CN110331165B - 用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，包括：制备含有T7终止子、P基因、L基因、NP基因和IRES片段的三种辅助质粒，和含有T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列、T7终止子的pUC57‑Simple质粒；将所述pUC57‑Simple质粒酶切后连接full‑2质粒酶切产物，得到仙台病毒主骨架质粒；提供BSR‑T7/5细胞，使用DMEM无血清完全培养基培养；转染前换液为Opti‑MEM培养基，并加入所述病毒辅助质粒T7‑IRES‑P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂进行转染；将转染后的细胞体进行增殖培养，收集重组仙台病毒。

Description

用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用。
背景技术
仙台病毒(SeV)，也称为1型副流感病毒或HVJ(Hemagglutinating Virus ofJapan，日本血凝病毒)，是副粘病毒科的一种负链单股单链RNA病毒。仙台病毒具有以下几个特征，使得仙台病毒载体在导入外源基因过程中具有很强的优势：(1).仙台病毒的生命周期中，病毒蛋白和基因组均在细胞质内，病毒基因组不与细胞基因组进行整合；(2).仙台病毒能够在细胞全生命周期内进行感染，能够以极高的效率感染大多数细胞，包括慢病毒难以感染的细胞类型；3.表达外源基因高效并且可调控，在体内和体外实验中均可以检测到高表达的目的基因。因此，仙台病毒作为一种高效的基因转导工具被广泛研究。
自从山中伸弥(Shinya Yamanaka)和高桥和利(Kazutoshi Takahashi)在2006年8月报道了将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)细胞重编程为诱导性多能干(iPS)细胞之后，大量实验室尝试利用体细胞重编程为iPS细胞，并取得了许多重要进展。目前，科学家们已经开发了数种方法用于细胞重编程诱导产生iPS细胞，包括慢病毒诱导。然而，这种方法诱导产生iPS细胞，需要进行多次感染，流程繁琐，重编程效率低；且慢病毒包装时效率低、病毒基因组整合目的细胞基因组，造成插入突变和残留表达，干扰诱导效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，旨在解决现有细胞重编程诱导产生iPS细胞的方法，重编程效率低，病毒基因组整合，且包装病毒纯度中容易引入其他活性病毒的问题。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的重组仙台病毒将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，包括以下步骤：
提供pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子，采用infusion融合技术制备pBluescript II SK(+)T7terminator质粒；将所述pBluescript II SK(+)T7terminator质粒采用Kpn1和Not1酶切处理后，分别插入P基因、L基因和NP基因，获得T7-P/L/NP质粒；将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP；
在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57-Simple质粒；将所述pUC57-Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full-2质粒酶切产物，制备得到pUC57-Sev，将所述pUC57-Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒；
提供BSR-T7/5细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染；将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养，经沉淀处理收集重组仙台病毒，其中，所述病毒增殖培养基含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶、以及谷氨酰胺。
本发明的另一方面提供一种将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，包括以下步骤：
提供上述方法制备得到的重组仙台病毒；
接种人体皮肤成纤维细胞，培养至50％～70％汇合度时，在人体皮肤成纤维细胞中加入所述重组仙台病毒溶液，继续培养，感染后换新鲜HDF培养基继续培养，收集iPS细胞，所述重组仙台病毒溶液为Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒和Sev-Myc重组仙台病毒的混合物。
本发明提供的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，具有以下优点：
首先，构建含有T7终止子、P基因、L基因、NP基因和IRES片段的3个病毒包装辅助质粒和含有T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列和T7终止子的仙台病毒主骨架质粒，两者结合形成不依赖辅助包装病毒(通常的辅助病毒为vTF7.3或MVA-T7，两者都是包含完整T7聚合酶序列的重组痘病毒)的纯质粒仙台病毒包装系统。由此形成的纯质粒包装系统，不会引入其他活性病毒，如vTF7.3或MVA-T7工程学病毒，从而可以保证重组仙台病毒的纯度，同时避免了后续杂病毒的污染，提升了病毒包装过程中的安全性，进而在采用重组仙台病毒诱导人体细胞重编程为iPS细胞时，提高诱导效果。
其次，采用P基因、L基因、NP基因对应的三种病毒辅助质粒，P基因、L基因、NP基因聚合在一起形成RNA聚合酶复合体，促进仙台病毒的包装，有利于提高包装效率；而IRES(internal ribosome entry site内部核糖体进入位点)片段，可以不依赖mRNA的帽子结构进入核糖体进行蛋白翻译(通常别的仙台病毒或负黏病毒科病毒包装依赖辅助病毒，辅助病毒有加帽活性，但是依赖加帽活性的包装效率很低)，可以促进T7聚合酶生成的mRNA进一步表达成蛋白的效率，进而提升病毒包装效率。所述仙台病毒主骨架质粒中同时含有T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，其中，在病毒基因组起始位置之前插入一段优化的锤头状核酶序列，可以使仙台病毒的Leader序列的起始位点处断裂，配合病毒基因组终止位置加入的乙肝核酶序列(促使仙台病毒的Trailer序列的最后一个碱基处断裂)，从而获得完整的仙台病毒基因组RNA，显著提升仙台病毒的包装效率。
再次，本发明在仙台病毒包装体系的转染过程中，以BSR-T7/5细胞作为病毒包装细胞系，提高了转染效果和病毒包装生产滴度；同时采用添加聚乙烯亚胺的lipo3000作为转染试剂，所述聚乙烯亚胺通过与DNA结合形成阳离子聚合物介导的内吞作用，竞争性弥补lipo3000通过脂质体介导的内吞作用的不足，从而提高转染效率。
本发明提供的将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，通过构建多顺反子的仙台病毒用于人体皮肤成纤维重编程，可将KLF4、c-MYC、OCT4和SOX2基因导入人体成纤维细胞，诱导生成iPS细胞。本发明提供的采用重组仙台病毒将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，与相同滴度慢病毒相比，其效率提高5倍左右，且诱导获得的iPS细胞能够在体外传代，稳定表达干细胞相关基因同时长期维持干性，解决了慢病毒病毒效率低，重编程困难的问题。
附图说明
图1是本发明实施例提供的锤头状酶序列模式图；
图2是本发明实施例提供的乙肝核酶模式图；
图3是本发明实施例提供的仙台病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP酶切片段电泳结果图；
图4是本发明实施例提供的仙台病毒主骨架质粒pUC57-Sev-GFP酶切片段电泳结果图；
图5是本发明实施例提供的采用lipo3000和lipo3000+PEI法，将pUC57-Sev-GFP质粒转染进BSR-T7/5细胞后的荧光效果图；
图6是本发明实施例提供的BSR-T7/5细胞包装GFP仙台病毒的包装效率比较图；
图7是本发明实施例提供的商品化慢病毒S和重组仙台病毒对人皮肤成纤维细胞的iPS重编程效率比较图；
图8是本发明实施例提供的对传代10次以上的仙台病毒iPS克隆进行碱性磷酸酶染色的结果图；
图9是本发明实施例提供的iPS克隆凝胶电泳检测结果图；
图10是本发明实施例提供的iPS细胞向心肌细胞诱导分化21天后，软骨细胞高表达Collagen II蛋白的荧光效果图；
图11是本发明实施例提供的iPS细胞向心肌细胞诱导分化12天后，心肌细胞高表达肌钙蛋白T的荧光效果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实施例一方面提供一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，包括以下步骤：
S01.提供pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子，采用infusion融合技术制备pBluescript II SK(+)T7terminator质粒；将所述pBluescript II SK(+)T7 terminator质粒采用Kpn1和Not1酶切处理后，分别插入P基因、L基因和NP基因，获得T7-P/L/NP质粒(T7-P/L/NP质粒表示三种质粒，分别为T7-P质粒、T7-L质粒和T7-NP质粒)；将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP(T7-IRES-P/L/NP表示三种病毒辅助质粒，分别为T7-IRES-P病毒辅助质粒、T7-IRES-L病毒辅助质粒和T7-IRES-NP病毒辅助质粒)；
S02.在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57-Simple质粒；将所述pUC57-Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full-2质粒(含有完整仙台病毒基因组序列)酶切产物，制备得到pUC57-Sev，将所述pUC57-Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒；
S03.提供BSR-T7/5细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染；将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养，经沉淀处理收集重组仙台病毒，其中，所述病毒增殖培养基含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶、以及谷氨酰胺。其中，TPCK处理胰酶是采用甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)处理，灭活残留的胰凝乳蛋白酶活性。因此，胰蛋白酶活力更高，糜胰蛋白酶活性被抑制。TPCK处理胰酶能够专一性地切割蛋白分子中精氨酸和赖氨酸位点。
本发明实施例提供的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，具有以下优点：
首先，构建含有T7终止子、P基因/L基因/NP基因、IRES片段的3个辅助质粒和含有T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列和T7终止子的仙台病毒主骨架质粒，两者结合形成不依赖辅助包装病毒(通常的辅助病毒为vTF7.3或MVA-T7，两者都是包含完整T7聚合酶序列的重组痘病毒)的纯质粒仙台病毒包装系统。由此形成的纯质粒包装系统，不会引入其他活性病毒，如vTF7.3或MVA-T7工程学病毒，从而可以保证重组仙台病毒的纯度，同时避免了后续杂病毒的污染，提升了病毒包装过程中的安全性，进而在采用重组仙台病毒诱导人体细胞重编程为iPS细胞时，提高诱导效果。
其次，采用P基因、L基因、NP基因对应的三种病毒辅助质粒，P基因、L基因、NP基因聚合在一起形成RNA聚合酶复合体，促进仙台病毒的包装，有利于提高包装效率；而IRES(internal ribosome entry site内部核糖体进入位点)片段，可以不依赖mRNA的帽子结构，介导mRNA进入核糖体翻译为蛋白质(通常别的仙台病毒或负黏病毒科病毒包装依赖辅助病毒，辅助病毒有加帽活性，但是依赖加帽活性的包装效率很低)，可以促进T7聚合酶生成的mRNA进一步表达成蛋白的效率，进而提升病毒包装效率。所述仙台病毒主骨架质粒中同时含有T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，其中，在病毒基因组起始位置之前插入一段优化的锤头状核酶序列，可以使仙台病毒的Leader序列的起始位点处断裂(如图1所示，箭头所指为断裂处)，配合病毒基因组终止位置加入的乙肝核酶序列(如图2所示，促使仙台病毒的Trailer序列的最后一个碱基处断裂)，从而获得完整的仙台病毒基因组RNA，显著提升仙台病毒的包装效率(仙台病毒的基因组RNA要求十分苛刻，增减仙台病毒基因组均影响其包装效率，常规方法是直接将T7聚合酶连接仙台病毒Leader序列，但是转录不稳定，易产生不受控的剪切碱基，因此效率低下)。
再次，本发明实施例在仙台病毒包装体系的转染过程中，以BSR-T7/5细胞作为病毒包装细胞系，提高了转染效果和病毒包装生产滴度；同时采用添加聚乙烯亚胺的lipo3000作为转染试剂，所述聚乙烯亚胺通过与DNA结合形成阳离子聚合物介导的内吞作用，竞争性弥补lipo3000通过脂质体介导的内吞作用的不足，从而提高转染效率。
具体的，上述步骤S01中，本发明实施例通过构建含有T7终止子、P基因/L基因/NP基因、IRES片段的3个辅助质粒，与含有T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列和T7终止子的仙台病毒主骨架质粒，两者结合形成不依赖辅助包装病毒的纯质粒仙台病毒包装系统。
本发明实施例中，所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP中，所述IRES片段添加在T7启动子后，所述T7终止子添加在T3启动子之前。由于T3启动子也有少量结合T7聚合酶的活性，因此，把T7终止子加在T3前面可以避免结合T7聚合酶。
具体的，满足上述排序的病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP，其制备方法中各片段的获取方法，以及片段之间的融合方法如下：
所述病毒辅助质粒的构建过程中，先提供pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子。所述pBluescript II SK(+)质粒所述pBluescript II SK(+)质粒采用第一引物组扩增获得，所述第一引物组包括：
第一上游引物：CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG
第一下游引物：GAGCTCCACCGCGGTGGC。
以pBluescript II SK(+)质粒为模板，采用第一引物组扩增，获得片段长度2961bp的pBluescript II SK(+)质粒。
所述T7终止子采用第二引物组、以pET-28a(+)作为模板扩增获得，所述第二引物组包括：
第二上游引物：ACCGCGGTGGAGCTCctgctaacaaagcccgaaagg
第二下游引物：AGGGAACAAAAGCTGatccggatatagttcctcc。
以pET-28a(+)为模板，采用第二引物组扩增，获得片段长度为159bp的所述T7终止子。
所述采用infusion融合技术制备pBluescript II SK(+)T7terminator质粒的步骤中，依照VAZYME C115-ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒的操作，将pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子进行infusion融合，制备pBluescript II SK(+)T7terminator质粒。
然后，将pBluescript II SK(+)T7terminator质粒用Kpn1和Not1进行酶切处理，分别插入P基因、L基因、NP基因进行连接，且P基因、L基因、NP基因的酶切位点与P基因一致，由此获得T7-P/L/NP质粒。
进一步的，将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒，然后与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP。所述将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合的步骤中，按照VAZYME C115-ClonExpress Ultra One StepCloning Kit试剂盒的操作，将所述T7-P/L/NP的线性质粒与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP。
其中，所述IRES片段采用第三引物组、以pH2B_mCherry_IRES_puro2作为模板扩增获得，所述第三引物组包括：
第三上游引物：CTATAGGGCGAATTGGGTACCatgcatctagggcggccaattc
第三下游引物：
TTGATCCATGGTGGCGGTACCagcttatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccacgtc。
以pH2B_mCherry_IRES_puro2(addgene#21045)为模板，采用第三引物组扩增，获得IRES片段。
上述步骤S02中，在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57-Simple质粒，并使得所述pUC57-Sev中，所述T7启动子和所述锤头状酶序列添加在M13fwd序列后，所述乙肝核酶序列和所述T7终止子添加在乳糖操纵子之前。具有该序列特征的pUC57-Sev，在病毒基因组起始位置之前插入一段优化的锤头状核酶序列，可以使仙台病毒的在Leader序列的起始位点处断裂，配合病毒基因组终止位置加入的乙肝核酶序列(促使仙台病毒的Trailer序列的最后一个碱基处断裂)，获得完整的仙台病毒基因组序列，从而显著提升仙台病毒的包装效率。
具体的，所述pUC57-Simple中插入的序列如下：
ACGCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGAGTCTAGACTCCGTCACCAAACAAGAGAAAAAACATGTATGGGATATACAATGAAGTTAGACAGGATTTTAGGGTCAAAGTATCCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGCTGCCAAAGTTCACGCGGCCGCCGTACCGCGGTACCTGGAAGTCTTGGACTTATCCATATGACAATAGTAAGAAAAACTTACAAGAAGACAAGAAAATTTAATAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACCCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATGGGCCC。
将所述pUC57-Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full-2质粒(full-2表示构建的包含仙台病毒全序列的质粒)酶切产物，制备得到pUC57-Sev。Full-2是包含仙台病毒基因组的质粒，这一步可以将仙台病毒基因组序列加到构建的原件之间(仙台病毒基因组序列构建在T7聚合酶+锤头状核酶序列之后，乙肝核酶序列+T7终止子之前)。
进一步的，将所述pUC57-Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒。在一些实施例中，将pUC57-Sev通过酶切连接GFP片段，获得pUC57-Sev-GFP质粒；在一些实施例中，将pUC57-Sev通过酶切连接Klf4-Oct4-Sox2基因片段获得pUC57-Sev-Klf4-Oct4-Sox2质粒；在一些实施例中，将pUC57-Sev通过酶切连接c-Myc基因片段获得pUC57-Sev-Myc质粒。
特别的，pUC57-Sev-Klf4-Oct4-Sox2质粒同时含有三个基因片段，跟其他含多个基因片段的质粒相比，pUC57-Sev-Klf4-Oct4-Sox2质粒中三个基因片段均保留完整的天然结构序列，并能分开表达，从而保证表达的准确性。
本发明实施例可以将pUC57-Sev-Klf4-Oct4-Sox2质粒和pUC57-Sev-Myc质粒经过包装可以分别得到Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒和Sev-Myc重组仙台病毒，两者共同加入培养后的人体细胞中，通过两种重组仙台病毒中四类因子的共同作用，诱导人体细胞重编程为iPS细胞。
上述步骤S03中，选取BSR-T7/5细胞(稳定表达T7聚合酶的BHK-21细胞)作为重组仙台病毒的包装细胞，BSR-T7/5细胞是由BHK-21细胞稳定表达野生型T7RNA聚合酶基因获得。以BSR-T7/5细胞作为病毒包装细胞系，提高了转染效果和病毒包装生产滴度。其中Sev-GFP、Sev-Klf4-Oct4-Sox2和Sev-Myc重组仙台病毒，均使用BSR-T7/5细胞包装获得。
具体的，先将BSR-T7/5细胞接种、培养。在一个具体实施例中，接种BSR-T7/5细胞至6孔板细胞培养瓶，1×106个细胞/孔，在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中过夜培养，使用2mL DMEM无血清完全培养基培养。其中，DMEM无血清完全培养基中含有质量百分含量为1％的谷氨酰胺(GibcoTMGlutaMAXTM货号35050061)，和质量百分含量为2％的PALLTMUltroserTMG serum substitute，货号15950-017)。
转染前，换液为1mL Opti-MEM培养基(GibcoTMOpti-MEMTM货号31985062)，然后加入所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养。
在优选实施例中，所述加入三种所述病毒辅助质粒(T7-IRES-P病毒辅助质粒、T7-IRES-L病毒辅助质粒和T7-IRES-NP病毒辅助质粒)和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养的步骤中，每5×105个细胞中添加2～8μg病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP，每5×105个细胞中添加2～15μg仙台病毒主骨架质粒，且所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒的质量比为2.5:4，从而使得病毒辅助质粒和仙台病毒主骨架质粒在下述步骤中能顺利并高效转染BSR-T7/5细胞，获得包装病毒。若所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒的质量比不为2.5:4，会导致仙台病毒包装滴度下降。在具体优选实施例中，每5×105个细胞中添加2.5μg病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP，每5×105个细胞中添加4μg仙台病毒主骨架质粒。
进一步的，在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染。采用添加聚乙烯亚胺的lipo3000作为转染试剂，所述聚乙烯亚胺通过与DNA结合形成阳离子聚合物介导的内吞作用，竞争性弥补lipo3000通过脂质体介导的内吞作用的不足，从而提高转染效率。优选的，所述转染试剂中，所述聚乙烯亚胺的浓度为20～100μg/mL。若所述聚乙烯亚胺的浓度过低，则其与DNA结合形成阳离子聚合物介导的内吞作用效果不明显；若所述聚乙烯亚胺的浓度过高，则其活性过高，会抑制lipo3000通过脂质体介导的内吞作用，反而影响转染效果。
具体的，病毒辅助质粒为pUC57-SevGFP质粒时，经转染制备得到的重组仙台病毒为Sev-GFP重组仙台病毒；病毒辅助质粒为pUC57-Sev-Klf4-Oct4-Sox2质粒时，经转染制备得到的重组仙台病毒为Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒；病毒辅助质粒为Sev-Myc质粒时，经转染制备得到的重组仙台病毒为Sev-Myc重组仙台病毒。
转染结束如6小时后，换液为2mL DMEM无血清完全培养基培养，在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中继续培养如48小时。
为了验证包装效率，可去掉培养基，使用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞去除培养基残液，加入0.5mL TrypLE(GibcoTMTrypLETMExpress(1X),Phenol Red货号12605010)进行消化，消化结束，使用细胞计数板，在荧光显微镜下检测GFP表达细胞数量，判断病毒包装效率。燃后转入细胞，添加DMEM无血清完全培养基培养，在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中继续培养24小时。
进一步的，使用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞去除培养基残液，将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养。所述病毒增殖培养基为DMEM病毒增殖培养基，且DMEM病毒增殖培养基中含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶、以及谷氨酰胺。所述TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶可以将刚组装的病毒中存在的F基因位点进行消化，从而活化病毒活性，使其具有浸染活性，从而快速增殖。
优选实施例中，所述病毒增值培养基中，所述重组人肺β类胰蛋白酶或TPCK处理胰酶的浓度为2-50μg/mL，从而保证刚组装的病毒中存在的F基因位点进行充分消化，显著提高增殖速率。
在一些优选实施例中，所述病毒增殖培养基为DMEM病毒增殖培养基，且DMEM病毒增殖培养基中含有重组人肺β类胰蛋白酶和谷氨酰胺，此时，病毒生产过程中可以在减少使用生物源物质的情况下，提高了病毒活性。
本发明实施例的另一方面提供一种将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，包括以下步骤：
E01.提供上述方法制备得到的重组仙台病毒；
E02.接种人体皮肤成纤维细胞，培养至50％～70％汇合度时，在人体皮肤成纤维细胞中加入所述重组仙台病毒溶液，继续培养，感染后换新鲜HDF培养基继续培养，收集iPS细胞，所述重组仙台病毒溶液为Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒和Sev-Myc重组仙台病毒的混合物。
本发明实施例提供的将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，通过构建多顺反子的仙台病毒用于人体皮肤成纤维重编程，可将KLF4、c-MYC、OCT4和SOX2基因导入人体成纤维细胞，诱导生成iPS细胞。本发明实施例提供的采用重组仙台病毒将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，与相同滴度慢病毒相比，其效率提高5倍左右，且诱导获得的iPS细胞能够在体外传代，稳定表达干细胞相关基因同时长期维持干性，解决了慢病毒病毒效率低，重编程困难的问题。
具体的，上述步骤E01中，重组仙台病毒的制备及制备过程中的优选情形，如上文所述。为了节约篇幅，此处不再赘述。
上述步骤E02中，接种人体皮肤成纤维细胞，采用HDF完全培养基(FibroGROTMComplete Media Kit，Merck，SCMF001)，在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中培养。培养至50％～70％汇合度时，在人体皮肤成纤维细胞中加入所述重组仙台病毒溶液，继续培养，此时，加入的重组仙台病毒溶液为Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒和Sev-Myc重组仙台病毒的混合物。通过两种重组仙台病毒中四类因子的共同作用，诱导人体细胞重编程为iPS细胞。优选的，所述在人体皮肤成纤维细胞中加入所述重组仙台病毒溶液的步骤中，所述重组仙台病毒溶液的滴度为3MOI～10MOI。
感染一天后，换液成新鲜HDF完全培养基，去除剩余的病毒，继续培养。隔一段时间重新换一次HDF完全培养基，收集iPS细胞。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，包括以下步骤：
S11.以pBluescript II SK(+)质粒为模板，采用第一引物组扩增，获得片段长度2961bp的pBluescript II SK(+)质粒，其中，所述第一引物组包括：
第一上游引物：CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG
第一下游引物：GAGCTCCACCGCGGTGGC。
以pET-28a(+)为模板，采用第二引物组扩增，获得片段长度为159bp的所述T7终止子。所述第二引物组包括：
第二上游引物：ACCGCGGTGGAGCTCctgctaacaaagcccgaaagg
第二下游引物：AGGGAACAAAAGCTGatccggatatagttcctcc。
依照VAZYME C115-ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒的操作，将pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子进行infusion融合，制备pBluescript II SK(+)T7terminator质粒。
将pBluescript II SK(+)T7terminator质粒用Kpn1和Not1进行酶切处理，分别插入P基因、L基因、NP基因进行连接，获得T7-P/L/NP质粒。
以pH2B_mCherry_IRES_puro2(addgene#21045)为模板，采用第三引物组扩增，获得IRES片段。所述第三引物组包括：
第三上游引物：CTATAGGGCGAATTGGGTACCatgcatctagggcggccaattc
第三下游引物：
TTGATCCATGGTGGCGGTACCagcttatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccacgtc。
将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成4595bp的线性质粒，然后与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP。所述将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合的步骤中，按照VAZYME C115-ClonExpress Ultra One StepCloning Kit试剂盒的操作，将所述T7-P/L/NP的线性质粒与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP。
S12.在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57-Simple质粒，并使得所述pUC57-Sev中，所述T7启动子和所述锤头状酶序列添加在M13fwd序列后，所述乙肝核酶序列和所述T7终止子添加在乳糖操纵子之前。所述pUC57-Simple中插入的序列如下：
ACGCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGAGTCTAGACTCCGTCACCAAACAAGAGAAAAAACATGTATGGGATATACAATGAAGTTAGACAGGATTTTAGGGTCAAAGTATCCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGCTGCCAAAGTTCACGCGGCCGCCGTACCGCGGTACCTGGAAGTCTTGGACTTATCCATATGACAATAGTAAGAAAAACTTACAAGAAGACAAGAAAATTTAATAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACCCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATGGGCCC。
将所述pUC57-Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full-2质粒酶切产物，制备得到pUC57-Sev。将所述pUC57-Sev分别与GFP片段，Klf4-Oct4-Sox2基因片段、c-Myc基因片段连接，得到pUC57-Sev-GFP、pUC57-Sev-Klf4-Oct4-Sox2和pUC57-Sev-Myc三种仙台病毒主骨架质粒。
S13.第一天：接种BSR-T7/5细胞至6孔板细胞培养瓶，1*106个细胞/孔，在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中过夜培养，使用2mL DMEM无血清完全培养基培养：DMEM(GibcoTM货号11995065)、质量百分含量为1％的谷氨酰胺(GibcoTMGlutaMAXTM货号35050061)质量百分含量为2％(PALLTMUltroserTMG serum substitute货号15950-017)。
第二天：转染前换液为1mL Opti-MEM培养基(GibcoTMOpti-MEMTM货号31985062)，将2.5μg仙台病毒辅助质粒(T7-IRES-P病毒辅助质粒、T7-IRES-L病毒辅助质粒和T7-IRES-NP病毒辅助质粒)和4.0μg仙台病毒主骨架质粒混合，分3组进行操作：第一组按照lipo3000说明书进行操作(InvitrogenTMLipofectamineTM3000货号L3000008)进行操作；第二组按照按照lipo3000说明书进行操作再添加30μg/mL PEI(聚乙烯亚胺)；第三组做空白对照，不加任何转染试剂。转染后混匀，再加入BSR-T7/5细胞。6小时后换液为2mL DMEM无血清完全培养基培养，在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中继续培养48小时。
第四天：去掉培养基，使用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞去除培养基残液，加入0.5mL TrypLE(GibcoTMTrypLETMExpress(1X),Phenol Red货号12605010)进行消化，消化结束，使用细胞计数板，在荧光显微镜下检测GFP表达细胞数量，判断病毒包装效率，后转入25cm2细胞，添加5mL DMEM无血清完全培养基培养，在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中继续培养24小时。
第五天：使用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞去除培养基残液，加入5mL DMEM病毒增殖培养基：DMEM(GibcoTM货号11995065)、质量百分含量为1％的谷氨酰胺(GibcoTMGlutaMAXTM货号35050061)、浓度为10μg/mL重组人肺β类胰蛋白酶(PromegaTMrhLung Beta Tryptase货号PAG5631)在温度为37℃，体积百分含量为5％的CO2培养箱中继续培养72h。
第八天：将细胞用培养细胞液进行吹打混匀，将细胞混悬液液进行收集，-70℃-37℃循环冻融2次后，1000rpm/min 4℃离心5分钟，去除细胞沉淀，获得重组仙台病毒病毒上清。
S14.转染前1天，将5-8*104个细胞接种6孔板，加入2mL HDF完全培养基(FibroGROTMComplete Media Kit，Merck，SCMF001)，37℃，5％CO2培养箱中培养。实验分3组，①空白对照组、②慢病毒感染对照组(M公司商品化慢病毒S)按照说明书进行操作、③仙台病毒实验组(Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒+Sev-myc重组仙台病毒)，每组2个平行对照。
病毒感染：
第一天：孔中细胞生长到50-70％汇合度时，将空白的一个孔消化下来细胞计数。仙台病毒实验组各取出1mL细胞培养液，将新鲜的1mL HDF完全培养基与病毒混合，再轻柔的加入细胞培养孔中。慢病毒感染对照组按照操作说明书，将慢病毒和5μg/mL polybrene与新鲜的1mL HDF完全培养基混合，再缓缓加入细胞培养孔。
第二天：空白对照组、仙台病毒实验组换液2mL新鲜HDF完全培养基。慢病毒感染对照组进行二次感染，添加慢病毒溶液量与第一次相同。
第三天：空白对照组、仙台病毒实验组无操作。慢病毒感染对照组去掉旧培养基，用PBS轻柔洗2次，加入2mL新鲜HDF完全培养基。
第四天：空白对照组、仙台病毒实验组换液2mL新鲜HDF完全培养基。慢病毒感染对照组换液2mL新鲜HDF完全培养基。
第五天：空白对照组、仙台病毒实验组无操作。慢病毒感染对照组换液2mL新鲜HDF完全培养基。
第六天：空白对照组、仙台病毒实验组换液2mL新鲜HDF完全培养基。慢病毒感染对照组换液2mL新鲜HDF完全培养基。用Laminin-521(Biolaminin，货号LN521)按照15μg/mL包被6孔板，4℃过夜。
第七天：将感染孔细胞消化下来，离心后，用12mL NutriStem XF培养基(BI
Figure BDA0002057206690000171
hPSC XF Medium货号05-100-1A)重悬细胞，接种到弃去包被液的六孔板中。
第八至十四天：每天更换NutriStem XF培养基观察克隆情况。
iPS克隆传代：
待iPS细胞克隆生长到合适尺寸后，挑选边缘清晰、无分化的克隆团，在显微镜下将其划分成小块，用200μl枪头吸出克隆，转移至Laminin-521(Biolaminin货号LN521)按照15μg/mL包被的24孔板中继续生长。
鉴定与检测
一、仙台病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP酶切鉴定
T7-IRES-P/L/NP经过Kpn1和Not1双酶切后理论上会生成4个条带，其中，T7-IRES-P的4个条带为：3009bp、1724bp、485bp和136bp；T7-IRES-NP的4个条带为：3009bp、1586bp、485bp和136bp；T7-IRES-L的4个条带为：6696bp、3009bp、485bp和136bp。如图3所示(左图模拟结果，右图实际凝胶电泳结果)，酶切片段结果与预期相符，证明质粒与预期结构相符。
二、仙台病毒主骨架质粒pUC57-Sev-GFP酶切鉴定
pUC57-Sev-GFP经过Kpn1和Not1双酶切后理论上会生成3个条带：15183bp、3224bp和780bp。酶切片段结果与预期相符，证明质粒与预期结构相符，如图4所示。
三、不同转染方法的病毒包装效率比较
如图5所示，分别采用lipo3000和lipo3000+PEI法，将pUC57-Sev-GFP质粒转染进BSR-T7/5细胞后，检测带有GFP荧光表达的细胞数量占总细胞数量的百分比，计数5次取平均值来比较不同转染方法的包装效率。结果如图6所示，组1，lipo3000转染组的包装效率为0.09％；组2，lipo3000+PEI转染组的包装效率为0.61％，组3，空白组包装效率为0。lipo3000+PEI转染组的包装效率是lipo3000转染组的6.8倍。
四、皮肤成纤维细胞重编程iPS细胞诱导效率比较
重编程结束后，ESC样克隆数量计数，细胞重编程效率的计算公式如下：
重编程效率＝ESC样克隆数量÷感染前细胞数量×100％。
各组iPS细胞重编程效率统计如图7所示。慢病毒感染对照组的iPS重编程效率为0.006％，而仙台病毒感染实验组的iPS重编程效率为0.03％，重编程效率是慢病毒S感染组的5.0倍。
五、iPS克隆的鉴定
1.碱性磷酸酶检测鉴定
按照碱性磷酸酶染色试剂盒(北京雷根生物货号DE0004)说明书进行操作：将试剂B1(AS-BI染色液)与试剂B2(FBB染色液)按1：1比例混合均匀后，即为ALP显色底物溶液，4℃避光保存备用。取24孔板培养的待检测iPS细胞，弃液，PBS清洗干净；加入试剂A(ALP固定液)固定或4％多聚甲醛固定，PBS清洗；滴加配制好的ALP显色底物溶液，避光孵育30min；PBS清洗后，放在倒置显微镜下观察拍照。
iPS细胞具有高碱性磷酸酶活性，对传代10次以上的仙台病毒iPS克隆进行碱性磷酸酶染色，结果如图8所示，可见克隆团细胞均染成蓝色。
2.iPS细胞基因表达鉴定
方法如下：
2.1iPS细胞提取RNA
(1)选取传代10次以上的iPS克隆，接种至24孔板中，培养至50-80％覆盖率；
(2)弃掉培养板中的培养基，PBS洗涤两次后，每孔中加入500μl TRNzolUniversal试剂，反复吹打，在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
(3)4℃，12,000rpm离心10min，取上清；
(3)加入五分之一体积的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min；
(4)4℃，12,000rpm离心15min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新的离心管中。
(5)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。
(6)4℃，12,000rpm离心10min，去上清，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
(7)加入1mL 75％乙醇(用RNase-free ddH2O配制)洗涤沉淀。
(8)4℃，10,000rpm离心5min。倒出液体，注意不要倒出沉淀。
(9)室温放置晾干，根据实验需要，加入30-100μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
2.2逆转录PCR
(1)按下表在冰浴条件下配制反应液：
Figure BDA0002057206690000201
(2)按下表设置PCR反应条件：
Figure BDA0002057206690000202
2.3琼脂糖凝胶电泳检测逆转录PCR产物
配制1％浓度的琼脂糖凝胶，上样检测2.2中获得的PCR产物，凝胶成像仪进行拍照观察电泳结果，检测结果如图9所示，可见仙台病毒诱导感染生产的iPS克隆表达SOX2、OCT3/4、LIN28三个基因。
3.iPS细胞多能性检测
方法如下：
3.1 iPS细胞向软骨细胞的诱导分化
(1)成软骨诱导分化完全培养基的配制
Figure BDA0002057206690000203
Figure BDA0002057206690000211
成软骨诱导分化完全培养基，包括：44.5mL DMEM(H)、5mL FBS、500uL试剂A、5uL试剂B、5uL试剂C和50uL试剂D，完全混匀后，0.22um滤膜过滤除菌。
(2)成软骨诱导分化
选取传代10次以上的仙台病毒诱导生成的iPS细胞，向软骨方向进行诱导分化。
分化第1天：弃去iPS细胞培养皿中旧培养液，加入成软骨诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养3天。
分化第4-20天：每隔两天弃去培养皿中的培养液，补加成软骨诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
分化第21天：软骨细胞已分化完全，可用于下一步应用或检测分析。
诱导后21天用免疫荧光染色法检测软骨细胞标志物Collagen II的表达情况，利用Leica倒置荧光显微镜进行拍摄。仙台病毒感染组的iPS细胞所诱导的软骨细胞高表达Collagen II蛋白(绿色荧光通道)，如图10所示，证明仙台病毒诱导iPS细胞具有向软骨细胞分化的能力。
(3)软骨细胞的鉴定
分化第21天，利用Collagen II免疫荧光抗体检测软骨细胞标志物Collagen II的表达情况。
3.2iPS细胞向心肌细胞的诱导分化
(1)心肌方向诱导分化
心肌的诱导分化使用Thermo Fisher Scientific公司的PSC CardiomyocyteDifferentiation Kit(Cat.No:A2921201)，具体步骤如下：
选取传代10次以上的仙台病毒诱导生成的iPS细胞，进行心肌方向的诱导分化。
分化第1天：弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的CardiomyocyteDifferentiation Medium A，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
分化第3天：细胞状态开始变差，且会出现脱落的死细胞。弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的Cardiomyocyte Differentiation Medium B，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
分化第5-11天：细胞状态会变的更差，且仍然会出现脱落的死细胞。弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的Cardiomyocyte Maintenance Medium，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，此后每两天更换新鲜的Cardiomyocyte Maintenance Medium。
(2)心肌细胞的鉴定
分化成熟的心肌细胞利用Cardiac Troponin T免疫荧光抗体检测心肌细胞标志物Cardiac Troponin T(心肌肌钙蛋白T)的表达情况。
诱导后第12天，利用免疫荧光染色法检测心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T以及肌动蛋白的表达情况，利用Leica倒置荧光显微镜进行拍摄。如图11所示，可以看出，仙台病毒感染组的iPS细胞所诱导的心肌细胞高表达肌钙蛋白T(绿色荧光通道)，证明仙台病毒诱导iPS细胞具有心肌细胞方向分化的能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市瑞亚再生医学科技有限责任公司
<120> 用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用
<130> 2019
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cagcttttgt tccctttagt gaggg 25
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gagctccacc gcggtggc 18
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
accgcggtgg agctcctgct aacaaagccc gaaagg 36
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agggaacaaa agctgatccg gatatagttc ctcc 34
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctatagggcg aattgggtac catgcatcta gggcggccaa ttc 43
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ttgatccatg gtggcggtac cagcttatca tcgtgttttt caaaggaaaa ccacgtc 57
<210> 7
<211> 533
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
acgcgttaat acgactcact atagggagat tggtctgatg agtccgtgag gacgaaacgg 60
agtctagact ccgtcaccaa acaagagaaa aaacatgtat gggatataca atgaagttag 120
acaggatttt agggtcaaag tatccaccct gaggagcagg ttccagaccc tttgctttgc 180
tgccaaagtt cacgcggccg ccgtaccgcg gtacctggaa gtcttggact tatccatatg 240
acaatagtaa gaaaaactta caagaagaca agaaaattta ataggataca tatctcttaa 300
actcttgtct ggtggccggc atggtcccag cctcctcgct ggcgccggct gggcaacatt 360
ccgaggggac cgtcccctcg gtaatggcga atgggaccct gctaacaaag cccgaaagga 420
agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 480
acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatggg ccc 533

Claims (7)

1.一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子，采用infusion融合技术制备pBluescript II SK(+) T7 terminator质粒；将所述pBluescript II SK(+) T7terminator质粒采用Kpn1和Not1酶切处理后，分别插入P基因、L基因和NP基因，获得T7-P/L/NP质粒；将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP；所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP中，所述IRES片段添加在T7启动子后，所述T7终止子添加在T3启动子之前；
在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57-Simple质粒，且所述T7启动子和所述锤头状酶序列添加在M13 正向序列后，所述乙肝核酶序列和所述T7终止子添加在乳糖操纵子之前；将所述pUC57-Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full-2质粒酶切产物，制备得到pUC57-Sev，将所述pUC57-Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒；
提供BSR-T7/5细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染；将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养，经沉淀处理收集重组仙台病毒，其中，所述病毒增殖培养基含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶，以及谷氨酰胺，其中，所述加入所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养的步骤中，每5×105个细胞中添加2~8μg病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP，每5×105个细胞中添加2~15μg仙台病毒主骨架质粒，且所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒的质量比为2.5:4；所述转染试剂中，所述聚乙烯亚胺的浓度为20~100μg/mL。
2.如权利要求1所述的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，所述pBluescript II SK(+)质粒采用第一引物组扩增获得，所述pBluescript II SK(+)质粒的片段长度2961bp，所述第一引物组包括：
第一上游引物：CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG
第一下游引物：GAGCTCCACCGCGGTGGC；
所述T7终止子采用第二引物组、以pET-28 a (+)作为模板扩增获得，所述T7终止子的片段长度为159bp，所述第二引物组包括：
第二上游引物：ACCGCGGTGGAGCTCctgctaacaaagcccgaaagg
第二下游引物：AGGGAACAAAAGCTGatccggatatagttcctcc；
所述IRES片段采用第三引物组、以pH2B_mCherry_IRES_puro2作为模板扩增获得，所述第三引物组包括：
第三上游引物：CTATAGGGCGAATTGGGTACCatgcatctagggcggccaattc
第三下游引物：TTGATCCATGGTGGCGGTACCagcttatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccacgtc。
3.如权利要求2所述的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，所述采用infusion融合技术制备pBluescript II SK(+) T7 terminator质粒的步骤中，依照VAZYME C115-ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒的操作进行infusion融合，制备pBluescript II SK(+) T7 terminator质粒；
所述将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合的步骤中，VAZYME C115-ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒的操作进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP。
4.如权利要求1所述的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，所述pUC57-Simple中插入的序列如下：
ACGCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGAGTCTAGACTCCGTCACCAAACAAGAGAAAAAACATGTATGGGATATACAATGAAGTTAGACAGGATTTTAGGGTCAAAGTATCCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGCTGCCAAAGTTCACGCGGCCGCCGTACCGCGGTACCTGGAAGTCTTGGACTTATCCATATGACAATAGTAAGAAAAACTTACAAGAAGACAAGAAAATTTAATAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACCCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATGGGCCC。
5.如权利要求1至4任一项所述的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，所述病毒增殖培养基中，所述重组人肺β类胰蛋白酶或TPCK处理胰酶的浓度为2-50μg/mL。
6.一种将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供权利要求1至5任一项所述方法制备得到的重组仙台病毒；
接种人体皮肤成纤维细胞，培养至50%~70%汇合度时，在人体皮肤成纤维细胞中加入所述重组仙台病毒溶液，继续培养，感染后换新鲜HDF培养基继续培养，收集iPS细胞，所述重组仙台病毒溶液为Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒和Sev-Myc重组仙台病毒的混合物。
7.如权利要求6所述的将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于，所述在人体皮肤成纤维细胞中加入所述重组仙台病毒溶液的步骤中，所述重组仙台病毒溶液的滴度为3 MOI ~10MOI。
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