CN101155826B

CN101155826B - 作为疫苗的复制缺陷型rna病毒

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Publication number: CN101155826B
Application number: CN2006800090622A
Authority: CN
Inventors: W·J·纽伯特; S·博索; S·施勒希特
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2026-02-10
Also published as: CA2599036A1; US20180142256A1; CA2599036C; EP1851239B1; DE102005006388A1; PL1851239T3; EA015013B1; AU2006212385A1; DK1851239T3; PT1851239E; HK1118297A1; HRP20090230T1; JP2008529508A; BRPI0607487A2; WO2006084746A1; CN101155826A; EP1851239A1; KR101279636B1; KR20070110345A; ZA200707216B

Abstract

本发明涉及基因组复制缺陷的且有转录能力的负链RNA病毒，其可用于表达转基因和尤其用于疫苗开发领域。该病毒基因组在基因N、L或P中的至少一个之中含有突变。

Description

作为疫苗的复制缺陷型RNA病毒

描述

本发明涉及复制缺陷的且有转录能力的负链RNA病毒，其可用于表达转基因和尤其用于疫苗开发领域。

用活疫苗进行免疫可模拟天然的感染并产生全面的免疫应答。在疫苗接种中使用减毒的但能够增殖的病毒。疫苗病毒的增殖必须缓慢进行以便免疫应答以及因此对病毒的增殖和/或清除的控制得到保证。活疫苗构思已多次在各个不同年龄组中得到证明。然而，存在重要的目标群体，对于这些群体，用活疫苗进行免疫是有问题的并且需要额外的安全措施：母体抗体在生命的最初几个月内保护婴儿。同时，它们是在活免疫接种中必须克服的屏障，尽管另一方面不会出现疫苗病毒的过度增殖和与之相关的疫苗接种性损害。另一个目标群体是老年人，他们的免疫系统不再那么有效，从而可能会出现通过疫苗接种而产生过载，和通过疫苗病毒增殖增加而出现疫苗接种性损害。因此，存在这样的问题：使免疫学上优异的活疫苗接种在特定目标群体中的应用更安全，以及增加总体应用的安全特性。

若干年以来，已经可以通过反向基因技术来有目的地改变负链RNA病毒，例如狂犬病毒或仙台病毒(SeV)。EP-A-0702085描述了从克隆的cDNA产生重组的、传染性的、复制性的、不分节段的负链RNA病毒。EP-A-0863202描述了一种重组仙台病毒，在所述仙台病毒的基因组中插入了一个异源基因或者删除或失活一个基因，但是它的基因组复制依然是完整的。

负链RNA病毒特别适合作为疫苗的骨架，因为它们在细胞质中的增殖在RNA水平上发生并且病毒基因组内的基因可以简单地交换。因此，已经成功地产生了具有多种病毒类型的表面蛋白的重组病毒并且在动物试验中用作疫苗(Schmidt等人，J.Virol.75(2001)，4594-4603和WO01/42445)。通过将人副流感病毒3型(hPIV3)的F-和HN-蛋白以及呼吸道合胞病毒(RSV)的G-或F-蛋白重组插入至基于牛副流感病毒3型(bPIV3)的载体中，可以在仓鼠中施用后检测到针对hPIV3和RSV的粘膜免疫应答。因此，已经实现了这种在动物试验中测试的活疫苗的二价抗原性。

由于涉及物种屏障，这种具有人PIV3-和RSV-表面抗原的牛副流感病毒对于在人中使用应当已经经充分减毒。回复为野生型是不可能的，因为全部基因换成了病毒表面蛋白。所述疫苗的临床试验已经开始。

然而，由于所述的病毒突变体是能复制的，所以在免疫接种者中无疑将会发生病毒增殖，增殖的强度虽然可通过修饰病毒而削弱，但不能够完全消除。因此，预期的病毒血症的强度和因此免疫接种者遭受副作用取决于个体因素。

在本发明范围内，将试图显著降低活疫苗接种的风险，特别是来自特定目标组的疫苗接种者的风险。

为此，一种方法是在施用疫苗后抑制病毒基因组复制。由此，不依赖于疫苗接种者的免疫效率，病毒的增殖和相应的疫苗接种性损害将不会发生。

这种方法的一个主要困难是病毒RNA聚合酶行使两种功能：病毒mRNA的合成和病毒基因组的增殖。在新疫苗中必须放弃这种偶联，因为疫苗现在必须只能够合成病毒mRNA。

另一个问题是，为了完全适合作为活疫苗，重组病毒必须导致有效的病毒mRNA合成。因此，存在两个根本上矛盾的需求，这意味着在制备安全但有效的基于负链RNA病毒的活疫苗中预期会有相当大的困难。

Shoji等人(Virology318(2004)，295-305)描述了P基因缺陷型狂犬病毒的制备和表征。该病毒借助于表达P-蛋白的辅助细胞来产生。不从头合成P-蛋白，该病毒只能够初级转录。轻微的病毒基因表达在免疫荧光中表现出非常弱的关于N-蛋白的信号并且仅在非常少的细胞中显示，并且这种轻微的病毒基因表达的更令人信服的证明将只能通过PCR分析来提供。在小鼠模型中的攻击试验中使用这种病毒突变体将显示出保护作用，但是使用转录失活的病毒的对照试验确不是这样，并且所考虑的病毒攻击的时间间隔太短。推测的保护作用的持续时间未经研究。因此，将这种病毒突变体用于开发减毒的狂犬病疫苗看上去不是非常有希望的。

在导致本发明的研究的范围内发现，在副粘病毒中，复制和转录功能的分离可以通过部分除去对于基因组复制功能来说不可缺少的聚合酶的成分而实现。在此，该成分可以是病毒蛋白N、P和L之一，或者是此类蛋白质的特定功能结构域。

令人惊讶地发现，通过其中由病毒基因N、L和/或P编码的蛋白质的功能不是完全而是部分除去的突变，可以产生复制缺陷型RNA病毒，所述病毒拥有足够的转录功能从而适合用于制备活疫苗。

因此，本发明的一个目标是重组负链RNA病毒，其为复制缺陷的且具有转录能力。根据本发明的病毒包含在基因N、L和P中的至少一个之中具有突变的病毒基因组，其中所述突变导致基因组复制的丧失而不丧失次级转录能力。

根据本发明的病毒是制备活疫苗，特别是制备具有增加的安全特性的活疫苗的先决条件，所述活疫苗特别适合用于具有弱的或受损的免疫系统的危险患者(Risikopatient)。

本发明还涉及重组病毒的核衣壳，其包含与蛋白N、L和P相复合的病毒的负链RNA，以及分离形式的重组病毒的负链RNA。

本发明的进一步目标是cDNA，其编码根据本发明的负链RNA，特别是病毒RNA和/或与其互补的RNA。

本发明的更进一步目标是用于根据本发明的重组负链RNA病毒的增殖的细胞系。

根据本发明的重组负链RNA病毒可以通过在基因N、L和P中的至少一个之中突变起始病毒而获得。起始病毒可以是天然的负链RNA病毒，特别是来自副粘病毒科(Paramyxoviridae)或弹状病毒科(Rhabdoviridae)的负链RNA病毒，或者其重组变体。特别优选的代表是副粘病毒(例如仙台病毒)、人或牛副流感病毒(例如人副流感病毒(hPIV)1、2、3、4 a或4b型)、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒或人呼吸道合胞病毒(hRSV)，或者弹状病毒(例如水泡性口膜炎病毒(VSV))。特别优选地，该病毒是仙台病毒，例如Fushimi株系的仙台病毒(ATCC VR105)。此外，本发明还包括上述病毒的重组变体，如它们例如在EP-A-702085、EP-A-0863202或WO01/42445中进行了描述。

其他优选的负链RNA病毒是弹状病毒科、线病毒科(Filoviridae)、波纳病毒科(Bornaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)或布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的代表，例如VSV。

与其他副粘病毒类似，仙台病毒是具有螺旋核衣壳的有包膜病毒(图1)。包膜由脂质膜组成，其源自从中释放病毒的宿主细胞的质膜。跨膜糖蛋白，即融合蛋白(F)和血细胞凝集素-神经氨酸酶(HN)，锚定在病毒包膜内。基质蛋白(M)衬在膜内部。包含于包膜内的核衣壳由与核蛋白(N)复合的单链RNA(其中，RNA的每6个核苷酸结合一个N蛋白)、RNA依赖性RNA聚合酶(L)和辅因子磷蛋白(P)组成。

仙台病毒的负链RNA基因组包含顺序如下的6个结构蛋白的基因：3′-N-P/C-M-F-HN-L-5′(图2)。P/C基因编码总共8个蛋白质，即结构磷蛋白和所有迄今为止已知的非结构蛋白。

蛋白P、N和L对于功能性的转录和复制是重要的(Lamb等人，Paramyxoviridae：The Viruses and their Replication.FieldsVirology，第四版(2001)，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，1305-1340)。

根据本发明的重组负链RNA病毒在基因N、L和P中的至少一个之中含有突变。所述突变可以是在基因N、L或P之一中的缺失、置换和/或插入，这导致该病毒的复制缺陷，但不会破坏转录能力。突变优选涉及由基因N、L和/或P编码的蛋白质的部分序列，所述部分序列是复制所必需的，而转录所必需的其他部分序列仍保持功能。

在本发明一个优选实施方案中，重组病毒在基因P中，更确切地说在基因P的N-端的部分序列中具有突变。所述突变优选至少涉及蛋白P的氨基酸33-41的区域，该区域对复制能力而言是重要的。此外优选的是，C-端区域(从氨基酸320开始)没有任何损害转录功能的突变。特别优选地，所述突变是在氨基酸2-77区域中的导致复制能力丧失的突变，例如删除(a)由基因P编码的蛋白质的氨基酸2-77，或(b)对于复制能力丧失来说足够的(a)的部分序列。相应的突变还可以在其他负链RNA病毒例如其他副粘病毒(如hPIV3)的P蛋白中发生。

根据本发明的重组病毒是复制缺陷型的且具有转录能力。复制能力的丧失意味着在靶细胞(不反向产生经突变而消除的任何功能的细胞)中没有发现可检测的病毒基因组增殖，其中与减少的或条件性的复制缺陷不同，也不存在许可性条件，在该条件下可能发生复制。复制能力的丧失可以如实施例8中描述的进行测定。然而，根据本发明的病毒能够在感染靶细胞后转录由其编码的基因产物，以便可以在靶细胞中进行病毒蛋白质(包括一种或多种异源基因产物)的表达。重要的是，根据本发明的重组病毒拥有次级转录(sekund

reTranskription)能力，即通过使用最初包含于核衣壳中的蛋白质成分进行初级转录(prim

re Transkription)而产生的病毒基因产物能够引起和/或支持它们自身的次级转录。在此，次级转录的程度导致相对于相应的野生型病毒(即在基因N、L和P中的至少一个之中没有突变的病毒)而言优选至少1％、至少2％、至少3％、至少4％或至少5％的蛋白质合成。次级转录能力可以相对于相应的野生型病毒而言降低，但优选至多降低20倍，特别优选至多降低10倍。次级转录能力可以如实施例7.1和/或7.3中通过定量测定异源基因产物(例如报告蛋白)的表达来测定。

除了所述突变，根据本发明的重组病毒优选包含至少一个转基因，即至少一种编码异源基因产物的序列。异源基因产物可以是蛋白质，例如报告蛋白，例如荧光蛋白如GFP或其衍生物，或者是将要产生针对其的免疫应答的抗原，或者是治疗性蛋白质，例如用于病毒治疗的蛋白质，或者还有功能性RNA分子，例如反义RNA、核酶或能够胜任RNA干扰的siRNA分子。优选地，异源基因产物是源自病原体例如病毒、细菌、真菌或原生动物的抗原，肿瘤抗原，或自身抗原。特别优选地，所述抗原是源自异源负链RNA病毒(例如人副流感病毒或RSV)的病毒抗原，例如hPIV3 F和HN或hRSV F和G。根据本发明的病毒可以包含一种或多种，例如两种或三种，编码异源基因产物的序列。

编码异源基因产物的序列可以插入至重组病毒的基因组中。在另一方面，编码同源基因产物的序列，例如基因F和/或HN，也可以由编码异源基因产物例如嵌合基因产物的序列取代。插入和取代的转基因的组合也是可能的。

因此，例如，仙台病毒的序列可以用其他负链RNA病毒的异源序列，例如用副流感病毒如hPIV3的序列和/或用RSV的序列全部或部分取代。特别优选地使用嵌合序列，即由基础病毒基因组的片段和异源病毒基因组的片段组成的序列。例如，嵌合基因F和/或HN可以插入至病毒基因组中，所述嵌合基因由基础病毒基因组(例如仙台病毒)的序列和异源序列(例如来自人副流感病毒如hPIV3和/或RSV)组成。

重组病毒可以包含一个或多个不同的转基因。如果存在多个转基因，那么这些转基因可以来自相同或不同的来源，其可源自例如单种或数种不同的病原体，例如病毒。因此，可以存在来自数种例如2或3种不同的病原体，优选病毒，特别优选负链RNA病毒的转基因。

将转基因整合入副粘病毒中例如在下列文献中进行了描述：Hasan等人(J.Gen.Virol.78(1997)，2813-2820)、Bukreyev等人(J.Virol.70(1996)，6634-6641)、Yu等人(Genes Cells 2(1997)，457-466)、Masaki等人(FASEBVB J.15(2001)，1294-1296)、Shiotani等人(Gene Therapy 8(2001)，1043-1050)和Bitzer等人(Mol.Therapy 7(2003)，210-217)。优选将转基因插入至病毒基因组的3′区域。插入例如以转录盒的形式实现，其中在载体水平上(即，在编码负链RNA的载体例如质粒载体的水平上)，在前导区后紧接着引入一个或多个转录盒，所述转录盒具有单一用于整合各个阅读框架的限制性酶切位点。几个转基因的整合优选在各自独立的转录盒中实现。转录盒优选包含与转录起始序列和转录终止序列以及优选地翻译信号有效连接的编码异源基因产物的序列。

本发明另外一个目标的是单链或双链DNA分子，例如cDNA分子，其编码根据本发明的重组负链RNA病毒基因组或其前体或者病毒反基因组或其前体。在本文中，术语“前体”表示，DNA分子尚未含有编码异源基因产物的序列，而是只包含用于引入这样的序列的克隆位点。克隆位点可以是限制性酶切位点，例如DNA中的单一或非单一的限制性酶切位点，或者是包含多个连续的限制性酶切位点的多克隆位点，优选单一的限制性酶切位点。编码病毒基因组和/或互补序列的DNA分子优选与合适的表达控制序列有效连接。

所述DNA分子优选为载体，例如质粒载体，所述载体适合在合适的宿主细胞中，即在载体或质粒扩增性细胞中，优选在原核细胞中，还有在真核细胞特别是哺乳动物细胞中增殖，并且具有用于对此必需的遗传元件，例如复制起点、整合序列和/或选择标记序列。

所述DNA分子包含编码重组病毒或互补序列的序列，优选在转录信号的控制下，以便在适合于病毒初始产生的宿主细胞中，即在病毒生产性细胞(Virus-Herstellungszelle)中用DNA依赖性RNA聚合酶进行转录的过程中，可以形成病毒负链RNA。如此选择转录信号以使DNA在各自使用的宿主细胞中能够有效转录。对此还可以使用对于各细胞来说异源的转录信号，例如噬菌体启动子(如T7或SP6启动子)，其中病毒生产性细胞那么还必须包含引起转录的相应的异源DNA依赖性RNA聚合酶，例如T7-或SP6-RNA聚合酶。除了转录信号，所述DNA分子优选在编码重组病毒的序列的3′末端进一步包含转录终止子和核酶序列，所述的核酶使得转录产物能够在病毒序列的末端裂解。所述病毒生产性细胞优选为真核细胞，特别是哺乳动物细胞。

除了编码复制缺陷型副粘病毒的DNA之外，根据本发明的病毒生产性细胞此外还包含辅助序列，所述辅助序列的基因产物反过来使得根据本发明的重组病毒RNA的装配能够进行。为此，所述细胞可以例如另外还包含一种或多种载体，所述载体反向(in trans)提供N-蛋白、P-蛋白和/或L-蛋白。这使得根据本发明的重组病毒的核衣壳能够在生产性细胞(Herstellungszelle)中进行装配。

最初在病毒生产性细胞中装配的重组病毒的增殖在用根据本发明的病毒感染的病毒增殖性细胞(Virus-Vermehrungszelle)中发生。另外，病毒增殖性细胞还包含如上提及的辅助序列，用于反向提供N-蛋白、P-蛋白和/或L-蛋白。优选使用其中例如通过基因组整合来稳定表达辅助序列的病毒增殖性细胞。病毒增殖性细胞优选为哺乳动物细胞。特别优选的增殖性细胞是源自293细胞(人胚胎肾成纤维细胞系)的细胞H29或源于它的细胞。细胞H29依照布达佩斯条约的规定于2004年11月05日保藏于德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Mascheroder Weg)(DSM ACC2702)。已经用相应的辅助序列(例如SeV N和P基因)稳定转染的来源于Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)或LLCMK2细胞(来自猕猴的肾细胞系)的细胞也是合适的。

因此，本发明进一步目标是细胞，优选真核细胞，特别优选哺乳动物细胞，所述细胞包含(i)编码根据本发明的重组病毒的基因组和/或其互补序列或其前体的DNA分子，和/或(ii)根据本发明的病毒的RNA基因组。所述细胞可以是如先前说明的载体扩增性细胞(Vektor-Vermehrungszelle)、病毒生产性细胞或病毒增殖性细胞。

如果细胞是载体扩增性细胞，例如质粒扩增性细胞，那么可以使用适合于扩增相应的载体的任何细胞，例如还可以使用原核细胞如经转化的大肠杆菌细胞。

如果细胞是病毒生产性或增殖性细胞，那么其含有用于反向产生病毒蛋白N、P和/或L的辅助序列。导入病毒生产性细胞中的DNA优选位于异源转录信号的控制下，其中所述细胞有利地进一步包含编码异源的DNA依赖性RNA聚合酶的DNA，所述DNA依赖性RNA聚合酶识别所述异源转录信号并引起编码重组负链RNA病毒的DNA的转录。

如果细胞是病毒增殖性细胞，那么其感染有例如核衣壳形式的基因组病毒RNA分子，并包含可稳定表达形式的辅助序列。

本发明的更进一步的目标为产生根据本发明的重组负链RNA病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备用编码负链RNA病毒基因组的DNA分子转染的病毒生产性细胞，所述负链RNA病毒基因组在基因N、L和P中的至少一个之中具有突变和可选地包含至少一种编码异源基因产物的序列，所述突变导致基因组复制能力的丧失而不丧失转录能力，和(b)在根据(a)的DNA分子的转录得以发生并初始形成所述重组负链RNA病毒的条件下培养所述宿主细胞。所述宿主细胞优选能够例如通过用相应的辅助质粒转染来反向提供N-蛋白、P-蛋白和/或L-蛋白，所述辅助质粒包含编码蛋白N、P和/或L的序列。

为了产生大量的核衣壳或病毒颗粒，优选使用组成型或诱导型地稳定表达负链RNA病毒的蛋白N、L和/或P，优选至少蛋白P的细胞。因而，本发明还涉及使根据本发明的重组负链RNA病毒增殖的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备用负链RNA病毒的基因组感染的病毒增殖性细胞，所述负链RNA病毒在基因N、L和P中的至少一个之中具有突变和可选地包含至少一种编码异源基因产物的序列，所述突变导致基因组复制能力的丧失而不丧失转录能力，和(b)在病毒增殖得以发生的条件下培养所述宿主细胞。

本发明的进一步目标为药物组合物，其包含重组的复制缺陷型且有转录能力的负链RNA病毒(如先前说明的)或者其核衣壳作为活性物质，以及可选地包含药学上常用的载体和/或助剂。该药物组合物适合应用于人和兽医学。它可以特别用作疫苗或用于抗肿瘤疗法，特别是应用于危险患者，例如儿童、老年人和/或具有受损的或弱的免疫系统的人。在此，所述药物组合物可以含有在其天然病毒包膜内的负链RNA病毒。

作为疫苗应用是特别优选的，例如作为抗病原体如病毒、细菌或原生动物的疫苗。当重组病毒包含一个转基因或相同起源(例如来自单个病原体)的多个转基因时，它是单价疫苗。当重组病毒包含不同起源的转基因时，它还可以用作多价疫苗，例如用作二价或三价疫苗。例如，可以产生针对多种致病病毒，例如针对多种致病性负链RNA病毒如人副流感病毒和RSV的多价疫苗。

根据本发明的疫苗能够引发体液免疫应答(优选形成中和抗体)和/或T-细胞免疫应答。特别优选的是引发体液免疫应答和T-细胞免疫应答。

药物组合物可以是溶液、悬浮液、冻干物形式或者任何其他合适的形式。除了活性物质，所述组合物还可包含用于调节pH值的试剂、缓冲剂、用于调节张力的试剂、湿润剂等，以及佐剂。其可以以气雾剂、流体、粉末等形式通过常规途径，例如口服、局部、鼻、肺等途径施用。在此，将治疗有效量的病毒施用给患者，其中该剂量取决于各自的应用(例如病毒治疗或疫苗)，取决于疾病类型、患者的健康状态和体重、施用方式以及制剂等。通常每次应用施用10³-10⁷个病毒颗粒，特别优选约10⁴-10⁶个病毒颗粒。任选地，多种不同的病毒颗粒可以一起施用，例如在联合疫苗接种的情况下。如果需要，施用可以是单次或多次。

优选的应用范围是例如呼吸道病毒性疾病的预防或治疗。

本发明将用下面的附图和实施例来进一步说明。

实施例

1.概要

图1显示了根据Fields(Virology.Lippincott，Williams和Wilkins(2001)，第四版；修订版)的仙台病毒(SeV)的形态学。基因组由具有以核衣壳形式的蛋白N、P和L的单链RNA组成。核衣壳由包膜包裹，在该包膜中贮藏有蛋白HN和F(各由一个F₁和F₂亚基组成)。蛋白M与膜的内部结合，并且同时还与核衣壳成分相结合。

野生型仙台病毒的单链负方向的RNA基因组由15384个核苷酸组成。6个结构蛋白的基因以3′-N-P/C-M-F-HN-L-5′的顺序位于其上(图2)。在这些基因之间，存在50-80个核苷酸的过渡区，每个过渡区包含22个核苷酸的高度保守区：前面的基因的终止信号、基因间的序列和下一个基因的起始信号。由起始信号、开放阅读框架(ORF)、任选地非翻译区和终止信号组成的单元称为转录盒。在N基因之前，存在55个核苷酸长的前导序列(ld)，所述引导序列能被转录，但不能被翻译。L基因之后是54个核苷酸长的尾随序列(tr)。ld和tr区域用作用于复制基因组或反基因组的基因组和反基因组启动子。除P/C-RNA以外，通过转录形成的mRNA分子是单顺反子。

仙台病毒的增殖周期包括：进入宿主细胞，转录和翻译，以及复制和病毒成熟，之后释放新产生的病毒。特别地，蛋白N、P和L参与转录过程，其中L是具有全部催化活性的病毒RNA依赖性RNA聚合酶。由于仙台病毒的基因组是负链取向的，因而病毒RNA不能直接转化成蛋白质。首先，通过与核衣壳相结合地一起进入细胞中的RNA聚合酶来初级转录成mRNA。

图3是仙台病毒的转录模式示意图。在此，聚合酶复合物(由L蛋白以及P蛋白的同型四聚体组成)沿着用N蛋白包装的RNA移向5′末端。由此读出基因组负链RNA上的遗传信息并转录成正链mRNA。

基因组的复制包括具有负极性(negative Polarit

t)的新病毒基因组的产生。为此，首先形成反基因组，其随后用作用于形成基因组的模版(Matrizen)。由于转录在基因组的3′末端(ld)开始，所以需要从转录模式转变成复制模式。该转变通过细胞中游离的N蛋白的量来测定。只有当在mRNA分子翻译后已经形成了足够的N蛋白时，才能进行复制。由于存在在其全长上与N蛋白复合的反基因组，因而该反基因组可用作用于生产其他基因组的模版。这些基因组也直接用N蛋白包装。蛋白N、P和L反过来又负责复制过程(图4)。

在病毒复制过程中，通过mRNA分子数量增加，病毒蛋白质的合成也增加了。然后，将病毒RNA和病毒蛋白质的复合物(核衣壳)以分泌小泡的形式运送至细胞膜，在这里发生用病毒表面蛋白的包裹和病毒颗粒的出芽。

在本发明范围内，制备了重组病毒突变体，在所述突变体中转录和复制功能相分离，即该病毒是能转录的，但是却是复制缺陷的。为了产生病毒颗粒或它们的核衣壳，丧失的基因组复制功能必须通过辅助细胞来补偿，所述的辅助细胞反向补充丧失的或功能缺陷的病毒蛋白质。优选的此类辅助细胞是细胞系H29(Willenbrink和Neubert，J.Virol.68(1994)，8413-8417)。在本申请范围内，该细胞系依照布达佩斯条约的规定于2004年11月05日保藏于登记号DSMACC2702下。为了产生复制缺陷的但有转录能力的病毒，没有完全去除编码P蛋白的基因，而只去除了基因组复制所需的结构域。因而，从早期研究(Curran，Virology 221(1996)，130-140；Curran等人，J.Virol.69(1995)，849-855)中已经知道：在体外系统中，在删除蛋白P的氨基酸2-77时，基因组复制受到抑制，而病毒转录仍然保持活跃。

图5是P蛋白的示意图，所述P蛋白具有N-末端和C-末端结构域(PNT、PCT)、四聚体化结构域(氨基酸320-446)、P:L结构域(氨基酸411-445)和P:RNP结合结构域(氨基酸479-568)。为了关闭病毒基因组复制功能而同时保留病毒mRNA合成的能力，选择删除蛋白P的前77个氨基酸。在此，首先产生相应的仙台病毒突变体(SeV-PΔ2-77)，其中删除了P-ORF的5′-末端区域。这些病毒只编码在N-末端缩短的P蛋白。感染研究显示，该病毒突变体不能在细胞培养中增殖。利用尤其提供所需要的野生型P蛋白的辅助细胞系H29(DSM ACC2702)，可以实现所述病毒突变体的增殖。与野生型仙台病毒相比较，病毒增殖的效率是大约45％。

在感染后，根据本发明的病毒突变体能够在受感染细胞中表达病毒编码的转基因。由病毒突变体提供的缩短的蛋白P对次级病毒mRNA的合成给予充分的支持。病毒编码的蛋白质的合成在感染细胞中持续几天并且相对于野生型病毒只减少大约10倍，从而使用该突变体作为疫苗时能可靠地期望产生足够的免疫应答。

2.复制缺陷型仙台病毒载体(SeVV)的基础构建体的制备

2.1 cDNA构建体pSeV-X的制备

将一个编码性的转录盒插入至SeV Fushimi株(ATCC VR105)的3′区域中。在对基因组的所有操作中，无论如何必须注意，重组SeV基因组的核苷酸总数是可以被6除尽的(“6位规则”)。

从用作模版的cDNA pSeV开始，制备两个PCR片段PCR X I和PCRX II以用来产生pSeV-X(图6)。

PCR X I(370bp)由下列部分组成：T7启动子(T7-Prom.)序列、前导序列(1d)、具有一直到N-ORF(开放阅读框架)的起始密码子之前的5′-NTR的N-基因起始点。通过反向引物X I(+)(表3)，单个NotI限制性酶切位点和N-基因终止序列的24个核苷酸得以连接。PCR X I的N-基因终止序列的24个核苷酸(通过诱变引物X I(+)插入)在随后的融合步骤中用作与PCR X II交叠的区域。

PCR X II(970bp)由N-基因起始点和最先的第三个N-ORF组成。通过正向引物X II，3′-NTR N的序列和N的基因终止序列，以及基因间区域(IR)得以连接。反向引物X II(+)紧接在SeV基因组中的单个SphI切割位点之后在最先的第三个N-ORF中结合。扩增子PCR X I在3′区域与PCR X II的5′区域互补。通过该交叠区，这两个PCR片段X I和X II可以融合。在完成PCR之后，融合产物(1310bp)可以通过用酶MluI和SphI进行限制性酶切而插入至同样经MluI和SphI处理的载体pSeV中。从获得的克隆中通过质粒制备而分离质粒-DNA，并通过限制性酶切分析和测序来检验转录盒的正确插入。从而可以获得cDNA构建体pSeV-X。

现在将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的基因插入pSeV-X的空盒中，以便可以容易地监控重组病毒的产生。通过PCR从表达质粒pEGFP-N1(Clontech公司)扩增出eGFP-ORF，其中通过诱变引物来保持“6位规则”并完成与两个侧翼的NotI切割位点的连接。将得到的771-bp大小的PCR片段用限制性内切酶NotI切割并将738-bp大小的片段通过凝胶洗脱而分离，所述738-bp大小的片段通过pSeV-X的NotI切割位点而插入其“空的”转录盒pSeV-X中。在转化大肠杆菌、质粒制备和随后对通过PCR而插入的eGFP阅读框架进行测序之后，获得了cDNA构建体pSeV-eGFP。

2.2 cDNA构建体pSeV-X-X的制备

通过构建体pSeV-X-X，可以获得两个另外的转录盒，在所述转录盒中可以整合进两个转基因。将pSeV-X-X用作基础载体(Basisvektor)以用于产生复制缺陷型载体，将会使得载体能够具有多价(例如三价)特性。

pSeV-X-X通过PCR反应制备，在该反应中将pSeV-X用作模板(图7)。将正向引物XX在NotI切割位点区域中与pSeV-X杂交，并与待整合的第二个转录盒的3′-NTR杂交。单个SgrAI限制性酶切位点借助于XX-正向引物在NotI切割位点和3′-NTR之间插入。该限制性酶切位点用作单个限制性酶切位点以用于随后插入转基因的ORF。在PCR产物XX中随后是基因终止点、基因间区域(IR)、基因起始点和5′-NTR。通过与5′-NTR杂交的引物XX(+)而插入单个限制性酶切位点FseI和NruI。该FseI切割位点用于整合另一个转基因的ORF。有预见地克隆入了单个NruI切割位点，以便能够在需要时整合第三个转录盒。引物XX(+)在3′区域与pSeV-X的NotI切割位点的序列杂交。将PCR产物XX(220bp)用限制性内切酶NotI处理，并且通过凝胶提取来分离144bp的片段。然后可以将该片段(被设计成保持“6位规则”)整合进同样经NotI处理的质粒pSeV-X中。在检验NotI PCR片段XX的正确方向并确证该序列后，就提供了质粒pSeV-X-X。可将任意的转基因整合入单一位点SgrAI和FseI中。

为了在该工作中的研究，给pSeV-X-X的两个转录盒(X)装配两种不同的荧光蛋白的阅读框架。在一个方面，将来自表达质粒pEGFP-N1的荧光蛋白eGFP的阅读框架在遵守“6位规则”的条件下通过PCR反应进行扩增，其中借助于诱变引物连接两个侧翼的SgtAI切割位点。在用SgrAI进行限制性酶切和凝胶洗脱后，可以将约738-bp大小的片段整合入pSeV-X-X的第一个转录盒中(pSeV-eGFP-X)。在另一方面，以同样的方式，在保持“6位规则”的条件下通过PCR反应并采用FseI的限制性酶切位点来装配荧光蛋白DsRed的ORF(来自质粒“pDsRed”，Clontech公司)，对DNA进行酶切、凝胶洗脱，并随后将该片段(702bp)在pSeV-eGFP-X的3′区域处克隆进第二个转录盒中。所得物是基因组SeV cDNA构建体pSeV-eGFP-DsRed。

3.复制缺陷型仙台病毒载体(SeVV)的制备

制备编码复制缺陷型仙台病毒的eDNA构建体pSeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL，在它们之中各自删除了蛋白N、P和L的基因。为此，必须在保持6位规则的情况下各自删除基因N、P或L的阅读框架，其中非编码性转录盒应当保留在相应的位置(图8A)。

在各个cDNA构建体pSeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL中，通过整合限制性酶切位点以代替被删除的ORF，使得对于随后的应用可以提供另外的功能性转录盒，在所述另外的功能性转录盒中在需要时可插入其他的转基因。

作为复制缺陷型SeVV的另一种变体，制备了缺失型突变体pSeVV-eGFP-PΔ2-77，其编码缺少氨基酸2-77的在N-末端缩短的P蛋白(图8B)。

克隆pSeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL都根据相同的原理实施。例如，pSeVV-eGFP-ΔP的克隆将在下一章节中详细描述。然后，仅将pSeVV-eGFP-ΔN和-ΔL的克隆的差异概括在表中。

3.1 cDNA构建体pSeVV-eGFP-ΔP和pSeVV-eGFP-PΔ2-77的克隆

将P蛋白的ORF从能进行复制的病毒pSeV-eGFP的cDNA构建体中除去，以产生编码复制缺陷型载体的新的cDNA pSeVV-eGFP-ΔP。用XhoI限制性酶切位点代替P-ORF。

为了克隆pSeVV-eGFP-ΔP，产生称为PCR ΔPI和PCR ΔPII的两个PCR片段，并随后将其融合。将pSeV-eGFP用作两种PCR反应的模板。在片段PCR ΔPI(1272bp)的情况下，通过正向引物ΔPI(＝N-578；表3)，在单一的SphI位点之前在N ORF区域中进行与模板的杂交。反向引物ΔPI(+)在直至P的ATG密码子之前的P-基因的5′-NTR区域中与模板杂交，并在那里插入限制性酶切位点XhoI。

片段PCR ΔPII由1938bp组成，在这里pSeV也用作模板。正向引物ΔPII与5′-NTR P序列的部分杂交并连接XhoI切割位点。PCRΔPII(+)的反向引物在单一Eco47III位点之后在F基因的ORF中结合，并另外具有人工MluI位点。

这两个PCR片段ΔPI和ΔPII通过XhoI位点相组合。将融合产物(由N ORF的部分序列、具有插入的XhoI限制性酶切位点的非编码性P-转录盒、M以及四分之一的F ORF组成)用限制性内切酶SphI和MiuI进行酶切、相互克隆(zwischenklonieren)和序列验证。从具有正确序列的亚克隆中切割出大小为3006bp的SphI-Eco47III片段，并连接至经同样处理的载体pSeV-eGFP中。在序列检验后，相应的pSeVV-eGFP-ΔP克隆(基因组病毒cDNA)现在准备用于制备复制缺陷型SeVV-eGFP-ΔP(图9)。

将使用两种诱变引物的PCR用于构建缺失型突变体pSeVV-eGFP-PΔ2-77。正向引物“XhoIPΔ2-77”含有一个XhoI位点，之后是ATG起始密码子以及P蛋白的氨基酸78-86的密码子。反向引物“PΔ2-77(+)XhoI”包含P蛋白的最后10个密码子和一个XhoI位点。在N-端缩短了76个氨基酸的P蛋白的阅读框架在保持6位规则的情况下从模板pSeV开始通过PCR产生。将经XhoI酶切的1488bp大小的片段通过两个克隆步骤在初始P-ORF的位置处插入至pSeVV-eGFP-ΔP的非编码性转录盒中。序列验证后，现在还提供了基因组cDNA克隆以用于制备复制缺陷型SeVV-eGFP-PΔ2-77。

P ORF中密码子2-77的缺失具有这样的结果：在非结构蛋白的情况下，V和W蛋白质也在N-末端缩短并且，在C-家族中只有C′(同样也截短了)仍得以编码；因为起始密码子缺失，蛋白C、Y1和Y2不再能通过缩短的mRNA翻译。

3.2 eDNA构建体pSeVV-eGFP-ΔN和-ΔL的克隆

pSeVV-eGFP-ΔN和pSeVV-eGFP-ΔL的制备通过与克隆pSeVV-eGFP-ΔP类似的策略完成。为了概括该克隆步骤，将所有决定性参数在表1中给出。

通过各自制备两种可融合的PCR产物PCR I和PCR II，将基因N或L的ORF从pSeV-eGFP中除去(注意6位规则)，并在pSeVV-eGFP-ΔN以及SeVV-eGFP-ΔL中均插入单一ApaI限制性酶切位点以替代之。用于克隆pSeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL的引物的序列在所使用的DNA寡核苷酸的列表中列出(表3)。将制得的PCR产物PCR I和PCR II融合，并借助于PCR I的正向引物以及PCR II的反向引物进行扩增。随后，将融合PCR产物用限制性内切酶进行切割，所述限制性内切酶单独存在于pSeV-eGFP中并使相应的融合产物插入pSeV-eGFP中(例如：在克隆pSeVV-eGFP-ΔN时的NarI，见表1)。纯化的酶切产物通过连接而插入至同样用相应的酶消化的载体pSeV-eGFP中。

表1.关于在克隆pSeVV-eGFP-ΔX时使用的

引物和限制性酶切位点的概括

	pSeVV-eGFP-ΔN	pSeVV-eGFP-ΔP	pSeVV-eGFP-ΔL
				引物对PCR I	ΔN I，ΔN I(+)	ΔP I，ΔP I(+)	ΔL I，ΔL I(+)
引物对PCR II	ΔN II，ΔN II(+)	ΔP II，ΔP II(+)	ΔL II，ΔL II(+)
				转录盒的RSS^§	ApaI	XhoI	ApaI
克隆的RSS^§	NarI	SphI+Eco47III	Eco47III+AscI

§RSS＝限制性酶切位点

用一部分所述连接制备物转化大肠杆菌细胞，并且将获得的克隆的质粒DNA通过质粒小量制备(plasmid mini-preparation)进行分离。在通过限制性分析和测序来检验正确序列后，从每一个阳性克隆中制备质粒制备物(DNA Maxi Prep-Kit，Qiagen)，并因而提供了多种pSeVV-eGFP-ΔX用于产生重组的缺失型突变体。

4.复制缺陷型病毒突变体的制备

在细胞培养中从cDNA构建体pSeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL制备复制缺陷型SeV载体(SeVV-eGFP-ΔX)。

4.1 SeVV-eGFP-ΔX的初始产生

为了制备具有全部基因组的重组SeV：

-将稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系“BSR-T7”(Buchholz等人(1999)J.Virol.73，251-259)

-或细胞培养物，用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒MVA-T7(Sutter等人(1995)FEBS 371，9-12)感染，并且

-用病毒基因组(pSeV)以及质粒编码的基因N、P和L的cDNA转染(pTM-N，-P，-L；Elroy-Stein等人，(1989)PNAS 86，6126-6130)。T7聚合酶现在转录病毒反基因组和/或互补序列以及基因N、P和L。通过pTM-N表达的N蛋白包装了合成的病毒反基因组的和/或互补的RNA，并且这种核衣壳-核心(RNP)与蛋白P和L一起形成复制复合体，反过来通过该复制复合体可产生基因组RNA并包装成核衣壳(Leyrer等人，J.Virol.Meth.75(1998)，47-55)。在这之后，转录所有病毒编码的蛋白质并复制其他的病毒基因组(图10)。

与具有全部基因组的重组SeV wt的所述制备不同，在pSeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL的质粒编码的cDNA中缺乏基因N、P或L中每一个的遗传信息。因此，初始制备的核衣壳只能够每次表达基因N、P或L中的两种。因此，SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL核衣壳增殖所需的缺失的蛋白质的量必须通过质粒编码的基因N、P和L的由T7-启动子控制的表达来专门提供。

复制缺陷型SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL的制备类似于制备在HeLa细胞(ATCC CCL2)或BSR-T7细胞中有复制能力的SeV变体。在孵育HeLa细胞48小时后，研究了SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL的病毒颗粒是否已经释放进培养上清液中，以及多少初始缺失型突变体已经产生。

4.2初始制备的SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL的检测

就这些病毒载体的存在研究其中应该已经初始产生了SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL的HeLa细胞或BSR-T7细胞的上清液。与重组SeV wt不同，SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL在3′区域整合了eGFP的报道基因。该检测标记现在用于分析多少SeVV-eGFP-ΔX已经形成。

在平行测定中，将5×10⁵个Vero细胞(ATCC CCL18)各用1ml在SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL的初始产生过程中转染的HeLa细胞的细胞培养上清液，以及同时用与用于缺失的蛋白质的反式互补的SeVwt(MOI＝3)进行共感染。作为对照，将Vero细胞只用1ml初始制备的SeV-eGFP感染，或者备选地用初始制备的SeV-eGFP感染并同时用SeV wt(MOI＝3)感染。

用来自制备SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL时的培养物上清液以及SeVwt共感染细胞的结果显示，所有这三种病毒突变体SeVV-eGFP-ΔX可以初始制备，并且在初始制备后还能够感染细胞，这可通过可检测的eGFP转基因表达来检测。初始可以制备大约13×10²SeV-eGFP、6.7×10²SeVV-eGFP-ΔN、3.2×10²SeVV-eGFP-ΔP和0.55×10²SeVV-eGFP-ΔL病毒突变体。

5.SeVV-eGFP-ΔX的增殖

研究了载体SeVV-eGFP-ΔX是否是可增殖的，即是否是有生物学功能的。复制能力首先将通过提供缺失的基因N、P或L的蛋白质来进行研究，所述蛋白质的提供是通过使用SeV的病毒反式互补来进行的。

5.1 SeVV-eGFP-ΔX的增殖能力的证实

首先必须证明，在通过SeV wt病毒进行相应的反式互补时所述突变体能够增殖并因而感染周围的细胞。为了研究SeVV-eGFP-ΔX的增殖能力，可以再次采用用SeVV-eGFP-ΔX和SeV wt来共感染细胞。在该实验中，将细胞用低MOI的SeV wt感染，用SeVV-eGFP-ΔX共感染，并孵育数天，以便能够从荧光细胞的数量增加来检测SeVV-eGFP-ΔX载体的扩散。

将5×10⁵个Vero细胞同时用平均100个初始制备的SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL以及SeV wt(MOI＝0.2)感染。用能复制的病毒SeV-eGFP和SeV wt的约100个颗粒共感染Vero细胞，其用作阳性对照。在48小时的孵育过程中，可以观察到所有这三种缺失型突变体的增殖：在每种情况下，首先只有发荧光的个别Vero细胞，所述Vero细胞已经用SeVV-eGFP-ΔX和SeVwt共感染。在大约24小时后，新合成的病毒颗粒从这些细胞中释放，这些病毒现在能够侵入邻近的细胞。如果这些细胞再次同时用SeVV-eGFP-ΔX和SeV wt感染，那么在这些细胞中也会存在可检测的荧光外观。SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL在用wt共感染的细胞中的增殖可以在感染后(p.i.)48小时以及更长时间通过荧光细胞的这种“拖尾(Schweifbildung)”来检测。

该实验确定了，SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL所源自的基因组cDNA构建体在所有区域中是有功能的。此外还可以显示，在加入缺失的病毒蛋白质时病毒突变体的增殖是可能的。专门由wt病毒产生的蛋白质(例如P)足够用于使缺失型突变体和wt两者增殖，即甚至亚最佳量的P蛋白也可导致形成SeV wt和SeVV-eGFP-ΔP的功能性的核衣壳。通过由反式互补配偶体SeV wt提供缺失的蛋白质，可以导致所有SeVV-eGFP-ΔX的明显增殖，这通过培养物中荧光细胞的增加来测量。

5.2 SeVV-eGFP-ΔX增殖所需的蛋白质的确定

接下来我们研究，如果SeV蛋白N、P和L可以彼此独立地合成，那么在SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP和-ΔL增殖的各个单独情况下哪种蛋白质必须由辅助细胞提供。三种重组痘苗病毒(VV)VV-N、VV-P和VV-L可用于独立合成SeV蛋白N、P和L，所述痘苗病毒重组地表达SeV蛋白N、P或L(Graef，H.(1994)Funktionelle Charakterisierung desrekombinanten Sendai-Virus Large(L)Proteins.Dissertation，Eberhard-Karls-Universitt Tübingen)。

将1×10⁶个Vero细胞同时用SeVV-eGFP-ΔX或SeV-eGFP(MOI＝0.01)和VV共感染。在此，VV-N、-P和-L单独使用或组合使用(MOI＝0.5)。在吸附一小时后，用DMEM+10％胎牛血清(FCS)+阿糖胞苷(AraC)(100μg/ml)进行培养基更换，并且将细胞在33℃下孵育72小时，每天更换培养基，以添加新鲜的AraC。

在72小时后通过eGFP表达来分析SeVV-eGFP-ΔX的扩散。此时，在阳性测定中，绿色荧光细胞从一个初始细胞扩大至10-30个邻接的荧光细胞。

关于哪种SeV蛋白质是Vero细胞中SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL增殖所需要的研究的结果概括在表2中。仅是通过VV-N表达SeV N不引起SeVV-eGFP-ΔN的增殖。只有当SeV蛋白N和P借助于重组痘苗病毒VV-N和VV-P在受感染细胞中同时表达时，SeVV-eGFP-ΔN才会增殖。SeVV-eGFP-ΔP只要借助于VV-P在Vero细胞中表达SeV P蛋白就可以增殖。SeVV-eGFP-ΔL的增殖需要通过VV同时合成蛋白P和L。在用SeVV-eGFP-ΔL和仅用VV-L感染的Vero细胞中，不发生SeVV-eGFP-ΔL的增殖。

表2.SeVV-eGFP-ΔX增殖所需的SeV蛋白质

	借助于VV的体外增殖
			SeVV-eGFP-ΔN	N -	(N+P) +
SeVV-eGFP-ΔP	P +	(N+P) +
			SeVV-eGFP-ΔL	L -	(L+P) +

为了SeVV-eGFP-ΔN的增殖，辅助细胞必须同时表达SeV蛋白N和P，SeV P蛋白在辅助细胞中的表达足够用于SeVV-eGFP-ΔP的增殖，并且通过SeV蛋白P和L的细胞表达，SeVV-eGFP-ΔL的扩增将是可能的。

5.3 H29辅助细胞对SeVV-eGFP-ΔX扩增的支持

为了研究SeVV-eGFP-ΔX借助于H29细胞系的增殖，在四个不同测定法中将1×10⁶个H29细胞各自用约100个最初在HeLa细胞中产生的SeVV-eGFP-ΔN、-ΔP或-ΔL病毒颗粒感染，或用约100个SeV-eGFP病毒颗粒感染以作为能够复制的SeV在H29细胞中成功增殖的对照。在感染后的1-10天期间，对SeVV-eGFP-ΔX增殖的研究通过检测从最初感染的H29细胞开始的荧光细胞的尾状扩散(斑点形成)来进行。

在对照测定中可以观察到SeV-eGFP的增殖，从感染后1天单个荧光细胞开始到感染后3天达到具有高达50个荧光细胞的斑点。因此确定，所选择的实验方案引起SeV增殖。

病毒增殖也在用SeVV-eGFP-ΔN感染的H29细胞中发生。除了H29(人293-肾细胞的衍生物)，用SeV P和N基因稳定转染的Vero细胞(非洲绿猴的肾细胞)的衍生物和LLCMK2细胞(猕猴的肾细胞)的衍生物也适合用于病毒增殖。

在使用SeVV-eGFP-ΔP的测定法中，在感染后1天可以检测到约100个最初感染的单个细胞。在感染后3天，约70％的发荧光的单个细胞已经发展成具有多达30个荧光细胞的斑点。因此，可以清楚地观察到SeVV-eGFP-ΔP向周围的H29细胞的扩散。因此，首先可能的是增殖已经删除了其P-ORF的病毒SeV载体。在下面的小节中将会论述SeVV-eGFP-ΔP增殖的表征。

5.4 H29细胞上SeVV-eGFP-ΔP的增殖

SeVV-eGFP-ΔP可以通过由H29辅助细胞产生的SeV P蛋白进行扩增。释放的P-缺失型突变体能够感染周围的H29细胞。目前应当分析与有复制能力的SeV-eGFP的扩散相比较而言的SeVV-eGFP-ΔP的扩散。

为此，将1×10⁶H29细胞用平均100个SeVV-eGFP-ΔP或SeV-eGFP感染。在感染后3、5和10天，用荧光显微镜检测绿色荧光细胞。

SeVV-eGFP-ΔP可以通过细胞提供SeV P蛋白而成功地增殖。在所有所研究的时间点上可看出，SeVV-eGFP-ΔP和SeV-eGFP可在H29细胞上有效地增殖。

与之相反，未能观察到SeVV-eGFP-ΔP在未提供缺失的P蛋白的细胞(“靶细胞”，例如Vero细胞)上增殖，这证实了SeVV-eGFP-ΔP是复制缺陷型的(参见第8节)。

5.5 SeVV-eGFP-ΔP在受感染的靶细胞中的基因表达

可以证实在没有反向提供P蛋白的细胞类型上不存在SeVV-eGFP-ΔP的增殖。同时，表达效能远远地低于期望值。

类似地，如在狂犬病毒ΔP突变体的情形中(Shoji等人(2004)Virology 318，295-305)，尽管在统计上，在MOI＝1时实际上约70％的细胞每个被一个病毒颗粒感染，但是只有非常少的受感染细胞显示出弱的eGFP荧光性(少于5％；见图11)。甚至在更高的MOI＝5时，由于SeVV-eGFP-ΔP，只观察到个别发绿色光的Vero细胞(见图12，左上端)。

这证实了这样的假设：在细胞用P基因缺陷型病毒感染后，通过一起携带的来自病毒颗粒的聚合酶复合物仅可能进行初级转录。而且，在SeV ΔP突变体的情形中，显然只有小比率的感染性颗粒能够发生初级转录，或者基因表达只在数种可转录的核衣壳同时存在于一个细胞中时才可观察到。

对于这种复制缺陷型SeVV的治疗应用，这种表达效能似乎太弱，必须过度地给每位患者施用许多SeVV ΔP颗粒。因此，期望使用还进行次级转录的复制缺陷型SeV变体。这导致开发出另一种经修饰的聚合酶复合物，所述聚合酶复合物不能复制病毒基因组，但是能够增强治疗性基因或抗原的表达。

6.经修饰的SeVV-eGFP-ΔP cDNA构建体的制备

为了可能提高P基因缺陷型SeVV在靶细胞中的转录效能，制备了另一种重组构建体，其在原来的P-阅读框架位置处编码在N-末端缩短了76个氨基酸的P蛋白形式(“pSeVV-eGFP-PΔ2-77”，见第3.1节和图8B)。

类似于第4.1和5.4节来进行SeVV-eGFP-PΔ2-77颗粒的产生和增殖。

6.1 SeVV-eGFP-PΔ2-77在H29辅助细胞中的生长特性

在用SeVV-eGFP-PΔ2-77感染的H29辅助细胞中，在N-末端缩短了76个氨基酸的、病毒编码的PΔ2-77蛋白与细胞编码的P蛋白一起合成。

为了研究缩短的P蛋白PΔ2-77的表达对病毒复制的影响，类似于在关于SeVV-eGFP-ΔP的生长动力学时所描述的方法，将H29细胞用SeVV-eGFP-PΔ2-77、SeV-eGFP-ΔP或对照病毒SeV-eGFP感染(MOI＝3)。在120小时的时间内，通过子代病毒滴度的细胞感染剂量测试，通过表达eGFP的细胞的数目来测定各个测定法的上清液。

在120小时的时间内，从一个经SeV-eGFP感染的H29细胞(阳性对照)中释放平均80个病毒颗粒，其中在这种情况下不需要通过H29细胞进行P蛋白的反式互补。在H29反式互补系统中，SeVV-eGFP-PΔ2-77可以以与SeVV-eGFP-ΔP大约相等的效率进行增殖：在120小时后，大约20×10⁶个SeVV-eGFP-ΔP或SeVV-eGFP-PΔ2-77的病毒颗粒从受感染的H29细胞中释放，这相当于每个H29细胞释放约40个P突变体病毒颗粒这样的数量。

7.SeVV-eGFP-ΔP和SeVV-eGFP-PΔ2-77的基因表达的比较以及受感染靶细胞中蛋白质合成的定量

为了研究载体SeVV-eGFP-PΔ2-77是否相比SeVV-eGFP-ΔP而言在受感染靶细胞中显示出增加的转基因表达，详细表征了病毒编码的报道基因eGFP的表达和HN蛋白的表达。

将5×10⁵个Vero细胞用SeVV-eGFP-PΔ2-77感染(MOI＝1)，其中在感染后2天，可以观察到约70％发荧光的Vero细胞(未显示)。这意味着，该病毒载体变体的几乎每一个RNP复合物均能够在靶细胞中诱导可测量的转录。

7.1通过FACS分析对eGFP表达进行定量

在随后的医学领域应用中，其中插入了在SeVV-eGFP-PΔ2-77中的报道基因eGFP的转录盒将编码病原体的抗原，例如所期望的病毒的抗原。这种抗原表达必须足以在患者中引起保护性免疫应答。

为了确定感染靶细胞的每个SeVV-eGFP-PΔ2-77核衣壳能够进行可检测的转基因表达，将相同数目的H29细胞和Vero细胞用相同量的病毒颗粒感染，并且用FACS-Calibur流式细胞仪通过FACS(荧光激活细胞分选术)分析来比较表达eGFP的H29细胞或Vero细胞的数目。数据经由计算机柱状图进行估计，其中将受感染细胞的荧光信号相对于总细胞数进行了作图。

将2.5×10⁵个Vero细胞或H29细胞以MOI＝1用SeVV-eGFP-PΔ2-77或用P基因缺陷型病毒SeVV-eGFP-ΔP感染。样品的FACS分析在感染后24小时进行。将受感染的细胞吸收于PBS中并通过流式细胞shu术来测定荧光细胞的数目。结果在图11中显示为发荧光的Vero细胞和H29细胞的比例[％]。

在用SeVV-eGFP-ΔP感染H29辅助细胞后24小时，通过FACS分析检测到86％的表达eGFP的H29细胞。在此，P蛋白的细胞合成支持新的P:L复合物的形成并因此支持新mRNA的产生，这导致eGFP蛋白在受感染细胞中的合成。然而，当将Vero细胞用SeVV-eGFP-ΔP感染时，在另外的试验测定法中，在感染后24小时和更迟时间都未检测到eGFP蛋白的表达。在以MOI＝1进行感染时，通过SeVV-eGFP-ΔP核衣壳转移的P:L复合物不能在受感染的Vero细胞中引起可检测的表达。

与之相反，在SeVV-eGFP-PΔ2-77感染后24小时，通过FACS分析鉴定了将近80％的表达eGFP的H29细胞以及75％的表达eGFP的Vero细胞。当H29细胞受感染时，可以通过P蛋白的细胞合成并从而通过新的P:L复合物来支持eGFP mRNA的转录。当Vero细胞用SeVV-eGFP-PΔ2-77感染时，转录通过新合成在N-末端缩短的P蛋白PΔ2-77而加强。

基于这些结果，可以得出关于可转录的SeVV-eGFP-PΔ2-77的数目的重要论点：H29细胞和Vero细胞以1的MOI被感染。理论上，在这两个测定法中发生细胞的多次感染在统计上可能性同样低。在感染后24小时，可以鉴定到将近80％的表达eGFP的H29细胞和约75％的表达eGFP的Vero细胞。因此，可以得到这样的结论：能够在P辅助细胞中进行转基因表达的、具有缩短的P-变体PΔ2-77的每个RNP复合物在受感染的靶细胞中同样引起转基因表达。与此相反，P ORF完全缺失的变体SeVV-eGFP-ΔP不具有该特性。

7.2在受感染的靶细胞中表达的HN蛋白的功能测试

借助于血吸附(HAD)测试，检测了结合人红细胞的效率以及因此病毒HN蛋白暴露于单个受感染的细胞上的效率(图12)。

将5×10⁵个Vero细胞用SeVV-eGFP-PΔ2-77以低的MOI＝0.5感染。与此相反，在SeVV-eGFP-ΔP的情况下，Vero细胞必须用高10倍的MOI＝5感染，以能够观察到完全单个的荧光细胞。在吸附1小时后，用DMEM+10％FCS进行培养基更换。随后，将细胞在33℃下孵育数天。首先，两种载体变体的转基因表达都通过eGFP荧光进行监控。在感染后第5天和第9天，实施HAD测试系列，以根据结合人红细胞来分析病毒HN蛋白的暴露。

尽管在SeVV-eGFP-ΔP的情况下，当MOI＝5时，据统计99.3％的Vero细胞将受到感染，但是在显微镜下只能观察到0.01％的eGFP-阳性细胞(图12左上方)。相反地，用SeVV-eGFP-PΔ2-77，以MOI＝0.5在40％的细胞中观察到绿色荧光，与预期的一样(图12左下方)。

在用SeVV-eGFP-ΔP感染后两天，只有一半的eGFP-阳性细胞(5×10⁵个细胞中的25个，受感染的)能够在它们的表面上结合红细胞(图12上中部)。在进一步孵育和再次HAD测试后，在受感染细胞上不再吸附红细胞。用另一种复制缺陷型SeVV变体SeVV-eGFP-PΔ2-77，可以获得好得多的结果：在感染后5天，约40％的受感染细胞(MOI＝0.5)能够在它们的表面上结合红细胞(图12下中部)。在此，在单个细胞的情况下，可以观察到从10至70个复合的红细胞的不同的结合活性。从而显示出，用SeVV-eGFP-PΔ2-77感染的细胞在感染后5天能够使HN蛋白暴露于细胞表面上，并且功能性HAD测试可以被评定为阳性。同时，根据结合的红细胞的不同数量，确定HN蛋白在受感染细胞中有效表达。

将受感染的细胞在33℃下进一步孵育，其中HN蛋白的神经氨酸酶活性引起结合在受感染细胞上的红细胞释放。洗涤细胞以除去释放的红细胞，并且在33℃下进一步孵育4天。在感染后第9天再次进行HAD测试。现在可以检测到大约30％的HAD-阳性的Vero细胞。在此，结合的红细胞数量降低至每个细胞5-20个红细胞。

因而，在感染后9天，足够功能性的HN仍然通过复制缺陷型变体SeVV-eGFP-PΔ2-77来合成。与此相反，P ORF完全缺失的变体SeVV-eGFP-ΔP不具有这些特性。

7.3通过蛋白质印迹分析来对eGFP表达进行定量

复制缺陷型SeV载体相比能复制的SeV-eGFP而言的eGFP表达的半定量估计，用细胞总蛋白质的连续稀释物，通过蛋白质印迹分析来完成。

将5×10⁵个Vero细胞用SeV-eGFP或SeVV-eGFP-PΔ2-77(MOI＝3)感染。在感染后24小时实施细胞破碎；将细胞提取物以总量为20μg至2.5μg的系列稀释物(1∶2)在SDS-PAGE中分开。将蛋白质转移至PVDF膜上，并且首先通过蛋白质印迹分析来检测病毒编码的eGFP蛋白(26kDa)(图13)。

借助于蛋白质印迹分析，在SeV-eGFP和SeVV-eGFP-PΔ2-77感染的Vero细胞中均可检测到荧光蛋白eGFP。eGFP信号强度的比较使得能够得出这样的结论：通过复制缺陷型SeVV-eGFP-PΔ2-77介导的表达与有复制能力的SeV-eGFP相比较减少了约16倍。

在此，减少16倍是微小的，并可以作出结论，尽管是经修饰的P蛋白，但SeVV-eGFP-PΔ2-77可以产生非常有效的次级转录。

7.4通过蛋白质印迹分析来估计HN表达

与eGFP蛋白不同，SeV HN蛋白是一种膜结合表面蛋白并且是一种重要的抗原决定簇。通过HN蛋白在受SeVV-eGFP-PΔ2-77感染的细胞中的表达强度的相对定量，可以得出有关SeV HN抗原的表达强度的结论。

复制缺陷型SeV载体相比能复制的SeV-eGFP而言的HN表达的半定量估计，用细胞，总蛋白质的系列稀释物，通过蛋白质印迹分析来进行。各自将5×10⁵个Vero细胞在两个平行测定中用SeV-eGFP或SeVV-eGFP-PΔ2-77感染(MOI＝1)，并孵育24小时或48小时。随后裂解细胞；将细胞提取物以总量为16μg至2μg的系列稀释物(1∶2)在SDS-PAGE中分开。将蛋白质转移至PVDF膜上，并且借助于单克隆的HN抗体来检测病毒编码的HN蛋白(60kDa)(图14)。

在SeV-eGFP感染的Vero细胞的情况下，在两个孵育时间后在所有泳道(16至2μg总蛋白质；泳道2-5，左边和右边)中均有效检测到了HN蛋白。在SeVV-eGFP-PΔ2-77的情况下，HN蛋白的条带在具有16和8μg总蛋白的泳道(泳道7、8)中依然清晰可见，但具有较低的强度。相对于SeV-eGFP而言的在SeVV-eGFP-PΔ2-77感染的Vero细胞中HN表达的相对定量通过比较具有16和8μg总蛋白对具有2μg总蛋白的泳道(泳道7和8对5，左边和右边)来进行，并允许估计出P-缺失型变体的HN表达减少8-16倍，而不依赖于孵育时间。这使得能够得出结论：SeVV-eGFP-PΔ2-77感染的靶细胞中的转录率相对较高，并因而该病毒复制缺陷型载体的转基因表达通常高。

考虑这两种测量(eGFP蛋白和HN蛋白)，可以认为表达平均减少10倍。

8.SeVV-eGFP-PΔ2-77在靶细胞中的复制缺陷

如果用有复制能力的SeV-eGFP感染Vero细胞，在接下来的两天内，在最初受感染的、强烈发荧光的细胞周围形成由多达成千的另外的荧光细胞组成的斑点。为了证明SeVV-eGFP-PΔ2-77在Vero细胞中的复制缺陷性，现在应当证实在考虑了Vero细胞的自然分裂率的情况下在最初受感染的靶细胞周围不存在绿色荧光细胞的这种增加。Vero细胞平均每24小时分裂一次。如果Vero细胞用SeVV-eGFP-PΔ2-77感染，那么在约24小时后可看到可检测的eGFP表达。据观察，在进一步的24小时孵育期内，有时由于自然分裂而从这种最初感染的、发荧光的Vero细胞产生两个发(更弱的)荧光的子细胞。这种观察到的现象与病毒增殖无关，在病毒增殖中10¹至10⁴个病毒颗粒从受感染的靶细胞中释放，并且随后可感染邻近的细胞。另一方面，受感染细胞的这种自然分裂率影响eGFP的表达强度，其随着细胞分裂数量的增加而降低。该观察到的现象显示，病毒载体SeVV-eGFP-PΔ2-77是基因组复制缺陷型的，所以没有合成新的基因组。如果受感染细胞的多次连续细胞分裂导致荧光强度持续降低，直到其最终停止，那么可以排除病毒增殖。

为了最终证实SeVV-eGFP-PΔ2-77在靶细胞中的复制缺陷性，进行了最后一项研究：

将～20×10⁶个Vero细胞置于T75烧瓶中。所述细胞已经在孵育阶段开始时以高密度接种并因而不再非常活跃地分裂。将这些Vero细胞用SeVV-eGFP-PΔ2-77以0.001的MOI进行感染。在孵育1小时后将培养基更换成具有5％FCS的DMEM(为了降低分裂活性)，并且将这些Vero细胞在33℃下孵育(P1)。在感染后2天，根据所选择的MOI，最初观察到数千个单独存在的、受感染的、发荧光的Vero细胞。由于高的细胞密度，在接下来的4天孵育中几乎不存在细胞分裂，即最初受感染细胞的数量(通过荧光检测)保持恒定。如果在这个时期病毒颗粒已经形成，那么它们将能够感染邻近的细胞，这反映为荧光的增加。甚至在8天后，病毒载体的扩散才可以排除，因为周围的细胞不存在新的感染。为了给细胞提供新鲜的培养基，将上清液除去并用新鲜的培养基覆盖Vero细胞。孵育开始后12天，Vero细胞与培养容器底部脱离。在整个实验期间，未能以荧光细胞增加的形式观察到病毒载体的复制。因而可以排除SeVV-eGFP-PΔ2-77通过产生新病毒基因组以及病毒颗粒而从最初受感染细胞扩散至周围的Vero细胞。因此，SeVV-eGFP-PΔ2-77可以称为复制缺陷型病毒载体。

总结：

上面的结果显示，通过对聚合酶复合物的成分的基因进行定向操作，可以制备复制缺陷型负链RNA病毒，所述病毒仍然能够转录病毒编码的基因，但是不再能够复制病毒基因组。

在仙台病毒的情况下，特别更详细地研究了两种变体，其中聚合酶辅因子磷蛋白的基因被完全删除(“SeVV-eGFP-ΔP”)或者去除了氨基酸2-77的密码子(“SeVV-eGFP-PΔ2-77”)。这两种SeV载体在不反式提供P蛋白的细胞(所谓的靶细胞)中都是复制缺陷型的，但是它们在它们的基因表达效能方面明显不同。

尽管在SeVV-eGFP-ΔP的情况下，当MOI＝5时，据统计只有0.7％的Vero细胞仍然是未感染的(99.3％应该含有至少一个RNP复合物)，但是在显微镜下只能观察到0.01％的eGFP-阳性细胞。有此通过计算可以得出这样的结论：只有当15个或更多个SeVV-eGFP-ΔP的RNP同时存在于一个受感染靶细胞中时才会发生明显的转基因表达。

这种P基因缺陷的SeVV显示出与类似的狂犬病ΔP变体相似地弱的表达(Shoji等人，同上)。在受感染的靶细胞中，这两种载体通过一起携带的来自病毒颗粒的聚合酶复合物都只能够进行初级转录。然而，对于载体的治疗应用，所编码的转基因或抗原的更强表达是所期望的。这个条件可以通过复制缺陷型变体SeVV-eGFP-PΔ2-77来实现，所述变体在靶细胞中提供了与有复制能力的SeV相比只平均降低10倍的表达效能。通过在载体基因组中存在在N-末端缩短的P蛋白的基因，不仅初级转录，而且次级转录也是可能的。这通过新形成的、经修饰的聚合酶复合物来实现，所述聚合酶复合物含有载体编码的PΔ2-77蛋白质；然而，这不支持聚合酶的复制模式。

通过对受感染靶细胞中的蛋白质合成进行定量，已经证明，复制缺陷型病毒载体SeVV-eGFP-PΔ2-77能够进行有效的转录以及病毒编码的基因的表达。在此，不仅3′-邻近的转基因(eGFP)得以有效合成；而且位于基因组位置6处的HN基因在感染后得以转录至少9天并且该蛋白质被功能性地暴露于受感染的靶细胞上。

9.由复制缺陷型RNA疫苗在小鼠模型中诱导的免疫应答的测定

据显示，优选通过在P基因中的缺失(“PΔ2-77”)来产生经改变的病毒聚合酶复合物，其不再允许合成新的基因组。同时，在用这样的复制缺陷型病毒感染后，在靶细胞中介导的病毒基因表达与用有复制能力的病毒感染相比较只大约低10倍。

为了证明该复制缺陷型负链RNA病毒作为疫苗接种载体的足够的免疫原性，将两种异源病毒(人副流感病毒3型，hPIV3，和呼吸道合胞病毒，RSV)的抗原或抗原决定簇插入至所述病毒基因组中：为此，构建复制缺陷型SeV PΔ2-77，其中原始的表面蛋白F和HN的基因用编码嵌合的F和HN蛋白SeV/hPIV3的基因替代。嵌合的F蛋白含有558个氨基酸，并且由hPIV3的细胞外结构域(493个氨基酸)、SeV的跨膜结构域(23个氨基酸)和SeV的胞质结构域(42个氨基酸)组成。嵌合的HN蛋白具有579个氨基酸，并且由SeV的胞质结构域(35个氨基酸)、SeV的跨膜结构域(25个氨基酸)以及hPIV3的细胞外结构域(519个氨基酸)组成。嵌合的F蛋白和嵌合的HN蛋白的氨基酸序列在序列表中显示为SEQ ID No.27和28。

通过在病毒基因组中插入嵌合基因，产生了新的抗原性，并且另外确保了疫苗颗粒在它们的产生过程中有效装配。

RSV的表面蛋白F于在这两种病毒基因之间插入的另外的表达盒之中编码，由此该构建体扩展为二价疫苗。

将这种新疫苗在动物模型中进行测试。将Balb/C小鼠组以三周的间隔用两种不同的病毒制剂(A或C组，每组10⁴个感染单位)鼻内免疫接种三次，并且对照组(B)接受PBS而不是疫苗。在第三次免疫后，获取鼻洗出液(NW)以用于分析粘膜免疫应答，以及进行支气管肺泡(BAL)冲洗，并分离出血清以用于分析体液免疫应答。通过ELISA来测定诱导出的特异性地针对hPIV3和RSV的免疫球蛋白IgA和IgG的量。复制缺陷型疫苗原型引起特异性地针对hPIV3的IgA抗体的明显诱导(图15A)，但是较少地诱导了抗-RSV IgA抗体(未显示)。针对这两种病毒的表面抗原的体液免疫应答的诱导产生了相当的滴度，并且特异性IgG的量差别2倍(图15B)。抗-hPIV3-IgG的进一步分析显示，诱导的抗体具有中和特性(滴度1/64)。与此相反，如所期望的，在对照组中丝毫没有发现特异性IgA或IgG的诱导。

根据本发明的疫苗能够诱导针对异源病毒抗原的特异性的粘膜和体液免疫应答。另外的试验显示，经免疫接种的小鼠的淋巴细胞产生了干扰素-γ，但是IL-5未能检测到。该发现表明，二价的、复制缺陷型的RNA疫苗能够引发T-细胞免疫应答，其是长效免疫的先决条件。

总结

在将试验动物用其中插入了编码两种异源病毒的抗原的序列的、经修饰的载体感染后，检测到中和抗体的诱导。这显示了复制缺陷型负链RNA病毒用于开发新疫苗的潜力。

10.所使用的DNA寡核苷酸的列表

在上面实施例中使用的DNA寡核苷酸在下表3中显示。

表3：

SEQID No.	名称	长度[nt]	序列5′→3′	Tm[℃]
					1	X I＝M13	19	GGAAACAGCTATGACCATG	54
2	X I(+)	59	GGATCATTAGTACCTTGAAGCCTCGTAGATCGCGGCCGCGTGAACTTTGGCAGCAAAG	56

3	X II	57	GGCTTCAAGGTACTAATGATCCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTATTCCACC	64
					4	X II(+)＝N-1029(+)	18	GGTAGGTGTCTATGAGGC	56
5	XX	44	GGAAGGAAAAGCGGCCGCCGGCGGGATCATACGAGGCTTCAAGG	61
					6	XX(+)	57	CCTGTGTTTCTGCGGCCGCCGTTCGCGAGGCCGGCCCGTGAACTTTGGCAGCAAAGC	61
7	NotI eGFP	44	CGCGGGCCCGGGGCGGCCGCGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGC	60
					8	eGFP NotI(+)	26	GATGCATGCTCGAGCGGCCGCTTTAC	58
9	SgrAI eGFP	36	GGATTACTATCGCCGGCGGTCGCCACCATGGTGAGC	61
					10	eGFP SgrAI(+)	37	CGCTAACTGTCGCCGGCGTTTACTTGTACAGCTCGTCC	63
11	FseI DsRed	36	CGGATCAAGTGGCCGGCCGTCGCCACCATGGTGCGC	59
					12	DsRed FseI(+)	42	CGCGAATATCGGCCGGCCAAGTCTACAGGAACAGGTGGTGGC	63
13	ΔN I＝M13	19	GGAAACAGCTATGACCATG	54
					14	ΔN I(+)	35	CGGTGCGGGCCCGCACGTGAACTTTGGCAGCAAAGC	50
15	ΔN II	28	GTTCACGTGCGGGCCCGATCATACGAGG	44

16	ΔN II(+)＝P-2892(+)	19	CGCGTCTCGGGATGATTCG	62
					17	ΔP I＝N-578	17	CCCTGACACACTCCTTC	54
18	ΔP I(+)	31	GCGCCGCTCGAGGCGGTAAGTGTAGCCGAAG	64
					19	ΔP II	34	CCTGCGCTCGAGCTCATCCCGGGTGAGGCATCCC	64
20	ΔP II(+)	34	GGCGACGCGTCAGTCTCACAGCCTAATTCG	64
					21	XhoI PΔ2-77	47	CCCCCTTTTTCTCGAGATGTCGACCCAAGATAATCGATCAGGTGAGG	84
22	PΔ2-77(+)XhoI	46	TTTTTCCCCCCTCGAGTTACTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTC	80
					23	ΔL I＝F-4871	20	AGCATATATCCAGAGGTCAC	58

SEQID No.	名称	长度[nt]	序列5′→3′	Tm[℃]
					24	ΔL I(+)	38	GGGACTAATTAGTCGGGCCCGACC	58
25	ΔL II	31	GCACTTGGGCCCGACTAATTAGTCCCTC	60
					26	ΔL II(+)	21	CGAATGGCGCGCCTGATGCGG	64

序列表

<110>Max-Planck-Gesellschaft zur Forderung der Wissenschaften

e.V.

<120>作为疫苗的复制缺陷型RNA病毒

<130>33778P WO

<150>DE102005006388.8

<151>2005-02-11

<160>28

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>1

ggaaacagct atgaccatg 19

<210>2

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>2

ggatcattag taccttgaag cctcgtagat cgcggccgcg tgaactttgg cagcaaag 58

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>3

ggcttcaagg tactaatgat ccgtagtaag aaaaacttag ggtgaaagta ttccacc 57

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>4

ggtaggtgtc tatgaggc 18

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>5

ggaaggaaaa gcggccgccg gcgggatcat acgaggcttc aagg 44

<210>6

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>6

cctgtgtttc tgcggccgcc gttcgcgagg ccggcccgtg aactttggca gcaaagc 57

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgcgggcccg gggcggccgc gtcgccacca tggtgagcaa gggc 44

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>8

gatgcatgct cgagcggccg ctttac 26

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>9

ggattactat cgccggcggt cgccaccatg gtgagc 36

<210>10

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>10

cgctaactgtcgccggcgtt tacttgtaca gctcgtcc 38

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>11

cggatcaagt ggccggccgt cgccaccatg gtgcgc 36

<210>12

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>12

cgcgaatatc ggccggccaa gtctacagga acaggtggtg gc 42

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>13

ggaaacagct atgaccatg 19

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>14

cggtgcgggc ccgcacgtga actttggcag caaagc 36

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>15

gttcacgtgc gggcccgatc atacgagg 28

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>16

cgcgtctcgg gatgattcg 19

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>17

ccctgacaca ctccttc 17

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>18

gcgccgctcg aggcggtaag tgtagccgaa g 31

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>19

cctgcgctcg agctcatccc gggtgaggca tccc 34

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>20

ggcgacgcgt cagtctcaca gcctaattcg 30

<210>21

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>21

cccccttttt ctcgagatgt cgacccaaga taatcgatca ggtgagg 47

<210>22

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>22

tttttccccc ctcgagttac tagttggtca gtgactctat gtcctc 46

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>23

agcatatatc cagaggtcac 20

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>24

gggactaatt agtcgggccc gacc 24

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>25

gcacttgggc ccgactaatt agtccctc 28

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>26

cgaatggcgc gcctgatgcg g 21

<210>27

<211>558

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合蛋白

<400>27

Met Pro Thr Ser Ile Leu Leu Ile Ile Thr Thr Met Ile Met Ala Ser

1 5 10 15

Phe Cys Gln Ile Asp Ile Thr Lys Leu Gln His Val Gly Val Leu Val

20 25 30

Asn Ser Pro Lys Gly Met Lys Ile Ser Gln Asn Phe Glu Thr Arg Tyr

35 40 45

Leu Ile Leu Ser Leu Ile Pro Lys Ile Glu Asp Ser Asn Ser Cys Gly

50 55 60

Asp Gln Gln Ile Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Leu Asp Arg Leu Ile Ile

65 70 75 80

Pro Leu Tyr Asp Gly Leu Arg Leu Gln Lys Asp Val Ile Val Ser Asn

85 90 95

Gln Glu Ser Asn Glu Asn Thr Asp Pro Arg Thr Lys Arg Phe Phe Gly

100 105 110

Gly Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile

115 120 125

Thr Ala Ala Val Ala Leu Val Glu Ala Lys Gln Ala Arg Ser Asp Ile

130 135 140

Glu Lys Leu Lys Glu Ala Ile Arg Asp Thr Asn Lys Ala Val Gln Ser

145 150 155 160

Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn Leu Ile Val Ala Ile Lys Ser Val Gln

165 170 175

Asp Tyr Val Asn Lys Glu Ile Val Pro Ser Ile Ala Arg Leu Gly Cys

180 185 190

Glu Ala Ala Gly Leu Gln Leu Gly Ile Ala Leu Thr Gln His Tyr Ser

195 200 205

Glu Leu Thr Asn Ile Phe Gly Asp Asn Ile Gly Ser Leu Gln Glu Lys

210 215 220

Gly Ile Lys Leu Gln Gly Ile Ala Ser Leu Tyr Arg Thr Asn Ile Thr

225 230 235 240

Glu Ile Phe Thr Thr Ser Thr Val Asp Lys Tyr Asp Ile Tyr Asp Leu

245 250 255

Leu Phe Thr Glu Ser Ile Lys Val Arg Val Ile Asp Val Asp Leu Asn

260 265 270

Asp Tyr Ser Ile Thr Leu Gln Val Arg Leu Pro Leu Leu Thr Arg Leu

275 280 285

Leu Asn Thr Gln Ile Tyr Arg Val Asp Ser Ile Ser Tyr Asn Ile Gln

290 295 300

Asn Arg Glu Trp Tyr Ile Pro Leu Pro Ser His Ile Met Thr Lys Gly

305 310 315 320

Ala Phe Leu Gly Gly Ala Asp Val Lys Glu Cys Ile Glu Ala Phe Ser

325 330 335

Ser Tyr Ile Cys Pro Ser Asp Pro Gly Phe Val Leu Asn His Glu Met

340 345 350

Glu Ser Cys Leu Ser Gly Asn Ile Ser Gln Cys Pro Arg Thr Val Val

355 360 365

Lys Ser Asp Ile Val Pro Arg Tyr Ala Phe Val Asn Gly Gly Val Val

370 375 380

Ala Asn Cys Tle Thr Thr Thr Cys Thr Cys Asn Gly Ile Gly Asn Arg

385 390 395 400

Ile Asn Gln Pro Pro Asp Gln Gly Val Lys Ile Ile Thr His Lys Glu

405 410 415

Cys Asn Thr Ile Gly Ile Asn Gly Met Leu Phe Asn Thr Asn Lys Glu

420 425 430

Gly Thr Leu Ala Phe Tyr Thr Pro Asn Asp Ile Thr Leu Asn Asn Ser

435 440 445

Val Ala Leu Asp Pro Ile Asp Ile Ser Ile Glu Leu Asn Lys Ala Lys

450 455 460

Ser Asp Leu Glu Glu Ser Lys Glu Trp Ile Arg Arg Ser Asn Gln Lys

465 470 475 480

Leu Asp Ser Ile Gly Asn Trp His Gln Ser Ser Thr Thr Val Ile Thr

485 490 495

Ile Ile Val Val Met Val Val Ile Leu Val Val Ile Ile Val Ile Val

500 505 510

Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly Asn Pro Asp

515 520 525

Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu Pro Lys Ile Arg His

530 535 540

Met Tyr Thr Asn Gly Gly Phe Asp Ala Met Ala Glu Lys Arg

545 550 555

<210>28

<211>579

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合蛋白

<220>

<221>嵌合蛋白

<222>(1)..(579)

<400>28

Met Asp Gly Asp Arg Gly Lys Arg Asp Ser Tyr Trp Ser Thr Ser Pro

1 5 10 15

Ser Gly Ser Thr Thr Lys Leu Ala Ser Gly Trp Glu Arg Ser Ser Lys

20 25 30

Val Asp Thr Trp Leu Leu Ile Leu Ser Phe Thr Gln Trp Ala Leu Ser

35 40 45

Ile Ala Thr Val Ile Ile Cys Ile Ile Ile Ser Ala Asn Ser Ile Lys

50 55 60

Ser Glu Lys Ala His Glu Ser Leu Leu Gln Asp Val Asn Asn Glu Phe

65 70 75 80

Met Glu Val Thr Glu Lys Ile Gln Met Ala Ser Asp Asn Ile Asn Asp

85 90 95

Leu Ile Gln Ser Gly Val Asn Thr Arg Leu Leu Thr Ile Gln Ser His

100 105 110

Val Gln Asn Tyr Ile Pro Ile Ser Leu Thr Gln Gln Met Ser Asp Leu

115 120 125

Arg Lys Phe Ile Ser Glu Ile Thr Ile Arg Asn Asp Asn Arg Glu Val

130 135 140

Pro Pro Gln Arg Ile Thr His Asp Ala Gly Ile Lys Pro Leu Asn Pro

145 150 155 160

Asp Asp Phe Trp Arg Cys Thr Ser Gly Leu Pro Ser Leu Met Lys Thr

165 170 175

Pro Lys Ile Arg Leu Met Pro Gly Pro Gly Leu Leu Ala Met Pro Thr

180 185 190

Thr Val Asp Gly Cys Val Arg Thr Pro Ser Leu Val Ile Asn Asp Leu

195 200 205

Ile Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn Leu Ile Thr Arg Gly Cys Gln Asp Ile

210 215 220

Gly Lys Ser Tyr Gln Val Leu Gln Ile Gly Ile Ile Thr Val Asn Ser

225 230 235 240

Asp Leu Val Pro Asp Leu Asn Pro Arg Ile Ser His Thr Phe Asn Ile

245 250 255

Asn Asp Asn Arg Lys Ser Cys Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp Val

260 265 270

Tyr Gln Leu Cys Ser Thr Pro Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ala

275 280 285

Ser Ser Gly Ile Glu Asp Ile Val Leu Asp Ile Val Asn His Asp Gly

290 295 300

Ser Ile Ser Thr Thr Arg Phe Lys Asn Asn Asn Ile Ser Phe Asp Gln

305 310 315 320

Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Lys

325 330 335

Gly Lys Ile Ile Phe Leu Gly Tyr Gly Gly Leu Glu His Pro Ile Asn

340 345 350

Glu Asn Ala Ile Cys Asn Thr Thr Gly Cys Pro Gly Lys Thr Gln Arg

355 360 365

Asp Cys Asn Gln Ala Ser His Ser Pro Trp Phe Ser Asp Arg Arg Met

370 375 380

Val Asn Ser Ile Ile Val Val Asp Lys Gly Leu Asn Ser Ile Pro Lys

385 390 395 400

Leu Lys Val Trp Thr Ile Ser Met Arg Gln Asn Tyr Trp Gly Ser Glu

405 410 415

Gly Arg Leu Leu Leu Leu Gly Asn Lys Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser

420 425 430

Thr Ser Trp His Ser Lys Leu Gln Leu Gly Ile Ile Asp Ile Thr Asp

435 440 445

Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Lys Trp Thr Trp His Asn Val Leu Ser Arg

450 455 460

Pro Gly Asn Asn Glu Cys Pro Trp Gly His Ser Cys Pro Asp Gly Cys

465 470 475 480

Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp Ala Tyr Pro Leu Asn Pro Thr Gly Ser

485 490 495

Ile Val Ser Ser Val Ile Leu Asp Ser Gln Lys Ser Arg Val Asn Pro

500 505 510

Val Ile Thr Tyr Ser Thr Ser Thr Glu Arg Val Asn Glu Leu Ala Ile

515 520 525

Arg Asn Lys Thr Leu Ser Ala Gly Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Ile Thr

530 535 540

His Tyr Asn Lys Gly Tyr Cys Phe His Ile Val Glu Ile Asn His Lys

545 550 555 560

Ser Leu Asp Thr Phe Gln Pro Met Leu Phe Lys Thr Glu Ile Pro Lys

565 570 575

Ser Cys Ser

Claims

1.重组仙台病毒，其包含这样的病毒基因组，所述病毒基因组具有由基因P编码的蛋白质的氨基酸2-77的缺失，所述缺失导致复制能力的丧失而不丧失次级转录能力。

2.权利要求1的重组仙台病毒，其特征在于，所述病毒基因组还包含至少一种编码异源基因产物的序列。

3.权利要求2的重组仙台病毒，其特征在于，所述异源基因产物是蛋白质、核酶、反义分子或siRNA分子。

4.权利要求3的重组仙台病毒，其特征在于，所述异源基因产物是报告蛋白、抗原或治疗性蛋白质。

5.权利要求4的重组仙台病毒，其特征在于，所述异源基因产物是选自病毒、细菌和原生动物的异源病原体的抗原。

6.权利要求5的重组仙台病毒，其特征在于，所述异源基因产物是病毒抗原。

7.权利要求6的重组仙台病毒，其特征在于，所述病毒基因组编码来自相同或不同病毒的多种异源抗原。

8.权利要求2的重组仙台病毒，其特征在于，将编码至少一种异源基因产物的序列插入病毒基因组中和/或取代编码同源基因产物的序列。

9.权利要求1的重组仙台病毒，其特征在于，所述病毒具有相比野生型病毒而言降低至多20倍的转录能力。

10.权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒的核衣壳。

11.权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒的基因组。

12.DNA分子，其编码权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒的基因组和/或反基因组。

13.权利要求12的DNA分子，其特征在于，它与转录信号有效连接。

14.权利要求13的DNA分子，其特征在于，所述转录信号是噬菌体启动子。

15.权利要求14的DNA分子，其中所述噬菌体启动子是T7或SP6启动子。

16.细胞，其包含权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒、权利要求10的核衣壳、权利要求11的基因组或权利要求12-15中任一项的DNA分子。

17.权利要求16的细胞，其特征在于，它是重组仙台病毒增殖性细胞。

18.权利要求16的细胞，其特征在于，它是重组仙台病毒生产性细胞。

19.权利要求18的细胞，其特征在于，它进一步包含编码异源DNA依赖性RNA聚合酶的DNA分子，所述DNA分子影响编码所述重组仙台病毒的DNA分子的转录。

20.权利要求16的细胞，其特征在于，它进一步包含编码仙台病毒N和/或P蛋白的DNA分子。

21.产生权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)制备用编码重组仙台病毒基因组的DNA分子转染的细胞，所述重组仙台病毒基因组包含由基因P编码的蛋白质的氨基酸2-77的缺失和可选地包含至少一种编码异源基因产物的序列，和

(b)在根据(a)的DNA的转录得以发生并形成所述重组仙台病毒的条件下培养所述细胞。

22.权利要求21的方法，其进一步包括从所述重组仙台病毒获得核衣壳或病毒基因组。

23.用于使权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒增殖的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)制备用重组仙台病毒感染的细胞，所述重组仙台病毒包含由基因P编码的蛋白质的氨基酸2-77的缺失和可选地包含至少一种编码异源基因产物的序列，和

(b)在病毒增殖得以发生的条件下培养所述细胞。

24.药物组合物，其特征在于，它包含权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒、权利要求10的核衣壳或权利要求11的病毒基因组作为活性物质，以及可选地包含药学上常用的载体和/或助剂。

25.权利要求24的药物组合物，其用作疫苗。

26.权利要求25的药物组合物，其用作单价或多价疫苗。

27.权利要求25或26的药物组合物，其用作对抗病毒感染的疫苗。

28.权利要求27的药物组合物，其用作对抗致病性负链RNA病毒感染的疫苗。

29.权利要求24的药物组合物，其用于抗肿瘤疗法。

30.权利要求24的药物组合物，其用于危险患者。

31.权利要求30的药物组合物，其中所述危险患者为儿童、老年人和/或具有受损的或弱的免疫系统的人。

32.权利要求24的药物组合物，其包含有在天然病毒包膜中的核衣壳。

33.组成型或诱导型地稳定表达重组仙台病毒的蛋白P的细胞的用途，所述用途为使权利要求1-9中任一项的重组仙台病毒、权利要求10的核衣壳或权利要求11的病毒基因组产生或增殖。

34.权利要求33的用途，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。

35.权利要求33或34的用途，其特征在于，所述细胞选自H29细胞DSM ACC2702。