JP7406257B2

JP7406257B2 - 人工マイクロｒｎａ前駆体およびそれを含む改良されたマイクロｒｎａ発現ベクター

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Publication number: JP7406257B2
Application number: JP2020567720A
Authority: JP
Inventors: 将之佐野; 真人中西
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2020-01-24
Publication date: 2023-12-27
Anticipated expiration: 2040-01-24
Also published as: US20220127640A1; WO2020153478A1; JPWO2020153478A1

Description

本発明は、人工マイクロＲＮＡ前駆体およびそれを含む改良されたマイクロＲＮＡ発現ベクターに関する。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、約２１塩基対の小さな二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって転写後遺伝子サイレンシングが引き起こされる現象である。ｓｉＲＮＡを細胞内で安定的に供給するためには、一般的に、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクターを細胞に導入する。しかし、ｓｈＲＮＡの非生理的な過剰発現は、内在性のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）生成経路を飽和および阻害することにより、細胞毒性を引き起こすことが知られている。そこで、この問題を回避するために、内在性ｍｉＲＮＡ前駆体のステム－ループ骨格を利用した人工ｍｉＲＮＡ発現ベクターの開発が試みられており、そのようなベクターとしては、ＤＮＡプラスミドベクターやレトロウイルスがよく利用されている（非特許文献１、２）。しかし、これらのベクターは、核内に入り込んでｍｉＲＮＡ一次転写産物を発現するため、宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組み込みを起こすリスクがある。

一方、発明者らは、核内に入らずに細胞質において外来遺伝子を高効率で発現することができる、センダイウイルス（ＳｅＶ）ベースの細胞質型ＲＮＡベクターを開発している（特許文献１、２）。本ベクターは、単一のベクターから複数の外来遺伝子を同時に安定的に発現させることができ、かつ、宿主細胞の染色体ＤＮＡを損傷するリスクもなく、細胞毒性も低い。そのため、ｉＰＳ細胞の作製に特に適しており（特許文献３）、現在、国内外の数多くの研究室において幹細胞研究等に利用されている。本ベクターを人工ｍｉＲＮＡの発現にも応用できれば、遺伝子発現抑制のための優れたツールとなり得、基礎研究から応用研究に至るまで幅広い貢献が期待される。しかし、細胞質型ＲＮＡベクターの場合、核内のｍｉＲＮＡ生成経路を利用できないため、ｍｉＲＮＡの発現効率が低いことが問題となる。

国際公開第２０１６／１１４４０５号特許第５６３３０７５号特許第５９６３３０９号

Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，（２００５），Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．１１，ｐｐ．１２８１－１２８８Ｃｈｕｎｇ，Ｋ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，（２００６），Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．７，ｅ５３

本発明は、細胞毒性が低く、宿主細胞に悪影響を及ぼすことなく、高効率で人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現することができるベクターを提供することを目的としてなされたものである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、ｍｉＲ－３６７前駆体の骨格をベースとした人工マイクロＲＮＡ前駆体を用いることにより、種々のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターから人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させることに成功した。

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、人工マイクロＲＮＡ前駆体を含んでなる単離されたＲＮＡ分子であって、前記人工マイクロＲＮＡ前駆体が、５’→３’方向に、第１の末端オリゴヌクレオチド、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチド、ＣＹＧ（配列番号２）からなる第１の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｙは、ＣまたはＵであり、ＵＵＧＡＡＵＡＫＡＡＡＵ（配列番号３）と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｋは、ＧまたはＵであり、ＹＧＧ（配列番号４）からなる第３の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｙは、ＣまたはＵであり、ガイド鎖オリゴヌクレオチド、および第２の末端オリゴヌクレオチドを含み、ここで、前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のｍＲＮＡの標的配列に対して相補性を有する１７～２９ヌクレオチドからなり、前記パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドが、前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドと同じ長さまたは前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドよりも１～３ヌクレオチド短い長さを有し、前記第１の末端オリゴヌクレオチドは、ＡＧＧＣＣＲ（配列番号１）またはその１～３個のヌクレオチドが置換されたヌクレオチド配列からなり、ここで、Ｒは、ＡまたはＧであり、前記第２の末端オリゴヌクレオチドは、ＵＧＧＡＹＹＫ（配列番号５）またはその１～３個のヌクレオチドが置換されたヌクレオチド配列からなり、ここで、Ｙは、それぞれ独立に、ＣまたはＵであり、Ｋは、ＧまたはＵであり、前記第１の末端オリゴヌクレオチドおよび前記第２の末端オリゴヌクレオチドが対合して第１の骨格ステム領域を形成し、前記パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドおよび前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドが対合して二本鎖マイクロＲＮＡ領域を形成し、前記第１の中央オリゴヌクレオチドおよび前記第３の中央オリゴヌクレオチドが対合して第２の骨格ステム領域を形成し、前記第１の骨格ステム領域、前記二本鎖マイクロＲＮＡ領域、および前記第２の骨格ステム領域が一緒にステム構造を形成し、前記第２の中央オリゴヌクレオチドがループ構造を形成する、単離されたＲＮＡ分子を提供するものである。

前記二本鎖マイクロＲＮＡ領域は、ミスマッチまたはバルジを含んでもよい。

前記第１の中央オリゴヌクレオチドと前記第２の中央オリゴヌクレオチドとの間、または前記第２の中央オリゴヌクレオチドと前記第３の中央オリゴヌクレオチドとの間に、１～１０ヌクレオチドからなるスペーサーオリゴヌクレオチドがさらに含まれてもよい。

また、本発明は、一実施形態によれば、上記単離されたＲＮＡ分子もしくはその相補配列からなるＲＮＡ分子またはそれらをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを提供するものである。

前記発現ベクターは、ＲＮＡウイルスベクターであることが好ましく、細胞質型ＲＮＡウイルスベクターであることがさらに好ましく、センダイウイルスベクターであることが特に好ましい。

本発明に係る人工マイクロＲＮＡ前駆体を含んでなる単離されたＲＮＡ分子は、従来用いられているＤＮＡプラスミドベクターのみならず、細胞質型ＲＮＡウイルスベクターからも高効率で人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させることができる。そのため、細胞質型ＲＮＡウイルスベクターと組み合わせて用いることにより、宿主細胞に悪影響を及ぼすことなく高効率で人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させることができ、有用である。

図１は、ｍｉＲＮＡを発現させるためのＳｅＶベクターのゲノム構成を示す模式図である。図２は、ＳｅＶベクター（ＳｅＶ－１２４）を導入したＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－１２４の発現レベルを示すグラフである。図３は、図２の細胞にレポーター遺伝子を導入し、ｍｉＲ－１２４の遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図４は、ＳｅＶベクター（ＳｅＶ－３０２－３６７）を導入したＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃ、ｍｉＲ－３０２ｄおよびｍｉＲ－３６７の発現レベルを示すグラフである。図５は、図４の細胞にレポーター遺伝子を導入し、ｍｉＲ－３０２ａの遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図６は、図４の細胞にレポーター遺伝子を導入し、ｍｉＲ－３６７の遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図７は、ＳｅＶベクター（ＳｅＶ－３０２－３６７）によりｍｉＲ－３０２－３６７クラスターを導入したＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃ、ｍｉＲ－３０２ｄおよびｍｉＲ－３６７の発現レベルを、ヒトｉＰＳ細胞における発現レベルと比較したグラフである。図８は、ＨＣＴ１１６細胞にレトロウイルスベクター（Ｒｅｔｒｏ－３０２－３６７）またはＳｅＶベクター（ＳｅＶ－３０２－３６７）によりｍｉＲ－３０２－３６７クラスターを導入した場合の、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを比較したグラフである。図９は、ｍｉＲ－３６７前駆体の二次構造を示す図である。図１０は、ｍｉＲ－３６７前駆体から発現させたｍｉＲ－３６７の遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図１１は、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）の二次構造を示す図である。図１２は、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）から発現させたｍｉＲ－１２４の遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図１３は、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（２）の二次構造を示す図である。図１４は、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（２）から発現させたｍｉＲ－１２４の遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図１５は、種々のｐｒｅ－ｍｉＲ骨格をベースとしたホタルルシフェラーゼ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す図である。図１６は、図１５に示された各種人工ｍｉＲＮＡ前駆体を含むＳｅＶベクターから産生されたホタルルシフェラーゼ人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図１７は、図１５に示された各種人工ｍｉＲＮＡ前駆体を含むＣＭＶプラスミドベクターから産生されたホタルルシフェラーゼ人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図１８は、ＥＧＦＰ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７骨格）の二次構造を示す図である。図１９は、図１８に示された人工ｍｉＲＮＡ前駆体を含むＳｅＶベクターから産生されたＥＧＦＰ人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を、ＥＧＦＰの蛍光強度により評価したグラフである。図２０は、マウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７骨格）の二次構造を示す図である。図２１は、図２０に示された人工ｍｉＲＮＡ前駆体を含むＳｅＶベクターから産生されたマウスｐ５３人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。図２２は、リプログラミング因子（ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２）発現ＳｅＶベクター、および、リプログラミング因子（ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２）＋ｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ発現ＳｅＶベクターの、ゲノム構成を示す模式図である。図２３は、図２２に示されたベクターの導入による細胞リプログラミング効率を、ＳＳＥＡ１の発現に基づいて評価したグラフである。図２４は、マウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体を含むＳｅＶベクターから産生されたｐ５３人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を、ルシフェラーゼ活性に基づいて評価したグラフである。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

本発明は、第一の実施形態によれば、人工マイクロＲＮＡ前駆体を含んでなる単離されたＲＮＡ分子であって、前記人工マイクロＲＮＡ前駆体が、５’→３’方向に、第１の末端オリゴヌクレオチド、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチド、ＣＹＧ（配列番号２）からなる第１の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｙは、ＣまたはＵであり、ＵＵＧＡＡＵＡＫＡＡＡＵ（配列番号３）と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｋは、ＧまたはＵであり、ＹＧＧ（配列番号４）からなる第３の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｙは、ＣまたはＵであり、ガイド鎖オリゴヌクレオチド、および第２の末端オリゴヌクレオチドを含み、ここで、前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のｍＲＮＡの標的配列に対して相補性を有する１７～２９ヌクレオチドからなり、前記パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドが、前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドと同じ長さまたは前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドよりも１～３ヌクレオチド短い長さを有し、前記第１の末端オリゴヌクレオチドは、ＡＧＧＣＣＲ（配列番号１）またはその１～３個のヌクレオチドが置換されたヌクレオチド配列からなり、ここで、Ｒは、ＡまたはＧであり、前記第２の末端オリゴヌクレオチドは、ＵＧＧＡＹＹＫ（配列番号５）またはその１～３個のヌクレオチドが置換されたヌクレオチド配列からなり、ここで、Ｙは、それぞれ独立に、ＣまたはＵであり、Ｋは、ＧまたはＵであり、前記第１の末端オリゴヌクレオチドおよび前記第２の末端オリゴヌクレオチドが対合して第１の骨格ステム領域を形成し、前記パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドおよび前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドが対合して二本鎖マイクロＲＮＡ領域を形成し、前記第１の中央オリゴヌクレオチドおよび前記第３の中央オリゴヌクレオチドが対合して第２の骨格ステム領域を形成し、前記第１の骨格ステム領域、前記二本鎖マイクロＲＮＡ領域、および前記第２の骨格ステム領域が一緒にステム構造を形成し、前記第２の中央オリゴヌクレオチドがループ構造を形成する、単離されたＲＮＡ分子である。

本実施形態において、「単離された」とは、本実施形態のＲＮＡ分子が他の核酸を実質的に含まないように精製された状態、すなわち、本実施形態のＲＮＡ分子が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは９９％以上の純度であることを意味する。

本実施形態において、「人工マイクロＲＮＡ前駆体」とは、既知または野生型のマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」とも記載する）前駆体の骨格を模倣したＲＮＡ分子であって、天然もしくは人工のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する、天然には存在しないＲＮＡ分子を意味する。なお、本実施形態における人工ｍｉＲＮＡ前駆体には、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのいずれもが含まれ得る。

本実施形態における人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、第１の構成部分として、第１の末端オリゴヌクレオチドおよび第２の末端オリゴヌクレオチドが対合して形成される、第１の骨格ステム領域を含む。ここで、「対合する」とは、２つのオリゴヌクレオチド間で塩基対が形成されることを意味し、塩基対には、Ｇ：ＣおよびＡ：Ｕのみならず、ゆらぎ塩基対（Ｇ：Ｕ）も含まれてよい。本実施形態において、人工ｍｉＲＮＡ前駆体における第１の骨格ステム領域は、マウスおよびヒトのｍｉＲ－３６７前駆体の骨格に基づいており、マウスまたはヒトのｍｉＲ－３６７前駆体の骨格の対応する部分と完全に同一であるか、または実質的に同一であってよい。ここで、「実質的に同一」とは、当該ステム領域の全体構造には影響しない程度に、例えば１～３個程度のヌクレオチド置換が含まれることを意味する。

すなわち、第１の末端オリゴヌクレオチドは、ＡＧＧＣＣＲ（配列番号１）またはその１～３個のヌクレオチドが置換されたヌクレオチド配列からなり、第２の末端オリゴヌクレオチドは、ＵＧＧＡＹＹＫ（配列番号５）またはその１～３個のヌクレオチドが置換されたヌクレオチド配列からなる。ここで、配列番号１のヌクレオチドにおいて、Ｒは、ＡまたはＧであり、配列番号５のヌクレオチドにおいて、Ｙは、それぞれ独立に、ＣまたはＵであり、Ｋは、ＧまたはＵである。ヌクレオチド置換の位置および種類は、特に限定されず、第１の骨格ステム領域の全体構造が維持される限り任意であってよい。好ましくは、第１の末端オリゴヌクレオチドは、ＡＧＧＣＣＧ（配列番号６）またはＡＧＧＣＣＡ（配列番号７）からなってよく、第２の末端オリゴヌクレオチドは、ＵＧＧＡＣＣＵ（配列番号８）またはＵＧＧＡＵＵＧ（配列番号９）からなってよい。

本実施形態における人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、第２の構成部分として、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドおよび前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドが対合して形成される二本鎖マイクロＲＮＡ領域を含む。ここで、「ガイド鎖」とは、二本鎖ｍｉＲＮＡのうち、成熟ｍｉＲＮＡとなる鎖（すなわち、ｓｉＲＮＡにおけるアンチセンス鎖）を意味し、「パッセンジャー鎖」とは、二本鎖ｍｉＲＮＡから取り除かれ分解される鎖（すなわち、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖）を意味する。

本実施形態において、ガイド鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の標的配列に対して相補性を有する１７～２９ヌクレオチドからなり、好ましくは１９～２５ヌクレオチドからなり、特に好ましくは２１～２３ヌクレオチドからなり、最も好ましくは２２ヌクレオチドからなる。なお、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の標的配列は、当分野ですでに確立されている人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡの設計方法に基づいて、標的遺伝子の発現を特異的に抑制できるように、適宜選択され得る。

本実施形態におけるガイド鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を完全に抑制しようとする場合には、標的配列に対して完璧または完全な（すなわち１００％の）相補性を有する配列からなることが好ましいが、標的遺伝子の発現を弱～中程度抑制しようとする場合には、標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に認識できる程度の相補性を有する配列であればよい。したがって、本実施形態におけるガイド鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の標的配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列相補性を有していればよい。言い換えれば、本実施形態におけるガイド鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の標的配列に対して完全に相補的な配列において、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個または１個のヌクレオチドが置換されたものであってよい。なお、配列の相補性は、当分野における慣用の計算アルゴリズム（ＮＣＢＩＢＬＡＳＴなど）を用いて計算することができる。

本実施形態において、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドは、ガイド鎖オリゴヌクレオチドと同じ長さからなるか、ガイド鎖オリゴヌクレオチドよりも１～３ヌクレオチド短い長さを有する。すなわち、ガイド鎖オリゴヌクレオチドが２２ヌクレオチドからなる場合には、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドは１９～２２ヌクレオチドからなる。本実施形態において、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドは、ガイド鎖オリゴヌクレオチドに対して１００％の相補性を有していることが好ましいが、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドとガイド鎖オリゴヌクレオチドとが対合して二本鎖を形成できることを限度として、例えば１個、２個、３個、４個または５個のミスマッチまたはバルジを含むことができる。ミスマッチまたはバルジの位置は任意であってよいが、好ましくは、マウスおよびヒトのｍｉＲ－３６７前駆体におけるミスマッチまたはバルジに相当する位置であることができ、すなわち、ガイド鎖オリゴヌクレオチドの５’末端から２番目、８番目および／または９番目の位置であることが好ましい。

本実施形態における人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、第３の構成部分として、ＣＹＧ（配列番号２）からなる第１の中央オリゴヌクレオチドおよびＹＧＧ（配列番号４）からなる第３の中央オリゴヌクレオチドが対合して形成される、第２の骨格ステム領域を含む。ここで、配列番号２および４のヌクレオチドにおいて、Ｙは、それぞれ独立に、ＣまたはＵである。本実施形態において、人工ｍｉＲＮＡ前駆体における第２の骨格ステム領域は、マウスおよびヒトのｍｉＲ－３６７前駆体の骨格に基づいており、マウスおよびヒトのｍｉＲ－３６７前駆体の骨格の対応する部分と完全に同一であるか、または実質的に同一であってよい。好ましくは、第１の中央オリゴヌクレオチドは、ＣＵＧ（配列番号１０）からなってよく、第３の中央オリゴヌクレオチドは、ＵＧＧ（配列番号１１）からなってよい。

本実施形態における人工ｍｉＲＮＡ前駆体では、第１の骨格ステム領域、二本鎖ｍｉＲＮＡ領域、および第２の骨格ステム領域が一緒にステム構造を形成する。このとき、ステム構造は、第１の骨格ステム領域、二本鎖ｍｉＲＮＡ領域、および第２の骨格ステム領域のみから構成されてもよいし、第１の骨格ステム領域と二本鎖ｍｉＲＮＡ領域との間、および／または二本鎖ｍｉＲＮＡ領域と第２の骨格ステム領域との間に、全体のステム構造に影響しない程度のヌクレオチドの挿入があってもよい。すなわち、第１の末端オリゴヌクレオチドとパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドとの間、パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと第１の中央オリゴヌクレオチドとの間、第３の中央オリゴヌクレオチドとガイド鎖オリゴヌクレオチドとの間、および／またはガイド鎖オリゴヌクレオチドと第２の末端オリゴヌクレオチドとの間には、数個（例えば、１個、２個、または３個）のヌクレオチドの挿入が許容され得る。本実施形態において、人工ｍｉＲＮＡ前駆体のステム構造は、各領域が直接連結されて、第１の骨格ステム領域、二本鎖ｍｉＲＮＡ領域、および第２の骨格ステム領域のみから構成されることが好ましい。

本実施形態における人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、第４の構成部分として、ＵＵＧＡＡＵＡＫＡＡＡＵ（配列番号３）と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチドを含む。ここで、配列番号３のヌクレオチドにおいて、Ｋは、ＧまたはＵである。本実施形態における第２の中央オリゴヌクレオチドは、マウスおよびヒトのｍｉＲ－３６７前駆体の骨格に基づいており、マウスおよびヒトのｍｉＲ－３６７前駆体と同様のループ構造が形成されればよい。そのため、本実施形態における第２の中央オリゴヌクレオチドは、ＵＵＧＡＡＵＡＫＡＡＡＵ（配列番号３）からなるヌクレオチド配列と少なくとも７０％または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなってよく、好ましくは９０％以上、特に好ましくは１００％の相同性を有するヌクレオチド配列からなってよい。言い換えれば、本実施形態における第２の中央オリゴヌクレオチドは、ＵＵＧＡＡＵＡＫＡＡＡＵ（配列番号３）からなるヌクレオチド配列において、例えば４個以下、３個以下、２個または１個のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されたものであってよい。好ましくは、第２の中央オリゴヌクレオチドは、ＵＵＧＡＡＵＡＧＡＡＡＵ（配列番号１２）またはＵＵＧＡＡＵＡＵＡＡＡＵ（配列番号１３）からなってよい。

本実施形態において、第１の中央オリゴヌクレオチド、第２の中央オリゴヌクレオチド、および第３の中央オリゴヌクレオチドは、直接連結されることが好ましいが、第１の中央オリゴヌクレオチドと第２の中央オリゴヌクレオチドとの間、または第２の中央オリゴヌクレオチドと第３の中央オリゴヌクレオチドとの間に、１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、または１～３ヌクレオチドからなるスペーサーオリゴヌクレオチドが含まれてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドは任意の配列であってよいが、ＵＵＧＡＡＵＡＫＡＡＡＵ（配列番号３）からなるヌクレオチド配列との間で塩基対を形成しない配列であることが好ましい。

本実施形態の単離されたＲＮＡ分子は、上記にしたがって設計された人工ｍｉＲＮＡ前駆体の５’末端および／または３’末端に、任意選択的にフランキング配列が付加されることにより調製されてよい。なお、フランキング配列は、当該単離されたＲＮＡ分子を組み込む発現ベクターに応じて、適宜決定されることができる。また、フランキング配列は天然のｍｉＲ-３６７前駆体のフランキング配列に相当する配列を含んでもよく、その長さは、例えば１～１００ヌクレオチド、１～５０ヌクレオチド、１～４０ヌクレオチドであってよく、好ましくは１５～２５ヌクレオチドであってよい。

本実施形態の単離されたＲＮＡ分子は、当分野において公知の方法により、化学合成または遺伝子工学的手法により生合成することができる。例えば、本実施形態の単離されたＲＮＡ分子は、鋳型となるＤＮＡを調製し、それをＲＮＡポリメラーゼにより転写することによって製造することができる。なお、本実施形態の単離されたＲＮＡ分子は、すべてＲＮＡから構成されてもよいし、その一部に修飾ＲＮＡが含まれてもよい。修飾ＲＮＡとしては、例えば、ホスホロチオエート化ＲＮＡ、ボラノホスフェート化ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ、２’－Ｆ化ＲＮＡ、２’，４’－ＢＮＡ（別名ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ））、などが挙げられる。

本実施形態の単離されたＲＮＡ分子またはそれをコードするＤＮＡ分子を細胞に導入することにより、人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させることができる。ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の細胞への導入は、細胞の種類に応じて、当分野において周知の方法により行うことができ、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより行うことができる。

あるいは、本実施形態の単離されたＲＮＡ分子を、細胞質型ＲＮＡウイルスベクターを含む種々の発現ベクターに組み込んで細胞に導入することにより、高効率で人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させることができる。

すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、上記単離されたＲＮＡ分子もしくはその相補配列からなるＲＮＡ分子またはそれらをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターである。

本実施形態において用いることができる発現ベクターの種類は、特に限定されず、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのいずれも使用することができる。ウイルスベクターには、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどのＤＮＡウイルスベクターや、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ボルナウイルスベクター、パラミクソウイルスベクターなどのＲＮＡウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、非ウイルスベクターには、例えば、ｐＯＬ１（以下の実施例において作製）、ｐＣＩＭａｍｍａｌｉａｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＢＡｐｏ－ＣＭＶＤＮＡ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）などのプラスミドベクターや、ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｈｙｇ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）などのエピソーマルベクターなどが挙げられる。

本実施形態の発現ベクターは、ＲＮＡウイルスベクターであることが好ましく、細胞質型ＲＮＡウイルスベクターであることがさらに好ましい。細胞質型ＲＮＡウイルスベクターは、例えば、センダイウイルスベクターなどのパラミクソウイルスベクター、シンドビスウイルスベクターなどのアルファウイルスベクター、ダニ媒介性脳炎ウイルスベクターなどのフラビウイルスベクター、水泡性口内炎ウイルスベクターなどのベシクロウイルスベクターなどから選択されてよい。本実施形態の発現ベクターは、特に好ましくはセンダイウイルスベクターであり得る。

本実施形態の発現ベクターは、当分野において公知の方法により、上記単離されたＲＮＡ分子もしくはその相補配列からなるＲＮＡ分子またはそれをコードするＤＮＡ分子を、発現ベクター中のプロモーターの下流に作動可能に連結することにより調製することができる。なお、１つの発現ベクターにつき、１つまたは複数の上記単離されたＲＮＡ分子もしくはそれをコードするＤＮＡ分子が導入されてもよい。例えば、発現ベクターがセンダイウイルスベクターである場合には、遺伝子開始シグナル（ｇｅｎｅ－ｓｔａｒｔｓｉｇｎａｌ）と遺伝子終了シグナル（ｇｅｎｅ－ｅｎｄｓｉｇｎａｌ）との間に上記単離されたＲＮＡ分子を挿入すればよく、１つのセンダイウイルスベクターにつき、遺伝子開始シグナルと遺伝子終了シグナルとの間に挿入された上記単離されたＲＮＡ分子を、例えば１～１０個、１～５個、１～３個、２個または１個導入することができる。

本実施形態の発現ベクターの細胞への導入は、細胞および発現ベクターの種類に応じて、当分野において周知の方法により行うことができる。非ウイルスベクターであれば、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどにより導入することができる。ウイルスベクターであれば、適切な力価または多重感染度（ＭＯＩ）において細胞に感染させることにより導入することができる。

第一の実施形態における単離されたＲＮＡ分子および第二の実施形態における発現ベクターは、従来の人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ発現系と比較して顕著に高い効率により人工ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させることができ、有用である。

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜１．センダイウイルスベクターからの各種ｍｉＲＮＡの発現＞
（１－１）ｍｉＲＮＡ発現ベクターの作製
センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターに種々の天然ｍｉＲＮＡ前駆体を導入し、ｍｉＲＮＡの発現レベルおよび遺伝子ノックダウン効果を評価した。ＳｅＶベクターには、ＳｅＶｄｐベクター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２０１１），Ｖｏｌ．２８６，Ｎｏ．６，ｐｐ．４７６０－４７７１）を用いた。ＳｅＶｄｐベクターのＰ／Ｃ／Ｖ遺伝子の下流に、選択マーカーであるブラストサイジン耐性遺伝子（ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子；ｐＣＸ４ｂｓｒプラスミド（Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ，（２００３），Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．２３，ｐｐ．１３５６７－１３５７２）を鋳型としたＰＣＲにより調製）および発現マーカーであるＥＧＦＰ遺伝子（ｐＥＧＦＰ－１プラスミド（ＴａｋａｒａＢｉｏ）を鋳型としたＰＣＲにより調製）を導入し、さらに、その下流にｍｉＲ－１２４遺伝子またはｍｉＲ－３０２－３６７クラスターを導入して、ｍｉＲ－１２４発現ベクター（ＳｅＶ－１２４）およびｍｉＲ－３０２－３６７発現ベクター（ＳｅＶ－３０２－３６７）を調製した。ｍｉＲ－１２４遺伝子およびｍｉＲ－３０２－３６７クラスターは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス胎児由来線維芽細胞（ＭＥＦ）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより調製した。また、ｍｉＲＮＡ遺伝子を含有しないベクター（ＳｅＶ－Ｃｔｒｌ）を陰性対照として調製した。ＳｅＶ－１２４、ＳｅＶ－３０２－３６７、およびＳｅＶ－Ｃｔｒｌのゲノム構成を図１に示す。

また、ｍｉＲ－３０２－３６７クラスターを導入したレトロウイルスベクター（Ｒｅｔｒｏ－３０２－３６７）を以下の手順により調製した。ｐＣＸ４ｐｕｒプラスミド（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２００３），Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．２３，ｐｐ．１３５６７－１３５７２）のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位に、ＭＥＦからクローニングされたｍｉＲ－３０２－３６７クラスターを導入した。得られたプラスミドベクターをｐＶＰａｃｋ－ＧＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ）およびｐＶＰａｃｋ－Ａｍｐｈｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ）とともに、ＦｕＧＥＮＥＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。３日後に培養上清を回収し、０.４５μｍフィルターでろ過することで、ｍｉＲ－３０２－３６７発現レトロウイルスベクターを調製した。

（１－２）ｍｉＲＮＡの発現レベルの定量
ＳｅＶベクターは、ＭＯＩ＝５でＨＣＴ１１６細胞に感染させ、翌日から１０μｇ／ｍｌブラストサイジンＳを培地に添加して培養することにより、ＳｅＶベクターゲノムを安定に保持する細胞を選択した。また、レトロウイルスベクターは、１×１０^９コピーのベクターを４μｇ／ｍｌポリブレン存在下でＨＣＴ１１６細胞に感染させ、３日後に０．２μｇ／ｍｌのピューロマインシンを培地に添加して培養することにより、導入したｍｉＲＮＡを安定に発現する細胞を選択した。これらの細胞から、ＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて各ｍｉＲＮＡについてのＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ＲＴ反応にはＴａｑＭａｎＭｉｃｒｏＲＮＡＲｅｖｅｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ｑＰＣＲにはＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＩＩ，ｎｏＵＮＧ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。各ｍｉＲＮＡのＣｑ（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｙｃｌｅ）値をＲＮＵ４８（内在性コントロール遺伝子）のＣｑ値でノーマライズしたΔΔＣｔ法により、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲに用いたＴａｑＭａｎＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙｓを以下に示す。

表１．ＲＴ－ｑＰＣＲのためのＴａｑＭａｎＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙｓ

（１－３）ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果の評価
ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を評価するために、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）遺伝子およびウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）遺伝子を含むｐｓｉＣＨＥＣＫ－２ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＲＬｕｃ遺伝子の３’非翻訳領域に対してｍｉＲＮＡに完全な相補性を有する標的配列を組み込んだレポーターベクターを作製した。このレポーターベクターからは、ＦＬｕｃおよびＲＬｕｃが発現されるが、ｍｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンが起こると、ＲＬｕｃの発現のみが減少する。このため、ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃの相対値を算出することで、レポーターベクターのトランスフェクション効率を補正した、ＲＬｕｃの活性を測定することができる。

上記レポーターベクターを、上記（１－２）で調製された細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりトランスフェクションした。その後、約２２～２５時間後に、Ｄｕａｌ－ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｔｅｒＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＦＬｕｃおよびＲＬｕｃの活性を測定し、ＲＬｕｃ活性の相対値（以下、「ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ値」と表記する）を算出した。コントロールとして、ｍｉＲＮＡの標的配列に代えて、ｍｉＲＮＡの標的とならないスクランブル配列を組み込んだベクターをトランスフェクションして得られた陰性対照細胞について、同様にルシフェラーゼ活性を評価した。スクランブル配列はｓｉＲＮＡＷｉｚａｒｄｖ３．１Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を利用して設計した。陰性対照細胞におけるＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ値を１．０とした場合の、レポーターベクター導入細胞におけるＲＬｕｃ／ＦＬｕｃの相対値を算出することにより、レポータールシフェラーゼであるＲＬｕｃの活性に基づいて各ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を評価した。各ｍｉＲＮＡの標的配列およびそれに対応するスクランブル配列を以下に示す。

表２．ｍｉＲＮＡの標的配列およびそれに対応するスクランブル配列

結果を図２～６に示す。ＳｅＶ－１２４の導入により、ＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－１２４の発現レベルは約２０倍に上昇し（図２）、ＲＬｕｃ活性を約５３％抑制した（図３）。また、ＳｅＶ－３０２－３６７の導入により、ＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃ、ｍｉＲ－３０２ｄおよびｍｉＲ－３６７の発現レベルは約９００～２００００倍に上昇し（図４）、例えばｍｉＲ－３０２ａは、ＲＬｕｃ活性を約５２％抑制した（図５）。とりわけ、ｍｉＲ－３６７は高い標的遺伝子ノックダウン効果を示し、ＲＬｕｃ活性を約９６％抑制した（図６）。

また、上記（１－２）と同様の手順によりヒトｉＰＳ細胞（ＰＬＯＳＯＮＥ，（２０１６），Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１０，ｅ０１６４７２０）におけるｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃ、ｍｉＲ－３０２ｄおよびｍｉＲ－３６７の発現レベルを定量し、ＳｅＶ－３０２－３６７を導入したＨＣＴ１１６細胞におけるそれらの発現レベルと比較した結果を図７に示す。ＳｅＶ－３０２－３６７を導入したＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃおよびｍｉＲ－３０２ｄの発現レベルは、ｉＰＳ細胞におけるそれらの発現レベルと比較して圧倒的に低かったのに対し、ｍｉＲ－３６７の発現レベルは、両細胞間でそれほど大きな差はなかった。

さらに、Ｒｅｔｒｏ－３０２－３６７を導入したＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃ、ｍｉＲ－３０２ｄおよびｍｉＲ－３６７の発現レベルと、ＳｅＶ－３０２－３６７を導入したＨＣＴ１１６細胞におけるそれらの発現レベルとを比較した結果を図８に示す。ｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃおよびｍｉＲ－３０２ｄの発現レベルは、Ｒｅｔｒｏ－３０２－３６７とＳｅＶ－３０２－３６７との間で大きな差はみられなかったのに対し、ｍｉＲ－３６７の発現レベルは、ＳｅＶ－３０２－３６７導入細胞の方が顕著に高かった。

以上の結果から、ＳｅＶベクターからのｍｉＲ－３６７の発現効率が特に高い可能性が示唆された。

＜２．ＳｅＶ－３６７から発現させたｍｉＲ－３６７の遺伝子ノックダウン効果＞
上記（１－１）と同様の手順により、ｍｉＲ－３０２－３６７クラスターに代えてｍｉＲ－３６７前駆体（図９）のみを導入したＳｅＶ発現ベクター（ＳｅＶ－３６７）を調製し、上記（１－２）と同様の手順によりＨＣＴ１１６細胞に発現ベクターを導入し、上記（１－３）と同様の手順により、遺伝子ノックダウン効果を評価した。

結果を図１０に示す。ＳｅＶ－３６７を導入したＨＣＴ１１６細胞においても、ＳｅＶ－３０２－３６７を導入したＨＣＴ１１６細胞における場合と同様に、極めて高い標的遺伝子ノックダウン効果が確認された。この結果から、ｍｉＲ－３６７前駆体のみを組み込んだＳｅＶベクターからでもｍｉＲ－３６７を高レベルで発現させることができることが示された。

＜３．ｍｉＲ－３６７前駆体ベースの人工ｍｉＲ－１２４前駆体からのｍｉＲ－１２４の発現＞
ｍｉＲ－３６７前駆体の二次構造に基づく人工ｍｉＲＮＡ前駆体として、ｍｉＲ－３６７前駆体の二次構造を完全に維持しつつ、ｍｉＲ－３６７配列をｍｉＲ－１２４配列に置き換えた人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）と、ｍｉＲ－３６７前駆体の骨格を維持しつつ、二本鎖ｍｉＲ領域にミスマッチ／バルジを含まないように、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）をさらに改変した人工ｍｉＲ－１２４前駆体（２）を設計した。人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）および（２）のヌクレオチド配列を表３に、二次構造を図１１および図１３に示す。図中、ｍｉＲ－１２４配列を太字で示す。なお、二次構造は、ｍｆｏｌｄｗｅｂｓｅｒｖｅｒ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，（２００３），Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１３，ｐｐ．３４０６－３４１５）を利用して予測した。

表３．人工ｍｉＲ－１２４前駆体のヌクレオチド配列

上記（１－１）と同様の手順により、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）または人工ｍｉＲ－１２４前駆体（２）を組み込んだＳｅＶ発現ベクターを調製し、上記（１－２）と同様の手順によりＨＣＴ１１６細胞に発現ベクターを導入して、上記（１－３）と同様の手順により遺伝子ノックダウン効果を評価した。

人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）の結果を図１２に、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（２）の結果を図１４に示す。人工ｍｉＲ－１２４前駆体（１）はＲＬｕｃ活性を約７７％抑制し、人工ｍｉＲ－１２４前駆体（２）はＲＬｕｃ活性を約８６％抑制した。これらの結果から、ｍｉＲ－３６７前駆体を利用することで高い活性を持つ異なる種類のｍｉＲＮＡを発現できることが確かめられた。

＜４．ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースの人工ｍｉＲＮＡ前駆体から発現させた人工ｍｉＲＮＡの標的遺伝子ノックダウン効果（１）＞
以下の手順により、様々な天然ｍｉＲＮＡ前駆体の骨格をベースとしてＦＬｕｃ遺伝子を標的とする人工ｍｉＲＮＡ前駆体を作製し、それらから発現されるＦＬｕｃ標的人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を比較した。

（４－１）ＳｅＶベクターからの人工ｍｉＲＮＡの発現
非特許文献１に記載されたｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０）、非特許文献２に記載されたｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲ－１５５）、およびマウス由来の天然のｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７、ｐｒｅ－ｍｉＲ－１２４、およびｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２ａ）の骨格をベースとして、それらの二次構造を模倣した、ＦＬｕｃ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体を設計した。人工ｍｉＲＮＡの配列として、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，（２００１），Ｖｏｌ．４１１，Ｎｏ．６８３６，ｐｐ．４９４－４９８）に記載された、ＦＬｕｃのｍＲＮＡ中の標的配列に対して完全に相補的な配列を用いた。ＦＬｕｃ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体のヌクレオチド配列を表４に、二次構造を図１５に示す。図中、ＦＬｕｃ遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列を太字で示す。

表４．前駆体のヌクレオチド配列

上記（１－１）と同様の手順により、人工ｍｉＲＮＡ前駆体のそれぞれを組み込んだＳｅＶ発現ベクターを調製し、上記（１－２）と同様の手順によりＨＣＴ１１６細胞に発現ベクターを導入した後、ブラストサイジンＳによりセレクションを行った。さらに、ＦＬｕｃをコードする配列を含むｐＧＬ３－Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＲＬｕｃをコードする配列を含むｐＲＬ－ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用いて細胞に導入し、約２４時間後にＦＬｕｃおよびＲＬｕｃの活性を測定し、ＦＬｕｃ活性の相対値（以下、「ＦＬｕｃ／ＲＬｕｃ値」と表記する）を算出した。人工ｍｉＲＮＡ前駆体を組み込んだＳｅＶ発現ベクターに代えてＳｅＶ－Ｃｔｒｌを用いた以外は同様にして調製された細胞におけるＦＬｕｃ／ＲＬｕｃ値を１．０として、各人工ｍｉＲＮＡを組み込んだＳｅＶ発現ベクターを導入した細胞におけるＦＬｕｃ／ＲＬｕｃの相対値を算出することにより、各人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を評価した。

結果を図１６に示す。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースの人工ｍｉＲＮＡ前駆体を組み込んだＳｅＶベクターから発現させた人工ｍｉＲＮＡが、最も高い遺伝子ノックダウン効果を示すことが確認された。

（４－２）プラスミドベクターからの人工ｍｉＲＮＡの発現
ＳｅＶベクターに代えて、ｐＯＬ１プラスミドのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流に、図１５に示した人工ｍｉＲＮＡ前駆体のそれぞれを組み込んだプラスミドベクターを作製した。ｐＯＬ１は、ｐＯＮ１（ＰＬＯＳＯＮＥ，（２０１６），Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１０，ｅ０１６４７２０）のゼオシン耐性遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子に置換して作製した。人工ｍｉＲＮＡ前駆体を組み込んだＣＭＶプラスミドベクター、ｐＧＬ３－ＣｏｎｔｒｏｌベクターおよびｐＲＬ－ＴＫベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用いてＨＣＴ１１６細胞に導入した。約２４時間後にＦＬｕｃおよびＲＬｕｃの活性を測定し、ＦＬｕｃ／ＲＬｕｃ値を算出した。人工ｍｉＲＮＡ前駆体を組み込んだＣＭＶプラスミドベクターに代えて、人工ｍｉＲＮＡ前駆体を含有しないＣＭＶプラスミドベクターを用いた以外は同様にして調製された細胞（陰性対照）におけるＦＬｕｃ／ＲＬｕｃ値を１．０として、各人工ｍｉＲＮＡを組み込んだプラスミドベクターを導入した細胞におけるＦＬｕｃ／ＲＬｕｃの相対値を算出することにより、各人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を評価した。

結果を図１７に示す。ＣＭＶプラスミドベクターの場合でも、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースの人工ｍｉＲＮＡ前駆体から発現させた人工ｍｉＲＮＡが、最も高い遺伝子ノックダウン効果を示すことが確認された。これらの結果から、発現ベクターの種類にかかわらず、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースの人工ｍｉＲＮＡ前駆体を用いることにより、人工ｍｉＲＮＡを高レベルで発現させることができ、高い遺伝子ノックダウン効果を得ることができることが示された。

＜５．ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースの人工ｍｉＲＮＡ前駆体から発現させた人工ｍｉＲＮＡの標的遺伝子ノックダウン効果（２）＞
ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７の骨格をベースとして、その二次構造を模倣した、ＥＧＦＰを標的とする人工ｍｉＲＮＡ前駆体を作製し、それを組み込んだＳｅＶベクターから発現されるＥＧＦＰ標的人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を評価した。人工ｍｉＲＮＡの配列として、ＥＧＦＰのｍＲＮＡ中の標的配列に対して完全に相補的な配列（ＮＣＢＩ：Ｐｒ００８８０８６６６）を用いた。ＥＧＦＰ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体のヌクレオチド配列を表５に、二次構造を図１８に示す。図中、ＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列を太字で示す。

表５．前駆体のヌクレオチド配列

上記（１－１）と同様の手順により、ＥＧＦＰ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体、選択マーカーであるハイグロマイシン耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子、人工遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）より入手）、および発現マーカーであるＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子（ｐｈｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ－Ｓ１プラスミド（Ｍｅｄｉｃａｌ＆ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｌａｔｒｉｅｓ）を鋳型としたＰＣＲにより調製）を組み込んだＳｅＶベクターを調製した。上記（１－２）と同様の手順によりＨＣＴ１１６細胞に発現ベクターを導入し、翌日から１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを培地に添加し、ＳｅＶベクターゲノムを安定に保持する細胞を選択した。得られた細胞に、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用いて導入した。翌日、フローサイトメトリーにより、ＥＧＦＰおよびＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎの蛍光強度を測定した。また、ＥＧＦＰ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体を組み込んだＳｅＶ発現ベクターに代えて、ＦＬｕｃ標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体を組み込んだＳｅＶ発現ベクターを用いた以外は同様にして蛍光強度を測定した（陰性対照）。陰性対照におけるＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ陽性細胞中のＥＧＦＰの蛍光強度を１．０として相対値を算出することにより、ＥＧＦＰ標的人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を評価した。なお、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ発現プラスミドは、ｐＯＬ１のＣＭＶプロモーターの下流にＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ遺伝子を組み込むことで作製した（Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ遺伝子、ｐＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型としたＰＣＲにより調製）。

結果を図１９に示す。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースの人工ｍｉＲＮＡ前駆体から発現させたＥＧＦＰ標的人工ｍｉＲＮＡは、ＥＧＦＰの蛍光強度を約７３％減少させ、高い遺伝子ノックダウン効果を示すことが確認された。

＜６．ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースの人工ｍｉＲＮＡ前駆体から発現させた人工ｍｉＲＮＡの標的遺伝子ノックダウン効果（３）＞
ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７の骨格をベースとして、その二次構造を模倣した、マウスｐ５３を標的とする人工ｍｉＲＮＡ前駆体を作製し、それを組み込んだＳｅＶベクターから発現されるマウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン効果を評価した。人工ｍｉＲＮＡの配列として、ＤｉｒａｃａｎｄＢｅｒｎａｒｄｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００３），Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．１４，ｐｐ．１１７３１－１１７３４）に記載された、マウスｐ５３のｍＲＮＡ中の標的配列に対して完全に相補的な配列を用いた。マウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体のヌクレオチド配列を表６に、二次構造を図２０に示す。図中、マウスｐ５３遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列を太字で示す。

表６．前駆体のヌクレオチド配列

上記（１－１）と同様の手順により、マウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体（１）、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子を組み込んだＳｅＶベクター：ＳｅＶ－ｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡを調製した。上記（１－２）と同様の手順によりＨＣＴ１１６細胞に発現ベクターを導入し、翌日から１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを培地に添加し、ＳｅＶベクターゲノムを安定に保持する細胞を選択した。得られた細胞に、上記（１－３）と同様の手順により、マウスｐ５３標的配列をＲＬｕｃ遺伝子の３’非翻訳領域に組み込んだレポータープラスミドを導入し、遺伝子ノックダウン効果を評価した。マウスｐ５３標的配列およびそれに対応するスクランブル配列を以下に示す。

表７．ｐ５３標的配列およびそれに対応するスクランブル配列

結果を図２１に示す。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースのマウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体から発現させたマウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡは、レポーターＲＬｕｃ活性を約９１％減少させ、高い標的遺伝子ノックダウン効果を示すことが確認された。

さらに、マウスｐ５３のｍＲＮＡ中の異なる部位を標的とする人工ｍｉＲＮＡ前駆体を作製した。マウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体（２）および（３）のヌクレオチド配列を表８に示す。

表８．前駆体のヌクレオチド配列

上記（１－１）と同様の手順により、各種マウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ブラストサイジン耐性遺伝子およびＥＧＦＰを組み込んだＳｅＶベクター：ＳｅＶ－ｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ（１）、ＳｅＶ－ｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ（２）およびＳｅＶ－ｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ（３）を調製した。上記（１－２）と同様の手順によりＨＣＴ１１６細胞に発現ベクターを導入し、翌日から１０μｇ／ｍｌブラストサイジンを培地に添加し、ＳｅＶベクターゲノムを安定に保持する細胞を選択した。得られた細胞に、上記（１－３）と同様の手順により、マウスｐ５３の全長オープンリーディングフレームをＲＬｕｃ遺伝子の３’非翻訳領域に組み込んだレポータープラスミドを導入し、遺伝子ノックダウン効果を評価した。

結果を図２４に示す。いずれのｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡもレポーターＲＬｕｃ活性を効率よく抑制した。このことから、ＳｅＶベクターから発現する人工ｍｉＲＮＡの効果は、特異的な標的配列のみに限定されるものではないことが確かめられた。

＜７．ＳｅＶ－ｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体を用いたｉＰＳ細胞の作製＞
ｉＰＳ細胞の作製のためには、一般的に、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２の３つのリプログラミング因子に加え、ｃ－ＭＹＣを導入する。しかし、ｃ－ＭＹＣはがん遺伝子であるため、腫瘍形成を促進するリスクがあることが問題となる。ここで、ｐ５３を標的とするｓｈＲＮＡを利用することによりｉＰＳ細胞誘導を促進できることが報告されているので（Ｎａｔｕｒｅ，（２００９），Ｖｏｌ．４６０，Ｎｏ．７２５９，ｐｐ．１１４０－１１４４）、ｃ－ＭＹＣ遺伝子に代えて、ＳｅＶベクターからｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡを発現させることにより、ｉＰＳ細胞の作製が可能かどうかを検証した。上記（１－１）と同様の手順により、マウスｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体、ＫＬＦ４遺伝子、ＯＣＴ４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子を組み込んだＳｅＶベクターを調製した。ＫＬＦ４遺伝子、ＯＣＴ４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子は人工遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）より入手した。ＳｅＶ－（ＫＯＳ）ベクターおよびＳｅＶ－（ｍｉｐ５３／ＫＯＳ）ベクターのゲノム構成を図２２に示す。

ＭＥＦに、ＳｅＶ－（ＫＯＳ）およびＳｅＶ－（ｍｉｐ５３／ＫＯＳ）をＭＯＩ＝５で導入した。翌日、ベクターが導入された細胞（１×１０^４個）を、マイトマイシンＣ処理されたＭＥＦ上に播種し、マウスＥＳ培地中で培養した。１４日後、多能性マーカーであるＳＳＥＡ１に対する抗体（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）により免疫染色した。なお、外来遺伝子を含まないＳｅＶベクター（ＳｅＶ－ｅｍｐｔｙ）を導入した細胞を陰性対照とした。

結果を図２３に示す。ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２の３つのリプログラミング因子に加え、ｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡを発現させることにより、ＳＳＥＡ１（＋）コロニーの形成が促進されることが示された。この結果から、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３６７ベースのｐ５３標的人工ｍｉＲＮＡ前駆体は、ｉＰＳ細胞の作製に有用であることが示された。

Claims

非天然マイクロＲＮＡ前駆体（ただし、ｍｉＲＮＡ－３６７を発現するものを除く）を含んでなる単離されたＲＮＡ分子もしくはその相補配列からなるＲＮＡ分子またはそれらをコードするＤＮＡ分子を細胞（ただし、ヒト生体内の細胞を除く）に導入するステップを含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
前記非天然マイクロＲＮＡ前駆体が、５’→３’方向に、
第１の末端オリゴヌクレオチド、
パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチド、
ＣＹＧ（配列番号２）からなる第１の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｙは、ＣまたはＵであり、
ＵＵＧＡＡＵＡＫＡＡＡＵ（配列番号３）またはその１個もしくは２個のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されたヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｋは、ＧまたはＵであり、
ＹＧＧ（配列番号４）からなる第３の中央オリゴヌクレオチド、ここで、Ｙは、ＣまたはＵであり、
ガイド鎖オリゴヌクレオチド、および
第２の末端オリゴヌクレオチド
を含み、
ここで、前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の標的配列に対して相補性を有する１７～２９ヌクレオチドからなり、
前記パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドが、前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドと同じ長さまたは前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドよりも１～３ヌクレオチド短い長さを有し、
前記第１の末端オリゴヌクレオチドは、ＡＧＧＣＣＲ（配列番号１）からなり、ここで、Ｒは、ＡまたはＧであり、
前記第２の末端オリゴヌクレオチドは、ＵＧＧＡＣＣＵ（配列番号８）からなり、
前記第１の末端オリゴヌクレオチドおよび前記第２の末端オリゴヌクレオチドが対合して第１の骨格ステム領域を形成し、
前記パッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドおよび前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドが対合して二本鎖マイクロＲＮＡ領域を形成し、
前記第１の中央オリゴヌクレオチドおよび前記第３の中央オリゴヌクレオチドが対合して第２の骨格ステム領域を形成し、
前記第１の骨格ステム領域、前記二本鎖マイクロＲＮＡ領域、および前記第２の骨格ステム領域が一緒にステム構造を形成し、
前記第２の中央オリゴヌクレオチドがループ構造を形成する、
方法。
前記二本鎖マイクロＲＮＡ領域がミスマッチまたはバルジを含む、請求項１に記載の方法。
前記第１の中央オリゴヌクレオチドと前記第２の中央オリゴヌクレオチドとの間、または前記第２の中央オリゴヌクレオチドと前記第３の中央オリゴヌクレオチドとの間に、１～１０ヌクレオチドからなるスペーサーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
前記単離されたＲＮＡ分子もしくはその相補配列からなるＲＮＡ分子またはそれらをコードするＤＮＡ分子が発現ベクターに組み込まれている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記発現ベクターがＲＮＡウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
前記発現ベクターが細胞質型ＲＮＡウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
前記発現ベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項６に記載の方法。