關於迴避動物細胞中先天免疫機制活化(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)之知識
3-1. 關於源自病毒RNA的PAMP
動物細胞具有之先天免疫機制，係辨識至存在於被侵入的細胞內的病毒基因體的RNA或病毒基因的mRNA的「病原微生物相關分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)」而被活化。到目前為止，PAMP的結構在C型肝炎病毒與人類免疫不全病毒中被確認。關於C型肝炎病毒，報告有基因體3’末端的非編碼區域之富含脲嘧啶(Uridine)之序列為PAMP(非專利文獻35)。另一方面，關於人類免疫不全病毒，報告有由Gag、Pol、Env的3個基 因轉錄之mRNA中存在有高含量腺嘌呤(Adenine)之區域成為PAMP(非專利文獻36)。其他，關於仙台病毒，已知有在感染細胞中存在的比600個鹼基長之長鏈RNA被檢測而區分為具有強PAMP活性(非專利文獻37)，以及F/HN/L之各基因的非編碼領域中存在有高度可能作為PAMP功能之二級結構(非專利文獻38)。因此，源自病毒的RNA被考量幾乎皆含有PAMP。
3-2. 對於源自病毒RNA最佳化之檢討
將編碼RNA病毒基因體中蛋白質的區域的密碼子進行人類細胞最佳化而破壞PAMP結構，迴避先天免疫機制的活化，自以往以來已進行多種的嘗試。例如，由於從人類免疫缺陷病毒(HIV)的Gag、Pol、Env之各基因轉錄的各mRNA中係存在各種PAMP，因此若使任一基因以原樣在動物細胞中表現則將誘導干擾素，惟已報告有進行人類細胞最佳化後表現的Gag、Pol、Env蛋白質皆可抑制干擾素的誘導(非專利文獻36)。再者，已知在猴免疫缺陷病毒(SIV)，與HIV相同的Gag、Pol、Env之mRNA中存在有PAMP，將含有各基因之PAMP區域的密碼子進行人類細胞最佳化，已知可降低干擾素誘導能力(非專利文獻48)。然而，僅將SIV基因體序列中之含有Pol基因的PAMP區域的密碼子進行最佳化的話，SIV的干擾素誘導能力幾乎沒有變化。可是，若除了Pol因基最佳化之外，含有Gag基因的PAMP區域的密碼子亦最佳化時，病毒的複製能力降低至1%以下，顯示病毒的轉錄/複製的功能亦產生巨大的 損傷之結果(非專利文獻48)。此結果係顯示SIV的Pol基因及Gag基因不僅編碼有Pol蛋白質及Gag蛋白質，編碼有蛋白質的核酸序列本身中亦存在有病毒的轉錄或複製功能所必須的資訊。
再者，針對C型肝炎病毒的基因體3’末端之非編碼區域中含有PAMP之區域，亦報告有若破壞該區域則該病毒的複製能力被破壞之情形(非專利文獻82、非專利文獻83)。
該等結果顯示，RNA病毒基因體中之「含有PAMP之區域」有高度可能同時對病毒的複製等功能而言是必須的區域。
據此，由於尚未知曉有在不損傷RNA病毒的功能下自基因體核酸將具有PAMP功能之結構去除的普遍方法，因此將病毒RNA中含有的PAMP區域的密碼子進行人類細胞最佳化的技術應用於RNA病毒載體係成為否定的結果。
3-3. 源自病毒的先天免疫阻礙因子的利用
使用RNA病毒的基因體或合成RNA作為基因表現平台之先前技術中，揭示作為PAMP被辨識之結構，該等技術不僅去除該結構，亦在各種病毒所具備之拮抗先天免疫機制的因子之作用下，阻礙藉由PAMP之先天免疫機制的活化，減弱細胞毒性。例如，在非專利文獻26及非專利文獻27中作為必須構成要件被使用的B18R蛋白質，因被編碼於牛痘病毒之基因體DNA中之干擾素結合蛋白質，而具有藉由阻礙干擾素的活性而阻礙先天免疫機制活化的功 能。
再者，在專利文獻3、專利文獻4、非專利文獻7中記載之以仙台病毒為基礎的載體係有RNA依賴性RNA合成酵素(L蛋白質與P蛋白質)之變異，並且源自仙台病毒之V蛋白質的表現，係擔任抑制先天免疫機制的角色。V蛋白質係由仙台病毒P基因區域所轉錄之mRNA所作成的蛋白質之一，其係具有與P蛋白質相同的N末端(317個胺基酸殘基)，以及具有V蛋白質之特有結構的鹼基性C末端(67個胺基酸殘基)(非專利文獻39)。V蛋白質係經由轉錄因子IRF-3的阻礙而抑制先天免疫機制的活化(非專利文獻40)。再者，在P基因的鹼基序列中導入人工變異而製作之缺少V蛋白質的仙台病毒，係已知喪失抑制先天免疫機制活化的功能，容易從感染個體中排除(非專利文獻40、非專利文獻41)。
據此，併用源自病毒之先天免疫阻礙因子時，產生了即使被導入外來基因的細胞感染有其他種病原微生物亦不會活化先天免疫機制如此之安全性疑慮。例如，由於在安定地保持仙台病毒載體的基因體的細胞中，V蛋白質持續地表現，在生體的組織細胞中使用此載體時，有即使該細胞被別的病毒感染先天免疫機制亦不會活化的可能性。因此，期望迴避先天免疫機制活化之技術係不依賴於藉由源自病毒的因子來抑制先天免疫機制的方法。
4. 在本發明之RNA基因表現系統中用以迴 避PAMP之手法
4-1. 在非編碼區域中之「不被先天免疫機制辨識之RNA」
本發明掌握的關鍵，係可迴避動物細胞具有之先天免疫機制活化的RNA選擇。又，本發明中所謂先天免疫機制活化的迴避係以干擾素β誘導能力作為指標，將正常細胞中IFN-β mRNA的表現量設為1.0時為30以下，較佳為20以下，更佳為10以下之觀點係如同上述。
因此，在本發明中作為「不被先天免疫機制辨識之RNA」之材料，選擇的是源自在廣泛的人類細胞中表現的管家基因的mRNA。該mRNA係幾乎在所有的人類細胞中皆比較大量的表現，不含有被人類先天免疫機制辨識的基序(motif)。進一步，由未編碼有該mRNA蛋白質的非編碼區域中，選擇不具有高度二級結構之5個鹼基至49個鹼基的RNA(表1)，配置於被搭載在載體上的各基因之5’側非編碼區域與3’側非編碼區域(第1圖)。
下述(表1)所列舉之源自管家基因之mRNA的部分序列，任一者皆可作為本發明之非編碼區域序列之「不被先天免疫機制辨識之RNA」中之特佳序列使用。此外，亦可較佳使用源自白蛋白基因等在生體內大量表現之基因的mRNA之部分RNA序列。
據此，在本發明之實施例中，考量應用於再生醫療而選擇源自在人類細胞中表現的mRNA之非編碼區域序列，使用其部分序列，惟作為「不被先天免疫機制辨識之RNA」 係不限定於實施例或(表1)例示之源自人類mRNA之源自非編碼區域序列的序列。例如，在OptimumGen基因設計系統(專利文獻7，GenScriPt USA股份有限公司)，為了求取基準CAI值，可使用所採用人類中表現量高的人類mRNA群中適當地選擇之mRNA所具有之非編碼序列的部分序列。其他，若使用之載體不被宿主細胞的先天免疫機制辨識時，亦可為mRNA以外的人類RNA、在其他動物種細胞中表現的RNA、或非天然的合成RNA。
Figure 105101364-A0202-12-0057-1
4-2. 對RNA載體、基因體的3’末端及5’末端區域之「不被先天免疫機制辨識之RNA」的置換
如第2圖、第3圖及第4圖所示，在構成本發明之匿跡型RNA載體之基因體RNA序列中之3’末端區域及5’末端區域中，除了存在有在前述2-2.至2-3.等記載之與轉錄、複製等相關之必須構成要件以外亦存在有任意的功能不明序列區域，在該等序列中存在有複數個地方，其係可被源自管家基因之mRNA的部分序列等「不被先天免疫機制辨識之RNA」置換的區域。
例如，如第3圖的實施例所示，存在於天然的病毒基因體3’末端結構中的(1)至(6)的區域，係可以包含表1之源自管家基因mRNA的部分序列之無同源性的其他鹼基序列置換，匿跡型RNA基因表現系統之3’變異型1至3’變異型6之任一者皆可進行安定的基因表現與載體粒子的產生。又，如第4圖的實施例所示，存在於天然的病毒基因體5’末端結構中的(1)至(4)的區域，係可以無同源性的其他鹼基序列置換或插入，匿跡型RNA基因表現系統之5’變異型1至5’變異型5之任一者皆可進行安定的基因表現。
此外，藉由將該等位置的序列置換成(表1)之源自管家基因mRNA之部分序列等「不被先天免疫機制辨識之RNA」，被認為進一步抑制干擾素誘導能力的可能性高。
5. 藉由轉錄、複製中所必須的蛋白質用以迴避先天免疫機制的活化(PAMP)之手法
5-1. 將編碼有轉錄、複製中所必須的蛋白質之基因中的PAMP結構作為指標值之檢討
在本發明之實施例中，選定仙台病毒的L蛋白質(RNA合成酵素之大次單元，PolL)與P蛋白質(RNA合成酵素之小次單元，PolS)作為「RNA依賴性RNA合成酵素」，仙台病毒的C蛋白質(C)作為「調節RNA合成酵素活性之蛋白質」，仙台病毒的NP蛋白質(N)作為「單股RNA結合蛋白質」。該等蛋白質係在負單股RNA的轉錄及複製中所必須，然而編碼有該等之仙台病毒的基因體RNA或mRNA中，如非專利文獻37中記載，存在有「病原微生物相關分子型態(PAMP)」之可能性高。因此，為了構築不活化先天免疫機制的匿跡型RNA基因表現系統，必須自編碼有該等蛋白質之RNA中，去除可能為PAMP之結構。
雖然構成仙台病毒的基因體RNA或mRNA中確實存在PAMP的活性，然而尚不清楚實際上哪個區域存在有PAMP的活性。但是，具有PAMP活性的RNA，係應該具有與在宿主細胞中表現的RNA明確不同的結構。因此，首先為了檢討源自RNA病毒之mRNA結構與人類細胞之mRNA結構的不同，將編碼區域之密碼子適應指數(Codon adaptation index，CAI)作為指標進行比較。CAI表示在某生物種的細胞中編碼最強表現的100個蛋白質之RNA的密碼子的出現頻率的偏離的指標，CAI=1.0時表示密碼子使用頻率與該等100種的mRNA相同(非專利文獻46)。藉由「OptimumGen基因設計系統(專利文獻7，GenScript USA股份有限公司)解析之結果，相對於經任意選擇的151個人類mRNA之編碼區域的CAI平均值為0.778，仙台病毒的7種mRNA之CAI平均值為0.704，同屬副黏液病毒科的麻疹病毒的7種mRNA之CAI平均值為0.697，得到副黏液病毒之mRNA的CAI顯著低於人類細胞之mRNA的平均CAI(第5圖)。再者，解析在大腸桿菌中表現的任意11種mRNA作為參考，其CAI平均值為0.698(第5圖)。由此考量在人類細胞中使用時，副黏液病毒之mRNA的結構係較偏向於原核生物的大腸桿菌之mRNA的結構，此有作為PAMP被辨識之可能性。
再者，為了由其他的觀點來檢討源自RNA病毒之mRNA與人類細胞之mRNA的結構的不同，計算編碼區域的GC含量。其結果為源自天然副黏液病毒RNA之GC含量平均值為47.7%至48.5%，顯著低於人類mRNA之編碼區域的GC含量平均值56.3%(非專利文獻47)(第6圖)。因考量RNA病毒基因體係GC含量較低、腺嘌呤及脲嘧啶較多之序列而成為PAMP之可能性高(非專利文獻43)，故GC含量被考量有成為暗示PAMP存在之指標的可能性。
5-2. 源自仙台病毒的轉錄、複製相關基因的「密碼子最佳化」應用實驗
用於使該等CAI值及GC含量接近於人類細胞mRNA之平均值的「密碼子最佳化」，在源自病毒編碼區域中之PAMP結構的破壞及PAPM的迴避中為有效之情形，已在如前述3-2.所示之HIV、SIV及肝炎病毒中證實。
然而，前述3-2.中亦顯示若在該等病毒之轉錄、複製中所必須的基因序列內的PAMP區域進行「密碼子最佳化」，將同時大幅損傷其複製能力的結果。由此結果，在轉錄、複製中所必須的基因序列內的PAMP結構，係有高度可能性在轉錄、複製中擔任必須的二級結構的腳色，此可稱為先前之技術常識。
綜合考量在一般病毒基因體中各種功能係被緊密在一起之事實，由如此之先前的常識考量，考量在仙台病毒中亦與該等病毒基因體相同，轉錄、複製中所必須基因序列內之PAMP結構有高度可能性在病毒功能中是重要的。亦即，為了在本發明之RNA基因表現系統中使用，而將源自仙台病毒的「RNA依賴性RNA合成酵素」等轉錄、複製相關的蛋白質之編碼區域中的密碼子進行人類細胞最佳化之情形，被強力預計即使可迴避PAMP，但同時本來的轉錄、複製能力亦大幅地損傷。
如此之狀況下，本發明人等係將編碼有「RNA依賴性RNA合成酵素」、「RNA結合蛋白質」等轉錄、複製相關之蛋白質的RNA全部進行人類細胞密碼子最佳化。
在本發明中，由於使用仙台病毒的L蛋白質(RNA合成酵素之大次單元，PolL)與P蛋白質(RNA合成酵素之小次單元，PolS)作為「RNA依賴性RNA合成酵素」，仙台病毒的C蛋白質(C)作為「調節RNA合成酵素活性之蛋白質」，仙台病毒的NP蛋白質(N)作為「單股RNA結合蛋白質」，以從編碼有該等RNA中去除PAMP為目的，藉 由作為密碼子最佳化法被廣泛使用之程式之一「OptimumGen基因設計系統(專利文獻7，GenScript USA股份有限公司)」進行密碼子最佳化。其結果顯示，任一CAI值皆變為0.86至0.88，接近於編碼有在人類細胞中高度表現之蛋白質的mRNA之數值。
以下，以(表2)顯示藉由「OptimumGen基因設計系統(亦稱為OGGDS法)」，針對仙台病毒的L、P、C以及N蛋白質基因進行密碼子最佳化之應用結果。
Figure 105101364-A0202-12-0062-2
在上述(表2)中，為了進一步由其他的觀點來解析經最佳化之RNA結構，針對密碼子最佳化後之RNA，同時計算CAI值與GC含量。其結果顯示，相對於最佳化前之RNA的GC含量為44.0%至50.1%，最佳化後之RNA的GC含量上升為52.5%至55.5%，接近人類mRNA之編碼區域的GC含量平均值之56.3%(非專利文獻47)(表2)(第6圖)。在RNA病毒中，已知腺嘌呤及脲嘧啶較多之序列成為PAMP之可能性高(非專利文獻36)，藉由密碼子最佳化 之手法使源自病毒之RNA的結構接近人類mRNA的結構，同時亦強力暗示具有PAMP活性區域被去除之可能性。
此外，在本發明中實際構築(實施例8)同時搭載有，以此手法將編碼有源自仙台病毒之NP蛋白質、P蛋白質、C蛋白質、L蛋白質之RNA進行人類細胞最佳化後的RNA，以及10個外來基因之RNA載體(第13圖)，使其在Hela細胞內表現進行驗證之結果(實施例9)，確認10個外來基因全都可觀察到充足的表現量。再者，亦確認該RNA載體可迴避人類纖維母細胞內之INF-β誘導(實施例13，第17圖)。
此結果顯示，本發明之搭載有經進行人類細胞最佳化之源自仙台病毒的轉錄、複製相關之基因RNA的RNA載體，係作為具備有PAMP迴避效果之優異的匿跡型RNA載體而顯示其功能者。
再者此結果係顯示，在仙台病毒之情形，存在於轉錄、複製中所必須的基因序列內之PAMP結構，並不是在全部轉錄、複製中所必須的結構，即使對於進行此實驗的本發明人等而言，亦是預料之外的驚人結果。
5-3. 密碼子最佳化方法之檢討
藉由前述(表2)之結果，為了去除具有PAMP活性之區域用以抑制先天免疫反應之誘導的「密碼子最佳化」，「CAI值」及「GC含量」2種數值範圍的設定被暗示為重要條件。此處，由於針對在二者條件中，何者為較必要的條件進行檢討，因此亦應用其他密碼子最佳化方法進行實驗。作為 密碼子最佳化的方法，除了上述OGGDS法之外，由於亦有GeneOptimizer程序(非專利文獻49)及GeneGPS表現最佳化技術(專利文獻8、專利文獻9)等各種方法被提案，藉由此追加試驗，確認即使應用OGGDS法以外之方法，亦可產生同樣的效果。
此處，藉由與OGGDS法同樣被廣泛使用之「密碼子最佳化」手法之GeneGPS表現最佳化技術(以下亦稱為GGEOT法)，將該密碼子最佳化方法應用於編碼有P蛋白質、C蛋白質、L蛋白質之模板DNA，同樣地製作可搭載10個外來基因之RNA載體(第15圖)。經實施例9之方法驗證後，確認該載體為與以OGGDS法最佳化後之匿跡型RNA載體相同，可迴避先天免疫機制的誘導之匿跡型RNA載體(未顯示實驗數據)。
藉由OGGDS法最佳化與藉由GGEOT法最佳化係使用完全不同之算法，將以此2個方法經最佳化的核酸鹼基序列進行比較，兩者間之同源性為77%至80%，可看出係選擇相當不同的鹼基進行密碼子最佳化(表3)。
綜合上述，為了將編碼有「RNA依賴性RNA合成酵素」、「調節RNA合成酵素活性之蛋白質」、「單股RNA結合蛋白質」之基因製作成匿跡型RNA基因表現系統而進行的最佳化方法，並不依賴於特定的密碼子最佳化法，無論以何種算法為基礎之密碼子最佳化方法，皆已被實證可應用作為本發明之密碼子最佳化法。
以下，(表3)表示針對仙台病毒之L、P、C及N蛋白 質基因藉由GGEOT法進行密碼子最佳化後之GC含量與CAI之值，使該等值與上述(表2)所示之藉由OGGDS法之值進行對比之表。再者，由於在GGEOT法中沒有「CAI值」之計算程式，因此根據OGGDS法之「CAI值」之計算程式進行計算。
又，(表4)表示分別針對L、P、C以及N蛋白質基因，顯示其原始序列、應用OGGDS後之序列、以及應用GGEOT後之序列間之同源性(homology)之值。
Figure 105101364-A0202-12-0065-3
Figure 105101364-A0202-12-0066-4
5-4. 為了「密碼子最佳化」之必須指標
雖然CAI係被使用作為估計在人類細胞內之mRNA轉譯效率之指標之一(非專利文獻46)，在本發明中，密碼子最佳化係使用作為一種從源自病毒之RNA中消除具有PAMP活性之結構的手段，因此沒有必然獲得轉譯效率的上升亦可。
再者，CAI係「顯示在某生物種的細胞中編碼最強表現的100個蛋白質之RNA的密碼子的出現頻率的偏離的指標」，然而作為標準的100個蛋白質之客觀選擇基準未被顯示。在本發明中，藉由OGGDS法最佳化在源自人類之培養細胞內抑制同等的先天免疫反應誘導而可達成10個基因表現，與藉由GGEOT法最佳化比較時，後者的CAI值(藉由OGGDS法計算)顯示最佳化後與最佳化前幾乎沒有變化的結果(表3)。
另一方面，針對GC含量，無論應用哪種最佳化法皆顯示51%以上，最大約為60%之值。由此可知，作為表示具有PAMP活性之結構被去除可能性之指標而言，相較於CAI值，GC含量更為有效。亦即，在用於先天免疫反應之誘導被抑制之「匿跡型RNA基因表現系統」之「密碼子最佳化」中作為指標者，GC含量係最佳之指標，源自病毒之蛋白質之密碼子最佳化後之GC含量，若至少為50.0%以上，期望為52.0%以上，則考量有具有PAMP活性之結構被去除之可能性。
綜上所述，所謂用於本發明中RNA基因表現系統之「密 碼子最佳化」，係指將編碼有RNA基因表現系統中必須蛋白質之全部鹼基序列，以GC含量調整為50至60%，較佳為52至56%。
再者，藉由密碼子最佳化之鹼基序列改變之結果，存在於P基因區域之編碼C蛋白質與V蛋白質之序列消失，亦未從經最佳化之P基因表現C蛋白質及V蛋白質。雖然即使編碼C蛋白質與V蛋白質之RNA完全地去除仍可進行基因表現，顯示該等非必須，然而對於適當地調節本發明之RNA載體表現量為重要的，特別是C蛋白質的情況，因此較佳為在序列中加入經如前述之方式經最佳化之C蛋白質基因RNA。關於V蛋白質RNA，亦可根據必要，同樣適當地進行密碼子最佳化後加入序列中。
6. 用於在本發明中搭載多個外來基因於匿跡型RNA之方法(轉錄匣連結法)
6-1. 在同一個載體上搭載6個以上基因之方法的檢討
接著，檢討將6個以上，例如10個外來基因以簡單的方法搭載於匿跡型RNA之方法。再者，由於RNA分子不能進行基因重組之操作，包含在5-4.中經最佳化之源自病毒之基因搭載，全部皆以cDNA進行構築，將此cDNA作為模板藉由源自T7噬菌體之T7 RNA聚合酶等DNA依賴性RNA合成酵素進行製作者。
為了最單純地製作搭載有10個基因之DNA分子，考量在各個基因cDNA的上游及下游中導入各基因固有之限制酵素切斷部位，將經此限制酵素切斷之cDNA依序插入 之方法。然而此方法，除了至少需要20個不同的限制酵素，為了基因之組合及變更基因在匿跡型RNA上之位置，則cDNA必須全部重做，此方法是不實際的。
6-2. 各搭載有2個基因之「匿跡型轉錄匣」之製作
在本發明中，採用如前述2-1.(第1圖)所述，製作各搭載有2個基因之「匿跡型轉錄匣」，將該等進行複數連結之手法，然而此時，搭載之基因全部以具有相同結構之方式設計，可搭載於匿跡型RNA中哪個位置亦須花費工夫(第7圖)。此設計法中，搭載之基因的5’上游側設計有限制酵素A及3’下游測設計有限制酵素B之個別的限制酵素切斷部位，此處將經切斷之cDNA插入成為模板DNA分子。在被插入之模板DNA中除了限制酵素A及限制酵素B之辨識序列之外，亦設定有限制酵素C及限制酵素D之辨識序列。該等限制酵素之組合係以經限制酵素A切斷之DNA片段可與經限制酵素D切斷之DNA片段共價結合之方式進行選擇，又經限制酵素B切斷之DNA片段可與經限制酵素C切斷之DNA片段共價結合之方式進行選擇，如此之組合存在多數，除了實施例列舉之Acc65I與BsiWI、XhoI與SalI之組合以外，亦考量有XbaI與SpeI或NheI之組合、BamHI與BglII之組合等。此時，關於搭載之基因的cDNA，其結構上的限制係其內部不含有限制酵素A、限制酵素B、限制酵素C、限制酵素D之辨識序列。藉由使用如此限制酵素之組合，首先製作各搭載有2個cDNA之DNA片段(第 8圖)。
6-3. 「轉錄匣」連結法
接著，將5個以上述方式製作之連結有2個cDNA的DNA片段連接一起，製作成搭載有共10個cDNA之DNA(第7圖、第8圖、第9圖)。在實施例中，以上述6-2.製作成之連結有2個cDNA之DNA片段，以SapI限制酵素切斷後單離。以SapI切斷之DNA其切斷面係在5’側具有3個鹼基突出之結構，該3個鹼基之序列以任意設定成可選擇4×4×4=64種切斷面(第9圖)。因此，5個DNA片段可按照設計正確地結合成1個DNA分子回收(第8圖)。此時，關於搭載之基因的cDNA係除了不含有限制酵素A、限制酵素B、限制酵素C、限制酵素D之辨識序列之外，亦設計成不含有SapI之辨識序列(第9圖)。
依此方式，具有在切斷面生成如NN或NNN方式表示之序列中的任意單股突出端之性質之限制酵素並不限定於SapI，以BbsI、BbvI、BcoDI、BfuAI、BsaI、BsmBI、BsmFI、BtgZI、EarI、FokI、HgaI、SfaNI等多種限制酵素亦可得到同樣的結果。再者，在辨識序列內部具有不定形序列之AlwNI、BglI、BstAPI、BstXI、DraIII、SfiI等亦可得到同樣的效果。又，此階段可使用不是經限制酵素之選殖，可利用相同重組法(In-Fusion HD選殖系統(TAKARA-Bio股份有限公司))亦可利用吉普生組裝系統(New England Biolabs股份有限公司))。又，將10個cDNA結合後組裝至環狀的質體DNA之階段，係可不使用如實施例所示之藉由相同重 組組裝至pDONR-221等方法(閘道系統(Gateway System)(Life Technologies股份有限公司))，亦可藉由使用通常之T4 DNA連結酵素進行共價結合之方法。又，藉由如第8圖所示之方法，可製作搭載有1個至10個任意基因之DNA分子。
6-4. 外來基因表現量之調節
一般而言，在含有分別編碼有1組RNA依賴性RNA合成酵素(PolS、PolL)、單股RNA結合蛋白質(N)、RNA合成酵素活性之調節蛋白質(C)之基因的負單股RNA基因表現系統中，插入複數個外來基因時，已知有越接近上游的3’末端側之表現量越多之情形。在本發明之匿跡型RNA基因表現系統亦有同樣的傾向。在本發明中，由於多個外來基因可以任意順序組裝成匣狀，因此可以簡單地使各個基因按照欲取得之表現量依序排列。又，由各個基因製造之蛋白質的表現量亦可藉由改變轉譯效率進行調節(第20圖)。
7. 匿跡型RNA之合成
接著，將以上述6.製作成之連結有10個cDNA之DNA片段，以前述5.記載之方法進行人類細胞密碼子最佳化(以下，亦稱作「人源化」，在各蛋白質的簡稱前附加h之方式記載)。將編碼有單股RNA結合蛋白質之基因(hN)、編碼有RNA合成酵素活性的調節蛋白質之基因(hC)、編碼有RNA依賴性RNA合成酵素之基因(hPolL、hPolS)進行連結，製作成用於合成匿跡型RNA之環狀的模板cDNA(第10 圖)。匿跡型RNA之結構係藉由RNA聚合酶所辨識之啟動子(promoter)位置可從負股及正股中選擇。此處，與被搭載在匿跡型RNA之基因所表現之mRNA為相同方向之RNA定義為正股，與mRNA為互補方向的RNA定義為負股，在第10圖中例示之模板的製作其係用於使用T7 RNA聚合酶合成負股RNA。為了切斷RNA而製作正確的末端，從T7啟動子(非專利文獻50)之下游側處設置源自人類D型肝炎病毒的反基因體的核糖酵素(ribozyme)(專利文獻51)與T7 RNA聚合酶之轉錄終止訊號(非專利文獻50)，形成可合成出與匿跡型RNA全長相當之RNA。在RNA合成中使用之酵素並不限定為T7 RNA聚合酶，若為可在大腸桿菌或動物細胞中使用之DNA依賴性RNA合成酵素者亦可使用。例如，亦可組合源自大腸桿菌T3噬菌體之T3 RNA聚合酶(非專利文獻52)或源自沙門氏桿菌SP6噬菌體之SP6 RNA聚合酶(非專利文獻53)，該等酵素辨識之啟動子與轉錄終止點而使用。又，核糖酵素(ribozyme)係為了正確地切斷RNA之3’末端而使用，並不限定於實施例之源自人類D型肝炎病毒的反基因體的核糖酵素，亦可使用源自人類D型肝炎病毒基因體之核糖酵素(非專利文獻51)或菸草輪狀病毒(Tobacco Ringspot Virus)之髮夾狀核糖酵素(非專利文獻54)，更甚者可使用可在細胞內切斷RNA之小片段干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)(非專利文獻55)。
又，與匿跡型RNA全長互補的cDNA係選殖至具有源自p15A複製起點之質體(非專利文獻56)。具有源 自p15A複製起點之質體，由於其在大腸桿菌中係以低複製數的狀態維持，不僅對於為了使大的DNA片段在大腸桿菌中安定地保持為有利，在用於再構成匿跡型RNA基因表現系統之方法2中，該質體亦可與具有源自ColE1複製起點的N蛋白質表現質體在大腸桿菌中共存(非專利文獻56)。在實施例中，具有源自p15A複製起點之質體搭載有胺苄青黴素(ampicillin)耐性，具有源自ColE1複製起點之質體搭載有康黴素(kanamycin)耐性，2個質體藉由胺苄青黴素及康黴素之雙重選擇可維持在同一個大腸桿菌內，然而抗生素之組合並不限於此例。又，質體之組合亦可使用具有源自F因子複製起點之質體取代具有源自p15A複製起點之質體，具有源自pUC複製起點之質體取代具有源自ColE1複製起點之質體。
8. 匿跡型RNA基因表現系統之再構築
8-1. 先前之再構築法
包含負單股RNA以及與該RNA結合之蛋白質之匿跡型RNA基因表現系統的再構築係可藉由2個方法。第一個方法係作為已經具有負單股RNA基因體之病毒及利用該病毒之載體再構成法而為已知的技術，使用T7 RNA聚合酶使與負單股RNA互補的正單股RNA在動物細胞內表現，同時，藉由使NP(N)、P(PolS)、L(PolL)3個蛋白質在該細胞表現而再構成正股RNA之匿跡型RNA基因表現系統(第11圖)(非專利文獻57、專利文獻3)。此方法之優點係僅藉由使用安定地表現T7 RNA聚合酶之動物細 胞，在細胞中導入成為材料之質體DNA而可簡單地再構成。另一方面，已知有由於將為了合成正單股RNA之含有模板cDNA之質體，以及搭載有表現NP、P、L的3個蛋白質之基因的質體同時導入細胞，該等DNA分子間經常產生基因重組，而在欲製作之負單股RNA結構中插入變異之情形(非專利文獻57)。又，在專利文獻3之實施例中，為了使再構成之效率上昇，進一步追加表現M、F、HN蛋白之質體。
8-2. 本發明開發之再構築法
在第2個方法中，首先在大腸桿菌中製作負單股RNA以及具有單股RNA結合能力之NP蛋白質(N)之複合體，將此複合體導入至表現有P(PolS)蛋白質及L(PolL)蛋白質之動物細胞中再構成匿跡型RNA基因表現系統(第12圖)。在此方法中，首先，由於在大腸桿菌中可共存2個質體，編碼有N蛋白質之mRNA及匿跡型RNA可分別藉由T7 RNA聚合酶合成，藉由在大腸桿菌內同時表現單股RNA結合蛋白質(N)以及匿跡型RNA而製作出複合體。將從天然存在之RNA病毒中分離的RNA-蛋白質複合體再構成為RNA病毒材料之方法係被揭示於非專利文獻58中，然而此次開發之方法係可將藉由基因重組技術合成之匿跡型RNA再構成為材料。此方法相較於第1個方法之缺點係步驟較多且複雜，然而由於使用之大腸桿菌係其相同重組相關之基因(RecA)及編碼有RNA分解酵素之基因(RNaseE)被破壞，而可再構成沒有變異插入基因體RNA之匿跡型RNA 基因表現系統。
亦即，本發明開發之匿跡型RNA基因表現系統之再構成法，係在表現有T7 RNA聚合酶之宿主細胞內，事先製作負單股RNA及具有單股RNA結合能力之蛋白質(例如，NP蛋白質(N))之複合體，將該複合體導入至表現有RNA依賴性RNA合成酵素(例如，P(PolS)蛋白質及L(PolL)蛋白質)之動物細胞中再構成匿跡型RNA基因表現系統之方法。作為宿主細胞較佳係使用RecA基因及RNaseE基因被破壞，且表現有T7 RNA聚合酶之大腸桿菌。
接著，使用以上述7.記載之方法合成之搭載有10個基因的匿跡型RNA，以前述8.中記載之任一個方法構築匿跡型RNA基因表現系統(第12圖)。如此製作成之具有負單股RNA的基因表現系統所搭載的10個基因全部都可持續地表現之情形，係可藉由3種藥劑耐性質(嘌呤黴素(puromycin)耐性、吉歐黴素(zeocin)耐性、潮黴素(hygromycin)耐性)、4種螢光蛋白質(EGFP、E2-Crimson、EBFP2、Keima-Red)、3種螢光酵素(luciferase)(螢火蟲螢光酵素、水母(Renilla)螢光酵素、夜光海螢(Cypridina noctiluca)螢光酵素)來確認基因安定地表現(第13圖)。
8-3. 在匿跡型RNA基因表現系統中RNA結合蛋白質(hN、hC、hPol)基因之連結順序
在本發明之匿跡型RNA基因表現系統，編碼有單股RNA結合蛋白質之基因(hN)、編碼有調節RNA合成酵素活性之蛋白質的基因(hC)、編碼有RNA依賴性RNA合成酵 素之基因(hPolS)，該等在匿跡型RNA上的位置係不被限定為如第13圖所示之從3’端側開始hN-hC-hPolS的順序。例如，亦可替換為如hN-hPolS-hC或hPolS-hN-hC之順序而構築匿跡型RNA基因表現系統(第16圖)。
8-4. 在匿跡型RNA基因表現系統中之源自病毒之蛋白質基因中的變異之必要性
又，在此匿跡型RNA基因表現系統中，由編碼有單股RNA結合蛋白質之人源化基因(hN)、編碼有調節RNA合成酵素活性之蛋白質的人源化基因(hC)、編碼有RNA依賴性RNA合成酵素之人源化基因(hPolS、hPolL)表現之蛋白質，係不需要有特別的變異存在。
如前述3-3.中所述，在先前之技術中，作為先天免疫機制之迴避方法，導入變異係作為源自病毒之RNA依賴性RNA合成酵素基因等之抑制PAMP活性最有效之方法而被使用。
然而，在本發明中，由於源自病毒之蛋白質基因係藉由前述5.所述之方法將全部密碼子最佳化而去除PAMP活性，故不需要事先在源自病毒之蛋白質中導入蛋白質層級之變異。例如，即使使用之基因為表現源自野生型副黏液病毒之仙台病毒Z株之已知具有高度干擾素誘導能力的NP、P、C及L蛋白質時，藉由前述5.所述之方法最佳化，而可作為匿跡型RNA基因表現系統的素材使用。例如，在(第16圖)以「hPol」表示之表現L蛋白質的基因係將源自Z株之基因序列進行人類細胞最佳化而使用。
9. 關於先天免疫機制之誘導活性的驗證
9-1. 與先前技術的先天免疫機制之迴避效果的比較
接著，關於基因導入時誘導先天免疫機制之活性，為了將搭載有匿跡型RNA基因表現系統之匿跡型RNA載體與先前技術比較，製作非專利文獻7之第1B圖中記載之先前技術之持續表現型仙台病毒載體、以及搭載有完全相同4個基因(圭馬-紅、保米黴素S(Blasticidin S)耐性基因、EGFP、Kusabira-橘)之匿跡型RNA載體。在使用此2種載體的人類初代培養纖維母細胞中導入基因，使用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR)法定量24小時後的干擾素-β mRNA之量(第17圖)。此結果為在匿跡型RNA載體中即使沒有搭載抑制先天免疫機制之V基因，干擾素-β mRNA量亦抑制為正常細胞之干擾素-β mRNA量的5倍以內。另一方面，先前技術中即使保持有V基因仍被觀察到正常細胞47倍之誘導量(第17圖)。從此結果，即使阻礙先天免疫機制之因子不存在的條件下，匿跡型RNA基因表現系統仍可迴避先天免疫機制的活化。
9-2. 額外的先天免疫機制活化之迴避
誘導先天免疫機制之活性係受保持匿跡型RNA基因表現系統之細胞的種類、以及從匿跡型RNA基因表現系統之基因表現強度所影響。例如，相對於在源自人類HeLa細胞中干擾素-β幾乎不會被誘導，同樣源自人類之293細胞中則被強力誘導。又，用於製造生物醫藥品之基因表現越強烈則干擾素-β的誘導亦變強。使用匿跡型RNA基因表 現系統製造生物醫藥品時，由於藉由干擾素而被誘導之細胞質的腺核苷去胺酶(Adenosine deaminase acting on RNA、ADAR1)活性造成RNA基因體變異(非專利文獻39)成為問題，故期望進一步抑制匿跡型RNA基因表現系統殘存之先天免疫機制誘導活性。
此目標可藉由在匿跡型RNA基因表現系統中追加搭載抑制先天免疫機制因子而達成(第18圖、第19圖)。作為如此之因子，可列舉存在於細胞質之「病原微生物相關分子型態(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)」受體RIG-I缺失變異型(RIG-IC)(非專利文獻71)、仙台病毒-V蛋白質之C末端區域(非專利文獻72)、蛋白酶體(proteasome)構成成分之PSMA7(非專利文獻73)等。
10. 基因表現程度的調節
接著，在匿跡型RNA基因表現系統之基因表現程度，係以調節被搭載於該載體之轉錄、複製相關因子的表現會有如此之變化而進行檢討(第20圖、第21圖)。再者，在第20圖以正股RNA序列記載。可從改變mRNA被轉譯為蛋白質之效率而調節各個因子的表現。又使轉譯效率變化最簡單的方法，係改變轉譯起始密碼子(AUG)鄰近上游之5’非編碼序列。被考量在動物細胞中轉譯效率最高的是在AUG之正前方具有5’-CCACC-3’(序列編號18)如此之結構(非專利文獻60)。另一方面，藉由在5’上游側插入短的編碼區域可使轉譯效率降低(非專利文獻61)。在實施例中，製作RNA依賴性RNA聚合酶(hPolS與hPolL)之表現 為固定，單股RNA結合蛋白質(hN)及調節RNA合成酵素活性之蛋白質(hC)的表現分別抑制為40%及23%的載體，比較被搭載之螢火蟲螢光酵素的表現(第20圖)。其結果為，藉由抑制hN及hC之任一者的表現則搭載之螢光酵素基因的表現上升，將hN及hC之表現抑制組合則可觀察到最多79倍的基因表現上升。
如此基因表現程度的調節，係可僅藉由調節RNA合成酵素活性之蛋白質(hC)的表現程度調節而進行(第21圖)。此時，即使缺少hC基因亦可再構築匿跡型RNA基因表現系統，由於基因表現的程度變為最大，hC基因不是匿跡型RNA基因表現系統之必須因子。然而，由於搭載基因的表現過強時細胞增殖會被強力阻礙，因此實用的是使hC蛋白質表現為適當程度而實現與目標相符的基因表現。
作為在基因表現系統中重要的性質可列舉根據目的選擇最適當的表現程度。例如，在細胞重編程(repogramming)中轉錄因子表現過強時細胞死亡被誘導。又，在生物醫藥品的製造中，表現弱時生產效率降低。一般而言，在使用RNA病毒之基因表現系統中，改變載體的表現程度是困難的，然而在匿跡型RNA基因表現系統中藉由微調節各個構成成分的表現平衡，而可根據使用目的自由地改變表現強度。
接著，嘗試將上述完成之匿跡型RNA基因表現系統封入內部，製作成可在各式各樣動物細胞中導入匿 跡型RNA基因表現系統的載體粒子。在細胞質中具有匿跡型RNA基因表現系統之BHK細胞中，使用強力Sra啟動子使副黏液病毒的M、F、HN之3種蛋白質表現，在細胞的培養上清夜中檢測到具有基因導入活性的載體粒子。其感染價約為107infectious units/mL，係可得到與先前的持續表現型仙台病毒載體相同的高活性。此載體粒子係以F及HN蛋白質之活性吸附於細胞表面，而可藉由膜彼此融合將內容物，亦即匿跡型RNA基因表現系統導入至細胞中。由於此過程不需要細胞分裂，因此不進行細胞分裂的細胞亦可基因導入。
又，可導入之細胞的細胞特異性、種特異性係以F及HN蛋白質之來源而決定，然而使用仙台病毒之F及HN蛋白質之情形，包含末梢血液之血液細胞之非常廣範圍的人類細胞及動物細胞皆可基因導入。
11. 載體的去除
又，先前技術之持續表現型仙台病毒載體中藉由siRNA抑制RNA依賴性RNA聚合酶的活性而成功地迅速去除載體(專利文獻3、非專利文獻7)。此處，檢討匿跡型RNA基因表現系統可否以同樣的方法去除(第23圖)。由於匿跡型RNA基因表現系統具有之人源化RNA依賴性RNA聚合酶(hPolL)之鹼基序列係與先前技術之持續表現型仙台病毒載體不同，因此合成3種新的siRNA，檢討其活性。其結果為確認使用3種中的1種siRNA(目標序列為序列編號46)，可與先前技術同樣地去除載體(第23圖)。由此可 知，本發明之匿跡型RNA基因表現系統，係可應用在以往之持續表現型仙台病毒載體中藉由RNAi去除載體之方法。同樣地，亦可應用使用microRNA(miRNA)之去除方法，例如，如專利文獻3記載之藉由在外來基因的3’非編碼區域或5’非編碼區域中插入microRNA(miRNA)之目標序列，而可以內部存在之miRNA進行反應去除。
12. 本發明之匿跡型RNA基因系統之用途
在本發明之匿跡型RNA基因表現系統中使用之負單股匿跡性RNA載體，係可搭載源自人類基因等任意的基因6個以上，進一步為10個為止，搭載長度為5,000個鹼基長，進一步為15,000個鹼基長為止。
此外，由於在人類細胞等動物細胞中具有可迴避先天免疫機制活化之匿跡性、載體之去除亦可簡單地進行，因此被考量可用於必須同時導入複數個基因之細胞重編程技術、含有巨大基因之基因治療、再生醫療、生物醫藥品的製造等廣泛的用途。
具體而言，考量有以下的實施態樣。
(1)應用於以高效率製作再生醫療中之臨床使用的高品質iPS細胞之技術
用於重編程人類細胞等動物細胞之6個以上的基因，例如，搭載用於iPS細胞轉換之山中4因子(KLF4、OCT4、SOX2、c-Myc)+BRG1+BAF155之6個因子時成為13,132個鹼基長。又，搭載OCT4、KLF4、SOX2、c-MYC、NANOG、LIN28之6個因子時成為7,000個鹼基長。
實際上，將該等6個基因搭載於本發明之匿跡性RNA載體(第25圖)，使其在人類胎兒纖維母細胞中表現後，得到可實現超過40%之初始化效率之結果(實施例22)。再者，確認此時山中4因子(KLF4、OCT4、SOX2、c-Myc)的搭載訊續更可適當改變(數據未顯示)。
又，將人類末梢血液細胞作為材料，在不含動物成分(Xeno-free)，不使用餵養細胞(Feeder-free)之條件下進行同樣的實驗之結果，同樣地，亦較先前方法得到可進行更高初始化之結果(數據未顯示)。
又，除了KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC之4個因子，搭載編碼有染色質再構成因子之CHD1基因(共9,907個鹼基長)，進一步追加編碼有DNA去甲基化酵素之TET1基因(共11,203個鹼基長)，可更提高初始化效率。
作為其他可能性之組合，進一步使組合有2種卵母細胞特異性組蛋白之8個基因在人類體細胞中表現，可高效率地製作人類iPS細胞。
(2)利用直接重編程技術做出從人類組織細胞(血液、皮膚、胎盤等)至神經細胞、神經幹細胞、幹細胞、胰臟β細胞等有用的基因，應用於再生醫療
例如，將人類纖維母細胞重編程為運動神經之技術中，除了LHX3、ASCL1、BRN2、MYT1L等4個基因，追加HB9、ISL1、NGN2等3個基因共可搭載7個基因(9,887個鹼基長)。
(3)包含複數個次單元之生物醫藥品的製造
本發明對於巨大因子，加上次單元同時在相同細胞中表現為必須，各次單元的表現量之調整亦為必須之免疫球蛋白G、M生產有用。
實際上，在本發明之匿跡性RNA載體搭載人類免疫球蛋白之H(μ)鏈基因、L(κ、λ)鏈基因以及J基因(第24圖)，使用BHK細胞製造人類免疫球蛋白M(實施例23)。此時，搭載基因之順序經設計可成功使H鏈：L鏈：μ鏈以約為1：1：0.2之比例表現。
又，本發明之匿跡性RNA載體中搭載人類免疫球蛋白之4個cDNA(2個H鏈及2個L鏈)，亦可成功表現人類雙重特異性抗體(實施例24)。
(4)應用於包含複數個次單元之潛力標靶藥物蛋白質的表現
例如，將gp91phox、p22phox、Rac、p47phox、p67phox、p40phox之6個次單元搭載於本發明之匿跡性RNA載體，使其同時表現，可使藥物標靶酵素之NADPH氧化酵素(Nox2)表現。
(5)應用於疾病之致病基因為巨大基因之情形，在本發明之匿跡性RNA載體中搭載該等巨大基因使其持續地表現作為該等疾病之基因治療用載體。
具體而言，可將血友病A的致病基因產物之血液凝固第8因子的cDNA(7053個鹼基長)或杜氏肌肉萎縮症的致病基因產物之肌肉萎縮蛋白的cDNA(11058個鹼基)搭載於本發明之匿跡性RNA載體而使用。
[實施例]
以下，藉由實施例對本發明進行詳細地說明。惟，本發明並不限定於該等實施例。
在本發明中之其他用語及概念，係以所屬技術領域中慣常使用之用語之意思為基礎，為了實施本發明使用之各式技術係除了特別明示其來源之技術之外，以公知的文獻為基礎，只要是所屬技術領域中具有通常知識者則可容易且確實地實施。又，各種分析等係根據使用之分析儀器或藥劑、套組(kit)之使用明書、目錄等記載之方法進行。
再者，本說明書中引用之先前技術文獻、專利公報以及專利說明書中之記載內容係作為本發明之記載內容而被參照者。
(實施例1)搭載有10個外來基因之DNA片段的製作(1)
下述之基因藉由PCR以成為Acc65I-cDNA-XhoI結構之方式增幅後進行次選殖(第7圖)。
1)螢火蟲螢光酵素(Firefly Luciferase)：(GenBank登錄號AY738224)、
2)水母螢光酵素(Renilla Luciferase)：(GenBank登錄號AY738228)
3)增強型綠色螢光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)：(GenBank登錄號U55761)、
4)嘌呤黴素耐性基因(進行人類細胞密碼子最佳化合成)：非專利文獻62，序列編號47、
5)夜光海螢(Cypridina noctiluca)螢光蛋白：非專利文獻63(GenBank登錄號AB177531)、
6)E2-深紅：源自pE2-深紅(Clontech Laboratories股份有限公司)，序列編號48、
7)增強型藍色螢光蛋白2(EBFP2)：非專利文獻64(GenBank登錄號EF517318)、
8)吉歐黴素耐性基因(進行人類細胞密碼子最佳化合成)：非專利文獻65，序列編號49、
9)dKeima-紅：非專利文獻66(GenBank登錄號AB209968)、
10)潮黴素B耐性基因(進行人類細胞密碼子最佳化合成)：非專利文獻67，序列編號50。
(實施例2)搭載有10個外來基因之DNA片段的製作(2)
接著，製作出下述載體。
再者，本實施例中使用之核酸皆為DNA片段，關於序列編號1或序列編號4等在序列表中作為負股RNA序列之特定序列，係指相對應之DNA序列。使用DNA片段之其他實施例亦為相同。
1)質體#1：
將具有下述結構之DNA選殖至質體LITMUS38i(New England BioLab股份有限公司)的ApaI切斷部位與StuI切斷部位之間：SapI切斷部位-attB1(序列編號51)-序列編號1-序列編號24-Acc65I切斷部位-SalI切斷部位-序列編號 25-序列編號4-ctt-序列編號1-序列編號26-BsiWI切斷部位-XhoI切斷部位-序列編號27-序列編號4-SapI切斷部位。
2)質體#2：
將具有下述結構之DNA選殖至質體LITMUS38i(New England BioLab股份有限公司)的ApaI切斷部位與StuI切斷部位之間：SapI切斷部位-序列編號1-序列編號28-Acc65I切斷部位-SalI切斷部位-序列編號29-序列編號4-ctt-序列編號1-序列編號30-BsiWI切斷部位-XhoI切斷部位-序列編號31-序列編號4-SapI切斷部位。
3)質體#3：
將具有下述結構之DNA選殖至質體LITMUS38i(New England BioLab股份有限公司)的ApaI切斷部位與StuI切斷部位之間：SapI切斷部位-序列編號1-序列編號32-Acc65I切斷部位-SalI切斷部位-序列編號33-序列編號4-ctt-序列編號1-序列編號34-BsiWI切斷部位-XhoI切斷部位-序列編號35-序列編號4-SapI切斷部位。
4)質體#4：
將具有下述結構之DNA選殖至質體LITMUS38i(New England BioLab股份有限公司)的ApaI切斷部位與StuI切斷部位之間：SapI切斷部位-序列編號1-序列編號36-Acc65I切斷部位-SalI切斷部位-序列編號37-序列編號4-ctt-序列編號1-序列編號38-BsiWI切斷部位-XhoI切斷部位-序列編號39-序列編號4-SapI切斷部位。
5)質體#5：
將具有下述結構之DNA選殖至質體LITMUS38i(New England BioLab股份有限公司)的ApaI切斷部位與StuI切斷部位之間：SapI切斷部位-序列編號1-序列編號36-Acc65I切斷部位-SalI切斷部位-序列編號37-序列編號4-ctt-序列編號1-序列編號38-BsiWI切斷部位-XhoI切斷部位-序列編號39-序列編號4-attB2(序列編號52)-SapI切斷部位。
(實施例3)搭載有10個外來基因之DNA片段的製作(3)(參照第8圖)
接著，製作出下述載體。
1)質體#1C
將含有螢火蟲螢光酵素基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#1之Acc65I-SalI之間製作出質體#1B。進一步，將含有水母螢光酵素基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#1B之Acc65I-XhoI之間製作出質體#1C。
2)質體#2C
將含有EGFP基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#2之Acc65I-SalI之間製作出質體#2B。進一步，將含有嘌呤黴素耐性基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#2B之Acc65I-XhoI之間製作出質體#2C。
3)質體#3C
將含有夜光海螢螢光酵素基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#3之Acc65I-SalI之間製作出質體#3B。進一步，將含有E2-Crimson基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#3B之Acc65I-XhoI之間製作出質體#3C。
4)質體#4C
將含有EBFP2基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#4之Acc65I-SalI之間製作出質體#4B。進一步，將含有吉歐黴素耐性基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#4B之Acc65I-XhoI之間製作出質體#4C。
5)質體#5C
將含有dKeima-Red基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#5之Acc65I-SalI之間製作出質體#5B。進一步，將含有潮黴素B耐性基因之Acc65I-XhoI片段選殖進質體#5B之Acc65I-XhoI之間製作出質體#5C。
(實施例4)搭載有10個外來基因之DNA片段的製作(4)(參照第9圖)
自質體#1C以SapI切出之含有螢火蟲螢光酵素基因與水母螢光酵素基因的DNA片段100ng、自質體#2C以SapI切出之含有EGFP基因與嘌呤黴素耐性基因的DNA片段100ng、自質體#3C以SapI切出之含有夜光海螢螢光酵素基因與E2-Crimson基因的DNA片段100ng、自質體#4C以SapI切出之含有EBFP2基因與吉歐徽素耐性基因的DNA片段100ng、自質體#5C以SapI切出之含有dKeima-Red基因與潮黴素B耐性基因的DNA片段100ng，將上述總計500ng的DNA溶解於5μL的水中，混合5μL的連結-便利套組(Ligation-ConvenienceKit)(NIPPON GENE股份有限公司)後使其在16℃反應60分鐘。純化後，溶解於7μL的水，加入1μL的質體#6(pDONR-221、Life Technologies股份有限 公司)(150ng)與2μL的BP Clonase2(Life Technologies股份有限公司)後使其在25℃反應2小時之後導入至大腸桿菌DH-5 α再分離康黴素耐性菌落，製作出質體#7。
(實施例5)製造搭載有10個外來基因之匿跡型RNA之DNA模板的製作(參照第10圖)
質體#8係以pDONR-221之含有attB1-氯黴素(Chloramphenicol)耐性基因-attB2的DNA片段置換具有p15A複製起點的質體pACYC177(非專利文獻56)之康徽素耐性基因而製作者。以OptimumGen基因設計系統最佳化後之含有hN-hC-hPolS的DNA(序列編號53)，在其5’側依序連接attB1、T7終止子、以及HDV核糖酵素，此DNA片段係GenScript公司合成者。同樣地，合成出以OptimumGen基因設計系統最佳化後之含有hPolL的DNA(序列編號54)，在其3’側連接有T7啟動子與attB2之DNA。以BamHI與XmaI切出依序含有attB1-T7終止子-HDV核糖酵素-hN-hC-hPolS之DNA片段100ng、以XmaI與NotI自質體#7切出含有10個基因的DNA片段100ng、以NotI與SalI切出依序含有hPolL-T7啟動子-attB2之DNA片段100ng，將上述總計300ng的DNA溶解於5μL的水中，混合5μL的連結-便利套組後使其在16℃反應60分鐘。純化後，溶解於7μL的水，加入1μL的質體#8(150ng)與2μL的BP Clonase2後使其在25℃反應16小時之後導入至大腸桿菌HST-08(Takara Bio公司)再分離胺苄青黴素耐性菌落，製作出質體#9B，其係作為合成負股匿跡型RNA的模 具。
合成正股匿跡型RNA的模具DNA係將T7啟動子與T7終止子互換而製作。具體而言，依序含有attB1-T7啟動子-hN-hC-hPolS的DNA片段100ng、以XmaI與NotI自質體#7切出含有10個基因的DNA片段100ng、以NotI與SalI切出依序含有hPolL-HDV核糖酵素-T7終止子-attB2之DNA片段100ng，將上述總計300ng的DNA溶解於5μL的水中，混合5μL的連結-便利套組後使其在16℃反應60分鐘。純化後，溶解於7μL的水，加入1μL的質體#8(150ng)與2μL的BP Clonase2後使其在25℃反應16小時之後導入至大腸桿菌HST-08再分離胺苄青黴素耐性菌落，製作出質體#9A，其係作為合成正鏈匿跡型RNA的模板。
(實施例6)搭載有10個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統的再構成(方法1)(參照第11圖)
方法1係根據專利文獻3與非專利文獻7所記載方法進行。
具體而言，作為BHK/T7/151M(SE)細胞，將安定地表現T7 RNA合成酵素與M蛋白之源自倉鼠BHK-21細胞以下述之方法製作。BHK-21細胞係從理化學研究所生物遺傳資源(Bio-Resource)中心取得。將T7 RNA聚合酶(非專利文獻74)進行動物細胞密碼子最佳化後合成之cDNA(序列情報77)搭載於反轉錄病毒載體pCX4neo(非專利文獻75，GenBank登錄號AB086385)，導入至BHK-21細胞後，以含有G-418 800μg/mL之含有10%FCS的DMEM培養基進行 篩選，得到BHK/T7細胞。接著，將仙台病毒溫度感受性變異株Clone 151株之M基因(GenBank登錄號NM_011046)搭載於反轉錄病毒載體pCX4pur(非專利文獻75，GenBank登錄號AB086386)，導入至BHK-21/T7細胞後，以含有嘌呤黴素200μg/mL之含有10%FCS的DMEM培養基進行篩選，得到BHK/T7/151M(SE)細胞。
再構成中使用之表現載體係以下述方法製作。NP蛋白質表現質體pCMV-NP、P蛋白質表現質體pCMV-P、L蛋白質表現質體pCMV-L、小鼠弗林(Furin)表現質體pCMV-Furin係將仙台病毒Z株的NP基因、P基因、L基因(GenBank登錄號M30202.1)以小鼠及弗林cDNA(非專利文獻76，GenBank登錄號NM_011046)連接在巨細胞病毒(Cytomegalovirus)的立即早期(Immediate Early)的增強子、啟動子(非專利文獻77)的下游進行製作。F以及HN蛋白質表現質體pSRD-HN-Fmut(非專利文獻78)係將仙台病毒Z株的F以及HN基因連接在SRD α啟動子(非專利文獻79)下游之質體。pMKIT-151M係在SRD α啟動子下游連接仙台病毒溫度感受性變異株Clone 151株之M基因進行製作。
將安定地表現M蛋白質之BHK/T7/151M(SE)細胞以5×105細胞/孔之方式接種於6孔盤，培養24小時後洗淨。將質體#9A、NP蛋白質表現質體pCMV-NP、P蛋白質表現質體pCMV-P、L蛋白質表現質體pCMV-L、F及HN蛋白質表現質體pSRD-HN-Fmut、小鼠弗林表現質體pCMV-Furin分別以2μg、1μg、1μg、1μg、2μg、20ng的定量比懸 浮於OptiMEM(Life Technologies股份有限公司)300μL，與含有10μL的Lipofectamine LTX(Life Technologies股份有限公司)之300μL OptiMEM混合後之培養基放置室溫20分鐘，將該培養基添加至上述細胞並培養4小時。將該細胞再度洗淨後，添加含有10%FCS的DMEM培養基進一步於32℃培養3日。之後，將細胞移接至含有潮黴素B 300μg/mL之含有10%FCS的DMEM培養基繼續培養後，分離BHK/#9A細胞。匿跡型RNA基因表現系統的再構成已產生之情況係藉由EGFP與Keima-Red之表現進行確認。
(實施例7)搭載有10個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統的再構成(方法2)(參照第12圖)
RecA與RNaseE雙重缺失變異株之大腸桿菌E-AIST7株，係依序將大腸桿菌BL21(DE3)株(非專利文獻68)的RNase E基因與RecA基因破壞進行製作。RNase E基因係在其C末端導入缺失變異(rne131)(非專利文獻59)，RecA基因係導入完全缺失變異。基因破壞係使用Gene Bridges GmbH公司的快速&簡單大腸桿菌基因去除套組(Quick & Easy E.coli Gene Deletion Kit)，根據同套組的操作說明進行。在大腸桿菌內表現單股RNA結合蛋白質(N)之質體#10係在質體pET-24a(+)(Merck KGaA)搭載符合大腸桿菌之密碼子最佳化後的N基因(eN)(序列編號55)進行製作。
在大腸桿菌E-AIST7株導入質體#9B及質體#10，以胺苄青黴素及康黴素進行篩選製作E-AIST7/N/9B株。將E-AIST7/N/9B株培養於30℃，當OD600=0.3時加入0.5mM IPTG誘導T7 RNA聚合酶之表現，培養3小時後回收大腸桿菌。回收之菌懸浮於10%蔗糖、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM氯化鎂中，加入150kunits的rLysozome(Merck KGaA)及25units的Benzonase(Merck KGaA)，在30℃處理30分鐘後回收原生質體(protoplast)。將原生質體以50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM氯化鎂、50mM CHAPS破壞後，將以4,500rpm離心10分鐘的上清液置於Beckman SW41Ti轉子以25,000rpm離心60分鐘，回收RNA-N蛋白質複合體之沉澱物。RNA-N蛋白質複合體進一步懸浮於28%氯化銫溶液，置於Beckman SW41Ti轉子以37,000rpm離心45分鐘，純化RNA-N蛋白質複合體。
將BHK/T7/151M(SE)細胞以5×105細胞/孔之方式接種於6孔盤，培養24小時後，將P蛋白質表現質體pCMV-P、L蛋白質表現質體pCMV-L各1μg以Lipofectamine LTX導入。再24小時後，將5μg的RNA-N蛋白質複合體與10μL的Pro-DeliverIN試劑(OZ Biosciences)混合後導入細胞。24小時之後將細胞移接至含有潮黴素B 300μg/mL之含有10%FCS的DMEM培養基中繼續培養，分離BHK/#9A2細胞。匿跡型RNA基因表現系統的再構成已產生之情況係藉由EGFP與Keima-Red之表現進行確認。
(實施例8)搭載有10個外來基因之匿跡型RNA載體#1之製作
相對於5.0 x 105個BHK/#9A細胞(或BHK/#9A2細胞)，將基因缺失表現質體之pMKIT-151M、 pSRD-HN-Fmut、pCMV-Furin以2μg、2μg、30ng的比例使用Lipofectamine LTX導入至細胞，4小時後洗淨細胞後，加入含有10%FCS的DMEM培養基進一步於32℃培養4日。之後，回收含有匿跡型RNA載體#1(第13圖)之培養上清液，以0.45μm的過濾器過濾後，若必要可藉由超高速離心法濃縮載體。載體懸浮液於液態氮中急速冷凍，保存於-80℃。載體的活性係使用源自猴腎臟LLCMK2細胞，藉由抗NP蛋白質抗體之間接螢光抗體法進行檢定(非專利文獻7)。以此方法得到之匿跡型RNA載體的感染價係約107infectious units/mL，得到與先前持續表現型載體同等或其以上的活性。
(實施例9)藉由搭載有10個外來基因之匿跡型RNA載體之基因表現(參照第14圖)
以(實施例8)製作之匿跡型RNA載體#1以MOI=3之方式感染HeLa細胞，以含有潮黴素B 100μg/mL之含有10%FCS的DMEM培養基篩選建立HeLa/#9細胞。此細胞的藥劑性耐性能力係以嘌呤黴素(1.5μg/mL)、吉歐黴素(100μg/mL)、潮黴素B(100μg/mL)、G418(800μg/mL)、保米黴素S(10μg/mL)進行篩選，生存率以菌落分析(colony assay)進行測定。相對於陰性對照的HeLa細胞係對該等抗生素皆有感受性者，HeLa/#9細胞顯示對嘌呤黴素、吉歐黴素、潮黴素B有選擇性耐性，確認表現有對該等3種藥劑之耐性性質(第14圖，上段)。
HeLa/#9細胞之螢光蛋白質的表現係藉由流式細胞儀 (Flow Cytometer)(Gallios，Beckman Coulter)進行計測。各螢光蛋白之觀察條件如下所述。EBFP2：激發光405nm、檢驗光450nm；Keima-Red：激發光405nm、檢驗光620nm；EGFP：激發光488nm、檢驗光530nm；E2-Crimson：激發光638nm、檢驗光660nm。相對於沒有保持載體的HeLa細胞，HeLa/#9細胞確認表現有4個螢光蛋白(第14圖，中間)。
HeLa/#9細胞之螢光酵素的表現係使用以下的藥劑，發光係以電荷計(Promega股份有限公司)檢驗。螢火蟲螢光酵素以及水母螢光酵素：雙重螢光酵素報告分析系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega股份有限公司)；夜光海螢螢光酵素：BioLux海螢螢光酵素分析套組(BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit)(New England Biolabs股份有限公司)。相對於沒有保持載體的HeLa細胞任一種螢光酵素的活性皆未被檢驗到，HeLa/#9細胞被檢驗有螢光酵素的高活性(第14圖，下段)。
(實施例10)搭載有10個外來基因之匿跡型RNA載體#2(第15圖)之製作
模板cDNA製作中使用的hN、hC、hPolS、hPolL基因藉由GeneGPS表現最佳化技術進行最佳化，除了將hN、hC、hPolS之3個基因以hN-hPolS-hC的順序搭載之外，與(實施例8)記載之方法同樣地製作載體，並以(實施例9)記載之方法驗證。在含有hN-hPolS-hC之DNA(序列編號78)之5’側依序連接attB1與T7啟動子的DNA片段係由DNA 2.0公司合成。同樣地，在含有含有hPolL之DNA(序列編 號79)之3’側依序連接HDV核糖酵素、T7終止子、以及attB2的DNA片段係由DNA 2.0公司合成。
(實施例11)搭載有10個外來基因之匿跡型RNA載體#3、#4(第16圖)之製作
除了以OptimumGen基因設計系統最佳化之hN、hC、hPolS之3個基因以hN-hPolS-hC的順序(#3)或以hPolS-hN-hC的順序(#4)搭載之外，與(實施例8)記載之方法同樣地製作載體，並以(實施例9)記載之方法驗證。在含有hN-hPolS-hC之DNA(序列編號80)之5’側依序連接attB1與T7啟動子的DNA片段、在含有hPolS-hN-hC之DNA(序列編號81)之5’側依序連接attB1與T7啟動子的DNA片段、以及在含有hPolL之DNA(序列編號82)之3’側依序連接HDV核糖酵素、T7終止子、以及attB2的DNA片段係由GenScript公司合成。
(實施例12)搭載有4個外來基因之匿跡型RNA載體#5之製作
保米黴素S耐性基因(非專利文獻69)(序列編號56)以及Kusabira-Orange基因(非專利文獻70)(GenBank登錄號AB128819)係藉由PCR以成為Acc65I-cDNA-XhoI結構之方式進行增幅後進行次選殖(第7圖)。質體#5D係在LITMUS38i的ApaI切斷部位及StuI切斷部位之間選殖有具有下述結構之DNA。然而，該DNA係與質體#5之SapI切斷斷面不同：SapI切斷部位-序列編號1-序列編號36-Acc65I切斷部位-SalI切斷部位-序列編號37-序列編號4-ctt-序列 編號1-序列編號38-BsiWI切斷部位-XhoI切斷部位-序列編號39-序列編號4-attB2-SapI切斷部位。
在質體#1之Acc65I-SalI之間選殖含有dKeima-Red基因之Acc65I-XhoI片段製作質體#1D。進一步，在質體#1D之BsiWI-XhoI之間選殖含有保米黴素S耐性基因之Acc65I-XhoI片段製作質體#1E。又，在質體#5D之Acc65I-SalI之間選殖含有EGFP基因之Acc65I-XhoI片段製作質體#5E。進一步，在質體#5E之BsiWI-XhoI之間選殖含有Kusabira-Orange基因之Acc65I-XhoI片段製作質體#5F。
以SapI自質體#1E切出含有dKeima-Red基因及保米黴素S耐性基因之DNA片段100ng、以SapI自質體#5F切出含有EGFP基因及Kusabira-Orange基因之DNA片段100ng，將上述總計200ng的DNA溶解於5μL的水中，混合5μL的連結-便利套組後使其在16℃反應60分鐘。純化後，溶解於7μL的水，加入1μL的質體#6(150ng)與2μL的BP Clonase2後使其在25℃反應2小時之後導入至大腸桿菌DH-5 α再分離抗康黴素菌落，製作出質體#11。使用以XmaI及NotI自質體#11切出之含有4基因的DNA片之匿跡型RNA載體#5的製作係根據(實施例5)至(實施例8)記載之方法進行。
(實施例13)由匿跡型RNA載體#5之IFN-β之誘導(第17圖)
使缺失持續表現型仙台病毒載體 SeVdp(KR/Bsr/EGFP/KO)係記載於非專利文獻7。以(實施例12)製作之匿跡型RNA載體#5、以及SeVdp(KR/Bsr/EGFP/KO)載體，同時以MOI=3之方式感染源自初代培養人類皮膚之纖維母細胞。此條件下兩個載體皆可導入至約80%的細胞。感染載體後第24小時，使用ISOGEN套組(NIPPON GENE股份有限公司)抽出細胞的全部RNA，使用去氧核糖核酸酵素(RT等級)(NIPPON GENE股份有限公司)分解基因體DNA。接著，該RNA作為模板使用RT-PCR以SuperScriptIII第一股合成系統(SuperScriptIII Synthesis System for RT-PCR)(Life Technologies股份有限公司)以及oligo(dT)20，藉由反轉錄反應進行第一股cDNA合成。進一步，使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)，將第一股cDNA作為模板，使用參考基因(reference gene)或干擾素-β基因的基因專一性引子對(Gene Specific Primers，GSP)與CFX96即時系統(Bio-Rad)藉由即時聚合酶連鎖反應進行IFN-β mRNA表現量的解析。
(實施例14)搭載有6個外來基因之匿跡型RNA載體#6、#7、#8、#9、#10之製作
質體#2D係在LITMUS38i的ApaI切斷部位及StuI切斷部位之間選殖有具有下述結構之DNA。然而，該DNA係與質體#2之SapI切斷斷面之序列不同：SapI切斷部位-序列編號1-序列編號28-Acc65I切斷部位-SalI切斷部位-序列編號29-序列編號4-ctt-序列編號1-序列編號30-BsiWI 切斷部位-XhoI切斷部位-序列編號31-序列編號4-attB2-SapI切斷部位。
在質體#2D之Acc65I-SalI之間選殖含有EGFP基因之Acc65I-XhoI片段製作質體#2E。進一步，在質體#2E之BsiWI-XhoI之間選殖含有嘌呤黴素耐性基因之Acc65I-XhoI片段製作質體#2F。
以SapI自質體#1C切出含有螢火蟲螢光酵素基因及水母螢光酵素基因之DNA片段100ng、以SapI自質體#2F切出含有dKeima-Red基因及抗潮黴素B基因之DNA片段100ng、以SapI自質體#5C切出含有EGFP基因及嘌呤黴素耐性基因之DNA片段100ng，將上述總計300ng的DNA溶解於5μL的水中，混合5μL的連結-便利套組後使其在16℃反應60分鐘。純化後，溶解於7μL的水，加入1μL的質體#6(150ng)與2μL的BP Clonase2後使其在25℃反應2小時之後導入至大腸桿菌DH-5 α再分離康黴素耐性菌落，製作出質體#12。使用以XmaI及NotI自質體#12切出之含有6個基因的DNA片之匿跡型RNA載體#6、#7、#8(第20圖)(實施例16)以及#9、#10(第22圖)(實施例18)的製作係根據(實施例5)、(實施例7)以及(實施例8)記載之方法進行。
(實施例15)搭載有5個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統#11、#12、#13、#14、#15之製作
搭載有5個基因的質體#13係除了去除(實施例14)之質體#12所搭載基因中的螢火蟲螢光酵素、並且將嘌呤黴素 耐性基因置換成源自質體pBR322的四環黴素耐性基因(GenBank登錄號J01749.1)之外，以(實施例14)記載之方法進行製作。
將此5個外來基因搭載於按照hN-hPolS-hC的順序搭載有hN、hC、hPolS之3個基因的匿跡型RNA載體#3(第16圖)，製造出搭載有5個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統#11。進一步，在此匿跡型RNA基因表現系統的XmaI部位插入含有密碼子最佳化之RIG-IC的基因匣(序列編號83)、含有密碼子最佳化之仙台病毒V蛋白質之C末端區域的基因匣(序列編號84)、含有密碼子最佳化之蛋白酶構成成分PSMA7的基因匣(序列編號85)，製作出搭載有5個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統#12、#13、#14。又，搭載有5個基因的匿跡型RNA基因表現系統#15係將hN-hPolS-hC基因中一部分的hPolS置換成沒有最佳化之仙台病毒Z株的P基因(序列編號86)，其係成為表現有V蛋白質者。
從含有該等匿跡型RNA基因表現系統之細胞依照實施例8製作匿跡型RNA載體，將該載體導入至源自人類293細胞，測定其干擾素誘導能力。在第19圖中，進行與作為代表例之匿跡型RNA載體#11及#12的比較，顯示藉由追加RIG-IC基因，在匿跡型RNA載體中殘存的干擾素誘導幾乎完全被抑制。
(實施例16)N蛋白質及C蛋白質表現效率的改變對於被搭載在匿跡型RNA基因表現系統中之外來基 因表現的影響之解析(參照第20圖)
編碼有螢火蟲螢光酵素之cDNA的pGL4.12(Promega股份有限公司)(GenBank登錄號AY738224)，在該cDNA的轉譯起始密碼子(AUG)的上游處，插入對應於序列編號56、序列編號57、序列編號58之RNA序列，使用CMV啟動子使其在HeLa細胞中表現，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System調查螢光酵素之活性(第20圖)。由結果可知，在原本的轉譯起始密碼子之上游處，將其他的起始密碼子置入外框架將造成原本的蛋白質的轉譯序列錯位，轉譯效率降低。
接著，調查hN mRNA及hC mRNA的轉譯起始密碼子的5’上游側之鹼基序列經改變匿跡型RNA基因表現系統#6、#7、#8之基因表現能力。在匿跡型RNA基因表現系統#6中，hN mRNA及hC mRNA的轉譯起始密碼子(AUG)的5’上游側係轉譯效率最高亦即「Kozak序列(序列編號57)」。在匿跡型RNA基因表現系統#7中，hN mRNA的轉譯起始密碼子的5’上游側係「Kozak序列(序列編號57)」、hC mRNA的轉譯起始密碼子的5’上游側係置換成轉譯效率降低23%的序列編號59之鹼基序列。又，在匿跡型RNA基因表現系統#8中，hN mRNA的轉譯起始密碼子的5’上游側係置換成轉譯效率降低40%的序列編號58之鹼基序列、hC mRNA的轉譯起始密碼子的5’上游側係置換成轉譯效率降低23%的序列編號59之鹼基序列。此實驗，在安定地保持有匿跡型RNA基因表現系統#6、#7、#8之 BHK/T7/151M(SE)細胞中，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System調查螢光酵素之活性(第20圖)。
(實施例17)搭載有5個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統#16、#17之製作(第21圖)
以hN-hPolS-hC的順序搭載hN、hC、hPolS之3個基因，搭載有5個外來基因之匿跡型RNA基因表現系統#11係記載於(實施例15)。此載體之hC基因係改變其5’側非轉譯區域之序列，轉譯效率降低23%(第21圖)。匿跡型RNA基因表現系統#16係從#11去除hC基因者。匿跡型RNA基因表現系統#17係#11之hC基因的5’非轉譯序列置換成Kozak序列，轉譯效率成為100%者。
由第21圖所示之EGFP的表現可知，匿跡型RNA基因表現系統的基因表現程度係可藉由改變hC基因的轉譯效率進行調節。又，雖然hC基因不是匿跡型RNA基因表現系統的再構成所必須的要件，由於沒有hC基因則外來基因的表現變為非常強，細胞的增殖被抑制。因此，藉由使hC基因表現某種程度而可得到實用程度的基因表現是實際的。
(實施例18)在匿跡型RNA基因表現系統3’側之組裝訊號對於載體例子產生的影響之解析(參照第22圖)
匿跡型RNA基因表現系統#9係匿跡型RNA基因表現系統#6(第20圖)缺失其基因體RNA3’側的序列D(序列編號17)者。又，匿跡型RNA基因表現系統#9係匿跡型RNA 基因表現系統#7(第20圖)缺失其基因體RNA3’側的序列D(序列編號17)者。在安定地保持有該等匿跡型RNA基因表現系統之BHK/T7/151M(SE)細胞中，以(實施例5)記載之法表現M、F、HN的各蛋白質，將從上清液回收之匿跡型RNA載體之基因導入能力，藉由使用LLCMK2細胞之抗NP蛋白質抗體以間接螢光抗體法進行檢定(非專利文獻7)。
進一步，將該18個鹼基序列(序列D)置換成從列舉於(表1)之源自管家基因之部分序列中任意選擇者(第3圖之(5)(序列編號75))後，確認粒子化效率沒有改變(數據未顯示)。
由此可知，基因體3’末端開始第97個至114個鹼基為止之18個鹼基長或其部分長度之區域，可考量其係在為了負單股RNA粒子化之組裝中所必須。任何狀況下，此位置的18個鹼基長或其部分長度之區域雖然不是在將負單股RNA作為模板之轉錄及複製中所必須，然而可以說是為了將匿跡型RNA基因表現系統組裝為病毒樣粒子所必須的「組裝訊號區域」。
(實施例19)以siRNA處理保持有匿跡型RNA基因表現系統之HeLa細胞時螢光酵素活性之歷時變化(參照第23圖)
從匿跡型RNA基因表現系統#6(第20圖)製作匿跡型RNA載體#6，基因導入至HeLa細胞藉由潮黴素B篩選而建立HeLa/#3細胞株。將HeLa/#3細胞以成為1.0×104/孔之方式接種於48孔盤，隔天，將最終濃度成為100nM 之以PolL基因的目標序列(序列編號46)作為目標的siRNA與導入藥劑RNAiMAX(Life Technologies股份有限公司)混合後導入至細胞。螢光酵素活性經歷時測定之結果，4次獨立之實驗皆明示，螢光酵素的活性在10日被抑制到約0.1%，匿跡型RNA基因表現系統被高效率從細胞中去除。
(實施例20)搭載大的基因之匿跡型RNA載體之製作(參照第24圖)
搭載有各種外來基因之匿跡型RNA載體之製作係可與(實施例1)至(實施例2)同樣地製作各2個基因的「轉錄匣」、與(實施例3)至(實施例5)同樣地按序連結「轉錄匣」、與(實施例6)或(實施例7)以及(實施例8)同樣地方法製作。作為如此大的外來基因，可搭載之外來基因名稱與其鹼基序列係如下所述。人類KLF4：序列編號60、人類OCT4：序列編號61、人類SOX2：序列編號62、人類c-Myc：序列編號63、人類BRG1：序列編號64、人類BAF155：序列編號65、人類免疫球蛋白G/H鏈：序列編號66、人類免疫球蛋白G/L鏈：序列編號67、人類免疫球蛋白M 2G9選殖株/H鏈：序列編號68、人類免疫球蛋白M 2G9選殖株/L鏈：序列編號69、人類免疫球蛋白M/J鏈：序列編號70、人類血液凝固第VIII因子：序列編號71、人類/肌肉萎縮蛋白：序列編號72。
將該等基因作為外來基因搭載之RNA表現系統係可依據上述各實施例中擠在之步驟的方法導入至目標細胞。此外，藉由使外來基因同時在同一個細胞中複數個表現，細 胞重編程等，可針對導入細胞加入期望之變更。
(實施例21)藉由搭載有6個初始化基因之匿跡型RNA載體之誘導多能性幹細胞(iPS細胞)之誘導
可搭載6個以上基因且確實地表現之匿跡型RNA載體的，係考量對所謂初始化人類體細胞將其轉換成iPS細胞之細胞重編程特別有效。因此，最初被報告之作為用於製作人類誘導多能性幹細胞之方法中的KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC之4個初始化基因的組合(專利文獻1、非專利文獻1)，在此組合中追加具有補充功能的初始化基因NANOG及LIN28(專利文獻2、非專利文獻2)，製作同時表現總計6個初始化基因之匿跡型RNA載體，與到目前為止被報告之iPS細胞的製作技術中初始化效率最高的「同時搭載有4個初始化基因(KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC)之持續表現型仙台病毒載體」，進行細胞初始化活性的比較。
搭載有6個初始化基因之匿跡型RNA載體#23(第25B圖)係使用實施例14所示之方法，依序結合有人類KLF4(序列編號60)、人類OCT4(序列編號61)、人類SOX2(序列編號62)、人類c-MYC(序列編號63)、人類NANOG(序列編號87)、人類LIN28(序列編號88)，組裝至第16圖之匿跡型RNA載體#3，依照實施例6及實施例7進行製作。
iPS細胞的製作係根據專利文獻3進行。具體而言，將源自人類胎兒纖維母細胞之TIG3細胞以1.0 x 105細胞/孔之方式接種於12孔盤，隔日將搭載有KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC之持續表現用仙台病毒載體(第25A圖)、以及搭載 有KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC、NANOG、LIN28之匿跡型RNA載體(第25圖)分別以MOI(Multiplicity of Infection)=3之條件加入培養基中，藉由室溫放置2小時後在37℃培養一晚使該等載體感染細胞。將經絲裂黴素(Mitomycin)處理之MEF作為餵養細胞，準備於有明膠層之培養皿上，將上述感染載體之細胞覆蓋於其上，在誘導多能性幹細胞用培養基StemFit AK03(Ajinomoto股份有限公司)中培養。基因導入後第11日，以AlexaFluor488標示抗TRA-1-60抗原抗體染色，從1x104個的TIG-3細胞中計數處現有TRA-1-60陽性反應之iPS細胞的菌落數(第25圖C)。其結果為，相對於由搭載4因子載體出現之iPS細胞為85個選殖株(初始化效率0.85%)，搭載6因子載體出現有4290個選殖株(初始化效率42.9%)之iPS選殖株，顯示同時搭載有6個基因之匿跡型RNA載體的有效性。再者，此實施例使用之基因的總計鹼基長為7.0kb，係使用先前之RNA載體的方法不可能實驗之尺寸。
(實施例22)藉由同時表現人類免疫球蛋白M(IgM)之H鏈、L鏈、J鏈之免疫球蛋白M的產生
在生物醫藥品製作的領域中，必須使複數個多肽同時表現之代表製品為抗體醫藥品。雖然表現H鏈及L鏈而可製造免疫球蛋白G(IgG)之商業生產技術已經被確立，然而必須使編碼有H鏈、L鏈、J鏈之3個基因同時表現之IgM的製造即使係現在仍為不易(非專利文獻84)。在IgM中已知具有IgG所沒有的強抗腫瘤活性之抗體存在(非專利文 獻85)，因此IgM製造法的確立係有大的產業意義。因此，嘗試藉由將編碼有人類IgM之H鏈、L鏈、J鏈的3個基因搭載於匿跡型RNA載體並使其同時表現，製造分子量為950k道耳吞的IgM。
在實施例23中，選擇與人類免疫缺陷病毒(HIV)感染細胞進行反應之人類免疫球蛋白IgM抗體9F11及2G9(非專利文獻86)作為材料，將9F11抗體之H鏈基因(序列編號89)與L鏈基因(序列編號90)、J鏈基因(序列編號70)、以及潮黴素B耐性基因(序列編號50)，或者是2G9抗體之H鏈基因(序列編號68)與L鏈基因(序列編號69)、J鏈基因(序列編號70)、以及潮黴素B耐性基因(序列編號50)按照此順序依照實施例12之方式進行連結，搭載於第20圖之匿跡型RNA載體#8，得到匿跡型RNA載體#23及#20。接著，以MOI=3之條件，對在蛋白質製造用之無血清培養基Opti-Pro SFM(Life Technologies股份有限公司)中馴化之源自倉鼠BHK細胞進行基因導入，將潮黴素以100μg/mL之方式添加進行篩選。更新培養基之後，在24小時回收該培養上清液。
將培養上清液中之人類IgM的量以抗人類IgM ELISA套組(Bethyl Laboratories股份有限公司)進行定量，導入2G9之基因組時，IgM被檢測出9.17μg/mL，導入9F112G9之基因組時，IgM被檢測出11.15μg/mL。未導入基因之BHK細胞的培養上清液中的IgM係在檢測界線以下。將上述之量以每一個細胞/每一天之表現效率(pg/細胞/日)進行換 算，2G9為16.38pg/細胞/日、9F11為19.91pg/細胞/日(第26圖)。
接著，將含有300ng及100ng之培養上清液使用4至20%梯度明膠(Bio-Rad)以SDS聚丙烯醯胺(SDS-PAGE)電泳進行解析，再以BioSafe Coomasie G250染劑(Bio-Rad)進行染色。其結果為，在非還原狀態，在與天然人類IgM相同之970k道耳吞之位置檢測到條帶，又在還原狀態，分子量75k道耳吞之H鏈及25k道耳吞之L鏈之位置檢測到條帶，由此可知可製造出與天然相同之21條多肽結合的IgM分子。
在非專利文獻84中，使用CHO-DG44細胞及HEK293細胞，藉由胺甲喋呤(Methotrexate)進行基因增幅之得到安定表現IgM細胞4選殖株之解析結果，記載有其表現效率為25.00、3.59、4.60、0.21pg/細胞/日。由此可知，相較於需要藉由數月之基因增幅達成之IgM表現，若使用匿跡型RNA載體，可容易地實現更高程度之生產。
(實施例23)藉由同時表現4個cDNA之雙重特異性抗體的產生
可辨識2個不同抗原之雙重特異性抗體係作為可大幅地擴張目前為止的抗體醫藥品可能性之分子，而近期在生物醫藥品之領域中備受注目。雙重特異性抗體係將包含辨識抗原A之H鏈(A)及L鏈(A)，與辨識抗原B之H鏈(B)及L鏈(B)的4倍體中，以H鏈(A)及L鏈(B)或H鏈(B)及L鏈(A)難以結合之方式導入變異，且相較於H鏈(A)彼此或 H鏈(B)彼此間的結合，H鏈(A)及H鏈(B)之結合變強之方式導入變異下，使編碼有H鏈(A)、L鏈(A)、H鏈(B)、L鏈(B)之4個基因同時表現進行製作(非專利文獻87)。由於將如此之4個基因同時地導入細胞後，經過基因增幅得到同時高表現有4個多肽之細胞株極為困難，通常係以一個基因過度表現之方式被生產。本實施例中，嘗試在非專利文獻87所記載之雙重特異性抗體中，製作同時辨識HER2及上皮細胞增殖因子受體(EGFR)之HEDesignLK。
將非專利文獻87中揭示之抗HER2抗體之H鏈HC1(VHVRD1CH1CRD2)基因(序列編號91)與L鏈LC1(VLVRD1C λCRD2)基因(序列編號92)、以及抗EGFR抗體之H鏈HC2(VHVRD2CH1WT)基因(序列編號93)與L鏈LC2(VLVRD2C κWT)基因(序列編號94)，與EGFP基因以及潮黴素耐性基因一起以實施例14之方式連結，搭載於匿跡型RNA載體#8(第20圖)製作匿跡型RNA載體#24。又，為了比較，將僅表現抗HER2抗體之H鏈與L鏈之載體#25(第27B圖)以及僅表現抗EGFR抗體之H鏈與L鏈之載體#26(第27C圖)，以實施例12之方式進行製作。
使用該等載體，以實施例22之方法基因導入至在Opti-Pro SFM(Life Technologies股份有限公司)馴化之源自倉鼠BHK細胞，以抗人類IgG ELISA套組(Bethyl Laboratories股份有限公司)定量表現安定細胞之培養上清液中的人類IgG之量。其結果為，相較於4倍體之製作活性低的僅有HC1與LC1的組合(12.93pg/細胞/日)、或僅有 HC2與LC2的組合(14.02pg/細胞/日)，同時搭載有HC1、LC1、HC2、LC2之4個基因時，可被觀察到顯著高(37.45pg/細胞/日)的抗體產生，暗示雙重特異性抗體被高效率地產生。又，此表現程度係相當於使用基因增幅在CHO細胞中建立之一般細胞株的基因表現程度(最大約為90pg/細胞/日)(非專利文獻88)。由此結果暗示，作為用於安定地產生雙重特異性抗體的方法，以先前方法難以得到表現安定細胞株，匿跡型RNA載體則為非常有效。再者，此實施例中使用之基因總計鹼基長為6.7k，係使用先前RNA載體之方法不能實驗之尺寸。
[產業上的可利用性]
本發明係在包含誘導多能性幹細胞(iPS細胞)之製作的人類細胞重編程、蛋白質醫藥品之製造、藉由包含巨大基因之各種基因的基因治療、潛力標靶藥物分子之發現等眾多的產業領域中有用的技術。
<110> 國立研究開發法人產業技術總合研究所(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY) 常磐生化股份有限公司(TOKIWA-BIO INC.)
<120> 使用具有匿跡性之RNA的基因表現系統及含有該RNA的基因導人、表現載體
<130> SJU5167979WO
<150> JP2015-007288
<151> 2015-01-16
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒轉錄起始訊息，負股序列
<400> 1
Figure 105101364-A0202-12-0111-140
<210> 2
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒轉錄起始訊息，負股序列
<400> 2
Figure 105101364-A0202-12-0111-141
<210> 3
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒轉錄起始訊息，負股序列
<400> 3
Figure 105101364-A0202-12-0111-142
<210> 4
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒轉錄終止訊息，負股序列
<400> 4
Figure 105101364-A0202-12-0112-143
<210> 5
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒轉錄終止訊息，負股序列
<400> 5
Figure 105101364-A0202-12-0112-144
<210> 6
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒轉錄終止訊息，負股序列
<400> 6
Figure 105101364-A0202-12-0112-145
<210> 7
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類副流感病毒III轉錄起始訊息 負股序列
<400> 7
Figure 105101364-A0202-12-0112-146
<210> 8
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類副流感病毒III轉錄終止訊息
<400> 8
Figure 105101364-A0202-12-0113-147
<210> 9
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 新城疫病毒轉錄起始訊息，負股序列
<400> 9
Figure 105101364-A0202-12-0113-148
<210> 10
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 新城疫病毒轉錄終止訊息，負股序列
<400> 10
Figure 105101364-A0202-12-0113-149
<210> 11
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒基因體RNA 3'末端複製起點，負股序列
<400> 11
Figure 105101364-A0202-12-0113-150
<210> 12
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒基因體RNA 3'末端複製起點，負股序列
<400> 12
Figure 105101364-A0202-12-0114-151
<210> 13
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒基因體RNA 5'末端複製起點，負股序列
<400> 13
Figure 105101364-A0202-12-0114-152
<210> 14
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒基因體RNA 5'末端複製起點，負股序列
<400> 14
Figure 105101364-A0202-12-0114-153
<210> 15
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒(CNNNNN)3-BOX，負股序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n為a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(11)
<223> n為a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(17)
<223> n為a、c、g或u
<400> 15
Figure 105101364-A0202-12-0115-154
<210> 16
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒(NNNNNG)3-BOX，負股序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(6)
<223> n為a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(12)
<223> n為a、c、g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(18)
<223> n為a、c、g或u
<400> 16
Figure 105101364-A0202-12-0115-155
<210> 17
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 仙台病毒組裝訊號，負股序列
<400> 17
Figure 105101364-A0202-12-0115-156
<210> 18
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類甘油醛-3-磷酸脫氫酶的非編碼區域
<400> 18
Figure 105101364-A0202-12-0115-157
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類真核細胞轉譯延長因子α-1的非編碼區域
<400> 19
Figure 105101364-A0202-12-0116-158
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類羥基甲基膽汁合成酶的非編碼區域
<400> 20
Figure 105101364-A0202-12-0116-159
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類甘油醛-3-磷酸脫氫酶的非編碼區域
<400> 21
Figure 105101364-A0202-12-0116-160
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類甘油醛-3-磷酸脫氫酶的非編碼區域
<400> 22
Figure 105101364-A0202-12-0116-161
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類粒線體蛋白質L32的非編碼序列
<400> 23
Figure 105101364-A0202-12-0117-162
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類β-肌動蛋白的非編碼序列
<400> 24
Figure 105101364-A0202-12-0117-163
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類β-肌動蛋白的非編碼序列
<400> 25
Figure 105101364-A0202-12-0117-164
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類磷酸甘油酯基酶1的非編碼序列
<400> 26
Figure 105101364-A0202-12-0117-165
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類磷酸甘油酯基酶1的非編碼序列
<400> 27
Figure 105101364-A0202-12-0118-167
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類肽基異構酶A的非編碼序列
<400> 28
Figure 105101364-A0202-12-0118-166
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類肽基異構酶A的非編碼序列
<400> 29
Figure 105101364-A0202-12-0118-168
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類微管蛋白，α-1b的非編碼序列
<400> 30
Figure 105101364-A0202-12-0118-169
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類微管蛋白，β-1的非編碼序列
<400> 31
Figure 105101364-A0202-12-0118-170
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類轉鐵蛋白受體的非編碼序列
<400> 32
Figure 105101364-A0202-12-0119-171
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類真核細胞轉譯延長因子2的非編碼區域
<400> 33
Figure 105101364-A0202-12-0119-172
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 然自人類泛素C的非編碼序列
<400> 34
Figure 105101364-A0202-12-0119-173
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類轉鐵蛋白受體的非編碼序列
<400> 35
Figure 105101364-A0202-12-0119-174
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類TATA核結合蛋白質的非編碼序列
<400> 36
Figure 105101364-A0202-12-0119-175
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類核層蛋白B2的非編碼序列
<400> 37
Figure 105101364-A0202-12-0120-176
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類α-肌動蛋白，心肌1的非編碼序列
<400> 38
Figure 105101364-A0202-12-0120-177
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類α-肌動蛋白，心肌1的非編碼序列
<400> 39
Figure 105101364-A0202-12-0120-178
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類微管蛋白，β-1的非編碼序列
<400> 40
Figure 105101364-A0202-12-0120-179
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類微管蛋白，β-1的非編碼序列
<400> 41
Figure 105101364-A0202-12-0121-180
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類1-醯基甘油-3-磷酸O-醯基轉移酶1的非編碼序列
<400> 42
Figure 105101364-A0202-12-0121-181
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類1-醯基甘油-3-磷酸O-醯基轉移酶1的非編碼序列
<400> 43
Figure 105101364-A0202-12-0121-182
<210> 44
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類微管蛋白，α-1b的非編碼序列
<400> 44
Figure 105101364-A0202-12-0121-183
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自人類甘油醛-3-磷酸脫氫酶的非編碼區域
<400> 45
Figure 105101364-A0202-12-0121-184
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於hPolL壓抑之siRNA目標序列
<400> 46
Figure 105101364-A0202-12-0122-185
<210> 47
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之嘌呤黴素耐性基因
<400> 47
Figure 105101364-A0202-12-0122-5
<210> 48
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2-Crimson螢光蛋白質基因
<400> 48
Figure 105101364-A0202-12-0122-6
Figure 105101364-A0202-12-0123-8
<210> 49
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之博來黴素耐性基因
<400> 49
Figure 105101364-A0202-12-0123-9
<210> 50
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼自最佳化之潮黴素耐性基因
<400> 50
Figure 105101364-A0202-12-0124-10
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組序列attB1
<400> 51
Figure 105101364-A0202-12-0124-11
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組序列attB2
<400> 52
Figure 105101364-A0202-12-0125-13
<210> 53
<211> 4212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括hN基因、hC基因及hPolS基因的DNA片段
<400> 53
Figure 105101364-A0202-12-0125-12
Figure 105101364-A0202-12-0126-14
Figure 105101364-A0202-12-0127-15
<210> 54
<211> 6884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括hPolL基因的DNA片段
<400> 54
Figure 105101364-A0202-12-0128-16
Figure 105101364-A0202-12-0129-17
Figure 105101364-A0202-12-0130-18
Figure 105101364-A0202-12-0131-19
Figure 105101364-A0202-12-0132-20
<210> 55
<211> 1575
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於表現於大腸桿菌之密碼自最佳化的N基因
<400> 55
Figure 105101364-A0202-12-0132-22
Figure 105101364-A0202-12-0133-23
<210> 56
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 保米黴素S耐性基因
<400> 56
Figure 105101364-A0202-12-0133-25
<210> 57
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak序列
<400> 57
Figure 105101364-A0202-12-0134-193
<210> 58
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'非編碼序列#1
<400> 58
Figure 105101364-A0202-12-0134-186
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'非編碼序列#2
<400> 59
Figure 105101364-A0202-12-0134-187
<210> 60
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類KLF4基因
<400> 60
Figure 105101364-A0202-12-0134-26
Figure 105101364-A0202-12-0135-27
<210> 61
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類OCT4基因
<400> 61
Figure 105101364-A0202-12-0135-29
Figure 105101364-A0202-12-0136-30
<210> 62
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類SOX基因
<400> 62
Figure 105101364-A0202-12-0136-32
Figure 105101364-A0202-12-0137-33
<210> 63
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類c-Myc基因
<400> 63
Figure 105101364-A0202-12-0137-34
Figure 105101364-A0202-12-0138-36
<210> 64
<211> 5040
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類BRG1基因
<400> 64
Figure 105101364-A0202-12-0138-35
Figure 105101364-A0202-12-0139-37
Figure 105101364-A0202-12-0140-38
Figure 105101364-A0202-12-0141-39
<210> 65
<211> 3318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類BAF155基因
<400> 65
Figure 105101364-A0202-12-0141-40
Figure 105101364-A0202-12-0142-41
Figure 105101364-A0202-12-0143-42
<210> 66
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類免疫球蛋白G的H鏈基因
<400> 66
Figure 105101364-A0202-12-0143-43
Figure 105101364-A0202-12-0144-44
<210> 67
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類免疫球蛋白G的L鏈基因
<400> 67
Figure 105101364-A0202-12-0144-45
Figure 105101364-A0202-12-0145-47
<210> 68
<211> 1773
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類免疫球蛋白M的H鏈基因
<400> 68
Figure 105101364-A0202-12-0145-46
Figure 105101364-A0202-12-0146-48
<210> 69
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類免疫球蛋白M的L鏈基因
<400> 69
Figure 105101364-A0202-12-0146-49
Figure 105101364-A0202-12-0147-52
<210> 70
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類免疫球蛋白M的J鏈基因
<400> 70
Figure 105101364-A0202-12-0147-51
<210> 71
<211> 7056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類凝結因子VIII基因
<400> 71
Figure 105101364-A0202-12-0147-50
Figure 105101364-A0202-12-0148-53
Figure 105101364-A0202-12-0149-54
Figure 105101364-A0202-12-0150-55
Figure 105101364-A0202-12-0151-56
Figure 105101364-A0202-12-0152-57
<210> 72
<211> 11058
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密碼子最佳化之人類基營養不良蛋白質基因
<400> 72
Figure 105101364-A0202-12-0152-59
Figure 105101364-A0202-12-0153-60
Figure 105101364-A0202-12-0154-61
Figure 105101364-A0202-12-0155-62
Figure 105101364-A0202-12-0156-63
Figure 105101364-A0202-12-0157-64
Figure 105101364-A0202-12-0158-65
Figure 105101364-A0202-12-0159-188
<210> 73
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類ATP合成酶之一部分，粒線體Fo複合物次單元B1之mRNA
<400> 73
Figure 105101364-A0202-12-0159-189
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類ATP合成酶之一部分，粒線體Fo複合物次單元B1之mRNA
<400> 74
Figure 105101364-A0202-12-0159-190
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類肽基異構酶A(親環蛋白質A)之部分mRNA
<400> 75
Figure 105101364-A0202-12-0159-191
<210> 76
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類核糖體蛋白質之一部分，大的，P1(RPLP1)mRNA
<400> 76
Figure 105101364-A0202-12-0159-192
<210> 77
<211> 2652
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7 RNA聚合酶cDNA
<400> 77
Figure 105101364-A0202-12-0160-66
Figure 105101364-A0202-12-0161-67
<210> 78
<211> 4242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hN-hPolS-hC cDNA
<400> 78
Figure 105101364-A0202-12-0161-68
Figure 105101364-A0202-12-0162-69
Figure 105101364-A0202-12-0163-70
Figure 105101364-A0202-12-0164-71
<210> 79
<211> 6884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPolL cDNA
<400> 79
Figure 105101364-A0202-12-0164-72
Figure 105101364-A0202-12-0165-73
Figure 105101364-A0202-12-0166-74
Figure 105101364-A0202-12-0167-75
Figure 105101364-A0202-12-0168-76
<210> 80
<211> 4248
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hN-hPolS-hC cDNA
<400> 80
Figure 105101364-A0202-12-0169-77
Figure 105101364-A0202-12-0170-78
Figure 105101364-A0202-12-0171-79
<210> 81
<211> 4242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPolS-hN-hC cDNA
<400> 81
Figure 105101364-A0202-12-0171-80
Figure 105101364-A0202-12-0172-81
Figure 105101364-A0202-12-0173-82
Figure 105101364-A0202-12-0174-83
<210> 82
<211> 6884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPolL cDNA
<400> 82
Figure 105101364-A0202-12-0174-84
Figure 105101364-A0202-12-0175-85
Figure 105101364-A0202-12-0176-86
Figure 105101364-A0202-12-0177-87
Figure 105101364-A0202-12-0178-88
<210> 83
<211> 2237
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hRIG-IC cDNA
<400> 83
Figure 105101364-A0202-12-0178-89
Figure 105101364-A0202-12-0179-90
Figure 105101364-A0202-12-0180-91
<210> 84
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hV-獨特區域cDNA
<400> 84
Figure 105101364-A0202-12-0180-92
<210> 85
<211> 857
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPSMA7 cDNA
<400> 85
Figure 105101364-A0202-12-0180-93
Figure 105101364-A0202-12-0181-94
<210> 86
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPolS cDNA
<400> 86
Figure 105101364-A0202-12-0181-95
Figure 105101364-A0202-12-0182-96
<210> 87
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NANOG cDNA
<400> 87
Figure 105101364-A0202-12-0182-97
Figure 105101364-A0202-12-0183-98
<210> 88
<211> 630
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類LIN28 cDNA
<400> 88
Figure 105101364-A0202-12-0183-99
Figure 105101364-A0202-12-0184-101
<210> 89
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgM 9F11重鏈cDNA
<400> 89
Figure 105101364-A0202-12-0184-100
Figure 105101364-A0202-12-0185-102
<210> 90
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgM 9F11輕鏈cDNA
<400> 90
Figure 105101364-A0202-12-0185-103
<210> 91
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG HC1重鏈cDNA
<400> 91
Figure 105101364-A0202-12-0186-104
<210> 92
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG LC1輕鏈cDNA
<400> 92
Figure 105101364-A0202-12-0187-105
<210> 93
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG HC2重鏈cDNA
<400> 93
Figure 105101364-A0202-12-0187-106
Figure 105101364-A0202-12-0188-107
<210> 94
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG LC2輕鏈cDNA
<400> 94
Figure 105101364-A0202-12-0188-108
Figure 105101364-A0202-12-0189-109
本案代表圖無元件符號及其所代表之意義。

Claims (25)

  1. 一種匿跡型RNA基因表現系統，其係不使先天免疫機制活化的複合體，該複合體包含含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)、單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)：(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域之源自在動物細胞表現的mRNA之5至49個鹼基長的RNA序列、(3)前述RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之源自屬於副黏液病毒科的病毒基因體之轉錄起始訊號序列、(4)該酵素所辨識之源自屬於副黏液病毒科的病毒基因體之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素之RNA序列，且為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為針對人類細胞而密碼子經最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白質的RNA序列，且為針對導入對象細胞所由來之生物種而密碼子經最佳化之RNA序列；其中，前述(6)之RNA序列所編碼的RNA依賴性RNA合成酵素，為源自屬於副黏液病毒科的RNA病毒之L蛋白質及P蛋白質； 前述(7)之RNA序列所編碼的調節該酵素活性之蛋白質，為源自與該RNA病毒相同的病毒之C蛋白質；前述(8)之RNA序列所編碼的單股RNA結合蛋白質，為源自與該RNA病毒相同的病毒之NP蛋白質；前述(3)至(5)之RNA序列均為源自與該RNA病毒相同的病毒之基因體序列中之含有轉錄起始訊號、轉錄終止訊號、以及複製起點之RNA序列；編碼有前述L蛋白質、P蛋白質、C蛋白質以及NP蛋白質之RNA序列係針對人類細胞經最佳化者，並且該RNA序列的GC含量被調整為50至60%的範圍內。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(1)之目標RNA序列係含有至少6個基因，或全長為5,000個至15,000個鹼基長之長度的RNA序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，包含相同或不同序列的前述(2)之RNA序列，其係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之各基因序列的3’末端側及/或5’末端側。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，屬於前述副黏液病毒科之RNA病毒為選自仙台病毒(Sendai virus)、人類副流感病毒(Human parainfluenza virus)、以及新城病病毒(Newcastle disease virus)中之任一種的RNA病毒。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(3)之轉錄起始訊號序列為選自：以3’-UCCCACUUUC-5’(序列編號1)、3’-UCCCUAUUUC-5’(序列編號2)、3’-UCCCACUUAC-5’(序列編號3)、3’-UCCUAAUUUC-5’(序列編號7)、以及3’-UGCCCAUCUUC-5’(序列編號9)所示之RNA序列中之任一個RNA序列，前述(4)之轉錄終止訊號序列為選自：以3’-AAUUCUUUUU-5’(序列編號4)、3’-CAUUCUUUUU-5’(序列編號5)、3’-UAUUCUUUUU-5’(序列編號6)、以及3’-UUAUUCUUUUU-5’(序列編號8)所示之RNA序列中之任一個RNA序列。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(3)之轉錄起始訊號序列為選自：以3’-UCCCACUUUC-5’(序列編號1)、3’-UCCCUAUUUC-5’(序列編號2)、3’-UCCCACUUAC-5’(序列編號3)、3’-UCCUAAUUUC-5’(序列編號7)、以及3’-UGCCCAUCUUC-5’(序列編號9)所示之RNA序列中之任一個RNA序列，前述(4)之轉錄終止訊號序列為選自：以3’-AAUUCUUUUU-5’(序列編號4)、3’ -CAUUCUUUUU-5’(序列編號5)、3’-UAUUCUUUUU-5’(序列編號6)、以及3’-UUAUUCUUUUU-5’(序列編號8)所示之RNA序列中之任一個RNA序列。
  7. 如申請專利範圍第3項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，包含相同或不同序列之前述(3)之轉錄起始訊號序列係經配置為鄰接於前述(2)之RNA序列的更3’末端側，該前述(2)之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列中之各基因序列的3’末端側，並且，前述(4)之轉錄終止訊號序列係經配置為鄰接於：經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列中之各基因序列的5’末端側的RNA序列的更5’末端側。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，包含相同或不同序列之前述(3)之轉錄起始訊號序列係經配置為鄰接於前述(2)之RNA序列的更3’末端側，該前述(2)之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列中之各基因序列的3’末端側，並且，前述(4)之轉錄終止訊號序列係經配置為鄰接於：經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列中之各基因序列的5’末端側的RNA序列的更5’末端側。
  9. 如申請專利範圍第1或2項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(5)之含有複製起點之RNA序列含 有下述序列：(a)3’-UGGUCUGUUCUC-5’(序列編號11)或3-UGGUUUGUUCUC-5’(序列編號12)所示之RNA序列、(b)3’-GAGAACAGACCA-5’(序列編號13)或3-GAGAACAAACCA-5’(序列編號14)所示之RNA序列、(c)3’-(CNNNNN)3-5’(序列編號15)所示之RNA序列、(d)3’-(NNNNNG)3-5’(序列編號16)所示之RNA序列。
  10. 如申請專利範圍第3項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(5)之含有複製起點之RNA序列含有下述序列：(a)3’-UGGUCUGUUCUC-5’(序列編號11)或3-UGGUUUGUUCUC-5’(序列編號12)所示之RNA序列、(b)3’-GAGAACAGACCA-5’(序列編號13)或3-GAGAACAAACCA-5’(序列編號14)所示之RNA序列、(c)3’-(CNNNNN)3-5’(序列編號15)所示之RNA序列、(d)3’-(NNNNNG)3-5’(序列編號16)所示之RNA序列。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(a)之RNA序列係位於負單股RNA(A) 之3’末端，並且前述(b)之RNA序列係位於5’末端。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(a)之RNA序列係位於負單股RNA(A)之3’末端，並且前述(b)之RNA序列係位於5’末端。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(c)之RNA序列為從負單股RNA(A)之3’末端算起第79個鹼基開始，並且前述(d)之RNA序列為從負單股RNA(A)之5’末端算起第96個鹼基開始。
  14. 如申請專利範圍第11項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(c)之RNA序列為從負單股RNA(A)之3’末端算起第79個鹼基開始，並且前述(d)之RNA序列為從負單股RNA(A)之5’末端算起第96個鹼基開始。
  15. 如申請專利範圍第9項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(5)之含有複製起點之RNA序列為在負單股RNA(A)之3’末端算起第97至116個鹼基的位置進一步包含(e)3’-AAAGAAACGACGGUUUCA-5’(序列編號17)之RNA序列或與上述(e)之RNA序列具有相同鹼基長之18個鹼基長的RNA序列。
  16. 如申請專利範圍第11項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(5)之含有複製起點之RNA序列為在負單股RNA(A)之3’末端算起第97至116個鹼基的位置進一步包含(e)3’-AAAGAAACGACGGUUUCA-5’(序列編號17)之RNA序列或與上述(e)之RNA序列具有相同鹼基長之18個鹼基長的RNA序列。
  17. 如申請專利範圍第13項所述之匿跡型RNA基因表現系統，其中，前述(5)之含有複製起點之RNA序列為在負單股RNA(A)之3’末端算起第97至116個鹼基的位置進一步包含(e)3’-AAAGAAACGACGGUUUCA-5’(序列編號17)之RNA序列或與上述(e)之RNA序列具有相同鹼基長之18個鹼基長的RNA序列。
  18. 一種不使先天免疫機制活化的匿跡型RNA載體，其係含有構成申請專利範圍第1至17項中任一項所述之匿跡型RNA基因表現系統之複合體，並且具有將該複合體導入至動物細胞的活性之RNA載體。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之匿跡型RNA載體，其係形成對動物細胞具有感染能力的病毒粒子。
  20. 一種動物細胞，其係經導入有如申請專利範圍第18或19項所述之匿跡型RNA載體。
  21. 一種匿跡型RNA，其係含有下述(1)至(8)的RNA序列之負單股RNA(A)，並且可與單股RNA結合蛋白質(B)、以及RNA依賴性RNA合成酵素(C)一起形成不使先天免疫機制活化的複合體：(1)編碼有任意蛋白質或功能性RNA之目標RNA序列、(2)構成非編碼區域的先天免疫機制無法辨識之RNA序列，其為源自在動物細胞表現的mRNA之5至49個鹼基長的RNA序列、(3)RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之源自屬於副黏液病毒科的病毒基因體之轉錄起始訊號序列、 (4)該酵素所辨識之源自屬於副黏液病毒科的病毒基因體之轉錄終止訊號序列、(5)含有該酵素所辨識之複製起點的RNA序列、(6)編碼有該酵素之RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列、(7)編碼有調節該酵素活性之蛋白質的RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列、(8)編碼有前述單股RNA結合蛋白質的RNA序列，且為以先天免疫機制無法辨識之方式經結構最佳化之RNA序列；其中，前述(6)之RNA序列所編碼的RNA依賴性RNA合成酵素，為源自屬於副黏液病毒科的RNA病毒之L蛋白質及P蛋白質；前述(7)之RNA序列所編碼的調節該酵素活性之蛋白質，為源自與該RNA病毒相同的病毒之C蛋白質；前述(8)之RNA序列所編碼的單股RNA結合蛋白質，為源自與該RNA病毒相同的病毒之NP蛋白質；前述(3)至(5)之RNA序列均為源自與該RNA病毒相同的病毒之基因體序列中之含有轉錄起始訊號、轉錄終止訊號、以及複製起點之RNA序列；編碼有前述L蛋白質、P蛋白質、C蛋白質以及NP蛋白質之RNA序列係針對人類細胞經最佳化者，並且該RNA序列的GC含量被調整為50至60%的範圍內。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之匿跡型RNA，其中，於前述負單股RNA(A)之3’末端側及5’末端側係包含有：前述(5)之含有RNA依賴性RNA合成酵素所辨識之複製起點的RNA序列，且為分別與3’末端側之RNA序列及5’末端側之RNA序列互補之RNA序列。
  23. 如申請專利範圍第21或22項所述之匿跡型RNA，其中，包含相同或不同序列之前述(3)之轉錄起始訊號序列係經配置為鄰接於前述(2)之RNA序列的更3’末端側，該前述(2)之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各者的3’末端側，並且，前述(4)之轉錄終止訊號序列係經配置為鄰接於：經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各基因序列的5’末端側之RNA序列的更5’末端側。
  24. 如申請專利範圍第21或22項所述之匿跡型RNA，其中，包含相同或不同序列之前述(3)之轉錄起始訊號序列係經配置為鄰接於前述(2)之RNA序列的更3’末端側，該前述(2)之RNA序列係經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各者的3’末端側，並且，前述(4)之轉錄終止訊號序列係經配置為鄰接於：經配置為鄰接於被包含在前述(1)之目標RNA序列之複數個基因序列之各基因序列的5’末端側之RNA序列的更5’末端側：進一步，在其兩端側以具有可藉由複數個限制酵素切斷的限制酵素切斷部 位之匣結構構成，並且該匣結構係複數結合。
  25. 一種再構成申請專利範圍第1至17項中任一項所述之匿跡型RNA基因表現系統之方法，其係包含下述(1)至(5)步驟之方法：(1)準備大腸桿菌步驟，準備表現有T7 RNA聚合酶(polymerase)之大腸桿菌，(2)轉形步驟，將搭載有外來基因RNA以及至少編碼有RNA依賴性RNA合成酵素與RNA結合活性蛋白質之RNA的大腸桿菌用載體，以及將編碼RNA結合活性蛋白質之DNA予以表現的大腸桿菌用載體導入至(1)之大腸桿菌宿主內進行轉形作用、(3)複合體形成步驟，在(2)的轉形大腸桿菌內，形成含有藉由T7 RNA聚合酶表現之外來基因RNA的負單股RNA、與RNA結合活性蛋白質的複合體，(4)準備動物細胞步驟，準備表現有RNA依賴性RNA合成酵素之動物細胞，(5)再構成步驟，將(3)得到之負單股RNA與RNA結合活性蛋白質之複合體導入至(4)的動物細胞宿主內，而再構成由含有負單股RNA、RNA結合活性蛋白質及RNA依賴性RNA合成酵素之複合體所構成之匿跡型RNA基因表現系統。
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