CN115725656A - 一种以细胞质rna病毒为载体递送干扰rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，本发明提供一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法。本发明方法包括使用细胞质RNA病毒作为载体，在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列，其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列，以替代核内Drosha加工过程，增加干扰RNA切割效率，实现对靶基因的表达干扰的目的。

Description

一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体为干扰RNA，特别涉及干扰RNA以细胞质RNA病毒为载体的递送方法。

背景技术

RNA药物是目前被广泛关注的寡核苷酸药物的一种，因其在RNA水平调控疾病相关基因的表达，而被期许有望填补分子水平治疗的领域空白。近年来FDA已批准的多款寡核苷酸药物中，包含多种反义核苷酸药物，通过与靶基因互补产生效用，例如硫代脱氧核苷酸药物Vitravene，通过对人类巨细胞病毒(CMV)mRNA的反义抑制发挥抑制病毒活性的作用，治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎。另外两款siRNA药物：Onpattro和Givlaari相继上市，使得RNA干扰技术抓住众多药企的目光。但是目前所有的商业化RNA药物均是化学合成，需要做结构修饰，脂质体或纳米材料包埋避免制剂降解，成本较高，比如Givlaari的定价为每年57.5万美元。因此，生物载体携带RNA药物的研发思路也逐渐被关注。

目前优先选择的生物载体为DNA载体和DNA病毒，例如使用最为广泛的腺病毒载体，在分子生物学中被作为常用的工具载体。但DNA病毒通常为入核病毒，会影响宿主基因组稳定性及表达，整合到宿主基因组，生物毒性较大。

RNA病毒是指以RNA为遗传物质的病毒，不同于DNA病毒的是其遗传物质复制通常发生在胞质中，且可以直接在细胞质中合成酶分子或其他蛋白分子。根据现有的病毒分类方式，RNA病毒又分为了正链RNA病毒、负链RNA病毒和双链RNA病毒，病毒在进入细胞后，其正义链RNA可直接合成复制相关酶，对其遗传物质进行大量扩增，随后表达复制、结构、免疫相关蛋白分子，完成在细胞中的大量扩增、繁殖和释放的工作。

减毒的RNA病毒是非常良好的生物药载体，它能携带药物进入病灶，并进行大量复制，最终达到给药到靶点，引发自身免疫效应或抑制疾病相关基因的表达，治疗相关疾病的目的。目前多个被改造的减毒RNA病毒药物被报道，并进入临床试验阶段，主要设计方向为减毒病毒疫苗、改造病毒载体表达相关蛋白。RNA病毒多数为细胞质病毒，仅有少数可入核。细胞质RNA病毒作为RNA药物载体，其优势之一是设计方式可以多样化，无论是正链病毒还是负链病毒都可以携带RNA药物分子，从而通过多样的加工方式避免对病毒活性的影响，部分病毒有组织特异性，使得RNA药物分子可以表达于靶点。另外一点是可持续复制表达，可以减小给药量，降低成本。另外RNA病毒通常在胞质中完成该过程，降低了载体病毒对细胞生理以及对内源miRNA生成途径的毒性，不会插入染色体从而影响宿主细胞基因组稳定性，安全性更好。

但是目前为止细胞质RNA病毒还没有被开发成RNA干扰药物表达载体。因为RNA病毒通常只存在于细胞质中，没有入核过程。正常干扰RNA的加工需要入核，被细胞核中的Drosha识别加工，从mRNA链释放出来，形成shRNA，然后由Exportin 5转运出细胞质，继续被Dicer加工形成双链siRNA，最后由Ago装载其中一条链形成RISC，起到干扰作用。不入核则仅依靠细胞质中很少量的Drosha难以加工成干扰RNA。再加上RNA病毒需要携带自身复制转录翻译相关的遗传信息，基因组一般会比较大，二级结构复杂，也进一步增加了Drosha识别的难度。因此，理论上RNA病毒不适合作为RNA干扰药物的表达载体。

由于RNA病毒载体的劣势，所以现有公开资料中采用RNA病毒递送干扰RNA屈指可数，比如细胞质RNA病毒仙台病毒，辛德毕斯病毒，蜱传脑炎病毒，昆津病毒。核质RNA病毒如流感病毒和博尔纳病毒。仙台病毒会导致Drosha蛋白的核定位功能区结构异常，该核酸酶通过核孔渗透释放到胞质中，加上仙台病毒基因组小，结构简单，插入到基因组上的miRNA前体分子易于被加工，弥补病毒无法入核的缺陷。

辛德毕斯病毒，蜱传脑炎病毒，昆津病毒则有自身独特的加工方式，不依赖于Drosha识别加工。流感病毒和博尔纳病毒虽然也是细胞质RNA病毒，但是可以入核，因此可以被Drosha识别加工。

但是其他多数细胞质RNA病毒并不具备以上特征，因此难以用于表达干扰RNA。主要障碍在于细胞质中Drosha缺乏，导致干扰RNA加工效率极低，因此需要额外的加工途径来辅助或替代Drosha加工。

自我剪切型核酶是一类RNA序列，无需蛋白酶加工就可以在自身序列特定位点切割RNA片段。比如有文献报导，在酵母中使用核酶可以表达出具有功能的gRNA。在细胞质RNA病毒中未有应用。

tRNA是一种由76-90个核苷酸所组成的内源性RNA，主要由RNase P和RNase Z在tRNA特定位点加工，这两种酶主要存在于线粒体，细胞质中。Csy4外源性酶为cas9蛋白的同源蛋白，可以特定识别两个相同的识别位点，在识别序列的第20位碱基剪切。

文章“A Multi-purpose Toolkit to Enable Advanced Genome Engineering inPlants”中比较过在植物中，这两种加工方式都可以加工出比传统加工方式更高效的gRNA。在细胞质RNA病毒中未有应用。

发明内容

针对现有技术的缺点与不足，本发明提供了一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法。具体发明如下：

本发明提供一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法，所述方法包括：使用细胞质RNA病毒作为载体，在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列。

本发明中，作为示例性的说明，可以仅在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列；也可以在干扰RNA序列的两端同时插入具有RNA切割活性的RNA序列；还可以在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列，另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列。

作为示例性的说明，本发明方法中干扰RNA可以为一个、两个或多个干扰RNA。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶，或它们中的两种或两种以上的组合。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法包括：在干扰RNA序列两端插入不同的核酶；优选在干扰RNA序列两端分别插入丁型肝炎病毒(HDV)核酶和锤头型(HH)核酶。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA、或csy4识别位点，或它们两种的组合。

本发明方法中，作为实施方案之一，干扰RNA表达框架在干扰RNA的两端分别插入两种不同的核酶。

作为实施方案之一，干扰RNA表达框架在干扰RNA的一端插入tRNA或csy4识别位点，另一端插入HH或HDV核酶。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述细胞质RNA病毒选自猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、麻疹病毒、流感病毒、非洲猪瘟病毒、新冠病毒、猪流感病毒、经典猪瘟病毒、新城疫病毒；优选猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、麻疹病毒、流感病毒。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述干扰RNA序列插入到细胞质RNA病毒基因组上。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：

1)根据不同的适应症选择不同的靶基因；

2)根据靶基因序列设计干扰RNA序列，化学合成siRNA oligo，体外验证siRNAoligo对靶基因的干扰活性；

3)根据siRNA序列设计shRNA序列；

4)在siRNA序列或shRNA序列一端或两端插入核酶；然后将所得RNA序列对应的DNA序列构建到细胞质RNA病毒表达载体；其中，

当在siRNA序列或shRNA序列一端插入核酶时，另一端优选插入tRNA或csy4识别位点；

进一步优选在siRNA序列或shRNA序列两端均插入核酶；

5)通过病毒拯救获得重组活病毒。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括所述步骤2)中体外验证siRNA oligo对靶基因的干扰活性进一步包括：化学全合成靶基因序列，通过PCR方法在靶基因上下游引物分别加上酶切位点及保护碱基，之后双酶切PCR片段和载体，连接后获得带有目的基因的载体。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：步骤2)中针对每个靶基因设计干扰RNA序列，在干扰序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链，在此干扰序列的互补序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，化学合成oligo。作为示例性的说明，干扰RNA序列是根据专业软件寻找位点，由技术服务公司完成，干扰RNA设计基于反义互补原则进行设计。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中步骤2)进一步包括以下步骤：

(2-1)293T细胞在10cm培养基中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3ml PBS洗涤细胞两次；

(2-2)加1ml Trypsin-EDTA溶液,混匀后，吸去胰酶溶液，37℃放置2-3分钟；

(2-3)加入2ml完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；

(2-4)血球计数板计数，按照每孔约1×10⁵的细胞量接种于24孔板；

(2-5)每1OD260 oligo用125μl DEPC-H2O溶解，终浓度约为20μM；

(2-6)Lipo2000的转染方法：每组三个重复孔的转染方法：在1.5ml EP管中加入150μl Opti-MEM I(50μl/well*3well)，再加入靶基因质粒60ng(每孔20ng)，以及相对应的oligo 1.5ul(每孔10pmol/500ul，即20nM转染)，混匀；在另一1.5ml EP管中加入150μlOpti-MEM I(50μl/well*3well)，以及6ul的转染试剂lipo2000，混匀，静置5min后将两者混匀，共300ul体积，室温静置20min；

(2-7)期间将前一天铺好的24孔板中培养基移除，按400μl/孔加入培养基；20min静置时间到后，将转染混合物分别加入到以上的24孔板中，100μl/孔，设3重复，将孔板摇匀，在培养箱中温育6小时；

(2-8)移除转染液，用PBS漂洗后，加入培养基继续培养；

(2-9)在转染24h后收取细胞，参照promega双荧光素酶试剂盒说明书做双荧光素酶检测。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中步骤3)进一步包括：以siRNA互补序列作为正义链，使用shRNA常用的loop环(TTCAAGAGA)、mir30 loop环序列、或mir155loop环序列，siRNA序列作为反义链，3’末端添加两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中步骤4)进一步包括：合成(A-B-C)_n基因片段；

其中n为1-5之间的整数；

A和C分别独立地选自具有RNA切割活性的RNA序列或被RNA酶所识别的特征RNA序列，其中A和C不同时为被RNA酶所识别的特征RNA序列；

所述B为干扰RNA；

本发明中，作为实施方案之一，优选所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶；

本发明中作为实施方案之一，优选所述被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA、或csy4识别位点；

所述干扰RNA选自siRNA、shRNA或它们的组合；

本发明中作为实施方案之一，优选所述(A-B-C)_n基因片段优选HDV-siRNA-HH、HDV-siRNA-HHL、(HDV-shRNA-HH)n、HDV-shRNAL-HH、HDV-HDV-shRNA-HH-HH、HDV-HDV-shRNA-HH、HDV-shRNA-HHL、HDV-shRNA-tRNA或Csy4(外源性酶)-HDV-shRNA-csy4(识别位点)的基因片段；

通过在PCR引物序列两端添加TRS(转录调控序列)和酶切位点，利用该引物扩增(A-B-C)_n基因片段，酶切PCR产物，连接到相同酶切的表达载体，获得带有两端带有核酶、或一端带有核酶而另一端带有tRNA或csy4识别位点的siRNA片段或shRNA片段的病毒表达载体。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中步骤5)进一步包括：

(5-1)将状态良好的细胞铺6孔板，铺板的密度5×10⁵个/ml，每孔2ml细胞，放置37℃的CO₂培养箱中培养24h；

(5-2)待细胞融合度达到约80％左右，将上清培养基弃去，用PBS洗涤两遍，加入含有3％FBS的DMEM维持液；

(5-3)根据细胞与质粒选择合适的转染试剂，根据转染试剂说明书分别将两端带有核酶、或一端带有核酶，而另一端带有tRNA或csy4识别位点的siRNA或shRNA片段的细胞质RNA病毒表达载体和RFP-靶基因病毒表达载体进行转染，转染96h后观察细胞形态的改变，例如有空泡等病变，记为P0代；

(5-4)将P0代病毒液以感染复数为0.1的感染量继续感染重新铺板的细胞，接毒72h后将细胞放入-20℃冰箱进行反复冻融三次，800g离心5min得到的病毒液记为P1代病毒；

(5-5)再将P1代病毒按照(5-4)方法进行传代依次传至P3代，将含有P3代病毒的细胞放入-20℃冰箱进行反复冻融三次，800g离心5min得到的P3代病毒保存至-80℃冰箱中备用。

本发明还提供一种前述方法制备得到的干扰RNA-细胞质RNA病毒在制备抗病毒药物、干扰RNA药物中的应用。

本发明的应用中，作为实施方案之一，所述干扰RNA选自非洲猪瘟病毒、流感病毒、麻疹病毒、新冠病毒、猪流感病毒、经典猪瘟病毒、新城疫病毒；优选非洲猪瘟病毒、流感病毒、新冠病毒的干扰RNA。

本发明的应用中，作为实施方案之一，所述抗病毒药物包括抗非洲猪瘟病毒、抗流感病毒、抗麻疹病毒、抗新冠病毒、抗猪流感病毒、抗经典猪瘟病毒、抗新城疫病毒的药物；优选抗非洲猪瘟病毒、流感病毒、新冠病毒的药物。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述细胞质RNA病毒为PRRSV，所述干扰RNA为非洲猪瘟病毒的干扰RNA，

构建如下干扰RNA表达框架：a)在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列；b)然后步骤a)所得所述干扰RNA与TRS(转录调控序列)结合；或者再进一步在干扰RNA与TRS之间插入EGFP或Csy4外源性酶或它们两者的组合。

所述干扰RNA表达框架插入到PRRSV病毒基因组的负链上。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述TRS(转录调控序列)优选TRS2、TRS3、TRS4、TRS5、TRS6、或TRS7，最佳为TRS 6。

作为实施方案之一，所述TRS序列由选自SEQ ID NO:159～SEQ ID NO:164中任一所示的序列转录后获得。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述具有RNA切割活性的RNA序列选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、窦状芽孢杆菌glmS核酶中的一种或多种；优选在干扰RNA两端插入不同种的核酶；进一步优选在干扰RNA两端分别插入丁型肝炎病毒核酶和锤头型核酶。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述干扰RNA的形式为siRNA(小干扰RNA)、saiRNA(由Ago2加工的单链干扰RNA)、G1、D1、D1L、shRNA(短发夹RNA)、shRNAL，优选siRNA、shRNA，最佳shRNA。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述干扰RNA的靶基因选自非洲猪瘟病毒的如下基因：O174L、EP296R、E165R、K196R、EP152R、CP204L、A240L、MGF360-9L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-18R、MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、S273R、CP530R、B646L、NP419L、G1211R、F1055L、NP1450L、EP1242L、I243L、D250R、P1192R、M448R、或pA104R。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述干扰RNA具有SEQ ID NO:47～SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQ ID NO:144中任一所示的序列，优选SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53～SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74～SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQID NO:122、或SEQ ID NO:124～SEQ ID NO:144中任一所示的序列。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中的干扰RNA表达框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-EGFP-HDV-siRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-siRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-G1-HH；TRS6-EGFP-HH-shRNA-HDV；TRS6-EGFP-HH-shRNAL-HDV；TRS6-EGFP-HDV-D1-HH；TRS6-EGFP-HDV-D1L-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6-EGFP-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA-HH；TRS6-HDV-HDV-shRNA-HH；TRS6-HDV-shRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA-HH)*5；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-tRNA；或TRS6-Csy4(外源性酶)-HDV-shRNA-csy4(识别位点)，优选TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6-HDV-shRNA-HHL；TRS6 HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA HH-HDV-shRNA HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA HH)*5，最佳TRS6-HDV-shRNA-HHL。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中的干扰RNA表达框架的序列由选自如下任一所示的序列转录后获得：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:34～SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111；优选SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46，最佳SEQID NO:44。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中的干扰RNA表达框架不含EGFP，选自具有如下序列特征的序列：TRS6-HDV-siRNA-HH；TRS6-HDV-siRNA-HHL；TRS6-HDV-G1-HH；TRS6-HDV-D1-HH；TRS6-HDV-D1L-HH；TRS6-HDV-shRNAL-HH；TRS6-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA-HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA-HH；TRS6-(HDV-shRNA-HH)*5；或TRS6-HDV-shRNA-tRNA，优选TRS6-(HDV-shRNA-HH)*5。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中干扰RNA表达框架的序列由选自如下任一所示的序列转录后获得：SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:155；优选SEQ ID NO:154。

本发明还提供一种前述方法制备得到的非洲猪瘟病毒干扰RNA-PRRSV病毒在制备治疗或预防非洲猪瘟的药物中的应用。

本发明还提供一种用于治疗或预防非洲猪瘟的干扰RNA-PRRSV病毒药物，其根据前文任一所述的方法制备得到。

本发明还提供一种抗病毒药物或干扰RNA药物，其根据前文任一所述的方法制备得到。

本发明还提供一种药物组合物，其含有前文任一所述的药物。

定义

本发明中，siRNA是小干扰RNA；saiRNA是可被Ago2识别加工的RNA序列；shRNA是短发卡RNA；G1，D1，D1L是shRNA的优化序列，有不同的RNA loop环和配对区，并延长了shRNA两端序列；shRNAL是加长的shRNA，末端添加4个T。

TRS为转录调控序列。

本发明中涉及到的干扰RNA表达框架的DNA序列的非限制性示例如下表所示：

本发明中涉及到的干扰RNA序列的非限制性示例如下表所示：

本发明中涉及的其他序列如下表所示，其中SEQ ID NO:156～SEQ ID NO:158分别依次为苯丙氨酸tRNA、Csy4外源性酶、csy4识别位点的cDNA序列：

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用细胞质RNA病毒递送干扰RNA，相比目前已经商业化的化学合成siRNA的方式，细胞质RNA病毒可以在体内持续表达，可以减小给药量，降低成本。

细胞质RNA病毒相比目前较成熟的DNA载体或DNA病毒载体加工方式，不会插入到宿主基因组，安全性更好。RNA病毒通常在胞质中完成对干扰RNA的加工过程，降低了载体病毒对细胞生理以及对内源miRNA生成途径的毒性。

本发明通过设计改造干扰RNA两端的剪切方式，增加了细胞质RNA病毒中的干扰RNA加工途径，可以增加加工效率进而增加干扰效率，且由于细胞质RNA病毒种类多，可以扩大细胞质RNA病毒的选用范围。

附图说明

图1：实施例3中P0-P3代包装病毒的荧光和病变情况。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例1～4以采用PRRSV表达非洲猪瘟病毒的干扰RNA为例进行说明。

实施例1干扰RNA序列筛选

本发明通过对国内流行非洲猪瘟病毒的序列比对和蛋白功能分析，筛选出具有高度保守性的关键基因，涉及非洲猪瘟病毒复制，免疫逃逸，结构等功能。靶基因及编码蛋白如下：

针对每个靶基因，设计了3条干扰RNA序列，在干扰序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链，在此干扰序列的互补序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，化学合成oligo。

siRNA oligo体外验证：

1. 293T细胞在10cm培养基中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3ml PBS洗涤细胞两次。

2.加1ml Trypsin-EDTA溶液,混匀后，吸去胰酶溶液，37℃放置2-3分钟。

3.加入2ml完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液。

4.血球计数板计数，按照每孔约1×10⁵的细胞量接种于24孔板。

5.每1OD260 oligo用125μl DEPC-H2O溶解，终浓度约为20μM。

6.Lipo2000的转染方法：每组三个重复孔的转染方法：在1.5ml EP管中加入150μlOpti-MEM I(50μl/well*3well)，再加入靶基因质粒60ng(每孔20ng)，以及相对应的oligo1.5ul(每孔10pmol/500ul，即20nM转染)，混匀；在另一1.5ml EP管中加入150μl Opti-MEMI(50μl/well*3well)，以及6ul的转染试剂lipo2000，混匀，静置5min后将两者混匀，共300ul体积，室温静置20min。

7.期间将前一天铺好的24孔板中培养基移除，按400μl/孔加入培养基；20min静置时间到后，将转染混合物分别加入到以上的24孔板中，100μl/孔，设3重复，将孔板摇匀，在培养箱中温育6小时。

8.移除转染液，用PBS漂洗后，加入培养基继续培养。

9.在转染24h后收取细胞，参照promega双荧光素酶试剂盒说明书做双荧光素酶检测。

表1干扰率验证结果

实施例2 PRRSV病毒表达载体的构建

shRNA序列合成：由单链的siRNA制备相应的shRNA步骤如下：以siRNA互补序列作为正义链，TTCAAGAGA或mir30或mir155 loop序列作为shRNA loop序列，siRNA序列作为反义链，3’末端添加两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。

PRRSV-shRNA病毒表达载体：

pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP(绿色荧光蛋白)载体构建参照文献(chengbao wang,Anovel porcine reproductive and respiratory syndrome virus vector system thatstably expresses enhanced green fluorescent protein as a separatetranscription unit,Veterinary Research,2013)。化学合成TRS6(转录调控序列)+EGFP+shRNA片段，通过PCR方法扩增TRS6+EGFP+shRNA，引物两端添加AsisI和MluI酶切位点。AsisI和MluI双酶切PCR产物，连接到AsisI和MluI双酶切的pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP载体，获得带有shRNA片段的蓝耳病毒表达载体pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP-shRNA。

PRRSV-RFP-靶基因病毒表达载体：

化学合成TRS6+RFP(红色荧光蛋白)+非洲猪瘟靶基因序列，通过PCR方法扩增TRS6+RFP+非洲猪瘟靶基因序列，引物两端添加AsisI和MluI酶切位点。AsisI和MluI双酶切PCR产物，连接到AsisI和MluI双酶切的pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP载体，获得带有RFP+靶基因的蓝耳病毒表达载体pBAC-PRRSV-TRS6-RFP-靶基因。RFP和靶基因融合表达，这样通过RFP的荧光强度可以判断靶基因被抑制的程度。

AsisI和MluI酶切、酶连参照《分子克隆实验指南》的常规条件：AsisI和MluI内切酶在CutSmart Buffer的环境中，37℃酶切过夜；连接条件为T4连接酶在T4 DNA ligasebuffer环境中，16℃条件下连接过夜。

实施例3 PRRSV重组病毒拯救

将状态良好的Marc-145细胞铺6孔板，铺板的密度5×10⁵个/ml，每孔加入2ml的DMEM完全培养基，放置37℃CO2培养箱中培养12h；第二天细胞融合度达到约80％左右，将上清培养基弃去，用PBS洗涤两遍，加入含有3％FBS的DMEM维持液；选用Attractene转染试剂，每孔的计量为100μl的opti-MEM中加入1.2μg的质粒和4.5μl的转染试剂，分别将PRRSV-shRNA病毒表达载体和PRRSV-RFP-靶基因病毒表达载体进行转染，转染96h后细胞形态改变，有空泡等病变，荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光(shRNA病毒表达载体)或红色荧光(RFP-靶基因病毒表达载体)，记为P0代；以感染复数为0.1的P0代病毒液感染Marc-145细胞，生长72h后细胞形态改变，有空泡等病变，荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光(shRNA病毒表达载体)或红色荧光(RFP-靶基因病毒表达载体)，将细胞放入-20℃冰箱进行反复冻融三次，将细胞破碎让病毒释放出来；将反复冻融的细胞转移到离心管中800g离心5min，记为P1代病毒；再将P1代病毒进行传代依次传至P3代病毒，将含有P3代病毒的细胞放入-20℃冰箱进行反复冻融三次，细胞转移到离心管中800g离心5min，获得P3代病毒将病毒保存至-80℃冰箱中。

如图1所示，P0代是病毒表达载体转染后的第一代，已经可以看到少量绿色和红色荧光，表明重组病毒已经获得拯救，随着传代次数的增加，病毒滴度不断增加，P2和P3代绿色荧光和红色荧光已经很强了，病毒滴度也基本达到了最高峰。

实施例4体外干扰活性和干扰RNA产物测定

本研究的主要目的是寻找治疗或预防非洲猪瘟的药物，非洲猪瘟病毒的靶细胞是猪肺泡巨噬细胞，因此本研究的干扰活性测试在猪肺泡巨噬细胞中进行，以QBH90544.1-siRNA-15为例。

将状态良好的猪肺泡巨噬细胞铺6孔板，铺板的密度1×10⁶个/ml，每孔加入2ml的RPMI-1640完全培养基，放置37℃CO₂培养箱中培养12h；第二天细胞融合度达到约80％左右，将上清培养基弃去，用PBS洗涤两遍，加入含有3％FBS的RPMI-1640维持液。为了排除病毒相互抑制对干扰率测试的影响，将不含有靶基因和干扰RNA的PRRSV病毒作为对照。将靶病毒PRRSV-TRS6-RFP-靶基因、PRRSV病毒和P3代PRRSV-TRS6-shRNA的病毒液提取RNA，用RT-PCR进行病毒滴度测定。

病毒滴度测定具体步骤为：

1.引物探针设计

参考目前通用的一步法RT-qPCR探针引物设计原则，使用南京金斯瑞生物科技引物探针设计软件设计RT-qPCR的引物与探针，引物及探针的设计区域为蓝耳病毒ORF1a框架区域，扩增条带大小为85bp，设计结果如下：

PRRSV-F:GTTGAGCCCAATACGTCACC(Tm:56.03)

PRRSV-R:TCTTTCCAGCACCGTACCAT(Tm:56.03)

PRRSV-pro:FAM-ACTGCCAAACCGGAAGATCTTCCCA-TAMRA(Tm:62.15)

2.病毒RNA提取

使用上海生工公司试剂盒对病毒液进行RNA提取(病毒液为将经过病毒侵染的细胞液进行反复冻融后离心，去除细胞沉淀物)。

将病毒液混匀后，取0.1～0.2mL病毒液样品于RNase-free的1.5mL离心管中。向离心管中加入0.6mL Buffer Rlysis-VG，振荡30s混匀后室温放置10min。加入0.6mL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15sec。短暂离心后将700μl溶液转移到离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm室温离心1min，弃穿透液，把吸附柱放回收集管中。将剩余溶液短暂离心后全部转移离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm室温离心1min，弃穿透液，把离心吸附柱放回收集管中。加入500μl RPE Solution到离心吸附柱中，12,000rpm室温离心1min，弃穿透液，把离心吸附柱放回收集管中。重复上述步骤1次。12,000rpm室温离心2min，弃含穿透液的离心管。将离心吸附柱套入到一个新的RNase-free的1.5mL离心管中，在离心吸附柱的滤膜的中部加入30～100μlDEPC-treated ddH2O，然后室温放置2min。12,000rpm室温离心2min，收集管中的样品即为病毒RNA。

将提取的病毒RNA进行浓度与纯度测量，OD260/OD280比值为2.0左右为纯度较好的RNA样品。

3.逆转录与qPCR

使用NEB一步法RT-qPCR试剂盒进行RT-qPCR扩增。

以步骤2中提取的病毒RNA为模板(并以水作为阴性对照)，按照以下体系进行配置RT-qPCR体系，每个样品做3个复孔，将配置好的体系放于8联管或96孔板中：

Luna universal probe one-step reaction mix(2*)	10ul
		Luna warmstart rt enzyme mix(20*)	1ul
PRRSV-F(10uM)	0.8ul
		PRRSV-R(10uM)	0.8ul
PRRSV-pro(10uM)	0.4ul
		Template	≤1ug
Nuclease-free Water	To 20ul

将8联管或96孔板中置于赛默飞7500荧光PCR仪器中，选择TaqMan中quantitationstandard curve ROX程序，以ROX荧光作为参比荧光，FAM荧光作为报告荧光，TAMRA作为淬灭荧光，并设置好孔径的位置，按以下条件进行程序设置后进行RT-PCR。

4.实验结果分析

RT-PCR结果的CT值可代表病毒相对滴度，CT值相差n则代表拷贝数相差2ⁿ。

以病毒滴度最小的作为标准，将PRRSV-TRS6-RFP-靶基因、PRRSV对照和P3代PRRSV-TRS6-shRNA病毒滴度调成一致后进行双病毒接毒；每种病毒接10μl到6孔板中，共设5个实验组，用实验组1空孔作为空白对照孔，实验组2孔接上PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒，实验组3孔中加入PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒和PRRSV对照病毒，实验组4孔加入PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒和P3代PRRSV-TRS6-shRNA病毒，实验组5孔细胞先转染siRNA标准品，然后再接入PRRSV-TRS6-RFP-靶基因病毒，实验组2-5孔板各做两个平行，接毒72h后其中一个6孔板进行反复冻融后转移到离心管中离心，吸取100μl裂解液加入到96孔板中用激发光和发射光分别为580和610的波长测定红光值，根据红光值的减少来评估干扰率；

另一个6孔板测定干扰RNA产物，弃去孔板中的上清，用PBS洗涤两次后，用含有EDTA的胰酶消化1min，弃去胰酶加入1ml的DMEM培养基将细胞吹散加入到1.5ml离心管中，用PBS洗涤两次，弃去残留的PBS，加入450ul buffer RLT涡旋30s，加入140ul混匀，在室温孵育3min；将溶解产物放于gDNA收集管中8000rpm/min离心30s收集上清液；加入1体积异丙醇混合均匀，将样品转移到RNeasy Mini column，8000×g离心15秒，弃去上清液；加入700ul Buffer RWT 8000×g离心15秒，去上清液；加入500ul Buffer RPE 8000×g离心15秒，去上清液，再重复一次此步骤后空离1min；加入35ul RNeasy water，放置1min，12000×g离心1min收集滤液；测定浓度后将浓度稀释一样；以样品稀释后浓度作为模板，以标准品10-5作为阳性对照，PRRSV-TRS6-RFP-90544.1和PRRSV-TRS6-EGFP共接毒的孔作为阴性对照，使用锐博加"A"法试剂盒进行加"A"，体系为RNA模板7ul，5*poly(A)polymerase Buffer2ul，poly(A)polymerase 1ul，将上述体系混匀后37℃反应1h；反应后进行反转录，体系为RTase mix 4ul，5*RTase buffer 4ul，miDETECT A Track Uni-RT primer 2ul和poly(A)Tailing产物10ul，将上述体系混匀后42℃反应1h，然后放于2℃反应10min；反转录后进行qPCR，体系为miDETECT A Track miRNA Forward Primer(10uM)0.5ul，miDETECT A TrackmiRNA Uni-Reverse Primer(10uM)0.5ul，2*SYBR Green Mix 10ul，cDNA 2ul，用RNase-free water将体系补充到20ul混合均匀，首先95℃10min，再95℃2s和60℃30s进行40个循环。

实验组2是单独含有靶基因病毒，实验组3是靶基因病毒和普通PRRSV病毒双病毒接毒，目的是为了评估双病毒接毒对红色荧光值的影响，实验组4是靶基因病毒和干扰病毒双病毒接毒，实验组5是siRNA标准品转染后再接靶基因病毒。

siRNA标准品干扰率计算公式：(实验组2红光值-实验组5红光值)/(实验组2红光值-空白红光值)*100％；

以标准品干扰率作为基准100％，计算干扰病毒的相对干扰率：((实验组3红光值-实验组4红光值)/(实验组3红光值-空白红光值))/标准品干扰率*100％。

表2 PAM细胞上干扰率及干扰RNA测试结果

以QBH90544.1-siRNA-15为例，按照上述的干扰率测定方法，比较了含有不同RNA表达框架的重组PRRSV的相对干扰率情况，具体结果如下表3。

含有以下序列特征的重组PRRSV构建参照实施例2PRRSV-shRNA病毒表达载体部分。以TRS6-HDV-shRNA-HHL为例，化学合成HDV-shRNA-HHL，通过PCR方法扩增HDV-shRNA-HHL，引物两端添加AsisI-TRS6和MluI酶切位点。AsisI和MluI双酶切PCR产物，连接到AsisI和MluI双酶切的pBAC-PRRSV-TRS6-EGFP载体，获得带有HDV-shRNA-HHL片段的蓝耳病毒表达载体。

表3

上表的序列特征中，siRNA是小干扰RNA；saiRNA是可被Ago2识别加工的RNA序列；shRNA是短发卡RNA；G1，D1，D1L是shRNA的优化序列，有不同的RNA loop环和配对区，并延长了shRNA两端序列；shRNAL是加长的shRNA，末端添加4个T。Intron代表内含子加工序列。HDV是丁型肝炎病毒核酶,HH是锤头型核酶，HHL是配对序列从6个碱基延长到10个碱基的锤头型核酶。

序号1是直接把常规的shRNA插入到PRRSV病毒基因组中，这种表达框架未检测到干扰率，推测是PRRSV病毒表达出的shRNA加工效率过低导致无法产生有效的干扰RNA。

框架2-21对shRNA内部匹配度，loop环序列，两端延伸序列作了优化来增加Drosha的加工效率，并考虑使用内含子切割代替Drosha切割方式，结果仍不理想；

框架31在细胞质中外源表达Drosha，但是由于Drosha蛋白过于大，无法包装出病毒；

剩余的框架都是使用了两端自剪切核酶，HDV是丁型肝炎病毒核酶，HH是锤头型核酶，这两种核酶都可以在RNA特定位点自我切割，将shRNA释放出来。考虑到病毒基因组稳定性，设计负链的识别序列，这样可以避免基因组正链被核酶切断，对病毒稳定性破坏更小。

序号23、24、26、36-46是核酶设计到负链上的框架，都具有一定的干扰率，序号22、25、27-30、32-35是核酶设计到正链上的框架，都没有获得理想的结果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 联邦生物科技（珠海横琴）有限公司

珠海联邦生物医药有限公司

珠海联邦制药股份有限公司

<120> 一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法

<130> LAC201266P

<160> 164

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacacattg catgcttggt 60

gttattcaag agataacacc aagcatgcaa tgttcg 96

<210> 2

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacacaccg cattgcatgc 60

ttggtgttat tcaagagata acaccaagca tgcaatgttt tttgcg 106

<210> 3

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagaagg ctgtatgctg 60

taacaccaag catgcaatgg ttttggccac tgactgacca ttgcgcttgg tgttacagga 120

caaggcctgt cg 132

<210> 4

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagaa ggctgtatgc tgtaacacca 60

agcatgcaat ggttttggcc actgactgac cattgcgctt ggtgttacag gacaaggcct 120

gtcg 124

<210> 5

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagaagg ctgtatgctg 60

taacaccaag catgcaatgg ttttggccac tgactgacca ttgcatgctt ggtgttacag 120

gacaaggcct gtcg 134

<210> 6

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacatgctg ttgacagtga 60

gcgacattgc atgcttggtg ttagtgaagc cacagatgta acacagcatg caatgctgcc 120

tactgcctcg gacttcaagg gcg 143

<210> 7

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgaaccaac tttaggcctg aattgaatgc tgttgacagt gagcgacatt gcatgcttgg 60

tgttagtgaa gccacagatg taacacagca tgcaatgctg cctactgcct cggacttcaa 120

gggcg 125

<210> 8

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcatgc tgttgacagt gagcgacatt 60

gcatgcttgg tgttagtgaa gccacagatg taacaccaag catgcaatgc tgcctactgc 120

ctcggacttc aagggcg 137

<210> 9

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacactgga ggcttgctga 60

aggctgtatg ctgtaacacc aagcatgcaa tggttttggc cactgactga ccattgcatg 120

cttggtgtta caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcccg 177

<210> 10

<211> 1186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacattagt gaaccgtatg 60

acgtataggt gttggctcta tgccacgaca ttggtattgt caggagctgt gaccattggc 120

acagcccaaa acttgctgca cggaaacacc cttctgtgac agccctcttc aggggagatt 180

aggggtctgt ccctagcacc ttgcttccgg agttgcactg ctttacggtc tctccacccc 240

tttaaccatg tctgggatac ttgatcggtg cacgtgtacc cccaatgcca gggtgtttat 300

ggcggagggc caagtctact gcacacgatg tctcagtgca cggtctctcc ttcctctgaa 360

tctccaagtt cctgagcttg gggtgctggg cctattttat aggcccgaag agccactccg 420

gtggacgttg ccacgtgcat tccccactgt cgagtgctcc cccgccgggg cctgctggct 480

ttctgcgatc tttccaattg cacgaatgac cagtggaaac ctgaactttc aacaaagaat 540

ggtgcgggtc gcagctgaga tctacagagc cggccaactc acccctgcag ttctgaaggc 600

tctacaagtt tatgaacggg gttgtcgctg gtaccccatt gtcggacctg tccctggagt 660

ggccgtcttc gccaactccc tacatgtgag tgacaaacct ttcccgggag caactcatgt 720

gttaaccaac ttaccgctcc cgcagaggcc caagcctgag gacttttgcc cttttgagtg 780

tgctatggct gacgtctatg acattggtcg tgacgccgtc atgtatgtgg ccagagggaa 840

agtctccttt aaccagagtt tcagcggaac actggaggct tgctgaaggc tgtatgctgt 900

aacaccaagc atgcaatggt tttggccact gactgaccat tgcatgcttg gtgttacagg 960

acacaaggcc tgttactagc actcacatgg aacaaatggc ctgggctggt attctttggg 1020

cacctcagtg ttagaattgg gggaatgtgt ggtgaatggc actgattgac actgtgcctc 1080

taagtcacct attcaattag ggcgaccgtg tgggggtaaa gtttaattgg cgagaaccat 1140

gcggccgcaa ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacg 1186

<210> 11

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacactgga ggcttgctga 60

aggctgtatg ctgtaacacc aagcatgcaa tggttttggc cactgactga ccattgcgct 120

tggtgttaca ggacacaagg cctgttacta gcactcacat ggaacaaatg gcccg 175

<210> 12

<211> 188

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcacga cttcttaacc caacagaagg 60

ctcgagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgaattgca tgcttggtgt tatagtgaag 120

ccacagatgt ataacaccaa gcatgcaatg tgcctactgc ctcggacttc aaggggctag 180

aattcgcg 188

<210> 13

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacattagt gaaccgtatg 60

acgtataggt gttggctcta tgccacgaca ttggtattgt caggagctgt gaccattggc 120

acagcccaaa acttgctgca cggaaacacc cttctgtgac agccctcttc aggggagatt 180

aggggtctgt ccctagcacc ttgcttccgg agttgcactg ctttacggtc tctccacccc 240

tttaaccatg tctgggatac ttgatcggtg cacgtgtacc cccaatgcca gggtgtttat 300

ggcggagggc caagtctact gcacacgatg tctcagtgca cggtctctcc ttcctctgaa 360

tctccaagtt cctgagcttg gggtgctggg cctattttat aggcccgaag agccactccg 420

gtggacgttg ccacgtgcat tccccactgt cgagtgctcc cccgccgggg cctgctggct 480

ttctgcgatc tttccaattg cacgaatgac cagtggaaac ctgaactttc aacaaagaat 540

ggtgcgggtc gcagctgaga tctacagagc cggccaactc acccctgcag ttctgaaggc 600

tctacaagtt tatgaacggg gttgtcgctg gtaccccatt gtcggacctg tccctggagt 660

ggccgtcttc gccaactccc tacatgtgag tgacaaacct ttcccgggag caactcatgt 720

gttaaccaac ttaccgctcc cgcagaggcc caagcctgag gacttttgcc cttttgagtg 780

tgctatggct gacgtctatg acattggtcg tgacgccgtc atgtatgtgg ccagagggaa 840

agtctccttt aaccagagtt tcacgacttc ttaacccaac agaaggctcg agaaggtata 900

ttgctgttga cagtgagcga attgcatgct tggtgttata gtgaagccac agatgtataa 960

caccaagcat gcaatgtgcc tactgcctcg gacttcaagg ggctagaatt cgtgggctgg 1020

tattctttgg gcacctcagt gttagaattg ggggaatgtg tggtgaatgg cactgattga 1080

cactgtgcct ctaagtcacc tattcaatta gggcgaccgt gtgggggtaa agtttaattg 1140

gcgagaacca tgcggccgca attaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacg 1197

<210> 14

<211> 352

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacattgaa tgaggcttca 60

atactttaca gaatcgttgc ctgcacatct tggaaacact tgctgggatt acttcttcag 120

gttaacccaa cagaaggcta aagaaggtat attgctgttg acagtgagcg aattgcatgc 180

ttggtgttat agtgaagcca cagatgtata acaccaagca tgcaatgtgc ctcggacttc 240

aaggggctac tttaggagca attatcttgt ttactaaaac tgaatacctt gctatctctt 300

tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat ggtataaatt aaatcacttt cg 352

<210> 15

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacactgga ggcttgctga 60

aggctgtatg ctgtaacacc aagcatgcaa tggttttggc cactgactga ccattgcatg 120

cttggtgtta caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcccagat 180

ccgacttctt aacccaacag aaggctcgag aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgaat 240

tgcatgcttg gtgttatagt gaagccacag atgtataaca ccaagcatgc aatgtgccta 300

ctgcctcgga cttcaagggg ctagaattcg cg 332

<210> 16

<211> 488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacactgga ggcttgctga 60

aggctgtatg ctgtaacacc aagcatgcaa tggttttggc cactgactga ccattgcatg 120

cttggtgtta caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcccagat 180

cttgaatgag gcttcaatac tttacagaat cgttgcctgc acatcttgga aacacttgct 240

gggattactt cttcaggtta acccaacaga aggctaaaga aggtatattg ctgttgacag 300

tgagcgaatt gcatgcttgg tgttatagtg aagccacaga tgtataacac caagcatgca 360

atgtgcctcg gacttcaagg ggctacttta ggagcaatta tcttgtttac taaaactgaa 420

taccttgcta tctctttgat acatttttac aaagctgaat taaaatggta taaattaaat 480

cactttcg 488

<210> 17

<211> 310

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtaag tatcaaggtt 60

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagacctgga 120

ggcttgctga aggctgtatg ctgtaacacc aagcatgcaa tggttttggc cactgactga 180

ccattgcatg cttggtgtta caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa 240

tggcctcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct 300

ctccacagcg 310

<210> 18

<211> 323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtaag tatcaaggtt 60

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagac gacttcttaa 120

cccaacagaa ggctcgagaa ggtatattgc tgttgacagt gagcgaattg catgcttggt 180

gttatagtga agccacagat gtataacacc aagcatgcaa tgtgcctact gcctcggact 240

tcaaggggct agaattcgtc ttgcgtttct gataggcacc tattggtctt actgacatcc 300

actttgcctt tctctccaca gcg 323

<210> 19

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtaag tatcaaggtt 60

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagac tggaggcttg 120

ctgaaggctg tatgctgtaa caccaagcat gcaatggttt tggccactga ctgaccattg 180

catgcttggt gttacaggac acaaggcctg ttactagcac tcacatggaa caaatggccc 240

agatccgact tcttaaccca acagaaggct cgagaaggta tattgctgtt gacagtgagc 300

gaattgcatg cttggtgtta tagtgaagcc acagatgtat aacaccaagc atgcaatgtg 360

cctactgcct cggacttcaa ggggctagaa ttcgtcttgc gtttctgata ggcacctatt 420

ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacagcg 459

<210> 20

<211> 479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtaag tatcaaggtt 60

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagat tgaatgaggc 120

ttcaatactt tacagaatcg ttgcctgcac atcttggaaa cacttgctgg gattacttct 180

tcaggttaac ccaacagaag gctaaagaag gtatattgct gttgacagtg agcgaattgc 240

atgcttggtg ttatagtgaa gccacagatg tataacacca agcatgcaat gtgcctcgga 300

cttcaagggg ctactttagg agcaattatc ttgtttacta aaactgaata ccttgctatc 360

tctttgatac atttttacaa agctgaatta aaatggtata aattaaatca cttttcttgc 420

gtttctgata ggcacctatt ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacagcg 479

<210> 21

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtaag tatcaaggtt 60

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagac tggaggcttg 120

ctgaaggctg tatgctgtaa caccaagcat gcaatggttt tggccactga ctgaccattg 180

catgcttggt gttacaggac acaaggcctg ttactagcac tcacatggaa caaatggccc 240

agatcttgaa tgaggcttca atactttaca gaatcgttgc ctgcacatct tggaaacact 300

tgctgggatt acttcttcag gttaacccaa cagaaggcta aagaaggtat attgctgttg 360

acagtgagcg aattgcatgc ttggtgttat agtgaagcca cagatgtata acaccaagca 420

tgcaatgtgc ctcggacttc aaggggctac tttaggagca attatcttgt ttactaaaac 480

tgaatacctt gctatctctt tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat ggtataaatt 540

aaatcacttt tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 600

tttctctcca cagcg 615

<210> 22

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt gttactgatg 780

agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt ctaacaccaa gcatgcaatg ggccggcatg 840

gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg aatgggaccg 900

<210> 23

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggcccatt 840

gcatgcttgg tgttagacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc agtaacaccg 900

<210> 24

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

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tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

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accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

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gcatgcttgg tgttagacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc agtaacacca 900

agcatgccg 909

<210> 25

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

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tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataatg caatctgatg 780

agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt cattgcatgc ttggtgttat agtgaagcca 840

cagatgtata acaccaagca tgcaatgttg gccggcatgg tcccagcctc ctcgctggcg 900

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<210> 26

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

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cttactcgtt tcgtcctcac ggactcatca gattgcacg 939

<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

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tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt gttactgatg 780

agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt ctaacaccaa gcatgcaatg ctgcatgctt 840

ggtgttatcg gccggcatgg tcccagcctc ctcgctggcg ccggctgggc aacatgcttc 900

ggcatggcga atgggaccg 919

<210> 28

<211> 1027

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

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acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

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tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

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tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt aagtatcaag 780

gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct tgtcgagaca gagtgttact 840

gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtctaaca ccaagcatgc aatgggccgg 900

catggtccca gcctcctcgc tggcgccggc tgggcaacat gcttcggcat ggcgaatggg 960

actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac atccactttg cctttctctc 1020

cacagcg 1027

<210> 29

<211> 1066

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

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acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

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aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

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tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

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gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct tgtcgagaca gatgcaatct 840

gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtcattgc atgcttggtg ttatagtgaa 900

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ggcgccggct gggcaacatg cttcggcatg gcgaatggga ctcttgcgtt tctgataggc 1020

acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acagcg 1066

<210> 30

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

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acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

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tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

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tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt aagtatcaag 780

gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct tgtcgagaca gagtgttact 840

gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtctaaca ccaagcatgc aatgctaatt 900

gcatgcttgg tgttatcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa 960

catgcttcgg catggcgaat gggactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1020

gacatccact ttgcctttct ctccacagcg 1050

<210> 31

<211> 3067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatgga gcccgaggag 60

accatgcccg acaagaacga ggaggaggag gaggagctgc tgaagcccgt gtggatcagg 120

tgcacccaca gcgagaacta ctacagcagc gaccccatgg accaggtggg cgacagcacc 180

gtggtgggca ccagcaggct gagggacctg tacgacaagt tcgaggagga gctgggcagc 240

aggcaggaga aggccaaggc cgccaggccc ccctgggagc cccccaagac caagctggac 300

gaggacctgg agagcagcag cgagagcgag tgcgagagcg acgaggacag cacctgcagc 360

agcagcagcg acagcgaggt gttcgacgtg atcgccgaga tcaagaggaa gaaggcccac 420

cccgacaggc tgcacgacga gctgtggtac aacgaccccg gccagatgaa cgacggcccc 480

ctgtgcaagt gcagcgccaa ggccaggagg accggcatca ggcacagcat ctaccccggc 540

gaggaggcca tcaagccctg caggcccatg accaacaacg ccggcaggct gttccactac 600

aggatcaccg tgagcccccc caccaacttc ctgaccgaca ggcccaccgt gatcgagtac 660

gacgaccacg agtacatctt cgagggcttc agcatgttcg cccacgcccc cctgaccaac 720

atccccctgt gcaaggtgat caggttcaac atcgactaca ccatccactt catcgaggag 780

atgatgcccg agaacttctg cgtgaagggc ctggagctgt tcagcctgtt cctgttcagg 840

gacatcctgg agctgtacga ctggaacctg aagggccccc tgttcgagga cagccccccc 900

tgctgcccca ggttccactt catgcccagg ttcgtgaggt tcctgcccga cggcggcaag 960

gaggtgctga gcatgcacca gatcctgctg tacctgctga ggtgcagcaa ggccctggtg 1020

cccgaggagg agatcgccaa catgctgcag tgggaggagc tggagtggca gaagtacgcc 1080

gaggagtgca agggcatgat cgtgaccaac cccggcacca agcccagcag cgtgaggatc 1140

gaccagctgg acagggagca gttcaacccc gacgtgatca ccttccccat catcgtgcac 1200

ttcggcatca ggcccgccca gctgagctac gccggcgacc cccagtacca gaagctgtgg 1260

aagagctacg tgaagctgag gcacctgctg gccaacagcc ccaaggtgaa gcagaccgac 1320

aagcagaagc tggcccagag ggaggaggcc ctgcagaaga tcaggcagaa gaacaccatg 1380

aggagggagg tgaccgtgga gctgagcagc cagggcttct ggaagaccgg catcaggagc 1440

gacgtgtgcc agcacgccat gatgctgccc gtgctgaccc accacatcag gtaccaccag 1500

tgcctgatgc acctggacaa gctgatcggc tacaccttcc aggacaggtg cctgctgcag 1560

ctggccatga cccaccccag ccaccacctg aacttcggca tgaaccccga ccacgccagg 1620

aacagcctga gcaactgcgg catcaggcag cccaagtacg gcgacaggaa ggtgcaccac 1680

atgcacatga ggaagaaggg catcaacacc ctgatcaaca tcatgagcag gctgggccag 1740

gacgacccca cccccagcag gatcaaccac aacgagaggc tggagttcct gggcgacgcc 1800

gtggtggagt tcctgaccag cgtgcacctg tactacctgt tccccagcct ggaggagggc 1860

ggcctggcca cctacaggac cgccatcgtg cagaaccagc acctggccat gctggccaag 1920

aagctggagc tggacaggtt catgctgtac gcccacggcc ccgacctgtg cagggagagc 1980

gacctgaggc acgccatggc caactgcttc gaggccctga tcggcgccgt gtacctggag 2040

ggcagcctgg aggaggccaa gcagctgttc ggcaggctgc tgttcaacga ccccgacctg 2100

agggaggtgt ggctgaacta ccccctgcac cccctgcagc tgcaggagcc caacaccgac 2160

aggcagctga tcgagaccag ccccgtgctg cagaagctga ccgagttcga ggaggccatc 2220

ggcgtgatct tcacccacgt gaggctgctg gccagggcct tcaccctgag gaccgtgggc 2280

ttcaaccacc tgaccctggg ccacaaccag aggatggagt tcctgggcga cagcatcatg 2340

cagctggtgg ccaccgagta cctgttcatc cacttccccg accaccacga gggccacctg 2400

accctgctga ggagcagcct ggtgaacaac aggacccagg ccaaggtggc cgaggagctg 2460

ggcatgcagg agtacgccat caccaacgac aagaccaaga ggcccgtggc cctgaggacc 2520

aagaccctgg ccgacctgct ggagagcttc atcgccgccc tgtacatcga caaggacctg 2580

gagtacgtgc acaccttcat gaacgtgtgc ttcttcccca ggctgaagga gttcatcctg 2640

aaccaggact ggaacgaccc caagagccag ctgcagcagt gctgcctgac cctgaggacc 2700

gagggcaagg agcccgacat ccccctgtac aagaccctgc agaccgtggg ccccagccac 2760

gccaggacct acaccgtggc cgtgtacttc aagggcgaga ggatcggctg cggcaagggc 2820

cccagcatcc agcaggccga gatgggcgcc gccatggacg ccctggagaa gtacaacttc 2880

ccccagatgg cccaccagaa gaggttcatc gagaggaagt acaggcagga gctgaaggag 2940

atgaggtggg agagggagca ccaggagagg gagcccgacg agaccgagga catcaagaag 3000

taatgataac accaagcatg caatggtttt ggccactgac tgaccattgc atgcttggtg 3060

ttattcg 3067

<210> 32

<211> 940

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt gttactgatg 780

agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt ctaacaccaa gcatgcaatg gttttggcca 840

ctgactgacc attgcatgct tggtgttatt ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc 900

gccggctggg caacatgctt cggcatggcg aatgggaccg 940

<210> 33

<211> 944

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt gttactgatg 780

agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt ctaacaccaa gcatgcaatg gttttggcca 840

ctgactgacc attgcatgct tggtgttatt ttttggccgg catggtccca gcctcctcgc 900

tggcgccggc tgggcaacat gcttcggcat ggcgaatggg accg 944

<210> 34

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagc aatgctgatg 780

agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt ccattgcatg cttggtgtta ttcaagagat 840

aacaccaagc atgcaatgtt ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg 900

caacatgctt cggcatggcg aatgggaccg 930

<210> 35

<211> 934

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagc aatgctgatg 780

agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt ccattgcatg cttggtgtta ttcaagagat 840

aacaccaagc atgcaatgtt ttttggccgg catggtccca gcctcctcgc tggcgccggc 900

tgggcaacat gcttcggcat ggcgaatggg accg 934

<210> 36

<211> 940

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaata 840

acaccaagca tgcaatggtc agtcagtggc caaaaccatt gcatgcttgg tgttagacga 900

gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc agtaacaccg 940

<210> 37

<211> 944

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaaa 840

aataacacca agcatgcaat ggtcagtcag tggccaaaac cattgcatgc ttggtgttag 900

acgagcttac tcgtttcgtc ctcacggact catcagtaac accg 944

<210> 38

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

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tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

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tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca 840

ttgcatgctt ggtgttatct cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt 900

ttcgtcctca cggactcatc agcattgccg 930

<210> 39

<211> 934

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaaa 840

aacattgcat gcttggtgtt atctcttgaa taacaccaag catgcaatgg acgagcttac 900

tcgtttcgtc ctcacggact catcagcatt gccg 934

<210> 40

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

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aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccgtcc 840

cattcgccat gccgaagcat gttgcccagc cggcgccagc gaggaggctg ggaccatgcc 900

ggccaacatt gcatgcttgg tgttatctct tgaataacac caagcatgca atggacgagc 960

ttactcgttt cgtcctcacg gactcatcag cattgcgacg agcttactcg tttcgtcctc 1020

acggactcat cagcattgcc g 1041

<210> 41

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc 180

gtcctcacgg actcatcagc attgccg 207

<210> 42

<211> 1090

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca 840

ttgcatgctt ggtgttatct cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt 900

ttcgtcctca cggactcatc agcattgcgt cccattcgcc atgccgaagc atgttgccca 960

gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca ttgcatgctt ggtgttatct 1020

cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc 1080

agcattgccg 1090

<210> 43

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccgtcccat 120

tcgccatgcc gaagcatgtt gcccagccgg cgccagcgag gaggctggga ccatgccggc 180

caacattgca tgcttggtgt tatctcttga ataacaccaa gcatgcaatg gacgagctta 240

ctcgtttcgt cctcacggac tcatcagcat tgccg 275

<210> 44

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc 180

gtcctcacgg actcatcagc attgcatgca acg 213

<210> 45

<211> 1250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca 840

ttgcatgctt ggtgttatct cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt 900

ttcgtcctca cggactcatc agcattgcgt cccattcgcc atgccgaagc atgttgccca 960

gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca ttgcatgctt ggtgttatct 1020

cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc 1080

agcattgcgt cccattcgcc atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc 1140

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caatggacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc agcattgccg 1250

<210> 46

<211> 1570

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca 840

ttgcatgctt ggtgttatct cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt 900

ttcgtcctca cggactcatc agcattgcgt cccattcgcc atgccgaagc atgttgccca 960

gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca ttgcatgctt ggtgttatct 1020

cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc 1080

agcattgcgt cccattcgcc atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc 1140

tgggaccatg ccggccaaca ttgcatgctt ggtgttatct cttgaataac accaagcatg 1200

caatggacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc agcattgcgt cccattcgcc 1260

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca 1320

ttgcatgctt ggtgttatct cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt 1380

ttcgtcctca cggactcatc agcattgcgt cccattcgcc atgccgaagc atgttgccca 1440

gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca ttgcatgctt ggtgttatct 1500

cttgaataac accaagcatg caatggacga gcttactcgt ttcgtcctca cggactcatc 1560

agcattgccg 1570

<210> 47

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gucuuaagcu accaacagc 19

<210> 48

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

augaaguacu gcguauggc 19

<210> 49

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

aaacguuucu uagguaugc 19

<210> 50

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

uuaucacagc cuuucuagg 19

<210> 51

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

uuaauaccga cuuccuugc 19

<210> 52

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

augugagccg uaucaaugc 19

<210> 53

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ugaagcacua ggucggagc 19

<210> 54

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

aacccggguc uauuaaacc 19

<210> 55

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

aaacagcgga aauauuugg 19

<210> 56

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

auggguccca gcacaaggc 19

<210> 57

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

acgucagaua acugugugc 19

<210> 58

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

aaagcaugca uuauguugg 19

<210> 59

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

uaacaccaag caugcaaug 19

<210> 60

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

uauguauguc uuccaucac 19

<210> 61

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

aaaguuaaac ugcuuaggg 19

<210> 62

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

aauuauacag gcuacccgc 19

<210> 63

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

auguucagua uacccuugc 19

<210> 64

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

cuccgaugag ggcucuugc 19

<210> 65

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

aauauaagau caccggugg 19

<210> 66

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

ugauuccauc ugcuugagc 19

<210> 67

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

aacguuguaa gguuaaagg 19

<210> 68

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

uucuaccauu aaucccucc 19

<210> 69

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

aauagaauga aacauggcc 19

<210> 70

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

uuuaugugcu auggacagg 19

<210> 71

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

uuguagccaa cauuagugc 19

<210> 72

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

uuauaaugac auaggcugg 19

<210> 73

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

uuaauagcga ggagucugc 19

<210> 74

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

auauucuuug gcucccagc 19

<210> 75

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

uuggaugcag gcuaugugc 19

<210> 76

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

aauaaccgga uuguaaugc 19

<210> 77

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

uuaagcccuc uuuaauacc 19

<210> 78

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

uugauugaug uuggcgccc 19

<210> 79

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

augauuucag gguccgugc 19

<210> 80

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

uuguauucgg ccacgaucc 19

<210> 81

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

uucaaaggca uuaccaccc 19

<210> 82

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

uuuaaguuua guggcaagg 19

<210> 83

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

uucgagacaa agaucaucc 19

<210> 84

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

aaagugguuc uaguuacgg 19

<210> 85

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

uucaucauca gauuagggc 19

<210> 86

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

auaucaagag ggccugagg 19

<210> 87

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

uucagcaaag uccgguucc 19

<210> 88

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

uugcucucaa gacuuaucc 19

<210> 89

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

auuaagucgu ggcgguugc 19

<210> 90

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

uuauguagga guuguaggc 19

<210> 91

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

uuggugcaug auggauugc 19

<210> 92

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

augaaagucg ccgauuugg 19

<210> 93

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

uuuacgaggu aguugacgc 19

<210> 94

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

uauuaguugc uuaaaccgc 19

<210> 95

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

aagggaacca ugaucuugc 19

<210> 96

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

aagcauuuca gugaacagg 19

<210> 97

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

uuacaaaggg uagaagccc 19

<210> 98

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

uguaagaaga cccguguug 19

<210> 99

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

uuauacaugu cuucgucgg 19

<210> 100

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

uuauaaugga cccucucaa 19

<210> 101

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

uauguccaua aagguuugg 19

<210> 102

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

uaaugucgua ugguauugg 19

<210> 103

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

uucauaggug gguugaucc 19

<210> 104

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

auguugcaua ggagagggc 19

<210> 105

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

uuguuuaccu gcuguuugg 19

<210> 106

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

uuauguccag auacguugc 19

<210> 107

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

auccauugca gagguuugc 19

<210> 108

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

uuguuguauc ccggcucau 19

<210> 109

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

uaguuguugu aucccggcu 19

<210> 110

<211> 964

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatggt gagcaagggc 60

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 120

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 180

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 240

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 300

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 360

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 420

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 480

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 540

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 600

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 660

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 720

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaataagt cccattcgcc 780

atgccgaagc atgttgccca gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccatg ccggccaaca 840

ttgcatgctt ggtgttatct cttgaataac accaagcatg caatgtgcac cagccgggaa 900

tcgaacccgg gtctgtaccg tggcagggta ctattctacc actagaccac tggtgctttg 960

ttcg 964

<210> 111

<211> 748

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacaatgga ccactacctc 60

gacattcgct tgcgaccgga cccggaattt cccccggcgc aactcatgag cgtgctcttc 120

ggcaagctcc accaggccct ggtggcacag ggcggggaca ggatcggcgt gagcttcccc 180

gacctcgacg aaagccgctc ccggctgggc gagcgcctgc gcattcatgc ctcggcggac 240

gaccttcgtg ccctgctcgc ccggccctgg ctggaagggt tgcgggacca tctgcaattc 300

ggagaaccgg cagtcgtgcc tcaccccaca ccgtaccgtc aggtcagtcg ggttcaggcg 360

aaaagcaatc cggaacgcct gcggcggcgg ctcatgcgcc ggcacgatct gagtgaggag 420

gaggctcgga aacgcattcc cgatacggtc gcgagagcct tggacctgcc cttcgtcacg 480

ctacgcagcc agagcaccgg acagcacttc cgtctcttca tccgccacgg gccgttgcag 540

gtgacggcag aggaaggagg attcacctgt tacgggttga gcaaaggagg tttcgttccc 600

tggttctgag tcccattcgc catgccgaag catgttgccc agccggcgcc agcgaggagg 660

ctgggaccat gccggccaac attgcatgct tggtgttatc tcttgaataa caccaagcat 720

gcaatgctgc ctatacggca gtgaaccg 748

<210> 112

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

ttcaagaga 9

<210> 113

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

gttgagccca atacgtcacc 20

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

tctttccagc accgtaccat 20

<210> 115

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

actgccaaac cggaagatct tccca 25

<210> 116

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

gtgaagccac agatg 15

<210> 117

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

gttttggcca ctgactgac 19

<210> 118

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

uucauggaua ucaaugggc 19

<210> 119

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

auaaugaguc ggugucacc 19

<210> 120

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

aaauauagcc cgcaucagc 19

<210> 121

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

aacacuucug cucaaaggg 19

<210> 122

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

aaaucuccag uuacuucgc 19

<210> 123

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

auacgugaag gaaagcugg 19

<210> 124

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

uuaggucaac gaugggagc 19

<210> 125

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

uauuuccucc gacucaagc 19

<210> 126

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

aaaccguacg guuucaagc 19

<210> 127

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

aaaggccaca caggcgugc 19

<210> 128

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

uuucuguuug uuuggaugc 19

<210> 129

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

auuaacauug gccgcucgc 19

<210> 130

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

uucauaacua gaucggugg 19

<210> 131

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

uugaucgucc cacaacggg 19

<210> 132

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

auacgcugcu ugcaguugg 19

<210> 133

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

aagcugcaug gcaguaucc 19

<210> 134

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

aauaugauac cacaugcgg 19

<210> 135

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

aaacucuggg agaaucugg 19

<210> 136

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 136

uugguaagcu guucguugc 19

<210> 137

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 137

uuucguucac gguuguugg 19

<210> 138

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 138

aaauucagac gcaagcugc 19

<210> 139

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 139

uugacuggcu gugcucugg 19

<210> 140

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 140

aauucguaua caagcucgg 19

<210> 141

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 141

uugacaagua aagcauggc 19

<210> 142

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 142

cuugauugug cuuuaaagc 19

<210> 143

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 143

auaggcucuc cuguggcgg 19

<210> 144

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 144

uuaacauauc auggacagg 19

<210> 145

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 145

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gcccattgca 120

tgcttggtgt tagacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagt aacaccg 177

<210> 146

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 146

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gcccattgca 120

tgcttggtgt tagacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagt aacaccaagc 180

atgccg 186

<210> 147

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 147

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatacatc tgtggcttca ctataacacc aagcatgcaa tgacgagctt 180

actcgtttcg tcctcacgga ctcatcagat tgcacg 216

<210> 148

<211> 217

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 148

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaataaca 120

ccaagcatgc aatggtcagt cagtggccaa aaccattgca tgcttggtgt tagacgagct 180

tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagt aacaccg 217

<210> 149

<211> 221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 149

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaaaaaat 120

aacaccaagc atgcaatggt cagtcagtgg ccaaaaccat tgcatgcttg gtgttagacg 180

agcttactcg tttcgtcctc acggactcat cagtaacacc g 221

<210> 150

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 150

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc 180

gtcctcacgg actcatcagc attgccg 207

<210> 151

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 151

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaaaaaac 120

attgcatgct tggtgttatc tcttgaataa caccaagcat gcaatggacg agcttactcg 180

tttcgtcctc acggactcat cagcattgcc g 211

<210> 152

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 152

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc 180

gtcctcacgg actcatcagc attgcgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc 240

ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg catgcttggt gttatctctt 300

gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagc 360

attgccg 367

<210> 153

<211> 527

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 153

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc 180

gtcctcacgg actcatcagc attgcgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc 240

ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg catgcttggt gttatctctt 300

gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagc 360

attgcgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg 420

gaccatgccg gccaacattg catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa 480

tggacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagc attgccg 527

<210> 154

<211> 847

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 154

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc 180

gtcctcacgg actcatcagc attgcgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc 240

ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg catgcttggt gttatctctt 300

gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagc 360

attgcgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg 420

gaccatgccg gccaacattg catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa 480

tggacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagc attgcgtccc attcgccatg 540

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 600

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc 660

gtcctcacgg actcatcagc attgcgtccc attcgccatg ccgaagcatg ttgcccagcc 720

ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg catgcttggt gttatctctt 780

gaataacacc aagcatgcaa tggacgagct tactcgtttc gtcctcacgg actcatcagc 840

attgccg 847

<210> 155

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 155

tgatggttcc gtggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaacagtccc attcgccatg 60

ccgaagcatg ttgcccagcc ggcgccagcg aggaggctgg gaccatgccg gccaacattg 120

catgcttggt gttatctctt gaataacacc aagcatgcaa tgtgcaccag ccgggaatcg 180

aacccgggtc tgtaccgtgg cagggtacta ttctaccact agaccactgg tgctttgttc 240

g 241

<210> 156

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 156

tgcaccagcc gggaatcgaa cccgggtctg taccgtggca gggtactatt ctaccactag 60

accactggtg ctttgtt 77

<210> 157

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 157

atggaccact acctcgacat tcgcttgcga ccggacccgg aatttccccc ggcgcaactc 60

atgagcgtgc tcttcggcaa gctccaccag gccctggtgg cacagggcgg ggacaggatc 120

ggcgtgagct tccccgacct cgacgaaagc cgctcccggc tgggcgagcg cctgcgcatt 180

catgcctcgg cggacgacct tcgtgccctg ctcgcccggc cctggctgga agggttgcgg 240

gaccatctgc aattcggaga accggcagtc gtgcctcacc ccacaccgta ccgtcaggtc 300

agtcgggttc aggcgaaaag caatccggaa cgcctgcggc ggcggctcat gcgccggcac 360

gatctgagtg aggaggaggc tcggaaacgc attcccgata cggtcgcgag agccttggac 420

ctgcccttcg tcacgctacg cagccagagc accggacagc acttccgtct cttcatccgc 480

cacgggccgt tgcaggtgac ggcagaggaa ggaggattca cctgttacgg gttgagcaaa 540

ggaggtttcg ttccctggtt ctga 564

<210> 158

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 158

ctgcctatac ggcagtgaac 20

<210> 159

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 159

ttgaacca 8

<210> 160

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 160

taaccat 7

<210> 161

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 161

ttgacca 7

<210> 162

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 162

attagcctgt c 11

<210> 163

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 163

tttaacca 8

<210> 164

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 164

taacca 6

Claims (29)

1.一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：使用细胞质RNA病毒作为载体，在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，其中所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶，或它们中的两种或两种以上的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在干扰RNA序列两端插入不同的核酶；优选在干扰RNA序列两端分别插入丁型肝炎病毒(HDV)核酶和锤头型(HH)核酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA、或csy4识别位点，或它们中两种的组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞质RNA病毒选自猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、麻疹病毒、流感病毒、非洲猪瘟病毒、新冠病毒、猪流感病毒、经典猪瘟病毒、新城疫病毒；优选猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、麻疹病毒、流感病毒。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：所述干扰RNA序列插入到细胞质RNA病毒基因组上。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

1)根据不同的适应症选择不同的靶基因；

2)根据靶基因序列设计干扰RNA序列，化学合成siRNA oligo，体外验证siRNA oligo对靶基因的干扰活性；

3)根据siRNA序列设计shRNA序列；

4)在siRNA序列或shRNA序列一端或两端插入核酶；然后将所得RNA序列对应的DNA序列构建到细胞质RNA病毒表达载体；其中，

当在siRNA序列或shRNA序列一端插入核酶时，在其另一端优选插入tRNA或csy4识别位点；

进一步优选在siRNA序列或shRNA序列两端均插入核酶；

5)通过病毒拯救获得重组活病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中体外验证siRNA oligo对靶基因的干扰活性进一步包括：化学合成靶基因，通过PCR方法在靶基因上下游引物分别加上酶切位点及保护碱基，之后双酶切PCR片段和载体，连接后获得带有目的基因的载体。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：步骤2)中针对每个靶基因设计干扰RNA序列，在干扰序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链，在此干扰序列的互补序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，化学合成oligo。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤2)进一步包括以下步骤：

(2-1)293T细胞在培养基中培养至80-90％融合时，倾去培养液，PBS洗涤细胞；

(2-2)加Trypsin-EDTA溶液,混匀后，吸去胰酶溶液，37℃放置；

(2-3)加入完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；

(2-4)血球计数板计数，按照每孔约1×10⁵的细胞量接种于24孔板；

(2-5)每1OD260 oligo用DEPC-H₂O溶解，终浓度约为20μM；

(2-6)Lipo2000的转染方法：每组三个重复孔的转染方法：在EP管中加入Opti-MEM I，再加入靶基因质粒，以及相对应的oligo，混匀；在另一EP管中加入Opti-MEM I，以及转染试剂lipo2000，混匀，静置后将两者混匀，室温静置；

(2-7)期间将前一天铺好的24孔板中培养基移除，加入培养基；静置后，将转染混合物分别加入到以上的24孔板中，100μl/孔，设3重复，将孔板摇匀，在培养箱中温育6小时；

(2-8)移除转染液，用PBS漂洗后，加入培养基继续培养；

(2-9)在转染24h后收取细胞，做双荧光素酶检测。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤3)进一步包括：以siRNA互补序列作为正义链，使用shRNA常用的loop环(TTCAAGAGA)、mir30 loop环序列(GTGAAGCCACAGATG)、或mir155loop环序列(GTTTTGGCCACTGACTGAC)，siRNA序列作为反义链，3’末端添加两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤4)进一步包括：合成(A-B-C)_n基因片段；

其中所述n为1-5之间的整数；

所述A或C分别独立地选自具有RNA切割活性的RNA序列或被RNA酶所识别的特征RNA序列，其中A和C不同时为被RNA酶所识别的特征RNA序列；

所述B为干扰RNA；

优选所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶；

优选所述被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA、或csy4识别位点；

优选所述干扰RNA选自siRNA或shRNA或它们的组合；

优选所述(A-B-C)_n基因片段选自HDV-siRNA–HH、HDV-siRNA-HHL、(HDV-shRNA-HH)n、HDV-shRNAL-HH、HDV-HDV-shRNA-HH-HH、HDV-HDV-shRNA-HH、HDV-shRNA-HHL、HDV-shRNA-tRNA或Csy4(外源性酶)-HDV-shRNA-csy4(识别位点)等基因片段；

通过在PCR引物序列两端添加TRS(转录调控序列)和酶切位点，利用该引物扩增(A-B-C)_n基因片段，酶切PCR产物，连接到相同酶切的表达载体，获得两端带有核酶，或一端带有核酶而另一端带有tRNA或csy4识别位点的siRNA片段或shRNA片段的病毒表达载体。

13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤5)进一步包括：

(5-1)将状态良好的细胞铺6孔板，铺板的密度5×10⁵个/ml，每孔2ml细胞，放置37℃CO₂培养箱中培养24h；

(5-2)待细胞融合度达到约80％左右，将上清培养基弃去，用PBS洗涤两遍，加入含有3％FBS的DMEM维持液；

(5-3)根据细胞与质粒选择合适的转染试剂，根据转染试剂说明书分别将两端带有核酶、或一端带有核酶而另一端带tRNA或csy4识别位点的siRNA片段或shRNA片段的细胞质RNA病毒表达载体和RFP-靶基因病毒表达载体进行转染，转染96h后观察细胞形态的改变，例如有空泡等病变，记为P0代；

(5-4)将P0代病毒液以感染复数为0.1的感染量继续感染重新铺板的细胞，接毒72h后将细胞放入-20℃冰箱进行反复冻融三次，800g离心5min得到的病毒液记为P1代病毒；

(5-5)再将P1代病毒按照(5-4)方法进行传代依次传至P3代，将含有P3代病毒的细胞放入-20℃冰箱进行反复冻融三次，800g离心5min得到的P3代病毒保存至-80℃冰箱中备用。

14.根据权利要求1～13任一所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：所述细胞质RNA病毒为PRRSV，所述干扰RNA为非洲猪瘟病毒的干扰RNA，

构建如下干扰RNA表达框架：a)在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列；b)然后步骤a)所得干扰RNA与TRS(转录调控序列)结合；或者再进一步在干扰RNA与TRS之间插入EGFP或Csy4外源性酶，或它们两者的组合；

所述干扰RNA表达框架插入到PRRSV病毒基因组的负链上。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述具有RNA切割活性的RNA序列选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、窦状芽孢杆菌glmS核酶中的一种或多种；优选在干扰RNA两端插入不同种的核酶；进一步优选在干扰RNA两端分别插入丁型肝炎病毒核酶和锤头型核酶。

16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述干扰RNA的形式为siRNA(小干扰RNA)、saiRNA(可被Ago2识别加工的RNA序列)、G1、D1、D1L、shRNA(短发夹RNA)、shRNAL，优选siRNA、shRNA，最佳shRNA。

17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述干扰RNA的靶基因选自非洲猪瘟病毒的如下基因：O174L、EP296R、E165R、K196R、EP152R、CP204L、A240L、MGF360-9L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-18R、MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、S273R、CP530R、B646L、NP419L、G1211R、F1055L、NP1450L、EP1242L、I243L、D250R、P1192R、M448R、或pA104R。

18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述干扰RNA具有SEQ ID NO:47～SEQID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQ ID NO:144中任一所示的序列，优选SEQ ID NO:48、SEQID NO:51、SEQ ID NO:53～SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74～SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:118～SEQ ID NO:122、或SEQ ID NO:124～SEQ ID NO:144中任一所示的序列。

19.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法中的干扰RNA表达框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-EGFP-HDV-siRNA–HH；TRS6-EGFP-HDV-siRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-G1-HH；TRS6-EGFP–HH-shRNA-HDV；TRS6-EGFP–HH-shRNAL-HDV；TRS6-EGFP-HDV-D1-HH；TRS6-EGFP-HDV-D1L-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6-EGFP-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6–HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6–HDV-HDV-shRNA-HH；TRS6–HDV-shRNA-HHL；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA–HH)*5；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-tRNA；或TRS6-Csy4(外源性酶)-HDV-shRNA-csy4(识别位点)，优选TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNAL-HH；TRS6–HDV-shRNA-HHL；TRS6 HDV-shRNA-HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA HH；TRS6-EGFP-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA HH-HDV-shRNA HH；TRS6-EGFP-(HDV-shRNA HH)*5，最佳TRS6–HDV-shRNA-HHL。

20.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34～SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111；优选SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46，最佳SEQ ID NO:44。

21.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法中的干扰RNA表达框架选自具有如下序列特征的序列：TRS6-HDV-siRNA–HH；TRS6-HDV-siRNA-HHL；TRS6-HDV-G1-HH；TRS6-HDV-D1-HH；TRS6-HDV-D1L-HH；TRS6-HDV-shRNAL-HH；TRS6-HDV-HDV-shRNA-HH-HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-HDV-shRNA-HH-HDV-shRNA–HH-HDV-shRNA–HH；TRS6-(HDV-shRNA–HH)*5；或TRS6-HDV-shRNA-tRNA，优选TRS6-(HDV-shRNA–HH)*5。

22.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法中的干扰RNA表达框架的序列是由选自如下任一所示的序列转录后获得的：SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:155；优选SEQID NO:154。

23.权利要求14～22任一所述的方法制备得到的干扰RNA-PRRSV病毒在制备治疗或预防非洲猪瘟的药物中的应用。

24.权利要求1～13任一所述的方法制备得到的干扰RNA-细胞质RNA病毒在制备抗病毒药物、干扰RNA药物中的应用。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述干扰RNA选自非洲猪瘟病毒、流感病毒、麻疹病毒、新冠病毒、猪流感病毒、经典猪瘟病毒、新城疫病毒；优选非洲猪瘟病毒、流感病毒、新冠病毒的干扰RNA。

26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗病毒药物包括抗非洲猪瘟病毒、抗流感病毒、抗麻疹病毒、抗新冠病毒、抗猪流感病毒、抗经典猪瘟病毒、抗新城疫病毒的药物；优选抗非洲猪瘟病毒、流感病毒、新冠病毒的药物。

27.一种用于治疗或预防非洲猪瘟的干扰RNA-PRRSV病毒药物，其特征在于，根据权利要求14～22任一所述的方法制备得到。

28.一种抗病毒药物或干扰RNA药物，其特征在于，根据权利要求1～13任一所述的方法制备得到。

29.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求27-28任一所述的药物。

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