CN112538498B - 重组仙台病毒的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组仙台病毒的构建方法，包括：构建质粒pCAGGS‑NP/P/L；以仙台病毒逆转录样品为模板扩增SeV‑01/02 DNA；扩增线性化pUC57‑insert质粒收集pUC‑insert DNA；将SeV‑01/02 DNA片段和pUC‑insert DNA融合，获得Sev‑full质粒，酶切得到Sev‑full‑Not1；合成pUC57‑A质粒，酶切收集A‑Not1，与Sev‑full‑Not1连接得到Sev‑A质粒；提供293T细胞，加入pCAGGS‑NP/P/L、Sev‑A和T7‑opt三种质粒，转染得到重组仙台病毒。

Description

重组仙台病毒的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组仙台病毒的构建方法，一种用于将PBMC重编程为iPS的试剂盒，以及一种将PBMC重编程为iPS细胞的方法。
背景技术
仙台病毒(SeV)，也称为1型副流感病毒或HVJ(Hemagglutinating Virus ofJapan，日本血凝病毒)，是副粘病毒科的一种负链单股单链RNA病毒。仙台病毒具有以下特征：(1)仙台病毒的生命周期中，病毒蛋白和基因组均在细胞质内，病毒基因组不与细胞基因组进行整合；(2)仙台病毒能够在细胞全生命周期内进行感染，能够以极高的效率感染大多数细胞，包括慢病毒难以感染的细胞类型；(3)表达外源基因高效并且可调控，在体内和体外实验中均可以检测到高表达的目的基因。由于具有上述特征，仙台病毒能够通过反向遗传学的开发，成功地进行重组改造，以表达相应的外源基因，同时不会将基因重组引入宿主细胞基因组。因此，仙台病毒作为一种高效的基因转导工具被广泛研究。
山中伸弥(Shinya Yamanaka)和高桥和利(Kazutoshi Takahashi)在2006年8月报道了将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)细胞重编程为诱导性多能干(iPS)细胞。该方法使用逆转录病毒进行基因导入操作，在病毒转基因进入细胞基因组时容易造成致癌风险。目前，科学家们已经开发了数种方法用于细胞重编程诱导产生iPS细胞，包括腺病毒载体和转座子替代方法，依然存在病毒整合风险。使用质粒DNA转染或小分子诱导生成iPS细胞，由于蛋白表达水平较低，因此重编程效率低下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组仙台病毒的构建方法，旨在解决细胞重编程诱导产生iPS细胞的方法，重编程效率低，且包装病毒纯度中容易引入其他活性病毒的问题的问题。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的重组仙台病毒将PBMC重编程为iPS的试剂盒和方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种重组仙台病毒的构建方法，包括以下步骤：
提供pCAGGS线性化载体、NP基因、P基因和L基因，将NP基因、P基因和L基因分别与pCAGGS线性化载体融合，构建质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L；
以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段和SeV-02 DNA片段；在pUC57-Simple中插入第一序列，获得pUC57-inser质粒，采用EcorI-HF酶切后获得线性化pUC57-insert质粒；采用第三引物对对线性化pUC57-insert质粒扩增，获得pUC-insertDNA；将SeV-01 DNA片段、SeV-02 DNA片段和pUC-insert DNA融合，获得Sev-full质粒；
在pUC57-Simple中插入表达功能性基团A的第二序列，获得pUC57-A质粒，NotI-HF限制性内切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段；使用NotI-HF限制性内切酶对Sev-full质粒酶切处理，收集Sev-full-Not1酶切片段；将A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段连接，得到Sev-A质粒；
提供293T细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述质粒pCAGGS-NP、所述质粒pCAGGS-P、所述质粒pCAGGS-L、所述Sev-A质粒和T7-opt质粒混合培养后进行转染、增殖培养，得到重组仙台病毒，其中，所述增殖培养采用无血清培养基。
本发明第二方面提供一种用于将PBMC重编程为iPS的试剂盒，所述试剂盒包括仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS，其中，所述仙台病毒载体Sev-KOS包括表达Klf4的基因、表达Oct3/4的基因和表达Sox的基因；所述仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc包括表达p53DD的基因和表达c-Myc的基因；仙台病毒载体Sev-p53DD-UL包括表达p53DD的基因、表达Lin28的基因和表达MycL的基因；且所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变。
本发明第三方面提供一种将PBMC重编程为iPS细胞的方法，包括以下步骤：
提供重组仙台病毒溶液，所述重组仙台病毒溶液包括按照上述方法制备的Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS，其中，所述仙台病毒载体Sev-KOS包括表达Klf4的基因、表达Oct3/4的基因和表达Sox的基因；所述仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc包括表达p53DD的基因和表达c-Myc的基因；仙台病毒载体Sev-p53DD-UL包括表达p53DD的基因、表达Lin28的基因和表达MycL的基因；且所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变；
接种并培养PBMC细胞，在所述PBMC细胞中加入所述重组仙台病毒溶液，继续培养，将所述PBMC细胞感染并重编程为iPS细胞。
本发明提供的重组仙台病毒的构建方法，将pCAGGS载体质粒、仙台病毒基因组质粒一同转染293T细胞系(稳定表达密码子优化过的T7 RNA聚合酶的293T细胞)，获得高滴度的仙台病毒。具体的，本发明具有以下优点：
第一，以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段和SeV-02 DNA片段；再与插入第一序列的pUC57-inser质粒的酶切产物融合形成Sev-full质粒，可以根据不同特性的仙台病毒灵活合成所需要的的质粒；
第二，对pCAGGS质粒进行改造，添加P基因、L基因、NP基因，三种基因聚合后形成RNA聚合酶复合体，促进仙台病毒的包装，有利于提高包装效率；同时，质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L利用CAG启动子，提高病毒表达效果；
第三，本发明选择293T细胞系转染系统，在加入所述质粒pCAGGS-NP、所述质粒pCAGGS-P、所述质粒pCAGGS-L、所述Sev-A质粒和T7-opt质粒后，可以获得优异的病毒包装效果；
第四，本发明采用基因合成和高保真酶的扩增，同时结合无血清培养基的培养，赋予重组仙台病毒良好的安全性能。
本发明提供的用于将PBMC重编程为iPS的试剂盒，包括仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS。该试剂盒提供的仙台病毒载体能够表达多个完整外援基因顺反子，并通过将基因p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc(或p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2、Lin28和MycL)导入人外周血单核细胞(PBMC)，能够诱导PBMC形成iPS细胞。采用含有本发明试剂盒的仙台病毒载体将PBMC诱导为iPS，诱导效率为慢病毒试剂盒的10倍-20倍，且诱导产生的iPS细胞能够在体外稳定传代，稳定表达。此外，所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变，不仅有利于提高iPS诱导效率，而且由于得到的重组仙台病毒具有较好的温度敏感性，因此，其安全性能大幅提高。
本发明提供的用于将PBMC重编程为iPS的方法，采用含有仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS的重组仙台病毒溶液诱导PBMC。该方法中诱导PBMC重编程为iPS细胞的仙台病毒能够表达多个完整外援基因顺反子，并通过将基因p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc(或p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2、Lin28和MycL)导入人外周血单核细胞(PBMC)，诱导PBMC形成iPS细胞。采用含有该方法将PBMC诱导为iPS，诱导效率为慢病毒试剂盒的10倍-20倍，且诱导产生的iPS细胞能够在体外稳定传代，稳定表达。此外，所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变，使得仙台病毒具有温度敏感性，能够提高iPS细胞的诱导效率；同时，在高于39℃的条件下活力降低甚至消失，因此，采用本发明的重组仙台病毒诱导iPS细胞具有较好的安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A是本发明实施例提供的质粒pCAGGS-NP的图谱；
图1B是本发明实施例提供的质粒pCAGGS-P的图谱；
图1C是本发明实施例提供的质粒pCAGGS-L的图谱；
图2是本发明实施例提供的将pCAGGS线性化载体和NP基因DNA片段制备成质粒pCAGGS-NP的流程示意图；
图3是本发明实施例提供的将SeV-01 DNA片段、SeV-02 DNA片段和pUC-insertDNA片段融合成Sev-full质粒的流程示意图；
图4是本发明实施例提供的Sev-full质粒的图谱；
图5是本发明实施例提供的pUC57-Mito-GFP质粒的图谱；
图6是本发明实施例提供的Sev-Mito-GFP质粒的图谱；
图7是本发明实施例提供的病毒稀释示意图；
图8是本发明实施例提供的质粒Sev-KOS(Y942H)质粒的图谱；
图9是本发明实施例提供的质粒Sev-p53DD-Myc(Y942H)质粒的图谱；
图10是本发明实施例提供的质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L的采用KpnI和NotI酶切后的电泳结果图；
图11是本发明实施例提供的将Sev-full质粒采用KpnI和EcorI酶切处理后的酶切产物电泳鉴定结果图；
图12是本发明实施例提供的293T转染后，获得的质粒包装仙台病在20X荧光显微镜下的荧光图；
图13是本发明实施例提供的10X显微镜下拍摄的细胞病变的96孔图；
图14是本发明实施例提供的PBMC重编程为iPS细胞后得到的iPS细胞示意图；
图15是本发明实施例提供的Sev-Mito-GFP重组仙台病毒感染Hela细胞后48h，60X荧光显微镜下拍摄得到的荧光图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质、界面、消息、请求和终端彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
本发明实施例第一方面提供一种重组仙台病毒的构建方法，包括以下步骤：
S01.提供pCAGGS线性化载体、NP基因、P基因和L基因，将NP基因、P基因和L基因分别与pCAGGS线性化载体融合，构建质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L；
S02.以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段和SeV-02 DNA片段；在pUC57-Simple中插入第一序列，获得pUC57-inser质粒，采用EcorI-HF酶切后获得线性化pUC57-insert质粒；采用第三引物对对线性化pUC57-insert质粒扩增，获得pUC-insert DNA；将SeV-01 DNA片段、SeV-02 DNA片段和pUC-insert DNA融合，获得Sev-full质粒；
S03.在pUC57-Simple中插入表达功能性基团A的第二序列，获得pUC57-A质粒，NotI-HF限制性内切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段；使用NotI-HF限制性内切酶对Sev-full质粒酶切处理，收集Sev-full-Not1酶切片段；将A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段连接，得到Sev-A质粒；
S04.提供293T细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述质粒pCAGGS-NP、所述质粒pCAGGS-P、所述质粒pCAGGS-L、所述Sev-A质粒和T7-opt质粒混合培养后进行转染、增殖培养，得到重组仙台病毒，其中，所述增殖培养采用无血清培养基。
本发明实施例提供的重组仙台病毒的构建方法，将pCAGGS载体质粒、仙台病毒基因组质粒一同转染293T细胞系(稳定表达密码子优化过的T7 RNA聚合酶的293T细胞)，获得高滴度的仙台病毒。具体的，本发明具有以下优点：
第一，以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段和SeV-02 DNA片段；再与插入第一序列的pUC57-inser质粒的酶切产物融合形成Sev-full质粒，可以根据不同特性的仙台病毒灵活合成所需要的的质粒。
第二，对pCAGGS质粒进行改造，添加P基因、L基因、NP基因，三种基因聚合后形成RNA聚合酶复合体，促进仙台病毒的包装，有利于提高包装效率；同时，质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L利用CAG启动子，提高病毒表达效果；
第三，本发明实施例选择293T细胞系转染系统，在加入所述质粒pCAGGS-NP、所述质粒pCAGGS-P、所述质粒pCAGGS-L、所述Sev-A质粒和T7-opt质粒后，可以获得优异的病毒包装效果；
第四，本发明实施例采用基因合成和高保真酶的扩增，同时结合无血清培养基的培养，赋予重组仙台病毒良好的安全性能。
具体的，上述步骤S01中，提供用于制备载体质粒的pCAGGS线性化载体、NP基因、P基因和L基因。
在一些实施例中，所述pCAGGS线性化载体可以通过下述方法获得：对采用KpnI-HF限制性内切酶(NEB R3142S)和NotI-HF限制性内切酶(NEB R3189S)对pCAGGS载体进行酶切处理，得到4117bp和727bp的DNA片段。纯化并收集4117bp的DNA片段，获得pCAGGS线性化载体。在一些实施例中，对酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，纯化并收集4117bp的DNA片段。
在一些实施例中，所述NP基因可以通过下述方法获得：以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO(VAZYME P503-d1)，采用下述引物对进行扩增，纯化收集1614bp的NP基因DNA片段：
NP-Kpn1-for：
CATCATTTTGGCAAAGGTACCATGGCCGGGTTGTTGAGCAC；
NP-Not1-rev：
AGAGGGAAAAGCGGCCGCCTAGATTCCTCCTATCCCAGCTACTGC；
在一些实施例中，采用1％琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，获得NP基因DNA片段。
在一些实施例中，所述P基因可以通过下述方法获得：以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO(VAZYME P503-d1)，采用下述引物对进行扩增，纯化收集1746bp的P基因DNA片段：
P-Kpn1-for：
CATCATTTTGGCAAAGGTACCATGGATCAAGATGCCTTCATTCTTAAAGAAGATTCTG；
P-Not1-rev：
AGAGGGAAAAGCGGCCGCCTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTCTTC。
在一些实施例中，采用1％琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，获得P基因DNA片段。
在一些实施例中，所述L基因可以通过下述方法获得：以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO(VAZYME P503-d1)，采用下述引物对进行扩增，纯化收集6726bp的L基因DNA片段：
L-Kpn1-for：
CATCATTTTGGCAAAGGTACCATGGATGGGCAGGAGTCCTCC；
L-Not1-rev：
AGAGGGAAAAGCGGCCGCTTACGAGCTGTCATATGGCTCGATATCAC。
在一些实施例中，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，获得L基因DNA片段。
将NP基因、P基因和L基因分别与pCAGGS线性化载体融合，分别构建质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L。质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L的图谱分别如图1A、1B、1C所示。
为了验证合成辅助质粒的准确性，可以对上述质粒进行酶切鉴定。质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L的采用KpnI和NotI酶切后的结果如图10所示。其中，左图为pCAGGS-L-01和pCAGGS-L-02采用KpnI和NotI酶切电泳结果图，右图为pCAGGS-P和pCAGGS-NP采用KpnI和NotI酶切电泳结果图。由图可见，pCAGGS-NP质粒经过KpnI和NotI酶切后生成4717bp和1578bp条带；pCAGGS-P质粒经过KpnI和NotI酶切后生成4717bp和1710bp条带；pCAGGS-L质粒经过KpnI和NotI酶切后生成6690bp和4717bp条带。
在一些实施例中，如图2所示，将pCAGGS线性化载体和NP基因DNA片段，依照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(VAZYME C115)相关操作进行，获得质粒pCAGGS-NP。
在一些实施例中，将pCAGGS线性化载体和P基因DNA片段，依照ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit试剂盒(VAZYME C115)相关操作进行，获得质粒pCAGGS-P。
在一些实施例中，将pCAGGS线性化载体和L基因DNA片段，依照ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit试剂盒(VAZYME C115)相关操作进行，获得质粒pCAGGS-L。
上述步骤S02中，以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶PhantaEVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段和SeV-02 DNA片段。
在一些实施例中，以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶PhantaEVO(VAZYME P503-d1)和第一引物对进行PCR扩增，纯化并收集7547bp的DNA产物，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段。其中，所述第一引物对包括：
NP-for(第一上游引物)：ATGGCCGGGTTGTTGAGCAC；
HN_up-rev(第一下游引物)：TTGGCATCCTCGGGTCCTACA。
在一些实施例中，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段。
在一些实施例中，以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶PhantaEVO(VAZYME P503-d1)和第二引物对进行PCR扩增，纯化并收集7626bp的DNA产物，获得仙台基因组SeV-02 DNA片段。其中，所述第二引物对包括：
HN_down-for(第二上游引物)：GTAGGACCCGAGGATGCCAAC；
Trailer-rev(第二下游引物)：
TTTAAGAGATATGTATCCTATTAAATTTTCTTGTCTTCTTGTAAG。
在一些实施例中，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段，获得仙台基因组SeV-02DNA片段。
通过采用高保真DNA聚合酶Phanta EVO和上述第一引物对和第二引物对对仙台病毒逆转录样品进行PCR扩增，可以分别获得长度分别为7547bp和7626bpSeV-01 DNA片段和SeV-02 DNA片段，从而有利于两者的对接融合，提高融合成功率。
在pUC57-Simple中插入第一序列，获得pUC57-inser质粒。其中，所述第一序列为：
ACGCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGAGTCTAGACTCCGTCACCAAACAAGAGAAAAAACATGTATGGGATATACAATGAAGTTAGACAGGATTTTAGGGTCAAAGTATCCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGCTGCCAAAGTTCACGCGGCCGCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGTTGAGCACGAATTCTAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACCCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATGGGCCC。
进一步的，将pUC57-inser质粒采用EcorI-HF(NEB R3101S)酶切处理，纯化并收集3159bp的DNA产物，获得线性化pUC57-insert质粒。在一些实施例中，采用1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的DNA片段，获得线性化pUC57-insert质粒。
以所述线性化pUC57-insert质粒样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO(VAZYME P503-d1)，采用第三引物对对线性化pUC57-insert质粒扩增，纯化并收集3194bp的DNA产物，获得pUC-insert DNA。其中，所述第三引物对包括：
pUC-for(第三上游引物)：
TAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCC
pUC-rev(第三下游引物)：GTGCTCAACAACCCGGCCATC。
在一些实施例中，采用1％琼脂糖凝胶电泳回收扩增后的DNA片段，获得pUC-insert DNA。
进一步的，将SeV-01 DNA片段、SeV-02 DNA片段和pUC-insert DNA融合(infusion)，获得Sev-full质粒。在一些实施例中，如图3所示，将SeV-01 DNA片段、SeV-02DNA片段和pUC-insert DNA片段一起，依照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(VAZYME C115)相关操作进行，获得Sev-full质粒。所述Sev-full质粒图谱如图4所示。
为了验证Sev-full质粒的准确性，可以对Sev-full质粒进行酶切鉴定。将Sev-full质粒采用KpnI和EcorI酶切处理，结果如图11所示，酶切后生成7609bp、5992bp和4806bp三条带。
上述步骤S03中，在pUC57-Simple中插入表达功能性基团A的第二序列，获得pUC57-A质粒。在一些实施例中，所述A选自GFP、mCherry、KOS、p53DD-Myc和p53DD-UL中的一种。在一些实施例中，所述A选自p53DD-Myc和/或p53DD-UL，且所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变，以提高重组仙台病毒的温度敏感性，进而提高重组仙台病毒的iPS诱导效率和安全性能。
本发明实施例可以通过合成标签蛋白荧光基因如GFP、mCherry，构建表达外源标签蛋白荧光基因的仙台病毒，可以用于活细胞示踪和活细胞动力学研究。通过构建荧光示踪用仙台病毒，将特定的基因融合GFP基因和mCherry基因，再将其重组进入仙台细胞，获得的重组仙台病毒能够高效感染已知的大部分细胞系(包括贴壁细胞和悬浮细胞)，可用荧光显微镜观察活细胞，为细胞器定位和细胞动力学研究提供了一种优秀的解决方案。
在一些实施例中，GFP基因为能够结合在线粒体上的GFP基因，即Mito-GFP基因，从而使得荧光示踪用仙台病毒的定位更具指向性(仅在线粒体位置发光，不会是整个细胞全部发光)，从而更有利于荧光显微镜观察活细胞，并为细胞器定位和细胞动力学研究提供准确依据。
在一些实施例中，所述A选自Mito-GFP，即在pUC57-Simple中插入表达功能性基团Mito-GFP的第二序列，获得pUC57-Mito-GFP质粒，所述pUC57-Mito-GFP质粒的图谱如图5所示。其中，所述第二序列为：
GCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGGGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCACCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAGGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACGTACGCCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCGCGGCCGC。
在一些实施例中，采用活细胞示踪仙台病毒感染Hela细胞，进行细胞器定位，包括以下步骤：
将Hela细胞进行传代，用胰酶消化，离心后用DMEM培养基重悬，细胞计数后加入多孔板，如(6孔板，每个孔2*104个细胞)。加入MOI＝3(～10)的Sev-Mito-GFP仙台病毒，摇晃混匀，体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养48h。
荧光显微镜下观察实验结果，可见细胞线粒体标记绿色荧光。Sev-Mito-GFP重组仙台病毒感染Hela细胞后48h，60X荧光显微镜下拍摄得到的荧光图如图15所示，可见，Sev-Mito-GFP仙台病毒能够为活细胞活动提供荧光指向性。
本申请实施例中，将pUC57-A质粒采用NotI-HF限制性内切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段。在一些实施例中，对pUC57-A质粒使用NotI-HF限制性内切酶(NEB R3189S)进行酶切，纯化并收集A-Not1酶切片段。在一些实施例中，pUC57-A质粒为pUC57-Mito-GFP质粒，使用NotI-HF限制性内切酶(NEB R3189S)进行酶切可获得2748bp和888bp两条DNA片段，纯化并收集888bp的DNA片段，获得Mito-GFP-Not1酶切片段。在一些实施例中，采用1％琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳，回收888bp的DNA片段，此片段为Mito-GFP-Not1酶切片段。
本申请实施例中，使用NotI-HF限制性内切酶对Sev-full质粒酶切处理，收集Sev-full-Not1酶切片段。在一些实施例中，对Sev-full使用NotI-HF限制性内切酶(NEBR3189S)进行酶切，可获得18407bp的DNA片段。在一些实施例中，对酶切产物使用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，回收18407bp的Sev-full酶切片段，此片段为Sev-full-Not1酶切片段。
将A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段连接，得到Sev-A质粒。在一些实施例中，A-Not1酶切片段为Mito-GFP-Not1酶切片段，将Mito-GFP-Not1酶切片段与Sev-full-Not1酶切片段使用T4 DNA连接酶(NEB M0202S)，16℃连接过夜，使用感受态细胞进行转化，获得Sev-Mito-GFP质粒。所述Sev-Mito-GFP质粒图谱如图6所示。
上述步骤S04中，提供293T细胞，进行接种、培养。293T细胞的接种、培养，可以通过常规方法实现。在一些实施例中，将293T细胞传代，胰酶消化后离心，使用DMEM(GibcoTM货号10569-010)培养基重悬，细胞计数后加入6孔板，每个孔8*105个细胞，添加2ml DMEM完全培养基(DMEM(GibcoTM货号10569-010)和体积百分含量2％的血清替代物(MerckTM货号S0638))，充分混匀后，体积百分含量为5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养。
转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，以避免引入血清培养基和其他非生物来源物质，影响重组仙台病毒的安全性。然后加入所述质粒pCAGGS-NP、所述质粒pCAGGS-P、所述质粒pCAGGS-L、所述Sev-A质粒和T7-opt质粒混合培养后进行转染。在一些实施例中，加入所述质粒pCAGGS-NP、所述质粒pCAGGS-P、所述质粒pCAGGS-L、所述Sev-A质粒和T7-opt质粒混合培养后进行转染的步骤中，采用lipo3000作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染。采用添加聚乙烯亚胺的lipo3000作为转染试剂，所述聚乙烯亚胺通过与DNA结合形成阳离子聚合物介导的内吞作用，竞争性弥补lipo3000通过脂质体介导的内吞作用的不足，从而提高转染效率。
对转染后的病毒进行增值培养，且所述增殖培养采用无血清培养基，以提高重组仙台病毒的安全性能。在一些实施例中，所述无血清培养基为添加有重组胰蛋白酶和胎牛血清替代物的高糖DMED培养基。
以Sev-Mito-GFP质粒为例，包装能够表达标签荧光基因，使线粒体标记绿色荧光蛋白的仙台病毒的方法包括：
转染前换液为1mL Opti-MEM培养基(GibcoTM Opti-MEMTM货号31985062)，将2.5μgpCAGGS辅助质粒、4.0μg Sev-Mito-GFP质粒、4.0μg T7-opt质粒混合，分3组进行操作：组1按照lipo3000说明书进行操作(InvitrogenTMLipofectamineTM 3000货号L3000008)进行操作，组2按照按照lipo2000说明书进行操作，组3做空白对照，不加任何转染试剂。转染后混匀，再加入293T细胞。6小时后换液为2mL DMEM无血清完全培养基培养，37℃，5％CO2培养箱中继续培养48小时。
去掉培养基，使用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞去除培养基残液，加入0.5mLTrypLE(GibcoTM TrypLETM Express(1X),Phenol Red货号12605010)进行消化，消化结束，使用细胞计数板，在荧光显微镜下检测GFP表达细胞数量，判断病毒包装效率，后转入25cm2细胞，添加5mL DMEM无血清完全培养基培养，37℃，5％CO2培养箱中继续培养24小时。
使用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞去除培养基残液，加入5mL DMEM病毒增殖培养基：DMEM(GibcoTM货号10569-010)+1.5μg/ml TrypLE(GibcoTM TrypLETM Express(1X),Phenol Red货号12605010)，37℃，5％CO2培养箱中继续培养72h。
将细胞用培养细胞液进行吹打混匀，将细胞混悬液液进行收集，-70℃-37℃循环冻融2次后，1000rpm/min 4℃离心5分钟，去除细胞沉淀，获得重组仙台病毒细胞上清。将仙台病毒细胞上清在超高速离心机，24000转，4℃离心3h，去掉上清液，将沉淀用2ml无菌PBS重悬过夜。
将沉淀的PBS悬液混匀后收集，通过0.22μm滤膜，获得仙台病毒溶液。
293T转染后20X荧光显微镜下获得的质粒包装仙台病如图12所示。
本申请实施例中，进一步的，还包括通过BHK-21细胞检测仙台病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50)，换算得到病毒滴度空斑形成单位(pfu)。
在一些实施例中，以Sev-Mito-GFP仙台病毒为例，通过BHK-21细胞检测仙台病毒的TCID50，换算得到病毒滴度空斑形成单位(pfu)的方法，包括以下步骤：
将BHK-21细胞消化，胰酶消化后离心，使用DMEM(GibcoTM货号10569-010)培养基重悬，细胞计数后加入96孔板，每个孔1*104个细胞，添加100μl DMEM完全培养基(DMEM(GibcoTM货号10569-010)和体积百分含量2％血清替代物(MerckTM货号S0638))，充分混匀后，体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养48h；
将每个孔的DMEM完全培养基吸出，100μl无菌PBS清洗2次后，更换为150μl DMEM病毒增殖培养基，将100μl Sev-Mito-GFP仙台病毒溶液用900μl DMEM依次倍比稀释10-1，10-2，10-3，……，10-10，将稀释倍数为10-3～10-10共8只稀释病毒，每个稀释度接12个孔，每个空加入稀释病毒50μl。体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养；其中，病毒稀释示意图如图7所示。
每天观察96孔板，将出现细胞病变的细胞孔在96孔板上做记号，统计每个稀释度出现的细胞病变的数量，10X显微镜下拍摄的细胞病变的96孔如图13所示；
根据统计每个稀释度出现的病变数量，根据公式计算病毒的TCID50数值，根据公式换算病毒pfu。
本发明第二方面提供一种用于将PBMC重编程为iPS的试剂盒，所述试剂盒包括仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS，其中，所述仙台病毒载体Sev-KOS包括表达Klf4的基因、表达Oct3/4的基因和表达Sox的基因；所述仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc包括表达p53DD的基因和表达c-Myc的基因；仙台病毒载体Sev-p53DD-UL包括表达p53DD的基因、表达Lin28的基因和表达MycL的基因；所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变。
本发明实施例提供的用于将PBMC重编程为iPS的试剂盒，包括仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS。该试剂盒提供的仙台病毒载体能够表达多个完整外援基因顺反子，并通过将基因p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc(或p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2、Lin28和MycL)导入人外周血单核细胞(PBMC)，能够诱导PBMC形成iPS细胞。采用含有本发明试剂盒的仙台病毒载体将PBMC诱导为iPS，诱导效率为慢病毒试剂盒的10倍-20倍，且诱导产生的iPS细胞能够在体外稳定传代，稳定表达。此外，所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变，不仅有利于提高iPS诱导效率，而且由于得到的重组仙台病毒具有较好的温度敏感性，因此，其安全性能大幅提高。
本发明实施例第三方面提供一种将PBMC重编程为iPS细胞的方法，包括以下步骤：
E01.提供重组仙台病毒溶液，所述重组仙台病毒溶液包括按照上述方法制备的Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS，其中，所述仙台病毒载体Sev-KOS包括表达Klf4的基因、表达Oct3/4的基因和表达Sox的基因；所述仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc包括表达p53DD的基因和表达c-Myc的基因；仙台病毒载体Sev-p53DD-UL包括表达p53DD的基因、表达Lin28的基因和表达MycL的基因；且所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变；
E02.接种并培养PBMC细胞，在所述PBMC细胞中加入所述重组仙台病毒溶液，继续培养，将所述PBMC细胞感染并重编程为iPS细胞。
本发明实施例提供的用于将PBMC重编程为iPS的方法，采用含有仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS的重组仙台病毒溶液诱导PBMC。该方法中诱导PBMC重编程为iPS细胞的仙台病毒能够表达多个完整外援基因顺反子，并通过将基因p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc(或p53DD、Klf4、Oct3/4、Sox2、Lin28和MycL)导入人外周血单核细胞(PBMC)，诱导PBMC形成iPS细胞。采用含有该方法将PBMC诱导为iPS，诱导效率为慢病毒试剂盒的10倍-20倍，且诱导产生的iPS细胞能够在体外稳定传代，稳定表达。此外，且所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变，使得仙台病毒具有温度敏感性，能够提高iPS细胞的诱导效率；同时，在高于39℃的条件下活力降低甚至消失，因此，采用本发明的重组仙台病毒诱导iPS细胞具有较好的安全性。
具体的，上述步骤E01中，所述重组仙台病毒溶液包括按照上述方法制备的Sev-p53DD-Myc或仙台病毒载体Sev-p53DD-UL，以及仙台病毒载体Sev-KOS。其中，所述仙台病毒载体Sev-KOS包括表达Klf4的基因、表达Oct3/4的基因和表达Sox的基因；所述仙台病毒载体Sev-p53DD-Myc包括表达p53DD的基因和表达c-Myc的基因；仙台病毒载体Sev-p53DD-UL包括表达p53DD的基因、表达Lin28的基因和表达MycL的基因；且所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变，即仙台病毒Sev-KOS(Y942H)和Sev-p53DD-Myc(Y942H)。所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变，使得仙台病毒具有温度敏感性，能够提高iPS细胞的诱导效率；同时，在高于39℃的条件下活力降低甚至消失，因此，采用本发明的重组仙台病毒诱导iPS细胞具有较好的安全性。其中，质粒Sev-KOS(Y942H)质粒图谱如图8所示；质粒Sev-p53DD-Myc(Y942H)质粒图谱如图9所示。
上述步骤E02中，接种并培养PBMC细胞，可以采用常规方法进行。在一些实施例中，将PBMC用1ml SFEM完全培养基(SFEM培养基(StemSpanTM货号09650)添加20ng/mL IL-3、20ng/mL IL-6、100ng/mL SCF、100ng/mL SCF FLT-3Ligand、2mM L-Glutamine、0.1％庆大霉素)重悬，加入24孔板1个孔，5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养。
在感染前三天至前一天，将SFEM完全培养基每天换液50％。
在所述PBMC细胞中加入所述重组仙台病毒溶液。在一些实施例中，在所述PBMC细胞中加入所述重组仙台病毒溶液的步骤中，所述重组仙台病毒溶液的滴度为3MOI～10MOI。
在一些实施例中，按照MOI＝3～10的剂量加入仙台病毒Sev-KOS(Y942H)和Sev-p53DD-Myc(Y942H)，每个孔2*105个PBMC，在加入SFEM完全培养基至体积为1ml。1000x g室温离心30min，再加入1mL SFEM完全培养基重悬后加入12孔板，体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养。
在培养24小时后，在200x g室温离心10minutes，弃掉上清(去除剩余病毒)，用1mLSFEM完全培养基重悬后加入24孔板。体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养，48h不用换液。
第3天：按照说明书稀释matrix胶(Corning hESC-Qualified Matrix货号354277)，6孔板1个1mL，室温下放置2h，37℃培养箱放置15min后备用。加入1mL SFEM不完全培养基(SFEM培养基(StemSpanTM货号09650)添加2mM L-Glutamine和0.1％庆大霉素)重悬，将细胞从24孔板转移至包被的6孔板。体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养。
第4-6天：每天使用1mL SFEM不完全培养基半量换液。体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养。
第7天：：使用1mL XF培养基(MSC
Figure BDA0002458572290000211
XF货号05-200-1A)半量换液，体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养。
第8天：使用2mL XF培养基全量换液，体积百分含量为5％的CO2气氛、37℃恒温细胞培养箱中培养。
第9-25天：使用2mL XF培养基全量换液，大约Day 20可以观察到iPS克隆形成。
本发明实施例提供的PBMC重编程为iPS细胞后得到的iPS细胞示意图如图14所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 精序（深圳）生物科技有限公司
<120> 重组仙台病毒的构建方法及其应用
<130> 20200409
<150> 重组仙台病毒的构建方法及其应用
<151> 2020-04-09
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<151> 2020-04-09
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
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acaagtaacg tacgccgtag taagaaaaac ttagggtgaa agttcatcgc ggccgc 896

Claims (3)

1.一种将PBMC重编程为iPS细胞的方法，其特征在于，接种并培养PBMC细胞，在所述PBMC细胞中加入重组仙台病毒Sev-p53DD-Myc和Sev-KOS，继续培养，将所述PBMC细胞感染并重编程为iPS细胞，
所述重组仙台病毒的构建方法包括：
提供pCAGGS线性化载体、NP基因、P基因和L基因，将NP基因、P基因和L基因分别与pCAGGS线性化载体融合，构建质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P和pCAGGS-L；
以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01DNA片段和SeV-02DNA片段；在pUC57-Simple中插入第一序列，获得pUC57-inser质粒，采用EcoRI-HF酶切后获得线性化pUC57-insert质粒；采用第三引物对对线性化pUC57-insert质粒扩增，获得pUC-insert DNA；将SeV-01DNA片段、SeV-02DNA片段和pUC-insert DNA融合，获得Sev-full质粒；
在pUC57-Simple中插入表达功能性基团A的第二序列，获得pUC57-A质粒，NotI-HF限制性内切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段；使用NotI-HF限制性内切酶对Sev-full质粒酶切处理，收集Sev-full-Not1酶切片段；将A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段连接，得到Sev-A质粒，所述基因A选自KOS和p53DD-Myc；
提供293T细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P、pCAGGS-L、Sev-A质粒和T7-opt质粒，而后进行增殖培养，得到重组仙台病毒，所述增殖培养采用无血清培养基；所述无血清培养基为添加有重组胰蛋白酶和胎牛血清替代物的高糖DMED培养基；
其中，所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变；
所述第一引物对包括：
NP-for：ATGGCCGGGTTGTTGAGCAC；
HN_up-rev:TTGGCATCCTCGGGTCCTACA；
和所述第二引物对包括：
HN_down-for：GTAGGACCCGAGGATGCCAAC；
Trailer-rev：
TTTAAGAGATATGTATCCTATTAAATTTTCTTGTCTTCTTGTAAG；
和所述第三引物对包括：
pUC-for：TAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCC；
pUC-rev：GTGCTCAACAACCCGGCCATC；
所述第一序列为：
ACGCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGAGTCTAGACTCCGTCACCAAACAAGAGAAAAAACATGTATGGGATATACAATGAAGTTAGACAGGATTTTAGGGTCAAAGTATCCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGCTGCCAAAGTTCACGCGGCCGCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGTTGAGCACGAATTCTAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACCCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATGGGCCC。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入所述质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P、pCAGGS-L、质粒Sev-A和T7-opt的步骤中，采用lipo3000作为转染试剂。
3.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，在所述PBMC细胞中加入所述重组仙台病毒溶液的步骤中，所述重组仙台病毒溶液的滴度为3MOI～10MOI。
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