CN108384759A - 诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A‑FD基因，其中转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c‑Myc。ASF1A‑FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因。将ASF1A‑FD基因与OSKM转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c‑Myc)一起导入皮肤成纤维细胞中，可以大大提高重编程效率。

Description

诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞领域，特别是涉及一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)在药物筛选、再生医学、疾病发生机制研究等方面的应用前景诱人，但由于材料来源、伦理压力及操作技术等因素的限制，ESCs的发展极为缓慢。通过病毒载体将4个外源转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc(OSKM)导入体细胞，可以诱导产生与ESCs特性相似的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stemcells，iPS细胞)。该方法不仅避免了以往获取ESCs所涉及的伦理争争议，且操作简单、材料来源丰富，有望根据患者需要获取个体特异性的治疗材料，解决免疫排斥问题。因此，iPS细胞技术的诞生为干细胞的基础研究和临床疾病治疗带来了前所未有的希望。但是，目前iPS细胞的产生效率很低，大约是万分之几的效率，特别是采用病毒载体引入转录因子时，病毒感染后只有很少的细胞会发生重编程。并且iPS细胞在后续传代过程中，极易发生分化，这些都大大阻碍了iPS细胞在科研领域和临床上的推广和应用。因此探索一种高效、稳定的iPS细胞制备方法显得十分必要。
近年来，科学家们在提高iPS细胞转化效率上做了大量的研究，比如2009年，Yamanaka研究组通过阻断p53基因可以将iPS细胞转化成功率提高至10％左右，这是原有转化率的大约百倍。随后的一个月，该小组又发表文章称在培育iPS的过程中，通过降低培养环境的氧浓度，可大幅提高iPS细胞生成的效率。此外，中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿带领的研究小组发现，通过在培养过程中添加维生素C可使iPS诱导效率提高10倍。研究人员还在不断改良重编程方法，寻找新的作用因子、转导途径以提高重编程的效率。
综上，用传统的方法诱导皮肤成纤维细胞重编程时，重编程效率低，制得的iPS细胞稳定性差。
发明内容
基于此，有必要提供一种重编程效率高、制得的iPS细胞稳定性好的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用。
一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中，所述转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，所述ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因；以及
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞。
在一个实施方式中，所述ASF1A-FD基因包括：
(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，
(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列，或
(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因的步骤包括：
将皮肤成纤维细胞培养至汇合度为50％～80％；以及
用逆转录病毒感染所述皮肤成纤维细胞使得所述转录因子以及所述ASF1A-FD基因进入所述皮肤成纤维细胞中，其中，所述逆转录病毒包括携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒。
在一个实施方式中，其特征在于，所述逆转录病毒通过如下方法制备得到：
将gag基因、pol基因和env基因转染人胚肾HEK293细胞，获得病毒包装细胞；以及
将Oct3/4质粒、Sox2质粒、Klf4质粒、c-Myc质粒以及ASF1A-FD质粒分别转染所述病毒包装细胞，并分别培养转染后的所述病毒包装细胞并收集培养上清，获得携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒，混匀后得到所述逆转录病毒。
在一个实施方式中，所述细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞的步骤包括：
将层粘连蛋白和含钙镁的磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，并将所述混合液加入培养皿中，在2℃～8℃下放置12h～48h，去除所述混合液，得到混合液包被后的培养皿；
将导入了转录因子以及ASF1A-FD基因后的所述皮肤成纤维细胞加入到包被后的所述培养皿中，继续培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程出现胚胎干细胞样克隆，得到所述诱导性多能干细胞。
一种诱导性多能干细胞，通过上述任一项所述的方法制备得到。
上述任一项所述的方法或上述的诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
一种体外制备软骨细胞的方法包括以下步骤：
采用上述任一项所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法获得诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成软骨诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述软骨细胞，所述成软骨诱导分化培养基中含有0.5％v/v～2％v/v的ITS细胞培养添加物、5ng/mL～20ng/mL的TGF-β1、50mmol/L～200mmol/L的地塞米松和0.05mmol/L～0.5mmol/L维生素C-2磷酸钠。
一种体外制备脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
采用上述任一项所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法获得诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成脂肪诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述脂肪细胞，所述成脂肪诱导分化培养基中含有0.1mmol/L～1mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.5μmol/L～2μmol/L的地塞米松和5μg/mL～20μg/mL胰岛素和100μmol/L～500μmol/L的吲哚美辛。
一种体外制备心肌细胞的方法，包括以下步骤：
采用上述任一项所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法获得诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成心肌诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述心肌细胞。
上述诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因，能够编码组蛋白H3/H4的分子伴侣ASF1A(anti-silencing factor 1)的特定区域的结构域，参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配，同时参与转录调控、基因沉默以及DNA损伤修复等过程。实验结果表明，ASF1A-FD基因与OSKM转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)一起导入皮肤成纤维细胞中，可以大大提高重编程效率，其重编程效率是传统OSKM四转录因子导入法的13.8倍，并且获得的iPS细胞可以在体外培养传代中能够稳定表达iPS细胞的标记基因，长期维持干细胞特性，解决了传统iPS重编程方法存在的重编程效率低、iPS细胞传代过程中易分化的缺陷。
附图说明
图1为实施例1中pMXs-ASF1A-FD质粒酶切电泳图；
图2为实施例3中OSKM感染组和OSKM+ASF1A-FD感染组制备iPS重编程效率对比图；
图3为实施例3中OSKM感染组和OSKM+ASF1A-FD感染组制备的iPS克隆传代10次后对比图；
图4为实施例3中OSKM感染组和OSKM+ASF1A-FD感染组制备的iPS克隆的碱性磷酸酶染色结果对比图；
图5为实施例3中OSKM感染组OSKM+ASF1A-FD感染组制备的iPS细胞RT-PCR产物的电泳检测条带对比图；
图6为实施例4中OSKM感染组的iPS和OSKM+Erbin感染组的iPS诱导形成的软骨细胞的免疫荧光染色对比图；
图7为实施例5中OSKM感染组的iPS和OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS诱导形成的脂肪细胞的油红O染色对比图；
图8为实施例6中OSKM感染组的iPS和OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS诱导形成的心肌细胞的免疫荧光染色对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，包括以下步骤S110～S120。
S110、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中，转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因。
在一个实施方式中，皮肤成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。通过本实施方式的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法能够实现从人皮肤成纤维细胞重编程形成人iPS细胞，且重编程效率高。
具体地，Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四个转录因子的组合，简称OSKM，将OSKM导入体细胞中，能够将体细胞直接重编程为胚胎干细胞样的多潜能干细胞(iPS)。
ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因，能够编码组蛋白H3/H4的分子伴侣ASF1A(anti-silencing factor 1)的特定区域的结构域，参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配，同时参与转录调控、基因沉默以及DNA损伤修复等过程。
研究结果表明，选用包括ASF1A特定的结构域(第1号氨基酸～第154号氨基酸)的基因与OSKM转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)一起导入皮肤成纤维细胞中，可以大大提高重编程效率，其重编程效率是传统OSKM四转录因子导入法的13.8倍，并且获得的iPS细胞可以在体外培养传代中能够稳定表达iPS细胞的标记基因，长期维持干细胞特性。
本实施方式中，ASF1A-FD基因包括:(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。与SEQID No.1所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列或至少一种改变(如编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代，或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)对应的核苷酸序列，如果能够表达ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸组成的多肽，或与ASF1A-FD片段没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。
在一个实施方式中，ASF1A-FD基因仅为编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因。ASF1A-FD基因表达后得到的蛋白量大大减小，便于编码基因导入细胞中。
在一个实施方式中，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因步骤包括以下操作S111～S113。
S111、将皮肤成纤维细胞培养至汇合度为50％～80％。
具体地，汇合度是指细胞在瓶中增殖时，出现在细胞间的粘连和排列状态汇合程度，汇合度为50％～80％有利于目的基因的转染。
S112、用逆转录病毒感染S111中得到的皮肤成纤维细胞，使得转录因子以及ASF1A-FD基因进入所述皮肤成纤维细胞中，其中逆转录病毒包括携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒。
进一步地，逆转录病毒通过如下方法制备得到通过如下方法制备得到：将gag基因、pol基因和env基因转染人胚肾HEK293细胞，获得病毒包装细胞。将Oct3/4质粒、Sox2质粒、Klf4质粒、c-Myc质粒以及ASF1A-FD质粒分别转染病毒包装细胞，并分别培养转染后的病毒包装细胞并收集培养上清，获得携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒，混匀后得到逆转录病毒。
培养一段时间后，Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及ASF1A-FD基因导入皮肤成纤维细胞中，使得成纤维细胞发生成编程。
传统的方法很难实现将ASF1A-FD基因与OSKM转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)一起导入皮肤成纤维细胞中。
本实施方式将gag基因、pol基因和env基因转染人胚肾HEK293细胞，获得病毒包装细胞，获得稳定的逆转录病毒包装细胞(PLAT-A)，PLAT-A能够容许单个质粒转染实现快速地制备出逆转录病毒。然后使用携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒感染皮肤成纤维细胞，实现高效率的导入ASF1A-FD基因与OSKM转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)。
S120、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞。
在一个实施方式中，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤包括：将层粘连蛋白和含钙镁的磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，并将混合液加入培养皿中，在2℃～8℃下放置12h～48h，去除混合液，得到混合液包被后的培养皿。将导入了转录因子以ASF1A-FD基因后的皮肤成纤维细胞加入到包被后的培养皿中，继续培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程出现胚胎干细胞样克隆，得到诱导性多能干细胞。
具体地，层粘连蛋白为人类重组层粘连蛋白(Laminin-521)。皮肤成纤维细胞在包被后的培养皿中培养，有利于细胞的黏附，重编程效率更高，
一实施方式的诱导性多能干细胞(iPS)，通过上述的诱导性多能干细胞(iPS)的制备方法制备得到。
具体地，该诱导性多能干细胞(iPS)来源于人皮肤成纤维细胞。
上述iPS细胞的制备方法，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因。其中转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因。实验结果表明，ASF1A-FD基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞中，可以大大提高人iPS细胞的重编程效率，其重编程效率是传统OSKM四基因导入法的13.8倍，并且获得的iPS细胞可以在体外培养传代中长期维持多能性，解决了传统iPS重编程方法存在的重编程效率低、传代过程中易分化的缺陷。
综上，上述iPS细胞的制备方法，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因能够实现从皮肤成纤维细胞制备iPS细胞，制备iPS细胞时重编程效率高，制得的iPS细胞在传代培养时不容易发生分化，稳定性好。
一实施方式的上述诱导性多能干细胞的制备方法或上述诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
具体地，医用功能材料可以为软骨、脂肪或心肌等。
一实施方式的体外制备软骨细胞的方法，包括以下步骤S210～S230。
S210、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中，转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因。
具体地，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因的步骤可参见上文步骤S110。
S220、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞。
具体地，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤可参见上文步骤S120。
S230、将诱导性多能干细胞置于成软骨诱导分化培养基中培养使得诱导性多能干细胞分化得到软骨细胞，成软骨诱导分化培养基中含有0.5％v/v～2％v/v的ITS细胞培养添加物、5ng/mL～20ng/mL的TGF-β1、50mmol/L～200mmol/L的地塞米松和0.05mmol/L～0.5mmol/L维生素C-2磷酸钠。
具体地，成软骨诱导分化培养基包括基础培养基以及成软骨生长因子。将成软骨生长因子加入到基础培养基中配制成软骨诱导分化培养基。
具体地，基础培养基为DMEM培养基，成软骨生长因子包括ITS细胞培养添加物(成分包括胰岛素，Iusulin)、TGF-β1(转化生长因子-β1)、地塞米松和维生素C-2磷酸钠。
具体地，将诱导性多能干细胞(iPS细胞)置于培养瓶中，加入成软骨诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。分化1天后天换液，即弃去培养瓶中的旧培养液，添加新的成软骨诱导分化完全培养基。继续培养2～20天，每个两天换液。分化培养第21天，软骨细胞已分化完全。
上述体外制备软骨细胞的方法，由ASF1A-FD基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞制备得到的iPS细胞分化得到。实验结果表明，该iPS细胞诱导的软骨细胞标志物Collagen II的表达量明显提高。
一实施方式的体外制备脂肪细胞的方法，包括以下步骤S310～S330。
S310、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中，转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因。
具体地，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因的步骤可参见上文步骤S110。
S320、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞。。
具体地，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤可参见上文步骤S120。
S330、将诱导性多能干细胞置于成脂肪诱导分化培养基中培养使得诱导性多能干细胞分化得到脂肪细胞，成脂肪诱导分化培养基中含有0.1mmol/L～1mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.5μmol/L～2μmol/L的地塞米松和5μg/mL～20μg/mL胰岛素和100μmol/L～500μmol/L的吲哚美辛。
在一个实施方式中，成脂肪诱导分化培养基包括基础培养基以及成脂肪生长因子。将成脂肪生长因子加入到基础培养基中配制成脂肪诱导分化培养基。
具体地，基础培养基为DMEM培养基，成脂肪生长因子包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛。
具体地，将诱导性多能干细胞(iPS细胞)置于培养瓶中，加入成脂肪诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养，分化1天后天换液，即弃去培养瓶中的旧培养液，添加新的成脂肪诱导分化完全培养基。继续培养2～13天，每个两天换液。分化培养第14天，脂肪细胞已分化完全。
上述体外制备脂肪细胞的方法，由ASF1A-FD基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞制备得到的iPS细胞分化得到。实验结果表明，该iPS细胞诱导的成熟脂肪细胞的数量明显提高。
一实施方式的体外制备心肌细胞的方法，包括以下步骤S410～S430。
S410、向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中，转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因。
具体地，向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因的步骤可参见上文步骤S110。
S420、细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞。
具体地，细胞培养使得皮肤成纤维细胞发生重编程的步骤可参见上文步骤S120。
S430、将诱导性多能干细胞置于成心肌诱导分化培养基中培养使得诱导性多能干细胞分化得到心肌细胞。
在一个实施方式中，成心肌诱导分化培养基包括基础培养基以及成心肌生长因子。将成心肌生长因子加入到基础培养基中配制成心肌诱导分化培养基。
具体地，成心肌诱导分化培养基使用Thermo Fisher Scientific公司的PSCCardiomyocyte Differentiation Kit(Cat.No:A2921201)。该培养基中含有A液和B液。分化第1天：弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的CardiomyocyteDifferentiation Medium A(A液)，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。分化第3天：细胞状态开始变差，且会出现脱落的死细胞。弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的Cardiomyocyte Differentiation Medium B(B液)，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。分化第5～11天：细胞状态会变的更差，且仍然会出现脱落的死细胞。弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的Cardiomyocyte Maintenance Medium，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，此后每两天更换新鲜的Cardiomyocyte Maintenance Medium。直至心肌细胞分化完全。
上述体外制备心肌细胞的方法，由ASF1A-FD基因与OSKM四基因一起导入皮肤成纤维细胞制备得到的iPS细胞分化得到。实验结果表明，该iPS细胞诱导的心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T的表达量明显提高。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
构建含ASF1A功能结构域的逆转录病毒表达载体pMXs-ASF1A-FD
1、ASF1A功能结构域的选取
本实施例中选取ASF1A蛋白质的功能域参见GenBank:CAG33628.1第1号氨基酸～第154号氨基酸，标记为ASF1A-FD。
2、含ASF1A-FD的逆转录病毒表达载体的构建
人工合成编码ASF1A-FD的基因，ASF1A-FD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在5’端添加BamH I限制性酶切位点CGGATCCG(SEQ ID No.2所示)，3’端添加XhoI性酶切位点CCTCGAGG(SEQ ID No.3所示)。将上述合成的基因片段通过BamH I和XhoI双酶切克隆进逆转录病毒载体pMXs(Cell Biolabs，RTV-010)中，构建好的逆转录病毒表达载体pMXs-ASF1A-FD经过BamH I和XhoI双酶切进行鉴定，酶切产物电泳图如图1所示(M表示Marker)，构建的pMXs-ASF1A-FD逆转录病毒表达载体经过BamH I和XhoI双酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在大约0.6kb、4.6kb处有两条清晰条带，与预期片段数和片段大小一致。证明ASF1A-FD基因成功插入到pMXs载体中。
实施例2
逆转录病毒的制备
选取PLAT-A细胞作为逆转录病毒包装细胞，该细胞是由人胚肾HEK293细胞通过稳定转染gag、pol和env基因而获得，转染gag、pol和env基因后的HEK293细胞可容许单个质粒转染实现快速地制备出逆转录病毒。ASF1A-FD逆转录病毒以及Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MYC逆转录病毒均利用该系统进行包装制备，其中Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MYC逆转录病毒表达质粒均采购自Addgene(货号分别为17217、17218、17219、17220)。ASF1A-FD逆转录病毒表达质粒按实施例1的方法制备。
逆转录病毒制备的详细实验步骤如下：
(1)Day1：接种Plat-A细胞至10cm培养皿中，5×106个/皿，共6个皿，于37℃，5％CO2培养箱中过夜培养。
(2)Day2：质粒转染前2h将培养液换成不含血清的DMEM培养液，2h后换成DMEM完全培养液。
按照lipo3000试剂盒说明书对Plat-A细胞分别进行5种逆转录病毒表达质粒的转染，具体分组如下：
1#皿：空白对照；2#皿：Oct3/4质粒转染组；3#皿：Sox2质粒转染组；
4#皿：Klf4质粒转染组；5#皿：c-MYC质粒转染组；6#皿：ASF1A-FD质粒转染组。
(3)Day4：收集培养皿中细胞培养基，0.45μg滤膜过滤后，0.5mL/支分装，保存于-80℃冰箱中。
实施例3
皮肤成纤维细胞的重编程
1、接种细胞
转染前2～3天，消化人原代皮肤成纤维(HDF)细胞，计数后取3×105个细胞接种至六孔板的六个孔中，0.5×105个细胞/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
实验共分三组，①空白对照；②OSKM感染组；③OSKM+ASF1A-FD感染组。每组设置两个平行对照。
2、逆转录病毒感染
(1)Day0：当孔中HDF细胞长满至50％～80％汇合度时，将空白对照组其中一个孔的细胞消化下来计数，另外将制备好的逆转录病毒从-80℃冰箱中取出置于冰上解冻，按照分组分别加入相应的逆转录病毒溶液，①组加入2mL空白对照皿收集的培养基，②组每孔分别加入0.5mL Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MYC逆转录病毒，③组每孔加入0.5mL Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MYC逆转录病毒以及0.5mL ASF1A-FD逆转录病毒，另外每孔分别加入6μg/mLpolybrene，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
(2)Day1：弃去含病毒培养液，换成新鲜的HDF完全培养基。
(3)Day2～6：每隔一天用新鲜的人皮肤成纤维细胞培养基全量换液。
(5)Day6：用15μg/mL Laminin-521包被培养皿，封口膜封好后放至2-8℃冰箱中。
(6)Day7：将六孔板各孔中的细胞消化下来，离心后吸弃上清液，用适量人皮肤成纤维细胞培养基重悬，接种至提前包被好的培养皿中培养。
(7)Day8：培养皿中的培养基换成人iPS细胞培养基(Nutristem hESC XF withHAS，05-100-1A，BI)继续培养。每隔一天更换新鲜的人iPS细胞培养基，同时在显微镜下观察是否有ESC样克隆出现，并记录各组出现的克隆数量,并统计iPS细胞重编程效率。
各组iPS细胞重编程效率的计算公式如下：
iPS重编程效率＝ESC样克隆数量÷病毒感染前细胞数量×100％。
各组iPS细胞重编程效率统计如图2所示。OSKM感染组的iPS重编程效率为0.012％，而OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS重编程效率为0.166％，远远高于OSKM感染组，重编程效率是OSKM感染组13.8倍。
3、iPS克隆传代
ESC样细胞克隆生长至合适大小后，挑选边缘清晰、无分化的克隆团，在显微镜下将其划分成小块后，用100μL枪头吸出克隆，转入事先包被好的12孔培养板中继续培养，备用。
注：每个iPS克隆传至12孔板的一个孔。
对iPS克隆的测定
1、将实施例2的方法制备的第②OSKM感染组和第③OSKM+ASF1A-FD感染组两组克隆分别经过10次以上传代后，由显微拍摄，结果如图3所示，可以看出，OSKM病毒感染组的克隆边缘发生分化形象(左侧)，而OSKM+ASF1A-FD病毒感染组的iPS克隆仍然保持典型的ESC样克隆形态，克隆边缘清晰，未发生分化现象(右侧)，说明该组iPS细胞的基因组更稳定，可长期维持其ESC样形态，并保持未分化状态。
2、碱性磷酸酶染色
(1)ALP显色底物溶液的配制(北京雷根生物，DE0004)
将试剂B1(AS-BI染色液)与试剂B2(FBB染色液)按1：1比例混合均匀后，即为ALP显色底物溶液，4℃避光保存备用。
(2)iPS克隆染色
取一部分按实施例2的方法培养在24孔板中的待检测iPS细胞，弃液，PBS清洗干净；
加入试剂A(ALP固定液)固定或4％多聚甲醛固定，PBS清洗；
滴加配制好的ALP显色底物溶液，避光孵育30min；
PBS清洗后，放在倒置显微镜下观察拍照，结果如图4所示。由于iPS细胞具有较高的碱性磷酸酶活性，利用碱性磷酸酶检测试剂盒对传代10次以上的iPS克隆进行染色，则会在iPS细胞处生成蓝色反应产物。由图4可以看出，OSKM病毒感染组的克隆边缘发生分化的细胞没有染成蓝色，而OSKM+ASF1A-FD病毒感染组的iPS克隆均成功染上蓝色，初步判定为正确的iPS细胞。
3、iPS细胞基因表达水平检测
3.1、iPS细胞总RNA的获取
(1)iPS细胞接种至24孔板中，培养至50％～80％覆盖率；
(2)弃掉培养板中的培养基，PBS洗涤两次后，每孔中加入500μl TRNzolUniversal试剂，反复吹打，在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
(3)4℃，12,000rpm离心10min，取上清；
(4)加入五分之一体积的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min；
(5)4℃，12,000rpm离心15min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新的离心管中。
(6)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。
(7)4℃，12,000rpm离心10min，去上清，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
(8)加入1mL 75％乙醇(用RNase-free ddH2O配制)洗涤沉淀。
(9)4℃，10,000rpm离心5min。倒出液体，注意不要倒出沉淀。
(10)室温放置晾干，根据实验需要，加入30-100μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
3.2逆转录PCR
(1)按下表1在冰浴条件下配制反应液：
表1：逆转录PCR反应体系
组分 体积
2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix 25μl
25×RT-PCR Enzyme Mix 2μl
上游特异性引物(10μM) 1.25μl
下游特异性引物(10μM) 1.25μl
总RNA 10ng-1μg
RNase-Free ddH2O 补水至50μl
注意：SOX2、OCT3/4、LIN28三个基因的检测体系需分开配制。
(2)按下表2设置PCR反应条件：
表2：PCR反应条件
3.3琼脂糖凝胶电泳检测逆转录PCR产物
配制1％浓度的琼脂糖凝胶，上样检测3.2中获得的PCR产物，凝胶成像仪进行拍照观察电泳结果。从电泳条带图5可以看出，在OSKM感染组仅有OCT3/4有表达，而在OSKM+ASF1A-FD感染组则表达SOX2、OCT3/4、LIN28三个基因，证明OSKM感染组的iPS细胞只是部分重编程，而OSKM+ASF1A-FD感染组为完全重编程的iPS细胞。
实施例4
iPS细胞向软骨细胞的诱导分化
(1)按下表3配制成软骨诱导分化完全培养基
表3：成软骨诱导分化完全培养基
成软骨诱导分化完全培养基：44.5mL DMEM(H)+5mLFBS+500μL试剂A+5μL试剂B+5μL试剂C+50μL试剂D，完全混匀后，0.22μm滤膜过滤除菌。
(2)成软骨诱导分化
分别选取传代10次以上的第②OSKM感染组和第③OSKM+ASF1A-FD感染组两组iPS细胞，向软骨细胞方向进行诱导分化。
分化第1天：弃去iPS细胞培养皿中旧培养液，加入成软骨诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养3天。
分化第2～20天：每隔两天弃去培养皿中的培养液，补加成软骨诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
分化第21天：软骨细胞已分化完全，可用于下一步应用或检测分析。
(3)软骨细胞的鉴定
分化第21天，利用Collagen II免疫荧光抗体检测软骨细胞标志物Collagen II的表达情况。
诱导后第21天，用免疫荧光染色法检测软骨细胞标志物Collagen II的表达情况，利用Leica倒置荧光显微镜进行拍摄，如图6所示。可以看出，OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS细胞所诱导的软骨细胞Collagen II(绿色荧光通道)的表达量明显高于OSKM感染组。根据Image J软件对绿色荧光通道的测量结果，OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS细胞所诱导的软骨细胞Collagen II的表达量是OSKM感染组的9.4倍。
实施例5
iPS细胞向脂肪细胞的诱导分化
(1)按下表4配制成脂肪诱导分化完全培养基的配制
表4：成脂肪诱导分化完全培养基
成脂诱导分化完全培养基：50mL MSC细胞完全培养基+1支试剂A+1支试剂B+1支试剂C+1支试剂D，37℃完全溶解后，0.22μm滤膜过滤除菌。
(2)成脂肪诱导分化
分别选取传代10次以上的第②OSKM感染组和第③OSKM+ASF1A-FD感染组两组iPS细胞，向脂肪细胞方向进行诱导分化。
分化第1天：弃去iPS细胞培养皿中旧培养液，补加相应体积的成脂肪诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
分化第3～13天：每隔两天弃去培养皿中的培养液，补加成脂诱导分化完全培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
分化第14天：脂肪细胞已分化完全，可用于下一步应用或检测分析。
(3)脂肪细胞的鉴定
1)油红O染液的配制
a)油红O母液：油红O粉末0.5g溶于100mL异丙醇中，混匀，配成0.5％的母液，4℃避光保存；
b)油红O工作液：临用前取6mL油红O母液+4mL去离子水，静置5-10min，混匀用后滤纸或0.4μm滤膜过滤，于2h内使用。
2)细胞染色步骤
a)清洗：弃掉培养液，DPBS洗2次；
b)固定：4％甲醛固定30min；
c)漂洗：弃甲醛，DPBS轻柔清洗一次；
d)染色：油红O工作液室温避光染色10分钟到1小时；
e)弃掉油红，DPBS轻柔洗3次，3min/次；
f)加入DPBS浸润(可长期保存)，显微镜拍照观察脂滴数量。
诱导14天后，利用油红O染色法进行鉴定，结果如图7所示。可以看出，OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS细胞所诱导的成熟脂肪细胞的数量明显高于OSKM感染组。OSKM感染组的iPS向脂肪细胞诱导的效率约为20％，而OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS向脂肪细胞诱导的效率约为90％，远远高于OSKM感染组。
实施例6
iPS细胞向心肌细胞的诱导分化
分别选取传代10次以上的第②OSKM感染组和第③OSKM+ASF1A-FD感染组两组iPS细胞，向心肌细胞方向进行诱导分化。
(1)心肌方向诱导分化
心肌的诱导分化使用Thermo Fisher Scientific公司的PSC CardiomyocyteDifferentiation Kit(Cat.No:A2921201)，具体步骤如下：
分化第1天：弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的CardiomyocyteDifferentiation Medium A，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
分化第3天：细胞状态开始变差，且会出现脱落的死细胞。弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的Cardiomyocyte Differentiation Medium B，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
分化第5～11天：细胞状态会变的更差，且仍然会出现脱落的死细胞。弃去培养皿中的旧培养基，补加适量预热至37℃的Cardiomyocyte Maintenance Medium，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，此后每两天更换新鲜的Cardiomyocyte Maintenance Medium。
(2)心肌细胞的鉴定
分化成熟的心肌细胞利用Cardiac Troponin T免疫荧光抗体检测心肌细胞标志物Cardiac Troponin T(心肌肌钙蛋白T)的表达情况。
诱导后第12天，分化成熟的心肌细胞利用免疫荧光染色法(Anti-CardiacTroponin T antibody)检测心肌细胞标志物Cardiac Troponin T(心肌肌钙蛋白T)的表达情况。利用Leica倒置荧光显微镜进行拍摄，如图8所示。可以看出，OSKM+Erbin感染组的iPS细胞所诱导的心肌细胞肌钙蛋白T(绿色荧光通道)的表达量明显高于OSKM感染组。根据Image J软件对绿色荧光通道的测量结果，OSKM+ASF1A-FD感染组的iPS细胞所诱导的心肌细胞肌钙蛋白T的表达量是OSKM感染组的12.4倍。
以上实验结果，可以得出结论：将ASF1A功能结构域(ASF1A-FD)基因与OSKM四基因共同导入人皮肤成纤维细胞制备人iPS细胞，其重编程效率是传统OSKM四基因导入法的13.8倍，大大提高了人皮肤成纤维细胞的重编程效率，且获得的iPS细胞可以在体外长期培养传代中稳定表达iPS细胞的标记基因，并维持多能性，可在体外向软骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞进行高效诱导分化。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市瑞亚再生医学科技有限责任公司
<120> 诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcaaagg ttcaggtgaa caatgtagtg gtgctggata acccttctcc tttctacaac 60
ccgttccagt tcgagatcac cttcgagtgc atcgaggacc tgtctgaaga cttggaatgg 120
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<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggatccg 8
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctcgagg 8

Claims (10)

1.一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中，所述转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，所述ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因；以及
细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述ASF1A-FD基因包括：
(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，
(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列，或
(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因的步骤包括：
将皮肤成纤维细胞培养至汇合度为50％～80％；以及
用逆转录病毒感染所述皮肤成纤维细胞使得所述转录因子以及所述ASF1A-FD基因进入所述皮肤成纤维细胞中，其中，所述逆转录病毒包括携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒。
4.根据权利要求3所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，其特征在于，所述逆转录病毒通过如下方法制备得到：
将gag基因、pol基因和env基因转染人胚肾HEK293细胞，获得病毒包装细胞；以及
将Oct3/4质粒、Sox2质粒、Klf4质粒、c-Myc质粒以及ASF1A-FD质粒分别转染所述病毒包装细胞，并分别培养转染后的所述病毒包装细胞并收集培养上清，获得携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒，混匀后得到所述逆转录病毒。
5.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞的步骤包括：
将层粘连蛋白和含钙镁的磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，并将所述混合液加入培养皿中，在2℃～8℃下放置12h～48h，去除所述混合液，得到混合液包被后的培养皿；
将导入了转录因子以及ASF1A-FD基因后的所述皮肤成纤维细胞加入到包被后的所述培养皿中，继续培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程出现胚胎干细胞样克隆，得到所述诱导性多能干细胞。
6.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，通过如权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。
7.如权利要求1～5任一项所述的方法或如权利要求6所述的诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
8.一种体外制备软骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如权利要求1～5中任一项所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法获得诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成软骨诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述软骨细胞，所述成软骨诱导分化培养基中含有0.5％v/v～2％v/v的ITS细胞培养添加物、5ng/mL～20ng/mL的TGF-β1、50mmol/L～200mmol/L的地塞米松和0.05mmol/L～0.5mmol/L维生素C-2磷酸钠。
9.一种体外制备脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如权利要求1～5中任一项所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法获得诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成脂肪诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述脂肪细胞，所述成脂肪诱导分化培养基中含有0.1mmol/L～1mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.5μmol/L～2μmol/L的地塞米松和5μg/mL～20μg/mL胰岛素和100μmol/L～500μmol/L的吲哚美辛。
10.一种体外制备心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用如权利要求1～5中任一项所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法获得诱导性多能干细胞；以及
将所述诱导性多能干细胞置于成心肌诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述心肌细胞。
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