CN1318596C - 基于重组缺损病毒基因组的载体及其在疫苗制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

此类载体包括一种重组缺损病毒基因组，它表达至少一个适于诱导分泌或系统免疫反应的抗原或一种保护(动物)免受传染原感染的抗体。该病毒缺损基因组包含一种亲代病毒基因组，其3′或5′末端含病毒复制酶识别标识，并另含内部缺失，其中该缺损病毒基因组的复制和包衣依赖于一种辅助病毒。该载体适于形成含该表达载体和辅助病毒的重组系统。该系统适于制备单价和多价疫苗抗多种动物传染原，特别是猪，狗，猫，并作为抗传染原的保护抗体表达工具。

Description

基于重组缺损病毒基因组的载体及其 在疫苗制剂中的应用
此类载体包括一种重组缺损病毒基因组，它表达至少一个适于诱导系统或分泌免疫反应的抗原。该缺损病毒基因组包括亲代病毒基因组，其3′和5′端含病毒复制酶识别信号，并含内部缺失，其中该缺损病毒基因组复制依赖于一种辅助病毒。这些载体适于形成一种重组系统，该系统包括(a)上述表达载体，和(b)一种辅助病毒为缺损基因组复制和包衣提供功能和结构蛋白。此系统适于生产单价和多价疫苗以对抗各种动物特别是猪、狗、猫的传染原。
发明领域
本发明关于一些基于重组缺损病毒基因组的载体，及其与一种适宜的辅助病毒联合在疫苗制备中的应用，该重组缺损病毒基因组表达的抗原适于诱导系统或分泌免疫反应，预防粘膜感染。
发明背景
使用表达载体获得重组蛋白是众所周知的事实。通常，原核和酵母表达系统高效便捷，而所用的含高等真核细胞的表达系统却存在蛋白产量低，寄主范围局限等缺点。现有高等真核细胞表达系统中，基于杆状病毒的载体是就蛋白产量而言最高效的。然而，他们只能用于昆虫细胞，如已知，其糖基化蛋白生成方式与动物细胞不同。另外，通过同源重组构建重组病毒是一种费力的技术，尤其是要分析大量遗传变异体时。
另一方面，已知基于DNA病毒的载体适于异源基因表达。然而，使用基于DNA的载体存在一些缺点，因其在寄主细胞核中复制时可被整合入基因组中，因而是不可靠的。相反，使用基于RNA的载体克服了与使用DNA病毒有关的缺点，因为它们复制不在寄主细胞基因组中而在细胞质中，复制通过RNA而非DNA，整合入基因组的可能性非常低，使得基于RNA病毒的载体更可靠。
还已知干扰缺损粒子(DI)含毒粒衣壳和缺损基因组，多为来自传染病毒基因组由复制误差产生的缺失亚基因组突变体。通常，术语“DI粒子”指缺损病毒，它们缺少RNA或DNA基因组的一段区域，含病毒蛋白和抗原，复制需传染性的亲代病毒(辅助病毒)共感染，并与同源辅助病毒特异相互作用，因DI粒子复制以辅助病毒为代价[Huang和Baltimore，Nature，226，325～327(1970)]。DI基因组来自基因组重新组织，是RNA聚合酶从一个RNA模板转到另一个RNA模板或从RNA模板的一个片段转移到同一分子的另一个片段的结果。DI基因组一旦产生，即消耗亲代基因组或编码参与复制和包衣蛋白的扩增着的病毒而自行扩增，并与缺损基因组竞争这些产物。
DI粒子已从冠状病毒得到并已进行了特征描述，如鼠肝炎病毒(MHV)，传染性支气管炎病毒(IBV)，和牛冠状病毒(BCV)，而来自猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DI粒子尚未被记述。MHV天然DI粒子之一已被用作基础来发展表达载体，其中插入外源基因受内部启动子转录序列调控[Lin和Lai，J.Virol.，6110-6118，Oct.(1993)]。
通常，已知基于DI粒子的异源基因表达载体具有与其生物种类和靶标器官特异性及有限克隆容量相关的缺点，这限制了它们在基础研究和应用于为治疗为目的，包括疫苗而发展此类载体的可能性。
结果，仍然需要可以成功克服上述缺点的异源基因表达载体。具体地，拥有具有安全性高，克隆容量大，并能设计成其种类特异性和趋性可便于调控的异源基因表达载体将大有好处。
本发明提供了解决现存问题的一种方案，包括基于重组缺损病毒基因组的一种载体，它表达的抗原适于诱导免疫反应并预防不同传染原在不同动物种类所致的感染。本发明提供的异源基因表达载体(或DNA序列)安全性高，克隆容量大，可设计成其种类特异性和趋性便于调控，使得此类载体适于制备疫苗，预防不同传染原在不同动物种类所致的感染。
因此，本发明的目的之一是基于重组缺损病毒基因组的一种载体，它表达至少一个抗原适于诱导免疫反应。具体地，抵御不同动物传染原的系统和分泌免疫反应-或预防传染原的一种抗体，其安全性高，克隆容量大，可设计成其种类特异性和趋性便于调控。
用作构建该载体基础的缺损病毒基因组也是本发明的另一目的。
本发明的另一目的是异源蛋白的一种重组表达系统，包括(a)上述载体和(b)一种辅助病毒，提供蛋白参与该重组缺损病毒基因组的复制与包衣。
本发明的另一目的是能保护不同动物不受传染原所致感染的疫苗，这包括上述重组系统及药学上可接受的赋形剂。这些载体可以是单价或多价的，取决于该重组系统的表达载体表达能诱导免疫反应的一个或多个抗原，或者一种或多种抗体来保护(动物)不受一种或多种传染原感染。
本发明的其他目的包括动物免疫的一种方法，含该重组系统或疫苗的施用，及使保护上述动物的新生个体免受传染原感染的一种方法。
附图简述
图1示TGEV的结构。病毒粒子球形，由类脂膜及其内部的单键，正性，285千碱基(kb)RNA分子组成。RNA联结N蛋白形成核蛋白壳。膜中含M和sM结构蛋白。S组蛋白自成三联体，锚定于膜外部形成膜粒。
图2示四个已测序的冠状病毒的基因组织：MHV，IBV，HCV229E(人冠状病毒229E)和TGEV。编码蛋白的开读框按比例显示。基因组中，表达病毒的RNA起始以箭头表示。病毒MHV或TGEV表达的信使RNA(mRNA)的数目可随病毒品系而异。此图中，TGEV箭头对应于THER-1品系表达的mRVA。mRNA共3′末端并以大小递减顺序编号。
图3示TGEV基因组THER-1品系的表达。显示基因组开读框(ORF)的异位：Pol，聚合酶；S，sM，M和N，结构蛋白；nsp3 a，3b和7，非结构蛋白(蛋白3b并非由此病毒生产)。基因组转录为等长的负链(-)RNA，它将作为模板合成7个mRNA(1到7)。每一种RNA部有共同序列，前导序列，5′端(方块)，3′端聚腺嘌呤部分及每种RNA的翻译区(粗线)。
图4示ST细胞中高感染复数(m.o.i.)时，TGEV THER-1(A)和PUR46-mar 1CC12(B)分离物滴度随传代数目的进化。
图5示感染THER-1病毒的ST细胞在高m.o.i.传代46次时所产RNA的电泳分析结果。传代数目示于泳道上方，左侧标尺示分子量标记(TGEV基因组RNA和Gibco BRL标记)，以kb表示。右侧标尺示TGEV mRNA和缺损干扰(DI)RNA。NI，未感染。
图6示感染THER-1p35病毒的ST细胞RNA的Northern印迹检测结果。
图7示ST细胞中稀释传代THER-1-ST p41病毒RNA的Northern印迹检测结果。
图8示细胞系变化对缺损RNAA，B和C增殖的影响。病毒THER-1-ST p46在IPEC(猪肠上皮细胞)传代十次未稀释，在PM(猪巨噬)细胞传代五次。图8A和8B：病毒滴度分别在IPEC和PM中随传代数的进化。图8C：感染病毒的ST细胞RNA分析，IPEC中1至10代(32Pi代谢标记)，或PM细胞中1至5代(以与前导RNA互补的寡核苷酸杂交)。
图9示缺损基因组A，B和C的包衣。图9A示溴化乙锭染琼脂糖胶，其中抽提自1代和41代纯化病毒的RNA以15％(w/v)蔗糖层离心分析。41代泳道可观察到RNAA，B和C及亲代基因组。左侧标尺示迁移率。标记以kb表示。图9B示41代RNA分析结果，以蔗糖层或连续梯度离心纯化病毒，以与前导RNA互补的寡核苷酸进行Northern印迹检测。商业化的Gibco BRL RNA和1代病毒RNA(泳道a)用作标记。泳道b和c分别为以31％和15％(w/v)蔗糖层沉降的病毒抽提RNA。泳道d和e分别为以密度为1.20和1.15g/ml的连续蔗糖层纯化病毒，抽提RNA。
图10示缺损RNA DI-B和DI-C的克隆策略，图中可见由RT-PCR所得互补DNA(cDNA)片段，模板为全长基因组RNA(A)，DI-B(B)和DI-C(C)。虚线示因个大而缺如的参与片段。缺损RNA克隆入四个重叠片段(a，b，c和d)，以线表示；线下数字示以琼脂糖胶测定的片段大小。用作引物的寡核苷酸及其极性以箭头和数字表示。寡核苷酸序列示于表2。(A)中斜条框和空白框示病毒基因组的相对位置：pol，聚合酶；S，M和N，结构基因；3a，3b，sM和7，小ORF，阴影窄框示前导序列。
图11示缺损RNA扩增所得PCR产物的电泳分析结果。纯化病毒THER-1p1或THER-1p41的RNA作为模板，与寡核苷酸1和2(a)，3和4(b)，或7和8(d)进行RT-PCR反应，其序列及在亲代基因组中的位置示于表2。相应于1代(亲代基因组RNA)或41代(亲代RNA，DI-A，DI-B和DEC)RNA模板的泳道和DNA迁移率标记(M，GibcoBRL)泳道均示。黑体数字为以kb表示的缺损RNA特异扩增产物的大小。RNA B+C，RNA B和C：胶中分离THER-1ST p41病毒RNA实验所纯化的谱带。RNA B和C迁移非常接近，作为单一谱带切下。
图12示由a，b，c和d克隆重叠片段测序所得的完整RNA DI-C cDNA序列(见SEC，DI No.24)。RNA DI-C保留四个不连续的亲代基因组区域：I，II，III和IV。区域两翼位点以箭头表示。基因组DI-C的三个ORF翻译为：6.7kb的嵌合体ORF，来自不连续区域I和II的相融合；前段三个氨基酸的小ORF，和示S基因组AUG的ORF。阴影部为高度同源区域-及其他冠状病毒的蛋白区域，其负责聚合酶和解旋酶活性，及金属离子结合位点。CTAAAC转录启动子序列为阴影，ORF 1a和1b重叠区(41个核苷酸)为阴影，核糖体不稳定序列以下划线示，ORF 1a终端密码子示于框中。在位置637，6397，和6485示与亲代基因组有关的特异变化。也示这些位置上的亲代基因组核苷酸。
图13示RNA DI-C结构图。基因组全长位于框右侧。RNA DI-C包含四个不连续的TGEV基因组区(I，II，III和IV)。这些区域包括基因组5′端的2.1kb，几乎完整的ORF 1b及ORF1a和1b的重叠区，基因S的始端，不完整的ORF7和不翻译的3′区。亲代基因组框上方的字母和数字示病毒基因。框下方数字示亲代基因组不连续区两翼核苷酸的位置，参照TGEV PUR 46-PAR分离物序列。对应于RNA DI-C的框中，四个不连续区的长度示以核苷酸上。第三框示来自各病毒基因的核苷酸数目。考虑到ORF 1a和1b在亲代基因组中相互重叠43个核苷酸。计算机分析预测的ORF示以箭头。Pnt，拟结；Pol、聚合酶；Mib，金属离子结合，Hel，解旋酶；Cd，保守区。
图14示RNA DI-B结构。RNA DI-B含TGEV基因组三个不连续区(I，II和III)，包括基因组5′端2.1 kb，ORF 1a和1b重叠区在内的完整ORF 1b，基因S的始端，ORF7的终端和不翻译的3′端。亲代基因组框上方字母和数字示病毒基因。框下方数字示亲代基因组不连续区的两翼核苷酸的位置，参照TGEV PUR 46-PAR分离物序列。不连续区II和III之间发生大小异源缺失形成DI-B基因组群。第二和第三框分别示最大和最小基因组中三个不连续区的核苷酸长度。第三框示来自各病毒基因的核苷酸数目，考虑到ORF 1a和1b在亲代基因组中相互重叠43个核苷酸。计算机分析预测的ORF示以箭头。Pnt，拟结；Pol，聚合酶；Mib，金属离子结合；Hel，解旋酶；Cd，保守区。
图15示RNA DI-C中ORF 1a和1b重叠区的二级和三级RNA结构。(A)预测结构，考虑距叉状结构最近的区域，与结处核苷酸互补，从而构成拟结(2354至2358核苷酸)。不稳定序列UUUAAAC示以下划线。ORF 1a终端密码子示于框中。(B)拟结示意图，两部分序列互补(茎：S1和S2)。不稳定序列示于框中。(C)替代模型，考虑到拟结折叠中的2489至2493核苷酸序列。此结构含一个额外的序列互补(茎)部分。(D)拟结示意图，其中三茎标记为：S1，S2和S3。
图16示RNA DI作图，由以专一于该病毒的寡核苷酸杂交Northern印迹检测。THER-1-ST p41病毒RNA在琼脂糖胶中分离直至亲代基因组RNA与DIA，B和C明显分开。RNA转移至尼龙膜，与若干32Pi标记的寡核苷酸杂交，与亲代基因组杂交(+)，并缺损基因组杂交(+)与否(-)。互补于亲代基因组核苷酸的相应序列位置示以箭头。其确切序列和位置示于表3。所有寡核苷酸与亲代基因组杂交并给出与RNA B和C的预期结果。
图17示以RNA DI-C感染细胞转染获得疫苗病毒的方法概要。原型概要示由体外转录生产DI-C RNA的构造，保留原始缺损粒子的5′和3′端。T7启动子[PrT7]序列和肝炎delta病毒(HDV)自催化核糖酶[Rz HDV]序列克隆于DI-CRNA序列两翼。核糖酶引入的自催化裂解位点标于序列上方。箭头示内部转录启动子序列位点，保持RNA DI-C的天然形式。L，前导序列。T7，T7噬菌体转录终止信号。当体外转录的RNA转染感染有相应辅助病毒的ST细胞时，回收包裹有辅助病毒及已克隆入异源基因的缺损基因组的病毒粒子。
图18示由体外转录促产pDIA-6A.C3结构的原型概要，保留原始缺损粒子的3′和5′端。噬菌体T7启动子序列[PrT7]和肝炎delta病毒(HDV)自催化核糖酶[Rz HDV]序列克隆于编码自复制RNA的cDNA两翼。质粒pDIA-6A.C3含编码单克隆抗体6A.C3的基因，该抗体中和TGEV[见实施例4]。异源基因克隆于ORF 1b之后，随之以S基因起始密码子(AUG)，并与该基因共读码(IGS：基因间序列；L：前导序列；D：多样区；J：联结区；VH：免疫球蛋白重链可变区；CH：免疫球蛋白重链不变区；VK：免疫球蛋白轻链可变区；CK：免疫球蛋白轻链不变区；polyA：聚腺苷酸序列；T7：T7转录终止子)。
发明详述
本发明提供异源DNA表达载体，该载体基于重组缺损病毒基因组，表达至少一种抗原，适于诱导免疫反应，抵御不同动物传染原，或预防传染原的一种抗体，该载体安全性高，克隆容量大，可设计成种类特异性和趋性易于调控。
用于本发明的术语“传染原”包括感染动物并致病的任何病毒，细菌或寄生传染原。
术语“动物种类”包括任何种类的动物，通常是哺乳类，尤指猪，犬，猫。
本发明中，表达载体得自重组缺损病毒基因组，该载体表达抗原适于诱导系统和分泌免疫反应，预防粘膜感染，该载体设计成易于调控种类特异性和对肠或呼吸粘膜感染的趋性，这使它们足以诱导粘膜和生乳免疫力，特别是在新生动物预防肠道传染方面。本发明另外提供一种基于重组缺损病毒基因组的表达载体，它表达至少一个抗体预防传染原。
本发明得到的表达载体包括来自病毒的缺损病毒基因组，优选地，一种含RNA基因组的正链病毒，保留亲代病毒的3′和5′端，含内部缺失，复制依赖于辅助病毒。因此，发明另外提供含亲代病毒基因组的缺损病毒基因组，其病毒复制酶识别信号位于3′和5′端，且含内部缺失，其中该缺损病毒基因组依赖于辅助病毒为重组缺损病毒基因组复制和包衣提供功能和结构蛋白。特别地，缺损病毒基因组另外包括编码亲代病毒复制酶的完整序列。这样，如果需要的话，辅助病毒可以只提供重组缺损病毒基因组包衣所需的结构蛋白，或者，也可以提供重组缺损病毒基因组复制和包衣所需的功能和结构蛋白。若重组缺损病毒基因组来自RNA病毒时，表达载体包括与该缺损RNA互补或基本上互补的cDNA。
发明提供的载体具有高的克隆容量—至少18kb—这对基于RNA真核病毒是最大的克隆容量。另外，载体具备高的安全水准，因为它们(a)基于缺损基因组，(b)含RNA基因组且不以DNA为复制居间态，(c)基于生长于感染细胞胞浆的病毒，这些都防止缺损基因组与细胞染色体重组。
发明具体描述了从冠状病毒，特别是TGEV中获得缺损RNA基因组。这些基因组额外的好处是TGEV重组频率非常低(＜1×109)，这防止缺损基因组易于与辅助病毒基因组重组。然而，既便这种重组可能实际发生，将得到一种减毒病毒，因为发明仔细考虑了方便地利用该减毒病毒作为辅助病毒和获得缺损基因组的启始材料。
构成此类载体基础的缺损基因组可自不同细胞系统中，从来源病毒的未稀释血清传代获得。DI粒子世代频率在不同病毒—细胞系统中变化很大；因此建议在不同细胞系中以不同病毒分离物传代来筛选合适的分离物和细胞系。一定传代数后，分离病毒并用来分析感染产生的细胞内RNA来观测不与任何病毒mRNA对应的可能谱带，这样，为分析这些新RNA的性质—亚基因组的或缺损的—继续亲代病毒的非稀释血清传代。传代后，分析全部血清传代的RNA模式进化，为此，以来自不同传代的病毒感染适宜的细胞系统，以传统技术分析产生的RNA，如32pi代谢标记或与适合寡核苷酸杂交。从TGEV中获得缺损RNA并定性详述于实施例1。
可能以缺损RNA得到相应的cDNA-互补或基本上互补于-该缺损RNA，通过逆转录(RT)反应和聚合酶链式反应(PCR)扩增，后作RT-PCR。此后，可将cDNA克隆入相应的质粒，如BluescriptII，受高效启动子调控。产物质粒包含受某些调节元件调控的缺损病毒基因组，调节元件含复制调控和转录翻译启止信号。因此，这些质粒包含poly A序列，自催化剪切序列或允许异源DNA插入的限制酶识别，和相应的调控终止信号。
如此获得的质粒，含缺损基因组或相应cDNA，可以传统基因工程技术操作，来增效克隆至少一个编码特异活性的异源DNA序列，受缺损病毒基因组中的基因启动子或缺损基因组来源病毒的其他启动子或这些启动子的变异体，和产物表达载体所含调节序列调控。实施例2描述编码预防不同病毒的抗原的表达载体的产生。
本发明得到的表达载体能表达一种或多种活性，如一个或多个能诱导免疫反应抵御不同传染原的抗原，或一至多个保护(动物)免受一种或多种传染原感染的抗体。特别值得一提的是，这些载体表达至少一个能诱导系统或粘膜免疫反应抵御在呼吸或肠粘膜繁衍的不同传染原的抗原。另外特别提出的是，该表达载体表达至少一个基因编码抗体同型(如：IgG1，IgA，等)的重链和轻链预防传染原。具体地，表达出的抗体是中和TGEV的定义为6A.C3(见实施例4)的单克隆抗体，与IgG1或IgA共表达，其中免疫球蛋白的不变部分是来自猪的。
发明特别指出，质粒中异源基因克隆于ORF 1b之后，含来自缺损RNA的cDNA，随后是S基因启始编码子(AUG)，并与该基因共阅读框(实施例2)。或者，异源DNA序列可以克隆于基因组其他区域，如相应于TGEV ORF 1，2或3的区域。用适合的聚合酶从产物质粒中表达RNA，并以之转染相应的细胞—曾感染减毒辅助病毒，使能回收含辅助病毒基因组的病毒粒子和含缺损基因组的病毒粒子(图17)。
或者，采用上述策略，本发明中的表达载体允许一个或若干个基因表达。为些，可用一个或若干个启动子、或者一个启动子和若干个内部核糖体通道位点(IRES)，或者若干个启动子和一个内部核糖体通道位点。
发明还提供表达异源蛋白的一种重组系统，包括(a)上述载体和(b)辅助病毒，提供蛋白参与重组缺损病毒基因组复制和包衣。因此，基于重组缺损病毒基因组，为表达异源蛋白提供一种重组系统，表达至少具一种特异活性的蛋白，该重组系统包括：
a)重组载体，含缺损病毒基因组，已得其cDNA，可由传统遗传工程方法操作，3′和5′端含病毒复制酶识别信号，另含内部缺失和至少一个内部DNA序列编码一种活性，如能赋予系统或粘膜免疫性的抗原；或保护(动物)免受传染原感染的抗体；和
b)辅助病毒，为缺损基因组复制和包衣提供功能和结构蛋白。
或者，该异源蛋白表达重组系统包括上述类型的表达载体，含完整序列编码亲代病毒复制酶，和辅助亲代病毒提供缺损病毒包衣的结构蛋白，和可选地，缺损病毒基因组复制的功能蛋白(复制酶)。
这些系统能表达可诱导免疫反应的抗原或保护(动物)免受传染原感染的抗体，因此适用于疫苗目标预防感染。
本发明还提供能诱导保护不同动物种类免受各类传染原所致感染的疫苗，包括(i)上述重组系统，含：(a)基于缺损病毒基因组，克隆有异源DNA序列的表达载体，和(b)可选地，合作复制缺损基因组的辅助病毒，(ii)药学上可接受的赋形剂。本发明提供的疫苗因此适于赋予免疫力抵御各类传染原侵染不同动物种类。
“赋予免疫力”，用于本叙述中，应理解为意指在受体有机体(待处理的动物)，由上述重组系统启动适当机制，如抗原存在细胞，B和T淋巴细胞，抗体，蕴蓄细胞免疫反应物质(白细胞介素，干扰素等.)，细胞坏死因子和类似物质预防病原感染动物。
本发明提供的疫苗可以是单价的或多价的，依于重组系统的表达载体表达一个或多个抗原诱导免疫反应抵御一个或多个传染原。表达载体可以是单价或多价的，依于它们表达一个或多个抗体保护(动物)免受一个或多个传染原感染。
种类特异性是如此控制的，以使辅助病毒将表达的膜蛋白适于被相应种类细胞受体识别。本发明得到的特异疫苗包括冠状病毒，优选地猪，犬或猫冠状病毒，作为辅助病毒。
这些疫苗特别针对侵染猪，犬和猫种类的传染原，感染粘膜或以粘膜为侵入途径。
本发明特别提供单价疫苗能使猪，犬和猫预防各类猪，犬和猫传染原，趋性由冠状病毒S糖蛋白表达调控。
抵御猪传染原的单价疫苗包含表达载体表达以下猪病原之一的抗原：胸膜肺炎放线芽孢杆菌(Aceinobacillus pleuropheumoniae)，猪放线芽孢杆菌(Actinobacillus suis)，副猪嗜血菌(Haemophilusparasuis)，猪细小病毒，钩端螺旋体属，大肠杆菌，红斑丹毒丝菌(Erysipeloturix rhusiopathioe)，多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，梭菌属类(Clostriducm sp.，)，猪痢疾小蛇菌(Serpulinohyodcsenteriac)，Mycoplasma hyopneumoniae，猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪呼吸冠状病毒，轮状病毒，或抵御引发猪生殖呼吸病症，Aujeszky′s病(假狂犬病)，猪流感，转移性胃肠炎的病毒和萎缩性鼻炎和增殖性回肠炎的病原体。
抗犬传染原的单价疫苗包括表达以下犬病原之一的抗原的表达载体：犬疱疹病毒，犬腺病毒1和2型，犬细小病毒1和2型，犬呼肠病毒，犬轮状病毒，犬冠状病毒，犬副流感病毒，犬流感病毒，犬瘟病毒，狂犬病毒，反转录病毒和犬杯状病毒。
抗猫传染原的单价疫苗包括表达载体表达以下猫病原之一的抗原：猫杯状病毒，猫免疫缺陷病毒，猫疱疹病毒，猫全白细胞减少病毒，猫呼肠病毒，猫轮状病毒，猫冠状病毒，猫传染性腹膜炎病毒，狂犬病毒，猫Chlamydia psittaci和猫白血病病毒。
载体可以表达抗体保护(动物)免受传染原感染，如上述猪，犬和猫传染原。特别指出，一些抗体用来表达重组单克隆抗体，鉴定为中和VGPT的6A.C3。
本发明得到的疫苗能诱导生乳免疫力保护小猪，这对保护新生小猪预防肠道感染格外有利。
通常，本发明得到的疫苗所含抗原数量能将辅助病毒导入待免疫动物，滴度至少为108蚀斑形成单位(pfu)。
稀释剂如生理盐水血清或其他类似盐水溶液可用作赋形剂。类似地，这些疫苗还可包含疫苗制剂中常用的佐剂如：水状的(氢氧化铝，QuilA，氧化铝胶悬浮液及类似物)，或油状的[基于矿物油的，甘油酯和脂肪酸副产物及其混和物，如Marcol 52(ESSO Espa ola S.A.)，Simulsol 5100(SEPIC)和Montanide 888(SEPIC)]。
这些疫苗还可含细胞反应潜势物质(CRP)，即T辅助细胞(Th1和Th2)亚种群潜势物质，如白细胞介素1(IL-1)，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-12，γ-IFN(伽玛干扰素)，细胞坏死因子和类似物质，在理论上可刺激接种疫苗动物的细胞免疫力。这些CRP物质可以水状或油状佐剂用于疫苗制剂。也可用调节和免疫刺激细胞反应的其他类型佐剂，如MDP(胞壁酰二肽)，ISCOM(免疫刺激复合物)或脂质体。
发明提供多价疫苗能预防动物不受各种感染。多价疫苗可由表达载体制备，其中编码相应抗原的不同序列已插入同一重组载体，或构建独立重组载体，然后混和，与辅助病毒共同接种。因此，多价疫苗包括重组系统，其中表达载体自身含多于一个DNA序列编码多于一个传染原，或者，用于制备疫苗的重组系统含不同表达载体，其中每一个表达至少一个不同的抗原。这种类型多价疫苗的实际局限是上述表达载体必须表达同种动物传染原的抗原及辅助病毒必须适于那一特定种。类似地，可制备含多价载体的多价疫苗，以编码预防传染原抗体的序列替代编码抗原的序列。这些载体包括重组系统，或含表达载体具多于一个DNA序列编码多于一个抗体，或含不同表达载体，其中每一个表达至少一个不同的抗体。
本发明特别提供疫苗能保护猪，犬和猫分别预防各类猪，犬和猫传染原。为此，疫苗重组系统所含表达载体必须表达上述猪，犬和猫病原的抗原。
本发明疫苗可以液态或干冻态呈现并可由悬浮重组系统于赋形剂中制备。若该系统为干冻态，赋形剂本身可为稀释剂。
或者，本发明得到的疫苗可与其他传统疫苗复合使用，或作为其一部分或作为稀释剂，或者干冻部分可与传统或重组疫苗稀释。
本发明提供的疫苗可通过口，鼻，皮下，皮内，腹膜内，肌内或气雾途径施用于动物。
本发明还提供一种动物免疫方法，特别是猪，犬和猫同时抗各类传染原—包括通过口，鼻，皮下，皮内，腹膜内，肌内或气雾(或复合方式)施用—疫苗含本发明提供的重组系统的免疫有效量。
另外，发明还提供一种方法保护新生动物抗侵染该动物的传染原，包括通过口，鼻，皮下，皮内，腹膜内，肌内或气雾(或其复合方式)途径向妊娠期前或期间的母畜或其子代施用含本发明提供的重组系统免疫有效量的疫苗。
发明以下列实施例阐释，详述缺损病毒基因组的获得，特征描述，质粒构建和获得表达载体的操作，及诱导中和抗体抗各种类的不同传染原。
实施例1
从TGEV中获得缺损粒子
1.1高复数感染(m.o.i)的TGEV品系未稀释血清传代
为促进产生缺损粒子，或增加病毒种群中已存在的小比例的缺损粒子，在不同细胞系统中进行不同未稀释TGEV分离物的血清传代。因为DI粒子产生频率在不同病毒—细胞系统中变化很大，传代以不同TGEV分离物(THER-1和PUR 46-mar ICC 12)在ST(猪睾，猪睾上皮细胞)细胞系中进行。
品系THER-1(转移性胃肠炎辅助呼肠冠状病毒是来自PUR 46-MAD株[Sánchez et al.Virology 174，410-417(1990)]在ST细胞系减毒20代的突变体。品系PUR 46 marICC 12也见Sánchez etal.(同上)。
每侏TGEV都在ST细胞中未稀释传代35次。三例中每一个的第一代m.o.i都是每细胞100 pfu。感染后20至48小时(h.p.i)收集每代上清，观察到明显的细胞致病作用—正常地当该作用正影响半数以上细胞单层时—，一半上清液用于感染下一代。病毒滴度随传代数变异示于图4。每一病毒全部血清传代中，病毒滴度范围在两个对数单位之间。对于品系THER-1，30至46代滴度低于前三十代。
在ST细胞传代35次的病毒用来分析感染产生的细胞内RNA。分析感染后6至9小时32Pi代谢标记的RNA[Maniatis et al.，MolecularCloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1982)]。在THER-1-p35感染中(THER-1品系病毒高复数感染，传代35次)观察到三条强带并不对应于任何病毒mRNA。这些带位于基因组RNA和S基因信使之间(图5)。为分析这些新的亚基因组RNA的性质，以品系THER-1继续未稀释血清传代。46代后，分析全血清传代RNA模式的进化。为此，以来自不同传代的病毒感染ST细胞，并以变性琼脂糖胶分析得到的代谢标记的RNA(图5)。而在第一代只检测基因组RNA和亚基因组病毒信使，在30代检测到22，10.6和9.7kb的三个新RNA(RNA A，B和C示于图5分别为DI-A，DI-B和DI-C)。这些亚基因组RNA在随后15代保持稳定，明显干扰基因组RNA复制及辅助病毒mRNA合成(图5，泳道30至45)。这些结果显示未稀释血清传代产生或扩增的三个RNA是稳定的且至少其中之一在起干扰作用。
1.2亚基因组RNA特征描述
1.2.1末端及内部区域分析
为确定亚基因组A，B和C是否具有冠状病毒缺损RNA的标准结构，尤其是，它们是否保留野生型基因组的5′和3′端及其小分子是否由内部缺失所致，以病毒特异探针进行若干杂交检测。为此，从感染THER-1-ST p35病毒(THER-1品系病毒，ST细胞传代35次)的细胞中抽提RNA并用互补于前导区和病毒3′端序列的寡核苷酸为特异病毒探针，以Northen印迹检测(Maniatis et al，同上)分析杂交。每种情况下，来自感染THER-1-pl病毒(品系THER-1病毒在ST细胞传代一次)细胞和来自未感染ST细胞(NI)(分别为每次过滤的泳道1和2)的RNA用作对照。用作探针的寡核苷酸互补于前导区RNA(亲代基因组5′端66-91位)，3′端不翻译区(亲代基因组5′端28524-28543核苷酸)，及结构基因M和N(分别为始于基因引物AUG的97-116位和5-24位)。右侧标尺示病毒mRNA和亚基因组RNA A，B和C的位置。
图6示，两个寡核苷酸与所有亲代病毒mRNA杂交，它们还检测到RNAA，B和C，表明这些RNA已通过内部缺失并保留末端。作为初步探讨分析存在于这些RNA的基因组序列，将感染细胞的RNA与互补于病毒结构蛋白S，M和N基因的寡核苷酸杂交。没有一个与缺损RNA杂交，暗示结构蛋白基因已缺失。因此，亚基因组RNAA，B和C保留亲代病毒末端并具内部缺失。
1.2.2 RNA A，B和C繁衍
为证明RNA A，B和C为缺损基因组，培养中依赖亲代病毒繁衍，ST细胞以不同m.o.i：10，0.1，0.01和0.001pfu/细胞感染病毒THER-1-ST p41(THER-1病毒系在ST细胞传代41次)。传代得到的病毒收集于10h.p.i，测滴度并在ST细胞扩增第二代，再用来感染新细胞，从中抽提细胞质RNA(Maniatis，et al.同上)。RNA分析用互补于前导区RNA的寡核苷酸进行Northern印迹检测。图7示所得结果。m.o.i示于各泳道上方(10-3，10-2，10-1和10pfu/细胞)。在相应于以10pfu/细胞感染THER-1-ST p41病毒的泳道中，标记正对照，基因组RNA(mRNA 1)，缺损RNA A，B和C(示为DI-A，DI-B，DI-C)及相应S基因(mRNA 2)。
观察到当第一代(本实验的“瓶颈”，因其后传代为扩增传代)m.o.i为0.1 pfu/细胞或更小时，RNA A，B和C丢失，此条件下按预期比例检测到病毒基因组RNA和mRNA(图7)。当m.o.i为10pfu/细胞时三个缺损RNA保留。因为在用于感染的THER-1-p41病毒中发现RNA A，B和C比例高于基因组RNA，结果显示这些RNA复制或繁衍需要细胞感染缺损病毒和辅助病毒。这样，RNA A，B和C需要途中提供辅助病毒功能。因此，RNA A，B和C是缺损基因组，繁衍依赖于辅助病毒。
1.2.3 DI RNA在另一细胞系中体外产生，扩增，繁衍和干扰
RNA DI的体外产生，扩增，繁衍和干扰特异于细胞素，因此研究了细胞系改变对缺损RNA的效果。为此，将THER-1-ST p46病毒(THER-1病毒以高m.o.i在ST细胞传代46次)施于猪肠上皮细胞(IPEC)和猪巨噬(PM)细胞一新系列未稀释传代。图8示在IPEC10代(图8A)和在PM 5代(图8B)滴度变异和传代数目。在这两个细胞系的病毒产量低于在ST细胞所得，估计每代m.o.i变化在20和0.2pfu/细胞之间。
感染THER-1-ST p46-IPEC p1 (THER-1-ST p46病毒在IPEC细胞传代一次)和THER-1-ST p46-IPEC p10(THER-1-ST p46病毒在IPEC细胞传代10次)的ST细胞产生的RNA，以32Pi标记并以变性琼脂糖胶分析(图8C)。
感染THER-1-ST p46-PM p1病毒(THER-1-ST p46病毒在PM细胞传代一次)和THER-1-ST p46-PM p5(THER-1-ST p46病毒在PM细胞传代5次)的ST细胞的RNA与互补于前导区RNA的寡核苷酸进行Northern印迹分析(图8C)。
图8C结果显示三个缺损RNA在这两个细胞系中保留第一代，但只RNA A持续下去，至少在PM5代，在IPEC 10代。两种情况下都标出相应于野生基因组(1)的RNA的位置，RNA A，B和C分别为(DI-A，DI-B和DI-C)和mRNA 2(蛋白S)。在相应于THER-1-ST p46-PM p5病毒RNA的泳道，示基因组RNA的位置—只当放射自显影曝光时间十倍于图8C所示时间时才能观察到。
1.3缺损基因组包衣
为研究缺损RNA是否具包衣能力，以15％重量/体积(w/v)蔗糖垫离心同时部分纯化病毒THER-1-ST p1(THER-1病毒在ST细胞传代一次)和THER-1-ST p41(THER-1病毒在ST细胞传代41次)。从纯化病毒粒子中抽提RNA，并在琼脂糖胶中以溴乙锭染色分析(图9A)。在41代病毒粒子，RNA A，B和C经检测与基因组RNA强度相同，表明这三个缺损RNA有效包衣。
为确定缺损基因组是否与完整基因组共包衣，或相反地，它们是否独立包衣，以不同密度蔗糖垫或连续蔗糖梯度离心，纯化THER-1-ST p41病毒。每种纯化病毒粒子的RNA以互补于前导区RNA的寡核苷酸进行Northern印迹检测分析(图9B)。当以31％(w/v)(d＝1.19g/ml)蔗糖垫离心时，在沉淀病毒粒子中只检测到野生型基因组。然而，当使用低密度15％(w/v)(d＝1.11g/ml)蔗糖垫时，除完整基因组外，还检测到三个缺损RNA。在连续蔗糖垫中(15-42％w/v)可能在梯度上部(密度近于1.15g/ml)富集缺损病毒粒子，在下部(密度近于1.20g/ml)富集标准病毒粒子，见图9B泳道d和e。各泳道靠上的带对应于野生型基因组和缺损基因组A(DI-A)，靠下的带对应于缺损基因组B和C(DI-B和DI-C)。这些结果表明在轻于标准病毒粒子的缺损病毒粒子中，RNA A，B和C有效包衣，基因组DI-B和DI-C(10.6和9.7kb)包衣不依赖于野生型基因组。
1.4′缺损RNA B和C的克隆和测序。确定其初级结构
1.4.1互补DNA合成及RNA B和C扩增。
缺损RNA B和C的大小，基于凝胶电泳迁移率，估计分别为10.6和9.7kb。因为它们较大，不可能用互补于基因组末端的引物在单一逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中扩增缺损RNA。为克服这一局限，在四个独立反应中扩增缺损基因组，所用引物对在所有情况下允许四个重叠的片段覆盖基因组全长。这些重叠片段自5′端至3′端定为a，b，c和d(图10)。抽提自纯化病毒粒子的THER-1-STp41病毒RNA用作模板。该RNA除含亲代基因组外，还含三个缺损RNA A，B和C。作为对照，同时扩增THER-1野生型病毒的基因组RNA。
RT-PCR反应中用作引物的寡核苷酸的序列和位置示于表2。
表2
RT-PCR反应中用作引物的寡核苷酸的特征
序列鉴定号     极性   冠状病毒ORF     在RNA DI-C的位置 限制位点
    12     +-   前导式ORFla FIPV     15-411874-1887 --
   3a)4a)5a)6a)78a)9     +-+-+-+    ORF1a TGEVORF1b TGEVORF1b HCV229EORF1b TGEVORF1b TGEV3′UTR TGEVORF1b TGEV     1524-15504365-43894097-41147633-76507633-76509691-97078251-8270      Xbal Xbal EcoRIEcoRI-Spel-
a)：含5′限制位点利用其后克隆。
b)：在相应ORF的寡核苷酸位置与示于图12的序列有关。
用引物1和2由RT-PCR扩增THER-1-ST p41病毒RNA和亲代病毒THER RNA给出1.9 kb优势PCR产物(图11，片段a)。反应中观察到的弱带是由于非特异杂交，因其出现于两个泳道。用胶纯化抽提DI-B和DI-CRNA，并以此富含DI-B和DI-CRNA的琼脂分离物进行同样的RF PCR反应，得到同样结果。这表明片段a普遍存在于所有RNA DI，并相应于野生型TGEV基因组5′端1.9kb区。
用寡核苷酸3和4扩增THER-1-ST p41病毒RNA给出唯一的2.8kb PCR产物(图11，片段b)。从THER-1对照病毒RNA未得到PCR产物，因预期产物大小为12kb。基于这些数据，推断至少一个缺损基因组含一个2.8kb的b片段，余者含同样或更大片段，大片段由于较大而不可在PCR反应中检测。
寡核苷酸5和6在亲代基因组中间隔4.6kb，给出THER-1-ST p41病毒RNA的两个不同产物3.5和4.6kb(图11，片段C)。4.6kb产物也在野生型病毒RNA对照中得到。这些结果暗示片段C至少在一个缺损基因组(可能是DI-C，最丰富的缺损基因组)含一个缺失，从而由PCR给出3.5kb片段。4.6kb片段来自THER-1-STp41病毒RNA群体中存在的亲代基因组，和保留基因组该区域的那些缺损基因组。
以引物7和8由RF-PCR扩增亲代病毒基因组RNA不产生任何带(图11，片段d)，因为这些寡核苷酸在完整基因组中间隔9.5 kb(图10)。与此对照，当THER-1-ST p41病毒RNA用作模板时，观察到1.9和2.1kb两个非常强的带。这些带宽且连续，相应于片段d(图11)，可能因为它们与一组约为1.9kb的弱带共迁移，阻碍凝胶分辨。异源性观测于克隆片段d的大小(见下)。
1.4.2定位扩增产物(a，b，c和d)于不同缺损RNA。
为将大小在1.9至2.1kb之间的d片段定位于不同缺损基因组，在琼脂糖胶中分离用作模板的THER-1-ST p41病毒RNA，直至明显分离相应于野生型基因组，DI-A，DI-B和DI-C RNA的带。相应于这四种RNA的每一条带分别切下，并作为模板与寡核苷酸8和9进行RT-PCR扩增反应。从纯化基因组RNA带开始，未得到PCR产物。从RNA DI-B，得到1.9kb PCR主产物，尽管也得到较少的大小近于1.9kb的DNA，这表明该区域一定的异源性。RNA DI-C扩增给出2.1kb PCR主产物。这些结果允许将1.9kb片段定位于缺损RNA B，并将2.1kb定位于RNA DI-C。
一旦d片段定位，以引物5和6得到的3.5和4.6kb C片段也分别定位于缺损RNA C和B，因为这样定位得到的片段a至d的总和总与以迁移率估计的RNA B和C大小相一致。
一旦基因组B和C的完整序列确定了，可由用特异缺失两翼寡核苷酸扩增各纯化RNA带来证明片段定位。片段定位还可由Northern印迹检测确认，使用寡核苷酸对不存在于DI-C的DI-B区域作图，反之亦然。
1.4.3克隆和测序重叠片段a，b，c和d
四个重叠DNA片段a(1.9kb)，b(2.8kb)，c(3.5kb)和d(2.1kb)，互补于RNA C，克隆于Bluescript SK。测序来自独立RT-PCR反应的至少两个克隆。在不同克隆中位置不一致的序列(可能是Taq聚合酶误差)以相应的未克隆PCR产物直接测序。由此，确定RNA DI-C的一致序列。平均每1.2kb拷贝出现1个Taq聚合酶误差。DI-C基因组的完整序列见图12。
将这样得到的完整RNA DI-C序列与PUR 46-PAR病毒的ORF1a和1b序列[Eleouet et al.，Virology 206，817-822(1995)]，并与我们实验室测定的其他THER-1病毒ORF序列相比较。与品系PUR46-PAR序列比较，发现完整RNA DI-C序列上14个核苷酸差异。测序缺损基因组亲代病毒品系THER-1的这些位置，来确定基因组缺损RNA DI-C的特异变化。与亲代病毒相应序列相比，DI-CRNA序列只呈现三个核苷酸差异和9189位一个插入，这并不影响任何ORF(图12)。
1.4.4 DI-C和DI-B基因组初级结构。
序列数据表明DI-C基因组由四个不连续的亲代基因组区域组成(图13)包括：a)基因组5′端2144个核苷酸；b)相应于亲代基因组12195至16734位区域的4540个核苷酸，这包括ORF 1a和1b的重叠部分，和ORF 1b5′端约一半；c)相应于野生型基因组17843-20372位的2531个核苷酸区，这包括ORF 1b3′端一半和基因S前8个核苷酸；和d)3′端493个核苷酸。
由测序克隆片段a和b(共存于基因组DI-C)，C(似亲代基因组)和d(特异在基因组DI-B)，确定DI-B基因组的初级结构。基因组DI-B由基因组三个不连续区域组成(图14)：a)基因组5′端2144个核苷酸，普遍存在于所有DI-B克隆，与RNA DI-C区域I等同；b)大小可变区，8178-8243个核苷酸，相应于亲代基因组12195-20369至20436位，这包括基因1两个ORF的重叠区，完整的ORF 1b，基因S的前核苷酸；和c)基因组3′区278至303核苷酸。
组成定为基因组DI-B群体的克隆缺失大小不同，缺失在II和III区之间，起自基因S始端(核苷酸6和73之间)，止于基因7终端(核苷酸195和233之间)。
直接测序RNA确定亲代RNA THER-15′端序列为5′-NCUUUUAAAG-3′。序列第一个核苷酸“N”未被测定。迄今，已记述三个TGEV分离物PUR 46-PAR，PUR 46-BRI和FS 772/70的5′端序列[Eleouet et al.，同上；Page et al.，Virus Genes 4，289-301(1990)；Sethna et al.，S.Virol，65，320-325(1991)]，它们第一个核苷酸都不相同。缺损RNA前导区序列必定与亲代病毒前导序列相同，鉴于冠状病毒感染中发生的前导区交换[Makino et al.，S.Virol.57，729-737(1986)]。
三个缺损RNA含poly A，因为它们交联寡聚dT柱(未示结果)。1.4.5 RNA B和C保留ORF 1a和1b重叠区，目的是为核糖体转位(-1)。
与定位于基因组DI-C和DI-B的序列相一致，可能分别预测6370和10003的核苷酸ORF，始于基因组5′端315核苷酸。RNA DI-CORF止于不连续区域II和III联结位点处产生的终止密码子，其间内部缺失发生于ORF 1b，DI-C基因组6685位。DI-B基因组ORF止于ORF 1b的天然终止密码子。
两个缺损RNA保留ORF 1a和1b的重叠区，包括滑动序列和三级结构拟结，负责该区核糖体转位(-1)(Eleouet el al.，同上)。图15示此区可能的RNA二级和三级结构。Eleouet el al.，建议的此区拟结结构示于C和D；然而，还有其他可能的结构(如示于A和B)，尽管不知哪个正确。
已有记述表明TGEV中转位效率为20％(Eleouet el al.同上)且使基因1能连续翻译。RNA DI-B和DI-C(可能还有DI-ARNA)保留亲代基因组区域的事实暗示这可能是RNA复制或基因组繁衍所必须的。
缺损基因组DI-C和DI-B另有两个小ORF。其一位于长阅读框之前，编码三个氨基酸的肽，也发现于野生型基因组，功能未知。两种情况下，另一ORF始于基因S的AUG，在DI-C编码16氨基酸的肽，在DI-B编码可变大小的肽。不知道这些ORF是否是功能性的。病毒保留的仅有的两个转录启动子一致序列(CUAAAC)恰恰是缺损RNA B和C中基因1和基因S之前的序列。这些序列标于图12。
图16示以特异于病毒的寡核苷酸进行Northern印迹杂交对RNAA，B和C作图。以琼脂糖胶分离THER-1-ST p41病毒RNA直至明显分离亲代基因组RNA并得到DI，A，B和C。RNA转移到尼龙滤膜，以32Pi标记的不同寡核苷酸与亲代基因组杂交(+)，并与缺损基因组杂交(+)或否(-)。互补于亲代基因组寡核苷酸的序列大致定位示以箭头。其确切序列和位置见表3。所有寡核苷酸都与亲代基因组杂交，并得到RNA B和C的预期结果。
表3
寡核苷酸 鉴定序列号 极性 TGEV的基因 在基因组的位置
    1234567891011121314     1011121314151617181920212223  --------------     前导区ORF1aORF1aORF1aORF1aORF1bORF1bORF1b基因S基因S基因S基因S基因SUTR-3′     66-912151-21706121-61408684-870312261-1228014148-1416717363-1738118792-188111055-10741980-19993600-361997-1165-2428524-28543
a)：在基因组的位置示以始于野生型病毒基因组5′端互补于基因1(ORF 1a和ORF 1b)和3′端不翻译区(3′-UTR)的寡核苷酸(ON)的碱基数；在引物对基因S，M和N作图时，始于相应于ON 5′核苷酸的基因的引物ATG的第一个核苷酸。
实施例2
产生表达载体
编码RNA DI-C的cDNA克隆于Bluescript II质粒，受控于噬菌体T7启动子。该cDNA包括poly A序列，肝炎delta病毒(HDV)核糖酶，和噬菌体T7终止信号。质粒之一，构建见图17，命名为pDIC-1。这些质粒可被克隆操作进异源基因，受控于缺损基因组的基因S启动子，或另一TGEV启动子，或其增效变异体。
这些异源基因克隆于ORF 1b之后，紧随S基因启始密码子(AUG)，并与此基因共读。
用噬菌体T7聚合酶从这些cDNA表达RNA，并转化曾以减毒辅助病毒THER-1感染的ST细胞，使能回收含辅助病毒基因组的病毒粒子，和含相应缺损基因组的其他病毒粒子。这些病毒以2％胎牛血清冻干，用作疫苗诱导特异抗体抗感染猪，犬和兔胃肠呼吸道的病原。
抗体趋性特异地靶标于猪，犬或猫种类，使用相应的减毒辅助病毒。
实施例3
诱导中和抗体
3.1诱导预防猪流行性腹泻冠状病毒(PEDV)
用由辅助病毒(THER-1)和已克隆有PEDV糖蛋白S基因的pDIC-1质粒组成的重组系统免疫猪。
通过口道每小猪施用109pfu进行免疫。
免疫后15，30，45和60天在接受疫苗动物血清中检测到中和抗体存在；用放免检测(RIA)确认特异于PEDV的抗体存在(Maniatis et al.，同上)。
以免疫后45天采集的血清预防10日龄小猪感染PEDV(品系SEG86-1)，口道施用前血清已与有毒病毒预保温。
3.2诱导御防犬冠状病毒
用由辅助病毒(犬冠状病毒品系Fort Dodge)和已克隆有犬冠状病毒糖蛋白S基因的pDIC-1质粒组成的重组系统免疫犬。
通过口道每犬施用109pfu进行免疫。
免疫后15，30，45和60天在接受疫苗动物血清中检测到中和抗体存在，并用RIA确认特异于犬冠状病毒的抗体存在。
以免疫后45天采集的血清预防10日龄小犬感染犬冠状病毒(品系Fort Dodge)，口道施用前血清已与有毒病毒预保温。
3.3诱导御防arterivirus PRRSV引发的感染
用由辅助病毒(THER-1)和已克隆有arterivirus PRRSV ORF3和ORF5(品系Fort Dodge)的pDIC-1质粒组成的重组系统免疫猪。
通过口道每小猪施用109pfu进行免疫。
免疫后15，30，45和60天在接受疫苗动物血清中分析到中和抗体存在，并用RIA确认特异于PRRSV的抗体存在。
以免疫后第45天采集的血清御防10日龄小猪感染PRRSV(品系Fort Dodge)，口道施用前血清已与有毒病毒预保温。
实施例4
产生表达载体
用类似于实施例2的方法，将编码自复制RNA的cDNA克隆进Bluescript II质粒，受控于噬菌体T7启动子。该cDNA包括poly A序列，肝炎delta病毒(HDV)的核糖酶和噬菌体T7终止信号。质粒之一，构建示于图18，命名为pDIA-6A.C3。该质粒含基因编码中和TGEV的单克隆抗体6A.C3。单克隆抗体6A.C3的特性及其构建见Soaquin Castilla Carrion博士的博士论文，题为“Construccion deanimales transgenicos secretores de anticuerpos neutralizantes paracoronarirus”，Universidad Autonoma，Madrid，Faculty of Sciece，December1996，pages 43-52，65-79。
异源基因克隆于ORF 1b之后，紧随基因S启始密码子(AUG)，并与该基因共读。
用噬菌体T7聚合物从该cDNA表达RNA，并以此转化曾以减毒辅助病毒感染的ST细胞；结果回收含辅助病毒基因组的病毒粒子和含相应缺损基因组的其他病毒粒子。这些病毒与2％胎牛血清冻干，用作载体表达重组单克隆抗体6A.C3。用相应病毒辅助病毒使载体趋性特异于猪。
实施例5
表达中和抗体
用由辅助病毒(THER-1)和含编码重组单克隆抗体6A.C3来中和TGEV序列的pDIA-6A.C3质粒组成的重组系统免疫猪。
通过口道每小猪施用109 pfu进行免疫。
免疫后15，30，45和60天用RIA[Maniatis et al.，同上]在接受疫苗动物血清中检测到中和抗体6A.C3存在，重抗体RIA滴度高于103并能降低传染病毒滴度104倍以上。
微生物保藏
引入来自大肠杆菌的DH-5细菌的质粒命名为pDIC-1，1996年3月6日保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，PortonDown，Salisbury，Wiltshire SP 4 OJG，United Kingdom，保藏号P96030641。
此外，减毒辅助病毒命名为THER-1，1996年3月6日保藏于ECACC，保藏号V96030642。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)姓名：CYANAMID IBERICA，S.A.
(B)地址：CRISTOBAL BORDIU，35
(C)城市：马德里
(E 国家：西班牙
(F)邮政编码：28003
(G 电话：3416639121
(H)电传：3416639401
(ii)发明题目：基于重组缺损病毒基因组的载体及其在疫苗制剂中的应用
(iii)序列数目：24
(iv)计算机可读方式：
(A)媒介：磁盘
(B)计算机：IBM PC-兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patentln Release#1.0，Version#1.30(EPO)
(2)ID.SEQ.No.：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：1：
GTGAGTGTAGCGTGGCTATATCTCTTC    27
(2)ID.SEQ.No.：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：2：
CCGTTGTGGTGTCACATTAAC                 21
(2)ID.SEQ.No.：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：32碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：3：
GCCTCTAGAG GAGCTTTGTG GTTCACTTAC AC      32
(2)ID.SEQ.No.：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：32碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：4：
GCTCTAGAGC GTTTGAATCA ACCCCCAAAA GC     32
(2)ID.SEQ.No.：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
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(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：5：
GGAATTCCG GGACTATCCTA AGTGTG     26
(2)ID.SEQ.No.：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
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(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：6：
GGAATTCCAG CAATACTATT ATCAA     25
(2)ID.SEQ.No.：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
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(iv)反义：无
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TTGATAATAG TATTGCTGGC     20
(2)ID.SEQ.No.：8的信息：
(i)序列特征：
 (A)长度：23碱基对
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 (iii)假设：无
 (iv)反义：无
 (xi)序列记述ID.SEQ.No.：8：
GGACTAGT ATCACTATCAAA AGG     23
(2)ID.SEQ.No.：9的信息：
(i)序列特征：
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(iv)反义：无
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GATGGATGTT GTGGTGTGAG     20
(2)ID.SEQ.No.：10的信息：
(i)序列特征：
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(iv)反义：无
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CGAGTTGGTG TCCGAAGACA AAATCT     26
(2)ID.SEQ.No.：11的信息：
(i)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(iv)反义：无
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ATACGAGCAT CAATATCACC     20
(2)ID.SEQ.No.：12的信息：
(i)序列特征：
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(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：12：
AGAGTTGCCA CAGACTGCAG     20
(2)ID.SEQ.No.：13的信息：
(i)序列特征：
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CAGCAGTTC AAAGTTACCC     20
(2)ID.SEQ.No.：14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
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(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：14：
CCATTGTTAAGCCAACAACC     20
(2)ID.SEQ.No.：15的信息：
(i)序列特征：
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(D)拓扑学：线性
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(iv)反义：无
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ATCACACTTA GGATAGTCCC    20
(2)ID.SEQ.No.：16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：19碱基对
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(iv)反义：无
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GTCTAACAAT GTGCCAAGG     19
(2)ID.SEQ.No.：17的信息：
(i)序列特征：
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(ii)分子类型：DNA
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GCCAGCAATA CTATTATCAA     20
(2)ID.SEQ.No.：18的信息：
(i)序列特征：
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(iii)假设：无
(iv)反义：无
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CACTGTGGCA CCCTTACCTG     20
(2)ID.SEQ.No.：19的信息：
(i)序列特征：
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(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：19：
GTACACCCAC TATGTTGTCT     20
(2)ID.SEQ.No.：20的信息：
(i)序列特征：
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(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
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(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：20：
TTGCGAGTGA AAACAAATGT     20
(2)ID.SEQ.No.：21的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：21：
CTCACAATCA GACGCTGTAC     20
(2)ID.SEQ.No.：22的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：22：
GACACGTTGT CCCTGGTTGG     20
(2)ID.SEQ.No.：23的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
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(xi)序列记述ID.SEQ.No.：23：
ACATTTTAAA CAATCACTAG     20
(2)ID.SEQ.No.：24的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9714碱基对
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(D)拓扑学：环型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)来源：
(A)有机体：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)
(B)株：THER-1
(C)个体分离物：DI-C
(xi)序列记述ID.SEQ.No.：24：
NCTTTTAAAG   TAAAGTGAGT   GTAGCGTGGC   TATATCTCTT   CTTTTACTTT   AACTAGCCTT       60
GTGCTAGATT   TTGTCTTCGG   ACACCAACTC   GAACTAAACG   AAATATTTGT   CTTTCTATGA      120
AATCATAGAG   GACAAGCGTT   GATTATTTCC   ATTCAGTTTG   GCAATCACTC   CTTGGAACGG      180
GGTTGAGCGA   ACGGTGCAGT   AGGGTTCCGT   CCCTATTTCG   TAAGTCGCCT   AGTAGTAGCG      240
AGTGCGGTTC   CGCCCGTACA   ACGTTGGGTA   GACCGGGTTC   CGTCCTGTGA   TCTCCCTCGC      300
CGGCCGCCAG   GAGAATGAGT   TCCAAACAAT   TCAAGATCCT   TGTTAATGAG   GACTATCAAG      360
TCAACGTGCC   TAGTCTTCCT   ATTCGTGACG   TGTTACAGGA   AATTAAGTAC   TGCTACCGTA      420
ATGGATTTGA   GGGCTATGTT   TTCGTACCAG   AATACTGTCG   TGACCTAGTT   GATTGCGATC      480
GTAAGGATCA   CTACGTCATT   GGTGTTCTTG   GTAACGGAGT   AAGTGATCTT   AAACCTGTTC      540
TTCTTACCGA   ACCCTCCGTC   ATGTTGCAAG   GCTTTATTGT   TAGAGCTAAC   TGCAATGGCG      600
TTCTTGAGGA   CTTTGACCTT   AAAATTGCTC   GCACTGTCAG   AGGTGCCATA   TATGTTGATC      660
AATACATGTG   TGGTGCTGAT   GGAAAACCAG   TCATTGAAGG   CGATTTTAAG   GACTACTTCG      720
GTGATGAAGA   CATCATTGAA   TTTGAAGGAG   AGGAGTACCA   TTGCGCTTGG   ACAACTGTGC      780
GCGATGAGAA   ACCGCTGAAT   CAGCAAACTC   TCTTTACCAT   TCAGGAAATC   CAATACAATC      840
TGGACATTCC   TCATAAATTG   CCAAACTGTG   CTACTAGACA   TGTAGCACCA   CCAGTCAAAA      900
AGAACTCTAA   AATAGTTCTG   TCTGAAGATT   ACAAGAAGCT   TTATGATATC   TTCGGATCAC      960
CCTTTATGGG   AAATGGTGAC   TGTCTTAGCA   AATGCTTTGA   CACTCTTCAT   TTTATCGCTG     1020
CTACTCTTAG   ATGCCCGTGT   GGTTCTGAAA   GTAGCGGCGT   TGGAGATTGG   ACTGGTTTTA     1080
AGACTGCCTG   TTGTGGTCTT   TCTGGCAAAG   TTAAGGGTGT   CACTTTGGGT   GATATTAAGC     1140
CTGGTGATGC   TGTTGTCACT   AGTATGAGCG   CAGGTAAGGG   AGTTAAGTTC   TTTGCCAATT     1200
GTGTTCTTCA   ATATGCTGGT   GATGTTGAAG   GTGTCTCCAT   CTGGAAAGTT   ATTAAAACTT     1260
TTACAGTTGA   TGAGACTGTA   TGCACCCCTG   GTTTTGAAGG   CGAATTGAAC   GACTTCATCA     1320
AACCTGAGAG   CAAATCACTA   GTTGCATGCA   GCGTTAAAAG   AGCATTCATT   ACTGGTGATA     1380
TTGATGATGC   TGTACATGAT   TGTATCATTA   CAGGAAAATT   GGATCTTAGT   ACCAACCTTT     1440
TTGGTAATGT   TGGTCTATTA   TTCAAGAAGA   CTCCATGGTT   TGTACAAAAG   TGTGGTGCAC     1500
TTTTTGTAGA   CGCTTGGAAA   GTAGTAGAGG   AGCTTTGTGG   TTCACTCACA   CTTACATACA     1560
AGCAAATTTA   TGAAGTTGTA   GCATCACTTT   GCACTTCTGC   TTTTACGATT   GTAAACTACA     1620
AGCCAACATT   TGTGGTTCCA   GACAATCGTG   TTAAAGATCT   TGTAGACAAG   TGTGTGAAAG     1680
TTCTTGTAAA   AGCATTTGAT   GTTTTTACGC   AGATTATCAC   AATAGCTGGT   ATTGAGGCCA     1740
AATGCTTTGT   GCTTGGTGCT   AAATACCTGT   TGTTCAATAA   TGCACTTGTC   AAACTTGTCA     1800
GTGTTAAAAT   CCTTGGCAAG   AAGCAAAAGG   GTCTTGAATG   TGCATTCTTT   GCTACTAGCT     1860
TGGTTGGTGC   AACTGTTAAT   GTGACACCTA   AAAGAACAGA   GACTGCCACT   ATCAGCTTGA     1920
ACAAGGTTGA   TGATGTTGTA   GCACCAGGAG   AGGGTTATAT   CGTCATTGTT   GGTGATATGG     1980
CTTTCTACAA   GAGTGGTGAA   TATTATTTCA   TGATGTCTAG   TCCTAATTTT   GTTCTTACTA     2040
ACAATGTTTT   TAAAGCAGTT   AAAGTTCCAT   CTTATGACAT   CGTTTATGAT   GTTGATAATG     2100
ATACCAAAAG   CAAAATGATT   GCAAAACTTG   GTTCATCATT   TGAACAAATA   CCAACTGGCA     2160
CACAAGATCC   AATTCGGTTC   TGTATTGAAA   ATGAAGTTTG   TGTTGTCTGT   GGTTGTTGGC     2220
TTAACAATGG   TTGCATGTGC   GATCGTACTT   CTATGCAGAG   TTTTACTGTT   GATCAAAGTT     2280
ATTTAAACGA   GTGCGGGGTT   CTAGTGCAGC   TCGACTAGAA   CCCTGCAATG   GTACTGATCC     2340
AGACCATGTT   AGTAGAGCTT   TTGACATCTA   CAACAAAGAT   GTTGCGTGTA   TTGGTAAATT     2400
CCTTAAGACG   AATTGTTCAA   GATTTAGGAA   TTTGGACAAA   CATGATGCCT   ACTACATTGT     2460
CAAACGTTGT   ACAAAGACCG   TTATGGACCA   TGAGCAAGTC   TGTTATAACG   ATCTTAAAGA     2520
TTCTGGTGCT   GTTGCTGAGC   ATGACTTCTT   CACATATAAA   GAGGGTAGAT   GTGAGTTCGG     2580
TAATGTTGCA   CGTAGGAATC   TTACAAAGTA   CACAATGATG   GATCTTTGTT   ACGCTATCAG   2640
AAATTTTGAT   GAAAAGAACT   GTGAAGTTCT   CAAAGAAATA   CTCGTGACAG   TAGGTGCTTG   2700
CACTGAAGAA   TTCTTTGAAA   ATAAAGATTG   GTTTGATCCA   GTTGAAAATG   AAGCCATACA   2760
TGAAGTTTAT   GCAAAACTTG   GACCCATTGT   AGCCAATGCT   ATGCTTAAAT   GTGTTGCTTT   2820
TTGCGATGCG   ATAGTGGAAA   AAGGCTATAT   AGGTGTTATA   ACACTTGACA   ACCAAGATCT   2880
TAATGGCAAT   TTCTACGATT   TCGGCGATTT   CGTGAAGACT   GCTCCGGGTT   TTGGTTGCGC   2940
TTGTGTTACA   TCATATTATT   CTTATATGAT   GCCTTTAATG   GGGATGACTT   CATGCTTAGA   3000
GTCTGAAAAC   TTTGTGAAAA   GTGACATCTA   TGGTTCTGAT   TATAAGCAGT   ATGATTTACT   3060
AGCTTATGAT   TTTACCGAAC   ATAAGGAGTA   CCTTTTCCAA   AAATACTTTA   AGTACTGGGA   3120
TCGCACATAT   CACCCAAATT   GTTCTGATTG   TACTAGTGAC   GAGTGTATTA   TTCATTGTGC   3180
TAATTTTAAC   ACATTGTTTT   CTATGACAAT   ACCAATGACA   GCTTTTGGAC   CACTTGTCCG   3240
TAAAGTTCAT   ATTGATGGTG   TACCAGTAGT   TGTTACTGCA   GGTTACCATT   TCAAACAACT   3300
TGGTATAGTA   TGGAATCTTG   ATGTAAAATT   AGACACAATG   AAGTTGAGCA   TGACTGATCT   3360
TCTTAGATTT   GTCACAGATC   CAACACTTCT   TGTAGCATCA   AGCCCTGCAC   TTTTAGACCA   3420
GCGTACTGTC   TGTTTCTCCA   TTGCAGCTTT   GAGTACTGGT   ATTACATATC   AGACAGTAAA   3480
ACCAGGTCAC   TTTAACAAGG   ATTTCTACGA   TTTCATAACA   GAGCGTGGAT   TCTTTGAAGA   3540
GGGATCTGAG   TTAACATTAA   AACATTTTTT   CTTTGCACAG   GGTGGTGAAG   CTGCTATGAC   3600
AGACTTCAAT   TATTATCGCT   ACAATAGAGT   CACAGTACTT   GATATTTGCC   AAGCTCAATT   3660
TGTTTACAAA   ATAGTTGGCA   AGTATTTTGA   ATGTTATGAC   GGTGGGTGCA   TTAATGCTCG   3720
TGAAGTTGTT   GTTACAAACT   ATGACAAGAG   TGCTGGCTAT   CCTTTGAACA   AATTTGGTAA   3780
AGCTAGACTT   TACTACGAAA   CTCTTTCATA   TGAAGAGCAG   GATGCACTTT   TTGCTTTAAC   3840
AAAGAGAAAT   GTTTTACCCA   CAATGACTCA   AATGAATTTG   AAATACGCTA   TTTCTGGTAA   3900
GGCAAGAGCT   CGTACAGTAG   GAGGAGTTTC   ACTTCTTTCT   ACCATGACTA   CGAGACAATA   3960
TCATCAGAAG   CATTTGAAGT   CAATTGCTGC   AACACGCAAT   GCTACTGTGG   TCATTGGTTC   4020
AACCAAGTTT   TATGGTGGTT   GGGACAATAT   GCTTAAAAAT   TTAATGCGTG   ATGTTGATAA   4080
TGGTTGTTTG   ATGGGATGGG   ACTATCCTAA   GTGTGACCGT   GCTTTACCTA   ATATGATTAG   4140
AATGGCTTCT   GCCATGATAT   TAGGTTCTAA   GCATGTTGGT   TGTTGTACAC   ATAATGATAG   4200
GTTCTACCGC   CTCTCCAATG   AGTTAGCTCA   AGTACTCACA   GAAGTTGTGC   ATTGCACAGG   4260
TGGTTTTTAT   TTTAAACCTG   GTGGTACAAC   TAGCGGTGAT   GGTACTACAG   CATATGCTAA   4320
CTCTGCTTTT   AACATCTTTC   AAGCTGTTTC   TGCTAATGTT   AATAAGCTTT   TGGGGGTTGA   4380
TTCAAACGCT   TGTAACAACG   TTACAGTAAA   ATCCATACAA   CGTAAAATTT   ACGATAATTG   4440
TTATCGTAGT   AGCAGCATTG   ATGAAGAATT   TGTTGTTGAG   TACTTTAGTT   ATTTGAGAAA   4500
ACACTTTTCT   ATGATGATTT   TATCTGATGA   TGGAGTTGTG   TGCTACAACA   AAGATTATGC   4560
GGATTTAGGT   TATGTAGCTG   ACATTAATGC   TTTTAAAGCA   ACACTTTATT   ACCAGAATAA   4620
CGTCTTTATG   TCCACTTCTA   AGTGTTGGGT   AGAACCAGAT   CTTAGTGTTG   GACCACATGA   4680
ATTTTGTTCA   CAGCATACAT   TGCAGATTGT   TGGGCCTGAT   GGAGACTACT   ATCTTCCCTA   4740
TCCAGACCCG   TCCAGAATTT   TGTCAGCTGG   TGTGTTTGTT   GATGACATAG   TTAAAACAGA   4800
CAATGTTATT   ATGTTAGAAC   GTTACGTGTC   ATTGGCTATT   GACGCATACC   CGCTCACAAA   4860
ACACCCTAAG   CCTGCTTATC   AAAAAGTGTT   TTACACTCTA   CTAGATTGGG   TTAAACATCT   4920
ACAGAAAAAT   TTGAATGCAG   GTGTTCTTGA   TTCGTTTTCA   GTGACAATGT   TAGAGGAAGG   4980
TCAAGATAAG   TTCTGGAGTG   AAGAGTTTTA   CGCTAGCCTC   TATGAAAAGT   CCACTGTCTT   5040
GCAAGCTGCA   GGCATGTGTG   TAGTATGTGG   TTCGCAAACT   GTACTTCGTT   GTGGAGACTG   5100
TCTTAGGAGA   CCACTTTTAT   GCACGAAATG   TGCTTACGAC   CATGTTATGG   GAACAAAGCA   5160
TAAATTCATT   ATGTCTATCA   CACCATATGT   GTGTAGTTTT   AATGGTTGTA   ATGTCAATGA   5220
TGTTACAAAG   TTGTTTTTAG   GTGGTCTTAG   TTATTATTGT   ATGAACCACA   AACCACAGTT   5280
GTCATTCCCA   CTCTGTGCTA   ATGGCAACGT   TTTTGGTCTA   TATAAAAGTA   GTGCAGTCGG   5340
CTCAGAGGCT   GTTGAAGATT   TCAACAAACT   TGCAGTTTCT   GACTGGACTA   ATGTAGAAGA   5400
CTACAAACTT   GCTAACAATG   TCAAGGAATC   TCTGAAAATT   TTCGCTGCTG   AAACTGTGAA   5460
AGCTAAGGAG   GAGTCTGTTA   AATCTGAATA   TGCTTATGCT   GTATTAAAGG   AGGTTATCGG   5520
CCCTAAGGAA   ATTGTACTCC   AATGGGAAGC   TTCTAAGACT   AAGCCTCCAC   TTAACAGAAA   5580
TTCAGTTTTC   ACGTGTTTTC   AGATAAGTAA   GGATACTAAA   ATTCAATTAG   GTGAATTTGT   5640
GTTTGAGCAA   TCTGAGTACG   GTAGTGATTC   TGTTTATTAC   AAGAGCACGA   GTACTTACAA   5700
ATTGACACCA   GGTATGATTT   TTGTGTTGAC   TTCTCATAAT   GTGAGTCCTC   TTAAAGCTCC   5760
AATTTTAGTC   AACCAAGAAA   AGTACAATAC   CATATCTAAG   CTCTATCCTG   TCTTTAATAT   5820
AGCGGAGGCC   TATAATACAC   TGGTTCCTTA   CTACCAAATG   ATAGGTAAGC   AAAAATTTAC   5880
AACTATCCAA   GGTCCTCCTG   GTAGCGGTAA   ATCTCATTGT   GTTATAGGTT   TGGGTTTGTA   5940
TTACCCTCAG   GCGAGAATAG   TCTACACTGC   ATGTTCTCAT   GCGGCTGTAG   ACGCTTTATG   6000
TGAAAAAGCA   GCCAAAAACT   TCAATGTTGA   TAGATGTTCA   AGGATAATAC   CTCAAAGAAT   6060
CAGAGTTGAT   TGTTACACAG   GCTTTAAGCC   TAATAACACC   AATGCGCAGT   ACTTGTTTTG   6120
TACTGTTAAT   GCTCTACCAG   AAGCAAGTTG   TGACATTGTT   GTAGTTGATG   AGGTCTCTAT   6180
GTGTACTAAT   TATGATCTTA   GTGTCATAAA   TAGCCGACTG   AGTTACAAAC   ATATTGTTTA   6240
TGTTGGAGAC   CCACAGCAGC   TACCAGCTCC   TAGAACTTTG   ATTAATAAGG   GTGTACTTCA   6300
ACCGCAGGAT   TACAATGTTG   TAACCAAAAG   AATGTGCACA   CTAGGACCTG   ATGTCTTTTT   6360
GCATAAATGT   TACAGGTGCC   CAGCTGAAAT   TGTTAAAACA   GTCTCTGCAC   TTGTTTATGA   6420
AAATAAATTT   GTACCTGTCA   ACCCAGAATC   AAAGCAGTGC   TTCAAAATGT   TTGTAAAAGG   6480
TCAGATTCAG   ATTGAGTCTA   ACTCTTCTAT   AAACAACAAG   CAACTAGAGG   TTGTCAAGGC   6540
CTTTTTAGCA   CATAATCCAA   AATGGCGTAA   AGCTGTTTTC   ATCTCACCCT   ATAATAGTCA   6600
AAATTATGTT   GCTCGGCGTC   TTCTTGGTTT   GCAAACGCAA   ACTGTGGATT   CCGCTCAGGG   6660
TAGTGAGTAT   GATTACGTCA   TCTAGCTGCT   CTGAAGATTT   TTAATCCTGC   TGCAATTCAC   6720
GATGTGGGTA   ATCCAAAAGG   CATCCGTTGT   GCTACAACAC   CAATACCATG   GTTTTGTTAT   6780
GATCGTGATC   CTATTAATAA   CAATGTTAGA   TGTCTGGATT   ATGACTATAT   GGTACATGGT   6840
CAAATGAATG   GTCTTATGTT   ATTTTGGAAC   TGTAATGTAG   ACATGTACCC   AGAGTTTTCA   6900
ATTGTTTGTA   GATTTGATAC   TCGCACTCGC   TCTAAATTGT   CTTTAGAAGG   TTGTAATGGT   6960
GGTGCATTGT   ATGTTAATAA   CCATGCTTTC   CACACACCAG   CTTATGATAG   AAGAGCTTTT   7020
GCTAAGCTTA   AACCTATGCC   ATTCTTTTAC   TATGATGATA   GTAATTGTGA   ACTTGTTGAT   7080
GGGCAACCTA   ATTATGTACC   ACTTAAGTCA   AATGTTTGCA   TAACAAAATG   CAACATTGGT   7140
GGTGCTGTCT   GCAAGAAGCA   TGCTGCTCTT   TACAGAGCGT   ATGTTGAGGA   TTACAACRTT   7200
TTTATGCAGG   CTGGTTTTAC   AATATGGTGT   CCTCAAAACT   TTGACACCTA   TATGCTTTGG   7260
CATGGTTTTG   TTAATAGCAA   AGCACTTCAG   AGTCTAGAAA   ATGTGGCTTT   TAATGTCGTT   7320
AAGAAAGGTG   CCTTCACCGG   TTTAAAAGGT   GACTTACCAA   CTGCTGTTAT   TGCTGACAAA   7380
ATAATGGTAA   GAGATGGACC   TACTGACAAA   TGTATTTTTA   CAAATAAGAC   TAGTTTACCT   7440
ACAAATGTAG   CTTTTGAGTT   ATATGCAAAA   CGCAAACTTG   GACTCACACC   TCCATTAACA   7500
ATACTTAGGA   ATTTAGGTGT   TGTCGCAACA   TATAAGTTTG   TGTTGTGGGA   TTATGAAGCT   7560
GAACGTCCTT   TCTCAAATTT   CACTAAGCAA   GTGTGTTCCT   ACACTGATCT   TGATAGTGAA   7620
GTTGTAACAT   GTTTTGATAA   TAGTATTGCT   GGCTCTTTTG   AGCGTTTTAC   TACTACAAGA   7680
GATGCAGTGC   TTATTTCTAA   TAACGCTGTG   AAAGGGCTTA   GTGCCATTAA   ATTACAATAT   7740
GGCCTTTTGA   ATGATCTACC   TGTAAGTACT   GTTGGAAATA   AACCTGTCAC   ATGGTATATC    7800
TATGTGCGCA   AGAATGGTGA   GTACGTCGAA   CAAATCGATA   GTTACTATAC   ACAGGGACGT    7860
ACTTTTGAAA   CCTTCAAACC   TCGTAGTACA   ATGGAAGAAG   ATTTTCTTAG   TATGGATACT    7920
ACACTCTTCA   TCCAAAAGTA   TGGTCTTGAG   GATTATGGTT   TTGAACACGT   TGTATTTGGA    7980
GATGTCTCTA   AAACTACCAT   TGGTGGTATG   CATCTTCTTA   TATCGCAAGT   GCGCCTTGCA    8040
AAAATGGGTT   TGTTTTCCGT   TCAAGAATTT   ATGAATAATT   CTGACAGTAC   ACTGAAAAGT    8100
TGTTGTATTA   CATATGCTGA   TGATCCATCT   TCTAAGAATG   TGTGCACTTA   TATGGACATA    8160
CTCTTGGACG   ATTTTGTGAC   TATCATTAAG   AGCTTAGATC   TTAATGTTGT   GTCCAAAGTT    8220
GTGGATGTCA   TTGTAGATTG   TAAGGCATGG   AGATGGATGT   TGTGGTGTGA   GAATTCACAT    8280
ATTAAAACCT   TCTATCCACA   ACTCCAATCT   GCTGAATGGA   ATCCCGGCTA   TAGCATGCCT    8340
ACACTGTACA   AAATCCAGCG   TATGTGTCTC   GAACGGTGTA   ATCTCTACAA   TTATGGTGCA    8400
CAAGTGAAAT   TACCTGATGG   CATTACTACT   AATGTCGTTA   AGTATACTCA   GTTGTGTCAA    8460
TACCTTAACA   CTACTACATT   GTGTGTACCA   CACAAAATGC   GTGTATTGCA   TTTAGGAGCT    8520
GCTGGTGCAT   CTGGTGTTGC   TCCTGGTAGT   ACTGTATTAA   GAAGATGGTT   ACCAGATGAT    8580
GCCATATTGG   TTGATAATGA   TTTGAGAGAT   TACGTTTCCG   ACGCAGACTT   CAGTGTTACA    8640
GGTGATTGTA   CTAGTCTTTA   CATCGAAGAC   AAGTTTGATT   TGCTCGTCTC   TGATTTATAT    8700
GATGGCTCCA   CAAAATCAAT   TGACGGTGAA   AACACGTCGA   AAGATGGTTT   CTTTACTTAT    8760
ATTAATGGTT   TCATTAAAGA   GAAACTGTCA   CTTGGTGGAT   CTGTTGCCAT   TAAAATCACG    8820
GAATTTAGTT   GGAATAAAGA   TTTATATGAA   TTGATTCAAA   GATTTGAGTA   TTGGACTGTG    8880
TTTTGTACAA   GTGTTAACAC   GTCATCATCA   GAAGGCTTTC   TGATTGGTAT   TAACTACTTA    8940
GGACCATACT   GTGACAAAGC   AATAGTAGAT   GGAAATATAA   TGCATGCCAA   TTATATATTT    9000
TGGAGAAACT   CTACAATTAT   GGCTCTATCA   CATAACTCAG   TCCTAGACAC   TCCTAAATTC    9060
AAGTGTCGTT   GTAACAACGC   ACTTATTGTT   AATTTAAAAG   AAAAAGAATT   GAATGAAATG    9120
GTCATTGGAT   TACTAAGAAA   GGGTAAGTTG   CTCATTAGAA   ATAATGGTAA   GTTACTAAAC    9180
TTTGGTAACC   ACTTCGTTAA   CACACCATGA   AAAAATGCTG   TATTTATTAC   AGTTTTAATC    9240
TTACTACTAA   TTGGTAGACT   CCAATTATTA   GAAAGACTAT   TACTTAATCA   CTCTTTCAAT    9300
CTTAAAACTG   TCAATGACTT   TAATATCTTA   TATAGGAGTT   TAGCAGAAAC   CAGATTACTA    9360
AAAGTGGTGC   TTCGAGTAAT   CTTTCTAGTC   TTACTAGGAT   TTTGCTGCTA   CAGATTGTTA    9420
GTCACATTAA   TGTAAGGCAA   CCCGATGTCT   AAAACTGGTT   TTTCCGAGGA   ATTACTGGTC    9480
ATCGCGCTGT   CTACTCTTGT   ACAGAATGGT   AAGCACGTGT   AATAGGAGGT   ACAAGCAACC    9540
CTATTGCATA   TTAGGAAGTT   TAGATTTGAT   TTGGCAATGC   TAGATTTAGT   AATTTAGAGA    9600
AGTTTAAAGA   TCCGCTACGA   CGAGCCAACA   ATGGAAGAGC   TAACGTCTGG   ATCTAGTGAT    9660
TGTTTAAAAT   GTAAAATTGT   TTGAAAATTT   TCCTTTTGAT   AGTGATACAA   AAAA          9714

Claims (15)

1.一种抗原或抗体的表达载体，所述抗原能诱导抗趋向于粘膜的传染原的系统和分泌免疫反应，所述抗体保护动物免受上述传染原感染，该抗原或抗体存在于用含该表达载体的重组表达系统处理过的动物的胃肠和呼吸道中，该表达载体特征在于：
a)一种来自猪传染性胃肠炎病毒TGEV的缺损病毒基因组或其相应的cDNA，包括位于3′和5′端的TGEV复制酶识别信号和至少包括一个启动子，其中所述载体含有TGEV基因组的5’端的1.9kb区；拟结区，其包括TGEV基因组中ORF 1a和1b之间的重叠区；TGEV基因组的缺损或缺失的S、M和N结构基因；以及TGEV基因组的3’端的至少bp9691-9707区；及
b)至少有一段编码选自下组的一种产物的DNA序列：(i)一种抗原，能诱导抗趋性于粘膜的传染原的系统和分泌反应，和(ii)一种保护动物免受上述传染原感染的抗体，所述DNA序列与存在于来自TGEV的所述缺损病毒基因组的至少一个启动子操作性连接。
2.权利要求1的载体，其中来自TGEV的缺损病毒基因组或其相应的cDNA还包括编码TGEV复制酶的完整序列。
3.权利要求1的载体，包括不止一段的DNA序列，各DNA序列各自编码不同的能诱导抗趋向于粘膜的传染原的系统和分泌反应的抗原。
4.权利要求1的载体，包括不止一段的DNA序列，各DNA序列各自编码不同的保护动物免受趋向于粘膜的传染原感染的抗体。
5.一种重组表达系统，用于表达能诱导抗趋性于粘膜的传染原的系统和分泌免疫反应的抗原，或表达保护动物免受上述传染原感染的抗体，所说抗原或抗体存在于用所说重组表达系统处理过的动物的胃肠和呼吸道中，所述重组表达系统包括：
a)权利要求1至4任一项的的表达载体；和
b)一种辅助病毒。
6.权利要求5的系统，其中辅助病毒为来自TGEV的缺损基因组的复制和包衣提供功能和结构蛋白。
7.权利要求5的系统，其中辅助病毒为来自TGEV的缺损基因组的包衣提供结构蛋白。
8.一种保护动物免受趋向于粘膜的传染原感染的疫苗，包括适量的权利要求5至7任一项的重组系统和药学上可接受的赋形剂。
9.权利要求8的疫苗，用于保护猪免受趋向于粘膜的猪传染原感染，包括：
a)重组表达系统，其选自：
(i)重组表达系统，其包括至少一种含至少一段DNA序列的表达载体，所述DNA序列编码趋向于粘膜的猪病原的抗原；
(ii)重组表达系统，包括含不止一段DNA序列的表达载体，各DNA序列各自编码趋向于粘膜的不同猪病原的抗原；和
(iii)重组表达系统，其包括权利要求1至4任一项的各自含至少一段DNA序列的不同表达载体，该DNA序列编码趋性于粘膜的猪病原的抗原；及
(b)作为辅助病毒的猪冠状病毒。
10.权利要求9的疫苗，其中猪病原选自：猪放线芽孢杆菌，胸膜肺炎放线芽孢杆菌，副猪嗜血菌，猪细小病毒，钩端螺旋体属，大肠杆菌，红斑丹毒丝菌，多杀巴斯德氏菌，支气管炎博德特氏菌，梭菌属类，猪痢疾小蛇菌，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)，猪流行性腹泻病毒PEDV，猪呼吸冠状病毒，轮状病毒，或抗引发猪生殖和呼吸病症，Aujeszky′s病，猪流感或传染性胃肠炎的病原和萎缩性鼻炎和增殖性回肠炎的病原。
11.权利要求8的疫苗，用于保护狗免受趋向于粘膜的狗传染原感染，包括：
a)选自如下的重组表达系统：
(i)重组表达系统，包括至少一种含至少一段DNA序列的表达载体，该DNA序列编码趋向于粘膜的犬病原的抗原；
(ii)重组表达系统，包括含不止一段DNA序列的表达载体，各DNA序列各自编码趋向于粘膜的不同犬病原的抗原；和
(iii)重组表达系统，包括权利要求1至4任一项的各自含至少一段DNA序列的不同表达载体，其中的DNA序列编码趋性于粘膜的犬病原的抗原；及
b)选自犬冠状病毒和重组猪冠状病毒的辅助病毒，其中的病毒表达可被犬靶细胞的特异细胞表面受体识别的包膜蛋白。
12.权利要求11的疫苗，其中犬病原选自：犬疱疹病毒，犬腺病毒1和2型，犬细小病毒1和2型，犬呼肠病毒，犬轮状病毒，犬冠状病毒，犬副流感病毒，犬流感病毒，犬瘟病毒，狂犬病毒，反转录病毒和犬杯状病毒。
13.权利要求8的疫苗，用于保护猫免受趋向于粘膜的猫传染原感染，包括：
a)选自如下的重组表达系统：
(i)重组表达系统，包括至少一种含至少一段DNA序列的表达载体，其中的DNA序列编码趋向于粘膜的猫病原的抗原；
(ii)重组表达系统，包括含不止一段DNA序列的表达载体，各DNA序列各自编码趋向于粘膜的不同猫病原的抗原；和
(iii)重组表达系统，包括权利要求1至4任一项的不同的各自含至少一段DNA序列的表达载体，其中的DNA序列编码趋性于粘膜的猫病原的抗原；及
b)选自猫冠状病毒和重组猪冠状病毒的辅助病毒，其中的病毒表达可被猫靶细胞的特异细胞表面受体识别的包膜蛋白。
14.权利要求13的疫苗，其中猫病原选自：猫杯状病毒，猫免疫缺陷病毒，猫疱疹病毒，猫全白细胞减少病毒，猫呼肠病毒，猫轮状病毒，猫冠状病毒，猫传染性腹膜炎病毒，狂犬病毒，猫Chlamydia psittaci和猫白血病病毒。
15.权利要求8的疫苗，用于保护猪免受猪传染性胃肠炎病毒TGEV感染，其中重组表达系统包括至少一种表达载体pDIA-6A.C3。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL210451B1 (pl) * 1999-06-10 2012-01-31 Merial Sas Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV)
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
US6764685B1 (en) 2000-03-21 2004-07-20 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
CN101921732A (zh) 2001-01-19 2010-12-22 维洛诺瓦蒂夫公司 在易感哺乳动物中引起呼吸道疾病的病毒
ES2208051B1 (es) * 2002-01-24 2005-08-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas Secuencia de acido nucleico que comprende la señal de encapsidacion del rna de un coronavirus del grupo 1 y sus aplicaciones.
IL163646A0 (en) 2002-02-21 2005-12-18 Vironovative Bv Recombinant parainfluenza virus expression systemsand vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
US7704720B2 (en) 2003-04-25 2010-04-27 Medimmune, Llc Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
EP1650308A1 (en) * 2004-09-03 2006-04-26 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
AU2005279303B2 (en) * 2004-09-03 2011-10-27 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
US7959929B2 (en) 2005-04-21 2011-06-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
US20090304738A1 (en) * 2005-06-16 2009-12-10 Moran Thomas M Methods for Enhancing Immune Responses
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
BRPI0800485B8 (pt) * 2008-01-17 2021-05-25 Univ Minas Gerais vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose
BRPI0822947B1 (pt) * 2008-11-19 2018-09-18 Laboratorio Avi Mex S A De Cv vacina recombinante.
CN104262488B (zh) * 2014-09-24 2017-07-28 普莱柯生物工程股份有限公司 一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用
US20230346917A1 (en) * 2020-04-12 2023-11-02 Novoscope Ip Limited Particles, dna & rna

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991003552A1 (en) * 1989-08-28 1991-03-21 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression systems and vaccines

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5785974A (en) * 1993-01-23 1998-07-28 Immunologia Y Genetica Aplicada, S.A. Synthetic peptides and vaccines against parvovirus

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991003552A1 (en) * 1989-08-28 1991-03-21 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression systems and vaccines

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