JP2015523065A - 組換えマイナス鎖rnaウイルスベクターを使用する異種タンパク質発現方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、複製−欠損しているが、転写−コンピテントである、組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターを使用する、細胞において少なくとも1種の異種核酸配列を発現する方法に関する。特に本発明は、より少なく分化した状態に細胞を再プログラミングする方法、並びに該組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターを使用する、インビボ及びインビトロにおける遺伝子治療の方法に関する。加えて本発明は、該インビトロ法により調製された細胞又は細胞集団、及びこの調製された細胞又は細胞集団の医薬品としての使用に関する。
組換えウイルスベクターは、安定したトランスジェニック発現を媒介する哺乳動物細胞への外来遺伝子の導入に利用可能ないくつかの公知の物質の中のひとつである。レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスを含む様々なウイルスが、この目的のために使用されている。これらの組換えウイルスは、ウイルスワクチンの製造における使用又は遺伝子欠損症の治療のための遺伝子治療ベクターとしての使用が特に知られている。組換えウイルスの他の適用は、レトロウイルス又はレンチウイルスが媒介した形質導入、及び特定の細胞の再分化因子又は再プログラミング因子の発現による、誘導万能幹(iPS)細胞としても公知の万能細胞の脱分化を含む。
先行技術を考慮し、本発明の目的は、改善された安全性プロファイルを示し、且つ十分に長い期間にわたり異種核酸配列を効率的に発現することが可能である、新規ウイルスベクターを提供することである。特に本発明は、様々な疾患の遺伝子治療アプローチとして、標的細胞において治療的タンパク質をコードしている遺伝子を送達し且つ発現する新規方法を提供することを目的としている。更に本発明は、少なくとも部分的に分化した細胞を再生医療における使用に適しているより少なく分化した細胞へ再プログラミングするため、又は所望の分化状態を選ぶように細胞をプログラミングするために、細胞の再プログラミング因子又はプログラミング因子をコードしている遺伝子を送達し且つ発現することを目的としている。
第一の態様において、本発明は、少なくとも1種の異種核酸配列を細胞において発現する方法に関する。この方法は、インビトロ法又はインビボ法であり、且つ該細胞を、該少なくとも1種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターで感染することにより、少なくとも1種の異種核酸配列を細胞へ導入する工程を含み、ここで組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたPタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに、ここで該少なくとも1種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質をコードしている。
本発明は、細胞再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は細胞における治療的タンパク質をコードしている異種核酸配列(本明細書において「導入遺伝子」と称されることもある)を発現する方法を提供する。本方法は、特異的組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターの使用を基にしている。この組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターは、少なくとも1種の異種核酸配列を保有するように設計され、且つ関心対象の異種タンパク質の効率的生成を可能にする程度まで依然転写−コンピテントである一方で、その複製を欠損していることにより特徴付けられる。
(a)ドナー由来の少なくとも部分的に分化した細胞又はプログラミングされるべき細胞を提供する工程、
(b)少なくとも1種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも1種の異種核酸配列を、工程(a)において提供される細胞へ導入する工程、並びに
(c)感染された細胞を、該少なくとも1種の異種核酸配列を発現するのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスゲノムの複製能の喪失につながる、変異されたPタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに該異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子又はプログラミング因子をコードしている。
(a)ドナーから細胞を提供する工程、
(b)少なくとも1種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも1種の異種核酸配列を、工程(a)において提供された細胞へ導入する工程、並びに
(c)感染された細胞を、該少なくとも1種の異種核酸配列を発現する及び/又は該細胞を増殖させるのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターは、ウイルス転写能を喪失することなくウイルスゲノム複製能を喪失することにつながる、変異されたPタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、且つここで該異種核酸配列は、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている。
以下は、本発明の方法の使用は、組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターを使用し、安全且つ信頼できる様式で、効率的且つ長期の導入遺伝子発現を可能にすることを示している。本発明に関連したこれらの予想外の利点の多い特徴は、医学的状態の治療において有用であるとはこれまで考えられなかったこれらのウイルスベクター型の新たな適用分野を開拓した。
Vero細胞を、N−末端アミノ酸2から77を欠いている切断型Pタンパク質に加え遺伝子発現の全体のマーカーとしてのグリーン蛍光タンパク質(GFP)をコードしている変異されたP遺伝子を含むウイルスゲノムを有する組換えセンダイウイルス(SeV)(SeV−PΔ2−77/GFP)により、感染多重度(MOI)1で、感染した。蛍光顕微鏡及び光学顕微鏡の写真を、1、6、12及び30日目に、倍率100×で撮影した(露光(exposition)時間2秒)。
導入遺伝子としてそのウイルスゲノムに含まれた転写因子「Oct4」を有する組換え複製−欠損センダイウイルス(SeV−PΔ2−77/Oct4)又は導入遺伝子としてそのウイルスゲノムに含まれた転写因子「Nanog」を有する組換え複製−欠損センダイウイルス(SeV−PΔ2−77/Nanog)を使用し、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)を、MOI 3又は20で感染した。2、5、8、及び12日目に、総細胞RNAを、トリアゾール(Invitrogen社)を用い抽出し、且つリアルタイムRT−PCRを行った。このcDNA合成工程は、mRNAのみの増幅を可能にするオリゴ−(dT)12−18プライマー(酵素「superscript II」;Invitrogen社)を用いて行った。
ウイルスベクターSeV−PΔ2−77を使用し、長期遺伝子発現を更に増強する試みにおいて、P遺伝子内の遺伝子修飾を研究した。より詳細には、センダイP遺伝子は、Pタンパク質のみではなく、「Cタンパク質」として公知のいくつかの他の非構造タンパク質をコードしている。これらのタンパク質は、代替リーディングフレーム(Pタンパク質に対し−1位置)から翻訳されるか、又は翻訳の代替開始コドン(ACGの代わりにAUG(ATG))の使用から生じる。この代替開始コドンの使用は、Pタンパク質の低下した遺伝子発現率(野生型と比べ約10〜20%の減少)をもたらすと考えられる。文献において、Cタンパク質は、宿主ウイルス相互作用における調節因子として、主にインターフェロン反応アンタゴニストとして作用すると説明される。
P遺伝子内のアミノ酸2−77に欠失を持っている複製−欠損センダイベクターに関する最適作製システムを評価するために、比較試験を実行した。より詳細には、3種の異なる設定を比較した:
(1)追加の導入遺伝子としてP遺伝子のみを伴う産生細胞株。他のウイルス成分(タンパク質)は全て該ベクターのゲノム内のそれらの野生型起源において依然コードされているので、これは、高レベル量のベクターを作製するのに十分なはずである。
(2)センダイウイルスP遺伝子及びN遺伝子の安定した組込みを伴う産生細胞株。この組合せは、該ベクターの作製時に、これらのウイルスタンパク質の不均衡を生じると予想された。通常Nタンパク質及びPタンパク質は、宿主細胞において、おおまかに同等なレベルで生成される(Homannら、Virology、177:131−140(1990)、及びTokusumiら、Virus Research、86:33−38(2002)参照)。この比は、最適なウイルス成長に関して重要であると見なされる。しかしこの設定において、非常に過剰なウイルスのNタンパク質を生成することが予想され、Nタンパク質は、RNA分子に結合するその固有の活性のために、細胞傷害性であることがわかっているので、これはより低い作製効率を生じるはずである。
(3)センダイウイルスP遺伝子及びN遺伝子及びL遺伝子の安定した組込みを伴う産生細胞株。この組合せは、ヌクレオカプシドの全てのウイルスのタンパク質成分を反映している。従ってこれは、ウイルス作製に対し支援的影響を有するであろう。しかし設定(2)について既に言及したように、同じく、ウイルス成分N及びLの不均衡を生じることがあり、これらは既に、ウイルスのゲノム中にコードされており、従って作製時にこのウイルスゲノムから発現される。
Claims (15)
- 細胞において少なくとも1種の異種核酸配列を発現する方法であって、
該細胞を、該少なくとも1種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターで感染することにより、少なくとも1種の異種核酸配列を細胞へ導入することを含む方法であって、
ここで組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたPタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに
ここで該少なくとも1種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質をコードしている、方法。 - 前記組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターが、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルス及びヒト呼吸器合胞体ウイルスを含むパラミクソウイルス、又は水疱性口内炎ウイルス若しくは狂犬病ウイルスを含むラブドウイルスのベクターである、請求項1記載の方法。
- 前記Pタンパク質の変異が、センダイウイルスのPタンパク質のアミノ酸配列2−77の又はその配列への、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのPタンパク質のアミノ酸配列2−77と相同のアミノ酸配列の又はその配列への、1個又は複数のアミノ酸の欠失、挿入又は置換である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記変異が:
(a)センダイウイルスのPタンパク質のアミノ酸2から77の欠失、又はセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのPタンパク質のアミノ酸2−77と相同のアミノ酸の欠失であるか;あるいは
(b)センダイウイルスのPタンパク質のアミノ酸33−41の欠失、又はセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのPタンパク質のアミノ酸33−41と相同のアミノ酸の欠失である、請求項3記載の方法。 - 前記細胞の再プログラミング因子が、Nanog、Oct−3/4、Sox2、c−Myc、Klf4、Lin28、ASCL1、MYT1L、TBX3b、SV40ラージT、hTERT、miR−291、miR−294、miR−295、及びそれらの組合せからなる群から選択され、並びに/又はここで該プログラミング因子が、神経成長因子(NGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、インターロイキン−6(IL−6)、骨形成タンパク質(BMP)、ニューロゲニン3(Ngn3)、膵臓及び十二指腸ホメオボックス1(Pdx1)、Mafa、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 前記治療的タンパク質が、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、p91−PHOX、IX因子、VIII因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、β−グロビン(HBB)、ジストロフィン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)、フェニルアラニン水酸化酵素(PAH)、グルコシルセラミダーゼ(GBA及びGBA2)、フィブリリン−1(FBN1)、ハンチンチン(HTT)、アポリポタンパクB(apoB)、低密度リポタンパク受容体(LDLR)、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質1(LDLRAP1)、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)、シヌクレインα(SNCA)、パーキン(PRKN)、ロイシン−リッチリピートキナーゼ2(LRRK2)、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)、パーキンソンタンパク質7(DJ−1)、ATPase型13A2(ATP13A2)、癌自殺遺伝子産物、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質2(TRP−2)及び癌胎児性抗原(CEA)を含む癌自己抗原、免疫刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子(GM−CSF)及び上皮増殖因子(EGF)を含む増殖因子、インターロイキンIL−2、IL−4、IL−5、IL−12、及びIL−17を含むサイトカイン、免疫抑制物質、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも部分的に分化した細胞のより少なく分化した細胞への再プログラミング、又は所望の分化状態へプログラミングされるべき細胞のプログラミングのインビトロ法であって:
(a)ドナー由来の少なくとも部分的に分化した細胞又はプログラミングされるべき細胞を提供する工程、
(b)少なくとも1種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも1種の異種核酸配列を、工程(a)において提供される細胞へ導入する工程、並びに
(c)感染された細胞を、該少なくとも1種の異種核酸配列を発現するのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで該少なくとも1種の異種核酸配列が、細胞の再プログラミング因子又はプログラミング因子をコードしている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。 - 前記少なくとも部分的に分化した細胞が、高分化型体細胞、前駆体細胞、系列−制限された幹細胞、体性幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される哺乳動物の細胞である、請求項7記載の方法。
- 前記少なくとも部分的に分化した細胞が、少能性細胞、多能性細胞、又は万能性細胞へ再プログラミングされる、請求項7又は8記載の方法。
- 前記プログラミングされるべき細胞が、高分化型体細胞である、請求項7記載の方法。
- 遺伝性障害を治療するインビボ法であって:
少なくとも1種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターを患者へ投与し、該少なくとも1種の異種核酸配列を患者の細胞へ導入する工程を含み、
ここで該少なくとも1種の異種核酸配列が、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。 - 遺伝性障害を治療するインビトロ法であって:
(a)ドナー由来の細胞を提供する工程、
(b)少なくとも1種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖RNAウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも1種の異種核酸配列を、工程(a)において提供された細胞へ導入する工程、並びに
(c)感染された細胞を、該少なくとも1種の異種核酸配列を発現するか及び/又は該細胞を増殖させるのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで該少なくとも1種の異種核酸配列が、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。 - 請求項1〜10及び12のいずれか一項記載の方法により、インビトロにおいて調製された細胞又は細胞集団。
- 医薬品として使用するための、請求項13記載の細胞又は細胞集団。
- 請求項13記載の細胞又は細胞集団、あるいは請求項7〜9のいずれか一項記載の再プログラミングのインビトロ法により調製された細胞又は細胞集団に由来した再分化した細胞又は再分化した細胞集団を含有する、医薬組成物。
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