JP5852959B2 - 汎用的抗癌薬及びワクチンを設計及び開発する方法 - Google Patents
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Description
図を参考しながら本発明の特定の具体的実施形態を説明するが、これらの具体的実施形態は例示に過ぎず、本発明の原理の応用を代表する例であることを理解すべきである。当技術分野を熟知しているものであれば、簡単に種々の変更や修飾ができるので、これらの変更や修飾は特許請求の範囲に含むと見なすべきである。
我々の過去の研究では、ヒト黒色腫細胞Colo−829及び前立腺癌細胞PC3において、mir−302発現の増加はこれらの悪性癌細胞をhES様の多能性の(pluripotent)状態に再プログラムができることを示した(Lin氏ら, 2008)。体細胞の再プログラム(SCR)の過程において、mir−302が98%より多くの(>98%)癌細胞のアポトーシスを引き起こすとともに、さらに、残りの(<2%)再プログラム細胞の増殖速度を大幅に低減した。確かにこれらの特性は癌治療に有益だが、mir−302が正常ヒト細胞における機能はまだ確実ではない。その効果を評価するために、我々は誘導性pTet−On−tTs−miR302s発現ベクターを正常ヒト毛嚢細胞(hHFCs)中に導入させた。hHFCsを選んだ理由は、量が十分で、到達性を有し、且つ成長が速いことにある。我々は、ドキシサイクリン(Dox)の濃度が10μMまで増加することにつれ、ドキシサイクリン濃度が7.5μMより濃い(>7.5μM)(図1D、実施例5)閾値において、コア再プログラム因子(core reprogramming factors)Oct4−Sox2−Nanogが一斉に促進されるとともに、増殖性の細胞クラスターが70%減少し、即ち、本来の37%±2%から11%±2%まで減少した(図1E、M期、実施例7)ことを観察できた。それに応じて、休眠細胞クラスターが41%増加し、即ち、本来の56%±3%から79%±5%までに増加し(図1E、G0/G1期、実施例7)、我々が以前、mir−302によって再プログラムされた多能性幹細胞(mir−302−reprogrammed pluripotent stem cells)において発見された(mirPS cells,Lin氏ら,2008)強力な抗増殖作用と相似することを示唆した。しかし、mir−302により再プログラムされたhHFC細胞(mirPS−hHFC)はアポトーシスを測定できるDNAラダーリング(DNA laddering)又は細胞死のいずれの徴候も示さない(図1F、実施例6)ことから、腫瘍/癌細胞と比較して、正常細胞のほうがよりmir−302による抗増殖作用を耐えられることを示した。腫瘍/癌細胞はその旺盛な新陳代謝及び急速な成長拡張に伴い、このような休眠状態における生存が極めて困難となると考えられる。
mir−302は癌細胞のアポトーシス及び細胞周期の減衰を引き起こす機能を有することに鑑みて、我々は引き続きmir−302を汎用性ヒト腫瘍/癌細胞の治療薬として使用する可能性を検討した。我々の過去の研究では、黒色腫(melanoma)と前立腺癌細胞における可能性を既に示したが(Lin氏ら,2008)、現行の研究で、乳癌細胞MCF7、肝癌細胞Hep G2、及び胚性奇形腫細胞NTera−2における可能性を更に試した。図6A−Bに示すように、3種類の腫瘍/癌細胞はpTet−On−tTS−miR302sベクターによって形質移入され、且つ、10μMドキシサイクリンの刺激下で、全てが休眠mirPS細胞に再プログラムされ、且つ、胚性体様コロニー(embryoid body−like colonoes)を形成した。3種類の腫瘍/癌細胞の全てにおいて、該濃度水準のmir−302は顕著なアポトーシスも引き起こした(>95%)(図1F、実施例6)。更に、フローサイトメトリーによって、細胞周期の各時期のDNA含量を分析した結果、全てのmirPS細胞中の有糸分裂細胞集団が著しく減少したことを示した(図6C、実施例7)。有糸分裂細胞集団(M期)は、mirPS−MCF7細胞中では49%±3%から11%±2%まで78%低減し、mirPS−HepG2細胞中では46%±4%から17%±2%まで63%低減し、mirPS−NTera2細胞中では50%±6%から19%±4%まで62%低減した。一方、休止/休眠の細胞集団(G0/G1期)は、mirPS−MCF7細胞、mirPS−HepG2細胞及びmirPS−NTera2細胞では、それぞれ80%、65%及び72%増加し、mirPS−MCF7細胞では41%±4%から74%±5%まで、mirPS−HepG2細胞では、43%±3%から71%±4%まで、またmirPS−NTera2細胞では、40%±7%から69%±8%まで増加した。これらの結果は、mir−302がこれらの腫瘍/癌細胞の速い細胞周期速度を有効的に低減し、顕著なアポトーシスを誘発することができたことを示唆している。
mir−302とその標的となるG1チェックポイント調節因子との間の実際の相互作用を確認するために、我々は3’末端非翻訳領域のルシフェラーゼレポーター(luciferase 3’UTR region reporter)アッセイを行った(図7A、実施例15)。その結果、種々の濃度のmir−302による処理は、サイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)、サイクリンD1/D2(cyclins−D1/D2)とBMI−1 ポリコームリングフィンガー発癌遺伝子(BMI1 polycomb ring finger oncogene)を含む標的となるG1チェックポイント調節因子に対して、大く異なる抑制効果を引き起こすこととなった。10μMドキシサイクリンの存在下で、mir−302はCDK2、cyclins D1/D2、及びBMI−1転写物の標的部位に効果的に結合し、80%より多く(>80%)のレポータールシフェラーゼの発現をサイレンシングすることに成功した(図7B、実施例15)。mirPS細胞中で真の標的遺伝子に対するmir−302の抑制効果をウェスタンブロット分析法によって確認した結果は、3’末端非翻訳領域のルシフェラーゼレポーターアッセイ(図7C、実施例5)による結果と一致する。これに反して、5μMのドキシサイクリンにより誘導されるmir−302の比較的少量の発現では、レポーター遺伝子の標的部位、又はサイクリンD2以外の標的となるG1チェックポイント調節因子のいずれに対しても顕著なサイレンシング効果を誘発できない(図7B及び7D)。これはmir−302が現れた用量依存性(dose−dependent manner)及びmir−302が用量依存性に基づいて細胞周期の速度を微調整する能力を示している。ほ乳類動物の細胞周期では、G1−S期の移行は通常、代償性の2つのサイクリン−サイクリン依存性キナーゼ複合体(cyclin−CDK complexes)であるcyclin−D−CDK4/6及びcyclin−E−CDK2によって制御される(Berthet氏ら,2006)。そこで、我々は、高濃度のmir−302がCDK2及びcyclins D1/D2の共抑制を通じて両複合体を失活させることで、G1−S期移行を制御する2つの経路を阻害するとともに、再プログラムされたmirPSの細胞周期速度を低下することを発見した。hHFCs及びmirPS細胞において、cyclin D3の有限な発現量は、mirPS細胞におけるcyclins D1/D2損失の代償に及ばない。
我々は、mir−302の腫瘍抑制機能及びその正常と腫瘍/癌細胞との間における異なる作用を確認した後、8週齢の雄性胸腺欠損マウス(BALB/c−nu/nu 種)のインビボNTera2由来の奇形腫を治療する薬物としてmir−302が使用可能か否かの試験を行った(実施例13)。腫瘍Tera−2細胞株(neoplastic Tera−2、NTera−2)は多能性ヒト胚性奇形腫細胞株(human embryonal teratocarcinoma cell line)であって、特に、原始的腺組織及び原始的神経組織のようなインビボで多種の原始的体細胞組織(primitive somatic tissue)に分化することができる(Andrews氏ら,1984)。その多能性のため、NTera−2由来の奇形腫はインビボでの種々の腫瘍を治療するモデルになることができる。薬剤の投与において、インサイチュー(in situ)注射によってポリエチレンイミン(polyethylenimine、PEI)で調製されたpCMV−miR302s発現ベクターを腫瘍にできるだけ近い部位に注射した。pCMV−miR302sベクターはテトラサイクリン応答要素により制御される(TRE−controlled)CMVプロモーターを一般のCMVプロモーターに変えることで構成させたが(実施例2)、DNAメチル化のため、pCMV−miR302sのヒト細胞における発現は1ヶ月くらい期間に続く。上限値の10μg/マウス体重(g)(一回の注射の最大量)のpCMV−miR302sベクターを注射した後、マウスに疾患又は悪液質(cachexia)の徴候が観察されなかったため、この方法の安全性が証明された。組織学的検査においても、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、及び脾臓に組織損傷(lesion)が検出されなかったことが示された。
人工誘導多能性幹細胞(iPS)には老化を加速し、拡張を制限する可能性があるという問題が報告された(Banito氏ら,2009;Feng氏ら,2010)。正常の成熟細胞は、有限回数の分裂を行い、最終的に複製老化(replecative senescence)と呼ばれる静止状態(quiescence state)に至る。複製老化を回避した細胞は大抵腫瘍/癌細胞のような不死化細胞(immortal cells)となるため、複製老化は腫瘍/癌細胞の形成に対抗する正常な防御機構である。本発明では、我々は、mir−302はBMI−1を直接サイレンシングすることによって、p16Ink4a/p14ART関連の細胞周期調節を引き起こすことができることを発見した。他の研究では、BMI−1によってヒトテロメラーゼ逆転写酵素(human telomerase reverse transcriptase、hTERT)の転写作用が活性化され、テロメラーゼの活性化が高められることによって複製老化が回避されて、細胞寿命が増長されるとのことが更に指摘された(Dimri氏ら,2002)。このことから、mir−302の過剰発現はmirPS細胞のhTERT随伴性老化(hTERT−associated senescence)を引き起こすことが分かる。これを解明するために、我々はテロメアリピート増幅プロトコル法(telomeric repeat amplification protocol、TRAP)(実施例16)を用いて、テロメラーゼの活性を測定した。図9Aに示すように、10μMのドキシサイクリンで処理した全てのmirPS細胞は、意外にもその本来の腫瘍/癌細胞及びH1/H9細胞に相似し、強烈なテロメラーゼ活性を示した。また、ウエスタンブロック分析は、これらmirPS細胞において、hTERTの発現は減少ではなく、増加したことが示された(図9B)。テロメラーゼPCR ELISA試験によって、テロメラーゼの相対活性が増加したことが証明された(図9C)。更に、我々はmirPS細胞中のリジン特異的ヒストンデメチラーゼ(lysine−specific histone demethylase AOF2、又はKDM1/LSD1とも言う)及びヒストンデアセチラーゼ(histone deacetylase HDAC2)のサイレンシングも検出できた(図9B)。hTERT転写の抑制にAOF2が必要であり、AOF2とHDAC2の両者の欠乏がhTERTの過剰発現を引き起こすことは過去の研究で指摘された(Won氏ら,2002;Zhu氏ら,2008)。我々はまた、本発明において、AOF2とHDAC2はmir−302の強い標的であり、且つmirPS細胞中ではいずれもサイレンシングされたことを発見した(図10)。そのため、mirPS細胞中では、mir−302は実際に、hTERT随伴性老化を誘発するのではなく、mirPS細胞のテロメラーゼの活性を増強させる。しかしながら、hTERT活性増大の効果はmir−302により引き起こされたBMI−1の抑制とp16Ink4a/p14ARFの活性化で中和され、mir−302細胞中で腫瘍/癌細胞の形成を防ぐバランスに達している。
本発明をより理解しやすくするために、下記のように、幾つかの用語を定義する。
ヌクレオチド:糖成分(五炭糖、pentose)、リン酸基(phosphate)及び窒素複素環塩基(nitrogenous heteroyclic base)を含み、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)の単量体単位である。該塩基はグリコシド連結した炭素(glycosidic carbon、該五炭糖の1’炭素)によって該糖成分と結合し、該塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。該五炭糖の3’又は5’の位置に少なくとも1つのリン酸基が結合しているヌクレオシドはヌクレオチドである。
ヌクレオチド類似体:プリン又はピリミジンヌクレオチドであって、構造において、A(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)、C(シトシン)又はU(ウラシル)ヌクレオチドは異なるが、十分に類似しており、核酸分子中で通常のヌクレオチドと置換できる。
遺伝子:核酸であって、そのヌクレオチド配列はRNA及び/又はポリペプチド(タンパク質)のためにコードする。遺伝子はRNA又はDNAである。
センス核酸:配列順及び組成が相同なmRNAと同じ核酸分子である。「+」、「s」又は「sense」の符号で該センス核酸構造を示す。
保存性(Conserved):ヌクレオチド配列が予めて選択された配列(参照配列)に精確に相補するものと非無作為的にハイブリダイゼーションする場合、このヌクレオチド配列はこの予めて選択された配列の間に保存性を有する。
相補的ヌクレオチド配列:1本鎖分子のDNA又はRNAにおけるヌクレオチド配列がもう一方の1本鎖のヌクレオチド配列と十分に相補しており、水素結合によって、2本鎖間で特異的にハイブリダイゼーションする。
マイクロRNA(Micro RNA、miRNA):該マイクロRNA(miRNA)に部分的に相補な標的遺伝子転写物に結合できる1本鎖RNAである。MiRNAは通常長さが約17〜27個のオリゴヌクレオチドで、該miRNAとその標的mRNAとの相補性によって、細胞内のmRNA標的を直接分解するか、又はその標的mRNAのタンパク質翻訳を抑制する。天然のmiRNAはほぼ全ての真核細胞で発見され、その役割はウィルス感染に対抗する防御物のようなものであるとともに、動植物の発育期間における遺伝子発現を制御するものとして機能している。
プロモーター:ポリメラーゼ分子により認識され(おそらく結合し)、合成を誘発する核酸である。本発明の目的に対して、プロモーターは、既知のポリメラーゼ結合部位、エンハンサーとその類似物、又は必要なポリメラーゼを用いて合成を誘発する如何なる配列であってもよい。
RNA一次転写物:リボヌクレオチド配列であって、メッセンジャーRNA(mRNA)、ヘテロ核RNA(hnRNA)、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、マイクロRNA前駆体(pre−microRNA)、ウィルスRNA(viral RNA)、及びその前駆体と誘導体から選ばれる。
癌組織(Cancerous Tissue):皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、脳腫瘍/癌、リンパ癌、白血病及びこれらの組み合わせから選ばれる腫瘍組織である。
本発明は組換え核酸組成物を使用する設計と方法に関する。該組換え核酸組成物は標的ヒト細胞に送達され、mir−302様遺伝子サイレンシングエフェクターに転写及びプロセシングされ、細胞におけるmir−302の標的細胞周期調節因子及び発癌遺伝子の特定遺伝子のサイレンシング効果を誘発する。下記の手順を含む。
b)該組換え核酸組成物で細胞基質を処理する工程。
a)必要な機能をもつ遺伝子転写物を形成するように連結可能な複数のエクソンと;
b)組換えmir−302相同体を含み、細胞内RNAスプライシング及びプロセシング機構によって切断されることでエクソンから切り離し可能な少なくとも1つイントロンと;
を更に含む。
a)スプライセオソーム結合のための5’末端供与スプライス部位と;
b)該mir−302ファミリーメンバーと相同な遺伝子サイレンシングエフェクターインサートと;
c)スプライセオソーム認識のための分岐点モチーフと;
d)スプライセオソーム相互作用のためのポリピリミジントラクトと;
e)スプライセオソーム結合のための3’受容スプライス部位と;
f)5’から3’の方向に上記各成分のそれぞれを連結する複数のリンカーと;
を更に含む。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい具体的実施例と形態を示すものであるが、本発明の範囲を制限するものではない。
ヒト癌細胞株NTera−2、HepG2、MCF7、PC3及びColo829はアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC、Rockville、MD)から入手し、ヒト毛嚢細胞(hHFCs)は、少なくとも2つの毛嚢真皮乳頭(hair dermal papillae)を4mg/mlのコラゲナーゼで分解することによって得られ、そのうち、コラゲナーゼの消化は、20%胎児ウシ血清(FBS)が補充されている新鮮なRPMI 1640培養液中で45分作用させた。メラニン細胞(melanocytes)は、37℃、5%CO2で、ヒトメラニン細胞成長補充剤−2(HMGS−2、Invitrogen、Carlsbad、CA)が添加されており、抗生物質が含まれていない254培養液(Medium 254)中で培養された。細胞が70%〜80%の密集度(confluency)までに成長した時に、細胞をtrypsin−EDTA溶液中で1分間暴露することで単離させ、フェノールレッドフリーのDMEM培養液(phenol red−free DMEM medium、Invitrogen)で1回すすいだ後、これらの単離された細胞を1:10に希釈し、HMGS−2補助剤を含有する新鮮な254培養液中で培養し続けた。電気穿孔法で遺伝子形質移入を行う工程については、pTet−On−tTS−miR302sベクター(10μg)とpTet−On−Adv−Neo(−)ベクター(50μg)の混合物を、低浸透圧緩衝溶液(200μl、Eppendorf、Westbury、NY)における単離された細胞(20,000〜50,000個)中に投入し、また、電気穿孔は電気穿孔機を用いて、300〜400Vで150μsec実施し、これらのベクターを相応な細胞内に送達した。電気穿孔を経た細胞はまずフェノールレッドフリーで、20%ノックアウト血清(Knockout serum)、1%MEM非必須アミノ酸、10ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、1mM GlutaMax及び1mMピルビン酸ナトリウムを含有するDMEM培養液(Invitrogen)中で、37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した。続いて、850μg/mlのG418及び3.75μg/mlより高い濃度のドキシサイクリン(Dox)を追加し、毎日入れ替えるように、細胞が強烈の赤色蛍光(RGFP)を発現するまで3から5日間継続した。次に、TE200倒立顕微鏡システム(Nikon、Melville、NY)で個々の赤色蛍光細胞(mirPS)を監視し、MO−188NE 3D顕微操作装置(Nikon)で96穴プレートに個別的に収集した。ドキシサイクリン(Dox)欠乏条件下で、20%ノックアウト血清(Knockout serum)、1%MEM非必須アミノ酸、100μMのβ−メルカプトエタノール、1mMのGlutaMax、1mMのピルビン酸ナトリウム、10 ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、100 IU/mlのペニシリン/100μg/mlのステレプトマイシン/250μg/mlのG418、0.1μMのA83−01及び0.1μMのバルプロ酸(Stemgent、San Diego、CA)を含有するDMEM/F−12培地でmirPS細胞を37℃、5%CO2の条件下で培養した。一方、ドキシサイクリン(Dox、3.75〜5μg/ml、Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)存在下で、mirPS細胞を同様なフィーダーフリー(feeder−free)の培養条件下で培養し、更に0.05μMのGSK抑制剤SB216763(Stemgent)を添加した。GSK抑制剤の添加はmirPSの増殖を促進したが、神経分化を引き起こす傾向がわずかに見られた。神経細胞誘導の面では、mirPS細胞を0.05μM SB216763を含有し、ドキシサイクリン(Dox)を含有しない上記フィードフリー層の培養条件で培養する。
Mir−302ファミリークラスター(mir−302s)の生成は前記の通りである(Lin氏ら、2008)。Mir−302sクラスターは、mir−302a、mir−302b、mir−302c、及びmir−302dのマイクロRNA前駆体(pre−miRNAs)という4つの部分を含有する。mir−302sクラスターを構築するために使用される合成オリゴヌクレオチド(Sigma−Genosys,St.Louis,MO)は下記のように挙げられる。発現ベクターの構成において、我々は等量(1:1)のmir−302sと予め作られたSpRNAi−RGFP組換え遺伝子を混合させ(Lin氏ら,2006と2008)、そしてMluI/PvuI制限酵素によって37℃でこの混合物を4時間消化させた。次に、ゲル抽出フィルター(Qiagen、CA)で該消化された混合物を純化させるとともに、30μlの再蒸留水(ddH2O)に収集し、T4DNAリガーゼ(T4 ligase)を用いて8℃で16時間作用し、該混合物をライゲーションさせた。該工程では、mir−302を発現する組換えSpRNAi−RGFP遺伝子が形成され、更にXhoI/HindIII制限酵素によって切断された後、ドキシサイクリンにより誘導できるpSingle−tTS−shRNAベクター(Clontech、Palo Alto、CA)中に挿入されたことで、誘導性のpTet−On−tTS−miR302s発現ベクターが形成された。その後、我々はpTet−On−tTS−miR302sベクターを更に修正し、即ち、pTRE−Tightプラスミド(Clontech)から単離されたTRE−CMVプロモーターを用いて、pTEt−On−tTS−miR302sベクター本来のU6プロモーターを置換した。非誘導性のpCMV−miR302sの持続的発現ベクターを生成するために、我々はEcoRI制限酵素で該修飾したpTEt−On−tTS−miR302sベクターを切断し、ゲル電気泳動によりtTS−TREの上流配列(1.5kb)を除去するとともに、切断されたベクターを改めて該ゲルから得ることによって、DNAライゲーション工程を行い、非誘導性のpCMV−miR302sベクターの構築を完成させた。
細胞密集度70%で、mirVanaTMマイクロRNA単離キット(mirVanaTM miRNA isolation kit、Ambion)を用いて、各細胞培養物から小型RNAsを単離した。単離した小型RNAsの純度と含量を1%ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動及び分光光度計の測定(Bio−Rad)によって評価した後、直ちにドライアイスで凍結させ、RNAマイクロアレイ分析を行うためにLCSciences社(San Diego、CA)に送付した。各マイクロアレイチップは、それぞれCy3もしくはCy5で標識した単一のサンプルとハイブリダイゼーションされ、又はCy3及びCy5で標識した1対のサンプルとハイブリダイゼーションされた。次に、バックグラウンドの差し引き(background subtraction)及び正規化(normalization)を行った。二重分析において、p値を算出し、3倍より大きな差で発現した転写物を一覧表に示した。その結果は図1Cに示す。
mirVanaTMマイクロRNA単離キット(Ambion、Austin、TX)で全RNAs(10μg)を単離した後、15%のTBE−ウレアポリアクリルアミドゲル又は3.5%の低融点アガロース電気泳動によって該全RNAsを分画し、該分画された全RNAsを電気ブロッティングによってナイロンメンブラン(nylon membrane)上に移した。続いて、[LNA]−DNAプローブ(5’−[TCACTGAAAC]ATGGAAGCAC TTA−3’)(SEQ.ID.NO.19)でmir−302を検出した。その他の遺伝子を検出するプローブは更に合成され、その配列は表1に示す。全てのプローブは高速液体クロマトグラフィー法(HPLC)によって精製し、且つ[32P]−dATP(>3000 Ci/mM、Amersham International、Arlington Heights,IL)存在下で、末端転移酵素(terminal transferase、20 units)で末端標識を行った。ハイブリダイゼーションは、50%の新鮮な脱イオンホルムアミド(freshly deionized formamide、pH7.0)、5倍デンハート液、0.5%SDS、4倍SSPE、及び250mg/mLの変性サケ精子DNA断片の混合液中にて実施した(18時間、42℃)。次に、メンブランを2倍SSC、0.1%のSDSで連続2回洗浄し(15分間、25℃)、0.2倍SSC、0.1%のSDSで1回洗浄し(45分間、37℃)、そして、オートラジオグラフィーを実施した。その結果を、図1D、図4A及び8Bに示す。
製造元の提案に基づき、プロテアーゼ抑制剤(protease inhibitor)、ロイペプチン(Leupeptin)、TLCK、TAME及びPMSFを補充したCelLytic−M溶解/抽出試薬(CelLytic−M lysis/extraction reagent、Sigma)で細胞(1,000,000個)を溶解した。該溶解液を12,000rpm、4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液を取った。そして、E−maxマイクロプレートリーダー(microplate reader、Molecular Devices、CA)において、改良されたSOFTmaxプロテインアッセイパッケージでタンパク質濃度を測定した。還元(reducing、+50mM DTT)及び非還元(non−reducing、DTT無し)下において、各々30μgの細胞溶解物をSDS−PAGEサンプル用緩衝液に添加し、さらに3分間沸騰してから、6%〜8%ポリアクリルアミドゲルにロードした。次に、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)でタンパク質を解析した後、タンパク質をニトロセルロースメンブラン(nitrocellulose membrane)に電気ブロットし、Odysseyブロッキング試薬(Odyssey blocking reagent;Li−Cor Biosciences、Lincoln、 NB)でメンブランを室温で2時間培養した。その後、該試薬に一次抗体を加えて4℃で該混合物を培養した。使用した一次抗体は、Oct3/4(Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)、Sox2(Santa Cruz)、Nanog(Santa Cruz)、Lin28(Abcam Inc.,Cambridge,MA)、UTF1(Abcam)、Klf4(Santa Cruz)、TRP1(Santa Cruz)、keratin 16(Abcam)、CDK2(Santa Cruz)、cyclin D1(Santa Cruz)、cyclin D2(Abcam)、BMI−1(Santa Cruz)、AOF2(Sigma)、HDAC2(Abcam)、hTERT(Santa Cruz)、β−actin(Chemicon,Temecula,CA)、及びRGFP(Clontech)を含む。一晩経過後、TBS−Tで該膜を3回すすぎ、そして、ヤギ抗マウスIgG(goat anti−mouse IgG)中に室温で1時間暴露した。該ヤギ抗マウスIgGとAlexaFluor 680反応性染料(1:2,000;Invitrogen−Molecular Probes)が結合して二次抗体を形成した。更にTBS−Tで3回すすいだ後、Li−CorOdyssey Infrared Imager及びOdyssey SoftwareV.10(Li−Cor)を用いて免疫ブロットの蛍光スキャニング及び画像解析を行った。その結果を、図1D、図4B、図7C〜7D、図8B及び9Bに示す。
製造元の提案に基づき、アポトーシスのDNAラダーキット(Apoptotic DNA Ladder Kit、Roche Biochemicals、Indianapolis、IA)を用いて、約2,000,000個の細胞からゲノムDNAを単離し、そして単離されたDNAを2μg取り、2%アガロースゲル電気泳動法によって評価した。その結果を図1Fに示す。
必要な実験を終えた後、細胞をトリプシンで加水分解させ、塊状に遠心分離し、さらに予め冷却した1ml 70%メタノールを含有するPBS溶液中に浮遊させ、これらの細胞を−20℃で1時間固定した。そして、これらの細胞をペレット状に遠心分離し、1mlのPBSで1回洗浄した。再びこれらの細胞をペレット状に遠心分離し、37℃で、1mg/mlのヨウ化プロピジウム、0.5μg/mlのリボヌクレアーゼ(RNase)を含む1 mlのPBS溶液において30分間再浮遊させた。続いて、BD FACSCaliburフローサイトメトリー(San Jose、CA)で約15,000個の細胞を分析した。パルス幅対パルス面積の図を描き、単一細胞をゲーティングすることによって細胞ダブレットを除外した。収集したデータを「WatsonPragmatic」アルゴリズムでソフトウェアFlowjoを使用して解析した。その結果を図3A〜B、図6A−b及び6Cに示す。
ヒトゲノムGeneChip U133 plus 2.0 アレイ(Affymetrix、Santa Clara、CA)を用いて、47,000個を超えたヒト遺伝子の発現パターンの変化を検出した。製造元の提案に基づき、mirVanaTMマイクロRNA単離キット(mirVanaTM miRNA Isolation Kit、Ambion)を用いて、各試験サンプルから全RNAを単離した。単離したRNAの純度と含量を1%ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動及び分光光度計の測定(Bio−Rad)によって評価した。完全マッチしたプローブ及びミスマッチプローブの全体的平均差を用いて、サンプルシグナルを正規化した。そして、AffymetrixMicroarray Suite 5.0版、ExpressionConsoleTM 1.1.1版(Affymetrix)、及びGenesprings(SiliconGenetics)ソフトウェアを用いて、ゲノム全体の遺伝子発現パターンの変化を分析した。遺伝子発現の変化が1倍より大きい場合は、陽性差異遺伝子と見なされた。遺伝子クラスター測定において、プラグインプログラムGenetrix(EpicenterSoftware)とAffymetrixソフトウェアを組み合わせて使用した。各マイクロアレイ内の対照群ハウスキーピング遺伝子の平均値で、該サンプルシグナルを正規化した。その結果を図5Aに示す。
DNA単離キット(DNA isolation kit、Roche)によって、約2,000,000個の細胞中のゲノムDNAを単離した。1μgの単離されたDNAを取り、製造元の提案に基づき、重亜硫酸塩処理(CpGenome DNA modification kit、Chemicon、Temecula、CA)を行った。一方、2μgの単離されたDNAsを取り、CCGG切断制限酵素HpaIIで消化し、さらに1%アガロースゲル電気泳動によって、全ゲノムの脱メチル化を判別した(図5B)。重亜硫酸塩でDNAを処理することによって、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換させる一方、メチル化シトシンをシトシンのままに維持させた。重亜硫酸塩DNA配列決定分析においては、我々はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてOct3/4とNanogプロモーター領域を更に増幅した。Oct3/4プロモーター領域を増幅するために使用されるプライマーは、5’−GAGGCTGGAG CAGAAGGATT GCTTTGG−3’(SEQ.ID.NO.20)及び 5’−CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC−3’(SEQ.ID.NO.21)を含み、また、Nanogプロモーター領域を増幅するために使用されるプライマーは、5’−TGGTTAGGTT GGTTTTAAAT TTTTG−3’(SEQ.ID.NO.22) 及び 5’−AACCCACCCT TATAAATTCT CAATTA−3’(SEQ.ID.NO.23)を含む。まず、重亜硫酸塩修飾後のDNAs(50ng)とこれらのプライマー(合計100 pmole)を1倍PCR緩衝液中にて混合し、94℃に加熱しながら2分間保ち、そして直ちに氷で冷却した。その後、高感度のPCR延長キット(Expand High Fidelity PCR kit、Roche)を用いて94℃で1分間、70℃で3分間のようなPCRを25サイクル行った。増幅反応終了後、3%アガロースゲル電気泳動法によって正確な大きさを有するDNA産物を更に分画し、続いて該DNA産物をゲル抽出キット(Qiagen)で精製し、DNA配列決定を行った。DNAメチル化部位の詳細なプロフィルは、重亜硫酸塩で修飾されたDNA配列内に変わっていないシトシンと重亜硫酸塩で修飾されていないDNA配列内の変わっていないシトシンとを比較することによって得られた。その結果を図5Cに示す。
約5〜10個のmirPS細胞由来の胚様体(4〜8細胞段階)を50μlのDMEM培養液とマトリゲル(Matrigel)の2:1混合液中に浮遊させた後、これらのmirPS細胞由来の胚様体を6週齢の雌性偽妊娠の免疫不全SCIDベージュ(SCID−beige)マウスの子宮に移植した。偽妊娠マウスを作る方法は、1IUのヒト閉経期ゴナドトロピン(human menopausal gonadotrophin、HMG)を2日間腹膜内注射し、そしてヒト絨毛性ゴナドトロピン(humanchorionic gonadotrophin、hCG)をもう1日間注射した。該細胞及び該マウスは、移植前又は移植後において、ドキシサイクリン(Dox)処理を行わない。移植期間では、2.5%トリブロモエタノール(Avertin)溶液で、1匹のマウスに0.4mlの量でマウスを麻酔した。移植後又は移植細胞集団が100mm3より大きいサイズに成長した後、移植細胞集団(Xenografted masses)を3から4週間監視した。該腫瘍/奇形腫を切り離した後、数式(長さ×幅2)/2を用いて、その体積を計算し、且つ計数、秤量、及び、更なる組織学的解析を行った。奇形腫様組織嚢腫の形成(teratoma−like tissue cysts)は、通常移植して約2.5週間後に観察できる。その結果を図5Dに示す。
まず、200μg/mlのMatrigelを単独使用し、又は20%FBS及び1%L−グルタミン(L−Glutamine)のフェノールレッドフリーのDMEM培養液を追加したMatrigelを用いて、チャンバーインサート(chamber inserts、穴径12μm、Chemicon)を塗布し、無菌環境下において翌日まで乾燥させた。フェノールレッドフリーDMEM培養液を使用して、最終的に100,000個細胞/mlの細胞密度になるように細胞を収集、すすぎ、及び浮遊させた。該細胞懸濁液を500μl取ってトップチャンバー(top chamber)内に分配させ、1.5mlのDMEMならし培養液をボトムチャンバーに追加することで、走化性勾配(chemotactic gradient)を作り出した。37℃で一晩置き、16時間培養した後、侵入状況について測定を行った。まず、脱脂綿でトップチャンバーを拭き、そして100%メタノールを用いてメンブランの下側に位置する侵入細胞を10分間固定し、風乾させ、クレシルバイオレット(cresyl violet)で20分間染色した後、水で緩やかに洗浄した。乾燥後、1:1の100%エタノールと0.2Mクエン酸ナトリウム(NaCitrate)の洗浄液でメンブラン上のクレシルバイオレット染色を20分間洗い出し、Precisionマイクロプレートリーダー(Precision Microplate Reader、Molecular Dynamics)で波長570nmの吸光度を読み取った。細胞の侵入率の表示法は、試験サンプルの吸光度対メンブランインサート層未乾燥の場合(総細胞数)に得られた吸光度の百分比とした。その結果を図6Dに示す。
細胞接着試験は過去の報告に述べられた通りに行われた(Lin氏ら,2007)。ヒト骨髄内皮細胞(hBMECs)を100,000個細胞/mlの密度で96穴プレートに植え、試験前に接着培養液(adhesion medium)[RPMI 1640/0.1%BSA/20mM HEPES(pH7.4)]ですすいだ。トリプシン(腫瘍/癌細胞に使用する)又はコラゲナーゼ(mirPS細胞に使用する)を用いて、被験細胞を単離させ、無菌生理塩水で細胞をすすいだ後、10μM fura−4アセトキシメチルエステル蛍光プローブ(acetoxymethyl ester,fluorescent probe,Sigma)を含有するPBS中で、再び細胞を1,000,000個細胞/mlの密度で浮遊させたまま、37℃の暗黒環境下で1時間経過した。続いて、該細胞を遠心分離させ、1%(v/v)プロベネシド(probenecid、100mM)を含む無血清の培養液で細胞をすすいだ後、該細胞を接着培養液に37℃の暗黒環境下で20分間培養することで、細胞内の蛍光プローブを活性化した。その後、該100,000個の細胞(300μlの細胞懸濁液/well)をコンフルエント(confluent)なhBMEC内皮細胞単層に投入し、37℃で50分間培養した。250μlの接着培地を用いて2回すすいで、未接着の細胞を洗い流した。蛍光プレートリーダー(fluorescent plate reader、Molecular Dynamics)を用いて、37℃で励起波長485nm及び発光波長530nmで蛍光を読み取った。その結果を図6Eに示す。
我々はNTera−2細胞(総体積が100μlであるMatrigel−PBS中の2,000,000個細胞)を8週齢の雄性マウス(BALB/c−nu/nu種)の脇腹部(即ち、後右肢)に異種移植した。該腫瘍に対して毎週監視し、NTera−2異種移植してから1週間後、pCMV−miR302sベクター又はpCMV−miR302d*ベクターをインサイチュー注射で導入した。マウス体重の1gあたり2μgのポリエチレンイミン(polyethylenimine、PEI)により調製されたpCMV−miR302s又はpCMV−miR302d*ベクターで、3日置きに5回の処理を行った。(合計10μg)。製造元の提案に基づき、インビボ−jetPEI送達試薬(Polyplus−transfection Inc.、New York、NY)を使用した。注射してから3週間後又はベクター非処理の腫瘍が平均サイズで約100mm3に成長した時点、サンプリングし始めた。腫瘍の組織学的評価及び免疫反応細胞毒性試験を行うために、血液、脳、心臓、肺臓、肝臓、腎臓又は脾臓のような主要な器官及び異種移植腫瘍は全て摘出された。そのうち、触診で腫瘍形成を監視し、数式(長さ×幅2)/2で腫瘍体積を計算した。また、腫瘍に対して計数、解剖及び秤量を行い、ヘマトキシリン・エオシン染色(H&E)及び免疫染色試験で組織学的な検査を行った。組織学的な検査では、脳、心臓、肺臓、肝臓、腎臓及び脾臓における検査可能な組織的病変が検出されなかった。その結果を図8Aに示す。
組織サンプルを4℃で4%のパラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)に一晩固定させた。該サンプルをパラフィンワックスに包埋する前に、1倍のPBS、メタノール、イソプロパノール、及びテトラヒドロナフタレン(tetrahydronaphthalene)の順で洗浄した。次に、包埋したサンプルをミクロトーム(microtome)で7〜10μmの厚さに切断し、TESPAでコートした清潔なスライドガラス上に固定した。次に、キシレン(xylene)を用いてスライドガラスを脱ろうし、取付け媒体(mounting media、Richard Allan Scientific、Kalamazoo、MI)を用いてカバーガラスの下に取り付け、そして、ヘマトキシリン(hematoxylin)及びエオシン(eosin)(H&E、Sigma)で染色して形態を観察した。免疫組織化学(IHC)染色キットは、Imgenex(SanDiego、CA)から購入した。製造元の提案に基づき、抗体の希釈及び免疫染色工程を行った。用いられた一次抗体は、Oct3/4(Santa Cruz)、Sox2(Santa Cruz)、Nanog(Santa Cruz)、CDK2(Santa Cruz)、cyclin D1(Santa Cruz)、cyclin D2(Abcam)、BMI−1(Santa Cruz)、及びRGFP(Clontech)を含む。二次抗体としては、ビオチン標識のヤギ抗ウサギ(goat anti−rabbit)又はビオチン標識のウマ抗マウス(horse anti−mouse)抗体(Chemicon、Temecula、CA)を用いた。三次抗体としてのストレプトアビジン−HRP(Streptavidin−HRP)を追加した。スライドガラスをPBTで3回洗浄した後、DAB基質(DAB substrate)で、結合された抗体の検出を行った。全視野スキャニングを備える100倍の顕微鏡で、陽性結果が観察され、Metamorphイメージングプログラム(Nikon 80i顕微鏡定量分析システム)によって、200倍の拡大倍率で計測して、定量分析を行った。その結果を図8Cに示す。
ルシフェラーゼアッセイは、修飾されたpMir−Report miRNA発現レポーターベクターシステム(pMir−Report miRNA Expression Reporter Vector System、Ambion)を用いて行った。Mir−302の標的部位(正常及び/又は変異)がpMir−Report Luciferase Reporterレポーターベクターの3’末端非翻訳領域(3’−UTR)のクローニングサイトに挿入された。合成された2つの標的部位を12個の−CAGT−重複配列で区切った。もう1つのpMir−Reportβ−gal Controlベクターはレポーターなし(no reporter)の制御ベクターとして使用された。ドキシサイクリンによって処理し、または処理せずに、FuGene HD試薬(Roche)を使用して、製造元の提案に基づき、200 ngのレポーターベクターで、50,000個のmirPS細胞を形質移入した。形質移入して48時間経過後に、細胞溶解液を収集した。ルシフェラーゼのノックダウンレベルは正規化(normalize)され、相対的なルシフェラーゼ活性(relative luciferase activity、RLA)で表示され、その計算方法は、ドキシサイクリンによって処理された(Dox−on)mirPS細胞のルシフェラーゼ活性レベルをドキシサイクリンによって処理されなかった(Dox−off)mirPS細胞のルシフェラーゼ活性レベルで割ることによって計算される。また、mir−434を発現する細胞は電気穿孔法によってpTet−On−tTS−miR434−5pをhHFCsに導入することで生成され、ネガティブコントロールとした。その結果を図7B及び図10Bに示す。
製造元の提案に基づき、プロテアーゼ抑制剤、ロイペプチン(Leupeptin)、TLCK、TAME及びPMSFを追加した細胞分解/抽出試薬(CelLytic−M lysis/extraction reagent、Sigma)で約1,000,000個の細胞を溶解した。12,000rpmの回転速度で、4℃において該分解液を20分間遠心分離させ、分解液(上澄み液)を収集した。続いて、E−maxマイクロプレートリーダー(microplate reader、Molecular Devices、CA)上で、改良されたSOFTmaxタンパク質アッセイソフトでタンパク質濃度を測定した。赤外アレクサフルオロ680(infrared Alexa Fluor 680 dye、TS Primer、Sigma−Genosys)標識のオリゴヌクレオチド5’−AATCCGTCGAGCAGAGTT−3’(SEQ.ID.NO.24)及び 5’−GTGTAACCCTAACCCTAACCC−3’(CX primer,30μM)(SEQ.ID.NO.25)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の産物を測定した。テロメラーゼ抑制剤は主要な混合液に直接に追加された。全ての被験細胞株に対して、反応ごとに50ngのタンパク質を使用することで、最良な結果に達した。30℃で30分間培養後、サンプルをポリメラーゼ連鎖反応器に入れ、94℃まで加熱し、2分間保持した後、94℃で変性反応(denuturation)を30秒間、57℃で合成反応(synthesis)を30秒間のPCRを35サイクル、最後に57℃で単一合成後を30秒間行った。次に、6%の非変性ポリアクリルアミドゲル(Nondenaturing polyacrylamide gel)電気泳動法でPCR産物を分画させ、Li−Corオディセ赤外イメージャー(Odyssey Infrared Imager)及びOdyssey Software V.10(Li−Cor)を用いて画像のスキャニング及び分析を行った。その結果を図9Aに示す。
免疫染色、ウェスタンブロット及びノーザンブロット法による分析において、75%より大きいシグナル強度の変化のいずれも陽性の結果とみなされ、これらの結果が解析された後、平均値±標準誤差(means±SE)で表示された。資料の統計解析は、一元配置分散分析(one−way ANOVA)によって計算された。主効果が有意な場合、Dunnett’sポストホックテスト(Dunnett’s post−hoc test)で対照群と有意に異なる群を判定した。2処理群間の対での比較には、両側スチューデントt検定(two−tailed student t test)を用いた。2群より多い処理群を含む実験では、ANOVAを行った後に、ポストホック多重範囲検定(post−hoc multiple range test)を行った。確率p<0.05を統計上において有意とみなした。両側検定から全p値を決定した。
以下の参考文献は、参照として本明細書に完全に記載されたものとして援用される。
Claims (14)
- 癌細胞の成長又は腫瘍の成長に対抗する治療薬又はワクチンを設計及び開発する方法であって、該方法は、
CDK2細胞周期調節因子及びBMI−1発癌遺伝子の発現を同時に干渉することができる少なくとも1つの遺伝子サイレンシングエフェクターに送達され、かつプロセシングされることが可能な少なくとも組換え核酸組成物を構築する工程を含み、
該遺伝子サイレンシングエフェクターはSEQ.ID.NO.3配列のみからなり、該組換え核酸組成物は、SEQ.ID.NO.9配列、SEQ.ID.NO.10配列、SEQ.ID.NO.11配列、SEQ.ID.NO.12配列、SEQ.ID.NO.13配列、SEQ.ID.NO.14配列、SEQ.ID.NO.15配列、SEQ.ID.NO.16配列及びそれらの組み合わせの雑種をライゲーションにより連結されて形成された薬剤誘導性遺伝子発現プロモーターまたは持続的遺伝子発現プロモーターを含む発現可能なベクターであり、それによりCDK2細胞周期調節因子、BMI−1発癌遺伝子、又はCDK2細胞周期調節因子及びBMI−1発癌遺伝子の両方を発現する少なくとも一つの細胞を含む細胞基質の細胞の成長を抑制することが可能である、方法。 - 該細胞は、奇形腫において見つかった腫瘍細胞類に属するヒト細胞を含む請求項1に記載の方法。
- 該細胞は、癌組織に由来するヒト細胞を含む請求項1に記載の方法。
- 該薬剤誘導性遺伝子発現プロモーターは、テトラサイクリン誘導体、又はその等価物によって制御される請求項1に記載の方法。
- 該持続的遺伝子発現プロモーターは、II型RNAポリメラーゼ、またはその等価物によって駆動可能である請求項1に記載の方法。
- 該持続的遺伝子発現プロモーターは、ウィルスプロモーターである請求項1に記載の方法。
- 該組換え核酸組成物は、薬剤及び治療に用いられる請求項1に記載の方法。
- 該細胞基質は、腫瘍に含まれるか、癌細胞を含むか、又はそれら両方である請求項1に記載の方法。
- 該組換え核酸組成物は、5’末端供与スプライス部位、イントロン挿入部位、分岐点モチーフ、ポリピリミジントラクト、及び3’末端受容スプライス部位を含む請求項1に記載の方法。
- 該イントロン挿入部位は、mir−302と相同性を有する該遺伝子サイレンシングエフェクターを含む請求項9に記載の方法。
- 該組換え核酸組成物は、さらに複数のエクソンを含む請求項1に記載の方法。
- 該遺伝子サイレンシングエフェクターは、mir−302の標的となるCDK2に関連する細胞周期遺伝子及びBMI−1に関連する発癌遺伝子のうちの少なくとも一方である複数の遺伝子を更に干渉することができる請求項1に記載の方法。
- 細胞の成長の該抑制は、細胞周期の減衰、G0/G1チェックポイントの停止、抗腫瘍形成、及び癌細胞のアポトーシスの中から選ばれる腫瘍を抑制する効果を生じさせることである請求項1に記載の方法。
- 該組換え核酸組成物は、1本鎖又は2本鎖の、DNA及びRNAのうちの少なくとも一方から選ばれる請求項1に記載の方法。
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