PL188546B1 - Wektor ekspresyjny antygenów lub przeciwciał, rekombinacyjny układ ekspresyjny i szczepionka do ochrony zwierząt - Google Patents

Wektor ekspresyjny antygenów lub przeciwciał, rekombinacyjny układ ekspresyjny i szczepionka do ochrony zwierząt

Info

Publication number
PL188546B1
PL188546B1 PL97328791A PL32879197A PL188546B1 PL 188546 B1 PL188546 B1 PL 188546B1 PL 97328791 A PL97328791 A PL 97328791A PL 32879197 A PL32879197 A PL 32879197A PL 188546 B1 PL188546 B1 PL 188546B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
mucosal
tropic
feline
rna
Prior art date
Application number
PL97328791A
Other languages
English (en)
Other versions
PL328791A1 (en
Inventor
Sanchez Luis Enjuanes
Duran Juan Plana
Villanueva Sara Alonso
Jarreno M Luisa Ballesteros
Castrillon Joaquin Castilla
Martinez José Manuel Gonzalez
Parmesan Ander Izeta
Zunzunegui Ana Mendez
Saenz Maria Muntion
Zoltan Penzes
Morgado José Manuel Sanchez
Sanchez Carlos Miguel Sanchez
Picazo Cristian Smerdou
Gurpegui Isabel Sola
Original Assignee
Iberica Cyanamid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iberica Cyanamid filed Critical Iberica Cyanamid
Publication of PL328791A1 publication Critical patent/PL328791A1/xx
Publication of PL188546B1 publication Critical patent/PL188546B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A61K39/225—Porcine transmissible gastroenteritis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C07K16/102—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/20064—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Wektor ekspresji antygenów zdolnych do indukowania ukladowych i wydzielni- czych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaznym wykazujacym tro- pizm do sluzówek, lub przeciwcial, które nadaja ochrone wzgledem wspomnianych czyn- ników zakaznych, przy czym antygeny lub przeciwciala prezentowane sa w przewodzie pokar- mowym i drogach oddechowych zwierzat traktowanych rekombinacyjnym ukladem ekspre- syjnym zawierajacym wspomniany wektor ekspresji, znamienny tym, ze obejmuje: a) wadliwy genom wirusowy pochodzacy z wirusa przenaszalnego zapalenia zoladka i je- lit swin (TGEV) lub komplementarne do niego DNA (cDNA), zawierajacy sygnaly rozpo- znania replikazy TGEV zlokalizowane na koncach 3' i 5', i, przynajmniej, promotor oraz b) przynajmniej sekwencje DNA kodujaca produkt wybrany z grupy skladajacej sie z (i) antygenu zdolnego do indukowania ukladowej i wydzielniczej odpowiedzi immunolo- gicznej przeciw czynnikowi zakaznemu wykazujacemu tropizm do sluzówek, i (ii) prze- ciwciala, które nadaje ochrone wzgledem wspomnianego czynnika zakaznego, przy czym wspomniana sekwencja DNA jest operacyjnie zwiazana z, przynajmniej, promotorem, któ- ry wystepuje we wspomnianym wadliwym genomie wirusowym pochodzacym z TGEV. 12. Szczepionka do ochrony zwierzat przed czynnikiem zakaznym wykazujacym tropizm do sluzówek, znamienna tym, ze zawiera uklad rekombinacyjny opisany w dowolnym z za- strzezen 5 do 1 1 w odpowiedniej ilosci, oraz farmaceutycznie dopuszczalna zaróbke. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresji antygenów zdolnych do indukowania układowych i wydzielniczych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, lub przeciwciał, które nadają ochronę względem wspomnianych czynników zakaźnych, obejmujący wadliwy genom wirusowy zawierający sygnały rozpoznania replikazy wirusowej umieszczone na końcach 3' i 5', ponadto obejmujący wewnętrzne delecje, i w którym wspomniany wadliwy genom wirusowy zależy od wirusa pomocniczego przy jego replikacji. Wektory te nadają się do tworzenia rekombinacyjnego układu ekspresyjnego obejmującego wspomniany wyżej wektor ekspresyjny, i wirus pomocniczy, który dostarcza białek funkcjonalnych i strukturalnych dla replikacji i enkapsydacji wadliwego genomu. Układ ten nadaje się do wytwarzania jedno- i wielowartościowych szczepionek przeciwko czynnikom zakaźnym różnych gatunków zwierzęcych, zwłaszcza świń, psów i kotów.
Uzyskiwanie białek rekombinacyjnych stosując wektory ekspresyjne jest faktem dobrze znanym. Zasadniczo, prokariotyczne i drożdżowe układy ekspresji są wysoce skuteczne i łatwe do zastosowania, podczas gdy stosowane układy ekspresji zawierające wyższe komórki eukariotyczne wykazują szereg wad w stosunku do niskich poziomów wytwarzania białek i ograniczeń co do zakresu gospodarzy. Z istniejących układów ekspresji wyższych komórek eukariotycznych, wektory oparte na bakulowirusie są najbardziej skuteczne w kategoriach wytwarzania białek. Jednak, można je tylko stosować w komórkach owadów, które jak wiadomo, glikozylują białka odmiennie niż to ma miejsce w komórkach zwierzęcych. Ponadto, budowa wirusa rekombinacyjnego odbywa się przez rekombinację homologiczną, co jest żmudną techniką, zwłaszcza gdy trzeba analizować liczne odmiany genetyczne.
Z drugiej strony, znane są wektory oparte na wirusach DNA nadające się do heterologicznej ekspresji genu. Jednak, stosowanie wektorów opartych na DNA wiąże się z licznymi wadami ponieważ nie są one niezawodne, jako że replikują się w jądrze komórki gospodarza i mogą zostać wbudowane w genom. Natomiast, stosowanie wektorów opartych na RNA przezwycięża wady związane ze stosowaniem wirusów DNA ponieważ, jako że replikują się
188 546 nie w genomie komórki gospodarza lecz w cytoplazmie, replikacja odbywa się przez RNA, a nie przez DNA, i możliwości wbudowania w genom są bardzo małe, co sprawia, że wektory oparte na tych wirusach RNA są bardziej niezawodne.
Dobrze znane są również cząstki wadliwie ingerujące (DI) zawierające kapsyd wirionu i wadliwy genom, które są mutantami delecji subgenomowej przeważnie wytworzonymi z genomów infekcji wirusowej przez błąd replikacji. Zasadniczo, określenie „cząstka DI” dotyczy wadliwych wirusów pozbawionych obszaru genomu RNA lub DNA, zawierającego białka i antygeny wirusa, wymagając koinfekcji macierzystego wirusa infekcyjnego (wirus pomocniczy) dla replikacji i które specyficznie oddziałują z homologicznym wirusem pomocniczym, ponieważ replikują się jego kosztem [Huang i Baltimore, Nature, 226, 325-327 (1970)]. Genomy DI powstają z reorganizacji genomu w wyniku przesunięć polimerazy RNA od jednego szablonu RNA do innego lub z jednego segmentu szablonu RNA do innego segmentu tej samej cząsteczki. Te genomy DI, po wytworzeniu, wzmacniają się same kosztem genomu macierzystego lub wirusa wzmacniającego kodującego białka związane z replikacją i enkapsydacją i muszą współzawodniczyć z genomami wadliwymi dla takich produktów.
Otrzymano i scharakteryzowano cząstki DI z pewnych koronawirusów, takich jak mysi wirus zapalenia wątroby (MHV), wirus infekcyjny zapalenia oskrzeli (D3V) i bydlęcy koronawirus (BCV), chociaż nie opisano cząstek DI wyprowadzonych z przenaszalnego wirusa zapalenia żołądka i jelit świni (TGEV). Jedną z naturalnych cząstek DI MHV użyto jako podstawę do opracowania wektora ekspresji, w którym egzogenny gen jest wstawiony pod kontrolą sekwencji transkrypcji wewnętrznego promotora [Lin i Lai, J. Virol., 6110-6118, Oct. (1993)].
Zasadniczo, znane heterologiczne wektory ekspresyjne genu oparte na cząstkach DI mają pewne wady związane z ich specyfiką gatunku i organu docelowego i ich ograniczoną zdolnością do klonowania, ograniczającą ich możliwości stosowania, zarówno w badaniach podstawowych jak i w zastosowaniu do opracowywania takich wektorów do celów terapeutycznych, włączając w to szczepionki.
W konsekwencji, istnieje wciąż potrzeba heterologicznych wektorów ekspresji genu, które mogą pomyślnie przezwyciężyć wspomniane wady. W szczególności, byłoby wysoce korzystne, gdyby były dostępne pewne heterologiczne wektory ekspresyjne genu o wysokim poziomie bezpieczeństwa i zdolności klonowania i które mogłyby być tak zaprojektowane, by ich specyficzność gatunku i tropizm mogły być łatwo kontrolowane.
Niniejszy wynalazek dostarcza rozwiązanie istniejącego problemu, obejmując wektor oparty na rekombinacyjnym wadliwym genomie wirusowym ekspresjonującym antygeny nadające się do indukowania reakcji immunologicznej i dla zapobiegania infekcjom spowodowanych przez różne czynniki zakaźne u różnych gatunków zwierzęcych. Heterologiczne wektory ekspresyjne genu (lub sekwencje DNA) dostarczone przez niniejszy wynalazek charakteryzuje wysoki poziom bezpieczeństwa, jak również wysokie zdolności klonowania i mogą one być zaprojektowane tak, by ich specyficzność gatunku i tropizm mogły być łatwo kontrolowane, czyniąc takie wektory odpowiednimi dla formułowania szczepionek zdolnych do zapewnienia ochrony przed infekcjami spowodowanymi przez różne czynniki zakaźne u różnych gatunków zwierzęcych.
Przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny antygenów zdolnych do indukowania układowych i wydzielniczych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, lub przeciwciał które nadają ochronę względem wspomnianych czynników zakaźnych, przy czym antygeny lub przeciwciała prezentowane są w przewodzie pokarmowym i drogach oddechowych zwierząt traktowanych rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym wspomniany wektor ekspresyjny, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) wadliwy genom wirusowy pochodzący z wirusa przenaszalnego zapalenia żołądka i jelit świń (TGEV) lub komplementarne do niego DNA (cDNA), zawierający sygnały rozpoznania replikazy TGEV zlokalizowane na końcach 3' i 5', i, przynajmniej, promotor oraz
b) przynajmniej sekwencję DNA kodującą produkt wybrany z grupy składającej się z (i) antygenu zdolnego do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek, i (ii) przeciwciała, które nadaje ochronę względem wspomnianego czynnika zakaźnego, przy czym wspomniana se6
188 546 kwencja DNA jest operacyjnie związana z, przynajmniej, promotorem, który występuje we wspomnianym wadliwym genomie wirusowym pochodzącym z TGEV.
Korzystnie wspomniany wadliwy genom wirusowy pochodzący z TGEV lub cDNA komplementarne do niego zawiera ponadto kompletną sekwencję kodującą replikazę TGEV.
Korzystnie wektor zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inny antygen zdolny do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek.
Korzystnie wektor zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inne przeciwciało, które nadaje ochronę względem czynnika zakaźnego wykazującego tropizm do śluzówek.
Przedmiotem wynalazku jest również rekombinacyjny układ ekspresyjny do ekspresji antygenów zdolnych do indukowania układowych i wydzielniczych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, lub przeciwciał które nadają ochronę względem wspomnianych czynników zakaźnych, przy czym antygeny lub przeciwciała prezentowane są w przewodzie pokarmowym i drogach oddechowych zwierząt traktowanych rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym wspomniany wektor ekspresyjny, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
(a) wektor ekspresyjny antygenów zdolnych do indukowania układowych i wydzielniczych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, lub przeciwciał które nadają ochronę względem wspomnianych czynników zakaźnych, opisanych wyżej; i (b) wirus pomocniczy.
Korzystnie wspomniany wektor zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inny antygen zdolny do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek.
Korzystnie układ zawiera różne wektory ekspresyjne opisane wyżej, przy czym każdy z nich zawiera inną sekwencję DNA, kodującą inny antygen zdolny do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek.
Korzystnie wspomniany wektor zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inne przeciwciało, które nadaje ochronę względem czynnika zakaźnego wykazującego tropizm do śluzówek.
Korzystnie układ zawiera różne wektory ekspresyjne opisane wyżej, przy czym każdy z nich zawiera inną sekwencję DNA kodującą inne przeciwciało, które nadaje ochronę względem innego czynnika zakaźnego wykazującego tropizm do śluzówek.
Korzystnie wspomniany wirus pomocniczy dostarcza funkcjonalne i strukturalne białka do replikacji i enkapsydacji wadliwego genomu wirusowego pochodzącego z TGEV.
Korzystnie wspomniany wirus pomocniczy dostarcza białka strukturalne do enkapsydacji wadliwego genomu wirusowego pochodzącego z TGEV.
Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka do ochrony zwierząt przed czynnikiem zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, charakteryzująca się tym, że zawiera układ rekombinacyjny opisany wyżej w odpowiedniej ilości, oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
Korzystnie szczepionka do ochrony świń przed czynnikami zakaźnymi świń wykazującymi tropizm do śluzówek, zawiera:
(a) rekombinacyjny układ ckspresyjjay wybrany z sł^^^o^^y^pcej się z:
(i) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego przynajmniej jeden wektor ekspresyjny zawierający przynajmniej jedną sekwencję DNA kodującą antygen patogenu świń wykazującego tropizm do śluzówek;
(ii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego wektor ekspresyjny zawierający więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje antygen innego patogenu świń wykazującego tropizm do śluzówek; i (iii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego różne wektory ekspresyjne opisane wyżej, przy czym każdy z nich zawiera przynajmniej sekwencję DNA kodującą antygen patogenu świń wykazującego tropizm do śluzówek; i
188 546 (b) koronawirus świń jako wirns pomocniczy.
Korzystnie wspomniany patogen świń wybiera się z grupy składającej się z: Actinobacillus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, parwowirus świń, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Serpulina hyodysenteriae, Mycoplasma hyopneumoniae, wirus epidemicznej biegunki świń (PEDV), koronawirus oddechowy świń, rotawirus, lub względem patogenów wywołujących zespół rozrodczo-oddechowy świń, chorobę Aujeszky'ego świń (pseudowścieklizna), grypę świń lub przenaszalne zapalenie żołądka i jelit oraz czynników etiologicznych zanikowego nieżytu nosa i proliferatywnego zapalenia jelita krętego.
Korzystnie, szczepionka do ochrony psów przed czynnikami zakaźnymi psów wykazującymi tropizm do śluzówek, zawiera:
(a) rekombinacyjny układ ekspresyjny wybrany z grupy składającej się z:
(i) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego przynajmniej jeden wektor ekspresyjny zawierający przynajmniej jedną sekwencję DNA kodującą antygen patogenu psów wykazującego tropizm do śluzówek;
(ii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego wektor ekspresyjny zawierający więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje antygen innego patogenu psów wykazującego tropizm do śluzówek; i (iii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego różne wektory ekspresyjne opisane wyżej, przy czym każdy z nich zawiera przynajmniej sekwencję DNA kodującą antygen patogenu psów wykazującego tropizm do śluzówek; i (b) wirus pomocniczy wybrany z grupy składającej się z: koronawirusa psów i rekombinacyjnego koronawirusa świń z ekspresją białka otoczki rozpoznawanego przez specyficzne receptory powierzchniowo-komórkowe na komórkach docelowych psów.
Korzystnie wspomniany patogen psów wybrany jest z grupy składającej się z: herpeswirusów psów, adenowirusa typu 1 lub 2 psów, parwowirusa typu 1 lub 2 psów, reowirusa psów, rotawirusa psów, koronawirusa psów-; wirusa grypy rzekomej psów, wirusa grypy psów, wirusa nosówki, wirusa wścieklizny, retrowirusa i kaliciwirusa psów.
Korzystnie, szczepionka do ochrony kotów przed czynnikami zakaźnymi kotów wykazującymi tropizm do śluzówek, zawiera:
(a) rekombinacyjny układ ekspresyjny wybrany z grupy składającej się z:
(i) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego przynajmniej jeden wektor ekspresyjny zawierający przynajmniej jedną sekwencję DNA kodującą antygen patogenu kotów wykazującego tropizm do śluzówek;
(ii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego wektor ekspresyjny zawierający więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje antygen innego patogenu kotów wykazującego tropizm do śluzówek; i (iii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego różne wektory ekspresyjne opisane wyżej, przy czym każdy z nich zawiera przynajmniej sekwencję DNA kodującą antygen patogenu kotów wykazującego tropizm do śluzówek; i (b) wirus pomocniczy wybrany z grupy składającej się z: koronawirusa kotów i rekombinacyjnego koronawirusa świń z ekspresją białka otoczki rozpoznawanego przez specyficzne receptory powierzchniowo-komórkowe na komórkach docelowych kotów.
Korzystnie wspomniany patogen kotów wybrany jest z grupy składającej się z: kalciwirusa kotów; wirusa niedoboru odporności kotów, herpeswirusów kotów, wirusa panleukopenii kotów, reowirusa kotów, rotawirusa kotów, koronawirusa kotów, wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, wirusa wścieklizny, Chlamydia psittaci kotów i wirusa białaczki kotów;
Korzystnie rekombinacyjny układ ekspresyjny zawiera przynajmniej jeden wektor ekspresyjny zawierający przynajmniej sekwencję DNa kodującą przeciwciało monoklonalne identyfikowane jako 6A.C3 zdolne do neutralizowania TGEV.
Krótki opis figur.
Figura 1 przedstawia budowę TGEV. Wirion jest sferyczną cząstką składającą się z otoczki lipidowej, w której wnętrzu jest jednołańcuchowa, o dodatniej polamości cząsteczka RNA o 28,5 kilozasadach (kb). To RNA jest związane z N białkiem tworzącym nukleokapsyd.
188 546
W błonie są zawarte białka strukturalne M i sM. Białko S grupuje się w trimery, i jest zakotwiczone na zewnętrznej części otoczki tworząc peplomery.
Figura 2 przedstawia genomową organizację czterech sekwencjonowanych koronawirusów: MHV, IbV, HCV229E (ludzki koronawirus 229E) i TGEV. Otwarte ramki odczytu kodujące każde białko przedstawiono w skali. W każdym genomie, początek RNA ekspresjonujących każdy wirus wskazano strzałką. Liczba informacyjnych RNa (mRNA) ekspresjonowanych przez wirusy MHV lub TGEV może się zmieniać zależnie od szczepu wirusa. Na tym szkicu, strzałki TGEV odpowiadają mRNA ekspresjonowanym przez szczep THER-1. mRNA są 3'-koterminalne i numerowane malejąco.
Figura 3 przedstawia ekspresję genomu TGEV, szczep THER-1. Wskazano ustawienie otwartych ramek odczytu (ORF) w genomie; Pol, polimeraza; S, sM, M i N, białka strukturalne; nsp 3a, 3b i 7, białka nie-strukturalne (białko 3b nie jest wytwarzane przy użyciu tego wirusa). Genom jest transkrybowany w RNA o równej długości, lecz ujemnej polarności (-), który będzie służyć jako matryca dla syntezy 7 mRNA (1 do 7). W każdym mRNA są przedstawione: wspólna sekwencja, lider, koniec 5' (kwadrat), odcinek poliadeninowy przy końcu 3' i strefa translowana w każdy z nich (linie pogrubione).
Figura 4 przedstawia zmianę miana izolatów TGEV THER-1 (A) i PUR46-mar 1CC 12 (B) wraz z liczbą pasażowań przy wysokiej krotności infekcji (m.o.i.) w komórkach ST.
Figura 5 przedstawia wyniki analizy elektroforetycznej RNA wytworzonych w komórkach ST infekowanych wirusem THER-1 pasażowanych 46 razy przy wysokim m.o.i. Liczbę pasażowania wskazano powyżej każdego paska i kreski po lewej wskazują pozycje markerów masy cząsteczkowej (markery genomowego RNA TGEV i GibcoBRL), wyrażoną w kb. Kreski po prawej wskazują mRNAs TGEV i wadliwie ingerujące (DI) RNA. NI, nieinfekowane.
Figura 6 przedstawia wyniki próby Northem-blot RNA komórek ST infekowanych wirusem THER-1p35.
Figura 7 przedstawia wyniki próby Northem-blot RNA z rozcieńczonego pasażowania wirusa THER-1-STp41 w komórkach ST.
Figura 8 przedstawia wpływ zmiany linii komórkowej na propagacje wadliwych A, B i C RNA. Wirus THER-1-STp46 nierozcieńczony pasażowano dziesięć razy w IPEC (komórki nabłonka jelit świni), i pięć razy w komórkach PM (makrofag świni). Figury 8A i 8B: zmiana miana wirusa wraz z liczbą pasażowania w IPEC i PM, odpowiednio. Figura 8C: analiza RNA komórek ST infekowanych wirusem z pasażowania 1 i 10 w IPEC (przez metaboliczne znakowanie 32P,) lub pasażowania 1 i 5 w komórkach PM (przez hybrydyzację z jednym oligonukleotydem komplementarnym do wiodącego RNA).
Figura 9 przedstawia enkapsydację wadliwych genomów A, B i C. Figura 9A przedstawia żel agarozowy wybarwiony bromkiem etydyny, w którym RNA wyekstrahowane z oczyszczonych wirionów z pasażowania 1 i z pasażowania 41 zanalizowano za pomocą odwirowania przez podkładkę z 15% sacharozy (wag./obj.). Na pasku pasażowania 41, można zaobserwować RNA A, B i C, jak również macierzysty genom. Kreski po lewej stronie wskazują markery ruchliwości w kb. Figura 9B przedstawia wyniki analizy RNA wirionów (pasażowanie 41) oczyszczonych przez odwirowanie przez podkładki z sacharozy lub ciągły gradient, z użyciem metody Northem-blot z oligonukleotydem komplementarnym do lidera RNA. W charakterze markerów użyto handlowe RNA GibcoBRL i RNA z wirionów z pasażowania 1 (pasek a). Paski b i c, RNA wyekstrahowane z wirionów sedymentowanych przez podkładki z 31% i 15% sacharozy (wag./obj.), odpowiednio. Paski d i e, RNA wyekstrahowane z wirusa oczyszczonego przez ciągłą podkładkę z sacharozy, przy gęstości 1,20 i 1,15 g/ml, odpowiednio.
Figura 10 przedstawia strategię klonowania wadliwych DI-B i DI-C RNA, w których można zaobserwować schematyczną reprezentację komplementarnych fragmentów DNA (cDNA) otrzymanych przez RT-PCR, stosując jako matrycę genomowy RNA o całkowitej długości (A), DI-B (B) i DI-C (C). Linie kropkowane wskazują brak przewidywanego fragmentu wskutek jego dużej wielkości. Wadliwe RNA klonowano w czterech nakładających się fragmentach (a, b, c i d), przedstawionych jako linie; liczby poniżej tych linii wskazują wielkość fragmentu oznaczoną w żelu agarozowym. Oligonukleotydy użyte jako startery i ich po188 546 larności wskazano za pomocą strzałek oraz liczb. Sekwencję oligonukleotydową przedstawiono w tabeli 1. Prostokąty w paski lub niewypełnione w (A) wskazują względną pozycję genów wirusowych: POL, polimeraza; S, M i N, geny strukturalne; 3a, 3b, sM i 7, małe ORF; cieniowane cienkie prostokąty wskazują sekwencję lidera.
Figura 11 przedstawia wyniki analizy elektroforetycznej produktów PCR otrzymanych przy amplifikacji wadliwych RNA. RNA oczyszczonych wirionów THER-1p1 lub THER-1 p41 użyto jako matrycę w reakcji RT-PCR z oligonukleotydami 1 i 2 (a), 3 i 4 (b), 5 i 6 (c), lub 7 i 8 (d), których sekwencje i pozycje w macierzystym genomie wskazano w tablicy 2. W każdym przypadku wskazano pasek odpowiadający matrycy RNA z pasażowania 1 (macierzysty genomowy RNA) lub z pasażowania 41 (macierzysty RNA, DI-A, DI-B i DI-C), i pasek markerów ruchliwości DNA (M, GibcoBRL). Liczby pogrubione wskazują wielkość w kb produktów amplifikacji specyficznych dla wadliwych RNA. B+C RN RNA A, B i C: oczyszczone pasma w eksperymencie, gdzie RNA wirusa THER-1 STp41 frakcjonowano w żelu. B i C RNA migrują bardzo ściśle i otrzymano je jako pojedyncze pasmo.
Figura 12 przedstawia pełną sekwencję RNA DI-C cDNA (patrz SEQ. ID. nr 24) otrzymaną przez sekwencjonowanie nakładających się fragmentów klonowania a, b, c i d. RNA DI-C utrzymało cztery nieciągłe obszary macierzystego genomu: I, II, III i IV. Miejsca flankowania tych obszarów wskazano strzałkami. Wskazano translacje trzech ORF obecnych w genomie DI-C: chimeryczna ORF o 6,7 kb wynikła z fuzji nieciągłych obszarów I i II w fazie; miniORF trzech aminokwasów poprzedzających go w fazie, i ORF, którą zapoczątkowuje AUG genu S. Wysoce homologiczne obszary - w domenach białkowych opisanych dla innych koronawirusów niż odpowiedzialne za aktywność polimerazy i helikazy, i miejsca wiązania jonów metali - zacieniowano. Sekwencje promotora transkrypcji CTAAAC zacieniowano. Zacieniowano nakładającą się powierzchnię między ORF 1a i 1b (41 nukleotydów), podkreślono „śliską” sekwencję rybosomu, i kodon terminacji ORF1a w prostokącie. W pozycjach 637, 6397 i 6485 wskazano specyficzne zmiany względem macierzystego genomu. Wskazano nukleotydy obecne w macierzystym genomie w tych pozycjach.
Figura 13 przedstawia schemat budowy RNA DI-C. Całkowitą długość genomu podano po prawej stronie prostokątów. RNA DI-C zawiera cztery nieciągłe obszary genomu TGEV (I, II, HI i IV). Obszzry te obejmują21 kk końca 5' genomu,prawie pełny ORhF b włąązzjąą w to nakładającą się powierzchnię między ORF 1a i 1b, inicjację genu S, niepełny ORF7 i nietranslowany obszar 3'. Litery i liczby powyżej prostokąta macierzystego genomu wskazują geny wirusów. Liczby poniżej prostokąta wskazują pozycje flankujących nukleotydów nieciągłych obszarów w macierzystym genomie, przyjmując jako odniesienie sekwencję izolatu TGEV PUR46-PAR. W prostokącie odpowiadającym RNA DI-C, wskazano w nukleotydach długość czterech nieciągłych obszarów. W trzecim prostokącie wskazano liczbę nukleotydów wyprowadzonych z każdego genu wirusowego, uwzględniając, że ORF 1a i 1b nakładają się wzajemnie z 43 nukleotydami w macierzystym genomie. ORF przewidziane w analizie komputerowej wskazano strzałkami lub grotami strzałek. Pnt, pseudowęzeł; Poi, polimeraza; Mib, wiązanie jonu metalu; Hel, helikaza; Cd, domena zachowana.
Figura 14 przedstawia budowę RNA DI-B. RNA DI-B zawiera trzy nieciągłe obszary (I, II i III) genomu TGEV, obejmując 2,1 kb końca 5' genomu, pełny ORF1 b włączając w to nakładającą się powierzchnię między ORFs 1a i 1b, inicjację genu S, terminację ORF7, i nietranslowany obszar końca 3'. Litery i liczby nad prostokątem macierzystego genomu wskazują geny wirusowe. Liczby pod prostokątem wskazują pozycje w macierzystym genomie flankujących nukleotydów nieciągłych obszarów, przyjmując jako odniesienie sekwencje izolatu TGEV PUR46-PAR. Heterogenność wymiarów delecji występującej między nieciągłymi obszarami II i III jest odpowiedzialna za faktyczne istnienie populacji genomu DI-B. W drugim i trzecim prostokącie wskazano długość nukleotydów trzech nieciągłych obszarów dla genomów o genomach największym i najmniejszym, odpowiednio. W trzecim prostokącie wskazano liczbę nukleotydów wyprowadzonych z każdego genu wirusowego, uwzględniając, że ORFs 1a i 1b nakładają się wzajemnie dla 43 nukleotydów w macierzystym genomie. ORF przewidziane przez analizę komputerową wskazano strzałkami lub grotami strzałek. Pnt, pseudowęzeł; Pol, polimeraza; Mib, wiązanie jonu metalu; Hel, helikaza; Cd, domena zachowana.
188 546
Figura 15 przedstawia drugorzędową i trzeciorzędową strukturę RNA w strefie nakładania się między ORF 1a i 1b w RNA DI-C. (A) Struktura przewidziana, gdy rozpatruje się obszar najbliższy strukturze widełkopodobnej wykazującej komplementarność względem nukleotydów węzła, tym samym tworząca pseudowęzeł (nukleotydy 2354 do 2358). „Śliską” sekwencję UUUAAAC podkreślono. Kodon terminacji ORF 1a wskazano w prostokącie. (B) Schematyczna reprezentacja tego .pseudowęzła, obejmującego dwa odcinki komplementamości sekwencji (trzony: S1 i S2). Śliską sekwencję przedstawiono w prostokącie. (C) Alternatywny model uwzględniający sekwencję nukleotydu 2489 do 2493 w złożeniu pseudowęzła. Struktura ta zawiera dodatkowy odcinek sekwencji komplementamości (rdzeń). (D) Schematyczne przedstawienie pseudowęzła, w którym zaznaczono trzy rdzenie: S1, S2 i S3.
Figura 16 przedstawia mapowanie RNA DI przez hybrydyzację z oligonukleotydami specyficznymi względem wirusa w próbach Northem-blot. RnA wirusa THER-1-STp41 frakcjonowano w żelu agarozowym do wyraźnego oddzielenia RNA genomu macierzystego i otrzymano DI A, B i C. RNA przeniesiono do filtrów nylonowych, które hybrydyzowano z szeregiem oligonukleotydów znaczonych 32Pi, hybrydyzowano z genomem macierzystym (+), i hybrydyzowano (+) lub nie (-) z wadliwymi genomami. Przybliżone umiejscowienie sekwencji komplementarnych do oligonukleotydów w macierzystym genomie wskazano przez strzałki. Ich dokładną sekwencję i pozycję wskazano w tablicy 3. Wszystkie oligonukleotydy hybrydyzowano z macierzystym genomem i dały one spodziewane wyniki z RNA B i C.
Figura 17 przedstawia szkic sposobu otrzymywania wirusów szczepionkowych przez transfekcję zainfekowanych komórek RNA DI-C. Przedstawiono zarys prototypu z budową, która umożliwiła wytwarzanie DI-C RNA przez transkrypcje in vitro, utrzymując końce 5' i 3' obecne w oryginalnej wadliwej cząstce. Sekwencję promotora T7 [PrT7] i sekwencję autokatalitycznego rybozymu wirusa zapalenia wątroby delta (HDV) [Rz HDV] klonowano flankując sekwencję DI-C RNA. Pozycję z autokatalitycznego cięcia wprowadzoną przez rybozym zaznaczono powyżej sekwencji. Strzałki wskazują pozycje sekwencji promotora wewnętrznej transkrypcji utrzymane w naturalnej formie w RNA DI-C. L, lider. T7φ, T7 sygnały zakończenia transkrypcji bakteriofaga. Odzyskano wiriony enkapsydujące wirus pomocniczy jak również wadliwe genomy, w których sklonowano geny heterologiczne, gdy RNA transkrybowane in vitro transfekowano do komórek ST zainfekowanych odpowiednim wirusem pomocniczym.
Figura 18 przedstawia zarys prototypu struktury, która umożliwiła wytwarzanie pDIA6A.C3 przez transkrypcję in vitro, utrzymując końce 3' i 5' obecne w oryginalnej wadliwej cząstce. Sekwencję promotora T7 bakteriofaga [PrT7] i obecność autokatalitycznego rybozymu wirusa zapalenia wątroby delta (HDV) [RzHDV] klonowano flankując sekwencję cDNA kodującą autoreplikatywny RNA. Plazmid pDIA6A.C3 zawiera gen kodujący przeciwciało monoklonalne 6A.C3, które neutralizuje TGEV [patrz przykład 4], Klonowanie heterologicznego genu wykonano według ORF1 b, po kodonie inicjacji genu S (AUG), i w fazie odczytu tego genu (IGS: sekwencja międzygenowa; L: sekwencja lidera; D: region zróżnicowania; J: region łączenia; VH: region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny; CH: region stały łańcucha ciężkiego immunoglobuliny; VK: region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny; CK: region stały łańcucha lekkiego immunoglobuliny; polyA: sekwencja polyA; T7 φ: terminator transkrypcji T7).
Niniejszy wynalazek dostarcza heterologiczne wektory ekspresyjne DNA, oparte na rekombinacyjnych wadliwych genomach wirusowych ekspresjonujących co najmniej jeden antygen nadający się do indukowania reakcji immunologicznej względem różnych czynników zakaźnych różnych gatunków zwierzęcych, lub jedno przeciwciało nadające ochronę względem czynnika zakaźnego, z zapewnionym wysokim bezpieczeństwem i zdolnością klonowania, i które mogą być zaprojektowane, tak by ich specyficzność gatunku i tropizm mogły być łatwo kontrolowane.
Określenie „czynnik zakaźny” w sensie, w którym jest stosowany w tym opisie obejmuje jakikolwiek wirusowy, bakteryjny lub pasożytniczy czynnik zakaźny, mogący infekować zwierzę i powodować patologię.
Określenie „gatunek zwierzęcy” obejmuje zwierzęta jakiegokolwiek gatunku, zwykle ssaki, a zwłaszcza świnie, psa lub kota.
188 546
W specyficznym wykonaniu niniejszego wynalazku, wektory ekspresyjne otrzymuje się w oparciu o rekombinacyjne wadliwe genomy wirusowe rksprrsjonujące antygeny zdolne do indukowania układowych i wedzielniczech reakcji immunologicznych, do zapobiegania infekcjom śluzówkowym, zaprojektowane tak, by umożliwić łatwą kontrolę specyficzności gatunku i ich tropizm względem infekcji śluzówek jelitowych lub oddechowych, co czyni je całkiem odpowiednimi do indukowania odporności śluzówkowej i laktogenicznej, o szczególnym znaczeniu w ochronie nowonarodzonych zwierząt względem infekcji jelit. W innym specyficznym wykonaniu niniejszego wynalazku, jest dostarczony wektor ekspresyjny oparty na Kombinacyjnym wadliwym genomie wirusowym ekspresjonującym co najmniej jedno przeciwciało zapewniające ochronę względem czynnika zakaźnego.
Wektory ekspresyjne otrzymane za pomocą niniejszego wynalazku obejmują wadliwy genom wirusowy wyprowadzony z wirusa, korzystnie, wirusa z genomem RNA i dodatnią polamością, który utrzymuje końce 3' i 5' wirusa macierzystego, ma wewnętrzne drlecje i zależy od wirusa pomocniczego przy jego replikacji. Zatem, wynalazek dostarcza ponadto wadliwy genom wirusowy obejmujący genom macierzystego wirusa zawierający sygnały rozpoznania replikazy wirusowej umieszczone przy końcach 3' i 5', obejmując także wewnętrzne delrcje, przy czym wspomniany wyżej wadliwy genom wirusowy zależy od wirusa pomocniczego dostarczającego funkcjonalne i strukturalne białka dla replikacji i enkapsydacji rekombinacyjnego wadliwego genomu wirusowego. W specyficznym wykonaniu, wadliwy genom wirusowy obejmuje, dodatkowo, pełną sekwencję kodującą macierzystą replikazę wirusa. W tym przypadku, jeśli jest to pożądane, wirus pomocniczy może dostarczyć tylko strukturalne białka wymagane dla enkapsydacji KOmbinacyjnego wadliwego genomu wirusowego lub, alternatywnie, funkcjonalne i strukturalne białka dla replikacji i enkapsydacji rekombinacyjnego wadliwego genomu wirusowego. Gdy wirus, z którego pochodzi rekombinacyjny wadliwy genom jest wirusem z genomem RNA, wektor ekspresyjny obejmuje cDNA komplementarny do wspomnianego wyżej wadliwego RNA lub cDNA zasadniczo komplementarnego do wspomnianego wyżej wadliwego RNA.
Wektory dostarczone przez niniejszy wynalazek mają wysoką zdolność klonowania -co najmniej 18 kb- co jest największą zdolnością klonowania opisaną dla wektora opartego na eukariotycznych wirusach RNA. Dodatkowo, wektory te mają wysoki poziom bezpieczeństwa, ponieważ (a) są oparte na wadliwych genomach, (b) obejmują genomy RNA i nie stosują DNA jako pośrednika replikacejnego, i c) są oparte na wirusach rosnących w cytoplazmie infekowanych komórek, przy czym wszystko to zapobiega, by wadliwy genom uległ rekombinacji w chromosomie komórki.
W specyficznym wykonaniu niniejszego wynalazku, opisano uzyskiwanie wadliwych genomów RNA wyprowadzonych z koronawirusów, w szczególności z TGEV. Genomy te mają dodatkową zaletę polegająca na bardzo niskiej częstotliwości rekombinacji TGEV (<1 x 109), co zapobiega temu, by wadliwy genom łatwo rekombinował z genomem wirusa pomocniczego. Jednak chociaż ta rekombinacja mogłaby faktycznie zachodzić, otrzymanoby osłabiony wirus, gdyż wynalazek rozpatruje dogodność stosowania tego samego osłabionego wirusa zarówno jako wirusa pomocniczego jak również i materiału wyjściowego do uzyskiwania wadliwego genomu.
Wadliwe genomy stanowiące podstawę takich wektorów mogą być otrzymane' w różnych układach komórkowych za pomocą nierozcirńczonrgo seryjnego pasaż.owania wirusa, z którego są wyprowadzone. Częstotliwość tworzenia cząstki DI może się bardzo zmieniać w różnych układach komórka-wirus; z tego względu zalecane jest wykonywanie pasażowania z różnymi izolatami wirusów w różnych liniach komórkowych w celu wyboru właściwego izolatu i linii komórkowej. Po pewnej liczbie pasażowań, wirusy są izolowane i następnie stosowane do analizy wewnątrzkomórkowych RNA wytworzonych w infekcji w celu zaobserwowania możliwego pojawienia się pasm nie odpowiadających jakiemukolwiek wirusowemu mRNA, w którym to przypadku, by zanalizować charakter tych nowych RNA (subgenomowe lub wadliwe) kontynuuje się nirrozcirńczonr seryjne paskowania z macierzystym wirusem. Po pewnych pasażowaniach, analizuje się ewolucje wzoru RNA przez całe seryjne paskowania i, w tym celu, komórki odpowiedniego układu komórkowego są infekowane wirusami pochodzącymi z różnych pasażowań i wytworzone' RNA są analizowane za pomocą technik
188 546 konwencjonalnych, na przykład, metabolicznego znakowania 32P, lub hybrydyzacji z odpowiednim oligonukleotydem. Szczegółowy opis uzyskiwania i charakterystyki pewnych wadliwych RNA wyprowadzonych z TGEV wykonano w przykładzie 1.
W przypadku wadliwych RNA jest możliwe otrzymanie odpowiednich cDNA - komplementarnych lub zasadniczo komplementarnych do wspomnianego wyżej wadliwego RNA, za pomocą reakcji odwrotnej transkryptazy (R.T) i amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR), dalej oznaczanych RT-PCR. Po tym, jest możliwe klonowanie cDNA w odpowiednich plazmidach, np. Bluescript II, pod kontrolą skutecznych promotorów. Uzyskane plazmidy zawierają wadliwy genom wirusowy pod kontrolą pewnych elementów regulacyjnych, zawierających sygnały dla regulacji i kontroli replikacji oraz dla inicjacji i zakończenia transkrypcji i translacji. Zatem, te plazmidy mogą zawierać sekwencje polyA, autokatalityczne sekwencje cięcia lub dla rozpoznania enzymów restrykcyjnych umożliwiających wstawienie heterologicznego DNA, i odpowiednich sygnałów regulacji, kontroli i zakończenia.
Tak otrzymane plazmidy, zawierające wadliwy genom, lub odpowiednie cDNA, mogą być manipulowane za pomocą konwencjonalnych technik inżynierii genetycznej, aby klonować ze zwiększoną skutecznością, co najmniej, jedną heterologiczną sekwencję DNA kodującą specyficzną aktywność, pod kontrolą promotora genu obecnego w wadliwym genomie lub jakiegokolwiek innego promotora wirusa, z którego pochodzi ten wadliwy genom lub odmiana tych promotorów, i sekwencji regulacyjnych zawartych w uzyskanym wektorze ekspresji. Przykład 2 opisuje tworzenie wektorów ekspresji kodujących antygeny zdolne do indukowania ochrony względem różnych wirusów.
Wektory ekspresyjne otrzymane według niniejszego wynalazku mogą wyrażać jedną lub więcej aktywności, takich jak jeden lub więcej antygenów, zdolnych do indukowania reakcji immunologicznych względem różnych czynników zakaźnych, lub jedno lub więcej przeciwciał zapewniających ochronę względem jednego lub więcej czynników zakaźnych. W jednym specyficznym i korzystnym wykonaniu, wektory te ekspresjonują co najmniej jeden antygen zdolny do indukowania układowej reakcji immunologicznej lub śluzówkowej reakcji immunologicznej względem różnych czynników zakaźnych rozprzestrzeniających się w śluzówkach oddechowych lub jelitowych. W innym specyficznym i korzystnym wykonaniu, wspomniane wektory ekspresyjne ekspresjonują co najmniej jeden gen kodujący łańcuchy - ciężki i lekki - przeciwciała jakiegokolwiek izotypu (np.: IgG1, IgA, itp.) nadającego ochronę względem czynnika zakaźnego. W specyficznym przypadku ekspresjonowanym przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne określone jako 6A.C3 (patrz przykład 4), które neutralizuje TGEV, ekpresjonowane z izotypami IgG1 lub IgA, w którym stała część immunoglobuliny pochodzi ze świni.
W specyficznym wykonaniu niniejszego wynalazku, klonowanie heterologicznych genów w plazmidzie, zawierającym jeden cDNA wadliwego RNA wyprowadzonego z niego, wykonano według ORF1b, po kodonie inicjacji genu S (AUG), i w ramce odczytu tego genu (przykład 2). Alternatywnie, heterologiczne sekwencje DNA mogą być klonowane w innych obszarach genomu, np. w strefach odpowiadających ORF 1, 2 lub 3 TGEV. Z uzyskanych plazmidów, ekspresjonowano RNA stosując odpowiednią polimerazę, przy użyciu której odpowiednie komórki - uprzednio infekowane osłabionym wirusem pomocniczym - transformowano, umożliwiając odzyskanie wirionów zawierających genom wirusa pomocniczego i inne wiriony wadliwego genomu (figura 17).
Alternatywnie, wektory ekspresyjne według niniejszego wynalazku umożliwiają ekspresję jednego lub więcej genów stosujących strategię opisaną powyżej. W tym celu, można stosować jeden lub szereg promotorów, lub promotor i szereg wewnętrznych miejsc wejścia rybosomu (IRES) lub, alternatywnie, szereg promotorów i wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu.
Niniejszy wynalazek także dostarcza rekombinacyjny układ ekspresyjny heterologicznych białek obejmujący (a) wektor opisany powyżej i (b) wirus pomocniczy, który ułatwia replikację i enkapsydację rekombinacyjnego wadliwego genomu wirusowego. Zatem, jest dostarczony rekombinacyjny układ ekspresyjny heterologicznych białek, oparty na rekombinacyjnych wadliwych genomach wirusowych ekspresjonujących białko z co najmniej jedną specyficzną aktywnością, obejmując:
a) rekombinacyjny cccktor zkwieraaący acadli wycenom wom owy,dlaktóragkt w tym przypadku, otrzymano cDNA, zdolne do podlegania manipulacji za pomocą kynwzndjykal188 546 nych technik inżynierii genetycznej, zawierający sygnały rozpoznania replikazy wirusowej umieszczone przy końcach 3' i 5', obejmując dodatkowo, wewnętrzne delecje, i co najmniej jedną wewnętrzną sekwencję DNA kodującą jedną aktywność, np. antygen zdolny do nadania układowej i śłuzówkowej odporności; lub przeciwciało nadające ochronę względem czynnika zakaźnego;i
b) wirus pons ocoiczy dostarczający funkcjonalne i struiluirdne białka dla rcpllikacji i cakapsydacji wadliwego genomu.
Alternatywnie, wspomniany wyżej rekombinacyjny układ ekspresyjny hceecologicznych białek obejmuje wektor ekspresyjny, typu opisanego powyżej, obejmując pełną sekwencję kodującą macierzystą replikazę wirusową i macierzysty wirus pomocniczy, który Czstąrcsa strukturalnych białek dla enkapsyCacji wadliwego genomu i, ewentualnie, funkcjonalnych białek (replikaza) dla replikacji wadliwego genomu wirusowego.
Układy te umożliwiają ekspresję antygenów zdolnych do indukowania reakcji immunologicznej lub przeciwciał, które nadają ochronę względem czynników zakaźnych, przez co nadają się do stosowania do celów szczepionek i ochrony przed infekcjami.
„Nadawanie odporności”, w sensie stosowanym w tym opisie, należy rozumieć jako rozpoczęcie w organizmie odbiorcy (zwierzę poddawane działaniu), przez układ rekzmbiaacyjny jak opisano powyżej, odpowiednich mechanizmów, takich jak komórki tworzące antygeny, limfocyty B i T, przeciwciała, substancje wzmagające reakcję immunologiczną komórki (inecclcukiny, inTerferony itp.), czynniki martwicy komórki i podobne substancje tworzące ochronę u zwierząt względem infekcji spowodowanych przez czynniki patogenne.
Szczepionki dostarczone przez niniejszy wynalazek mogą być jcCnzwactościzwc lub wiclzwartzścizwe, zależnie od tego czy wektory ekspresyjne obecne w układzie rekombiaacyjnym ekspresjonują jeden lub więcej antygenów zdolnych do indukowania reakcji immunologicznej względem jednego lub więcej czynników zakaźnych. Wektory ekspresyjne mogą być jednowartościzwe lub wiclowartościzwe zależnie od tego czy ekspcesjoanj:ą one jedno lub więcej przeciwciał nadających ochronę względem jednego lub więcej czynników zakaźnych. Specyficzność gatunku jest kontrolowana w taki sposób, że wirus pomocniczy będzie ekspresj zazwał białko otoczki odpowiednie dla rozpoznania przez receptory komórki odpowiedniego gatunku. Specyficzna grupa szczepionek otrzymanych według mniejszego wynalazku obejmuje jako wirus pomocniczy kocoaawirns, korzystnie kzronawicus świni, psa lub kota.
Szczepionki te są szczególnie wskazane względem czynników zakaźnych, które wpływają na gatunki: świnie, psa i kota, infekując śluzówki lub stosując śluzówki jako drogę wejścia.
Specyficzne wykonanie ainicjssego wynalazku dostarcza jednowacezściowe szczepionki zdolne do ochrony świń, psów i kotów względem różnych czynników zakaźnych świni, psa i kota, i hopizm jest kontrolowany przez ekspresjonowanie glikobiałka S koronawicusa.
Jedazwactościowe szczepionki względem czynników zakaźnych świni mogą zawierać wektor ekspresyjny cksprcsjznujący antygen wybrany z grupy złożonej zasadniczo z antygenów następujących patogenów świni: Actinobacillus pleurzpaeumoniae, Actinobacilłus suis, Haemophilus par^ms, pacwzwicns świni, Lcptospica, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multociCa, BorCeeella brznchiscptica, CloseriCinm sp., Serpuliaa hkzdisenteriae, Mycoplasma hyopncnmoaiae, wirus epidemicznej biegunki świń (PEDV), koczaawirus oddechowy świń, rotawims lub względem patogenów powodujących zespół rozrodczzoddechowy świń, chorobę Aujcssky'cgz świń (pseuCzwścieklizaa), grypę świń, przenaszalne zapalenie żołądka i jelit, czynnik etiologiczny zanikowego nieżytu nosa i przliferacyjae zapalenie jelita krętego.
Jcdnowartościzwe szczepionki względem czynników zakaźnych psa mogą zawierać wektor ekspresyjny ekspresjznnjąck antygen wybrany z grupy złożonej zasadniczo z antygenów następujących patogenów psów: herpes wirus psów, adcnowicusów typu 1 i 2 psów, parwzwirusa typu 1 i 2 psów, reow^^ psów, rztawirnsa psów, korznawicusa psów, wirusa grypy rzekomej psów, wirusa grypy psów, wirusa nosówki, wirusa wścieklizny, retrowirusa i kaliciwirusa psów.
JcCnowartościowe szczepionki względem czynników zakaźnych kota mogą zawierać wektor ekspresyjny ekspcesjzaujący antygen wybrany z grupy złożonej zasadniczo z antygenów następujących patogenów kotów: kaliciwhusa kotów, wirusa niedoboru odporności ko14
188 546 tów, herpes wirusów kotów; wirusa panleukopenii kotów, reowirusa kotów, rotawirusa kotów, koronawirusa kotów, wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, wirusa wścieklizny, Chlamydia psittaci kotów, i wirusa białaczki kotów..
Wektory mogą ekspresjonować przeciwciało nadające ochronę względem czynnika zakaźnego, np. czynnika zakaźnego świni, psa lub kota, takiego jak opisane powyżej. W specyficznym wykonaniu wytworzono pewne wektory ekspresjonujące rekombinacyjne przeciwciało monoklonalne oznaczone jako 6A.C3, które neutralizuje VGPT.
Szczepionki otrzymane według niniejszego wynalazku są zdolne do ochrony prosiąt za pomocą indukowania odporności laktogenicznej, co ma szczególne znaczenie przy ochronie nowonarodzonych prosiąt względem infekcji jelit.
Zasadniczo, szczepionki otrzymane według niniejszego wynalazku mogą zawierać pewną ilość antygenu zdolną do wprowadzenia do organizmu zwierzęcia poddawanego uodpornieniu wirusa pomocniczego w ilości co najmniej 108 jednostek tworzących płytki (pfu).
Jako zaróbkę można stosować rozcieńczalnik taki jak fizjologiczny roztwór surowicy z solą lub inne podobne fizjologiczne roztwory soli. Podobnie szczepionki te mogą także zawierać adiuwant, taki jak zwykle stosowane w formulacji szczepionek: wodny (wodorotlenek glinu, QuilA, zawiesiny żelu tlenku glinu i podobne), lub oleisty [oparty na olejach mineralnych, glicerydach i produktach ubocznych kwasów tłuszczowych i ich mieszaniny, np., Marcol 52 (ESSO Espanola S.A.), Simulsol 5100 (SEPIC) i Montanide 888 (SEPIC)].
Szczepionki te mogą także zawierać substancje wzmagające reakcje komórki (CRP), tzn., substancje wzmagające subpopulacje komórek pomocniczych T (Thl i Th2), takie jak interleukina 1 (IL-1), IL-2; IL-4, IL-5, lL-6, IL-12, g-IFN (gamma interferon), czynnik martwicy komórki i podobne substancje, które mogą, w teorii, wywoływać odporność komórkową u szczepionych zwierząt. Te substancje CRP mogłyby być stosowane w formulacjach szczepionek z adiuwantami wodnymi lub oleistymi. Można także stosować inne typy adiuwaritów; które modulują i immunostymulują reakcje komórki, takie jak MDP (dipeptyd muramylowy), ISCOM (kompleks immunostymulanta) lub liposomy.
Niniejszy wynalazek dostarcza wielowartościowe szczepionki zdolne do zapobiegania i ochrony zwierząt przed różnymi infekcjami. Te wielowartościowe szczepionki mogą być wytworzone z wektorów ekspresji, w których różne sekwencje kodujące odpowiednie antygeny wstawiono w ten sam wektor rekombinacyjny, lub przez skonstruowanie niezależnych wektorów rekombinacyjnych, które będą potem zmieszane dla ich koinokulacji z wirusem pomocniczym. Zatem, te wielowartościowe szczepionki obejmują układ rekombinacyjny. w którym wektor ekspresyjny sam zawiera ponad jedną sekwencję DNA kodującą ponad jeden czynnik zakaźny lub, alternatywnie, układ rekombinacyjny stosowany w wytwarzaniu szczepionki może zawierać różne wektory ekspresyjne, z których każdy ekspresjonuje co najmniej jeden różny antygen. Faktyczne ograniczenie przy tego typu wielowartościowych szczepionkach polega na tym, ze wspomniane wektory ekspresyjne muszą ekspresjonować antygeny czynników zakaźnych tych samych gatunków zwierzęcych i że wirus pomocniczy musi być odpowiedni dla konkretnego gatunku. Analogicznie, mogą być wytworzone wielowartościowe szczepionki obejmujące wielowartościowe wektory stosujące sekwencje kodujące przeciwciała, które nadają ochronę względem czynników zakaźnych zamiast sekwencji kodujących antygeny. Wektory te mogą zawierać układ rekombinacyjny obejmujący wektor ekspresyjny zawierający ponad jedną sekwencje DNA kodującą ponad jedno przeciwciało lub różne wektory ekspresyjne ekspresjonujące, w przypadku każdego z nich, co najmniej, jedno różne przeciwciało.
Specyficzne wykonanie niniejszego wynalazku dostarcza szczepionki zdolne do ochrony świń, psów i kotów względem różnych czynników zakaźnych świni, psa i kota, odpowiednio. W tym celu, wektory ekspresyjne zawarte w układzie rekombinacyjnym szczepionki muszą ekspresjonować różne antygeny wspomnianych patogenów świni, psa lub kota.
Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być w postaci ciekłej lub liofilizowanej i mogą być wytwarzane przez przeprowadzenie w stan zawiesiny układów rekombinacyjnych w zaróbce. Jeśli wspomniane układy są w postaci liofilizowanej, sama zaróbka może być rozcieńczalnikiem.
Alternatywnie, szczepionki uzyskane za pomocą niniejszego wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z innymi konwencjonalnymi szczepionkami, jako ich część lub jako
188 546 .5 rozcieńczalnik lub frakcja liofilizowana do rozcieńczenia z innymi, konwencjonalnymi lub rekombinacyjnymi, szczepionkami.
Szczepionki dostarczone przez niniejszy wynalazek do immunizacji zwierząt, zwłaszcza świń, psów i kotów, względem różnych czynników zakaźnych równocześnie, mogą być. podawane zwierzęciu drogą ustną, nosową, podskórna, doskómą, wewnątrzotrzewnową lub domięśniową lub przez aerozol. Szczepionki według wynalazku chronią także nowonarodzone zwierzęta względem czynników zakaźnych, które infekują wspomniane zwierzęta, poprzez podawanie ich drogą ustną, nosową, podskórną doskómą, wewnątrzotrzewnową i domięśniową, lub przez aerozol (lub ich formy łączone), matkom przed lub podczas okresu eiąży, lub ich potomstwu.
Wynalazek przedstawiono za pomocą następujących przykładów, które opisują szczegółowo uzyskiwanie wadliwych genomów wirusowych, ich charakterystykę, budowę plazmidów i manipulowanie nimi w ceiu otrzymania wektorów ekspresyjnych i indukowanie neutralizujących przeciwciał względem różnych czynników zakaźnych różnych gatunków.
Przykład 1
Tworzenie wadliwych cząstek wyprowadzonych z TGEV
1.1 Nierozcieńczone seryjne pysne owarna szczepów TGEV przy ppyzypici loOtnokci mfekcji (m.o.i.)
Aby sprzyjać tworzeniu wadliwych cząstek, lub impozycji tych już istniejących w małej ilości w populacji wirusów, wykonano sżryjnż peseżcwania różnych yierozcieńczoyych izolatów TGEV w różnych układach komórkowych. Ponieważ częstotliwość, z którą cząstki DI są wytwarzane może się znacznie zmieniać w różnych układach komórka-wirus, pasażowania wykonano dla różnych izolatów TGEV (THER-1 i PUR46-mar ICC 12) w liniach komórkowych ST (jądro świni, komórki nabłonkowe jądra świni).
Szczep THER-1 (koroyawirus prze^sza^ego zapalenia żołądka i jelit - Helper Enteric and Respiratory, szczep 1) jest mutantem osłabionym przez 20 pasażowań w hodowlach komórkowych wyprowadzonych ze szczepu PUR46-MAD [Sanchez i in., Virology 174, 410-417 (1990)]. Szczep PUR46-mar 1 CC 12 także opisali Sanchez i in. (supra).
Każdy szczep TGEV pasażowano niżroeciżeczony 35 razy w komórkach ST. m.o.i. pierwszego pasażowania w każdym z trzech przypadków wyniosło 100 pfu na komórkę. Supernatant każdego pasażowania zebrano między 20 i 48 godz. po infekcji (h.p.i.), po zaobserwowaniu wyraźnego efektu cytopatycznżgo - w normalnym przypadku, gdy wspomniany efekt wpływał na ponad połowę monowarstwy komórkowej, i połowę objętości tego supematantu użyto do infekcji w następnym pasażowaniu. Zmianę miana wirusa wraz z liczbą pasażowania przedstawiono na fig. 4. Miano wirusa uzyskiwało wartość między dwiema jednostkami logarytmicznymi przez seryjne pasażowania każdego wirusa. W przypadku szczepu THER-1, miano w pasażowaniach 30 do 46 było niższe niż w pierwszych trzydziestu pasażowaniach. Wirusy, które pasażowano 35 razy w komórkach ST użyto do analizy wewnątrzkomórkowych RNA wytworzonych w infekcji. RNA, metabolicznie znakowane 32Pi między godz. 6 i 9 po infekcji, poddano analizie [Maniatis i in., Mclżculαr cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)]. W infekcji THER-l-p35 (wirus szczepu THER-1 pasażowano 35 razy przy wysokim m.o.i.) zaobserwowano trzy intensywne pasma, nie odpowiadające żadnemu wirusowemu mRNA. Te pasma umieszczono między genomowym RNA i RNA informacyjnym genu S (figura 5). Do analizy charakteru tych nowych subgenomowych RNA, nieroecieńczonż sżryjnż pasażowania kontynucwαyc przy użyciu szczepu THER-1. Po 46 pasażowaniach, zanalizowano ewolucję schematu RNA w obrębie seryjnych pasażowań. W tym ceiu, komórki ST infekowano wirusem z różnych pasażowań i wytworzone RNA, metaboliczniż znakowane, poddano analizie w denaturującym żelu agarozowym (figura 5). Podczas gdy tylko geyomowż RNA i subgżnomowe wiruecwe RNA informacyjne wykryto w pierwszych pasażowaniach, w pasażowaniu 30 wykryto trzy nowe RNA o 22, 10,6 i 9,7 kb (RNA A, B i C określono na fig. 5 jako DI-A, DI-B i DI-C, odpowiednio). Te subgenomowe RNA pozostały w trwałej formie przez następujące 15 pasażowań, oddziałując wyraźnie z replikacją genomowego RNA i syntezą mRNA wirusa pomocyiozżgo (fig. 5, paski 30 do 45). Wyniki te wskazują, ze trzy RNA wytworzone lub wemconicyż przez nierozciżeczonż seryjne pasażowania są trwałe i że co najmniej jeden z nich ingeruje.
188 546
1.2 Charakterystyka subgenomowych RNA.
1.2.1 Analiza końców i obszarów wewnętrznych.
Aby określić czy subgenomowe RNA A, B i C miały standardową budowę wadliwego RNA koronawirusa, a zwłaszcza, czy zachowały końce 5' i 3' dzikiego genomu oraz czyjego mała wielkość wynikała z wewnętrznych delecji, przeprowadzono szereg prób hybrydyzacji przy użyciu sond specyficznych dla wirusa. W tym celu wyekstrahowano RNA z komórek infekowanych wirusem THER-1 -STp3 5 (wirusy szczepu THER-1, pasażowane 35 razy w komórkach ST) i jego hybrydyzację zanalizowano przy użyciu specyficznych sond wirusowych metodą Northem-blot (Maniatis i in., supra) stosując oligonukleotydy komplementarne do lidera i sekwencji 3'-końca wirusa. W każdym przypadku, RNA z komórek infekowanych wirusem THER-1-p1 (szczep THER-1 wirusa pasażowany raz w komórkach ST) i nieinfekowanych komórek ST (NI) (paski 1 i 2 każdego filtra, odpowiednio) użyto jako próbę kontrolną. Oligonukleotydy użyte jako sondy są komplementarne względem RNA lidera (pozycje 66-91 końca 5' genomu macierzystego), względem nietranslowanego obszaru końca 3' (nukleotydy 2852428543 końca 5' genomu macierzystego), i względem strukturalnych genów M i N (pozycje 97116 i 5-24 poczynając od startera AUG każdego genu, odpowiednio). Kreski po prawej stronie wskazują pozycje wirusowych mRNA i subgenomowych RNA A, B i C.
Jak podano na Fig. 6, dwa oligonukleotydy hybrydyzowano ze wszystkimi mRNA macierzystego wirusa i wykryto także RNA A, B i C, wskazując, że te RNA przeszły przez wewnętrzne delecje i zachowały swoje końce. Jako początkowe podejście do analizy, odnośnie tego które genomowe sekwencje były obecne w tych RNa, RNA infekowanych komórek hybrydyzowano z oligonukleotydami komplementarnymi do genów wirusowych białek strukturalnych S, M i N. Żaden z nich nie hybrydyzował z wadliwymi RNA, co sugeruje że geny białek strukturalnych uległy delecji. Zatem, subgenomowe RNa A, B i C zachowały końce macierzystego wirusa i mają wewnętrzne delecje.
1.2.2 Propagacja RNA A, B i C.
Aby sprawdzić, że RNA A, B i C są wadliwymi genomami, zależnymi od macierzystego wirusa przy propagacji w hodowli, komórki ST zainfekowano wirusem THER-1-STp41 (szczep wirusa THER-1 pasażowany 41 razy w komórkach ST) przy różnych m.o.i.: 10, 0,1, 0,01 i 0,001 pfu/komórkę. Wirus uzyskany z tego pasażowania, zebrany przy 10 h.p.i., zmiareczkowano i wzmocniono w drugim pasażowaniu w komórkach ST, które z kolei użyto do zainfekowania nowych komórek, z których wyekstrahowano cytoplazmowy RNA (Maniatis i in., supra). RNA zanalizowano metodą Northem-blot stosując oligonukleotyd komplementarny względem lidera RNA. Fig. 7 przedstawia otrzymane wyniki, m.o.i. wskazano na każdym pasku (10'3, 10'2, 10'1 i 10 pfu/komórkę). Jako negatywną próbkę kontrolną włączono RNA z infekcji komórek ST wirusem THER-1-pl, który nie zawiera subgenomowych RNA przy m.o.i. 10 pfu/komórkę (pierwszy pasek). Na pasku odpowiadającym infekcji wirusem THER-1-STp41 przy m.o.i. 10 pfu/komórkę (pozytywna próba kontrolna) są znakowane genomowe RNA (mRNA 1), jak również i wadliwe RNa A, B i C (oznaczone jako DI-A, DI-B, DI-C) i odpowiedni gen S (mRNA 2).
Zaobserwowano, że gdy m.o.i. pierwszego pasażowania („wąskie gardło” w tym eksperymencie, ponieważ pasażowania, które następują to pasażowania wzmacniające) wynosi 0,1 pfu/komórkę lub mniej, RNA A, B i C są stracone, w warunkach, w których genomowy RNA i mRNA wirusa są wykryte w spodziewanych ilościach (Figura 7). Trzy wadliwe RNA są utrzymane, gdy m.o.i. wynosi 10 pfu/komórkę. Ponieważ RNA A, B i C występują w większych ilościach niż genomowy RNA w wirusie THER-1-p41 stosowanym w infekcji, wyniki te pokazują, że replikacja lub propagacja tych RNA wymaga, by komórki były infekowane przez wadliwy wirus i także przez wirus pomocniczy. Zatem RNA A, B i C wymagają funkcji wirusa pomocniczego, które mają być dostarczone in trans. Zatem, RNA A, B i C to wadliwe genomy, zależnie od wirusa pomocniczego w ich propagacji.
1.2.3 Tworzenie in vitro, amplifikacja, propagacja i oddziaływanie RNA DI w innych liniach komórkowych.
Tworzenie in vitro, amplifikacja, propagacja i oddziaływanie DI RNA są specyficzne dla linii komórkowej, i z tego względu badano wpływ zmiany linii komórkowej na wadliwe RNA. W tym celu, wirus THER-1-STp46 (wirus THER-1 pasażowany 46 razy przy wysokim
188 546
m.o.i. w komórkach ST) poddano nowej serii nierozcieńczonych pasażowań, w komórkach nabłonkowych jelit świni (DPEC) i makrofagach świni (PM). Figura 8 przedstawia zmianę miana i liczbę pasażowania przez 10 pasażowań w IPEC (Figura 8A) i 5 pasażowań w PM (Figura 8B). Wydajność wirusa w obydwu liniach komórkowych była niższa od otrzymanej w komórkach ST i stwierdzono zmianę sięgającą między 20 i 0,2 pfu/komórkę w m.o.i. każdego pasażowania.
RNA wytworzone w komórkach ST infekowanych THER-1-STp46-IPECp1 (wirus THER-1-STp46 pasażowany jeden raz w komórkach IPEC) i THER-1-STp46-IPECp10 (wirus THER-1-STp46 pasażowany 10 razy w komórkach IPE-C) znakowano ^1 i poddano analizie w denaturującym żelu agarozowym (Figura 8C).
RNA komórek ST infekowanych wirusem THER-1-STp46-PMp1 (wirus THER-1STp46 pasażowany jeden raz w komórkach PM) i THER-1-STp46-PMp5 (wirus THER-1 STp46 pasażowany 5 razy w komórkach PM) zanalizowano metodą Northem-blot z oligonukleotydem komplementarnym do lidera RNA (Figura 8C).
Wyniki podano na Fig. 8C ilustrującej, że trzy wadliwe RNA pozostały w pierwszym pasażowaniu w obydwu liniach komórkowych, lecz tylko RNA A utrzymał się przez co najmniej pięć pasażowań w PM i dziesięć pasażowań w IPEC. W obydwu przypadkach pozycje RNA odpowiadające dzikiemu genomowi (1) RNA A, B i C zaznaczono (DI-A, DI-B i DI-C, odpowiednio) i mRNA 2 (białko S). Na pasku odpowiedniego RNA wirusa THER-1-STp46PMp5 wskazano pozycję genomowego RNA - obserwowaną jedynie gdy czas ekspozycji autoradiografu był dziesięciokrotnie dłuższy niż czas podany na Fig. 8C.
1.3 Enkapsydacja wadliwych genomów.
Aby zbadać, czy wadliwe RNA mają zdolność do eykapsydaaji, wykonano częściowe oczyszczanie równocześnie na wirusach THER-1-STp1 (wirus THER-1 pasażowany jeden raz w komórkach ST) i THER-1 -STp41 (wirus THER-1 pasażowany 41 razy w komórkach ST) za pomocą odwirowania przez podkładkę z 15% (wag./obj.) sacharozy. RNA wyekstrahowano z oczyszczonych wirionów i poddano analizie na żelu agarozowym za pomocą zabarwiającego bromku etydyny (figura 9A). W pasażowaniu 41, wykryto wiriony, RNA A, B i C z tą samą intensywnością co genomowy RNA wskazując, że trzy wadliwe RNA skutecznie enkapsydują się.
Aby określić czy wadliwe genomy koenkapsydują z pełnym genomem, lub też, z drugiej strony, czy enkapsydują niezależnie. Wirus THER-1 -STp41 oczyszczono przez odwirowanie przez podkładki z sacharozy o różnych gęstościach lub przez ciągłe gradienty sacharozy. RNA oczyszczonych wirionów w każdym przypadku poddano analizie metodą Northem-blot z oligonukleotydem komplementarnym do lidera RNA (figura 9B). Gdy odwirowanie wykonano przez podkładkę z sacharozą (31% (wag./obj.) (d =1,19 g/ml)), w sedymentowanych wirionach wykryto tylko dziki genom; natomiast gdy użyto podkładki o niższej gęstości, 15% (wag./obj.) (d=1,11 g/ml), wykryto trzy wadliwe RNA, oprócz pełnego genomu. Przy ciągłej podkładce z sacharozy (15-42%, wag./obj.) było możliwe wzbogacenie wadliwych wirionów w górnych frakcjach gradientu (gęstość bliska 1,15 g/ml) i standardowe wiriony w niższych frakcjach (gęstość bliska 1,20 g/ml), jak podano na paskach d i e fig. 9B. Górne pasmo w każdym pasku odpowiada genomom dzikiego typu i wadliwemu genomowi A (DI-A), a niskie pasmo odpowiada wadliwemu genomowi B i C (DI-B i DI-C). Wyniki te wskazują, że RNA A, B i C skutecznie enkapsydują i że genomy DI-B i DI-C (10,6 i 9,7 kb) wykonują to niezależnie od genomu dzikiego typu w wadliwych wirionach, które są lżejsze niż wiriony standardowe.
1.4 Klonowanie i sekwencjonowanie wadliwych RNA B i C.
Oznaczenie ich struktury pierwszorzędowej.
1.4.1 Synteza komplementarnego DNA i amplifikacja RNA B i C.
Wielkość wadliwych RNA B i C oszacowano opierając się na ich ruchliwości w żelach elektroforetycznych o 10,6 i 9,7 kb, odpowiednio. Wskutek ich dużej wielkości, nie była możliwa amplifikacja wadliwego RNA w pojedynczej odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) stosując startery komplementarne do końców genomu. Aby przezwyciężyć takie ograniczenie, wadliwe genomy amplifikowano w czterech niezależnych reakcjach stosując pary starterów umożliwiające aby cztery nakładające się fragmenty pokryły całkowitą długość genomu w każdym przypadku. Te nakładające się fragmenty oznaczono
188 546 jako a, b, c i d, umieszczone z końca 5' do końca 3' (Fig. 10). RNA wirusa THER-1-STp41 werkstrrhowanr z oczyszczonych wirionów użyto jako matrycy. Ten RNA zawierał trzy wadliwe RNA A, B i C oprócz macierzystego genomu. Jako próbę kontrolną wykonano równocześnie amplifikację genomowego RNA dzikiego wirusa THER-1.
Sekwencje i pozycje pligonukleotedów użytych jako startery w reakcji RT-PCR wskazano w tabeli 1.
Tabela I
Charakterystyka oligpnukleotedew użytych jako startery w reakcjach RT-PCR
SEQ. ID. nr Polarność ORF korpnawirusr Miejsce w RNA DI-C^ Miejsce restrykcyjne
1 + Lider TGEV 15-41 -
2 - ORF1a FIPV 1874-1887 -
33) + ORF1aTGEV 1524-1550 XbaI
4a) - ORF 1b TGEV 4365-4389 XbaI
5a) + ORF1b HCV229E 4097-4114 EcoRI
6a) - ORF1b TGEV 7633-7650 EcoRI
7 + ORFłb TGEV 7633-7650 -
8a) - 3'UTR TGEV 9691-9707 Spel
9 + ORF1b TGEV 8251-8270 -
a) : Mirjoce restrykcyjne w 5' włączono, by ułatwić następujące po tym klonowanie.
b) : Pozycja pligonukleptedu w odpowiednim ORF jest w stosunku do sekwencji podanej na fig. 12.
Amplifikacja przez RT-PCR ze starterami 1 i 2 RNA wirusa THER-1-STp41 i RNA macierzystego wirusa THER dała dominujący produkt PCR o 1,9 kb (fig. 11, fragment a). Mniejsze pasma zaobserwowane w tej reakcji są skutkiem niespecyficznych hybrydyzacji (występuje to na dwóch paskach). Tę samą reakcję RT-PCR wykonano poczynając od frakcji agarozy zawierającej zasoby RNA DI-B i DI-C wyekstrahowane przy oczyszczaniu żelem, z tymi samymi wynikami. Wskazuje to, że fragment a jest wspólny dla wszystkich DI RNA i odpowiada obszarowi 1,9 kb końca 5' dzikiego genomu TGEV.
Amplifikacja oligonukleotydami 3 i 4 wychodząc z RNA wirusa THER-l-STp41 dała niepowtarzalny produkt PCR o 2,8 kb (figura 11, fragment b). Nie otrzymano produktu PCR z RNA wirusa kontrolnego THER-1, ponieważ wielkość spodziewanego produktu wyniosła 12 kb. Opierając się na tych danych można wywnioskować, że co najmniej jeden wadliwy genom ma jeden fragment b o 2,8 kb, i że inne mają ten sam fragment lub większy, który nie jest wykrywalny w reakcjach PCR wskutek jego dużej wielkości.
Oligonuklrotyde 5 i 6, oddzielone przez 4,6 kb w macierzystym genomie, dały dwa różne produkty o 3,5 i 4,6 kb z RNA wirusa THER-l-STp41 (figura 11, fragment c). Produkt 4,6 kb także otrzymano z RNA dzikiego wirusa użytego jako próba kontrolna. Wyniki te sugerują, że fragment c zawiera jedną delecję w co najmniej jednym wadliwym genomie (prawdopodobnie w DI-C, najbardziej obszernym wadliwym genomie), dając w wyniku PCR fragment o 3,5 kb. Fragment 4,6 kb wywodzi się z macierzystego genomu obecnego w populacji RNA wirusa THER-l-STp41 i z tych wadliwych genomów, które zostały utrzymane w tym obszarze genomu.
Amplifikacja przez RT-PCR starterami 7 i 8 RNA genomu macierzystego wirusa nie wytworzyła żadnych pasm (figura 11, fragment d), ponieważ rozdział między tymi oligonukleotydami wynosi 9,5 kb w pełnym genomie (figura 10). Natomiast, dwa bardzo intensywne
188 546 pasma 1,9 i 2,1 kb zaobserwowano, gdy RNA wirusa THER-1-STp41 użyto jako matrycę. Pasma te mają wygląd szerokiego ciągłego pasma, odpowiadającego fragmentowi d (figura 11), prawdopodobnie dlatego że współmigrują z grupą mniejszych pasm wokół pasma 1,9 kb, zapobiegając ich rozdzieleniu w żelach. Zaobserwowano hztzrogznność w wielkości fragmentu klonowanego d (patrz poniżej).
1.4.2 Przypisanie produktów amplifikacji (a, b, c i d) różnym wadliwym RNA.
Aby przypisać fragmenty d o wielkościach zmieniających się między 1,9 i 2,1 kb różnym wadliwym genomom, RNa wirusa THER-1-STp41, użyte jako matryca, frakcjonowano w żelu agarozowym do osiągnięcia wyraźnego rozdzielenia pasm odpowiadających RNA dzikiego genomu, DI-A, DI-B i DI-C. Pasma odpowiadające każdemu z tych czterech RNA podzielono niezależnie i użyto jako matrycę w reakcji amplifikacji RT-PCR z oligonukleotydami 8 i 9. Poczynając od RNa oczyszczonego pasma genamowego, 'nie otrzymano żadnego produktu PCR. Z RNA DI-B otrzymano dominujący produkt PCR o 1,9 kb, chociaż otrzymano także mniej obszerne DNA, o zmiennej wielkości bliskiej 1,9 kb, co wskazuje na pewną hztzrogzkkość w tej strefie. Amplifikacja DI-C RNA dała dominujący produkt PCR o 2,1 kb. Wyniki te pozwoliły na przypisanie fragmentu 1,9 kb wadliwemu RNA B, i fragmentu 2,1 kb RNA DI-C.
Po przypisaniu fragmentów ó uzyskano fragmenty c o 3,5 i 4,6 kb otrzymane ze starterami 5 i 6, przypisano wadliwym RNA C i B, odpowiednio, ponieważ suma fragmentów a do d wynikająca z tego przypisania była zbieżna w każdym przypadku z wielkościami RNA B i C, oszacowanymi , na podstawie ruchliwości. ,
Po określeniu pełnej sekwencji genomów B i C, przypisanie fragmentów zweryfikowano amplifikując RNA każdego oczyszczonego pasma przez użycie oligokuklzotyóów flankujących specyficzne delecje. Przypisanie fragmentów także potwierdzono metodą Northern-blot, stosując oligonukleotyóy mapujące obszary DI-B, które nie były obecne w DI-C, i vice versa.
1.4.3 Klonowanie i sekwzncjonowakiz zachodzących na siebie fragmentów a, b, c, i d.
Cztery zachodzące na siebie fragmenty DNA a (1,9 kb), b (2,8 kb), c (3,5 kb) i d (2,1 kb), komplementarne do RNA C, sklonowano w Bluescript SK. Co najmniej dwa klony wyprowadzone z niezależnych reakcji RT-PCR sznwencjokowano. Sekwencje pozycji, które nie były zbieżne w różnych klonach (być może błędy palimerazy Taq) szkwekcjonowano bezpośrednio z odpowiednich keeklonowanych produktów PCR. Według tej procedury, oznaczono sekwencję konsensusową RNA DI-C. Otrzymano średnio 1 błąd polimerazy Taq na każde skopiowane 1,2 kb. Pełną sekwencję genomu DI-C przedstawiono na figurze 12.
Pełną sekwencję RNA DI-C otrzymaną w ten sposób porównano z sekwencją ORF 1a i lb wirusaPTU.R6-PAA [Eleooet i in., Viroloay 220,817-822 ( 1995)], i z sekwnnkją 0:^^· czoną w naszym laboratorium dla innych ORF wirusa TUER-1. W pełnej sekwencji RNA DI-C, stwierdzono 14 różnic w neklzotyóach w porównaniu z sekwencją szczepu PUR46-PAR. Pozycje te szkwekcjonowako w szczepie THER-1, macierzystym wirusie wadliwego genomu, aby określić specyficzne zmiany gznomowzgo wadliwego RNA DI-C. Sekwencja DI-C RNA wykazała tylko różnice trzech kukleotyóów w porównaniu z odpowiednią sekwencją wirusa macierzystego i jedno wstawienie w pozycje 9189, które nie wpłynęło na jakiekolwiek ORF (figura 12).
1.4.4 Pezrwszorzędowe struktury genomu DI-C i DI-B.
Dane dotyczące sekwencji wskazały, że genom DI-C był złożony z czterech nieciągłych obszarów macierzystego genomu (figura 13) obejmując: a) 2144 nukleoiyóy końca 5' genomu; b) 4540 nnOtnotydy yóyowicynjące (^szorowa mięćmy pozycjai^ ad91 i 16731 7enomu macierzystego, co obejmuje zachodzące na siebie pola między ORF 1a i 1b i w przybliżeniu połowę 5' ORF 1 b; c) obszar 2531 kukleoiydów odpowiadający pozycjom 17843-20372 dzikiego genomu, i który obejmuje połowę 3' ORF1 b i pierwsze 8 kukleotyóów genu S; oraz d) 493 kukleotydy końca 3'.
Pierwszorzędową strukturę genomu DI-B oznaczono przez sekwencjonywanie klonowanych fragmentów a i b (wspólnych dla genomu DI-C), c (podobny do genomu macierzystego) i ó (specyficzny dla genomu DI-B). Genom DI-B jest złożony z trzech nieciągłych obszarów genomu (figura 14): a) 2144 nukleotydów końca 5' genomu, wspólnych dla wszystkich
188 546 klonów DI-B, i identycznych z obszarem I RNA DI-C; b) obszaru zmiennego co do wielkości, o 8178-8243 nukleotydach odpowiadających pozycjom .12195-20369 do 20436 genomu macierzystego, i który obejmuje zachodzącą na siebie strefę między dwiema ORF genu 1, pełnym ORF1 b, i pierwszymi nukleotydami genu S; i c) nukleotydów 278 do 303 obszaru 3' genomu.
Klony stanowiące populację wyznaczoną jako genomy DI-B różnią się co do wielkości delecji, która miała miejsce między obszarami II i III, ą którą rozpoczyna się przy początku genu S (między nukleotydami 6 i 73) i kończy przy końcu genu 7 (między nukleotydami 195 i 233). χ
Sekwencję końca 5' macierzystego RNA THHR-1 oznaczono przez bezpośrednie sekwencjonowanie RNA, i jest ona następująca: 5'-NCUUUUAAAG-3'. Charakteru pierwszego nukleotydu „N” sekwencji nie oznaczono. Dotychczas opisano sekwencję końca 5' trzech izolatów TGEV, PUR46-PAR, PUR46-BRI i F5772/70 [Eleouet i in., supra; Page i in., Virus Genes 4, 289-301 (1990); Sethna i in., J. Virol. 65, 320-325 (1991)] i wszystkie one różnią się pierwszym nukleotydem. Sekwencja wadliwego lidera RNA musi być taka sama jak lidera wirusa macierzystego, zważywszy na wymianę liderów, która odbywa się w infekcji koronawirusowej [Makino i in., J. Virol. 57, 729-737 (1986)].
Trzy wadliwe RNA zawierają polyA, ponieważ łączą się kolumny oligo dT (wyników nie podano).
1.4.5 RNA B i C utrzymują naujadajkcy się obszar między ORF lai 1 b, który obejmuje motyw odpowiedzialny za translokację (-1) rybosomu.
Zgodnie z sekwencjami przypisanymi genomom DI-C i DI-B, jest możliwe, by przewidzieć ORF o 6370 i 10003 nukleotydach, odpowiednio, poczynając od nukleotydu 315, licząc od końca 5' genomu. ORF RNA DI-C kończy się przy kodonie terminacji wytworzonym przy łącznym miejscu nieciągłych obszarów II i III, gdzie miała miejsce wewnętrzna Relecja w ORF 1 b, w pozycji 6685 genomu DI-C. ORF genomu DI-B kończy się przy naturalnym kudunie terminacji ORF1 b.
Dwa wadliwe RNA utrzymują strefę zachodzącą na siebie między ORF 1a i 1b, która obejmuje sekwencję „ślizgową” i motyw trzeciorzędowej struktury pieudowęzla, odpowiedzialne za translokację (-1) rybosomu w tej strefie (Eleouet i in., supra). Figura 15 przedstawia możliwe drugorzędowe i trzeciorzędowe struktury RNA w tej strefie. Struktura zaproponowana przez Eleouet i in. dla pseudowęzła w tej strefie, jest strukturą wskazaną w C i D; jednak, są możliwe inne struktury (jak wskazano w A i B), chociaż nie wiadomo, która jest poprawna.
Wykonano opis wskazujący, że transluOacja następuje przy wydajności 20% w TGEV (Eleouet i in., supra) i umożliwia ciągłą translację genu 1. Fakt że RNA DI-B i DI-C (i prawdopodobnie DI-C RNA) utrzymują ten obszar genomu macierzystego sugeruje, że może on być niezbędny dla replikacji RNA lub propagacji genomu.
Istnieją dwie inne małe ORF w wadliwych genomach Dl-C i DI-B. Jedna z nich, przed długą ramką odczytu, koduje peptyd o trzech aminokwasach, występujący także w genomie dzikiego typu, którego funkcja jest nieznana. Inna ORF rozpoczyna się w obydwu przypadkach AUG genu S, i koduje peptyd 16 aminokwasów w DI-C, i peptyd o zmiennej wielkości w DI-B. Nie wiadomo, czy te ORF są funkcjonalne. Jedyne dwie sekwencje konsensusowe promotora transkrypcji (CUCCCC) wirusa, które są utrzymywane to dokładnie te, które poprzedzają gen 1 i gen S, w wadliwych RNA B i C. Sekwencje te zaznaczono na fig. 12.
Figura 16 przedstawia mapowanie RNA C, B i C przez hybrydyzację z oligonukleotydami specyficznymi dla wirusa metodą Northem-blot. RNA wirusa THER-1-STp41 frakcjonowano w żelu agarozowym do wyraźnego rozdzielenia RNA od macierzystego genomu i otrzymano DI, A, B i C; przeniesiono do nylonowych filtrów, które hybrydyzowano z różnymi ullgunukleotydsml znakowanymi 32P,, hybrydyzowano z macierzystym genomem (+), i hybrydyzowano (+) lub nie (-) z wadliwymi genomami. Przybliżone pozycje sekwencji komplementarnych do uligonuOleotydew w macierzystym genomie zaznaczono strzałkami. Ich dokładną sekwencję i pozycje podano w tabeli 2. Wszystkie oligonukleotydy hybrydyzowano z macierzystym genomem i z RNA B oraz C otrzymano spodziewane wyniki.
188 546
Tabela 2
ON ID SEQ Nr Pzlacaość Gen w TGEV Pozycja w geazmiea)
1 10 - Lider 66-91
2 11 - ORF1a 2151-2170
3 12 - ORF1a 6121-6140
4 13 - ORT1a 8684-8703
5 14 - ORF1a 12261-12280
6 15 - ORF1b 14148-14167
7 16 - ORF1b 17363-17381
8 17 - ORF1b 18792-18811
9 18 - gen S 1055-1074
10 19 - gen S 1980-1999
11 20 - gen S 3600-3619
12 21 - gen M 97-116
13 22 - gen N 5-24
14 23 - UTR-3' 28524-28543
a) Pozycje w genomie wskazano jako liczbę zasad zaczynając od końca 5' genomu wirusa dzikiego typu dla zligzaukleotkdów (ON) komplementarnych do genu 1 (ORF la i ORJFlb) i aictraaslzwaaego obszaru końca 3'(3'-UTR); oraz z pierwszego aukleotkCu startera ATG odpowiedniego genu do anklcoekCu 5' ON w przypadku starterów mapowania w genach S, M i N.
Przykład 2
Tworzenie wektorów ekspresyjnych.
cDNA kodujące RNA DI-C sklonowano w plazmidzie Bluesoript II, pod kontrolą promotora faga T7. To cDNA obejmuje sekwencje polyA, rybozym wirusa zapalenia wątroby delta (HDV) i sygnały terminacji faga T7. Jeden z tych plazmidów, których budowę podano na fig. 17, oznaczono pDIC-1. Plazmidy te mogą być przetwarzane w celu klonowania w nich hcteczlzgiczayoh genów pod kontrolą promotora genu S obecnego w wadliwym genomie, lub innego promotora TGEV, lub jego odmiany ze zwiększoną wydajnością.
Klonowanie tych heeerolzgicznkch genów wykonano według ORF1 b, następującej po kzdzaie inicjacji genu S (AUG), i w fazie odczytu tego genu.
Z tych cDNA, ckspcesjoaowaao RNA stosując polimecazę faga T7, którym tcansfzcmzwano komórki ST uprzednio infekowane osłabionym wirusem pomocniczym THER1, umożliwiając odzyskanie wirionów, zawierających genom wirusa pomocniczego, i inne wiriony, zawierające odpowiedni wadliwy genom. Wirusy te liofilizzwaae w obecności 2% surowicy płodu jagnięcego, użyto jako szczepionki do indukowania specyficznych przeciwciał względem środków infekujących drogi żołądkowo-jelitowe i oddechowe świń, psów i królików.
TiOpizm wektorów był specyficznie ukierunkowany na gatunki świni, psa, lub kota, stosując odpowiednie osłabione wicnsk pomocnicze.
188 546
Przykład 3
Indukowanie przeciwciał neutralizujących.
3.1 Indukowanie ochrony względem koronawirusa epidemicznej biegunki świni (PEDV).
Świnie immunizowano stosując układ rekombinacyjny składający się z wirusa pomocniczego (THER-1) i plazmidu pDIC-1, w którym sklonowano gen glikobiałka S PEDV.
Immunizacje wykonano przez podawanie 109 pfu na prosię, doustnie. Zbadano obecność neutralizujących przeciwciał w surowicy zwierząt szczepionych 15, 30, 45 i 60 dni po immunizacji; oraz oznaczono obecność przeciwciał specyficznych względem PEDV stosując oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) (Maniatis i in., supra).
Przy surowicach zebranych 45 dnia po immunizacji, całkowitą ochronę względem infekcji przez PEDV (szczep 5EG86-1) u 10-dniowych prosiąt dostarczono, gdy te surowice były preinkubowane z wirulentnym wirusem przed podaniem doustnym.
3.2 Indukowanie ochrony względem koronawirusa psa.
Psy immunizowano stosując układ rekombinacyjny składający się z wirusa pomocniczego (szczep Fort Dodge koronawirusa psa), i plazmidu pDIC-1, w którym sklonowano gen glikobiałka S koronawirusa psa (szczep Fort Dodge). Immunizacje wykonano przez podawanie 109 pfu na psa, doustnie.
Zbadano obecność neutralizujących przeciwciał w surowicy zwierząt szczepionych 15, 30, 45 i 60 dni po immunizacji; oznaczono obecność przeciwciał specyficznych względem koronawirusa psa stosując RIA.
Przy surowicach zebranych 45 dnia po immunizacji, całkowitą ochronę względem infekcji przez względem koronawirusa psa (szczep Fort Dodge) u 10-dniowych szczeniaków dostarczono, gdy te surowice były preinkubowane z wirulentnym wirusem przed podaniem doustnym.
3.3 Indukowanie ochrony względem infekcji spowodowanych przez arteriwirus PRRSV.
Świnie immunizowano stosując układ rekombinacyjny składający się z wirusa pomocniczego (THER-1) i plazmidu pDIC-1, w którym sklonowano arteriwirus PRRSV ORF3 i ORF5 (szczep Fort Dodge).
Immunizacje wykonano przez podawanie 109 pfu na prosię, doustnie. Zbadano obecność neutralizujących przeciwciał w surowicy zwierząt szczepionych 15, 30, 45 i 60 dni po immunizacji; oznaczono obecność przeciwciał specyficznych względem PRRSV stosując RIA.
Przy surowicach zebranych 45 dnia po immunizacji, całkowitą ochronę względem infekcji przez PRRSV (szczep Fort Dodge) u 10-dniowych prosiąt dostarczono, gdy te surowice były preinkubowane z wirulentnym wirusem przed podaniem doustnym.
Przykład 4
Tworzenie wektorów ekspresyjnych.
Według procedury podobnej do opisanej w przykładzie 2, cDNA kodujący samoreplikacyjny RNA sklonowano w plazmidzie Bluescript II, pod kontrolą promotora faga T7. Ten cDNA obejmuje sekwencje polyA, rybozym wirusa zapalenia wątroby delta (HDV) i sygnały terminacji faga T7. Jeden z tych plazmidów, których budowę przedstawiono na fig. 18 oznaczono pDIA6A.C3. Plazmid ten zawiera gen kodujący przeciwciało monoklonalne 6A.C3, które neutralizuje TGEV. Charakterystykę przeciwciała monoklonalnego 6A.C3 i jego budowę opisano w pracy doktorskiej Dr. Joaquin Castilla Carrion, pt. „Construccion de animales transgenicos secretores de anticuerpos neutralizantes para coronavirus”, Universidad Autonoma, Madrid, Wydział Nauk, grudzień 1996, str. 43-52, 65-79.
Klonowanie heterologicznego genu wykonano w ORF 1b, następującej po kodonie inicjacji genu S (AUG) i w ramce odczytu tego genu.
Zaczynając od tego cDNA, RNA ekspresjonowano stosując polimerazę faga T7, przy użyciu której transformowano komórki ST uprzednio infekowane osłabionym wirusem pomocniczym THER-1, prowadząc do odzyskania wirionów zawierających genom wirusa pomocniczego i innych wirionów z odpowiednim wadliwym genomem. Wirusy te, liofilizowane w obecności 2% surowicy płodu jagnięcego, mogą być użyte jako wektory ekspresyjne rekombinacyjnego przeciwciała monoklonalnego 6A.C3. Tropizm wektorów wykonano specyficznie dla gatunku świni stosując odpowiedni osłabiony wirus pomocniczy.
188 546
Przykład 5
Ekspresja przeciwciał neutralizujących.
Świnie immunizowano stosując układ rekombinacyjny składający się z wirusa pomocniczego (THER-1) i plazmidu pDIA-6A.C3 (przykład 4), zawierający sekwencję kodującą rekombinacyjne przeciwciało monoklonalne 6A.C3, które neutralizuje TGEV.
Immunizację wykonano przez podawanie 109 pfu na prosię, doustnie. Zbadano obecność neutralizujących przeciwciał 6A.C3 w surowicy zwierząt szczepionych 15, 30, 45 i 60 dni po immunizacji stosując RIA [Maniatis i in., supra]. Przeciwciała rekombinacyjne miały miana RIA wyższe niż 103 i są zdolne do zmniejszenia miana wirusa infekcyjnego ponad 104-kyotnie.
Depozyt mikroorganizmów.
Plazmid oznaczony pDIC-1, wprowadzony do bakterii DH-5 wyprowadzonej z E. coli [Dl złożono 6 marca 1996 w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórek Zwierzęcych (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 Ojej Wielka Brytania, z odpowiednim numerem dostępu P96030641.
Dodatkowo, osłabiony wirus pomocniczy oznaczony przez THER-1 złożono w ECACC 6 marca 1996, z odpowiednim numerem dostępu V96030642.
188 546
LISTA SEKWENCJI (1) IN 00 OWACJA OGÓLNA:
(1) ZGŁASZAJĄCY:
CA) NAZWA: CYANAMID IBERICA, S.A.
(B) ADRES: CRISTOBAL BORDIU, 35 (C) MIASTO: MADRID (E) KRAJ: HISZPANIA (F) KOD POCZTOWY: 28003 (G) TELEFON: 341663 9121 (H) TELEFAKS: 341663 94 01 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
WEKTORY OPARTE NA REKOMBINACYJNYCH WADLIWYCH GENOMACH
WIRUSOWYCH I ICH ZASTOSOWANIE W FORMULACJI SZCZEPIONEK (iii) LICZBA SEKWENCJI: 24 (iv) POSTAĆ CZYTANA PRZEZ KOMPUTER:
(A) NOŚNIK: Dyskietka (B) KOMPUTER: Zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1,0, Wersja #1,30 (EPO) (2) INFOFORMCJA D OTO. ZIDENTYFIKOWANEJ S EKWENCCI N r. [ID
SEQ. No.]:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE
188 546 (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) CPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.:1:
GTGAGTGTAG CGTGGCTATA TCTCTTC 27 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr. 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 2:
CCGTTGTGGT GTCACATTAA C 21 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) NPE CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 3:
GCCTCTAGAG GAGCTTTGTG GTTCACTTAC AC 32 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
188 546 (A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (B) NPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (il) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 4:
GCTCTAGAGC GTTTGAATCA ACCCCCAAAA GC 32 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) NPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 5:
GGAATTCCGG GACTATCCTA AGTGTG 26 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr: 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) NPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) NPE CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE
188 546 (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 6:
GGAATTCCAG CAATACTATT ATCAA 25 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW;: jednolańcuchowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No. 7:
TTGATAATAG TATTGCTGGC 20 (2) INFORMACJA DOT.ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) NPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) NPE CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 8:
GGACTAGTAT CACTATCAAA AGG 2 3 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
188 546
CA) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) NPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednolańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA; NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 9:
GATGGATGTT GTGGTGTGAG 20 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr:10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednolańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) NPE CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.:10:
CGAGTTGGTG TCCGAAGACA AAATCT 26 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr:11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednolańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (Lii) HIPOTETYCZNA: NIE
188 546 (iv) ANNTY-SENSOWNA: NIE (xi) SPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.:11:
ATACGAGCAT CAATATCACC 20 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) NPE CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.:12:
AGAGTTGCCA CAGACTGCAG 20 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr:13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.:13:
CAGCAGTTC AAAGTTACCC 20 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
188 546
CA) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednolańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No,14
CCATTGTTAA GCCAACAACC 20 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 15 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA:: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No. 15
ATCACACTTA GGATAGTCCC 20 (2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 16 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ:19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednolańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE
188 546 (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) CPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No. 16
GTCTAACAAT GTGCCAAGG 19
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No. 17
GCCAGCAATA CTATTATCAA 2 0
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.:18:
CACTGTGGCA CCCTTACCTG 20
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
188 546 (A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) NPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.:19:
GTACACCCAC TATGTTGTCT 20
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 20 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) NPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 20 :
TTGCGAGTGA AAACAAATGT 2 0
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr 21 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE
188 546 (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 21:
CTCACAATCA GACGCTGTAC
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednołańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) NPE CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 22:
GACACGTTGT CCCTGGTTGG
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: jednolańcuchowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 23:
ACATTTTAAA CAATCACTAG
2) INFORMACJA DOT. ZIDENTYFIKOWANEJ SEKWENCJI Nr (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
22:
23:
:
188 546 (A) DŁUGOŚĆ: 9714 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA ŁAŃCUCHÓW: dwułańcuchowa (D) TOPOLOGIA: kołowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Wirus przenaszalnego zapalenia żołądka i jelit świń (TGEV) (B) SZCZEP: THER-1 (C) INDYWIDUALNY IZOLAT: DI-C (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEQ. No.: 24:
188 546
HCTTTTAAAG TAAAGTGAGT GTAGCGTGGC TATATCTCTT CTTTTACTTT AACTAGCCTT 60 GTGCTAGATT TTGTCTTCGG ACACCAACTC GAACTAAACG AATATTTGT CTTTCTATGA 120 AATCATACAG GACAAGCGTT GA“TTATTTCC ATTCAGTTTG GCAATCACTC CTTGGAACGG 130 CGTTGAGCGA ACC-CTC-CAGT AGGGTTCCGT CCCTATTTCG TAAGTCGCCT AGTAGTAGCG 240 AGTGCGGTTC CGCCGTACA ACCTTCCCTA GACCGGGTTC CCΓCCTGTCA TCTCCCTCG-C 300 CCCCCCCCAC GAG^TGAGT TCCAAACAAT TCAAGATCCT GACTATCAAG 360 TGA^^GCC TAGTCTTCCT ATTCGTCACC TGTTACA^A AATTAAGTAC T^ACCGTA 420 ATCCATTTGA CG<CCΓλTCTT AATACTCΓCC TGACCTAGTT GATTGCGATC 430
CTACGTCATT ΜΌΓΚΤΉ GTAACGCAC,T AAffT^TCTT AAACCTCTTC 540 TTCTTACCGA ACCCTCCGTC ATCTTCCAAC CCΓTTAT'TCT TAGAGCTAAC TCCAATCCCC 600 TT'CTTCAG-CA CTTTGACCTT AAAATTGCTC AGGTGCCATA TATCTTCATC 660 AATACATGTG TGCTOCTCλT ^AŁLACCAG TCATTCAACC α^ΠΤ^ CACTACTTCC 720 CTCATCAACA CATCATTGAA TΓΓCAAGCAC ACCAGTACCA TTGCGCTTCG ACAACTGTGC 780 ^^GATGAGAA ACC^^t^.AAT CAGCAAACTC TCTTTACCAT TCAGGAAATC CAATACAATC 840 TCGACATTCC TCATAiATTG CCAAACTGTC CTACTAGACA TGTλCCACCA CCAGTCAAAA 900 AGAACTCTAA AATACTTCTC TCTGAAGATT ACAAGAAGCT TTATGATATC TTCGGATCAC 960 €01™^ ALAT'CGTCAC TGTCTTAGCA AATCCΓTTGA CACTCTTCAT TTTATCCCTC 1020 CTACTCTTAG ATCCCCCTCT CCTTCTCAAA GTAGCGCCGT TGGACATTGC ACTGCTTTTA 1080 ΛαΟΚΟΌ TTGTOT<CTT ΚΓΟΧ^ TTAAGGGTGT CACTTTCCCT GATATTAAGC 1140 ΟΚΟΚλΊΟ: TGTTGTCACT CA(CCTA1CCC AGTTA.ACTTC TTTGCCAATT 1200 CTGTTCTKA ATAT^TG^ CCTCTTCAAC GTGTCTCCAT CTGGAAAGTT ATTAAAACTT 1260 TTACAGTTGA TGAG.^CrGTA TCCiCCOTG GTTTTCAAGC CGAATTCAAC GACTTCATCA 1320 AACCTCACAC CAAATCACTA GTT^AT^ &CCΓTλAAAC AGCATTCATT ACIGdGATA 1380 TTGATCATCC TGTACAIGAT TGTATCATTA CAGGJAATT ^ATCTTAGT ACCAACCTTT 1440 ΠGCTAATCT TGGTCTATTA TTCAACAACA CTCCATGGT TCTACAAAAC TGTGGTGCAC 1500 TTTTTCTACA CCCΓΓGCAAA GTAGTAGA^ AGCTTTGTGC TTCACTCACA CTTACATACA 1560 AGCAAATTTA TGA^(^TGTA KAATCACTTT ^CTTCT^ TrΊTACCATT CTAAACTACA 1620 AGCCAACATT TCTCCΓΓCCA GACACTCGTC TTAAA^TCT TGTACACAAG TCTCTGAAAC 1680 TTCTTGTAAA .C(cCΛCTTCAT GnTTTACGC AGATTATCAC AA'TACCTCCT ATTGAGGCCA 1740 AATGCITTGT GCTTGGTGCT AAATACCTCT TGTTCAATAA TG^.CTrGTC AAACTTGTCA 1800 GTGTTAAAAT CCTKΰCAAC AA^AAA^^ GTCTTCAATC T^TTCTTT GCTACTAOT 1860 TGGTIGGIGC AACTGTTAAT GTCACACCTA ACACACCACA CACTCCCACT atcAGCTTGA 1920 ACAAGGTTGA TCAT?rTGTA GCACCACGAC A^TTATAT CGTCATTGTT GGTGATATGG 1980 CTTTCTACAA CAGTOCTCAC TATTATTTCA TCATCTCTAC TCCTAATTTT GTTCTTACTA 2040 ACAATGTTTT TACAGCA(CΠ, AAAGTTCCAT CTTATGACAT CCTrTATCAT GTTGATAATG 2100
188 546
ATACCAAA.AG CAAAATGATT GCAAAACTTG CACAAGATCC AATTGGGTTC TGTATTGAAA TTAACAA.TGG TTGCATGTGG GATCGTACTT ATTTAJUCGA GTGCGGGGTT CTAGTGCAGC AGAGGAIGTT AGT.AGACGCTT TTGACATCTA
CGTTAAGAGG AATTGTTCAA GATTTAGGAA CAAACGTTGT ACAAAGACCG TTATGGACCA TTCTGGTGCT GTTGCTGAGC ATGACTTCTT TAATGTTGCA CGTAG^.AATC TTACAAAGTA AAATTTTGAT GAAAAGGAACT GTGAAGTTCT CACTGAAGAA TTGTTTGAAA ATAAAGATTG
TGAAGTTTAT GG.AAA.CTTG GACCCATTGT TTGOGATGCG ATAGTGGAAA AAGGCTATAT
TAATGGCAAT TTCTACGATT TCGGCGATTT TTGTGTTACA TCATATTATT CTTATATGAT GTCTGAAAAC TTTGTGAAAA GTGACATCTA AGCTTATGAT TTTACCGAAC ATAAGGAGTA TCGCACATAT GAGCGAAATT GTTGTGATTG TAATTTTAAC ACATTGTTTT CTATGACAAT TAAAGTTCAT ATTG.ATGGTG TACCAGTAGT TGCTATACTA TG^JU^-^<CTTG ATGTAAAATT τcrτAGATτr gtcacagatc c.aarcttct GCGTACTGTC TGTTTCTCCA TTGCAGCTTT ACCAGGTCAC TTTAACAAGG ATTTCTACGA GGGATCTGAG TTAACATTAA AACATTTTTT AGACTTCAAT TATTATCGCT ACAATAGAGT TGTTTACAAA ATAGTTGGCA AGTATTTTGA TGAAGTTGTT GTTACAAACT ATGACAAGAG AGCTAGACTT TACTACGAAA CTCTTTCATA
AAAGAGAAAT GTTTTACCCA CAATGACTCA GGCAAGAGCT CGTACAGTAG GAGGAfGTTTC TCATCAGAAG GATTTGAAGT GAATTGCTGC AACCAAGTTT TATGGTGGTT GGGACAATAT TGGTTGTTTG ATGGGATGGG ACTATCCTAA AATGGCTTCT GCCATGATAT TAGGTTGTAA
GTTCATCATT TGAACAAATA CO-ACTGGCA 2160
ATGAAGTTTG TGTTGTCTGT GGTTGTTGGG 2220 CTATGCAGAG TTTTACTGTT GATCAAAGTT 2230
TCGACTAGAA CCCTGCAATG GTACTGATCC 2340 CAACAAAGAT GTTGCGTGTA TTGGTAAATT 2400 TTTGGACAAA CATGATGCCT ACTACATTGT 2460 TGAGCAAGTC TGTTATAACG ATGTTAAAGA 2520
CACATATAAA GAGGGTAGAT GTGAGTTCGG 2580 CACAATGATG GATCTTTGTT ACGCTATCAG 2640 CAAAGAAATA GTGGTGACAG TAGGTGCTTG 2700 GTTTGATCCA GTTGAAAATG AjAGGCCATACA 2760
AOGCA^'TGCT ATGCTTAAAT GTGTTGCTTT 2820 AGGTGTTATA ACACTTGACA ACCAAGATGT 2330
CGTGAAGACT GCTCCGGGTT TTGGTTGCGC 2940 GCCTTTAATG GGGATGACTT GATGCTTAGA 3000
TGGTTCTGAT TATAAGCAGT ATGATTTACT 3060 CGTTTTCCAA AAATACTTTA AGTACTGGGA 3120 TACTAGTGAC GAGTGTATTA TTCATTGTGC 3180 AGCAATGACA GCTTTTGGAC GACTTGTCGG 3240 TGTTAGTGCA GGTTACGATT TCAAACAACT 3300 AGACACAATG AAGTTGAGCA TGAGTGATGT 3360 TGTAGCATCA AGGCCTGCAC TTTTAGACCA 3420 GAGTACTGGT ATTACATATC AGACAGTAAA 3480 TTTCATAACA GAGCGTGGAT TCTTTGAAGA 3540 GTTTGCACAG GGTGGTGAAG GTGCTATGAC 3600 CAGAGTAGTT GATATTTGCC AAGCTCAATT 3660 ATGTTATGAC GGTGGGTGGA TTAATGCTCG 3720
TGCTGGCTAT GCTTTGAACA AATTTGGTAA 3780 TGAAGAGCAG GATGCACTTT ITGCTTTAAC 3840 AATGAATTTG AAATAGGCTA TTTCTGGTAA 3900 ACTTCTTTCT AGCATGAGTA GGAGACAATA 3960 AACACGGAAT GCTACTGTG-G TCATTGGTTC 4020 GCTTAAAAAT TTAATGCGTG ATGTTGATAA 4080 GTGTGACGGT GCTTTACCTA ATATGATTAG 4140 GCATGTTGGT TGTTGTACAC ATAATGATAG 4200
188 546
AGTACTCACA GAACTTCTGC ATTGCACAC-G 4260 TAGCGGTG.AT aTACTACAG CATATGCTAA 4320 TGCTAATGTT AATA-AGCnT TCGCCCTTGA 4380 ATCCATACAA CCTAAAATTT ACGATAATTG 4440 TCTTCTTG·AC TAC^TTAGTT ATTTCACAAA 4500 ΊCCACTTCTC TGCTACAA.CA AACATTATCC 4560 TTTT^A-^GCA ACACTTTATT ACCAGAATAA 4620 AGAACCAGAT CTTACTGTTC GACCACATGA 4680 CCACACTACT ATCTTCCCTA 4740 TGTGTTTGTT CATGACAΊAC TTAAAACAGA 4800 ATTG^ATT GACGCATACC CGCTCACAAA 4860 TTACACTCTA CTACATTGGC TTAAACATCT 4920. TTCGTmCA CTGACAATGT TACACCAACC 4980
CGCTAaCCTC ΊAΊCAAAACT CCACTCTCTT 5040 TTCGCAAACT CTACTTOTT GTGCACACTG 5100 TGCTT.ACGAC CAΊCTTAΊCC GAACAAAGCA 5160 GTCTAGTTTT AATGCTTGTA ATCTCAAΊCA 5220 TTATTATTGT ATGAACCACA AACCACAGTT 5280 TCnGCTCTA TATAAAACTA CTCCAGTCCC 5340 TGCAGmCT CACTGCAC1A AΊCTACAACA 5400 TCTGAAAATT TTCGCTGCTC AAACTCTG^ 5460 KGCTTATOT CTATTAAACC ACCTTATCCC 5520 TTCTAAGACT AAGCCTCCAC TTAACAGAAA 5580 G^ATACTAAA ATTCAAΊTAC CTGAATTTCT 5640 TGTTTATTAC AACACCACCA CTACTTACAA 5700 TTCTCATA^AT CTCACTCCTC TTAAAGCTCC 5760 CATATCTAAG CTCTAΊCCTC TCTTTAATAT 5820
CTACCAAATC AΊACCΊAAGC AAAAATTTAC 5380 ATCTCATTCT GTTATAGCTT TGCCTTTCTA 5940 ATCTΊCTCAΊ CCCCCTGTAG ACCCTΊTATG 6000 TACATCTTCA ACCAΊAATAC CTCAAAGAAT 6060 TAATAACACC A.AΊCCGCAGT ACTTCTTTTG 6120 TGACATTGTT CTAGTTGATC AG^TCTCTAT 6180 TACCCCACTC AGTTACAAAC ATATTCTTTA 6240 TAGAACTTTG AΊΊAAΊAACC GTGTACTTCA 6300
ATTCTACCCC CTCTCCAATG AGTTAGCTCA TGGTTTTTA.T TiTA.AACCTG GTGGTACAAC CTCTCGCTTT AACATCTTTC AAGCTGTTTC TrCAAACG-CT TGTA&CAACG TTACAGTAAA TTATCGTAGT AGCAGCATTG ATGAA^.^AATT ACACTTTTCT ATGATGATTT TATCTGATGA GGATTTAGGT TATGTAGCTG ACATTAATGC
CGTCTTTATG ICCACTTCTA AGTGTTGGGT ATTTTGTTCA CACCATACAT TGCAG,^TTGT TCCAGACCCG TCCAGAATTT TGTCAGCTGG CAATGTTATT AIGTTAGAAC GTTACGTGTC ACACCCTAAG CCTGCTTATC AAAAAGTGTT ACAGAA^AAAT TTGATCCAG GTGTTCTTGA TCAAGAT.AAG TTCTGGAGTG AAC-AGTTTTA GCAAGCTGCA GGCATGTGTG TAGTATGTGG
TCTTAC-GAGA CCACTTTTAT GCACGAAATG TAAATTCATT ATGTCTATCA CACCATATGT TGTTACAAAG TTTTrrTTAG GTCGGTCTTAG GTCATTCCCA CTCTCT&CTA ATGGCAACGT
CTCAGAGGCT GTTGAAGATT TCAACAAACT CTACAAACTT GCTAACAATG TCAAG^JAATC
AGCTAAGAIG GACTCTGTTA AATCTGAATA CCCTAAGGAA AT^ACTCC AATGGGAAGC
ITCAGTTTTC ACGTGTTTTC AGATAAGTAA GTTTGAGCAA TCTGAGTACG GTAGTG.ATTC
ATTGACACCA GCTATCATTT TTGTGTTGAC AATTTTAGTC AACCAAGAAA AGTACAATAC AGCGGAGGCC TATAATACAC TGGTTCCTTA AACTATCCAA C-GTCCTCCTG GTAGCGGTAA TTACCCTCAG ^GA<^^TAG TCTACACTGC TGAAAAAGCA GCCAAAAACT TCA^ATGTTGA CAGAGTTGAT TCTTACACAC GCTTTAAGCC TACTCTTAAT GCTCTACCAG AAGCAAGTIG GTGTACTAAT TATGATCTTA GTGTCATAAA TGTTGCAGAC CCACAGCAGC TACCAGCTCC
188 546
ACCC-CAC-C-AT Tl.CAATGTTG TAACCAAAhG CCATAAATGT TACAC-GTGCC CACCTGAAAT ΑΑΑΤΑΑΑΊΤΤ GTACCTGTCA ACCCAGAATC TCAC-ATTCAC ATTGAGTCTA ACTCTTCTAT CTTTTTAC-CA CATAATCCAA AATCGCGTAA AAATTATGTT GCTCGGCGTC TTCTTC-GTTT TAC-TC-AC-TAT GATTACGTCA TCTAGCTCCT C-ATGTC-GGTA ATCCAAAAGG CATCCGTTGT C-f.TCGTGATC CTATTAATAA CAATGTTAGA CAAATC-AATC- GTCTTATGTT ATTTTGCAAC ATTGTTTGTA GATTTGATAC TCGCACTCGC C-GTGCATTGT ATGTTAATAA CCATGGTTC GCTAAGCTTA AACCTATGCC ATTCTTTTAC C-GGCAACCTA ATTATGTACC ACTT.AAGTCA C-GTGCTGTCT C-CAAGAAGCA TGCTGCTCTT TTTATGGAGG CTGGTTTTAC AATATGGTGT CATGGTTTTG TTAATAGCAA AGCACTTCAG AAGAAAGGTC- CCTTCACCGG TTTAAAAGGT ATAATGGTAA GAGATGGACC TACTGACAAA AC.AAATGTAG CTTTTGAGTT ATATGCAAAA ATACTTAGGA ATTTAGGTGT TGTCGCAACA GAACGTCCTr TCTCAAATTT CACTAAGCAA C-TTGTAACAT GTTTTGATAA TAGTATTGCT GATGCAGTGC TTATTTCTAA TAACGCTGTG GGCCTTTTGA ATGATCTACC TGTAAGTACT TATGTGCGCA AGAATGGTGA GTACGTCGAA ACTTTTGAAA CCTTCAAACC TCGTAGTACA ACACTCTTCA TCCAAAAGTA TGGTCTTGAG C-ATGTCTCTA AAACTACCAT TGGTGGTATG AAAATCGGTT TGTTTTCCGT TCAAGAATTT TGTTGTATTA CATATGCTGA TGATCCATCT CTCTTGCACG ATTTTGTGAC TATCATTAAG C-TGGATGTCA TTGTAGATTG TAAGGCATGG ATTAAAACCT TCTATCCACA ACTCCAATCT ACACTGTACA AAATCCAGCC TATGTCTCTC
AATGTC-CACA CTAGGACCTG ATGTCTTTTT 6360 TGTTAAAACA GTCTCTGCAC TTGTTTATC-A 6420 AAAC-CAGTGC TTCAAAATGT TTGTAAAAGG 6480 AAACAACAAG CAACTAGAGG TTGTCAAC-C-C 6540 AGCTGTTTTC ATCTCACCCT ATAATAGTCA 6600 GCAAACC-CAA ACTGTGGATT CCGCTCAGC-G 6660 CTGAAGATTT TTAATCCTGC TGCAATTCAC 6720 C-CTACAACAC CAATACCATG GTTTTGTTAT 6780 TGTCTGGATT ATGACTATAT GGTACATGC-T 6840 TGTAATGTAG ACATGTACCC AGAGTTTTCA 6900 TCTAAATTGT CTTTAGAAGG TTGTAATGGT 6960 CACACACCAG CTTATGATAG AAGAGCTTTT 7020 TATGATGATA GTAATTGTGA ACTTGTTCAT 7080 AATGTTTC-CA TAACAAAATG CAACATTGGT 7140 TACAGAGCGT ATGTTGAGGA TTACAACATT 7200 CCTCAAAACT TTGACACCTA TATGCTTTC-G 7260 AGTCTAGAAA ATGTCGCTTT TAATGTCGTT 7320 GACTTACCAA CTCCTGTTAT TGCTGACAAA 7380 TGTATTTTTA CAAATAAGAC TAGTTTACCT 7440 CGCAAACTTG GACTCACACC TCCATTAACA 7500 TATAAGTTTG TGTTGTGGGA TTATGAAGCT 7560 GTGTGTTCCT ACACTGATCT TGATAGTGAA 7620 GGCTCTTTTG AGCGTTTTAC TACTACAAGA 7680 AAAGGGCTTA GTGCCATTAA ATTACAATAT 7740 GTTGGAAATA AACCTGTCAC ATGGTATATC 7800 CAAATCGATA CTTACTATAC ACAGGGACC-T 7S60 ATGGAAGAAG ATTTTCTTAG TATGGATACT '920 CATTATGGTT TTGAACACGT TGTATTTC-GA 980 CATCTTCTTA TATCGCAAGT GCGCCTTGCA 8040 ATCAATAATT CTGACAGTAC ACTGAAAAGT 8100 TCTAAGAATG TGTGCACTTA TATGGACATA 8160 AGCTTAGATC TTAATGTTGT GTCCAAACTT S220 AGATGGATGT TGTCGTCTGA GAATTCACAT 8280 CCTGAATCGA ATCCCCGCTA TAGCATGCCT S34O GAACGGTGTA ATCTCTACAA TTATCGTC-CA 8400
188 546
CAAGTCAAAT TACCTGATGG CATTACTACT AATGTCGTTA AGTATACTCA GTTGTGTCAA 3460 TACCTTMCA CTACTACATT GTGTGTACCA CACAAAATCC GTGTATTGCA TTTAGGAGCT 3520 GCTa^^GCAT <χ·ακπ«: TCCTGGTAGT ACTGTATTAA GA^GATG^^ ACCAGATGAT 3580 C-CCATArrGG TTGATAATGA TTTGAGAGAT TACGTTTCCG ACG-CAGACTT CA^TrACA 3640 cCCTCATTGTA CTAGTCTTTA CATCGAAGAC AAGTTTGATT TCCΓCCTCTC ^11™^ 3700
AACACGraA AAGATGGT’TT CTTTACTTAT 8760 CTrCCTGCAr CΓCrrCCCAr TAAAATCACC 3820 TTGATTCAAA CAΊTΓCACTA TTGCACΓCTG 3880 G-AAG-GCTTTC TGATTGCTAT TAACTACTTA 3940 CC.AAATAr.AA TCCATCCCAA TTATATATTT 9000 CATAACTCAG TCCrACACAC TCCTAAATTC 9060 AATTTAAAAG AAAAAGAATT GAATGAAATC 9120 CrCATrACAA ATAATGCTAA CTTACTAAAC 9180 AAAATTGCTC TATTTATTAC ACTTTTAATC 9240 CAAACACTAT TACTTAATCA CTCTTTCAAT 9300 rATAGCACrΓ TAGCAGUAC CACATTACTA 9360 rTACrACCAT CACATrCTTA 9420 ΑΑΑΑα'αΏ' TTrCCCACGA ATTACTCCTC 9480 AAGCAOTGT AATAGCACCr ACAAGCAACC 9540 TTCCCAATCC TACATTTACr AATTrACACA 9600 ATCCAAGACC TAACCTCTGC ATCTAGTGAT 9660 τccrrrrcAT AcrcATACAA aaaa 9714
CATCC-CTCCA CAAAATCAAT TCACGCTGAA TCAT^TAkAGA CAAACrcTCA
G-AATTTAGrT CGAATAAAGA TTT^ATAT^GAA TTTTGTACAA CTCTTAACAC GTCATCATCA ^^ACCATACT (ęTCACAAAGC AATAGTAGAT rGCAGA_A.ACr CTACAATTAT CCCTCΓATCA AAcrcτccrr dAACAACGC acttattctt GTCATTG-CAT rACTAACCAA GGCrAACrTC ^-^<0 ACTTCGTTAA CACACCATGA n,ACTA.CTAA rTCCTACACΓ CCAATTATTA cttaaa-Actg tcaatgactt taatatctta AAACTGCTCC ΠCCACTAAT CTTTCTAGTC GTCACATTAA TCTAACGCAA CCCGATCrCr ArcGcccΓcr ctactcttct ACACAArGcτ CTATTGCATA TTAGCAAGTT TACAΊTTGAr ACTrTAAAGA rCCCCTACCA CGAGCCAACA TGTTOAAAT CrAAAATTCT TTCAAAAΊTr
188 546
2/27
CM
ΙΟ
ΙΟ
ΙΟ
ΙΟ .α
X.
CM
CO
Ο
CO m
CM
Ο
CM
188 546
CO 1 □
188 546
THER-
188 546
NUMER PASAŻOWANIA
ST NI 1 13 30 32 35 38 42 45
28.5 —
9.5 —
7.5 —
_1 (Genom ) — Dl-A _ Dl-B — DI-C -2(S)
4.4 •4 ·····-
_ 4 (sM)
-5(M)
-6(N)
FIG. 5
188 546
SONDA
UDER M N KONIEC 3'
NI 1 35 NI 1 35 NI 1 35 NI 1 35 RNA
FIG. 6
188 546
THER-1
p1 p41
mdi mdi' (pfu/komórkę)
10 10'3 10*2 10’1 10 RNA
— 1 (Genom ) — Dl-A
FIG.7
188 546
KOMÓRKI IPEC R KOMÓRKI PM
(iw/ddn) oueiui
to .2
c
rc
in 5
o
•N
Π3
«
re
o.
u
co O
E
□
CM c
CS
I rtJ D.
S ·<= <0 5 o
N (0 Cfl s °
a.
c ?
re ΐ
>o
E <
Z er in
E o
c ω
O <
o
I I
O Q
tt
W
I
W
E·
O
Ul re Ł re o 5 re o * re g S E a c ?
er
188 546
Μ Μ ρ1 ρ41
Β _
Μ Η ft 1 Η 1 w w Η PODKŁADKA Z SACHAROZY FRAKCJA GRADIENTU CIĄGŁEGO
GĘSTOŚĆ (g/ml) 1.19 1.11 gęstość (g/ml) 1.20 1.15
28.5_ 9.5 _ 7.5 — V = -
a b c d e
FIG.9
188 546
RNA genomowy (28.5 kb)
188 546 ?Or'z τci τfilii I Η
I I I I I I ty πράο ιη *- ό
φ ΙΛ τί σ>
II i I I i tJ-COCM CO .
U50
188 546
NCITTIAAACTAAAGTGAGTGTAGCCTCGCTATATCTCITCTTITACTTIAACIAGCCIIGTGCTACAITUGTGTCGGACACCAACIC
CAA£rA«CGAAATATTTCTCTTTCTATGAAATCATAGAGGACAAGCGTTGATTATTTCCATTCAGTTTCCCAATCACTCCTiCGAACCC
K A s ·
GCTTCACCGAACCGTCCAGTACCGTTCCCTCCCTATTTCGTAACTCGCCTAGTAGTAGCGACTGCGGTTCCCCCCGTACAACGTTCGGTA
GACCGCGTTCCGTCCTGICATCICCCTCGCCGGCCGCCAGGAGAATGAGUCCAAACAATICAACATCCTTGTTAATCAGGACTAJCAAG
H S S A 0 f A I L V N E 0 Y 0
TCAACGTCCCTAGTCTTCCTATTCCTGACCTCTTACAGGAAATTAACTACTGCTACCGTAATCGATTTGACGCCTATCTTTTCGTACCAG
V N V P s L P 1 R D V L 0 E 1 A Y C Y R N C F E G Y V F V P
AATACTCTCGTGACCTAGTICATTCCGATCGTAAGGATCACTACCTCATTGG1CTTCTTCCTAACGGAGTAACTGATCTTAAACCTGTTC £ Y C R 0 L V 0 C D R A D Η Y Y I C V L G N C V S D L A P V
TTCTTACCCAACCCTCCGICATGTICCAAGGCnTATTCTTACACCTAACTGCAATGCCCTICTTCACCAClTTGACCTIAAAATTCCK
L L I E P S Y « L 0 G F I V R A N G N G V L E 0 F D L A 1 A
CCACTCKACACGTCCCAIAUTCTIGAICAATACATCTCTCCICGICATCGAAAACCACICATTCAACGCGAITTTAACCACTACITCG
R 1 V R G A 1 Y V 0 0 Y II C C A 0 C A P V 1 £ C D £ t ΐ Y F
CTCATGAAGACATCATTCAATITGAAGGACAGGACTACCATTGCGCTIGCACAACTCTGCGCGATGAGAAACCCCTCAA1CAGCAAACTC
C D E 0 I 1 E F E C E E Y H C A V ϊ T V R D E A P L N 0 Q Ϊ
TCinACCATTCAGCAAAICCAAIACAATCTCCACAnCCTCATAAATTCCCAAACTCTGCTACTACACATCTACCACCACCACTCAAAA
L F I I 0 Ε I Q Y N L 0 i P Η A l P N C A l R H V A P P V A
FIG. 12/1
188 546
ACAACTCTAAAArAGTTCTCTCTGAACATTACAAGAAGCTTTATCATATCTrCCCAICACCCTTTATGGCAAATGGTGACTCrCTTAGCA 990
K N S Κ I V L S Ε 0 Y Κ Κ L Υ 0 I F C S Ρ F Μ C Ν C 0 C L S
AATGCTTTGACACTCTTCATTTTATCGCTGCTACTCTTACATGCCCGTGTGCTTCTCAAACTACCCCCGTTGCAGATTCGACTCGTTTTA 1080
XCFDTLHFIAATLRCPCGSES5GVGDVTGF
ACACTGCCTGriGTCGTCTTTCTGGCAAACTTAAGGGTGTCACTTICGGTGATArTAAGCCTGGTGATCCrcrTCTCACTAGTAIGAGCG 1170
Κ 1 A 0 [ Ε L S Ε Κ V Κ 0 V 1 L C 0 I Κ Ρ C 0 A Υ V 1 $ Η S
CAGGTAAGGGAGTTAACTTCTTTGCCAATTGTGTTCnCAATATGCrGCTGATCTTCAACGiGTCTCCArcrCGAAACTTATTAAAACTT 1260
A G Κ C Υ Υ F F A Ν C Υ I Q Υ A C D Υ Ε G Υ S I V Υ Υ I Κ Γ
TTACAGrTGATGAGACTCTATGCACCCCTGCTTTTGAAGGCGAATTGAACCACTTCATCAAACCTĆAGAGCAAATCACrAGTTGCATCCA 1350
F Τ Υ 0 Ε ΐ Υ C Τ Ρ C F Ε G Ε I Ν D F 1 Υ Ρ Ε S Υ S I Υ A C
GCGTTAAAAGACCATTCAnACTCCTGATATTCATCATCCTGTACATCAITCTATCATTACAGCAAAATTCGAICTTACTACCAACCITI I4W
S Υ Υ R A F 1 Τ G 0 1 0 0 Α Υ Η 0 C 1 ITGKiOLSTHL
TTCGTAATCnCCTCTATTATTCAAGAACACTCCATGGTTTCIACAAAAGTGTGCTGCACITTTIGTAGACGCTTGGAAAGTAGrACACC 1530
F G Ν V C l l F Κ Κ Τ Ρ V F Υ Q Κ C C A l F Υ D A V Κ Υ Υ Ε
AGCTTTGTGGnCACTCACACITACAIACAAGCAAATTTATGAAGTTGTAGCATCACTTTGCACTTCTGCTTTTACCATTCTAAACTACA 1620
Ε I C G S I Τ I ί Υ Υ Q I Υ Ε V Υ A S ί C 1 S A F Τ 1 Υ Ν Υ
AGCCAACATTTGTGGITCCAGACAATCCTGTTAAAGATCTTGTACACAAGrcrcrGAAACTTCTTGTAAAAGCATTTCATGTTTTTACCC 1710
Κ Ρ 1 F Υ Υ Ρ Ο Κ R Υ Υ Ο I Υ Ο Υ C Υ Υ Υ I Υ Υ A F Ο Υ F ϊ
FIG. 12/2
188 546
ACłTTATCACWTACCTCCTATTCAGCCCUATCCTTTCTCCTTCGTCCUUTACUCTTCTTCAATMTCCACTTGKAAACTIGTCA 1600
QliTlACłEAKCfVLCAKYLLFNNALVKlV GTCTTAAAATCCTTGGCAACAACCAAAACGCTCIICAATCTCCATTCTTTCCIACTACCITCGTTCCTCCAACTCTTAATCTGACACCTA 1890
SVKlLCK(iQICCLECAFFATSLVCATVNYTP
AAACAACAGAGACTCCCACTATCAGCTTCAACAAGCTTCATCATGTTGTAGCACCACGAGAGCCTTATATCGTCATTGTTCGTGATATCG 1960
KRTEIATISLNKYDOYYAPCECYIYIYCDH CTTTCTACAACACTGCTCAATATTATTTCATGATCTCTACTCCTAATTTTCTTCTTACTAACAATGTTTTTAAACCAGTTAAACTTCCAT 2070
AFYKSGEYYFnHSSPHFYLIHHYFKAYCYP
CTIATCACATCGTTIATCATGTTCATAATCATACCAAAAGCAAAATCATTCCAAAACTTCCTTCATCAIITCAACAAATACCAACTGCCA 2160 I II
SYOIYYDYONOTtSICHlArLCSSFEOIPTG CACAAGATCCAATTCGCTTCTGTATTCAAAATCAACTTTGTCTTCrCTCTCCTTCTTCCCTTAACAATGCITCCATCTGCCATCGTAC-TI 2250 toop1rfciekevcyycgcvl«hcchcort
CIATCCACACTTUACTCTTCATCfoWWAAAĆŚAĆtŚWC^ 2340 •SKLFrRYRGSSAARLEPCNCTOP
Sł1QSFTYDQSYLNECCYLYQL0·
ACACCATCITACTACACCTTTTCACATCTACAACAAACATCTTCCCTCTATTCCTAAATTCCTTAACACCAATTCTTCAACATITACCAA 2130 OHYSRAFOIYHKOYACICCFLKTNCSRFRH
TTTCCACAAACAICATCCCTACTACATTCTCAAACGTTCTACAAACACCCTTATGGACCATGACCAAGTCTGTTATAACCATCTTAAACA 2520 LDKHDAYYlYKRCIYlYNOHEflYCYHOLiO
FIG. 12/3
188 546
TTCTCCTCCTCTTCCTGACCATCACTICTTCACATATAAACAGCGTACATCTCACTTCGCTAATCTTCCACCTACCAATCTTACAAACTA 2610 S C A Y A Ε Η 0 F F I Υ Y E G R C E F G Ν Y A R R Ν L I Υ Υ
CACAATCATCCATCTTTCTTACCCYATCACAAATTTTCAYCAAAAGAACTCTCAACTTCTCAAACAAATACTCCTCACACTACCTCCTTC 2700 Τ Κ H 0 L C Y A I R H F D Ε Y N C Ε Y l Υ Ε 1 L Y 1 Y C A C
CACTCAAGAATTCTTTCAAAATAAAGATTCCTYTGATCCAGTTGAAAATGAAGCCATACATGAAGTTTATGCAAAACITGCKCCCATTCT 2790 1 Ε E F F Ε Ν Υ O V F D Ρ Υ Ε Ν Ε A I Η Ε Y Y A Y L C Ρ 1 Y
AGCCAATGCTATCCTTAAATCTGTTCCTrTTTGCCATGCCATACTCGAAAAACCCTATATAGGTGTTATAACACnCACAACCAACATCr 2880 A Ν A H L Y C V A F C O A ! Υ Ε Y C Y 1 C V I 1 L O N O O L
TAATGCCAATYTCIACCATTICCCCCATITCCICAAGACKCICCCCCITTICCTICCCCITCICTTACAICATATTAITCITATATCAI 2970 H G N F Y O F G O F Υ Υ I A P C F C C A C V' 1 S Y Y S Υ Η N
GCCnTAATGGGGATGACTTCAlGCHAGACTCTGAAAACTlTGlGAAAAGTCACAKlAlGGTTClGATIATAAGCAGTAIGATTTACT 3060 P L H G H I S C L E S Ε N F Y Y S O 1 Y G S D Y Y 9 Y O L L
AGCIlATCATTTIACCCAACATAACCAGTAGCliriCCAAAAArACiriAACTACTCGGAlCCCACATAlCACCCAAATTGlICTGAIlG 3150 A Y O F Τ Ε Η Υ Ε Y L F Q Y Y F Υ Υ V O R Τ Υ Η Ρ N C S O C
TACTACICACCAClCTAITArTCAnCTCCTAAlIIIAACAiATlCTTTTCIAlCACAATACCAATCACACCniTCCACCACnCTCCC 3240 1 6 O E C I I H C A N F Ν T L F S « 1 I Ρ Ν 1 A F C P L Y R lAAAGTTCAlATTGAlGGlGTACCAGTACTiClTACTGCAGGTTACCAllTCAAACAACllGGlAlAGlAiGGAATCTlGAlGTAAAAiT 3330 Υ V Η I D C V Ρ Υ Υ Y 1 A C Y H F Y Q l C I V V Ν l O Υ Y l
AGACACAATGAACTlCAGCATGAClGAlClTClIACAniClCACAGAlCCAACACllCHGlAGCAlCAAGCCCICCACnTIACACCA 3420 D 1 Η Y L S « 1 O L L R F Υ I O Ρ 1 l l Y A S S P A L l O O
FIG. 12/4
188 546
CCGIACTCTCTGTTTCTCCATTGCAGCTTTGAGTACTGGTATTACATATCACACACTAAAACCACGTCACTTTAACAACCATTTCTACGA 3510 R T V C F S I A A L S 1 G I 1 Y 0 T V K P G H F N K D F Y 0
TTTCATAACAGAGCGTGCATTCTnGAAGAGCCATCTGAGITAACATIAAAACAITTHTCTTTGCACAGGGTGGTGAAGCTGCTATGAC 3600 F I I E R C F F Ε E G S E L T L K H F F F A Q C C E A A « i
AGACTTCAATTATTATCCCTACAATACACTCACACTACTTCATATTTGCCAACCTCAATTTCTTTACAAAATAGTTCCCAACTATTTTCA 3690 0 F 'n y Y R Y κ R V T V L 0 I C Cl A 0 F V Y K I V G K Y F E
AIGnATGACGGTCGGTGCAlIAAlGCICGIGAAGIlGTIGTlACAAACTAIGACAACAGIGCTGGCTATCCTITGAACAAAITTCGTAA 3780 C Y 0 G G C 1 H A R Ε ¥ V V T H Y O K S A C Y P L N f F G K
AGCTAGACTTTACTACGAAACTCTTTCATATGAAGAGCAGGATGCACTTTTIGCITTAACAAAGAGAAATGTTTTACCCACAATGACTCA 3870 A R L Y Y Ε T L $ T £ t Ο δ A i f Ά i 1 $ R H ¥ i ? f $
AAICAATTTGAAATACGCTATTICTGGTAAGCCAAGAGCTCGTACAGTAGCACCACTTTCACTTCTTICTACCATGACTACGACACAATA 3960
ICATCACAACCAinGAAGTCAAnGCTGCAACACCCAATGCTACICTCGlCATTCCTICAACCAAGTITTATGGIGCITGGGACAAIAI 1050
...........................................................·?’.......................··' ····'·'·.......· ···'.......·-·········-·······.·.·.......·.......
GCTTAAAAATTTAATCCCTGATCITGATAAIGGTTGTTTGAICGCATCCCACTATCCTAAGTCIGACCGTGCTTTACCTAATATGATTAG 1110
EKEBSSfKttE.
AATGGCTTCIGCCłTGAIATIAGGITCTAAGCATCITGCUCTTGTACACATAAlGATACCTTCTACCGCCTCTCCAATCACTTACCTCA 1230
KW®· KW1W Ez - WE Wm ΒΙΚΒβΒβΕΙΙΒΟ
FIG. 12/5
188 546
AGTACTCACACAAGTTGTGCATTCCACAGGTCCTTTTTATTTTAAACCICGTCGIACAACTAGCGGTGATCCTACTACACCATAICCTAA 4320
CTCTGCTTTIAACATCTTTCAACCTCTTTCTCCTAATCTTAATAACCTTTTCGCCCTTGATICAAACCCTTCTAACAACCTrAjCACTAAA 4410
ATCCATACAACGTAAAATTIACCATAAnCTTATCGTAGIAGCACCATTGATCAACAATTTCTTGTICAGTACTTTACTTATTTGACAAA 4500
ACACTTTTCTATGATGATTTIATCTCATCATCCAGTTGTGrGCTACAACAAAGATIATCCGCATTIAGGTTATGTAGCTGACATTAATGC 4590
POLIMERAZA
TTTTAAAGCAACACTTTATTACCAGAKTAACGTCTTTATGTCCACUCTAACTGTTGGGTAGAACCAGATCTTACTGTTGGACCACATGA 4630 £<<·* *. $ -O :O/H: ?l'i; h? wfe
AITTTCITCACACCATACATTGCAGATTGTTCGGCCTGATGGACACTACTATCTTCCCTATCCAGACCCGTCCAGAArTTTGTCACCTGG 4770 pdgdyylpypdpsrilsag
TCTCTnGTTGATGACATACTTAAAACACACAATGTTAITATCTTAGAACGnACCTGTCAITGGCTATIGACCCATACCCGCTCACAAA 4860 Y F Y 0 0 I Y 4 T D N Y I H L E R Y Y S L A 1 0 A Y P L I 4
ACACCCTAAGCCTGCTTATCAAAAAGTGTTTTACACTCTACTAGATTCGGTIAAACATCTACAGAAAAATTTGAATGCAGGTGTTCTTGA 4950 Η P 4 P A Y 6 4 Y F Y 1 L L 0 V Y 4 H L Q X N L X A G Y L 0
TTCGTTTTCAGTCACAATGnAGAGGAAGGTCAACATAAGTiCTCGACTCAAGACTITTACCCTAGCCTCTATCAAAACTCCACTGTCTT 5040 S F S V I Γ L Ε Ε'·. Ο ϋ'ϊί .f '< S:. E. ć £'·£+ 5ΐίΓ:.Ύ'··1
WIĄZANIE CYNKU '
GCAAGCTGCAGGCATCYGTGTAGTATGTGGlTCGCAAACTGTACTiCGTTGTGGAGACTCrCTTACCAGACCACTTnATCCACCAAATC 5130 1'M'rc « c ;v Ύ.-..c c. s' o i y i ί;'ί r
FIG. 12/6
188 546
TGCTTACGACCATGTTATGGGAACAAAGCATAAATTCATTATGTCTATCACACCATAICTCTGTAGTTTTAATGGTTGTAATCTCAATCA 5220 H οί/ΐ c ν v « o
WIĄZANIE CYNKU
TCTTACAAAGTTCTTTTTACGTGGTCITACTIATTATTGTATGAACCAęAAACCACACTTCTCATTCCCACTCTGTCCTAATCGCAACGT 5310 V I K L F L G C L S Υ Ϊ C H Ν Η K P Q L $ F P L C A N C Ν V
TTTTCGTCTATATAAAACTAGTGCAGTCGCCTCAGAGCCTGTTCAACATTTCAACAAACTTGCAGTTTCTGACTGCACTAATGTACAACA 5Ί00 fglykssavcseaveofnklaysowtnyeo
CTACAAACTTGCTAACAATGTCAACGAArCTCTGAAAATTTTCCCTGCTCAAACTGTCAAACCTAACGAGCAGlCTGTTAAATCTCAATA 5490 YKLANNYKESLKIFAAETYKAKEESYKSEY
TGCTTATCCTCTATTAAAGCACCTTATCCCCCCTAACCAAATTCTACTCCAATGCGAAGCTTCIAACACTAACCCTCCACTTAACAGAAA 5580 A Y A V l K E V I G Ρ K E I Y l Q V E A S r T K Ρ P L N R N
TTCAGTTTTCACGTGTTTTCAGATAACTAACGATACTAAAATTCAAITACGTGAATTTCTGTTTCAGCAATCTGACTACCGIAGTGATTC 5670 S Y F T c F Q I S K D 7 K I D L G E F Y F E D S E Y G S O S
TCITIATTACAAGAGCACCAGTACTTACAAATTGACACCAGGIATGATTTTTGTGTTGACTICICAIAATGTGAGTCCTCTTKAACCTCC 5760 YYYKSTSTYKLTPCHIFYLTSHNYSPLCAP
AATTTTACTCAACCAAGAAAAGTACAAIACCATATCTAACCTCTATCCICICTTTAATATAGCCCAGGCCTATAATACACTGGITCCTTA 5850 1LYH0EKYNTISKLYP
CTACCAAATCATACGTAACCAAAAATTTACAAClATCCAACCTCCTCCTCGTACCGCIAAAICTCATTCTCTTATACCinCCCTTTCTA 5940
..•.•.•z.·.·.·.·.·...·. λ’·...·λλ..·.λ· ·.·.·.·.·.·.·?·., Y ........λ .. λ ?.·, · '.z.;.'?.·?.·.·.?.·.. Χ..λ·.Λ· ..ν... .*·'“· ' ·. · .·.·
HELIKAZA
FIG. 12/7
188 546
TTACCCTCAGGCGAGAATAGrCTACACTGCATCTTCTCATGCCGCTGTAGACCCTTTATGTCAAAAAGCACCCAAAAACTTCAATCITCA 6030
TACATGTTCAAGCATAATACCTCAAAGAATCACACT1GATTGTTACACAGGCTTTAAGCCTAATAACACCAATGCGCAGTACTTGTTTTC 6120 L F C
TACTCTIAATGCTCTACCAGAAGCAAGTTGTCACATTGTTCTAGTTCATCACGTCTCTATGTGTACTAATrATCATCTTACTGTCATAAA 6210 T V N A L P E i S C 0 I Y V V 0 Ε V S H C T N Y D l S V 1 H
TAGCCCACTCAGTTACAAACATATTGTTTATGTTGGAGACCCACAGCAGCTACCACCTCCIACAACTTTGATTAATAACGGTGTACTTCA 6300 S R L S Y K Η 1 Y Y V G 0 P Q 0 L P A P R I L I Η K G V L 0
ACCGCAGGATTACAATCTTCTAACCAAAAGAATCrGCACACTAGGACCTGArGTCTTTTTGCATAĄATGTTACAGGTGCCCAGCTGAAAT 6390 PODYNYYTKRHCTLGPDYFIHKCYRCPAEI
TCTTAAAACAGTCTCTCCACrTGTTTATGAAAATAAATTTGTACCTGTCAACCCAGAATCAAACCAGTGCTTCAAAATGTnCTAAAAGC 6480 V kS Y S A L Y Y ε η K F V P Y N P E S K 0 C F K H F Y K G
TCACiTTCAGATTCACTCrAACTCTTCTATAAACAACAAGCAACTACACCTTCTCAAGCCCTTTTTACCACATAATCCAAAATGGCCTAA 6570 £
0*1 Q I E S N S S I N N K O L Ε V V ( A F L A Η N P K V R K
AGCTCTTTTCATCTCACCCTATAAIAGlCAAAAITATGTTGCKGCCGICTTCHGCITIGCAAACCCAAACTCTGGAITCCGCiCAGGC 6660 A V F I S P Y H S Q Η Y Y A R R L L G L Q I Q 1 Y D 9 A Q G
TAGIGAGlATGAlIACGlCATC^A^lGClClGAAGAlTlTlAAlCClGClGCAinCACGAlGTCGGTAAlCCAAAAGGCAlGGGlTGT 6750 S Ε Y D Y Y I ·
II II!
CCTACAACACCAATACCATGCTTTTGTTATGATCGTGATCCTATTAATAACAATGTTACATGTCTCCATTATCACTATATGCTACATGCT 6840
FIG. 12/8
188 546
CAAATGAAIGCICIIATGIlAlIllGCAAClGiAAlGlACACATGTACCCAGACTTIKAATTCTTICTACATITCATAClCCCACTCCC 6930 KTAAAnGTCllTAGAAGGTlGTAATCGIGClCCATTGTATGTTAATAACCATGCTTTCCACACACCAGCTTATCATACAACACCTTTT 7020 GtTAAGCTTAAACCTATGCCATTCnTlACTAlCATCATAGTAATTGTCAACITCTTGATCCGCAACCTAATTATCIACCAClTAAGTCA 7110 AATGTTTGCATAACAAAATGCAACATTCGTGGTGCTGTCTCCAACAAGCATGCTGCTCTTTACACAGCCrATGTTCACCATTACAACATT 7200 HTATGCAGGCTGGTTTIACAAIAIGCTCTCCICAAAACTTTCACACCTAIATGCITTGCCAICCTTTTGITAATAGCAAAGCACTTCAC 7290 ACTCIAGAAAĄiGIGGCrTTTAATGTCCTIAACAAAGGTCCCTTCACCGGTTTAAAAGGTGACTTACCAACTGCTCUAlICCTCACAAA 7380 ATAATGCTAAGAGATGGACCIACTGACAAATCTATTTTTACAAATAAGACTAGITTACCTACAAATGTAGCITITGACTTATATGCAAAA 7470 CCCAAACTTCCACICACACCTCCATTAACAATACTTAGCAAITTACCICTTGTCGCAACATATAAGTTTCTGTTCTGGGATTATCAAGCT 7560 CAACCTCCTTTCTCAAATTICACIAACCAACTGTCTTCCTACACTCATCTTCATACTCAACTTCTAACATCTTTTCATAATACTATTGCT 7650 GGCTCTTTTGAGCGTTTTACTACTACAAGAGATGCAGTGCTTATTTCTAATAACCCTCTCAAAGGCCTTACTGCCATTAAATTACAATAT 7740 CCCCTTTTCAATGATCTACCTCTAACTACTGTTGCAAATAAACCTCTCACATCCTATATCTATCTCCCCAACAATCCTCAGTACCTCCAA 7830 CAAATCGATAGTTACTATACACACGGACGTACIITTGAAACCTTCAAACCTCGTAGTACAATGGAACAAGAITTTCTTACTAlCGATACI 7920 ACACTCTTCATCCAAAAGTATGCTCTTGAGGATTATGCTTTTGAACACGTTCTATTTCGAGATCTCTCTAAAACTACCATTCGTGCTATC 8010 CATCITCTTATATCGCAAGTGCGCCTTGCAAAAATGGGTTTCrTTTCCCITCAAGAATTTATGAATAATTCTGACAGTACACTGAAAACT 8100 TGT1GTATTACATATGCTGAICATCCATCTTCIAAGAATCTGTCCACTTATATCGACATACICTTGCACGATTITGTGACTATCATTAAG 8190 ACCTTAGATCTTAATCTTGTGICCAAACTTGTCGATGKATTGTACATTGTAAGGCATGCAGATGGATCITGTCGICTGAGAATTCACAT 8280 ATTAAAACCTTCTArCCACAACTCCAATCTCCTCAATCCAATCCCCCCTATACCATCCCTACACTGTACAAAATCCACCGTATGTGTCTC 8370 GAACCGTCIAATCTCIACAATTATGGIGCACAAGTGAAATTACCTGATGGCATTACTACTAATGTCGTTAAGTATACTCAGITGTGTCAA 8460 TACCrrAACACTACrACArTCTCTCTACCACACAAAArCCCTGTATTCCATTTACCAGCrCCTGCTGCATCTCCTGTTCCrCCrCCTACl 8550 ACTCTATTAAGAAGATGGTTACCAGATCATGCCAIATTCGrTGATAATCATITGAGAGATTACCTTTCCCACCCAGACTTCAGTCTTACA 8640
FIG. 12/9
188 546
GGTCATTGTACTAGTCTTTACATCGAAGACAAGTTTCATTTCCTCGTCTCTCATTTATA7CAIGCCTCCACAAAATCAATTGACGGTCAA 8730
AACACCTCGAAAGATGGTTTCTTllCTTATATTAAIGCTTTCATTAAACAGAAACTGTCACTTCGTGCATCTGITCCCATTAAAATCACC 8820
GAATITAGTTCCAATAAAGATTTATATCAATTGATICAAAGAITTCAGTATTCCACTGTGTITICTACAAGTGTTAACACGTCATCAICA 8910
CAACGCTTTCTGATTGGTATTAACTACTTACCACCATACTGTGACAAAGCAATAGTAGATGGAAATATAATCCĄTGCCAATTATATAITT 9000
TCCACAAACTCTACAATTATGCCTCTATCACATAACTCAGTCCTACACACTCCTAAATTCAACTGTCGTTGTAACAACCCACTTATTCTT 9090
AATTTAAAAGAAAAAGAATTGAATCAAATGCTCArrGGATTACTAAGGAAGGCTAAGIIGCTCATTAGAAATAATGCTAAGTTACriiAC-igifiO
TTTGGTAACCACTTCGTTAACACACC^T^AAAAATGCTGTATTIATTACAGTITrAAICITACTACIAATTGCTAGACICCAATTATTA 9270
III i ► IV
HKKCCIYYSFMLTTNW·
CAAAGACTAITACIIAATCACTCITTCAATCTTAAAACTGTCAATGACITTAATATCTTATATAGGAGTTTAGCAGAAACCAGATTACTA 9360 AAAGTCCTCCTTCGAGTAATCTTTCTACTCrTACTAGGATTTTGCTGCTACACATTCTTACTCACATTAATCTAACGCAACCCCATCTC7 9450 AAAACTGGTTITTCCGAGCAATTACTGGTCATCGCGCIGlCTACTCnGTACACAATGGTAACCACGIGTAATAGGAGClACAACCAACC 9540 CTAlTCCATATTAGCAACTTTACATTTCAmCGCAATGCTACATTTAGrAAnTACAGAAGTTTAAAGATCCGCTACGACCAGCCAACA 9630 ATGGAAGAGCTAACGTCTGGATCTAGTCATTGTTIAAAATGTAAAAITCnTGAAAATITTCCTTTTGATAGTGATACAAAAAA 9714
FIG. 12/10
188 546
ΙΛ
Ο
ο Ε Ω
< 2 < ζ U.
2 ω Ζ UJ CC
Οί Π) EC ϋ ο
188 546
ΛΛλΙΟΙΛΙ
188 546 gCACAUCUACAACAA 3' (2376) c I » C A
U-A
CucU c - G
C A
U
5' (2282) 1
U-T
U-A
G-C
G-C
G-C
C-U
C-G
G-C
A
G
A „C
UUUAAACGACU-AAUCGUACUGAU
B
S' -[UUUAAAC |«
FIG.15
C>CUUAUA 3’ (2506)
U c
UU UAAACGAGU-AAUGGU ACU CA N(142)
188 546
188 546
TAATACGACTCACTATAGGG
ATTATGCTGTGTGATATCCC z /
/ /
/ /
/ /
Miejsce rozszczepienia autokatalitycznego
AAAAAAA GGGTCGGCATGG ΙΙΙΙΊΙΙΙ CCCAGCCGTACC x-C=jPrT7[L|ó. 1 cDNA DI-C V GPT , J jpoliA[Rz HDV| T7Ć
Bluescript II
Transkrypcja in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7
DI-C RNA
W*
Transfekcja komórek ST
Amplifikacja
Infekcja wirusem komplementarnym
FIG. 17
188 546
ω
Ο <
ω
I <
δ
ο.
Ο
LL
188 546
FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (19)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wektor ekspresji antygenów zdolnych do indukowania układowych i wydzielniczych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, lub przeciwciał, które nadają ochronę względem wspomnianych czynników zakaźnych, przy czym antygeny lub przeciwciała prezentowane są w przewodzie pokarmowym i drogach oddechowych zwierząt traktowanych rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym wspomniany wektor ekspresji, znamienny tym, że obejmuje:
    a) wadliwy genom wirusowy pochodzący z wirusa przenaszalnego zapalenia żołądka i jelit świń (TGEV) lub komplementarne do niego DNA (cDNA), zawierający sygnały rozpoznania replikazy TGEV zlokalizowane na końcach 3' i 5',i, przynajmniej, promotor oraz
    b) przynajmniej sekwencję DNA kodującą produkt wybrany z grupy składającej się z (i) antygenu zdolnego do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek, i (ii) przeciwciała, które nadaje ochronę względem wspomnianego czynnika zakaźnego, przy czym wspomniana sekwencja DNA jest operacyjnie związana z, przynajmniej, promotorem, który występuje we wspomnianym wadliwym genomie wirusowym pochodzącym z TGEV.
  2. 2. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany wadliwy genom wirusowy pochodzący z TGEV lub cDNA komplementarne do niego zawiera ponadto kompletną sekwencję kodującą replikazę TGEV.
  3. 3. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inny antygen zdolny do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek.
  4. 4. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inne przeciwciało, które nadaje ochronę względem czynnika zakaźnego wykazującego tropizm do śluzówek.
  5. 5. Rekombinacyjny układ ekspresyjny do ekspresji antygenów zdolnych do indukowania układowych i wydzielniczych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, lub przeciwciał które nadają ochronę względem wspomnianych czynników zakaźnych, przy czym antygeny lub przeciwciała prezentowane są w przewodzie pokarmowym i drogach oddechowych zwierząt traktowanych rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym wspomniany wektor ekspresji, znamienny tym, że obejmuje:
    (a) wektor ekspresji antygenów zdolnych do indukowania układowych i wydzielniczych odpowiedzi immunologicznych przeciw czynnikom zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, lub przeciwciał które nadają ochronę względem wspomnianych czynników zakaźnych, opisanych w zastrzeżeniu 1 do 4; i (b) wirus pomocniczy.
  6. 6. Układ według zastrz. 5, znamienny tym, że wspomniany wektor zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inny antygen zdolny do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek.
  7. 7. Układ według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera różne wektory ekspresji opisane w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4, przy czym każdy z nich zawiera inną sekwencję DNA, kodującą inny antygen zdolny do indukowania układowej i wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikowi zakaźnemu wykazującemu tropizm do śluzówek.
  8. 8. Układ według zastrz. 5, znamienny tym, że wspomniany wektor zawiera więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje inne przeciwciało, które nadaje ochronę względem czynnika zakaźnego wykazującego tropizm do śluzówek.
    188 546
  9. 9. Układ wedhig zastiu. 8, znamienny tym, że zawiera różne wektory ekspresji opisane w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4, przy czym każdy z nich zrwierr inną oekwenc-ę DNA kodującą inne przeciwciało, które nadaje ochronę względem innego czynnika zakaźnego wykazującego tropizm do śluzówek.
  10. 10. Układ według zaotrz. 5, znamienny tym, że wspomniany wirus pomocniczy dostarcza funkcjonalne i strukturalne białka do replikacji i rnkapsedacji wadliwego genomu wirusowego pochodzącego z TGEV.
  11. 11. Układ według zastrz. 5, znamienny tym, że wspomniany wirus pomocniczy dostarcza białka strukturalne do rnkapsedacji wadliwego genomu wirusowego pochodzącego z TGEV.
  12. 12. Szczepionka do ochrony zwierząt przed czynnikiem zakaźnym wykazującym tropizm do śluzówek, znamienny tym, ee zawiera układ rekombinacyjny opisany w dowolnym z zastrzeżeń 5 do 11 w odpowiedniej ilości, oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
  13. 13. Szczepionka według zastrz. 12, do ochrony świń przed czynnikami zakaźnymi świń wykazującymi tropizm do śluzówek, znamienny tym, że zawiera:
    (a) rekombinacyjny układ akspresy-ne wybrany z grupy składającej się z:
    (i) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego przenąjmnie- jeden wektor ekspresji zawierający przenajmnie- jedną sekwencję DNA kodującą antygen patogenu świń wykazującego tropizm do śluzówek;
    (ii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego wektor ekspresji zawierający więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje antygen innego patogenu świń wykazującego tropizm do śluzówek; i (iii) Kombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego różne wektory ekspresji opisane w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4, przy czym każdy z nich zawiera przynajmniej sekwencję DNA kodującą antygen patogenu świń wykazującego tropizm do śluzówek; i (b) koronawirus świń jako wirus pomocniczy.
  14. 14. Szczepionka według zastrz. 13, znamienna tym, że wspomniany patogen świń wybiera się z grupy składającej się z: Actinobacillus suis, Actinobrcillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, parwowirus świń, Leptospira, Escherichia coli, Ereoipelothrix rhusiopathiae, Pasteurelia multocida, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Serpulina heodesrnteriae, Mycoplasma hyopneumoniaa, wirus epidemicznej biegunki świń (PEDV), koronawiruo oddechowy świń, rotawirus, lub względem patogenów wywołujących zespół rozrodczooddechowy świń, chorobę Aujeszke'ego świń (psrudowścirklizna), grypę świń lub przenaszalne zapalenie żołądka i jelit oraz czynników etiologicznych zanikowego nieżytu nosa i prolifrratywnego zapalenia jelita krętego.
  15. 15. Szczepionka według zastrz. 12, do ochrony psów przed czynnikami zakaźnymi psów wykazującymi tropizm do śluzówek, znamienna tym, że zawiera:
    (a) rekombinacyjny układ ekspresyjny wybrany z grupy składającej się z:
    (i) Kombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego przynajmniej jeden wektor ekspresji zawierający przynajmniej jedną sekwencję DNA kodującą antygen patogenu psów wykazującego tropizm do śluzówek;
    (ii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego wektor ekspresji zawierający więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje antygen innego patogenu psów wykazującego tropizm do śluzówek; i (iii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego różne wektory ekspresji opisane w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4, przy czym każdy z nich zawiera przynajmniej sekwencję DNA kodującą antygen patogenu psów wykazującego tropizm do śluzówek; i (b) wirus pomocniczy wybrany z grupy składającej się z: Oronawirusa psów i rekombinacyjnego koronawirusa świń z ekspresją białka otoczki rozpoznawanego przez specyficzne receptory powierzchniowo-komórkowe na komórkach docelowych psów.
  16. 16. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że wspomniany patogen psów wybrany jest z grupy składającej się z: herprswirusew psów, adenowirusa typu 1 lub 2 psów, parwowirusa typu 1 lub 2 psów, reowiruoa psów, rotawirusa psów, koronawirusa psów, wirusa grypy rzekomej psów, wirusa grypy psów, wirusa nosówki, wirusa wścieklizny, retrowirusa i kaliciwirusa psów.
    188 546
  17. 17. Szczepionka według zastrz. 12, do ochrony kotów przed czynnikami zakaźnymi kotów wykazującymi tropizm do śluzówek, znamienna tym, że zawiera:
    (a) rekombinacyjny układ ekspresyjny wybrany z grupy składającej się z:
    (i) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego przynajmniej jeden wektor ekspresji zawierający przynajmniej jedną sekwencję DNA kodującą antygen patogenu kotów wykazującego tropizm do śluzówek;
    (ii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego wektor ekspresji zawierający więcej niż jedną sekwencję DNA, przy czym każda z nich koduje antygen innego patogenu kotów wykazującego tropizm do śluzówek; i (iii) rekombinacyjnego układu ekspresyjnego zawierającego różne wektory ekspresji opisane w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 4, przy czym każdy z nich zawiera przynajmniej sekwencję DNA kodującą antygen patogenu kotów wykazującego tropizm do śluzówek; i (b) wirus pomocniczy wybrany z grupy składającej się z: koronawirusa kotów i rekombinacyjnego koronawirusa świń z ekspresją białka otoczki rozpoznawanego przez specyficzne receptory powierzchniowo-komórkowe na komórkach docelowych kotów.
  18. 18. Szczepionka według zastrz. 17, znamienna tym, że wspomniany patogen kotów wybrany jest z grupy składającej się z: kalciwirusa kotów; wirusa niedoboru odporności kotów, herpeswirusów kotów, wirusa panleukopenii kotów, reowirusa kotów, rotawirusa kotów, koronawirusa kotów, wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, wirusa wścieklizny, Chlamydia psittaci kotów i wirusa białaczki kotów.
  19. 19. Szczepionka według zastrz. 12, do ochrony świń przed wirusem przenaszalnego zapalenia żołądka i jelit (TGEV), znamienna tym, że rekombinacyjny układ ekspresyjny zawiera przynajmniej jeden wektor ekspresji zawierający przynajmniej sekwencję DNA kodującą przeciwciało monoklonalne identyfikowane jako 6A.C3 zdolne do neutralizowania TGEV.
PL97328791A 1996-03-14 1997-03-12 Wektor ekspresyjny antygenów lub przeciwciał, rekombinacyjny układ ekspresyjny i szczepionka do ochrony zwierząt PL188546B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES9600620A ES2109189B1 (es) 1996-03-14 1996-03-14 Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas.
PCT/ES1997/000059 WO1997034008A1 (es) 1996-03-14 1997-03-12 Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL328791A1 PL328791A1 (en) 1999-02-15
PL188546B1 true PL188546B1 (pl) 2005-02-28

Family

ID=8294176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97328791A PL188546B1 (pl) 1996-03-14 1997-03-12 Wektor ekspresyjny antygenów lub przeciwciał, rekombinacyjny układ ekspresyjny i szczepionka do ochrony zwierząt

Country Status (13)

Country Link
US (3) US7041300B1 (pl)
EP (2) EP1741789A1 (pl)
JP (1) JP3769300B2 (pl)
KR (1) KR100360327B1 (pl)
CN (1) CN1318596C (pl)
AU (1) AU729044B2 (pl)
BR (1) BR9708061A (pl)
CA (1) CA2248978A1 (pl)
ES (1) ES2109189B1 (pl)
HU (1) HUP0000356A3 (pl)
PL (1) PL188546B1 (pl)
RU (1) RU2199584C2 (pl)
WO (1) WO1997034008A1 (pl)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0011732B1 (pt) * 1999-06-10 2014-02-04 Vacinas de dna para animais de companhia e de esporte
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
US6764685B1 (en) 2000-03-21 2004-07-20 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines
KR101412317B1 (ko) 2001-01-19 2014-07-24 비로노바티브 비.브이. 감응성 포유류에서 호흡계 질환을 유발하는 바이러스
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
ES2208051B1 (es) * 2002-01-24 2005-08-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas Secuencia de acido nucleico que comprende la señal de encapsidacion del rna de un coronavirus del grupo 1 y sus aplicaciones.
JP4553589B2 (ja) 2002-02-21 2010-09-29 メディミューン，エルエルシー 組換えパラインフルエンザウイルス発現系とメタニューモウイルスから得られる異種抗原を含むワクチン
ES2233145B1 (es) * 2002-11-20 2006-07-16 Laboratorios Hipra, S.A. Vacuna viva atenuada contra la pleuroneumonia porcina.
CA2523319A1 (en) 2003-04-25 2004-11-11 Medimmune Vaccines, Inc. Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
US20060165723A1 (en) 2004-09-03 2006-07-27 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
EP1650308A1 (en) * 2004-09-03 2006-04-26 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
US7959929B2 (en) 2005-04-21 2011-06-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
WO2006138435A2 (en) * 2005-06-16 2006-12-28 Mount Sinai School Of Medicine Methods for enhancing immune responses
EP1792996A1 (en) 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
BRPI0800485B8 (pt) * 2008-01-17 2021-05-25 Univ Minas Gerais vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose
RU2528750C2 (ru) * 2008-11-19 2014-09-20 Лабораторио Ави-Мекс, С.А. Де С.В. Рекомбинантная вакцина на основе инактивированного вирусного вектора
CN104262488B (zh) * 2014-09-24 2017-07-28 普莱柯生物工程股份有限公司 一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用
WO2021191688A1 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 Institut Pasteur Defective interfering viral genomes
US12533406B2 (en) 2020-04-12 2026-01-27 Novoscope Ip Limited Particles, DNA and RNA
EP4188435A4 (en) * 2020-08-03 2025-03-05 The Penn State Research Foundation Synthetic defective interfering coronaviruses

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
RU2031122C1 (ru) * 1992-09-07 1995-03-20 Владимир Иванович Грабко Способ встраивания гетерологичной днк в геном аденовируса celo и рекомбинантный аденовирусный вектор celo/рuc19
CA2132742C (en) * 1993-01-23 2000-04-18 Carmen Vela Olmo Synthetic peptides and vaccines against parvovirus

Also Published As

Publication number Publication date
AU729044B2 (en) 2001-01-25
US7041300B1 (en) 2006-05-09
US20040052775A1 (en) 2004-03-18
HUP0000356A3 (en) 2001-09-28
JP2000513565A (ja) 2000-10-17
KR19990087724A (ko) 1999-12-27
CN1218513A (zh) 1999-06-02
KR100360327B1 (ko) 2003-03-28
EP1008652A1 (en) 2000-06-14
HUP0000356A2 (hu) 2000-06-28
PL328791A1 (en) 1999-02-15
EP1741789A1 (en) 2007-01-10
CA2248978A1 (en) 1997-09-18
ES2109189B1 (es) 1998-05-16
RU2199584C2 (ru) 2003-02-27
WO1997034008A1 (es) 1997-09-18
ES2109189A1 (es) 1998-01-01
CN1318596C (zh) 2007-05-30
JP3769300B2 (ja) 2006-04-19
AU1927797A (en) 1997-10-01
US20070048862A1 (en) 2007-03-01
BR9708061A (pt) 2000-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL188546B1 (pl) Wektor ekspresyjny antygenów lub przeciwciał, rekombinacyjny układ ekspresyjny i szczepionka do ochrony zwierząt
EP1470218B1 (en) Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes
JP4637432B2 (ja) 感染性クローン
AU2002311668A1 (en) Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes
JP2012213407A (ja) ワクチンとしての複製欠損ｒｎａ−ウイルス
US7556957B2 (en) Coronavirus-like particles comprising functionally deleted genomes
US7279327B2 (en) Methods for producing recombinant coronavirus
HK1028067A (en) Vectors based on recombinant defective viral genomes, and their use in the formulation of vaccines
HK1064409A (en) Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant rna-virus

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080312