JP2008529508A - ワクチンとしての複製欠損rna−ウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
(i)本発明による組換えウイルスのゲノム又は/及びその相補配列又はその前駆体をコードするDNA分子
又は/及び
(ii)本発明によるウイルスのRNA−ゲノム
を有する真核細胞、特に有利には哺乳類細胞である。この細胞は、先に説明したようなベクター増殖細胞、ウイルス産生細胞又はウイルス増殖細胞であってよい。
(a)遺伝子N、L及びPのうち少なくとも1つに、転写能力を欠損することなく、ゲノム複製能力の欠損を生じる突然変異、及び場合により少なくとも1つの異種遺伝子産物コード配列を含んでいる、マイナス鎖RNA−ウイルスのゲノムをコードするDNA分子でトランスフェクトしたウイルス産生細胞を準備し、かつ
(b)(a)によりDNA分子の転写が行われる条件下に宿主細胞を培養し、かつ組換えマイナス鎖RNAウイルスが初めに形成される
を含む本発明による組換えマイナス鎖RNA−ウイルスの製法である。
(a)遺伝子N、L及びPのうち少なくとも1つに、転写能力を欠損することなく、ゲノム複製能力の欠損を生じる突然変異、及び場合により少なくとも1つの異種遺伝子産物コード配列を含んでいる、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムに感染させたウイルス増殖細胞を準備し、かつ
(b)前記ウイルスの増殖が行われる条件下に宿主細胞を培養する
を含む本発明による組換えマイナス鎖RNAウイルスを増殖する方法にも関する。
1.概要
図1は、フィールドによるセンダイウイルス(SeV)の形態を示している(Virology. Lippincott, Williams und Wilkins(2001), 第4版;改訂)。このゲノムは、タンパク質N、P及びLとヌクレオカプシドの形で存在する一本鎖RNAから成る。ヌクレオカプシドは、タンパク質HNとF(それぞれF1−とF2−サブユニットから成っている)が挿入した膜エンベロープにより包囲されている。膜の内側はタンパク質Mと会合していて、これは同時にヌクレオカプシド成分と結合した形でも存在する。
2.1 cDNA−構築物pSeV-Xの製造
コード転写カセットをSeV、フシミ菌種(ATCC VR105)の3’−領域に挿入した。ゲノムの全ての操作の際には、組換えSeVゲノムのヌクレオチドの総数が必ず6で割り切れる("rule of six")ように注意を払わなくてはならない。
構築物pSeV−X−Xにより、2つの導入遺伝子を挿入できる2つの更なる転写カセットを準備することにした。複製欠損ベクターを製造するためのベースベクターとしてpSeV−X−Xを使用し、ベクターに多価、例えば、2価の特性を備えることができた。
それぞれタンパク質N、P及びLの遺伝子が欠失した複製欠損センダイウイルスをコードするcDNA構築物pSeVV−eGFP−ΔN、−ΔP及び−ΔLを製造した。このために、rule of sixを維持しながら、それぞれ遺伝子N、P又はLの読取り枠を欠失しなくてはならず、その際、非コード転写カセットは適切な位置で保持されたままでなくてはならなかった(図8A)。
P−タンパク質のORFを、複製可能なウイルスpSeV−eGFPのcDNA構築物から取り除き、複製欠損ベクターをコードする新たなcDNA pSeVV−eGFP−ΔPを製造した。P−ORFの代わりに、XhoI−制限切断部位を組込んだ。
pSeVV−eGFP−ΔNとpSeVV−eGFP−ΔLの製造は、pSeVV−eGFP−ΔPのクローニングと同じ方策により行った。クローニング法をまとめるために、表1に重要なパラメーターが全て記載されている。
cDNA構築物pSeVV−eGFP−ΔN、−ΔP及び−ΔLから、複製欠損したSeV−ベクター(SeVV−eGFP−ΔX)を細胞培養で製造した。
完全ゲノムを有する組換えSeVを製造するために、
− T7 RNA−ポリメラーゼを安定に発現する細胞株"BSR-T7"(Buchholz等(1999) J. Virol. 73, 251-259)又は細胞培養を、T7 RNA−ポリメラーゼを発現する組換えワクチニアウイルスMVA-T7に感染させ(Sutter等(1995)FEBS 371, 9-12)、かつ
− ウイルスゲノム(pSeV)のcDANならびにプラスミド−コード遺伝子N、P及びLでトランスフェクトした(pTM-N、-P、-L;Elroy-Stein等(1989) PNAS 86, 6126-6130)。T7−ポリメラーゼはウイルスアンチゲノム又は/及び相補配列ならびに遺伝子N、P及びLを転写した。pTM−Nにより発現したN−タンパク質は、合成ウイルスアンチゲノム又は/及び相補性RNAを包み、かつこれらのヌクレオカプシドコア(RNP)はタンパク質PとLと一緒に複製複合体を形成し、これにより再びゲノムRNAが製造され、かつヌクレオカプシドに包まれることができる(Leyrer 等、 J. Virol. Meth. 75(1998), 47-55)。これに引き続き、全てのウイルスコードタンパク質の転写と更なるウイルスゲノムの複製が行われた(図10)。
初めにSeVV−eGFP−ΔN、−ΔP及び−ΔLを製造しておいたHeLa細胞又はBSR−T7細胞の上澄みを、ウイルスベクターの存在で調べた。組換えSeVwtとは異なり、SeVV−eGFP−ΔN、−ΔP又は−ΔLは、3’−領域内でeGFPのレポーター遺伝子に挿入されていた。今度はこの検出マーカーを使用して、どれくらいのSeVV−eGFP−ΔXが形成されていたのかを分析した。
ベクターSeVV−eGFP−ΔXが増殖可能であるか、すなわち生物学的に機能的であるかどうかを試験した。複製能力は、まず欠損した遺伝子N、P又はLのタンパク質を準備するか、又はSeVでのウイルストランス相補化により調べた。
まず、突然変異体がSeV wtウイルスによる相応のトランス相補化の際に増殖でき、かつその際に周辺の細胞を感染させたことを検出しなくてはならなかった。またしてもSeVV−eGFP−ΔXの増殖性の試験は、SeVV−eGFP−ΔXとSeV wtでの細胞の同時感染に適当であった。前記細胞を同じ試験において低いMOIのSeV wtに感染させ、SeVV−eGFP−ΔXに同時感染させ、かつ数日にわたりインキュベートし、SeVV−eGFP−ΔXが拡がるほど増大する蛍光細胞の数によりベクターが検出できた。
次に、SeVV−eGFP−ΔN、−ΔP及び−ΔLを個々に増殖する際に、どのタンパク質をヘルパー細胞により増殖させておくべきか、SeVタンパク質N、P及びLとは相互に独立に合成できたのかを試験した。SeVタンパク質N、P及びLを独立に合成するために、SeVタンパク質N、P及びLを組換え発現した3種の組換えワクチンウイルス(VV)であるVV−N、VV−P、VV−Lを準備した(Greaf, H. (1994) Funktionelle Charakterisierung des rekombinanten Sendai-Virus Large(L) Proteins. Dissertation, Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen)。
H29細胞株を用いてSeVV−eGFP−ΔXを増殖する試験に関して、1×106個のH29細胞を4つの異なる調製物中で、初めにHeLa細胞中で製造したSeVV−eGFP−ΔN、−ΔP又は−ΔLウイルス粒子それぞれ約100個に感染させるか、もしくは成功した増殖のコントロールとして、複製可能なSeVをH29細胞中でSeV−eGFPウイルス粒子約100個に感染させた。p.i. 1〜10日の期間で、初めに感染したH29細胞から出発して、蛍光細胞のテイルのような伝播(スポット形成)を検出することにより、SeVV−eGFP−ΔXの増殖に関する試験を行った。
SeVV−eGFP−ΔPは、H29ヘルパー細胞から産生されたSeV Pタンパク質により増幅できた。遊離したP−欠失突然変異体は、周辺のH29細胞を感染できた。次にSeVV−eGFP−ΔPの伝播を複製可能なSeVV−eGFPの伝播と比較して分析した。
Pタンパク質をトランスの形で提供しない細胞タイプにおけるSeVV−eGFP−ΔPの増殖が起こらないことを証明できた。同時に、発現能力は期待するに及ばなかった。
標的細胞中でP遺伝子欠失SeVVの転写能力を場合によっては改善するために、元のP−読取り枠の位置で、N末端がアミノ酸76個だけ短くなった形のPタンパク質をコードする、もう1つの組換え構築物を製造した("pSeVV−eGFP−PΔ2-77";項目3.1と図8B参照)。
SeVV−eGFP−PΔ2-77に感染したH29ヘルパー細胞中では、N末端がアミノ酸76個たけ短くなったウイルスコードPΔ2-77タンパク質を細胞性コードPタンパク質と一緒に合成した。
感染した標的細胞中でベクターSeVV−eGFP−PΔ2-77がSeVV−eGFP−ΔPと比べて強い導入遺伝子発現を示すかどうかを調べるために、レポーター遺伝子eGFPならびにHNタンパク質のウイルスコード発現を詳細にキャラクタリゼーションした。
レポーター遺伝子eGFPがSeVV−eGFP−PΔ2-77中に挿入された転写カセットは、後で医学分野で使用する際に病原体、例えば、所望のウイルスの抗原をコードするべきである。これらの抗原発現は、患者において保存的免疫応答を引き起こすために十分でなくてはならない。
血球吸着(HAD)試験を用いて、個々の感染細胞においてヒト赤血球の結合の効果及びウイルスHN−タンパク質の露出の効果を検出した(図12)。
細胞の全タンパク質の一連の希釈系列を用いてウェスタンブロット分析により、複製可能なSeV−eGFPと比較して、複製欠損SeV−ベクターのeGFP発現の半定量的評価を実施した。
SeV HN−タンパク質はeGFPタンパク質とは異なり膜貫通型の表面タンパク質であり、かつ重要な抗原決定因子である。SeVV−eGFP−PΔ2-77感染細胞中でHN−タンパク質の発現強さを相対的に定量化することにより、SeV HN−抗原の発現の強さについて証言が可能である。
ベロ細胞を複製可能なSeV−eGFPに感染させた場合には、これに続いて2日で初めに感染した強い蛍光細胞の周辺に、1000個までの更なる蛍光細胞から成るスポットが生じた。ベロ細胞中でSeVV−eGFP−PΔ2-77の複製欠損を立証するために、ベロ細胞の自然な分裂速度を考慮して、初めに感染した標的細胞の周辺で緑色蛍光細胞が生じないことを確認することにした。ベロ細胞は平均して24時間ごとに分裂した。ベロ細胞をSeVV−eGFP−PΔ2-77に感染させた場合には、約24時間後に検出可能なeGFP−発現が見られた。さらにインキュベーションフェーズの24時間後にも、これらの初めに感染した蛍光ベロ細胞から、自然分裂により幾つかの場合に2つの(弱い)蛍光娘細胞が生じた。この観察結果は、101〜104個のウイルス粒子が感染した標的細胞から生じたウイルス増殖とは関係がなく、よって隣接する細胞を感染できる。他方で、感染細胞の自然な分裂速度は、細胞分裂の数が増すにつれて減少したeGFP−発現強さに影響を与えた。この観察結果は、ウイルスベクターSeVV−eGFP−PΔ2-77がゲノム複製欠損であるということ、すなわち、新たなゲノムが何も合成されていないことを示している。感染細胞の幾つかの連続した細胞分裂が、最後には停止するまで蛍光強さの連続的な減少を生じる場合には、ウイルス増殖は排除されることになる。
T75−フラスコを〜20×106個のベロ細胞で覆った。これらの細胞はインキュベーションフェーズを開始するために既に高密度で播かれていたので、その結果もはや強い分裂活性はなかった。これらのベロ細胞をMOI=0.001でSeVV−eGFP−PΔ2-77に感染させた。1時間のインキュベーション時間の後、5%FCS含有DMEM(少ない分裂活性)による培地交換を行い、かつベロ細胞を33℃でインキュベートした(P1)。p.i.2日目では、選択したMOIに相応して、初めに個々に存在する数千の感染蛍光ベロ細胞が観察できた。高い細胞密度ゆえに、それに続く4日のインキュベーションで、殆ど細胞分裂しなかった。すなわち、初めの感染細胞の数は、蛍光により一定のままで検出された。この時間内にウイルス粒子が形成された場合には、これに隣接する細胞を感染させることができた。このことは、蛍光の増大により反映されていた。8日後にも、周辺細胞の欠損した新たな感染ゆえにウイルスベクターの伝播を排除できた。細胞に新たな培地を与えるために、上澄液を取り出し、かつベロ細胞を新たな培地で覆った。インキュベーション開始から12日後に、培地の底からベロ細胞が剥がれた。全体の試験期間の間に、ウイルスベクターの複製は増大する蛍光細胞の形で観察することができなかった。従って、隣接するベロ細胞における一次感染細胞によるSeVV−eGFP−PΔ2-77の伝播を新規ウイルスゲノムならびにウイルス粒子の産生により排除できた。よって、SeVV−eGFP−PΔ2-77を複製欠損ウイルスベクターと称するべきである。
先に挙げた結果は、標的を定めたポリメラーゼ複合体の成分の遺伝子操作により、ウイルスコード遺伝子を転写できるが、ウイルスゲノムをもはや複製しない複製欠損マイナス鎖RNAウイルスを製造できたということを示している。
特にP遺伝子中の欠失("PΔ2-77")により、新たなゲノムの合成を可能にしない変性ウイルスポリメラーゼ複合体を生じることが示された。同時に、このような複製欠損ウイルスに感染した後に、標的細胞中で媒介されたウイルス遺伝子発現は、複製可能なウイルスでの感染と比べて約10倍低かった。
抗原のコード配列中に2組の異種ウイルスを挿入した変性ベクターで実験動物を感染させた後、中和抗体の誘発が検出された。このことは、新しいタイプのワクチンを開発するための複製欠陥マイナス鎖RNAウイルスの可能性を示している。
上記の実施例で使用したDNAオリゴヌクレオチドを以下の表3に挙げてある。
Claims (38)
- 二次転写能力を欠損することなく複製能力の欠損を生じる、遺伝子N、L及びPのうち少なくとも1つに突然変異を有するウイルスゲノムを含有している組換えマイナス鎖RNAウイルス。
- パラミクソウイルスであることを特徴とする、請求項1に記載のウイルス。
- センダイウイルスであることを特徴とする、請求項1又は2に記載のウイルス。
- 突然変異を遺伝子P中に有することを特徴とする、請求項1から3までのいずれか1項に記載のウイルス。
- 突然変異は、遺伝子Pにコードされるタンパク質のN末端部分配列に関することを特徴とする、請求項4に記載のウイルス。
- 突然変異は、
(a)遺伝子Pにコードされるタンパク質のアミノ酸2〜77又は
(b)複製能力を欠損するために十分な(a)の部分配列
の欠失を含むことを特徴とする、請求項5に記載のウイルス。 - ウイルスゲノムは、異種遺伝子産物をコードする配列を少なくとも1つ含有していることを特徴とする、請求項1から6までのいずれか1項に記載のウイルス。
- 異種遺伝子産物は、タンパク質、リボザイム、アンチセンス分子又はsiRNA分子であることを特徴とする、請求項7に記載のウイルス。
- 異種遺伝子産物は、レポータータンパク質、抗原又は治療タンパク質であることを特徴とする、請求項7又は8に記載のウイルス。
- 異種遺伝子産物は、ウイルス、バクテリア及び原生動物から選択される異種病原体の抗原であることを特徴とする、請求項7から9までのいずれか1項に記載のウイルス。
- 異種遺伝子産物は、ウイルス抗原であることを特徴とする、請求項7から10までのいずれか1項に記載のウイルス。
- ウイルスゲノムは、同じ又は異なるウイルス由来の幾つかの異種抗原をコードすることを特徴とする、請求項11に記載のウイルス。
- 少なくとも1つの異種遺伝子産物コード配列が、ウイルスゲノム中に挿入されている又は/及び同種遺伝子産物コード配列が置換されていることを特徴とする、請求項7から12までのいずれか1項に記載のウイルス。
- ウイルスは、野生型と比べて多くとも20倍弱い転写能力を有することを特徴とする、請求項1から13までのいずれか1項に記載のウイルス。
- 請求項1から14までのいずれか1項に記載のマイナス鎖RNAウイルスのヌクレオカプシド。
- 請求項1から14までのいずれか1項に記載のマイナス鎖RNAウイルスのゲノム。
- 請求項1から14までのいずれか1項に記載の組換えマイナス鎖RNAウイルスのゲノム又は/及びアンチゲノムをコードするDNA分子。
- 転写シグナルと作動的に連結した状態であることを特徴とする、請求項17に記載のDNA分子。
- 転写シグナルは、バクテリオファージプロモーター、例えば、T7−プロモーター又はSP6−プロモーターであることを特徴とする、請求項18に記載のDNA分子。
- 請求項1から14までのいずれか1項に記載のウイルス、請求項15に記載のヌクレオカプシド、請求項16に記載のゲノム又は請求項17から19までのいずれか1項に記載のDNA分子を含有している細胞。
- ベクター増殖細胞であることを特徴とする、請求項20に記載の細胞。
- ウイルス産生細胞であることを特徴とする、請求項20に記載の細胞。
- さらに異種DNA依存性RNAポリメラーゼをコードするDNA分子を含有し、これは組換えマイナス鎖RNAウイルスをコードするDNA分子の転写を引き起こすことを特徴とする、請求項22に記載の細胞。
- ウイルス増殖細胞であることを特徴とする、請求項20に記載の細胞。
- さらにウイルスL、N又は/及びPタンパク質をコードするDNA分子を含有していることを特徴とする、請求項20から24までのいずれか1項に記載の細胞。
- 次の工程:
(a)遺伝子N、L及びPのうち少なくとも1つに、二次転写能力を欠損することなく、ゲノム複製能力の欠損を生じる突然変異、及び場合により少なくとも1つの異種遺伝子産物コード配列を含んでいる、マイナス鎖RNA−ウイルスのゲノムをコードするDNA分子でトランスフェクトした細胞を準備する工程、及び
(b)(a)によりDNAの転写が行われる条件下に細胞を培養し、かつ組換えマイナス鎖RNAウイルスが形成される工程
を含む請求項1から14までのいずれか1項に記載のマイナス鎖RNA−ウイルスの製造方法。 - ヌクレオカプシドの獲得又はマイナス鎖RNAウイルスからのウイルスゲノムの獲得を含む、請求項26に記載の方法。
- 次の工程:
(a)遺伝子N、L及びPのうち少なくとも1つに、二次転写能力を欠損することなく、ウイルスゲノム複製能力の欠損を生じる突然変異、及び場合により少なくとも1つの異種遺伝子産物コード配列を含んでいる、マイナス鎖RNA−ウイルスに感染させた細胞を準備する工程、及び
(b)ウイルスの増殖が行われる条件下に細胞を培養する工程
を含む請求項1から14までのいずれか1項に記載のマイナス鎖RNAウイルスの増殖方法。 - 請求項1から14までのいずれか1項に記載の組換えマイナス鎖RNAウイルス、請求項15に記載のヌクレオカプシド又は請求項16に記載のウイルスゲノムを作用物質として、ならびに場合により製剤学的に通常の担体又は/及び助剤を含有していることを特徴とする、医薬組成物。
- ワクチンとして使用するための請求項29に記載の医薬組成物。
- 単価又は多価ワクチンとしての請求項30に記載の医薬組成物。
- ウイルス感染に対するワクチンとしての、例えば、病原性マイナス鎖RNAウイルスでの感染に対するワクチンとしての、請求項30又は31に記載の医薬組成物。
- 抗腫瘍治療に使用するための請求項29に記載の医薬組成物。
- リスクのある患者で使用するための請求項29から33までのいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ヌクレオカプシドを天然ウイルスのエンベロープ中に含んでいる、請求項29から34までのいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1から14までのいずれか1項に記載の組換えマイナス鎖RNAウイルス、請求項15に記載のヌクレオカプシド又は請求項16に記載のウイルスゲノムを製造又は増殖するための、マイナス鎖RNAウイルスのタンパク質N、L又は/及びPを構成的又は誘発的に安定に発現した細胞の使用。
- 細胞は哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項36に記載の使用。
- 細胞は、細胞H29(DSM ACC2702)から選択されるか、又はこれに由来する細胞であることを特徴とする、請求項36又は37に記載の使用。
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