JP2009529861A - 鳥インフルエンザウイルスのh5ヘマグルチニンを発現する組み換えニューキャッスル病ウイルス - Google Patents
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Abstract
本発明は、上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結(GE)配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有し、外来遺伝子配列が、少なくとも3個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、これらのアミノ酸をコードするコドンのヌクレオチド配列が、遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しない、組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを産生するための方法を提供する。
Description
本発明は、上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結(GE)配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターに関する。本発明はさらに、このような組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターの作製のための方法及びこのような組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを含むワクチンに関する。
感染宿主中で複製することができる生ウイルスは、その発現された抗原に対して強く長期間持続する免疫反応を誘導する。これらは、液性及び細胞介在性免疫反応の両方ならびに刺激性のサイトカイン及びケモカイン経路を誘導するのに有効である。したがって、弱毒化生ウイルスは、通常は免疫系の液性反応のみを大きく刺激する、不活性化又はサブユニット免疫原の何れかに基づくワクチン組成物を凌ぐ独特の長所を与える。
過去10年間にわたり、組み換えDNA技術は、DNA及びRNAウイルス両方のゲノムの遺伝子操作の分野を大きく変革させてきた。特に、現在、宿主動物での新しいベクターウイルスの複製において、宿主動物で生物学的効果を及ぼすことができる外来タンパク質が発現されるように、ウイルスのゲノムに外来遺伝子を導入することが可能である。このように、微生物感染の制御及び予防のためだけでなく、悪性腫瘍などの非微生物疾患に対して、及び遺伝子治療において標的治療を講じるためにも、組み換えベクターウイルスが開発されてきた。
1994年(Schnellら、EMBO J 13、4195−4203、1994)に最初に報告された「逆遺伝学」と呼ばれる技術による、完全にクローン化cDNA由来の非分節ネガティブ鎖RNAウイルス(モノネガウイルス目のウイルス)の生成により、ベクターとして、モノネガウイルス目(MV)のウイルスも使用できるようになった。このときから、その病原体に対するワクチンの開発において、病原性動物由来の外来抗原を発現させるためにウイルスベクターとしてMV目の多くのウイルスを使用することを述べる研究が発表されてきた。
モノネガウイルス目は、4種類の主な科:パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナウイルス科に分類される。これらの科に属するウイルスは、1本鎖のネガティブ(−)センスRNA分子により表されるゲノムを有し、即ち、RNAゲノムの極性は、プラス(+)センスと呼ばれるメッセンジャーRNA(mRNA)の極性とは反対である。主なヒト及び脊椎動物MVウイルスの分類を下記の表で示す。
MV目のウイルスのゲノム構成及び生活環の詳細は、現在よく分かっており、様々な著者による概説がある(Neumannら、J.Gen.Virology 83、2635−2662、2002;Whelanら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.203、63−119、2004;Conzelmann、K.、Curr.Top.Microbiol.Immunol.203、1−41、2004)。モノネガウイルス目ウイルスは、様々な宿主及び個別の形態学的及び生物学的特性を有するが、ゲノム構成及び複製及び遺伝子発現のそれらの典型的様式に必須の因子など、これらは共通の多くの特性を有し、この事実からこれらが共通の祖先由来であることが示される。これらは、細胞の細胞質において複製し、スプライシングされないmRNAを生成するエンベロープウイルスである。
モノネガウイルス目ウイルスは、2つの主な機能単位、リボ核タンパク質(RNP)複合体及びエンベロープからなる。上述の全ての科の属の代表的ウイルスに対して完全なゲノム配列が決定されている。ゲノムは、約9.000ヌクレオチドから約19.000のサイズの範囲であり、これらは、5から10個の遺伝子を含有する。MVウイルスのゲノムの構造及び構成は非常に類似しており、それらの特定の遺伝子発現形式により支配されている。MVウイルスゲノムは全て、核タンパク質(N又はNP)、リンタンパク質(P)及びRNA依存性RNAポリメラーゼ(L)をコードする3つのコア遺伝子を含む。ウイルスのエンベロープは、ウイルスの集合/出芽において、ならびにウイルスの細胞付着及び/又は侵入に関与する、マトリックス(M)タンパク質及び1以上の膜貫通糖タンパク質(例えばG、HN及びFタンパク質)から構成される。属によって、タンパク質レパートリーは、転写及びウイルス複製においてある種の特異的な制御機能を示す、又はウイルス宿主反応に関与する(例えばC、V及びNSタンパク質)、アクセサリータンパク質により拡大される。MVウイルスの遺伝子順序は非常によく保存されており、3’末端もしくはこの付近にコア遺伝子N及びPがあり、5’遠位にラージ(large)(L)遺伝子がある。表面糖タンパク質遺伝子であるMならびにその他のアクセサリー遺伝子は、N、P及びL遺伝子間に位置する。
RNP複合体において、ゲノム又はアンチゲノムRNAはNタンパク質により固くカプシド被覆されており、L及びPタンパク質からなるRNA依存性RNAポリメラーゼと会合している。細胞の感染後、RNP複合体(裸のRNAゲノムではない。)は、2つの個別のRNA合成機能(即ち、サブゲノムmRNAの転写及び全長ゲノムRNAの複製)のための鋳型となる。
タンデムに並んだ遺伝子の全てが、「遺伝子ジャンクション」と呼ばれる構造により分けられている。遺伝子ジャンクションは、保存された「遺伝子終結」(GE)配列、非転写「遺伝子間領域」(IGR)及び保存された「遺伝子開始」(GS)配列を含む。これらの配列は、遺伝子転写に対して必要十分である。最初のGS配列のゲノムRNAの3’末端で転写プロセスを開始させるウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによって、転写の間、各遺伝子は連続してmRNAに転写される。各遺伝子ジャンクションにおいて、GE配列でのRNAポリメラーゼの離脱の結果として転写が中断される。効率は低下するが、続くGS配列で転写が再開する。「終結−開始」プロセスとも呼ばれるこのプロセス中断の結果、続く下流遺伝子よりもMVウイルスゲノムの3’近位遺伝子がよく転写され、その結果として各遺伝子ジャンクションで転写の減衰が起こる。各遺伝子が個別のシストロン又は転写単位の一部である、MVウイルス遺伝子の転写のモジュラー型により、これらのウイルスが外来遺伝子の挿入及び発現に非常に適切となる。MVウイルスゲノムにおける各転写単位は、次のエレメント:3’−GS−オープンリーディングフレーム(ORF)−GE−5’を含む。
3’−及び5’−ゲノム末端で、MVウイルスゲノムは全て、それぞれ「リーダー」(約40−50nt)及び「トレイラー」(約20−600nt)と呼ばれる短い非転写領域を有する。リーダー及びトレイラー配列は、ゲノムRNAの複製、ウイルスのカプシド被覆及びパッケージングを調節する必須の配列である。
逆遺伝学技術及び感染性MVウイルスのレスキューによって、そのcDNAコピーを通じてそのRNAゲノムを操作できるようになった。ウイルスRNAを合成するために必要とされる最小複製開始複合体は、RNP複合体である。(抗)ゲノムRNA及び(T7)RNAポリメラーゼ駆動プラスミドからの適切なサポートタンパク質の細胞内同時発現により、感染性MVウイルスをレスキューすることができる。1994年のSchnellら、1994(前出)による最初の報告以来、オリジナルのプロトコール(又は僅かな変更のあるその変法)に基づき、多くのMVウイルス種が確実に回収された。
ニューキャッスル病及び鳥インフルエンザは、家禽の重大な疾患であり、世界中の養鶏業において重大な経済的損失を生じさせ得る。ニューキャッスル病ウイルスは、MV目内の非分節ネガティブ鎖RNAウイルスである。このゲノムは、長さ約15kbであり、核タンパク質(NP)、リンタンパク質及びVタンパク質(P/V)、マトリックス(M)タンパク質、融合(F)タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)タンパク質及びRNA依存性RNAポリメラーゼ又はラージ(large)(L)タンパク質をコードする6個の遺伝子を含有する。NDV遺伝子は、3’−NP−P−M−F−HN−L−5’の順序で連続して並んでおり、様々な長さの遺伝子間領域により分かれている。遺伝子は全て、遺伝子開始(GS)配列が先行し、続いて非コード領域、NDVタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、第二の非コード領域及び遺伝子終結(GE)配列が続く。NDVゲノムの長さは、外来遺伝子の導入が考慮されなければならないので6の倍数である。
鳥インフルエンザ(AI)は、軽度の呼吸徴候から高い死亡率の重症疾患を特徴とする家禽の疾患である。病原体は、オルトミクソウイルス科に属する、鳥インフルエンザAウイルス(AIV)である。AIVは、10個のタンパク質をコードするネガティブ極性のの8個のゲノムRNAセグメントを含有する。表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(N)の抗原性に基づき、AIウイルスがサブタイプに分類された。現在まで、16種類のヘマグルチニン(H1−H16)及び9種類のノイラミニダーゼ(N1−N9)サブタイプが知られている。H及びNに対する抗体は液性免疫反応において重要であり、感染を阻害するか又は疾患を予防する。
鳥インフルエンザ及びニューキャッスル病ウイルスは、それらの毒性により、2種類の個別の病原型にグループ化することができる。低病原性AIV(LPAI)又は弱毒性NDVにより引き起こされる症状は、関連性が低いと考えられる。一方、高毒性のウイルスにより引き起こされる高病原性鳥インフルエンザ(HPAI)及びニューキャッスル病(NDV:中等毒性及び強毒性株)は法定疾患である。
弱毒性NDV株でのNDVに対する通常のワクチン接種が高毒性NDV株からニワトリを保護するために行われる一方、HPAIは撲滅ストラテジーにより制御されるので、HPAIに対するワクチン接種は殆どの国で行われていない。しかし、損失を最小限に抑え、疾患の発生を低下させるためのストラテジーとしてワクチン接種を使用し得る。ワクチンにより誘導される免疫はサブタイプ特異的であり、これは、サブタイプH5ワクチンがH5 AIVを防御できるが、その他のHサブタイプを防御できないことを意味する。通常、インフルエンザウイルス複製は肺に限定されるが、これは、肺に限定されるトリプターゼClara、セリンプロテアーゼによってのみLPAIウイルスのヘマグルチニンが切断され得るからである。今までのところ、全てのHPAIウイルスは、H5及びH7サブタイプのものであった。これらのHPAIウイルスは、ユビキタスなフリン及びサブチリシン様酵素によりサブユニットHA1及びHA2へと切断され得るように、H切断部位において複数の塩基性アミノ酸を含有する。したがって、このようなウイルスをその他の生物中で増殖させることができる。
サブタイプH5及びH7ワクチンは、HPAIによる感染後の臨床徴候及び死亡が起こらないようにニワトリ及びシチメンチョウに対して防御効果を与えることができる。従来の不活性油を利用したAIV全体に加えて、ベクターウイルス、サブユニットタンパク質及びDNAワクチンがAIに対する免疫付与に有効であることが実験的に示されてきた。様々なウイルスに対する逆遺伝学の出現以来、ワクチンベクターとしての使用のための組み換えウイルスの生成は、重要な適用となっている。外来タンパク質を発現する様々な組み換えネガティブ鎖RNAウイルスが構築されてきた。また、感染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)(Luschowら、Vaccine 19、4249−59、2001)、牛疫ウイルス(Walshら、J.Virol.74、10165−75、2000)及び水疱性口内炎ウイルス(VSV)(Robertsら、J.Virol.247、4704−11、1998)のような様々なベクターウイルスにAIVのヘマグルチニンが挿入された。また、AIVヘマグルチニンの発現のためにNDVが使用された。インフルエンザA/WSN/33のヘマグルチニン遺伝子をNDV株HitchnerB1のP及びM遺伝子の間に挿入した。この組み換えにより、マウスの検出可能な体重低下はあったものの、10日以内に完全に回復し、致死性感染からマウスが保護された。Nakayaら(J.Virol.75、11868−73、2001)。外来遺伝子に対して同じ挿入部位を有するさらなる組み換えNDVがLPAIのH7を発現したが、強毒性NDV及びHPAIの両方が防御されたのはワクチン接種されたニワトリのうち40%のみであった(Swayneら、Avian Dis.47、1047−50、2003)。
前駆タンパク質(HA0)としてインフルエンザHAタンパク質が合成される。前駆ポリペプチドHA0は、保存されているアルギニン(Arg)残基において翻訳後に2個のサブユニット、HA1及びHA2に切断される。この切断は、ウイルスの感染性に関与する(HA前駆体が効率的に切断されるほど、ウイルスの毒性が強くなると思われる。)。様々なインフルエンザウイルスのHA1−HA2ジャンクション領域が分析されてきた。病原性株が、切断部位に隣接する塩基性アミノ酸の一続きを含有することが発見された。(Senneら、Avian Diseases、40:425−437、1996;Steinhauser、Virology、258、1−20、1999;Kawaoka及びWebster、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85、1988)。
特に、高病原性ウイルスは、インフルエンザワクチンにより与えられるはずである予防に関して重要である。
しかし、それらの配列中でアミノ酸の塩基性の一続きを有する、これらのタイプのタンパク質、即ち病原性H5インフルエンザのHAタンパク質のようなタンパク質をモノネガウイルス目ベクターに挿入した場合、ある種の問題に直面した。
最初に、遺伝子配列は、ある程度、不安定であると思われた。H5遺伝子が挿入されたNDVベクター(NDVH5)の数回の卵継代後、アミノ酸の塩基性の一続きをコードする遺伝子配列の部分内で自然発生的な突然変異が起こった。
さらに、塩基性アミノ酸の一続きに対するコード配列は、遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルスにより認識される配列を含有する可能性がある。モノネガウイルス目に対するGE配列はWhelanにより総括されている(Curr.Top.Microbiol.Immunol.、283、61−119、2004)。モノネガウイルス目に対するGE配列は、共通の保存的配列:nUUUUを特徴とする。
病原性H5型鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質の切断部位に隣接するものなどの、塩基性アミノ酸の一続きに対するコード配列の部分が、GE配列としてモノネガウイルス目ベクターのポリメラーゼにより認識されるGE配列に類似することが分かった。これにより、このようなベクターに基づくワクチンの効率に影響を与え得る、全長タンパク質のタンパク質発現のレベルが低下し得る。
本発明の目的は、既存のMVウイルスベクターよりも、ベクターウイルスのゲノムに挿入された外来遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルが高い及び/又は免疫原性が上昇している組み換えMVウイルスベクターを提供することである。
本発明は、この目的が、本発明による組み換えモノネガウイルス目ウイルスにより満たされることを見出した。
本発明は、上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結(GE)配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有し、外来遺伝子配列が、少なくとも3個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、該一続きがアルギニン(Arg)及び/又はリジン(Lys)残基からなり、少なくとも1個のリジンを含有するタンパク質をコードすることを特徴とし、遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しないように外来遺伝子のヌクレオチド配列が選択される、組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを作製するための方法を提供する。
遺伝子終結配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列は、モノネガウイルス目の殆どのGE配列に共通する最小保存配列、即ちa/uCUUUU(モノネガウイルスに対するゲノムのセンスであるネガティブセンスにおいて)を包含する配列である。ポジティブセンスにおいて(cDNAレベル)、このモチーフはt/aGAAAA)である。
使用される特定のモノネガウイルス目ベクターについて、当技術分野で公知の特定のGE配列が適合する(Whelanら、前出)。NDVについて、例えば、Whelanで挙げられるGE配列はaaucUUUUUUuである。(−センス、これは、モノネガウイルス目に対するゲノムのセンスである。)。従って、+センス(cDNAレベル))において、配列は、アデニン残基:gAAAAAAの一続きを特徴とする。
本発明によるベクターにおいて、このようなGE配列は外来タンパク質のコード配列内では生じない。
この目的を達成するために当業者に受け入れられるいくつかのオプションがある。本質的に、遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しない外来配列を選択することができる。
例えば、外来遺伝子配列がウイルスタンパク質をコードする場合、このタンパク質をコードする遺伝子(このコード配列は潜在的GE配列を包含しない。(一方、ウイルスの別の株において同じ遺伝子が包含する。))を本質的に担うウイルスの株から外来遺伝子が得られ得る。
しかし、このような変異体遺伝子配列が野生型ウイルスから得られ得る機会は少ないので、潜在的GE配列がもはや存在しないような程度に配列を変化させるために部位特異的突然変異誘発によって外来遺伝子の野生型配列を突然変異させることが好ましい。
外来遺伝子がタンパク質をコードしている得られた組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター(タンパク質は、アルギニン(Arg)及び/又はリジン(Lys)残基からなり少なくとも1個のリジンを含有する少なくとも3個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、外来遺伝子は、遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しない。)は同様に本発明の一部である。
修飾される必要がある外来遺伝子の部分(特に外来タンパク質が病原性H5鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質である場合)は、少なくとも3個の塩基性アミノ酸の一続きをコードする野生型外来遺伝子配列の部分であり得る。
塩基性アミノ酸の一続きは、リジン(一文字コード:K)及びアルギニン(一文字コード:R)(ここで少なくとも1つのアミノ酸残基がリジンである。)からなる群から選択される少なくとも3個のアミノ酸を包含するものとして定義される。
これには配列KKK及び2個のKと1個のRの組み合わせ(KKR、KRK、RKK)及び1個のKと2個のRの組み合わせ(KRR、RKR及びRRK)が含まれるが、本明細書中で述べられる特定の3個のアミノ酸配列を含む塩基性アミノ酸のより長い一続きも含まれる。Steinhauserら(前出)から分かるように、病原性インフルエンザウイルスのHAタンパク質において切断部位に隣接する塩基性アミノ酸の一続きは、より長いものであり得、RRKKR又はRRRKKのような配列が含まれ得る。
リジンをコードするコドンは、aaa及びaagであり、一方、アルギニンをコードするコドンはaga及びaggを含む。特にH5病原性鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質に対するコード配列において、そのタンパク質の切断部位に隣接するアミノ酸の塩基性の一続きをコードするコード配列は、GEモチーフt/aGAAAAを含有し得る。
野生型外来遺伝子内に存在するGE配列を修飾するために、少なくとも1個の突然変異が導入され得、それにより、元来野生型外来遺伝子配列に存在する共通モチーフ(t/aGAAAA)を有するGE配列内のアデニンストレッチの「A」が別のヌクレオチドにより置換される。
実際に、GE配列として認識される配列の一部である「aaaa」トラクトにおいて突然変異が導入される場合、アデニンヌクレオチドの少なくとも1個は、別のヌクレオチドで置換されなければならない(例えばグアニジン(「g」))。
部位特異的突然変異誘発により配列を変化させる場合、これらの変更は、好ましくはサイレントである(突然変異がアミノ酸レベルで突然変異を導かないことを意味する。)。しかし、アミノ酸レベルで保存的突然変異に導く核酸レベルでの突然変異(1個の塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸で置換されることを意味し、例えばLがRになるか又はRがLになるか。)もまた許容可能であり得る。例えば、アミノ酸の塩基性の一続きをコードする野生型遺伝子配列の部分において、少なくとも1個のリジン残基がコドン「aaa」によりコードされる場合、本発明のベクターに挿入される修飾外来遺伝子においてこのコドンは「aag」に突然変異され得る。又は、野生型配列において、アミノ酸の塩基性ストレッチの部分を形成する特定のアルギニン残基が「aga」によりコードされる場合、このコドンは、本発明によるベクターの部分が形成されるように、遺伝子において「agg」へと突然変異され得る。
野生型配列中の少なくとも1個の「aaa」コドン(リジンをコードする。)は、本発明のベクターに組み込まれる修飾外来遺伝子配列を生成するために突然変異され得る。このような突然変異には、「aag」コドンによる「aaa」コドンの置換が含まれ得る。例えば、塩基性アミノ酸の一続きが少なくとも2個のリジンアミノ酸を連続して含有する場合、及びこれらのリジンの少なくとも1個がコドン「aag」によりコードされるベクターが好ましい場合、しかし、2以上の突然変異が行われ得る。例えば、コード配列が2個の「aaa」コドンを連続して含有する場合、両者とも「aag」コドンにより置換され得る。
特に、得られるベクターが所望の安定性を有するために、少なくとも2個の突然変異が外来遺伝子に導入されることが好ましい。外来遺伝子が2個の「aaa」コドンを連続して含有する場合、好ましくは両者とも突然変異され、代わりにaagコドンにより置換され得る。
塩基性アミノ酸をコードする3又は4個の連続的なコドンのそれぞれにおいてアミノ酸の塩基性ストレッチをコードする外来遺伝子の部分が1個の突然変異を含有するベクターを用いて、よい結果が得られた。塩基性ストレッチが3個のアミノ酸のみを包含する場合、3個の突然変異が行われ得るが、4以上の塩基性アミノ酸がある場合、さらなる突然変異が行われ得る。
例えば、野生型配列がヌクレオチド配列aga aga aaa aaa(+センス配列、潜在的GE配列モチーフに下線を付す。)によりコードされるアミノ酸配列 RRKKを含有する場合、このコード配列は、agg agg aag aag(これは依然としてRRKKをコードする。)に突然変異され得る。
モノネガウイルス目ウイルスベクターは好ましくはニューキャッスル病ウイルス(NDV)ベクターであり、外来遺伝子は病原性H5鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質である。
病原性H5鳥インフルエンザの修飾されたHA遺伝子が組み込まれているNDVベクターを用いて、よい結果が得られた(NDVH5m)。
HA遺伝子が、NDVベクターのNDV融合(F)とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)遺伝子との間の遺伝子間領域に組み込まれた。HA遺伝子は修飾されたH5遺伝子であり、ここで、野生型「aga aga aaa aaa」配列は、本発明の方法による「agg agg aag aag」配列に変更された。
このベクターは、非常により多くの全長HA転写産物を産生し、非常により高いレベルのHAを発現し、また、そのエンベロープにより多くのHAタンパク質を組み込んだ。
さらに、NDVH5mは、10回を超える卵継代の間、修飾HA遺伝子を安定的に発現した。NDVH5mを用いたニワトリの免疫付与により、それぞれ、NDV−及びAIV H5−特異的抗体が誘導され、強毒性NDV又は高病原性AIVの致死量による曝露処置後のニワトリの臨床疾患を防御した。意外なことに、インフルエンザウイルスの出芽は観察されなかった。さらに、NDVH5mでの免疫付与によって、AIVの核タンパク質(NP)に対する抗体に基づき、ワクチン接種された動物及びAIVフィールドウイルスに感染した動物の血清学的識別が可能となった。従って、組み換えNDVH5mは、NDV及びAIVに対する二価ワクチンとして適切であり、鳥インフルエンザ(AI)の制御のためのマーカーワクチンとして使用され得る。
外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えMVウイルスベクターの調製のための方法は当技術分野で周知である。
とりわけ、この方法において、単離核酸分子及びMVウイルスのゲノムをそれらのcDNA型(+センス)で使用する。これにより、容易に操作しウイルスゲノムへ所望の核酸分子を挿入できるようになる。
一般に、2個の遺伝子間で、即ち遺伝子間領域(IGR)で、遺伝子の3’又は5’非コード領域ならびにゲノムの3’プロモーター−隣接(N/NP遺伝子の前)又は5’遠位末端(L遺伝子の後)で、外来遺伝子の挿入のためにゲノムの様々な部分を使用し得る。
N/NP遺伝子の前、NP−P、P−M、M−G/F、G/F−HN、HN−Lの間及びL遺伝子の後に、外来遺伝子を有利に挿入し得る。
最も単純な方法は、酵素で切断し適切な転写カセットを導入することによって、これらの部位の1つにおいて既存の制限酵素(RE)認識配列を使用することである。天然に存在する制限酵素認識配列は必ずしも所望の位置にあるわけではないので、従来どおり部位特異的又はPCR突然変異誘発により、ゲノムにRE認識部位を導入し得る。
挿入すべき転写カセットの組成は、挿入の部位に依存する。例えば、転写カセットがIGRに挿入される場合、カセットは次のエレメント:3’RE認識部位−GS−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−GE−RE認識部位5’を含み得る。
あるいは、転写カセットが天然のMVウイルス遺伝子の5’非コード領域に導入される場合、カセットは、3’RE認識部位−GE−IGR−GS−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−RE認識部位5’から構成され得る。
同様に、転写カセットが天然のMVウイルス遺伝子の3’非コード領域に導入されるべき場合、カセットは、3’RE認識部位−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−GE−IGR−GS−RE認識部位5’から構成され得る。
このような転写カセットの調製及びMVウイルスゲノムへのこの挿入は、列挙した参考文献及び本発明の実施例で例示されるものなどの通常の分子生物学的技術しか含まない。特に、この目的に対して、部位特異的及びPCR突然変異誘発などの技術を使用することができる(Peetersら、1999、前出;Current Protocols in Molecular Biology、編:F.M.Ausbelら、Wiley N.Y.、1995編集、8.5.1.−8.5.9頁;及びKunkelら、Methods in Enzymology Vol.154、376−382、1987)。
とりわけ、MV目の非分節ネガティブ鎖RNAウイルスの遺伝子修飾を可能にするよく確立された「逆遺伝学」法により、本発明による組み換えMVウイルスベクターを調製することができる(例えばConzelmann、K.K.、Current Topics Microbiol.Immunol.203、1−41、2004;及びWalpitaら、FEMS Microbiol.Letters 244、9−18、2005により概説される。)。
この方法において、MV(抗)ゲノム及びサポートタンパク質の転写及び同時発現及び組み換えMVベクターの作製を可能にするのに十分な条件下で、全長ゲノム又は、好ましくはMVウイルスのアンチゲノム(ポジティブセンス)をコードするヌクレオチド配列を含むcDNA分子を含むベクター及び、必要とされるサポートタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むcDNA分子を含む1以上のベクターにより、適切な細胞の同時遺伝子移入を行う。この方法において、全長MVウイルス(抗)ゲノムをコードする前記核酸分子は、上記で定義されるようなさらなる転写単位を含む。
ベクターは、このベクターにより遺伝子移入が行われた細胞において連結されるDNAセグメントの複製及びその転写及び/又は発現を起こすような、別のDNAセグメントが連結される、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンを意味する。
好ましくは、全長ゲノムの転写のためのベクターは、その5’末端でT7ポリメラーゼプロモーター及びその3’末端で(デルタ肝炎)リボザイム配列に隣接する、MVウイルスの(抗)ゲノムをコードするcDNA配列を含むプラスミドであるが、T3又はSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを使用することもできる。
適切なサポートタンパク質の細胞内発現に対して、適切な発現調節配列(例えばT7ポリメラーゼプロモーター)の調節下で、好ましくは、これらのタンパク質をコードするcDNA配列を含むプラスミドを使用する。
本発明による組み換えMVウイルスベクターの調製のための特に好ましい方法において、MVウイルスのN(又はNP)、P及びLタンパク質をコードする発現プラスミドを使用する。
この逆遺伝学技術で使用される遺伝子移入されたサポートプラスミドの量又は割合は、幅広い範囲にわたる。サポートプラスミド、N:P:Lに対する割合は約20:10:1から1:1:2の範囲であり得、各ウイルスに対する効率的な遺伝子移入プロトコールは当技術分野で公知である。
T7RNAポリメラーゼプロモーター及びリボザイム配列の複合作用により、遺伝子移入が行われた細胞中でゲノムRNAの正確なコピーが生成され、続いて、このRNAが、同時遺伝子移入された発現プラスミドにより与えられるウイルスサポートタンパク質によりパッケージ化され複製される。
遺伝子移入された細胞に感染する組み換えワクシニアウイルスにより、特にワクシニアウイルス vTF7−3、またその他の組み換えポックスベクター(鶏痘ウイルスなど、例えばfpEFLT7pol)により、T7ポリメラーゼ酵素が与えられることが好ましいか又はT7 RNAポリメラーゼの発現のために他のウイルスベクターを使用し得る。
ろ過など単純な物理的技術により、ワクシニアウイルスからレスキューされたウイルスの分離を容易に行うことができる。センダイウイルス又はNDVのレスキューのために、孵化卵での遺伝子移入細胞の上清の接種によって、レスキューを行うことができる。
さらにより好ましい実施形態において、(T7)RNAポリメラーゼ及び/又は必要なサポートタンパク質の1以上を構成的に発現する転写及び発現ベクターの遺伝子移入に対して、細胞株を使用する。
例えば、T7 RNAポリメラーゼ及び麻疹ウイルスサポートタンパク質、N及びPの両方を発現するヒト胚腎臓細胞株、293−3−46において、麻疹ウイルスのレスキューを行うことができる(Radeckeら、EMBO J.14、5773−5784、1995)。本発明において有利に使用できる別の非常に有用な細胞株は、T7 RNAポリメラーゼを発現するBSR細胞、即ち細胞株BSR−T7/5に基づく(Buchholzら、J.Virol.73、251−259、1999)。
さらに、本発明によるMVウイルスの調製のために本明細書中で使用されるべき逆遺伝学技術に関するより詳細な情報はConzelmann、K.K.(前出)による概説及び実施例1において開示される。
組み換えMVウイルスベクターが外来遺伝子を安定に発現する能力の結果、予防的及び治療的適用の両方に対してベクターが開発されてきた。
本発明による組み換えMVウイルスベクターにおいて、特異的MVウイルスベクター種及びベクターウイルスの適用に依存して、外来遺伝子は様々であり得る。
外来遺伝子は、(その他の)微生物病原体(例えば、ウイルス、寄生生物の細菌)抗原をコードし得、特に外来遺伝子は、防御的免疫反応を誘導することができる病原体の抗原をコードする。
例えば、本発明のウイルスベクターに挿入することができる非相同遺伝子配列には、以下に限定されないが、インフルエンザウイルス糖タンパク質遺伝子、特に鳥インフルエンザウイルスのH5及びH7ヘマグルチニン遺伝子、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス(IBDV)、特に(IBDV)のVP2由来の遺伝子、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、狂犬病ウイルス、エールリヒア生物、特にエールリヒア犬、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス及び麻疹ウイルス由来の遺伝子が含まれる。
あるいは、外来遺伝子は、例えばインターロイキンなどのサイトカイン(例えばIL−2、IL−12、INF−γ、TNF−α又はGM−CSF)を同時発現させることにより、ウイルス感染に対する免疫反応を促進又は調節することができるポリペプチド免疫調節因子をコードし得る。
MV目には、ヒト及び動物において又は両方において複製することができるウイルスの両方が含まれる(例えば狂犬病ウイルス及びニューキャッスル病ウイルス)。従って、ヒト及び脊椎動物微生物病原体の幅広い範囲から外来遺伝子を選択することができる。
本発明においてベクターウイルスとして全てのMVウイルスを使用することができるが、本発明の好ましい実施形態において、組み換えMVウイルスベクターはラブドウイルス科のウイルス、好ましくはリッサウイルス属又はノヴィラブドウイルス、より好ましくはそれぞれ狂犬病ウイルス又はIHNV種のウイルスである。
また好ましい実施形態において、組み換えMVウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスであり、好ましくはレスポウイルス属、特にhPIV3又はbPIV3種;麻疹ウイルス、特にCDV種;肺炎ウイルス、特にRSV種;及びアブラウイルス、特にNDV種である。
本発明の特に好ましい実施形態において、ウイルスがニューキャッスル病ウイルス(NDV)である組み換えMVウイルスベクターが提供される。NDVはヒト及び動物の両方、特に家禽、とりわけニワトリ、で複製可能なので、本発明による組み換えNDVベクターは、病原体の、特に呼吸器病原体の抗原又はヒトもしくはこれらの動物の何れにおいても適切な免疫反応を誘導し得る免疫調節因子をコードする外来遺伝子を含み得る。
Peetersら(J.Virology 73、5001−5009、1999)、Roemer−Oberdoerferら(J.Gen.Virol.80、2987−2995、1999)により、及びConzelmann、K.K.(前出)による概説において、NDVの遺伝子操作のための逆遺伝学的方法が具体的にNDVについて開示されている。さらに、外来遺伝子の発現のために、例えば、NDVベクターによって感染した動物での免疫反応の誘発のために、ベクターとしてNDVを使用することができることも知られている。(Nakayaら、2001、前出)及び(Swayneら、Avian Dis.47、1047−50、2003)。
上述のMVウイルスについて全般的に概説するように、NDVゲノムの様々な位置に外来遺伝子を有利に導入することができる。特に、本発明による組み換えNDVベクターにおいて、外来遺伝子(適切な転写単位の一部として)を次のNDV遺伝子の間(NP−P、P−M、M−F、F−HN、HN−L)及び3’隣接及び5’遠位遺伝子座に(Zhaoら、2003、前出;Nakayaら、2001、前出)、好ましくは3’隣接、P−M、M−F及びF−HN領域に挿入することができ、F−HN領域が最も好ましい。
本発明の特定の実施形態において、さらなる転写単位がF−HN遺伝子の間に位置する組み換えNDVベクターが提供される。
その他の病原体に対して家禽、特にニワトリにおいて免疫反応を誘導するために、本発明による組み換えNDVベクターを有利に使用することができる。従って、組み換えNDVベクターは、好ましくは、鳥類病原体、特にインフルエンザウイルス、マレック病ウイルス(MDV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、レオウイルス、鳥類レトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)、E.コリ、アイメリア種、クリプトスポリジア、マイコプラズマ、例えばM.ガリナルム(M.gallinarum)、M.シノビエ(M.synoviae)及びM.メレグリディス(M.meleagridis)など、サルモネラ、カンピロバクター、オルニトバクテリウム(ORT)又はパスツレラ種、の防御抗原をコードする外来遺伝子を含む。
より好ましくは、組み換えNDVベクターは、AIV、MDV、ILTV、IBV、TRTV、E.コリ、ORT又はマイコプラズマの抗原をコードする外来遺伝子を含む。
特に、組み換えNDVベクター突然変異体は、インフルエンザウイルス、好ましくは鳥インフルエンザウイルス(AIV)、より好ましくは高病原性AIV、特にH5又はH7AIVの、ヘマグルチニン(HA)遺伝子を含む。
原則として、本発明において、全ての(鳥類)インフルエンザ株のHA遺伝子を使用することができる。当技術分野で多くのHA遺伝子のヌクレオチド配列が開示されており、GenBank又はNCBIデータベースなどの核酸配列データベースから関連するHA遺伝子を回収することができる。
上記で概説されるように、本発明において、最近単離された高病原性H5N2サブタイプAVIA/chicken/Italy/8/98のヘマグルチニン(HA)遺伝子を外来遺伝子として有利に使用することができる。この遺伝子を逆転写し、真核発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)においてクローニングし、配列決定を行う(Luschowら、Vaccine、vol.19、4249−4259頁、2001年及びGenBank受託番号AJ305306)。得られた発現プラスミドpCD−HA5から、NDVゲノム配列におけるHA遺伝子の挿入を可能にする人為的RE認識部位を生成する特異的プライマーを用いた増幅によって、HA遺伝子を得ることができる。
さらなる実施形態において、上記で概説されるように、本発明において、高病原性H7N1サブタイプAIVA/chicken/Italy/445/99のHA遺伝子を外来遺伝子として使用することができる。このHA遺伝子を逆転写しPCRにより増幅する。SmaIで消化したベクターpUC18(Amersham)において1711bp産物をクローニングし、配列決定を行う(Veitsら、J.Gen.Virol.84.3343−3352、2003;及びGenBank受託番号AJ580353)。
本発明による特に有利な組み換えMVウイルスベクターにおいて、MVベクターウイルスは弱毒化されている、つまり、このベクターウイルスは標的動物にとって病原性ではないか、又は野生型ウイルスと比較して毒性が顕著に低下している。ウイルスベクターとして本明細書中で使用される多くのMVウイルスは、麻疹ウイルス及びNDVなどの弱毒化生ワクチンとして長らく安全であった記録があり、一方、SeV及びVSVなどのその他のウイルスはヒトに対して非病原性であると考えられる。さらに、限定的な複製又は感染能を示す弱毒化ウイルスを得てそれに対してスクリーニングを行うために、従来の技術が存在する。このような技術には、異種培養基におけるウイルスの連続的(コールド)継代及び化学的突然変異誘発が含まれる。
本発明による組み換えNDVベクターは、何らかの従来のNDワクチン株由来であり得る。市販のNDワクチンにおいて存在するこのような適切なNDV株の例は:Clone−30(登録商標)、La Sota、Hitchner BI、NDW、C2及びAV4であり;Clone−30(登録商標)は好ましい株である。
本発明による組み換えMVウイルスベクターが動物において防御的免疫反応を誘導できることもまた本発明により見出された。
従って、本発明の別の実施形態において、生又は不活性化型の上記で定義されるような組み換えMVウイルスベクターと、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と、を含む微生物病原体に対するワクチンが提供される。
市販の生及び不活性化MVウイルスワクチンに対して一般に使用されるものなどの従来の方法により、本発明によるワクチンを調製することができる。
簡潔に述べると、組み換えMVウイルスベクターを用いて感受性物質を接種し、所望のタイターにウイルスが複製するまで増殖させ、その後、物質を含有するウイルスを回収する。続いて、免疫付与特性を有する医薬製剤へと回収した物質を処方する。
本発明において、組み換えMVウイルスベクターの複製を支えることができる全ての培養基を使用することができる。培養基として、MVウイルスに依存して、原核及び真核源の両方からの宿主細胞を使用することができる。適切な宿主細胞は脊椎動物、例えば霊長類細胞であり得る。適切な例は;ヒト細胞株HEK、WI−38、MRC−5又はH−239、サル細胞株Vero、げっ歯類細胞株CHO、BHK、イヌ細胞株MDCK又は鳥類CEF又はCEK細胞である。
本発明による組み換えNDVベクターを増殖させることができる特に適切な培養基はSPF孵化卵である。例えば卵あたり少なくとも102.0EID50を含む尿膜腔液を含有する0.2mL NDVを孵化卵に接種することができる。好ましくは、9から11日胚の孵化卵に約105.0EID50を接種し、続いて37℃で2−4日間温置する。2−4日後、好ましくは尿膜腔液を回収することによって、NDウイルス産物を回収することができる。その後、2500gで10分間、この液体を遠心し、続いてフィルター(100μm)に通して上清を濾過することができる。
本発明によるワクチンは、このような組成物に対して慣習的に使用される医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とともに、組み換えMVウイルスベクターを含む。
生ウイルスを含有するワクチンを懸濁液又は乾燥凍結形態で調製し、販売することができる。担体には、安定化剤、保存料及び緩衝剤が含まれる。希釈剤には、水、水性緩衝液及びポリオールが含まれる。
本発明の別の態様において、不活性形態の組み換えMVウイルスベクターを含むワクチンが提供される。不活性化ワクチンの主要な長所は、その安全性及び長期にわたり高レベルの防御抗体を誘導できることである。
増殖段階後に回収されたウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの複製を排除することである。一般に、周知の化学又は物理的手段によってこれを達成することができる。
必要に応じて、本発明によるワクチンは、アジュバントを含有し得る。この目的のためのアジュバント活性のある適切な化合物及び組成物の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えば鉱物油(Bayol F(登録商標)又はMarcol 52(登録商標)など)又は植物油(ビタミンEアセタートなど)に基づく水中油又は油中水乳液及びサポニンである。
本発明によるワクチンの投与は、周知の有効な形態の何れかによるものであり得、MVウイルスベクターのタイプに基づき得る。投与の適切な形式には、非経口、鼻腔内、経口及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
本発明によるNDVベクターワクチンは、好ましくは、NDVワクチン接種に対して一般に使用される安価な大量適用技術により投与される。NDVワクチン接種の場合、これらの技術には、飲用水及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
本発明によるワクチンは、活性成分として組み換えMVウイルスベクターの有効量、即ちワクチン接種された鳥類において毒性微生物による曝露処置に対して免疫を誘導する免疫付与MVウイルス物質の量、を含む。免疫は、本明明細書中で、ワクチン接種していない群と比較した、ワクチン接種後の死亡及び臨床症状に対する、ヒト又は動物集団における顕著に高い防御レベルの誘導として定義される。特に、本発明によるワクチンは、ワクチン接種されたヒト又は動物の大部分において、疾患の臨床症状の発生及び死亡を防ぐ。
通常、102.0−108.0組織培養/胚感染用量(TC/EID50)の用量で、好ましくは、104.0−107.0TC/EID50の範囲の用量で、生ワクチンを投与することができる。不活性化ワクチンは、104.0−109.0の抗原当量(antigenic equivalent)を含有し得る。
本発明はまた、本発明による組み換えMVウイルスベクターに加えてさらなる病原体に対する防御を誘導することができるワクチン株を含む、混合ワクチンも含む。
実施例
非修飾(野生型)H5遺伝子及び修飾H5遺伝子を含むNDVベクターの構築及びタンパク質の発現
サブタイプH5の鳥インフルエンザウイルス(AIV)ヘマグルチニン(HA)を発現するニューキャッスル病ウイルス(NDV)を逆遺伝学によって構築した。NDV融合(F)とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)遺伝子との間の遺伝子間領域において高病原性(HP)AIV単離株A/chicken/Italy/8/98(H5N2、GenBank受託番号AJ305306)のHAをコードするオープンリーディングフレームを挿入するために、弱毒性NDV株Clone30のゲノムのクローニングされた全長コピーを使用した。
サブタイプH5の鳥インフルエンザウイルス(AIV)ヘマグルチニン(HA)を発現するニューキャッスル病ウイルス(NDV)を逆遺伝学によって構築した。NDV融合(F)とヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)遺伝子との間の遺伝子間領域において高病原性(HP)AIV単離株A/chicken/Italy/8/98(H5N2、GenBank受託番号AJ305306)のHAをコードするオープンリーディングフレームを挿入するために、弱毒性NDV株Clone30のゲノムのクローニングされた全長コピーを使用した。
3回の卵継代後、NDVH5組み換え体のタイターは親ウイルスClone30(109TCID50/mL)と同様であり、挿入されたH5遺伝子の存在をRT−PCRにより確認した。外来遺伝子の正しい転写を確認するために、ノーザンブロット分析を行った(図2)。組み換えNDV及びAIV(H5N2)におけるH5 ORFが同一であるにもかかわらず、NDVにクローニングされたH5 ORFは、HN遺伝子の非コード配列由来のおよそ270ヌクレオチドに隣接する。従って、NDVH5とAIV mRNAとの間のサイズの相違はそれぞれ〜2kb及び1.7kb mRNAの予想サイズとよく一致する(図2、中央)。しかし、NDVH5において約1kbの第二の転写産物が現れた(図2、中央、レーン3)。
ノーザンブロット分析により分かるように、組み換えNDVH5mは、2kb H5転写産物(図2、中央、レーン4)の予想サイズのみを生成し、このことから、NDVH5における短い転写産物がHA切断部位で終結し、おそらくHA1領域のみを示すことが確認される。
修飾の結果として、NDVH5mは、NDVH5よりも1.8倍多い全長HA(HA0)を生成する。AIVに感染した細胞における全長HA転写産物は、NDVH5m及びNDVH5よりもそれぞれ3.4倍及び6倍多かった。NDVH5のH5切断部位配列とは異なり(これは、5回の継代以内で変更されている。)、この領域のNDVH5配列は、試験した10回の継代を通じて依然として安定していた(表1)。NDV F及びHNプローブを用いたハイブリッド形成から、親NDV クローン30のF及びHN mRNAとサイズが異ならなかったので、隣接NDV遺伝子の正しい転写が確認された(図2)。さらに、HA ORFの挿入の結果として、HN遺伝子の転写効率の僅かな低下のみが観察された(図2、右)。
NDV組み換え体によるAIV H5の特異的発現を確認するために、感染したCEF細胞を間接的IF試験に供した。NDV特異的抗血清との温置から、NDV Clone30、NDVH5及びNDVH5mに感染した細胞では顕著な蛍光が見られたが、AIV−H5N2に感染した細胞では見られなかった。対して、AIVサブタイプH5−特異的抗血清は、AIV、NDVH5及びNDVH5mに感染した細胞においてH5の特異的発現を示し、一方、親NDVに感染した細胞は陰性であった。AIV感染細胞によるH5発現の強度は両組み換え体の強度よりもかなり高かったが、NDV組み換え体によるH5発現のレベルが顕著であることが分かった。
これと一致して、3倍だけ多いNDVH又はNDVH5 RNA量をRNA−ゲルに供し、同程度のハイブリッド形成シグナルが得られ(図2(中央)で示される。)、このことから、AIVがおよそ3倍多い転写産物を生成し、おそらくずっと多いタンパク質を生成することが示される。興味深いことに、NDVH5m感染細胞によるH5発現は、NDVH5に感染した細胞での発現よりも効率が高いと思われるが、これは、H5の早過ぎる転写終結を無効にするサイレント突然変異に起因し得る。
AIV H5タンパク質をNDV粒子のエンベロープに組み込む。
以前の実験から、非関連ウイルスのエンベロープへの外来タンパク質の組み込みが特異的組み込みシグナルの非存在下で受動的に起こり得ることが示された(Kretzschmar、E.ら、1997、J.of Virology、vol.71、5982−5989頁)。このような受動的組み込みの効率はタンパク質の発現レベルに主に依存するので、発明者らは、組み換えウイルスにより発現されるHAタンパク質が正しく切断され、またNDV組み換え体のエンベロープに組み込まれたか否かも調べた(図3)。両組み換え体により感染した細胞において、AIVサブタイプH5−特異的抗血清により、未切断HA0及び切断HA1及びHA2タンパク質をおそらく示すと思われるおよそ70、50及び25kDaの3種類のタンパク質が検出された(図3A)。このことから、組み換え体により発現されるHAがタンパク質分解酵素に接近可能であることが分かった。NDVH5ウイルスに感染した細胞において産生されるトータルHAタンパク質は、NDVH5mよりも顕著に少なく、NDVH5感染細胞におけるHA2タンパク質は辛うじて見ることができる。予想されるように、NDV Clone30感染細胞では反応は検出できず、一方、AIV−H5N2感染細胞では全ての対応するHAタンパク質種が検出された。AI特異的血清がウイルス全体に対して生成されたが、NP/NA及びMにおそらく対応すると思われるその他のタンパク質種もAIV感染細胞において検出された(図3)。興味深いことに、精製ビリオンのウエスタンブロット分析から、両組み換え体のエンベロープにHAタンパク質が効率的に組み込まれたことが示された(図3B)。より多くのNDVH5ウイルスタンパク質をウエスタンブロット分析に供したが、NDVH5に組み込まれたHA2タンパク質の量は依然としてNDVH5mビリオンのHA2よりもかなり低かった。このことから、NDVH5が産生し組み込むHA2タンパク質は非常に少ないことが示されるが、これはおそらく、切断部位での早過ぎる終結の結果として利用可能なタンパク質がより少ないことによると思われる。
AIV HAタンパク質を担う組み換えNDVはニワトリにおいて安全である。
あるNDV単離株の病原性の程度を測定する高感度である方法の1つは、脳内接種後1日齢ニワトリに対するウイルスの病原性を評価することによる(CEC(1992)Official Journal of the European Community L 260、1−20)。最も毒性の高いウイルスは、2.0の最大スコアに達する指数を与え、一方、弱毒株は、0.0に近い値を与える。AIVのヘマグルチニンは重要な毒性決定因子なので、HPAIウイルスのH5の発現がNDV毒性を変化させるか否かを評価するために、NDVH5及びNDVH5mに対する脳内病原性指数(ICPI)を決定した。両組み換え体に対して、ICPI値は、2の可能な最大スコアのうち0.0であったが、このことから、それ自身のタンパク質に加えて、AIV H5の発現はNDV毒性への著しい影響はなかった。ちなみに、可能な生ウイルスワクチンの使用のためには弱毒株NDVワクチン株のICPIは0.5以下でなければならない。
AIV HAタンパク質を発現する組み換えNDVは、NDV及びAIV曝露処置からニワトリを保護する。
NDVH5mによりH5タンパク質をより多く発現させるために、動物実験においてこの組み換え体のみを試験した。従って、動物あたり106EID50の用量で眼鼻経路により25羽の3週齢ニワトリに組み換えNDVH5を投与した。観察期間の間、全動物は何ら有害反応又は疾患の臨床徴候なく健康なままであった。HI試験により決定されるように、AIV H5−特異的抗体は、血清の28%で第14日に最初に検出可能であり、ワクチン接種後、21日で92%に上昇した(図4A)。しかし、間接的IF試験を用い、免疫付与後7日で、血清の96%において、AIに対してより早く免疫が出現することが検出された。
単回ワクチン接種の防御効果を調べるために、対照動物の適切な数とともに5及び10羽のワクチン接種動物の群をそれぞれNDV及びAIVに対する致死性曝露処置の最初の試験に供した。予想に違わず、ワクチン接種動物の100%が致死性の強毒性NDV曝露感染から保護され、一方、典型的なNDの徴候を示した全対象動物が4日以内に死亡した(図4B)。高病原性AIV−H5N2曝露感染により、非免疫付与ニワトリにおいて重症疾患が引き起こされ、死亡率は100%であった。一方、NDVH5m免疫付与群の動物は全て高病原性AIVの致死用量で生存した。10羽のニワトリのうち7羽は完全に健康なままであり、一方、3羽の動物が非常に軽度の呼吸器症状を呈した。しかし、0.05という得られた臨床スコアは、対照群に対する2.61の臨床スコアと比較して無視できるものであった(図4C)。AIからのニワトリの保護における追加免疫ワクチン接種の効果を調べるために、最初のワクチン接種から42日後に、残る10羽のニワトリに2回目の免疫付与を行い、それから2週間後、曝露処置を行った。同種HPAIウイルスの致死用量後、全動物において臨床疾患が完全に防御され、一方、全対照動物で重症疾患が発現し、4日以内に死亡し、その結果、臨床スコアは2.66となった(図4D)。
NDV−AIワクチンによりAIV出芽が減少する。
AIワクチンが成功するためには、ワクチンは、安全であり疾患を予防するのに有効である他に、ウイルス出芽の阻止に効果的であるべきである。ウイルス出芽の量を調べるために、曝露処置後様々な時間において、気管及び排泄スワブを定量的リアルタイムRT−PCRに供した。曝露処置から2日後、両対照群の免疫付与されていないが曝露処置が行われたニワトリ全てにおいて、ウイルスRNAが検出された。最初及び2回目のAIV曝露処置の対照ニワトリのスワブの閾値サイクル(threshold cycle、Ct)値は、それぞれ32.2から38.1及び29.2から35.5の範囲であった。曝露処置から4日以内に全対照動物が死亡したので、この群においてさらなる試験を行うことができなかった。一方、免疫付与動物の殆どにおいてvRNAは検出されなかった(60検体のスワブ中49検体)。
NP−ELISAにより循環AIVが検出される:
家禽の通常のワクチン接種での最大の懸念の1つは、ワクチン接種によって鳥間でウイルスが検出されずに循環することができるようになり得ることである。組み換えNDVワクチンは、HA遺伝子のみを含有するので、曝露処置前及び曝露処置後の様々な時間にワクチン接種動物から回収された血清を分析するために、非常に免疫原性の高い核タンパク質遺伝子に基づくELISAを使用した。曝露感染前に全動物の血清中でAIV NPに対する抗体がなかった一方、NPセロコンバーションがAIV曝露処置から7日及び21日後にそれぞれニワトリの90%及び100%で検出することができた(図5)。このことから、NPに基づくELISA試験によって、ワクチン接種動物と感染動物との区別が可能になるだけでなく、ワクチン接種したトリ間の何らかの循環ウイルスの検出も容易になり得ることが分かる。
家禽の通常のワクチン接種での最大の懸念の1つは、ワクチン接種によって鳥間でウイルスが検出されずに循環することができるようになり得ることである。組み換えNDVワクチンは、HA遺伝子のみを含有するので、曝露処置前及び曝露処置後の様々な時間にワクチン接種動物から回収された血清を分析するために、非常に免疫原性の高い核タンパク質遺伝子に基づくELISAを使用した。曝露感染前に全動物の血清中でAIV NPに対する抗体がなかった一方、NPセロコンバーションがAIV曝露処置から7日及び21日後にそれぞれニワトリの90%及び100%で検出することができた(図5)。このことから、NPに基づくELISA試験によって、ワクチン接種動物と感染動物との区別が可能になるだけでなく、ワクチン接種したトリ間の何らかの循環ウイルスの検出も容易になり得ることが分かる。
実施例1から6に対する材料及び方法
ウイルス及び細胞:
Clone−30のワクチン株に基づく組み換えNDVが既に記載されている(Roemer−Oberdoerfer、A.、Mundt、E.、Mebatsion、T.、Buchholz、U.J. & Mettenleiter、T.C.(1999)、J.Gen.Virol.80(Pt11)、2987−2995)。インフルエンザウイルス単離株A/chicken/Italy/8/98(H5N2)は、I.Capuaの好意により提供された。強毒性NDV株Herts33/56及びNDV Clone30ワクチン(Nobilis(登録商標))は、Intervet Int.BV、Boxmeer、The Netherlandsから得た。特定病原体不含(SPF)の10日胚齢孵化ニワトリ卵でウイルスを増殖させた。cDNAから感染性NDVを回収するために、ファージT7 RNAポリメラーゼを安定的に発現するBSR−T7/5細胞(Buchholz、U.J.、Finke、S. & Conzelmann、K.K.(1999)J.Virol.73、251−259)を使用した。タンパク質発現及びウイルス複製を調べるために、初代ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)、初代ニワトリ胚腎臓(CEK)細胞又はウズラ筋肉細胞(QM9−R)を使用した。
ウイルス及び細胞:
Clone−30のワクチン株に基づく組み換えNDVが既に記載されている(Roemer−Oberdoerfer、A.、Mundt、E.、Mebatsion、T.、Buchholz、U.J. & Mettenleiter、T.C.(1999)、J.Gen.Virol.80(Pt11)、2987−2995)。インフルエンザウイルス単離株A/chicken/Italy/8/98(H5N2)は、I.Capuaの好意により提供された。強毒性NDV株Herts33/56及びNDV Clone30ワクチン(Nobilis(登録商標))は、Intervet Int.BV、Boxmeer、The Netherlandsから得た。特定病原体不含(SPF)の10日胚齢孵化ニワトリ卵でウイルスを増殖させた。cDNAから感染性NDVを回収するために、ファージT7 RNAポリメラーゼを安定的に発現するBSR−T7/5細胞(Buchholz、U.J.、Finke、S. & Conzelmann、K.K.(1999)J.Virol.73、251−259)を使用した。タンパク質発現及びウイルス複製を調べるために、初代ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)、初代ニワトリ胚腎臓(CEK)細胞又はウズラ筋肉細胞(QM9−R)を使用した。
AIV H5遺伝子を発現する組み換えウイルスの構築:
AIV H5遺伝子を導入するために、Clone30の全長アンチゲノムRNAを発現するプラスミドpflNDV−1(Roemer−Oberdoerfer、A.、Mundt、E.、Mebatsion、T.、Buchholz、U.J. & Mettenleiter、T.C.(1999)J.Gen.Virol.80(Pt11)、2987−2995)を使用した。最初に、Clone30ゲノムのNotI/BsiWI断片(nt4953−8852)をpUC18プラスミドにクローニングした(段階A、図1)。次に、プライマーMP1(5’−gacaacagtcctcaaccatggaccgcgccg−3’、配列番号1)及びMP2(5’−ctggctagttgagtcaattcttaaggagttggaaagatggc−3’、配列番号2)を用いて、新しく生成したNcoI及びAfIII部位を導入した(段階B)。NcoI又はAfIIIで消化後、Clone30のHN ORFを置換するために、人為的NcoI又はAfIII制限部位を含有する特異的プライマー(PH5F2:5’−ccttccatggagaaaatagtgcttc−3’、配列番号3及びPH5R2:5’−cctccttaagtataattgactcaattaaatgcaaattctgcactgcaatgatcc−3’、配列番号4)によりプラスミドpCD−HA5から増幅されたAIV H5オープンリーディングフレーム(ORF)(Luschow、D.、Werner、O.、Mettenleiter、T.C. & Fuchs、W.(2001)Vaccine 19、4249−4259)を使用した(段階C)。さらに、プライマーMP3(5’−caaaacagctcatggtacgtaatacgggtaggacatgg−3’、配列番号5)及びMP4(5’−gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg−3’、配列番号6)を用いて、L遺伝子の前の遺伝子間領域に新しいSgfI−及びSnaBI−部位を導入した(段階C)。H5ORFの後にHN遺伝子をクローニングするために、プライマーMP3及びMP5(5’−gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg−3’、配列番号7)を用いて、HN遺伝子(段階D)に隣接する同様の部位を生成させた(段階E)。図1の段階Fで示されるように、プライマーMPH5F2(5’−ggaatgtccctcaaagaaggaggaagaagagaggactatttggggc−3’、配列番号8)を用いて、サイレント突然変異によって、NDVの転写終結配列に類似しているH5切断配列を修飾した。最後に、全長クローンNDVH又はNDVHmそれぞれを生成させるために段階E又はFから得られた同様の断片によって、pflNDV−1のNotI/BsiWI断片を置換した(図1)。得られたクローンの長さ(17196ヌクレオチド)は6で割ることができ、これにより「6の法則(rule of six)」が満たされる。Quik Change II XL部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いて本明細書中に記載の全ての突然変異誘発反応を行った。
AIV H5遺伝子を導入するために、Clone30の全長アンチゲノムRNAを発現するプラスミドpflNDV−1(Roemer−Oberdoerfer、A.、Mundt、E.、Mebatsion、T.、Buchholz、U.J. & Mettenleiter、T.C.(1999)J.Gen.Virol.80(Pt11)、2987−2995)を使用した。最初に、Clone30ゲノムのNotI/BsiWI断片(nt4953−8852)をpUC18プラスミドにクローニングした(段階A、図1)。次に、プライマーMP1(5’−gacaacagtcctcaaccatggaccgcgccg−3’、配列番号1)及びMP2(5’−ctggctagttgagtcaattcttaaggagttggaaagatggc−3’、配列番号2)を用いて、新しく生成したNcoI及びAfIII部位を導入した(段階B)。NcoI又はAfIIIで消化後、Clone30のHN ORFを置換するために、人為的NcoI又はAfIII制限部位を含有する特異的プライマー(PH5F2:5’−ccttccatggagaaaatagtgcttc−3’、配列番号3及びPH5R2:5’−cctccttaagtataattgactcaattaaatgcaaattctgcactgcaatgatcc−3’、配列番号4)によりプラスミドpCD−HA5から増幅されたAIV H5オープンリーディングフレーム(ORF)(Luschow、D.、Werner、O.、Mettenleiter、T.C. & Fuchs、W.(2001)Vaccine 19、4249−4259)を使用した(段階C)。さらに、プライマーMP3(5’−caaaacagctcatggtacgtaatacgggtaggacatgg−3’、配列番号5)及びMP4(5’−gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg−3’、配列番号6)を用いて、L遺伝子の前の遺伝子間領域に新しいSgfI−及びSnaBI−部位を導入した(段階C)。H5ORFの後にHN遺伝子をクローニングするために、プライマーMP3及びMP5(5’−gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg−3’、配列番号7)を用いて、HN遺伝子(段階D)に隣接する同様の部位を生成させた(段階E)。図1の段階Fで示されるように、プライマーMPH5F2(5’−ggaatgtccctcaaagaaggaggaagaagagaggactatttggggc−3’、配列番号8)を用いて、サイレント突然変異によって、NDVの転写終結配列に類似しているH5切断配列を修飾した。最後に、全長クローンNDVH又はNDVHmそれぞれを生成させるために段階E又はFから得られた同様の断片によって、pflNDV−1のNotI/BsiWI断片を置換した(図1)。得られたクローンの長さ(17196ヌクレオチド)は6で割ることができ、これにより「6の法則(rule of six)」が満たされる。Quik Change II XL部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いて本明細書中に記載の全ての突然変異誘発反応を行った。
遺伝子移入及びウイルス回収:
AIのH5を発現する組み換えNDVを回収するために、1:1.5のDNA:リポフェクタミン2000の比率でリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて、NP、P及びLタンパク質を発現するプラスミドとともに全長クローンをBSR−T7細胞に遺伝子移入した。ウイルス増殖及び感染性ウイルスの回収の確認は、基本的に既に記載されているように行った(Roemer−Oberdoerfer、1999、前出;Engel−Herbert、I.、Werner、O.、Teifke、J.P.、Mebatsion、T.、Mettenleiter、T.C. & Roemer−Oberdoerfer、A.(2003)J.Virol.Methods 108、19−28)。
AIのH5を発現する組み換えNDVを回収するために、1:1.5のDNA:リポフェクタミン2000の比率でリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて、NP、P及びLタンパク質を発現するプラスミドとともに全長クローンをBSR−T7細胞に遺伝子移入した。ウイルス増殖及び感染性ウイルスの回収の確認は、基本的に既に記載されているように行った(Roemer−Oberdoerfer、1999、前出;Engel−Herbert、I.、Werner、O.、Teifke、J.P.、Mebatsion、T.、Mettenleiter、T.C. & Roemer−Oberdoerfer、A.(2003)J.Virol.Methods 108、19−28)。
ノーザンブロット分析:
細胞あたり10の感染多重度(MOI)で、NDV Clone30、NDVH5、NDVH5m又はAIV−H5N2でCEK細胞を感染させ、37℃で8時間温置した。感染及び非感染細胞のトータルRNAを調製し(Chomczynski、P. & Sacchi、N.(1987)Analytical Biochemistry 162、156−159)、変性アガロースゲルで分離し、他で記載されるように、放射性標識cRNAとハイブリッド形成させた(Fuchs、W. & Mettenleiter、T.C.(1996)J.Gen.Virol.77(Pt9)、2221−2229)。32P−標識cRNA(SP6/T7転写キット、Roche)のインビトロ転写のために、AIV−H5N2ヘマグルチニン、NDV Clone30F及びHNのオープンリーディングフレームを含有するプラスミドを使用した。
細胞あたり10の感染多重度(MOI)で、NDV Clone30、NDVH5、NDVH5m又はAIV−H5N2でCEK細胞を感染させ、37℃で8時間温置した。感染及び非感染細胞のトータルRNAを調製し(Chomczynski、P. & Sacchi、N.(1987)Analytical Biochemistry 162、156−159)、変性アガロースゲルで分離し、他で記載されるように、放射性標識cRNAとハイブリッド形成させた(Fuchs、W. & Mettenleiter、T.C.(1996)J.Gen.Virol.77(Pt9)、2221−2229)。32P−標識cRNA(SP6/T7転写キット、Roche)のインビトロ転写のために、AIV−H5N2ヘマグルチニン、NDV Clone30F及びHNのオープンリーディングフレームを含有するプラスミドを使用した。
ウエスタンブロット分析:
5のMOIで、NDV Clone30、NDVH5、NDVH5m又はAIV−H5N2でCEK細胞を感染させ、37℃で30時間温置した。感染細胞又は連続スクロース勾配(30−60%)で精製したビリオンの溶解液をSDS−PAGEで分離し、ニトロセルロースフィルター(Trans−Blot SD cell、Bio−Rad)に転写した。NDVに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプH5のAIVに対するポリクローナルニワトリ抗血清とともにブロットを温置した(Intervet Int.BV、Boxmeer、NL)。X線フィルム(Hyperfilm MP、Amersham)上でSuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)を用いた化学発光により、ペルオキシダーゼ結合の種特異的二次抗体(Dianova)の結合を検出した。
5のMOIで、NDV Clone30、NDVH5、NDVH5m又はAIV−H5N2でCEK細胞を感染させ、37℃で30時間温置した。感染細胞又は連続スクロース勾配(30−60%)で精製したビリオンの溶解液をSDS−PAGEで分離し、ニトロセルロースフィルター(Trans−Blot SD cell、Bio−Rad)に転写した。NDVに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプH5のAIVに対するポリクローナルニワトリ抗血清とともにブロットを温置した(Intervet Int.BV、Boxmeer、NL)。X線フィルム(Hyperfilm MP、Amersham)上でSuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)を用いた化学発光により、ペルオキシダーゼ結合の種特異的二次抗体(Dianova)の結合を検出した。
動物実験:
European Community Council Directive(CEC(1992)Official Journal of the European Community L 260、1−20)に記載のように、1日齢ニワトリにおいて脳内病原性指数(ICPI)を決定することにより、NDV組み換え体の安全性を評価した。NDVH5mの106EID50を25羽の3週齢SPFニワトリに眼鼻投与することによって、ワクチン接種実験を行った。単回ワクチン接種後の組み換え体の防御能を評価するために、5羽のさらなる対照とともにワクチン接種動物5羽に対して、NDV株Herts33/56の105.3ELD50でワクチン接種から3週間後に筋肉内投与により曝露処置を行った。同様に、9羽のさらなる対照動物とともに10羽のワクチン接種動物に対して、高病原性AIV−H5N2の107.7EID50で眼鼻投与により曝露処置を行った。最初のワクチン接種から6週間後、残った10羽のニワトリに2回目の免疫付与を行い、それから2週間後、5羽のさらなる対照動物とともに同様のAI曝露処置に供した。免疫付与及び曝露感染後、臨床徴候に関して、10日間、全ての鳥を毎日観察した。
European Community Council Directive(CEC(1992)Official Journal of the European Community L 260、1−20)に記載のように、1日齢ニワトリにおいて脳内病原性指数(ICPI)を決定することにより、NDV組み換え体の安全性を評価した。NDVH5mの106EID50を25羽の3週齢SPFニワトリに眼鼻投与することによって、ワクチン接種実験を行った。単回ワクチン接種後の組み換え体の防御能を評価するために、5羽のさらなる対照とともにワクチン接種動物5羽に対して、NDV株Herts33/56の105.3ELD50でワクチン接種から3週間後に筋肉内投与により曝露処置を行った。同様に、9羽のさらなる対照動物とともに10羽のワクチン接種動物に対して、高病原性AIV−H5N2の107.7EID50で眼鼻投与により曝露処置を行った。最初のワクチン接種から6週間後、残った10羽のニワトリに2回目の免疫付与を行い、それから2週間後、5羽のさらなる対照動物とともに同様のAI曝露処置に供した。免疫付与及び曝露感染後、臨床徴候に関して、10日間、全ての鳥を毎日観察した。
リアルタイムRT−PCRによるウイルス出芽分析:
曝露処置から2、4、8及び14日後に、リアルタイムRT−PCRによってAIV出芽を分析するために、気管及び排泄スワブを回収した。定量的リアルタイムRT−PCRに供した。Nucleo Spinキット(Macherey−Nagel)を用いたTecan−Automat又はウイルスRNAキット(Qiagen)を用いた手動での方法の何れかによって、気管又は排泄スワブからRNAを調製した。曝露感染後のAIV出芽の検出のために、M遺伝子の増幅に基づくインフルエンザAウイルスリアルタイムRT−PCR法を使用した(18)。RT−PCR中のRNA抽出物及び阻害因子を異種内部調節系により調べた(19)。ワンステップRT−PCRキットの1つ(Platinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いたSuperscripTMIII One Step RT−PCRシステム)を用い、MX3000p(Stratagene)サイクラーで二重アッセイを行った。温度プロファイルは50℃で30分、94℃で2分、次いで94℃で30秒、57℃で30秒、68℃で30秒を42サイクルであった。
曝露処置から2、4、8及び14日後に、リアルタイムRT−PCRによってAIV出芽を分析するために、気管及び排泄スワブを回収した。定量的リアルタイムRT−PCRに供した。Nucleo Spinキット(Macherey−Nagel)を用いたTecan−Automat又はウイルスRNAキット(Qiagen)を用いた手動での方法の何れかによって、気管又は排泄スワブからRNAを調製した。曝露感染後のAIV出芽の検出のために、M遺伝子の増幅に基づくインフルエンザAウイルスリアルタイムRT−PCR法を使用した(18)。RT−PCR中のRNA抽出物及び阻害因子を異種内部調節系により調べた(19)。ワンステップRT−PCRキットの1つ(Platinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いたSuperscripTMIII One Step RT−PCRシステム)を用い、MX3000p(Stratagene)サイクラーで二重アッセイを行った。温度プロファイルは50℃で30分、94℃で2分、次いで94℃で30秒、57℃で30秒、68℃で30秒を42サイクルであった。
HI及びNP−ELISA
NDV及びAIV H5抗体の有無を調べるために、第0、7、14及び21日に血液試料を回収し、European Community Council Directive(CEC(1992)Official Journal of the European Community L 260、1−20;CEC(1992)Official Journal of the European Communities L 167、1−1620、21)に記載のように、ヘマグルチニン阻害(HI)試験に供した。免疫付与後のAIV−H5抗体の有無を評価するために、AIV感染CEFとともに血清の1:100希釈液を温置することによって、間接的免疫蛍光(IF)に対して血清をさらに使用した。核タンパク質(NP−ELISA)に基づく間接的酵素免疫測定アッセイ(ELISA)によって、AIV核タンパク質(NP)に対する抗体を調べた。この目的のために、AIV NP遺伝子の完全なコード領域を包含する精製組み換えバキュロウイルス由来グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−NP融合タンパク質を抗原として使用した。0.05%Tween20を含有するPBS中で1:300希釈した血清を2回測定して調べた。o−フェニレンジアミンを用いて呈色反応により二次POD−結合ヤギ−α−ニワトリIgG(H+L)(ROCKLAND)抗体の結合を検出し、吸収を492nmで測定した。
NDV及びAIV H5抗体の有無を調べるために、第0、7、14及び21日に血液試料を回収し、European Community Council Directive(CEC(1992)Official Journal of the European Community L 260、1−20;CEC(1992)Official Journal of the European Communities L 167、1−1620、21)に記載のように、ヘマグルチニン阻害(HI)試験に供した。免疫付与後のAIV−H5抗体の有無を評価するために、AIV感染CEFとともに血清の1:100希釈液を温置することによって、間接的免疫蛍光(IF)に対して血清をさらに使用した。核タンパク質(NP−ELISA)に基づく間接的酵素免疫測定アッセイ(ELISA)によって、AIV核タンパク質(NP)に対する抗体を調べた。この目的のために、AIV NP遺伝子の完全なコード領域を包含する精製組み換えバキュロウイルス由来グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−NP融合タンパク質を抗原として使用した。0.05%Tween20を含有するPBS中で1:300希釈した血清を2回測定して調べた。o−フェニレンジアミンを用いて呈色反応により二次POD−結合ヤギ−α−ニワトリIgG(H+L)(ROCKLAND)抗体の結合を検出し、吸収を492nmで測定した。
修飾されたH7遺伝子を含むNDVベクターの構築:
上述のものと基本的に同様の実験において、修飾されたH7遺伝子を担うNDVベクターコンストラクトを構築した。挿入物は、HP H7N1AIV単離株:A/chicken/Italy/445/99(その配列は、受託番号AJ580353のもと、GenBankで公開されている:Veits、J.ら、2003(J.of Gen.Virol.、vol.84、3343頁)も参照のこと。)由来であった。NDVベクターのFとHN遺伝子との間にH7遺伝子を挿入し、H7遺伝子をHN遺伝子からの非コード配列に隣接させた。
上述のものと基本的に同様の実験において、修飾されたH7遺伝子を担うNDVベクターコンストラクトを構築した。挿入物は、HP H7N1AIV単離株:A/chicken/Italy/445/99(その配列は、受託番号AJ580353のもと、GenBankで公開されている:Veits、J.ら、2003(J.of Gen.Virol.、vol.84、3343頁)も参照のこと。)由来であった。NDVベクターのFとHN遺伝子との間にH7遺伝子を挿入し、H7遺伝子をHN遺伝子からの非コード配列に隣接させた。
潜在的遺伝子末端配列は、H7 HA遺伝子の切断部位領域の後に存在する。アミノ酸IEKTをコードするヌクレオチド195−1206のオリジナル配列:ata gaa aaa actをata gag aag act(依然としてIEKTをコードする。)に突然変異させた。
この結果、非修飾H7遺伝子の発現と比較して、NDVベクターを介した、修飾されたH7配列の安定した発現及び提示が向上した。
Claims (13)
- 上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結(GE)配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを作製する方法であり、外来遺伝子配列は、少なくとも3個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、該一続きはアルギニン(Arg)及び/又はリジン(Lys)残基からなり、並びに少なくとも1個のリジンを含有するタンパク質をコードし、外来遺伝子のヌクレオチド配列は、遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しないように選択されることを特徴とする、方法。
- 修飾された外来遺伝子配列を作製するために、少なくとも3個の塩基性アミノ酸の前記一続きをコードする野生型外来遺伝子配列の一部が、遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る何れの配列も除去するための部位特異的突然変異誘発により修飾されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 野生型外来遺伝子配列に元来存在するt/aGAAAA配列内で、少なくとも1つの突然変異が導入されており、それによりアデニンストレッチ(adenine stretch)の「A」が別のヌクレオチドにより置換されることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 突然変異がサイレントであることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 少なくとも1つのaaaコドンがaagコドンにより置換されることを特徴とする、請求項3から4に記載の方法。
- 少なくとも2つの点突然変異が行われることを特徴とする、請求項3から5に記載の方法。
- 少なくとも2つのaaaコドンがaagコドンにより置換されることを特徴とする、請求項3から6に記載の方法。
- コード配列aga aga aaa aaaがコード配列agg agg aag aagにより置換されることを特徴とする、請求項3から7に記載の方法。
- モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルス(NDV)ベクターであり、並びに外来遺伝子が病原性H5鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項1から8に記載の方法。
- 上流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流モノネガウイルス目ウイルス遺伝子終結(GE)配列と操作可能に連結された外来遺伝子を含むさらなる転写単位を有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、外来遺伝子が、少なくとも3個の塩基性アミノ酸の一続きを含有し、該一続きはアルギニン(Arg)及び/又はリジン(Lys)残基からなり、並びに少なくとも1個のリジンを含有するタンパク質をコードし、外来遺伝子が遺伝子終結(GE)配列としてモノネガウイルス目ウイルスのウイルスポリメラーゼにより認識され得る配列を含有しないことを特徴とする、組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
- 外来遺伝子が病原性鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)タンパク質をコードし、塩基性アミノ酸の一続きが少なくとも2個のリジンアミノ酸を連続して含有し、並びにこれらのリジンの少なくとも1個がコドンaagによりコードされることを特徴とする、請求項10に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
- 塩基性アミノ酸の一続きが、ヌクレオチド配列aggaagaagによりコードされるアミノ酸配列Arg Lys Lysを含有することを特徴とする、請求項10から11に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
- 請求項10から12の何れかに記載の組み換えMVウイルスベクター及び医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む病原性微生物に対するワクチン。
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