JP5945385B2 - 誘導性組換えｒｎａ因子を用いた腫瘍のない多能性胚性幹様細胞の生成 - Google Patents

誘導性組換えｒｎａ因子を用いた腫瘍のない多能性胚性幹様細胞の生成 Download PDF

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Description

本特許出願は、２００８年１１月２８日に提出された「誘導性組換えＲＮＡ因子を用いた腫瘍のない多能性胚性幹様細胞の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ｆｒｅｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ−Ｌｉｋｅ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ＩｎｄｕｃｉｂｌｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮＡ Ａｇｅｎｔｓ）」という米国仮特許出願第６１／１９３，４３８号に基づく優先権を主張する。本願はまた、２００８年１月１６日に提出された「イントロンＲＮＡを用いたヒト多能性胚性幹様細胞の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ−Ｌｉｋｅ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｔｒｏｎｉｃ ＲＮＡ）」という米国仮特許出願第６１／０１１，３３３号に基づく優先権を主張する。本願はさらに、２００８年９月８日に提出された「誘導性組換えＲＮＡ因子を用いた腫瘍のない多能性胚性幹様細胞の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ｆｒｅｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ−Ｌｉｋｅ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮＡ Ａｇｅｎｔｓ）」という米国仮特許出願第６１／１９１，３２７号に基づく優先権を主張する。なお、本願は、２００３年５月１５日に提出された「ＲＮＡスプライシング及びプロセシング誘導性の遺伝子サイレンシング及びその関連適用（ＲＮＡ−Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という米国特許出願第１０／４３９，２６２号、２００６年３月３１日に提出された「イントロンＲＮＡを用いる新規遺伝子導入法（Ｎｏｖｅｌ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｔｒｏｎｉｃ ＲＮＡ）」という米国特許出願第１１／２７８，１４３号、及び２００８年５月７日に提出された「イントロンＲＮＡを用いたヒト胚性幹様細胞の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ−Ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｔｒｏｎｉｃ ＲＮＡ）」という米国特許出願第１２／１４９，７２５号の一部継続出願であり、本明細書に完全に記載されているかのように、これらの出願を引用として本願に組み込まれる。
本発明は一般に、組換え腫瘍抑制因子マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ因子の関連細胞における導入遺伝子発現を用いた腫瘍のない多能性胚性幹様（ＥＳ）細胞の発生、生成、及び選別の手段及び方法に関する。より詳細には、本発明は、スプライスされてほ乳類細胞内の短鎖ＲＮＡ遺伝子サイレンシングエフェクター（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡ）にプロセシングできる非天然組換えイントロン及びその構成要素を生成し、発生及び細胞分化関連遺伝子及び癌遺伝子に対して特定の特異的遺伝子サイレンシング効果を誘導し、その結果、細胞を多能性ＥＳ様状態に再プログラムする遺伝子導入法及び誘導性核酸成分に関する。短鎖ＲＮＡ遺伝子サイレンシングエフェクターは、例えばｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ｄ、これらの手動再設計したｓｈＲＮＡ相同体、及びこれらの組み合わせのような、腫瘍抑制因子様ｍｉＲＮＡを含むことが好ましい。すなわち、このように形成される多能性幹様細胞は、無フィーダー細胞培養条件で培養できる。関連細胞は、インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボで単離された体細胞又は癌細胞を含む。
ヒト幹細胞における最近の研究は、移植療法において極めて有望な可能性を示してきた。にもかかわらず、ヒト幹細胞のクローニング用供給源は限られ、その純度及び質の管理は極めて難しい。１９９８年、ＪａｍｅｓＴｈｏｍｓｏｎら（例えば米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号及び第７，２２０，５８４号）は、ヒト胚の後期胚盤胞から初めてヒト胚性幹（ＥＳ）細胞株を単離した（Ｔｈｏｍｓｏｎら，（１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。Ｈ１及びＨ９細胞は、これらの単離ヒトＥＳ様細胞由来の２つの代表的な細胞株である。２年後、Ｇｅａｒｈａｒｔら（例えば米国特許第６，０９０，６２２号、第６，２４５，５６６号及び第６，３３１，４０６号）も、胚盤胞後のヒト胚からＥＳ様始原生殖細胞を単離する方法を開発した。これらのＥＳ細胞単離法のやり方では、元の胚を破壊しなければならないので、このように得られるES細胞株を臨床療法に用いることの正当性を議論する多くの倫理的、人道的な懸念が生じてきた。
近年、治療安全性やのインフォームドコンセントの使用に関する問題も指摘されている。例えば、ＥＳ細胞の発生は、「フィーダー細胞」と言われる周囲の線維芽細胞が放出する未同定因子が必要なので、全てのヒトＥＳ様細胞は、マウス又はヒト線維芽細胞層で培養されることが好ましい（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆらによる米国特許第６，８７５，６０７号）。しかし、これらの線維芽細胞フィーダー細胞はまったく異なる表面抗原を持ち、これらがＥＳ細胞抗原の純度を汚染し、患者で免疫拒絶を引き起こすおそれがある。一方、いくつかの無フィーダー細胞培養条件も開発されてきたが、これらの無フィーダー細胞法は、いずれも長期に未分化ＥＳ細胞状態に維持することができない。残念ながら、現在利用可能なhES細胞株はいずれも培養条件において純度100％の細胞集団を達成できない。最良のフィーダー細胞培養条件下でさえ、不定の割合（約５％〜１０％又は１０％以上）のＥＳ細胞が他の組織細胞種に分化し、またその幹細胞性質を失う傾向がある。ＥＳ細胞から分化した最もよく観測される細胞種の１つは奇形腫である。奇形腫は、ヒト生殖系列細胞由来の腫瘍で、胚の内胚葉や中胚葉、外胚葉の組織に類似した複数の癌のように見える細胞種を含むことが多い。従って、フィーダー細胞の混入を阻止する方法、幹細胞の純度を上げる方法、腫瘍形成のリスクを低減する方法は、現在幹細胞研究における３つの主要な課題となっている。
２００６年に、高橋と山中は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を新たに導入した（Ｃｅｌｌ １２６： ６６３−６７６）。マウス線維芽細胞への４つの転写因子遺伝子（Ｏｃｔ３／４（Ｏｃｔ４）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４）の遺伝子導入による送達を用いて、インビトロで体細胞性線維芽細胞をＥＳ様のｉＰＳ細胞株に再プログラムして形質転換させることに成功した。このような方法は、被験細胞集団全体における成功率が０．００２％〜２％よりも小さいと見込まれた。２００７年には、これらのｉＰＳ細胞の行動特性に関する特性がマウスＥＳ細胞と同様なことが確認されている（Ｏｋｉｔａら，（２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８：３１３−３１７；Ｗｅｒｎｉｇら， （２００７） Ｎａｔｕｒｅ４４８： ３１８−３２４）。一方、Ｙｕらは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬＩＮ２８という他の転写因子を用いて、同様な方法でヒト線維芽細胞からより新しいｉＰＳ細胞株を開発している（Ｙｕら，（２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７−１９２０）。しかし、Ｙｕの方法は高橋の方法に比べて効率がずっと低くなる。これらのｉＰＳ細胞の適用は、従来のＥＳ細胞の倫理的問題を解決するだけでなく、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）技術と併用すれば、患者に優しい療法を提供する可能性もある利点を示した（Ｍｅｉｓｓｎｅｒら，（２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４３９： ２１２−２１５）。このようなｉＰＳに基づくＳＣＮＴ療法は、遺伝子導入マウスモデルにおける鎌状赤血球貧血の治療の成功で証明された（Ｈａｎｎａら，（２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９２０−１９２３）。しかし、まだ2つの問題が解決されていない。その1つはレトロウイルス導入遺伝子の使用であり、もう１つは癌遺伝子（例えばｃ−ＭｙｃとＫｌｆ４）の使用である。レトロウイルス感染は、遺伝子導入法で４つの転写因子遺伝子を標的宿主細胞に送達できる唯一の有効な手段であるが、標的細胞ゲノム内への複数のレトロウイルスベクターのランダムな挿入は、他の非標的遺伝子に影響を与える可能性がある。このように、不定のレトロウイルス挿入が常に細胞突然変異を引き起こすため、１つ以上の導入遺伝子が癌遺伝子の場合に特に危険である。これらの転写因子が誘発するｉＰＳ細胞からの腫瘍形成を防止する方法は、今にも明らかではない。
ｉＰＳ細胞のもう１つの欠点はその混在性である。ｉＰＳ細胞を生成するために、３つ以上の異なる転写因子をレトロウイルス感染によって単細胞ゲノムに挿入する必要がある。しかし、異なるレトロウイルス導入遺伝子は異なる送達効率と挿入突然変異率を持つため、複数のレトロウイルス挿入は宿主細胞ゲノムにおいて導入遺伝子の種々の組み合わせを引き起こすことが多い。適当な比率や数の４つの転写因子遺伝子を有する細胞だけが、優れた多能性を有するｉＰＳ細胞になり得る。それは、レトロウイルス挿入後、ｉＰＳ細胞はただ細胞集団全体の０．００２％〜２％に相当し、他の９８％以上の細胞は、導入遺伝子の複雑で不定の組み合わせによって形質転換するわけである。導入遺伝子の正しい組み合わせを有する純粋なｉＰＳ細胞を採取するために、一連の長たらしい細胞選択手順が必要である（ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａによる米国特許第７，２５０，２５５号）。ｉＰＳ細胞の形成メカニズムはまだ不明であるが、この技術は、胚性遺伝子の再活性化と発生シグナルの不活性化との間の変換を調整するための複数の転写調節因子が必要である。Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２−ｃ−Ｍｙｃ−Ｋｌｆ４又はＯｃｔ４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇ−ＬＩＮ２８による組み合わせ遺伝子の効果は、ある胚性遺伝子を直接に活性化させるようであるが、これらの作用は体細胞分化に必要な発生シグナル全体をどのように中止させるかは、まだ不明確である。Ｏｃｔ４にもかかわらず、ｉＰＳ方法に用いる他の全ての導入遺伝子は実質的に特定の組織細胞の発生に関与している。これらの導入遺伝子をまとめて配置すると、これらの発生シグナルの調整又は障害によって、なぜか細胞分化が停止し、その後細胞を形質転換させてＥＳ様状態に引き留める。これは自然なメカニズムではなく、例えば細胞突然変異や腫瘍形成のような不定のリスクを生じる可能性がある。
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）試験から、体細胞核と卵母細胞の細胞質との混成物は多能性幹様細胞を形成できることが明らかになり、細胞核内の転写因子よりもむしろ卵母細胞の細胞質内のいくつかの母性物質が細胞核の再プログラムにおいて重要な役割を果たすことを示した（ＳｉｍｏｎｓｓｏｎとＧｕｒｄｏｎ，（２００４） Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６： ９８４−９９０）。桑実期前の自然の受精卵と初期の接合体では、母性物質が正常幹細胞の更新と多能性の調節・維持という機能を果たし、腫瘍形成のリスクは全くない。これは、３２〜６４細胞（桑実胚）期より前の胚細胞が全て同じでかつ全能性である理由となる。母性物質は卵形成中に生じ、成熟卵母細胞に貯えられて初期胚発生に使用される。（マイクロＲＮＡの生合成に必要な保存RNA分解酵素であるＤｉｃｅｒを欠如するマウス卵母細胞は、第1減数分裂において停止するが、これはマイクロＲＮＡが卵母細胞内の主な母性物質の１つであることを示唆している（Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎら，（２００７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１： ６８２−６９３）。マウス卵母細胞では、母性物質の多くがＲＮＡで占められ、これはゲノムのトランスクリプトーム全体の約４５％に匹敵する（Ｓｔｉｔｚｅｌら， （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６： ４０７−４０８）。母性から胚性への転移中に、これらの母性ＲＮＡは急速に分解され、２〜４細胞期という初期から胚性遺伝子の転写が開始され、さらなる胚発生のシグナルを作る（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら， （２００４） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １４： Ｒ３５−４５）。これらの母性ＲＮＡの多くは、発生シグナルを同期化させるとともに全能／多能性ＥＳ細胞の胚発生初期段階における更新を維持するために、胚性遺伝子産物の阻害因子であると考えられる。従って、母性ＲＮＡは、ＥＳ細胞の維持と更新に必須な鍵となる母性物質の１つでありうる。
要するに、ＥＳ細胞の維持と更新の天然方式は、ｉＰＳ技術に用いられる活性化因子である４つの転写因子よりも、むしろ抑制因子である特定の母性ＲＮＡによって決められる。ＥＳ細胞の維持と更新の天然メカニズムを模倣した多能性ＥＳ様細胞を生成するために、これらの母性ＲＮＡの機能を同定して評価する新たな方策が高く望まれている。同定された母性ＲＮＡはヒト成体幹細胞又は体細胞に送達し、幹細胞性質を維持するか、又は／及び、体細胞をＥＳ様細胞状態に再プログラムすることができる。従って、母性ＲＮＡを好適に用いて多能性ＥＳ様細胞を生成する有効で簡単、しかも安全な方法及び因子の成分がまだ求められている。
米国特許第５，８４３，７８０号 米国特許第６，２００，８０６号 米国特許第７，０２９，９１３号 米国特許第７，２２０，５８４号 米国特許第６，０９０，６２２号 米国特許第６，２４５，５６６号 米国特許第６，３３１，４０６号 米国特許第６，８７５，６０７号 米国特許第７，２５０，２５５号
Ｔｈｏｍｓｏｎら， （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７ 高橋と山中， （２００６） Ｃｅｌｌ １２６：６６３−６７６ Ｏｋｉｔａら， （２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８：３１３−３１７ Ｗｅｒｎｉｇら， （２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８：３１８−３２４ Ｙｕら， （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７−１９２０ Ｍｅｉｓｓｎｅｒら， （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４３９： ２１２−２１５ Ｈａｎｎａら， （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９２０−１９２３ ＳｉｍｏｎｓｓｏｎとＧｕｒｄｏｎ，（２００４） Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６： ９８４−９９０ Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎら，（２００７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１： ６８２−６９３ Ｓｔｉｔｚｅｌら， （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６： ４０７−４０８ Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら， （２００４） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １４： Ｒ３５−４５
本発明は、少なくとも１つのほ乳類細胞を少なくとも１つの多能性幹様細胞に再プログラムする方法を提供する。この方法は、ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子を発現する少なくとも１つの細胞基質を提供する工程と、上記細胞基質内のｍｉｒ−３０２と相同な少なくとも１つの遺伝子サイレンシングエフェクターになるように、送達、転写、プロセシングできる少なくとも１つの組換え核酸成分を提供する工程と、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞遺伝子が抑制された条件で上記組換え核酸成分で細胞基質を処理する工程とを含む。すなわち、本発明は、多能性胚性幹様（ＥＳ）細胞を発生、生成、選別する方法であり、例えばｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ｄなどのようなヘアピン様組換えマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）因子、これらの手動再設計したｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）及び／又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）相同体、及びこれらの組み合わせの異所性発現を利用する。非天然／人造／人工ｍｉｒ−３０２因子の設計は、短鎖ヘアピンＲＮＡ及び／又は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）相同体又はクラスターのミスマッチや完全にマッチした構造体を含み、全ての構造体は、標的特異性を改良するとともに、導入遺伝子の送達及び遺伝子サイレンシングに必要なｍｉｒ−３０２のコピー数を低減する可能性がある。
天然マイクロＲＮＡは、一般に約１８〜２７ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり、miRNAとその標的との相補性に依存して、そのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的を直接分解するか、又は標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる。ｍｉｒ−３０２ファミリー（ｍｉｒ−３０２ｓ）は、極めて高い相同性を有する遺伝子間ｍｉＲＮＡ群であり、８９％以上の相同性を有し、ほぼ全てのほ乳類において保存されている。ｍｉｒ−３０２ｓは、５’から３’方向にｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｄ及びｍｉｒ−３６７を含む非コードＲＮＡクラスターとして同時転写される４つの要素からなる（Ｓｕｈら，（２００４）Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２７０：４８８−４９８）。ｍｉｒ−３６７とｍｉｒ−３０２は同時発現するが、これらの異なる標的遺伝子群に対する独特なシードモチーフから見ると、その機能が実際にお互いに異なっている。ｍｉｒ−３０２ｓはまた、多くのほ乳類の初期接合体と胚性幹（ＥＳ）細胞において極めて高く発現していることも分かっている（Ｔａｎｇら，（２００７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１： ６４４−６４８；Ｓｕｈら， （２００４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．２７０： ４８８−４９８）。上記発現は、生長が遅いＥＳ細胞内に認められることが最も多く、細胞分化及び／又は増殖後、速やかに減少した。ｍｉＲＮＡの生合成に必要な保存RNA分解酵素であるＤｉｃｅｒを欠如するマウス卵母細胞は第1減数分裂において停止するが、これはｍｉＲＮＡが卵形成で重要な役割を担うことを示唆している（Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎら，（２００７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１： ６８２−６９３）。ｍｉＲＮＡは、短鎖抑制性ＲＮＡが高度に相補的な標的遺伝子の翻訳を抑制できるという特徴を有するとすれば（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ． （２００４） Ｃｅｌｌ１１６： ２８１−２９７）、ｍｉｒ−３０２ｓは、ＥＳ細胞の初期胚発生におけるあらゆる発生可能な早期分化を防止するための主な母性抑制因子である可能性がある。これらの発見は、ｍｉｒ−３０２ファミリーが正常ＥＳ細胞の維持と更新において重要な役割を果たすことを示している。
ｍｉｒ−３０２の各要素は、シードモチーフ全体を含み、その５’端末配列の最初に同じ（１００％）１７ヌクレオチドがあり、これらの２３ヌクレオチドの成熟ｍｉＲＮＡ配列において全部で８３％〜９６％の相同性を有する。上記シードモチーフは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の５’端末の最初の８ヌクレオチドに位置し、ｍｉＲＮＡとその標的遺伝子との間の結合特異性や効率を決める。ウェッブサイトＳａｎｇｅｒｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）にリンクされた「ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／ｖｅｒｔ_４２／）及び「ＰＩＣＴＡＲ−ＶＥＲＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．ｎｙｕ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＰｉｃＴａｒ_ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ．ｃｇｉ？）プログラムによる予測に基づいて、ヒトとマウス内の４４５以上の保存遺伝子を含むほぼ同じの細胞遺伝子を標的とする。なお、ｍｉｒ−３０２とｍｉｒ−９３、ｍｉｒ−３６７、ｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２、ｍｉｒ−３７３及びｍｉｒ−５２０ファミリーの各要素も、重なったいくつかの標的遺伝子を共有している。これらの標的遺伝子の多くは、胚発生段階の初期細胞分化の開始又は促進に関与する発生シグナルや転写因子である（Ｌｉｎら， （２００８ｂ） ＲＮＡ １４： ２１１５−２１２４）。これらの標的遺伝子の一部はよく知られている癌遺伝子でもある。従って、ｍｉｒ−３０２ｓの機能は、従来のｉＰＳ法のように特定の胚シグナル伝達経路に転写の刺激を与えるよりも、むしろ発生シグナル及び分化関連転写因子の全体的発生を抑制する可能性がさらに高い。また、ターゲットされるこれらの発生シグナル及び分化関連転写因子の一部が癌遺伝子であるから、ｍｉｒ−３０２ｓは腫瘍抑制因子として機能し、正常ＥＳ細胞が更新を外して腫瘍を形成することを防止するするもできる。すなわち、本発明は、腫瘍のない多能性ＥＳ様細胞を生成する方法を提供する。例えば、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）又はホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔシグナル送達経路のいずれかを経由した神経細胞特異的幹細胞及び始原細胞系譜に対する強力な発生シグナルである。例えば、脳腫瘍や乳癌、肺癌、前立腺癌、皮膚悪性黒色腫のような多くの腫瘍／癌変換も同じ経路に関与する。本発明者らは、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ）−Ｒａｓ／ＰＩ３Ｋシグナル経路の１８以上ある要素がｍｉｒ−３０２ｓの強力な標的であることを見出したが、これはほ乳類卵母細胞とＥＳ細胞において、神経細胞の細胞分化が極めて厳格に遮断されることを示唆する。異なる組織細胞系譜に関与する多くの他の発生遺伝子において、mir-302sによる同様な阻害効果が観察されている。これらの証拠から、本発明者は、ｍｉｒ−３０２ｓが正常ＥＳ細胞の維持や更新において主な調節因子であり、分化している体細胞を相同なＥＳ様状態に再プログラムすることができると認めている。
ｍｉｒ−３０２ｓの機能を調べるために、本発明者らはＰｏｌ−ＩＩ誘導性の天然イントロンｍｉＲＮＡの生合成メカニズム（図１Ａ）に基づくｍｉＲＮＡ発現系を開発し、この系を用いてインビトロ及びインビボで天然ｍｉＲＮＡ及び人工ｓｈＲＮＡを生成することに成功した（図１Ｂ）。広義において、当該イントロンは、インフレーム内イントロン、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、及び３’−ＵＴＲを含む遺伝子の非コード配列である。従来の研究では、有効な成熟ｍｉＲＮＡが、ほ乳類遺伝子のこれらのイントロン領域、すなわち、イントロンｍｉＲＮＡに由来できることを証明している（Ｌｉｎら （２００３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ． ３１０： ７５４−７６０；Ｌｉｎら （２００５） Ｇｅｎｅ ３５６： ３２−３８）。イントロンｍｉＲＮＡ発現は、ほ乳類において一般的であり、これは、約５０％のほ乳類ｍｉＲＮＡがタンパク質をコードする遺伝子のイントロン内にコードするからである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら， （２００４） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４： １９０２−１９１０）。図１Ａに示すように、イントロンｍｉＲＮＡの生合成は、初期Ｐｏｌ−ＩＩ媒介ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写とイントロンのスプライシング／切り出しとの共役相互作用に依存するが、これはゲノムのクロマチン周辺線維に近い特定の核領域内で生じる（Ｇｈｏｓｈら， （２０００） ＲＮＡ ６： １３２５−１３３４；Ｌｉｎら （２００８ａ） Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３： ２２１６−２２３０）。これらのｍｉＲＮＡは、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）によってその宿主遺伝子の一次転写産物（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）において転写され、スプライセオソーム及び他のＲＮａｓｅIIIエンドヌクレアーゼによってスプライスされ、成熟ｍｉＲＮＡを形成する（Ｌｉｎら， ２００３；Ｄａｎｉｎ−Ｋｒｅｉｓｅｌｍａｎら， （２００３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１： １−１２８９）が、しかし、この過程においてＤｒｏｓｈａは必ずしも必要ではない（Ｒｕｂｙら， （２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８： ８３−８６）。従って、イントロンｍｉＲＮＡの生合成は、Ｐｏｌ−ＩＩ転写、ＲＮＡスプライシング、エキソソームプロセシング、及びナンセンス変異依存ＲＮＡ分解（ＮＭＤ）を含む複数の細胞内モニターシステムによって厳しく調整される。すなわち、ｍｉＲＮＡ様遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＲＮＡスプライシング、エキソソームプロセシング、ナンセンス変異依存分解、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる細胞内メカニズムによって放出される。このような高度の細胞内モニターにより、他のｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ発現系において認められるＲＮＡ過飽和の問題を予防でき、より有効性、標的特異性、かつ安全性を有する遺伝子サイレンシング効果を標的遺伝子に与えることができる（Ｌｉｎら，２００８ａ）。
本発明者らは、天然イントロンｍｉＲＮＡの経路を模倣することによって（図１Ａ）、イントロンｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡ様の遺伝子サイレンシングエフェクターを生成できる人造／人工スプライシング可能なイントロン（ＳｐＲＮＡｉ）を含む、赤方偏移蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）の組換え導入遺伝子であるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰを転写する新規なイントロンｍｉＲＮＡ発現系を設計した。ＳｐＲＮＡｉは、Ｐｏｌ−ＩＩによってＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいて同時転写され、ＲＮＡスプライシングによって切断される。その後、スプライス済みＳｐＲＮＡｉは、標的遺伝子に対する特異的転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）効果を引き起こすために、更に、例えば天然ｍｉＲＮＡと人工ｓｈＲＮＡのような成熟遺伝子サイレンシングエフェクターにプロセシングされる。一方、イントロンのスプライシング後、ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現の同定に用いられるＲＧＦＰマーカータンパク質の翻訳のために、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子転写産物であるエクソンが連結して成熟ｍＲＮＡを形成する。又は、例えば供与細胞再プログラム用の胚性幹細胞（ＥＳ）遺伝子マーカーのような他の遺伝子機能を備えるために、ＲＧＦＰの代わりに、機能性タンパク質エクソンを用いてもよい。すなわち、遺伝子サイレンシングエフェクターは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳抑制、ＲＮＡ干渉、及び／又はナンセンス変異依存分解によって細胞内遺伝子サイレンシング効果を誘導することができる。若し現在、脊椎動物において発現された機能不明の天然ｍｉＲＮＡ物質が１０００種類以上もあり、また新しいｍｉＲＮＡがさらに多く同定されてくると、このイントロンｍｉＲＮＡ発現系は、インビトロ及びインビボでこれらのｍｉＲＮＡの機能を測定する有効な手段として用いることができる。
ＳｐＲＮＡｉイントロンは、５’スプライス部位（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）、分岐点モチーフ（ＢｒＰ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７とＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）、及び３’スプライス部位からなるいくつかの共通ヌクレオチド配列を含む。また、ヘアピンｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ前駆体が、５’スプライス部位とＢｒＰモチーフとの間に挿入される。イントロンのこの部分は、一般にＲＮＡスプライシングとプロセシング中に投げ縄構造を形成する。さらに、ＳｐＲＮＡｉの３’末端は、イントロンＲＮＡスプライシング及びＮＭＤプロセシングの正確性を増すために、複数の翻訳終止コドン領域（Ｔコドン）を含む。このＴコドンは細胞質ｍＲＮＡにある場合、ＮＭＤシステムの活性化シグナルを生じさせ、細胞内に蓄積したあらゆるＲＮＡ非構造体を分解する。しかしながら、高度な構造をもつｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ前駆体は、さらなるＤｉｃｅｒによる開裂でそれぞれ成熟ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡになるために、保存される。本発明者らは、導入遺伝子の発現のために、ＳｐＲＮＡｉを手動でＲＧＦＰ遺伝子のＤｒａＩＩ制限部位（２０８番目のヌクレオチド）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２）に組み込んだ。それで、組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を形成した。ＤｒａＩＩによるＲＧＦＰの開裂によって、各末端に３つの陥凹ヌクレオチドをもつＡＧ−ＧＮヌクレオチド切断が生じ、ＳｐＲＮＡｉ挿入後にそれぞれ５’及び３’スプライス部位を形成する。このイントロン挿入は、機能性RGFPタンパク質の構造を破壊するが、これはイントロンのスプライシングによって回復できるので、作用を受けた細胞周囲に現れる赤色RGFPによって、イントロンｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの放出及びＲＧＦＰ ｍＲＮＡの成熟を測定することができる。ＲＧＦＰ遺伝子は、複数のエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）も備え、ＲＮＡスプライシングの正確性と効率を向上させる。
１つの好ましい実施形態において、本発明は、インビトロ及びインビボでのｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現量に対する制御を改良する誘導性ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現系である（図２Ａ及び２Ｂ）。この改良は、腫瘍感受性レトロウイルス感染の代わりに、より安全な電気穿孔法／マイクロインジェクション法によって導入遺伝子を送達するだけでなく、形質移入細胞において発生し得るＲＮＡの過剰蓄積を予防する。本発明者はこの改良に基づいて、正常表皮皮膚細胞（ｍｉｒＰＳ−ｈｐＥＳＣ）、正常毛嚢細胞（ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ）、癌性乳癌ＭＣＦ７（ｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７）、前立腺癌ＰＣ３（ｍｉｒＰＳ−ＰＣ３）及び皮膚悪性黒色腫Ｃｏｌｏ８２９（ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ）細胞のヒト初代培養細胞に由来する、ｍｉｒ−３０２により形質移入する種々の多能性幹（ｍｉｒＰＳ）細胞株の生成に成功した。図２Ａ及び２Ｂに示すように、本発明者らは、まず人工ｍｉｒ−３０２ｓｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ構造体（図３Ｂ）をＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子のイントロン挿入部位（すなわち、ＭｌｕＩ−ＰｖｕＩ制限／クローニング部位）に組み込み、そしてＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子をドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳベクターのマルチクローニング部位（すなわちＸｈｏＩ−ＣｌａＩ制限部位）に挿入し、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓ導入遺伝子ベクターを形成した（図３Ａ）。すなわち、例えばＳｐＲＮＡｉ、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰなどの組換え核酸成分は、薬剤誘導性遺伝子発現ベクターを含む。また、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰは、プラスミド、ウィルスベクター、レトロトランスポゾン、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子発現ベクターに組み込むこともできる。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子は、３７０の塩基対（ｂｐ）の相同領域に並び、宿主細胞ゲノムの標的部位に組換えて挿入する。導入遺伝子を送達するために、低浸透圧性ＰＨ緩衝液（４００μｌ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓベクター（１０〜３０μｇ）と宿主細胞（２００〜２０００個）を混合し、４００〜４５０Ｖで１００μｓｅｃ電気穿孔して、導入遺伝子を宿主細胞ゲノムに送達した。７２時間後、ＦＡＣＳフローサイトメトリーによる選択及び抗ＲＧＦＰと抗Ｏｃｔ３／４モノクローナル抗体を用いることによって、陽性導入遺伝子ｍｉｒＰＳ細胞を単離して収集した（図３Ｃ）。このような新規なｍｉｒ−３０２ｓ遺伝子導入法の成功率は、９１％を超えていると測定され、従来のｉＰＳ方法に認められた成功率０．００２％〜２％よりずっと高くなる。人工ｍｉｒ−３０２ｓの配列の全ては、ＳａｎｇｅｒｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラムの配列データベースに基づいて化学的に合成される。ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳベクターはＣＭＦ誘導性のｔＴＳ抑制遺伝子をコードし、導入遺伝子のＴＲＥ−ＣＭＶプロモーターを不活性化させる。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在により、ｔＴＳの抑制機能はＤｏｘにより中和されるので、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子とそのコードするｍｉｒ−３０２ｓが発現される。
別の好ましい実施形態において、本発明は、ｍｉｒ−３０２ｓ又はｍｉｒ−３０２様ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡ遺伝子サイレンシングエフェクターの作製に望ましい少なくとも１つの挿入配列を含む、人工／人造ＳｐＲＮＡｉイントロンを形成する遺伝子工学手法を提供する。例えば、５’スプライス部位、ＢｒＰ、ＰＰＴ、３’スプライス部位及びいくつかのリンカーオリゴヌクレオチドのような、ＲＮＡスプライシングに必要な合成オリゴヌクレオチド要素を連結することによって、ＳｐＲＮＡｉを形成する。オリゴヌクレオチド合成装置によって、これらの要素を化学的に作製、連結できる。すなわち、ＳｐＲＮＡｉのようなイントロンは、化学的合成法によって合成される。また、これらの要素の連結は、酵素による制限切断とライゲーションによって行ってもよい。すなわち、ＳｐＲＮＡｉのようなイントロンは、ヌクレオチド組換え法によっても形成される。このように得られたＳｐＲＮＡｉのようなイントロンは、関連細胞に形質移入するのに直接使用するか、又はさらに、遺伝子転写産物（すなわちpre-mRNA）と結合して同時発現させるために宿主遺伝子に組み込むことが可能である。従って、本発明の組換え核酸成分はさらに、少なくとも１つのｍｉｒ−３０２のようなＲＮＡ遺伝子サイレンシングエフェクターをコードする組換えイントロンを含む。一般に、イントロンの挿入法は、酵素制限／クローニング、相同ＤＮＡ組換え、トランスポゾンの送達、ジャンピング遺伝子の組み込み、レトロウイルス感染、及びこれらの組み合わせを含む。宿主遺伝子は、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子、胚性幹細胞（ＥＳ）マーカー遺伝子、ルシフェラーゼ、ｌａｃ−Ｚレポーター遺伝子、ウィルス遺伝子、トランスポゾン、ジャンピング遺伝子、人工組換え遺伝子、及び天然細胞遺伝子の群から選ばれる。すなわち、組換え核酸成分は更に、蛍光タンパク質マーカー遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｌａｃ−Ｚレポーター遺伝子、胚性幹細胞マーカー遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子、細胞マーカー遺伝子、ジャンピング遺伝子、トランスポゾン、及びこれらの組み合わせの群から選ばれる複数のエクソンを含む。本発明は、修正された赤色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）遺伝子を用いてｍｉｒ−３０２ｓの発現を示すことが好ましいが、これに制限されない。
一方、ＳｐＲＮＡｉイントロンは、５’ＧＴＡＡＧＡＧＫ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）又はＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵモチーフ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３８）（すなわち、５’ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３７）、５’ＧＴＡＡＧＡＧＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３９）、５’ＧＴＡＧＡＧＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４０）、及び５’ＧＴＡＡＧＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４１））のいずれかと相同な５’スプライス部位を含むが、その３’末端は、ＧＷＫＳＣＹＲＣＡＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５）又はＣＴ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＮＧモチーフ（すなわち、５’ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４２）、５’ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’、及び５’ＣＣＡＣＡＧ−３’）のいずれかと相同な３’受容スプライス部位である。すなわち、組換え核酸成分のイントロンは、５’供与スプライス部位、イントロン挿入部位、分岐点モチーフ、ポリピリミジントラクト、及び３’受容スプライス部位を含む。さらに、分岐点配列は、５’と３’のスプライス部位間に位置し、５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’及び５’−ＴＡＣＴＴＡＴ−３’のような５’−ＴＡＣＴＷＡＹ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）モチーフと相同な配列を含む。すなわち、分岐点モチーフは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６配列又はそれと相同な配列を含む。分岐点配列のアデノシン「Ａ」ヌクレオチドは、ほぼ全てのスプライセオソームイントロンにおいて細胞の（２’５’）−オリゴアデニル酸合成酵素とスプライセオソームによって、（２’５’）結合型の投げ縄イントロンＲＮＡの一部を形成する。さらに、ポリピリミジントラクトが分岐点と３’スプライス部位との間に近接して位置し、５’−（ＴＹ）ｍ（Ｃ／-）（Ｔ）ｎＳ（Ｃ／-）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７）又は５’−（ＴＣ）ｎＮＣＴＡＧ（Ｇ／-）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）モチーフのいずれかと相同なＴ又はＣ高含量の配列を含む。シンボル「ｍ」及び「ｎ」は１以上の複数の反復数を示し、最も好ましくは、ｍは１〜３、ｎは７〜１２である。シンボル「-」は、配列内に１つの空ヌクレオチドがあることを示す。また、これらの全てのイントロン構成要素を連結するために、いくつかのリンカーヌクレオチド配列もある。米国特許法施行規則（37 CFR）第1.822条のヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列データに使用するシンボル及び書式に関するガイドラインに基づき、シンボルＷはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＫはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＳはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）、シンボルＹはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＲはアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）、シンボルＮはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を示す。
一方、種々のイントロン遺伝子サイレンシングエフェクターを発現する複数の導入遺伝子及び／又はベクターを用いて複数の標的遺伝子での遺伝子サイレンシングを実現してもよい。又は、複数の遺伝子サイレンシングエフェクターは、１回のイントロン挿入によって生成することができる。すなわち、イントロン挿入部位は、少なくとも１つのｍｉｒ−３０２と相同な遺伝子サイレンシングエフェクターを含む。例えば、ゼブラフィッシュにおける1つの抗EGFP pre-miRNAを挿入したイントロンの異所性発現は、ｍｉＲ−ＥＧＦＰ（２８２／３００）及びｍｉＲ−ＥＧＦＰ（２８０−３０２）のようなサイズが異なる２種類のｍｉＲＮＡを生成することが報告されているが、これは、１回のＳｐＲＮＡｉ挿入が複数の遺伝子サイレンシングエフェクターを生成できることを示している（Ｌｉｎら，２００５）。特定の場合では、イントロン遺伝子サイレンシングエフェクターは標的遺伝子転写産物（すなわちｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションして、２本鎖ｓｉＲＮＡを形成してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）二次効果を引き起こす。これらの遺伝子サイレンシングエフェクターは導入遺伝子ベクターによって絶えずに生成されるので、インビボでの応用において、ＲＮＡの素早い分解の懸念が軽減される。この方策の利点は、導入遺伝子のベクターによる形質移入及びウイルス感染の使用によってその送達が安定していることで、特異的遺伝子サイレンシング効果を安定して比較的長期に提供することにある。1つの局面では、本発明は、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）、ウィルスポリメラーゼ、ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩＩ）、及びテトラサイクリン応答要素に制御されるＲＮＡポリメラーゼ（ＴＲＥ）プロモーターからなる群から選ばれる特定のＲＮＡプロモーター（ＲＮＡｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下で、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ関連遺伝子サイレンシングエフェクターを作製することができる。ウィルスプロモーターは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス（ＡＭＶ）、及びアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）から単離されたＰｏｌ−ＩＩ様ＲＮＡプロモーターである。例えば、レンチウイルスＬＴＲプロモーターは、1細胞当たりｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写産物を５×１０５コピーまで提供するのに十分である。薬剤感受性抑制体であるｔＴＳをウィルスポリメラーゼプロモーターの前に挿入して遺伝子サイレンシングエフェクターの転写速度を制御することも実行可能である。上記抑制体は、Ｇ４１８、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン、及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる化学薬剤又は抗生物質により抑制されてもよい。つまり、本発明の組換え核酸成分の発現は、テトラサイクリン誘導体のような、薬らしい抗生物質誘導体によって調節されてもよい。例えば、ドキシサイクリンはテトラサイクリン誘導体の１つである。
本発明によれば、細胞内機構によって所望のイントロンＲＮＡ挿入配列を切り出して放出し、上記ＲＮＡ挿入配列と高度に相補的な特定の遺伝子標的に対して所望の遺伝子サイレンシング効果を引き起こすとともに、特に赤色／緑色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ／ＥＧＦＰ）、胚性遺伝子マーカー、ルシフェラーゼ、ｌａｃ−Ｚ、及びこれらの誘導体の群から選ばれるレポーター又はマーカータンパク質の翻訳など、所望のタンパク質機能の発生のために、宿主遺伝子転写産物のエクソンは連結して成熟ｍＲＮＡを形成する。レポーター／マーカータンパク質の存在は、作用を受けた細胞において発現するイントロン遺伝子サイレンシングエフェクターのレベルと位置の同定に用いられ、生じた遺伝子サイレンシング効果を確認することができる。エクソンの連結で形成された成熟ｍＲＮＡはまた、損傷又は欠損した遺伝子機能の置換、もしくは特定の遺伝子発現の亢進のための従来型の遺伝子療法においても有用な可能性がある。一方、ｍｉｒ−３０２と相同な遺伝子サイレンシングエフェクターは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、短鎖一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、短鎖非コードＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用のＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びこれらの前駆体（すなわちｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ／ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を含んでもよい。これらのイントロン遺伝子サイレンシングエフェクターの使用は、外来遺伝子、病原性導入遺伝子、ウィルス遺伝子、突然変異遺伝子、癌遺伝子、疾患に関連する非コードＲＮＡ遺伝子、タンパク質をコードする多くの他のタイプの細胞遺伝子、及び非コード細胞遺伝子からなる群から選ばれる不要な標的遺伝子をサイレンシングさせる強力な道具として機能することができる。
一部の天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループ構造が過大及び／又は複雑でＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子に適合しないため、本発明者は、天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループの代わりに、手動再設計したｔＲＮＡｍｅｔループ（すなわち５’（Ａ／Ｕ）ＵＣＣＡＡＧＧＧＧＧ−３’）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４３）を用いる場合が多い。ｔＲＮＡｍｅｔループは、天然ｍｉＲＮＡと同じなＲａｎ−ＧＴＰ及びエクスポーチン−５の輸送メカニズムによって、細胞核から細胞質への手動再設計したｍｉＲＮＡの輸送を効率的に促進することを示している（Ｌｉｎら （２００５） Ｇｅｎｅ ３５６： ３２−３８）。有利なのは、現在、本発明では、５’ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．ｌ）と５’ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）を含む、手動改良した1対のｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ループを使用しており、これらは天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと同じ核外への輸送効率を備えるが、ｔＲＮＡ輸送には干渉しない。この改良は更に、ｍｉｒ−３０２ｓの全体的機能及び安定性を向上させる可能性があるｍｉｒ−３０２ａ−ｍｉｒ−３０２ａ*とｍｉｒ−３０２ｃ−ｍｉｒ−３０２ｃ*のデュプレックスの形成を促進する。これらの新しいｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループの設計はｔＲＮＡｍｅｔループをｍｉｒ−３０２ｂ／ｍｉｒ−３０２ａの短鎖ステムループと組み合わせることによって改善され、ｍｉｒ−３０２ｂ／ｍｉｒ−３０２ａは胚性幹細胞では高度に発現しているが、他の分化組織細胞ではそうでない。従って、ｍｉｒ−３０２ｓにおけるこれらの組換え／人造／人工ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡループの使用は、インビボでの天然ｍｉＲＮＡ経路に干渉せず、非常に小さい細胞毒性しか生じなく、さらに安全的である。
ｍｉｒ−３０２ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡファミリークラスターは、合成ｍｉｒ−３０２相同体のハイブリダイゼーション及び連結／ライゲーションによって形成され、５’から３’方向にｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、及びｍｉｒ−３０２ｄｐｒｅ−ｍｉＲＮＡという４つの部分からなる（図３Ｂ）。これらの手動再設計したｍｉｒ−３０２ ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子は、全てその５’末端配列の最初に、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）のような同じ１７ヌクレオチドがある。ｍｉｒ−３０２ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスターのＤＮＡ組換えのための合成オリゴヌクレオチドとしては、ｍｉｒ−３０２ａ−センス：５’ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴ ＡＡＡＣＧＴＧＧＡＴ ＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴ ＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡ ＧＡＡＧＴＡＡＧＴＧ ＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧ ＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２９）、ｍｉｒ−３０２ａ−アンチセンス：５’ＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡ ＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣ ＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡ ＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴ ＴＡＡＧＴＧＧＴＧＧ ＧＡＣＧＡＴＣＧＧＡ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３０）、ｍｉｒ−３０２ｂ−センス：５’ＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴ ＣＧＣＴＣＣＣＴＴＣ ＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡ ＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴ ＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴ ＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＧ ＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧ ＣＧＣＴＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３１）、ｍｉｒ−３０２ｂ−アンチセンス：５’ＴＡＧＣＧＣＴＡＧＣ ＧＡＣＴＣＣＴＡＣＴ ＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴ ＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡ ＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧ ＧＡＧＣＧＡＧＣＴＣ ＧＡＧＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３２）、ｍｉｒ−３０２ｃ−センス：５’ＣＧＣＴＡＧＣＧＣＴ ＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴ ＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧ ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧ ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴ ＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣ ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３３）、ｍｉｒ−３０２ｃ−アンチセンス：５’ＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＧＣＣＴＣＣＡＣＴＧ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡ ＣＡＧＣＡＧＧＴＡＣ ＣＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＣＡＡＡＧＧＴ ＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３４）、ｍｉｒ−３０２ｄ−センス：５’ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＣＣＡＧＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣ ＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３５）、及びｍｉｒ−３０２ｄ−アンチセンス：５’ＡＴＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧ ＧＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡ ＣＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３６）が挙げられる（Ｓｉｇｔｎａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。また、イントロンを挿入しやすいために、ｍｉｒ−３０２ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスターの代わりに、合成ｍｉＲ−３０２ｓ−センス５’ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴ ＣＡＴＡＡＧＴＧＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴ ＡＧＴＧＴＧＣＴＡＡ ＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡ ＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧ ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡ ＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣ ＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７）とｍｉｒ−３０２ｓ−アンチセンス５’ＡＴＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴ ＡＧＴＧＴＧＣＣＴＧ ＧＣＴＴＡＧＣＡＣＡ ＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧ ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡ ＴＧＡＣＧＡＴＣＧＧ ＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２８）の雑種によって形成される、手動再設計したｓｈＲＮＡを用いてもよい。すなわち、好ましい遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７とＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２８との雑種によって形成される組換え核酸配列である。ｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡは、全ての天然ｍｉｒ−３０２要素と９１％以上の相同性を有し、ヒトにおける同じ細胞遺伝子を標的とする。
ｍｉｒ−３０２ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡのイントロン挿入では、組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子の挿入部位はその５’及び３’末端にそれぞれＰｖｕＩ及びＭｌｕＩ制限／クローニング部位と並んでいると、最初の挿入配列は簡単に除去可能で、ｍｉｒ−３０２ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡのようなＰｖｕＩ及びＭｌｕＩ制限部位と一致する付着末端をもつ様々なｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ挿入配列によって置換可能である。異なる遺伝子転写産物に対してイントロン挿入配列を変化させることで、本発明のイントロンｍｉｒ−３０２ｓ発現系は、インビトロ及びインビボで標的遺伝子サイレンシングを誘導する強力な道具として機能することができる。サイズの確認と導入遺伝子の精製のために、ｍｉｒ−３０２を挿入したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ構造体（１０ｎｇ）は、1対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、５’ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣ ＴＧＣＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２３）及び５’ＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＧ ＧＧＣＡＧＧＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２４）を用いて、９４℃、５２〜５７℃、そして６８℃で各１分間の２５〜３０サイクルによるポリメラーゼの連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。単離して得られたＰＣＲ産物（約９００〜１１００ｂｐ）を２％のアガロースゲル上にて分画し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）によって抽出して精製する。ＤＮＡ配列を確認した後、精製されたｍｉｒ−３０２を挿入したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を更にｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳベクターの制限／クローニング部位（すなわちＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位）に挿入し、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓ導入遺伝子発現ベクターを形成して細胞内で発現させる（図３Ａ）。
ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓ導入遺伝子ベクターは、リポソームによる／化学的形質移入、電気穿孔法、遺伝子銃による貫入、トランスポゾン／レトロトランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子組み込み、マイクロインジェクション及びレトロウイルス／レンチウイルス感染の群から選ばれる方法によって、ほ乳類細胞に送達できる。ランダムな導入遺伝子挿入及び細胞の突然変異のリスクを防ぐために、本発明者は、電気穿孔法と相同組換えの組み合わせを用いて、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓ導入遺伝子ベクターを関連する宿主細胞に送達することが好ましい。例えば、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子は、既知遺伝子をコードしないＬＯＣ７２７９７７遺伝子座領域の３’近接端に近接するヒト染色体６に組換えて挿入するように、３７０−ｂｐ相同領域に並んでいる。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰはこの単一位置に正確に挿入されたことが検出された（図４Ａ）。従って、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子とそのコードするｍｉｒ−３０２ｓの発現は、完全にＤｏｘ存在下でのｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳベクターのＴＲＥ−ＣＭＶプロモーターの活性化によって決められる。本発明者は既に、正常表皮皮膚細胞、正常毛嚢細胞、癌性の乳癌ＭＣＦ７、前立腺癌ＰＣ３、及び皮膚悪性黒色腫Ｃｏｌｏ細胞を含むヒトの正常と癌性細胞における誘導性ｍｉｒ−３０２ｓ発現についてこのような新規方法を試験した。つまり、多能性幹様細胞状態に再コードすべきほ乳類細胞は、ヒト細胞、正常体細胞、病的体細胞、腫瘍又は癌細胞、ヒト毛嚢細胞、ヒト皮膚細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるものである。このように得られたｍｉｒ−３０２により形質移入した多能性幹（ｍｉｒＰＳ）細胞は、いずれも同じゲノム位置でしかＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子の１つ又は２つの付随コピーをもたず（図４Ａ）、これは、ｍｉｒ−３０２の合計濃度がこれらのｍｉｒＰＳ細胞の生存に影響を与え得ることを示した。また、ｍｉｒ−３０２ｓとそのマーカーＲＧＦＰｍＲＮＡの発現量は、Ｄｏｘ濃度の向上とともに増えていることも留意した（図４Ｂ）。体細胞の多能性ＥＳ様幹細胞への再プログラムを引き起こすために、ｍｉｒ−３０２の全体濃度は３０倍を超えて５０倍未満で発現すべきである。現在用いられるＰｏｌ−ＩＩＩ又はＣＭＶプロモーター誘導性の直接（エクソン）ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現系は、毛嚢と皮膚細胞において発現率が低いため機能していない（約１６倍しか増えない）。これは可能性があるというのは、天然ｍｉｒ−３０２クラスターの鋳型が短か過ぎて構造化され、Ｐｏｌ−ＩＩＩ又はＣＭＶプロモーターにより直接に転写できないからである。従って、本発明は、細胞内モニターシステム以外の第２の保護手段として用いられる、所定の薬剤であるＤｏｘによってｍｉｒ−３０２ｓのインビトロ及びインビボでの発現量を制御する誘導性メカニズムを提供する。本発明にかかるｍｉｒＰＳ細胞においては、ＲＮＡ蓄積又は過飽和による細胞毒性が検出されていない。
本発明は、誘導性導入遺伝子発現系の新規設計及び方策、すなわち、上述したｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓを採用し、これにより遺伝子導入法によってヒト体細胞／癌細胞においてｍｉｒ−３０２ファミリー（ｍｉｒ−３０２ｓ）の要素又は相同体を発現させることで、これらの体細胞／癌細胞を多能性胚性幹様細胞状態に再プログラムした。１つの好ましい実施形態において、本発明は、ヒト細胞におけるｍｉｒ−３０２様ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子／相同体となるように送達、転写、プロセシングできるので、細胞においてｍｉｒ−３０２の標的となる発生及び分化関連遺伝子の特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導する薬剤誘導性組換え核酸成分を用いた方法であって、ａ）：ｉ）ｍｉｒ−３０２ｓの標的となる複数の発生及び分化関連遺伝子を発現させる細胞基質、及びｉｉ）複数の非コードｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ又はその相同体をコードする単離ＲＮＡを転写し、またそれを細胞内メカニズムによって成熟ｍｉｒ−３０２ ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ又はその相同体にプロセシングできるので、細胞基質における標的遺伝子の機能を抑制できる組換え核酸成分を提供する工程と、ｂ）細胞基質における標的遺伝子の機能が抑制された条件で、組換え核酸成分によって細胞基質を処理する工程とを含む方法を提供する。薬剤誘導性組換え核酸成分としては、組換えｍｉｒ−３０２ファミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２９−３６の雑種）又は手動再設計したｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡ相同体（すなわちＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７と２８の雑種）を挿入したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子のＴｅｔ−Ｏｎベクターを含むことが最も好ましい。細胞基質は、インビトロ、エクスビボ又はインビボでｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ及びその標的遺伝子を発現させることができる。その後、細胞基質は、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬＩＮ−２８のような標準ＥＳ細胞マーカーを示すだけでなく、高度に脱メチル化されたゲノムを含み、幹細胞が再プログラムされた接合体ゲノムに類似するＥＳ様状態に再プログラム又は形質転換される。
本発明者は本発明により、７つの分野でｍｉｒ−３０２誘導性の多能性幹（ｍｉｒＰＳ）細胞の生成が成功したことを証明する証拠を収集した。第１に、ヒト正常毛嚢細胞由来（ｈＨＦＣ）、及び癌性黒色腫Ｃｏｌｏ細胞由来という同じ細胞種由来の２種類の同胞ｍｉｒＰＳ細胞株が生成され、ともにインビトロで胚様体を形成できた（図５Ａ〜Ｃ）。第２に、ｍｉｒＰＳトランスクリプトームのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）マイクロアレイ及びノーザンブロット分析を用いて、ｍｉｒ−３０２ｓの発現増加を確認した（図６Ａ〜Ｂ）。第３に、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇを含む標準胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現増加を検出した（図６Ｂ、８Ｂ〜Ｃ及び９Ｂ）。第４に、ゲノムＤＮＡ全体は脱メチル化し、再プログラムイベントを経た接合体ゲノムの状態に類似することを観測した（図７Ａ〜Ｃ）。第５に、これらのｍｉｒＰＳ細胞の全ゲノムの遺伝子発現パターンは、ヒトＥＳ ＷＡ０１（Ｈ１）及びＷＡ０９（Ｈ９）細胞と８６％以上の高度の相似性を有することを示した（図８Ａ及び９Ａ）。第６に、ｍｉｒＰＳ細胞由来の胚様体（ＥＢ）をインビボで免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスに移植すると、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び定形内胚葉）全体を含む奇形腫様組織嚢腫を形成できる（図１０）。しかし、これらの組織嚢腫は奇形腫と異なり、その周辺組織と非常に良くて明らかな境界が形成される。また、マウスにおけるこれらの嚢腫は、移植後約２．５週間にその発生が停止した。これらのｍｉｒＰＳ由来ＥＢ細胞のインビボランダムでの発生を制限する自動調節のメカニズムがあるようである。最後に、種々のホルモン及び／又は成長因子のインビトロでの処理を用いてｍｉｒＰＳ細胞分化を引き起こし、神経細胞の前駆細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、及び精原細胞様始原細胞のような、種々の体細胞及び生殖系組織細胞種を形成することができる（図１１Ａ〜Ｏ）。なお、本発明者は、電気穿孔に基づく導入遺伝子の送達によってこれらのｍｉｒ−３０２誘導性のｍｉｒＰＳ細胞株を形成し、レトロウイルス感染及び細胞突然変異というリスクを予防することに成功した（図２Ａ及び２Ｂ）。これらの研究の結果、ｍｉｒ−３０２ｓの異所性発現はヒト体細胞及び癌細胞を多能性ＥＳ様状態に再プログラムすることができるだけでなく、無フィーダー細胞培養条件でこれらのＥＳ様のｍｉｒＰＳ細胞の更新と多能性を維持することができるので、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）誘導性の幹細胞の生成に強力な証拠を提供した。ｍｉｒ−３０２ｓは、９１％〜９３％の高い成功率で正常組織細胞と癌性の組織細胞を多能性ＥＳ様幹細胞に再プログラムするように機能することができるとすれば、この新発明の研究結果は、幹細胞と癌症治療に有利な適用を提供できる。
以上の研究結果から、本発明者は、ｍｉｒ−３０２はサイクリン依存性キナーゼ２、サイクリンＤ１、Ｄ２の発現を顕著に抑制し、細胞増殖と移動速度を低減できるだけでなく、ＭＥＣＰ２及びＭＥＣＰ１−ｐ６６の活性を抑制し、ゲノムＤＮＡ全体の脱メチル化を誘導できることを知った（図８Ｂ〜Ｃ及び９Ｂ）。周知のように、サイクリンＥ依存性ＣＤＫ２はＳ期の細胞周期に入るのに必要で、ＣＤＫ２を抑制すると、Ｇ１期チェックポイントが停止してしまうが、サイクリンＤ１はＤＮＡの損傷に応じてＧ１期停止を乗り越えることができる。この原則に基づいて、ｍｉｒ−３０２がＣＤＫ２及びサイクリンＤ１を抑制することによって、ｍｉｒＰＳ細胞は極めて遅い分裂速度を有することを示した。図５Ａ及び５Ｃに示すように、ｍｉｒＰＳ細胞の平均細胞周期は約２０〜２４時間で、その体細胞／癌性対応細胞の平均細胞周期（１細胞周期あたりは約４〜６時間）より大幅に遅くなる。腫瘍／癌細胞は細胞増殖速度がそれほど遅い場合には生存できない。細胞周期のレートを制御することによって、ｍｉｒ−３０２は細胞の生存にも影響を与える。従って、この癌性−幹細胞周期の変換結果は、癌治療に顕著に有利である。また、ＭＥＣＰ２及びＭＥＣＰｌ−ｐ６６活性が抑制されたことは、図７Ａ〜Ｃの結果に合致し、悪性の癌細胞が良性のｍｉｒＰＳ細胞に後成的再プログラムされたことを示唆している。このように患者から得られたｍｉｒＰＳ細胞は、更に癌症組織損傷の修復を促進できると考えられる。ｍｉｒ−３０２ｓは、ゲノムインプリンティング及び細胞運命の確認に必要な細胞遺伝子を抑制することによって、分化体細胞／癌細胞を多能性ＥＳ様状態に再プログラムできるだけでなく、無フィーダー細胞培養条件下でこのようなＥＳ様状態を維持できる。さらに、ＣＤＫ２、サイクリンＤ１、Ｄ２を抑制すると、細胞増殖及び腫瘍／癌細胞の移動速度を低減できるため、ｍｉｒ−３０２ｓは、腫瘍細胞の発生と形成に対する強い腫瘍抑制因子として機能することが見出された（Ｌｉｎら，２００８ｂ）。このｍｉｒ−３０２ｓの腫瘍抑制因子という特徴は、臨床移植、幹細胞及び癌症の治療のために、腫瘍のない誘導性多能性幹細胞の生成を促進することができる。本発明の研究結果によれば、ｍｉｒ−３０２誘導性のｍｉｒＰＳ細胞は、転写因子誘導性のｉＰＳ細胞よりも再プログラムのメカニズムがより安全、鮮明で理解しやすいである。
要するに、本発明者らが新たに発明したｍｉｒ−３０２ｓ発現系は、取得しやすいため、特に体細胞毛嚢細胞の一次培養細胞による新規な多能性ＥＳ様幹細胞の生成に安全で強力な道具を提供する。イントロンｍｉＲＮＡ経路は、例えばｍＲＮＡ転写、ＲＮＡスプライシング、エキソソームプロセシング、及びＮＭＤのような複数の細胞内モニターシステムに厳しく調節されるため、通常のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ経路よりさらに有効かつ安全であると考えられている（Ｌｉｎら，２００８ａ）。有利なのは、本発明には少なくとも５つの突破がある。第１に、従来のｉＰＳ方法に用いられる全ての４つの大きい転写因子遺伝子の代わりに、ｍｉｒ−３０２を発現させる１つの導入遺伝子を用いることができ、ただ患者の幾つかの体細胞だけによってより多くの相同な多能性ＥＳ様幹細胞を生成でき、幹細胞の純度及び患者の免疫システムとの適合性が改良される。第２に、ｍｉｒ−３０２を発現させる導入遺伝子は全サイズが比較的小さい（約１０００塩基）ので、その導入遺伝子の送達がｉＰＳ方法における最大２％に対して極めて高い（成功率９１％以上）。第３に、ｍｉｒＰＳ細胞の生成と培養は、完全に無フィーダー条件で行われるので、フィーダー抗原による汚染のリスクはない。第４に、癌遺伝子を使用しないから、細胞の突然変異と腫瘍形成のリスクが予防される。最後に、本発明者は、レトロウイルス感染の代わりに電気穿孔法を用いてｍｉｒ−３０２を発現させる単一の導入遺伝子を送達するため、挿入突然変異を常に誘発する宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスのランダムな挿入によるリスクが予防される。実際には、ｍｉｒ−３０２は、強い腫瘍抑制因子として示しており、ひいては種々の腫瘍／癌細胞を多能性ＥＳ様幹細胞に再プログラムすることができる（Ｌｉｎらによる米国特許案第１２／１４９，７２５号の優先権）。とにかく、これらの利点により、レトロウイルス感染、癌突然変異、及び不定の腫瘍発生能力のリスクの予防というｉＰＳ方法の３つの問題を解決した。
多能性ＥＳ様細胞株を生成する本発明の一般的機能の他に、本発明の潜在的適用は、このように得られた多能性ＥＳ様幹細胞を用いて無フィーダー及び腫瘍のないＥＳ細胞の培養条件を維持すること、癌細胞分化及び形質転換を予防すること、純粋又は相同な幹細胞集団を単離すること、インビトロで体幹細胞株にクローニング及び精製すること、インビトロで幹細胞を純粋な体細胞組織に分化させるように誘導すること、移植と幹細胞治療の方法を発展することを更に含む。本発明はまた、幹細胞機能及びメカニズムを検討するための道具、又は、特定の用途に応じて幹細胞の特徴を変更する成分及び方法の道具として用いることができる。他の実施形態において、本発明の多能性ＥＳ様幹細胞は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、場合によってはマウスのようなほ乳類の正常及び癌性体細胞、並びに成体幹細胞の群から生成することができる。
例証の目的で図面を特に参照するが、この目的だけに限らない。
図１Ａは、イントロンｍｉＲＮＡ生合成とその関連する遺伝子サイレンシング効果のメカニズムを示す。イントロンｍｉＲＮＡは、タンパク質をコードするエクソン及び非コードイントロンを含む前駆体メッセンジャーＲＮＡの一部に転写される。ｐｒｅ−ｍＲＮＡからイントロンをスプライスし、その二次構造の一部を、標的遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる小さなｍｉＲＮＡ様分子に更にスプライスするとともに、マーカータンパク質の合成のために、エクソンが共に連結して成熟ｍＲＮＡを形成する。 図１Ｂは、イントロンｍｉＲＮＡ生合成とその関連する遺伝子サイレンシング効果のメカニズムを示す。予め設計されたイントロンｍｉＲＮＡを導入遺伝子によってＴｇ（アクチン−ＧＡＬ４：ＵＡＳ−ｇｆｐ）種のゼブラフィッシュに形質移入された実施例は、標的となる緑色ＥＧＦＰ発現に対する強い遺伝子サイレンシング効果（＞８０％抑制、左から４番目のレーン）を示し、（レーン１〜５）ｍｉＲＮＡを有しない空イントロン（１）、ＨＩＶ−ｐ２４（２）又はインテグリンβ１（３）に対するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入配列を有するイントロン、及び抗ＥＧＦＰｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入配列があるが機能性５’スプライス部位がないイントロン（５）を含む、他の的外れの挿入配列は機能しない。抗ＥＧＦＰｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、赤方偏移蛍光マーカー（ＲＧＦＰ）遺伝子の５’近接端イントロン領域に挿入される。ノーザンブロット分析（右）は、成熟ｍｉＲＮＡが空ＲＧＦＰ（−）又は欠損ＲＧＦＰ（Δ）ではなく、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを挿入したＲＧＦＰスプライシング産物だけより生成されることを示している。これは、イントロンｍｉＲＮＡ生合成においてＲＮＡスプライシングが必要であることを表明している。 図２Ａ及び２Ｂは、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を含む修飾されたＴｅｔ−Ｏｎベクター（すなわち、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓ）を用いて、ｍｉｒ−３０２ｓｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスター又はｓｈＲＮＡを発現させる構造体及び方策を示す。電気穿孔に基づく導入遺伝子導入法を用いて、ｍｉｒ−３０２を発現させるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を、標的となる体細胞／癌細胞に形質移入する。 図２Ａ及び２Ｂは、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を含む修飾されたＴｅｔ−Ｏｎベクター（すなわち、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓ）を用いて、ｍｉｒ−３０２ｓｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスター又はｓｈＲＮＡを発現させる構造体及び方策を示す。電気穿孔に基づく導入遺伝子導入法を用いて、ｍｉｒ−３０２を発現させるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を、標的となる体細胞／癌細胞に形質移入する。 図３Ａは、電気穿孔形質移入に基づいて予め設計されたＴｅｔ−Ｏｎ発現ｍｉｒ−３０２の導入遺伝子により、ヒト正常毛嚢ｈＨＦＣ及び癌性の黒色腫Ｃｏｌｏ細胞を多能性ＥＳ様干（ｍｉｒＰＳ）細胞に再プログラムしたことを示す。Ｔｅｔ−Ｏｎ誘導性ベクター（すなわち、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ）において組換えられたｍｉｒ−３０２を発現させる導入遺伝子（すなわちＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ）の構造。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子は、ヒト細胞ゲノムの標的部位に組換え挿入するために、３７０塩基対（ｂｐ）の相同領域に並んでいる。 図３Ｂは、電気穿孔形質移入に基づいて予め設計されたＴｅｔ−Ｏｎ発現ｍｉｒ−３０２の導入遺伝子により、ヒト正常毛嚢ｈＨＦＣ及び癌性の黒色腫Ｃｏｌｏ細胞を多能性ＥＳ様干（ｍｉｒＰＳ）細胞に再プログラムしたことを示す。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子のイントロンの一部として組み込まれた、ｍｉｒ−３０２ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ）の構造体。 図３Ｃは、電気穿孔形質移入に基づいて予め設計されたＴｅｔ−Ｏｎ発現ｍｉｒ−３０２の導入遺伝子により、ヒト正常毛嚢ｈＨＦＣ及び癌性の黒色腫Ｃｏｌｏ細胞を多能性ＥＳ様干（ｍｉｒＰＳ）細胞に再プログラムしたことを示す。ＦＡＣＳフローサイトメトリー選別及びＲＧＦＰマーカーに対する抗体による、陽性ｍｉｒ−３０２により形質移入したｍｉｒＰＳ細胞の選択。本発明の導入遺伝子送達の成功率は、約９１％〜９３％と測定された。 図４Ａは、種々のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）濃度の制御下でＴｅｔ−Ｏｎでｍｉｒ−３０２を発現させるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子のｍｉｒＰＳ細胞ゲノムにおける組み込み、及びｍｉｒ−３０２ファミリー要素（ｍｉｒ−３０２ｓ）の誘導型発現の引き起しを示す。すべてのｍｉｒＰＳ細胞が導入遺伝子の１つ又は２つの付随コピーだけを持つのに対し、始原ｈＨＦＣ及びＣｏｌｏ細胞（対照）は、導入遺伝子が検出されていないことを示す、異なるｍｉｒＰＳ細胞株から単離されたゲノムＤＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ；左）分析。蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；右）測定は、導入遺伝子がヒトゲノムの特定部位に挿入されることを更に示している。上記制限された導入遺伝子挿入は、ｍｉｒ−３０２発現の全体濃度がｍｉｒＰＳ細胞の生存に影響を与え得ることを示している。 図４Ｂは、種々のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）濃度の制御下でＴｅｔ−Ｏｎでｍｉｒ−３０２を発現させるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子のｍｉｒＰＳ細胞ゲノムにおける組み込み、及びｍｉｒ−３０２ファミリー要素（ｍｉｒ−３０２ｓ）の誘導型発現の引き起しを示す。Ｄｏｘ濃度に応じる誘導性ｍｉｒ−３０２ｓ発現を示すノーザンブロット及びバーチャート。 図５Ａは、ヒト正常毛嚢（ｈＨＦＣ）及び癌性の黒色腫Ｃｏｌｏ細胞から多能性ＥＳ様幹（ｍｉｒＰＳ）細胞へ再プログラムする変化を示す。ｍｉｒ−３０２により形質移入した細胞（すなわち、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ及びｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ）における、形態及び細胞増殖速度の変化。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）によって誘導されたｍｉｒ−３０２により形質移入した細胞において、ＥＳ様円形細胞形状及び大幅に遅い細胞更新速度が発現された。 図５Ｂは、ヒト正常毛嚢（ｈＨＦＣ）及び癌性の黒色腫Ｃｏｌｏ細胞から多能性ＥＳ様幹（ｍｉｒＰＳ）細胞へ再プログラムする変化を示す。ｍｉｒＰＳ細胞由来の胚様体（ＥＢ）の形成、及び陽性Ｔｕｊ１及び／又はＡＢＣＡ２マーカーによる神経前駆細胞への誘導分化。 図５Ｃは、ヒト正常毛嚢（ｈＨＦＣ）及び癌性の黒色腫Ｃｏｌｏ細胞から多能性ＥＳ様幹（ｍｉｒＰＳ）細胞へ再プログラムする変化を示す。限界希釈後、単一のｍｉｒＰＳ細胞からＥＢを形成する時間的経過。細胞周期は、約２０〜２４時間と推定される。 図６Ａは、ｍｉｒ−３０２ｓ形質移入とＥＳマーカー発現との間の関連性を示す。Ｄｏｘ誘導下で、全てのｍｉｒ−３０２ファミリー要素（ｍｉｒ−３０２ｓ）はｍｉｒＰＳ細胞においては高度に発現されるが、始原体細胞においては発現されない（ｎ＝３，ｐ＜０．０１）ことを示す全ｍｉＲＮＡ発現のマイクロアレイ分析である。 図６Ｂは、ｍｉｒ−３０２ｓ形質移入とＥＳマーカー発現との間の関連性を示す。ヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１及びＷＡ０９−Ｈ９細胞において観測されたものと非常に類似するような、Ｄｏｘ誘導下でｍｉｒＰＳ細胞によるＯｃｔ３／４（Ｏｃｔ４）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇを含む大量のＥＳ細胞マーカーの発現は多いが、Ｋｌｆ４発現は少ない（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）ことを示すノーザンブロット及びウェスタンブロット分析である。 図７Ａは、種々のｍｉｒＰＳ細胞株におけるゲノムのＤＮＡ脱メチル化のパターンを示す。ｍｉｒＰＳ細胞におけるゲノム全体範囲内の全ＣｐＧメチル化の喪失を示すＨｐａＩＩ分解である。 図７Ｂは、種々のｍｉｒＰＳ細胞株におけるゲノムのＤＮＡ脱メチル化のパターンを示す。Ｏｃｔ３／４プロモーターの９，４００ｂｐ調節領域において、非メチル化のＡＣＧＴが重亜硫酸塩修飾によってＡＵＧＴ部位になるが、これはすべてのｍｉｒＰＳ細胞において非メチル化のＡＣＴＧ（又はＡＵＣＴ）部位が顕著に増えたことを示す。 図７Ｃは、種々のｍｉｒＰＳ細胞株におけるゲノムのＤＮＡ脱メチル化のパターンを示す。Ｏｃｔ３／４プロモーターに並んだ起点の詳細なメチル化図を示す重亜硫酸塩ＤＮＡ配列決定である。黒い円いと白い円は、それぞれメチル化と非メチル化のシトシン部位を示す。 図７Ｄは、種々のｍｉｒＰＳ細胞株におけるゲノムのＤＮＡ脱メチル化のパターンを示す。その始原転移癌性ＰＣ３細胞に比べて、ｍｉｒＰＳ−ＰＣ３細胞は移動能が低減されることを示す。 図８Ａは、Ｃｏｌｏ、ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ、ヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）及びＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）細胞における全ゲノム遺伝子発現の分析を示す。ヒトゲノムＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ａ&Ｂ及びｐｌｕｓ２．０アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて変わった遺伝子発現パターンを比較し、ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ細胞がＨ１細胞（８９％）及びＨ９細胞（８６％）と高度に相似性を有するが、癌性のＣｏｌｏ細胞とは相似性（５３％）が高くないことを示す。白い点は、安定発現の遺伝子（緑点）に比べて高度に変化した遺伝子を指す。 図８Ｂは、Ｃｏｌｏ、ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ、ヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）及びＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）細胞における全ゲノム遺伝子発現の分析を示す。ＥＳ細胞マーカーが顕著に増え、黒色腫の癌遺伝子、発生シグナル及びｍｉｒ−３０２の標的となる細胞増殖が顕著に低減し、またｍｉｒＰＳ細胞においてＤＮＡメチル化遺伝子が検出され、Ｈ１及びＨ９細胞と非常に類似する（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）ことを示す、マイクロアレイ同定された特異的発現の遺伝子の機能クラスタリングである。 図８Ｃは、ノーザンブロット及びウェスタンブロット分析を示し、ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ細胞におけるｍｉｒ−３０２ｓ、ヒトＥＳ様細胞マーカーと予知したｍｉｒ−３０２標的遺伝子の発現パターンとの間の関連性が立証され、Ｋｌｆ４の発現を除いてヒトＥＳ様Ｈ１及びＨ９細胞と類似する（ｎ＝ ３、ｐ＜０．０１）ことを示している。 図９Ａは、ｈＨＦＣ、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ、ヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）及びＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）細胞における全ゲノム遺伝子発現の分析を示す。ヒトゲノムＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３ ｐｌｕｓ ２．０アフィメトリクスを用いて変わった遺伝子発現パターンを比較し、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞はＨ１細胞（９６％）及びＨ９細胞（９１％）と高度に相似性を有するが、ｈＨＦＣ体細胞との相似性（４７％−５６％）が高くないことを示している。 図９Ｂは、ｈＨＦＣ、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ、ヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）及びＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）細胞における全ゲノム遺伝子発現の分析を示す。ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞におけるｍｉｒ−３０２ｓ、ヒトＥＳ様細胞マーカーと予知したｍｉｒ−３０２標的遺伝子の発現パターンとの間の関連性が立証され、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５の発現を除いてヒトＥＳ様Ｈ１及びＨ９細胞と類似するウェスタンブロット分析である。挙げられたｍｉｒ−３０２標的遺伝子は、１７種類の転写調節因子、１種類のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡ４）、メチルＣｐＧ結合した２種類のタンパク質（ＭＥＣＰ１−ｐ６６及びＭＥＣＰ２）、及び３種類の細胞周期チェックポイントタンパク質（ＣＤＫ２、サイクリンＤ１、Ｄ２）を含む。 図１０は、雌性の偽妊娠の免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスの子宮又は腹膜腔におけるｍｉｒＰＳ移植物に由来する奇形腫様原基組織を示す。これらの分化された組織は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉という３つの胚葉の全てを含み、これらの異なる細胞形態は、例えばヘマトキシリン及びエオシン（ｅｏｓｉｎ）（Ｈ & Ｅ）によって染色された後確認された。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００システムによって２００×倍率で顕微写真を取った。 図１１Ａ〜Ｏは、誘導されたｍｉｒＰＳ細胞の多能性を示す。免疫不全マウスにおいて、エクスビボで上から下にそれぞれＤＨＴ、ＴＧＦ−β１及びＢＭＰ４に対する処理は、ｍｉｒＰＳ細胞を精原細胞様細胞（Ａ〜Ｅ）、線維芽細胞（Ｆ〜Ｊ）及び軟骨細胞（Ｋ〜Ｏ）組織細胞に分化させるように誘導する。免疫不全の裸マウスは、移植療法のインビボ環境を模倣するために用いられる。左から右に示された顕微写真は、微分干渉コントラストによるヘマトキシリン染色（Ａ、Ｆ、Ｋ）、導入遺伝子ｍｉｒ−３０２マーカーＲＧＦＰ（赤色）で標記された明視野（Ｂ、Ｇ、Ｌ）、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで標記された第１の組織マーカー（青色ＤＡＰＩ）に対する免疫染色（Ｃ、Ｈ、Ｍ）、フルオレセインで標記された第２の組織マーカー（緑色ＥＧＦＰ）に対する免疫染色（Ｄ、Ｉ、Ｎ）、及び全部の３種類の蛍光マーカーの組合せ（Ｅ、Ｊ、Ｏ）を示す。ＲＧＦＰ−明視野において、小さい窓は、高倍率（６００ｘ）でｍｉｒＰＳ細胞を分化させる形態を示す。 図１１Ａ〜Ｏは、誘導されたｍｉｒＰＳ細胞の多能性を示す。免疫不全マウスにおいて、エクスビボで上から下にそれぞれＤＨＴ、ＴＧＦ−β１及びＢＭＰ４に対する処理は、ｍｉｒＰＳ細胞を精原細胞様細胞（Ａ〜Ｅ）、線維芽細胞（Ｆ〜Ｊ）及び軟骨細胞（Ｋ〜Ｏ）組織細胞に分化させるように誘導する。免疫不全の裸マウスは、移植療法のインビボ環境を模倣するために用いられる。左から右に示された顕微写真は、微分干渉コントラストによるヘマトキシリン染色（Ａ、Ｆ、Ｋ）、導入遺伝子ｍｉｒ−３０２マーカーＲＧＦＰ（赤色）で標記された明視野（Ｂ、Ｇ、Ｌ）、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで標記された第１の組織マーカー（青色ＤＡＰＩ）に対する免疫染色（Ｃ、Ｈ、Ｍ）、フルオレセインで標記された第２の組織マーカー（緑色ＥＧＦＰ）に対する免疫染色（Ｄ、Ｉ、Ｎ）、及び全部の３種類の蛍光マーカーの組合せ（Ｅ、Ｊ、Ｏ）を示す。ＲＧＦＰ−明視野において、小さい窓は、高倍率（６００ｘ）でｍｉｒＰＳ細胞を分化させる形態を示す。 図１１Ａ〜Ｏは、誘導されたｍｉｒＰＳ細胞の多能性を示す。免疫不全マウスにおいて、エクスビボで上から下にそれぞれＤＨＴ、ＴＧＦ−β１及びＢＭＰ４に対する処理は、ｍｉｒＰＳ細胞を精原細胞様細胞（Ａ〜Ｅ）、線維芽細胞（Ｆ〜Ｊ）及び軟骨細胞（Ｋ〜Ｏ）組織細胞に分化させるように誘導する。免疫不全の裸マウスは、移植療法のインビボ環境を模倣するために用いられる。左から右に示された顕微写真は、微分干渉コントラストによるヘマトキシリン染色（Ａ、Ｆ、Ｋ）、導入遺伝子ｍｉｒ−３０２マーカーＲＧＦＰ（赤色）で標記された明視野（Ｂ、Ｇ、Ｌ）、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで標記された第１の組織マーカー（青色ＤＡＰＩ）に対する免疫染色（Ｃ、Ｈ、Ｍ）、フルオレセインで標記された第２の組織マーカー（緑色ＥＧＦＰ）に対する免疫染色（Ｄ、Ｉ、Ｎ）、及び全部の３種類の蛍光マーカーの組合せ（Ｅ、Ｊ、Ｏ）を示す。ＲＧＦＰ−明視野において、小さい窓は、高倍率（６００ｘ）でｍｉｒＰＳ細胞を分化させる形態を示す。
以下、図面を参照して本発明の特定の実施形態を説明するが、これらの実施形態は例示のために過ぎず、多くの可能性のある特定の実施形態のうち、本発明の原理の応用を代表できるほんの少し例証しか説明していないことを理解すべきである。当業者にとって明らかな各種の変更や修飾は、付属する特許請求の範囲でさらに定義されるような本発明の精神、範囲や企図の範ちゅうに含まれるとみなされる。
本発明は、誘導性組換えマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）様短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いてほ乳類体細胞／癌細胞の遺伝及び行動特性を多能性胚性幹様細胞（ＥＳ）状態に再プログラムする、新規な核酸成分と遺伝子導入法を提供する。すなわち、本発明は、少なくとも１つのほ乳類細胞を少なくとも１つの多能性幹様細胞に再プログラムする方法を提供する。この方法は、例えば、ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子を発現する少なくとも１つの細胞基質を提供する工程と、細胞基質の中のｍｉｒ−３０２と相同な少なくとも１つの遺伝子サイレンシングエフェクターに送達、転写及びプロセシングできる少なくとも１つの組換え核酸成分を提供する工程と、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞遺伝子が抑制された条件で上記組換え核酸成分を用いて細胞基質を処理する工程とを含む。従来のｓｈＲＮＡ設計と異なり、本発明にかかるｓｈＲＮＡは、天然ｍｉｒ−３０２ｓの前駆体（ｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ｓ）に類似するミスマッチステムアームを含んでもよい。さらに、本発明にかかるｓｈＲＮＡは、例えば５’ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．ｌ）及び５’ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）のような、ｔＲＮＡ輸送に干渉せずに天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと同じ核外への輸送効率を提供できる、改良されたｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ステムループを更に含んでもよい。すなわち、遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１又はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２と相同な配列を含む。いずれの特定の理論に制限せずに、上記再プログラムは、新たに発現されたｍｉｒ−３０２媒介性の遺伝子サイレンシングメカニズムに関与し、このメカニズムは、ｍｉｒ−３０２ファミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ）又はｍｉｒ−３０２と相同なｓｈＲＮＡを発現できる組換え導入遺伝子を形質移入することによって引き起こされる。
１つの好ましい実施形態において、本発明にかかる導入遺伝子発現の設計は、天然イントロンｍｉＲＮＡ生合成の経路に基づく（図１Ａ）。本発明者は、赤方偏移蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）をコードする組換え導入遺伝子であるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰを発現させる新規な核酸成分を設計した。上記導入遺伝子は、細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセシング機構によってイントロンｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡ様遺伝子サイレンシングエフェクターを生成することができる人造／人工スプライシング可能なイントロン（ＳｐＲＮＡｉ）を含む（Ｌｉｎら， ２００３， ２００６ａ，ｂ）。実施例１は、ＳｐＲＮＡｉイントロン及びＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を設計・構築するプロトコルについて説明する。ＳｐＲＮＡｉは、ほ乳類ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）によってＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子の一次転写産物（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）において共同転写され、ＲＮＡスプライシング／プロセシングによって切断される。その後、スプライス済みＳｐＲＮＡｉは、標的遺伝子に対する特異的転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）作用を引き起こすように、例えば天然ｍｉＲＮＡ及び人工ｓｈＲＮＡのような成熟な遺伝子サイレンシングエフェクターに更にプロセシングされる。この場合、本発明は、組換えｍｉｒ−３０２ｓ及び／又はｍｉｒ−３０２ｓと相同なｓｈＲＮＡを生成させる。一方、所望のｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現の同定に用いることができる赤色蛍光マーカータンパク質に翻訳するために、イントロンスプライシング後、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子転写産物のエクソンが連結して、成熟ＲＧＦＰｍＲＮＡを形成する。又は、ＲＧＦＰの代わりに機能性タンパク質エクソンを使用し、例えばＥＳ細胞マーカー遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ−２８、ＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４のような他の遺伝子機能を提供してもよい。
別の好ましい実施形態において、本発明は、ほ乳類細胞におけるｍｉｒ−３０２様ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子／相同体に送達、転写及びプロセシングできるから、細胞においてｍｉｒ−３０２の標的となる発生及び分化関連の遺伝子に対する特異的遺伝子サイレンシング効果を誘導する単離された薬剤誘導性核酸成分を用いる、ほ乳類体細胞／癌細胞を多能性ＥＳ様幹細胞に再プログラムする新規方法であって（図２Ａ及び２Ｂ）、ａ）ｍｉｒ−３０２の標的となる発生及び分化に関連する複数の遺伝子を発現させる細胞基質を提供する工程と、ｂ）細胞内メカニズムによって成熟ｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ又はその相同体にプロセシングされるから、細胞基質における標的遺伝子の機能を抑制できる複数の非コードｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ又はその相同体をコードする単離ＲＮＡを、転写できる組換え核酸成分を提供する工程と、ｃ）細胞基質において標的遺伝子の機能が抑制された条件で組換え核酸成分によって細胞基質を処理する工程とを含む方法を提供する。薬剤誘導性組換え核酸成分は、組換えｍｉｒ−３０２ファミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２９−３６の雑種）又は手動再設計したｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡ相同体（すなわち、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７と２８の雑種）を挿入したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を含むＴｅｔ−Ｏｎベクターであることが最も好ましい。つまり、組換え核酸成分は、薬剤誘導性遺伝子の発現ベクターを含む。また、組換え核酸成分は、プラスミド、ウィルスベクター、レトロトランスポゾン、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子発現ベクターを含んでもよい。また、組換え核酸成分は、Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ遺伝子発現ベクターを含む。細胞基質は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボでｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ及びその標的遺伝子を発現させることができる。実施例２、３は、ｍｉｒ−３０２ ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの構築及び導入遺伝子の送達についてのプロトコルを説明する。
本発明者は、細胞内スプライセオソーム、エキソソーム及びＮＭＤシステムによって、イントロンｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ因子をＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子から放出させるように触媒する。実施例１や図２Ａ、２Ｂは、細胞内スプライセオソーム構成要素をＳｐＲＮＡｉのいくつかのｓｎＲＮＰ認識部位［例えばｓｎＲＮＰＵ１、Ｕ２、Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５トリｓｎＲＮＰに必要な、５’スプライス部位（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）、分岐点モチーフ（ＢｒＰ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７又は８）及び３’スプライス部位（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５）を含む結合モチーフ］において順にＤＮＡ組換えを行わせることによって、合成ｓｎＲＮＰ認識要素をＳｐＲＮＡｉイントロンに組み込み、このような人工組換え型ＳｐＲＮＡｉを単離された誘導性ＲＧＦＰ遺伝子に組み込んでＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を形成する方法についてそれぞれ説明する。さらに、ＳｐＲＮＡｉは、組換えｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ因子をクローニングして発現させるように、５’スプライス部位とＢｒＰモチーフとの間に位置するイントロン挿入部位を更に含む。実施例２及び図３Ｂは、組換えｍｉｒ−３０２ファミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ）又は手動再設計したｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡ相同体の構築について説明する。実施例３及び図３Ｃは、組換えｍｉｒ−３０２ｓ ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの関連細胞への形質移入及び陽性導入遺伝子細胞の選択について説明する。すなわち、ｍｉｒ−３０２ マイクロＲＮＡ又はＯｃｔ３／４をマーカーとして用いて多能性幹様細胞を選択的に単離する。実施例４〜１２は、ほ乳類体細胞／癌細胞の多能性ＥＳ様細胞への再プログラムを評価するための測定について説明する。測定の結果を図４〜１１に示す。
ｍｉｒ−３０２様ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現できる誘導性ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子発現系の設計及び構築
本発明は、誘導性Ｔｅｔ−Ｏｎ／ＯｆｆイントロンｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現系であるｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ（図３Ａ）を用いて、ドキシサイクリン誘導制御下で、細胞内イントロンｍｉＲＮＡ生合成のメカニズムによって、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターの導入遺伝子発現を引き起こす（図１Ａ）。実施例１、２は、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓの構築について説明する。ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクターは、関連細胞に形質移入した後、ＴＲＥ−Ｐｏｌ−ＩＩ誘導性の組換え導入遺伝子、すなわち、ヘアピン様ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡのようなイントロン遺伝子サイレンシングエフェクターを生成できる人工スプライシング可能なイントロン（ＳｐＲＮＡｉ）を含むＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰを転写する（図３Ａ、３Ｂ）。実施例１に示すように、若干の合成ＤＮＡ配列を順にライゲーションすることで、遺伝子工学的にＳｐＲＮＡｉを赤方偏移蛍光タンパク質遺伝子（ＲＧＦＰ）に組み込む。ＳｐＲＮＡｉは、スプライセオソーム、エキソソーム、及びNMDシステムの構成要素のような細胞内RNAのスプライシング及びプロセシングメカニズムによって放出され、その後イントロンRNA媒介性の遺伝子サイレンシングを引き起こせる前駆体miRNA又はshRNA挿入配列（部位）を含む。ＳｐＲＮＡｉの運搬及び生成に使用できる他のＲＮＡ転写産物は、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｍｎＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ、及びこれらの前駆体と誘導体を含む。
実施例１に示すように、ＳｐＲＮＡｉを合成し、シライトイソギンチャクのＨｃＲｅｄ１色素タンパク質から突然変異して得たイントロン不含の赤方偏移蛍光タンパク質遺伝子（ＲＧＦＰ又はｒＧＦＰ）に組み込み、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を形成した。挿入されたＳｐＲＮＡｉはＲＧＦＰの機能的な蛍光タンパク質構造を破壊するので、形質移入に成功した細胞又は生体における５７０ｎｍの波長の赤色蛍光放射の再出現によって、イントロンの除去及びＲＧＦＰ−ｍＲＮＡへの成熟を確認することができる（図１Ｂ）。この組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子の構築は、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）での天然構造のスプライセオソームイントロンに基づくものである。ＳｐＲＮＡｉの主な構成要素は、例えば正確な開裂のための末端の５’及び３’スプライス部位、スプライシング認識用の分岐点モチーフ（ＢｒＰ）、スプライセオソーム相互作用のためのポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）、これらの各構成要素を連結するリンカー、及び所望のイントロン挿入用のいくつかの制限部位のような、複数のｓｎＲＮＰ認識部位及びリンカーを含む。本発明のSpRNAiの5’末端から3’末端への構造は、５’スプライス部位、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターと相同なイントロン挿入配列、分岐点モチーフ（ＢｒＰ）、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）、及び３’スプライス部位を含む。加えて、いくつかの翻訳終止コドン（Ｔコドン）は、ＳｐＲＮＡｉの３’スプライス部位の近くのリンカー配列に配置してもよい。
遺伝学において、５’スプライス部位は、５’ＧＴＡＡＧＡＧＫ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）又はＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵモチーフ（例えば５’ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３７）、５’ＧＴＡＡＧＡＧＴ−３’、５’ＧＴＡＧＡＧＴ−３’、５’ＧＴＡＡＧＴ−３’）のいずれかを含むか、又はそのいずれかと相同なヌクレオチド配列であるが、３’スプライス部位は、ＧＷＫＳＣＹＲＣＡＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５）又はＣＴ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＮＧモチーフ（例えば５’ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４２）、５’ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’、５’ＣＣＡＣＡＧ−３’）のいずれかを含むか、又はそのいずれかと相同なヌクレオチド配列である。さらに、分岐点配列は、５’と３’スプライス部位間に位置し、５’ＴＡＣＴＡＡＣ−３’及び５’ＴＡＣＴＴＡＴ−３’のような５’ＴＡＣＴＷＡＹ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）モチーフと相同な配列を含む。分岐点配列のアデノシン「Ａ」ヌクレオチドは、ほぼ全てのスプライセオソームイントロンにある細胞（２’５’）オリゴアデニル酸合成酵素及びスプライセオソームによって、（２’５’）結合型の投げ縄イントロンＲＮＡの一部を形成する。さらに、ポリピリミジントラクトは、分岐点と３’スプライス部位の間に近接して位置し、５’（ＴＹ）ｍ（Ｃ／-）（Ｔ）ｎＳ（Ｃ／-）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７）又は５’（ＴＣ）ｎＮＣＴＡＧ（Ｇ／-）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）モチーフのいずれかと相同なＴ又はＣ高含量のオリゴヌクレオチド配列を含む。ここで、シンボル「ｍ」、「ｎ」は、１以上の（≧１）の複数の反復配列を示し、最も好ましくは、数ｍは１〜３、数ｎは７〜１２である。シンボル「-」は、配列内に１つの空ヌクレオチドがあることを示す。また、これらの全イントロン構成要素をつなげるために、いくつかのリンカーヌクレオチド配列もある。米国特許法施行規則（37 CFR）第1.822条のヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列データに使用するシンボル及び書式に関するガイドラインに基づき、シンボルＷはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＫはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＳはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）、シンボルＹはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＲはアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）、シンボルＮはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味する。上記全てのスプライセオソーム認識構成要素について、デオキシチミジン（Ｔ）ヌクレオチドをウリジン（Ｕ）で置き換え可能である。
スプライス済みＳｐＲＮＡｉ挿入配列の機能を試験するために、様々な遺伝子サイレンシングエフェクター構造体を組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子導入のイントロン挿入部位に入れてクローニングすることができる。イントロン挿入部位は、エンドヌクレアーゼＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩ／ＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ／ＬＩ、ＡｓｅＩ、Ａｓｐ７１８Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｌＩ／ＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＢｓｐＨＩ／ＬＵＩＩＩ／１２０Ｉ、ＢｓｒＩ／ＢＩ／ＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ／ＳＩ、ＢｓｔＢＩ／Ｕ１／ＸＩ、ＣｌａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ／ＩＩ、ＥａｇＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＲＩＩ／４７III、ＥｈｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅIII、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨｉｎｄIII、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ／ＩＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭａｅＩＩ／ＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ１０Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ／ＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ／ＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ及びこれらの組み合わせの群から選ばれる制限酵素によって認識される複数の制限・クローニング部位を含む。これらのイントロン挿入配列は、投げ縄型ＲＮＡ、短鎖一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボザイム、及びこれらの前駆体、さらにセンス又はアンチセンス構造、もしくはその両者のいずれかの誘導体、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる高度二次構造として転写できるＤＮＡ鋳型である。
関連細胞又は生体での導入遺伝子の送達を簡便にするために、本発明のＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子は、ＤＮＡ導入遺伝子、プラスミド、レトロトランスポゾン、トランスポゾン、ジャンピング遺伝子、ウィルスベクター、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる発現可能ベクターに組み込むことが好ましい。このように得られた導入遺伝子発現ベクター類は、化学的／リポソーム形質移入、電気穿孔法、トランスポゾン媒介ＤＮＡ組換え、ジャンピング遺伝子挿入、ウィルス感染、マイクロインジェクション、遺伝子銃による貫入、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる高効率の遺伝子送達法によって細胞又は生体に導入することが好ましい。すなわち、組換え核酸成分は、リポソーム形質移入、化学的形質移入、導入遺伝子ＤＮＡ組換え、ウィルス感染、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、マイクロインジェクション、電気穿孔法、遺伝子銃による貫入、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子送達法によって上記ほ乳類細胞に導入する。上記ベクターは、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子の発現のために、少なくとも１つのウィルス、Ｐｏｌ−ＩＩ又はＰｏｌ−ＩＩＩプロモーター、又はこれらの組み合わせを更に含んでもよい。実施例３に示すように、導入遺伝子はＴｅｔ−Ｏｎ／Ｏｆｆベクターに組み込まれ、電気穿孔法によってこの導入遺伝子を標的細胞に送達することが最も好ましい。また、ベクターは更に、真核細胞における翻訳効率を上げるＫｏｚａｋ翻訳開始共通配列、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子の下流に位置する複数のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、原核細胞増殖のためのｐＵＣ複製起点、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ構造体をベクターに組み込むための少なくとも２箇所の制限部位、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現するほ乳類細胞の選択的ＳＶ４０複製起点、及び複製可能な原核細胞で抗生物質耐性遺伝子を発現させるための選択的ＳＶ４０初期プロモーターを含んでもよい。すなわち、組換え核酸成分は、テトラサイクリン応答要素、ウィルス又はＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーター又はその両者、Ｋｏｚａｋ翻訳開始共通配列、ポリアデニル化シグナル、複数の制限／クローニング部位及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるものである。また、組換え核酸成分は、ｐＵＣ複製起点、複製可能な原核細胞において抗生物質耐性遺伝子を少なくとも１つ発現させるＳＶ４０初期プロモーター、ほ乳類細胞における選択的ＳＶ４０複製起点、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるものである。抗生物質耐性遺伝子の発現は、導入遺伝子発現で陽性クローニングを単離する選択的マーカーとして用いられる。抗生物質は、ペニシリンＧ、アンピシリン、ネオマイシン、パロマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、スペクトロマイシン、フォスフォマイシン、テトラサイクリン、リファピシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、セファロチン、チロシン、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるものである。
ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子発現イントロンｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを用いた方策が、その緑色EGFP遺伝子発現を標的にするために、Tg（アクチン-GAL4:USA-gfp）系統ゼブラフィッシュにおいてインビボで試験した。実施例６及び図１Ｂに示すように、人工組換え型抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入配列を発現するＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰプラスミドのリポソームの形質移入（第４レーン）は、極めて強力なＥＧＦＰ遺伝子サイレンシング効果（遺伝子ノックダウン率＞80%）を示しているが、下記のレーンによって示された挿入配列ではサイレンシング効果が全く検出できなかった。上記レーンは、左から右に、１：空ベクター対照（Ｃｔｌ）、２：ＨＩＶ−ｐ２４を標的にするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入配列（偽）、３：ヘアピンループ構造を備えていないアンチセンスＥＧＦＰ挿入配列（アンチ）、及び５：抗ＥＧＦＰｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと完全に相補的な逆位ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲ*）である。マーカーＲＧＦＰとハウスキーピンβ−アクチンなどのような標的外遺伝子ではこのような効果は検知されなかったので、上記イントロンｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングは極めて標的特異的であることを示唆している。さらに、ノーザンブロット分析（図１Ｂ、右）によって、本発明者らは設計されたSpRNAi-RGFP遺伝子転写産物からのみ有効なイントロン短鎖RNAの生成を観察できたが（中央レーン）、イントロン不含のRGFPの天然転写産物（左レーン）又は機能的な5’スプライス部位のない欠損SpRNAi-RGFPの転写産物では、これらは観察されなかった。一方、スプライズ済みRGFPエクソンは連結し、マーカー赤色蛍光タンパク質の翻訳のために成熟RNAを形成することができる。
組換えｍｉｒ−３０２ファミリークラスター及びｍｉｒ−３０２様ｓｈＲＮＡ相同体の設計及び構築
一部の天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのヘアピンループ構造は過大及び／又は複雑でＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子に適しないため、本発明者は、天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループの代わりに、修飾されたｔＲＮＡｍｅｔループ（すなわち５’（Ａ／Ｕ）ＵＣＣＡＡＧＧＧＧＧ−３’）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４３）を設計した。ｔＲＮＡｍｅｔループは、天然ｍｉＲＮＡと同じなＲａｎ−ＧＴＰ及びエクスポーチン−５の輸送メカニズムによって、手動再設計したｍｉＲＮＡの細胞核から細胞質への輸送を効率的に促進することが示されている（Ｌｉｎら，２００５）。有利なのは、現在、本発明は、５’ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．ｌ）及び５’ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）を含む、手動改良した１対のｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ループを使用し、これらは天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと同様な核外への輸送効率を備えるが、ｔＲＮＡ輸送には干渉しない。この改良はさらに、ｍｉｒ−３０２ｓ全体の機能を安定化できるｍｉｒ−３０２ａ−ｍｉｒ−３０２ａ*とｍｉｒ−３０２ｃ−ｍｉｒ−３０２ｃ*のデュプレックスの形成を促進する。ｔＲＮＡｍｅｔループをｍｉｒ−３０２ｂ／ｍｉｒ−３０２ａの短鎖ステムループと組み合わせることによって、これらの新しいｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループについての設計が改善され、ｍｉｒ−３０２ｂ／ｍｉｒ−３０２ａは胚性幹細胞では高度に発現しているが、他の分化組織細胞ではそうでない。従って、ｍｉｒ−３０２ｓにおけるこれらの人造／人工ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループの使用は、インビボでの天然ｍｉＲＮＡ経路に干渉せず、非常に小さい毒性しか生じなく、さらに安全的である。
ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ及びｍｉｒ−３０２ｄの成熟配列は、それぞれ５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＵＧＧ ＵＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０）、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＵＡＧ ＵＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１）、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣＡＧ ＵＧＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ． １２）、及び５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵＧＡＧ ＵＧＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３）である。これらのｍｉｒ−３０２ファミリー遺伝子サイレンシングエフェクターは、最初の１７ヌクレオチドにおいて５’末端領域の高度な保存を共有しており（１００％相同性）、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）と同じである。すなわち、遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３と配列相同性又は／及び相補性を有する。これらのｍｉｒ−３０２配列と相同な配列についての設計において、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）を用いてもよい。
実施例２に述べるように、家族性ｍｉｒ−３０２ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスターは、合成ｍｉｒ−３０２相同体のハイブリダイゼーション及び連結／ライゲーションによって形成され、５’から３’方向にｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ及びｍｉｒ−３０２ｄｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである４つの部分からなる（図３Ｂ）。これらの手動再設計した全てのｍｉｒ−３０２ ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ相同体は、最初の１７ヌクレオチドにおいて同じ５’末端［例えば、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）］を有する。又は、イントロンを容易に挿入するために、ｍｉｒ−３０２ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスターの代わりに手動再設計したｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡを用いてもよい。合成ｍｉｒ−３０２ｓ−センス５’ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴ ＡＧＴＧＴＧＣＴＡＡ ＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡ ＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧ ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡ ＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣ ＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７）及びｍｉｒ−３０２ｓ−アンチセンス５’ＡＴＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴ ＡＧＴＧＴＧＣＣＴＧ ＧＣＴＴＡＧＣＡＣＡ ＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧ ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡ ＴＧＡＣＧＡＴＣＧＧ ＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２８）とをハイブリダイゼーションさせることによって、再設計されたｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡを形成する。この再設計されたｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡは、全ての天然ｍｉｒ−３０２要素と９１％以上の相同性を有し、ヒト体内の同様なｍｉｒ−３０２標的遺伝子を標的とする。
ｍｉｒ−３０２を誘導的発現させるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子の、ヒト正常毛嚢の一次培養細胞（ｈＨＦＣ）及び癌性の黒色腫Ｃｏｌｏ細胞への送達
組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子のイントロン挿入部位は、その５’末端と３’末端にそれぞれＰｖｕＩとＭｌｕＩ制限／クローニング部位に並んでいるとすれば、最初の挿入配列は、例えばｍｉｒ−３０２ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡのようなＰｖｕＩとＭｌｕＩ制限部位と適合した付着末端を有する種々のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ挿入配列により簡単に除去及び置換可能である。異なる遺伝子転写産物に対してイントロン挿入配列を変化させることで、イントロンｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現系は、インビトロ及びインビボにおいて標的遺伝子サイレンシングを誘導する強力な道具として機能することができる。実験において、まずＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子においてｍｉｒ−３０２ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを挿入し、次に、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ導入遺伝子発現ベクターを形成するために、導入遺伝子をｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳベクターのクローニング部位（すなわちＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位）に組み込んだ（図３Ａ）。その後、導入遺伝子を宿主細胞ゲノムに送達するように、低浸透圧性のＰＨ緩衝液（４００μｌ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）においてｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓベクター（１０〜３０μｇ）と宿主細胞（２００〜２０００個）を混合し、４００〜４５０Ｖで１００μｓｅｃ電気穿孔した。７２時間後、ＦＡＣＳフローサイトメトリー選別及び抗ＲＧＦＰと抗Ｏｃｔ３／４モノクローナル抗体を用いることによって、陽性導入遺伝子細胞を単離して収集した（図３Ｃ）。このような新規なｍｉｒ−３０２ｓ遺伝子導入法は成功率が９１％を越えると測定された。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子は、遺伝子を含まない特定のゲノム部位に組換えて挿入するように相同領域に並んでいるので（図４Ａ）、そのコード化したｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡエフェクターの発現は、完全にＤｏｘ誘導性のｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳベクターのＴＲＥ−ＣＭＶプロモーターの活性化によって決められる。ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳベクターは既にＣＭＶ誘導性のｔＴＳ抑制遺伝子を含み、導入遺伝子のＴＲＥ−ＣＭＶプロモーターを不活性化させる。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下、ｔＴＳの機能がＤｏｘに抑制されるため、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子及びそのコードしたｍｉｒ−３０２ｓが発現され得る（図４Ｂ）。
無フィーダー培養条件下でヒト正常と癌性体細胞をＥＳ様状態に再プログラムする
実施例１〜２及び図３Ａ〜３Ｂに述べるように、本発明者らは、既に人工連結のｍｉｒ−３０２ａ−ｍｉｒ−３０２ｂ−ｍｉｒ−３０２ｃ−ｍｉｒ−３０２ｄ（ｍｉｒ−３０２ｓ）ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又は再設計したｍｉｒ−３０２様ｓｈＲＮＡ［例えば、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＵＡＧ ＵＧＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）を含むヘアピン様配列］をコードする誘導性ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を設計、構築し、次に、その種々の体細胞及び癌細胞（例えばヒト正常毛嚢細胞（ｈＨＦＣ）、及び癌性黒色腫Ｃｏｌｏ細胞）内の発生及び分化関連の標的遺伝子サイレンシングの作用について試験した。
図２Ａ及び２Ｂに示された工程によって、本発明者は、それぞれ遺伝子導入法によって組換えｍｉｒ−３０２ｓｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをｈＨＦＣ細胞に送達し、また再設計されたｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡ相同体（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）をＣｏｌｏ細胞に送達した。すなわち、遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９と相同な配列を含む組換えヘアピン様ＲＮＡである。Ｄｏｘ誘導性ｍｉｒ−３０２異所性発現後、ｍｉｒ−３０２により形質移入／誘導した上記多能性幹（ｍｉｒＰＳ）細胞株の全てはその形態が紡錘状から円形状へと変わった（下の図）。これは、ＥＳ細胞の発生に類似するように、移動能を失ったばかりでなく、非常に遅い細胞更新速度を有する可能性があることを示している（図５Ａ）。フローサイトメトリー分析（上の図；実施例７）では、各細胞周期段階のＤＮＡ含量を比較し、ｍｉｒＰＳ細胞の有糸分裂細胞集団が６７％以上減少したことを更に示し、細胞増殖速度がその体細胞／癌性複製起点より大幅に遅いことを表明している。上記分裂は、３７℃、５％のＣＯ２で、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７培地を含む無フィーダーの培養条件下で２０〜２４時間あたり１回起こした。上記培地は、１０％の木炭除去済みＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのアクチビン、５ｎｇ／ｍｌのノギン、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び０．５μＭのＹ−２７６３２と０．５μＭのＧＳＫ−３抑制因子ＸＶの等量混合物を補充したｍｉｒＰＳ細胞培地である。すなわち、多能性幹様細胞は、１０％の木炭除去済みＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのアクチビン、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び０．５μＭのＹ−２７６３２と０．５μＭのＧＳＫ−３抑制因子ＸＶの等量混合物を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７培地において無フィーダー培養できる。フローサイトメトリーグラフの１番目（左）と２番目（右）のピークは、被験細胞集団全体における休止期Ｇ０／Ｇ１及び有糸分裂期Ｍの細胞集団のレベルを示している。ｍｉｒ−３０２ｓ形質移入後、有糸分裂細胞集団（Ｍ期）はｈＨＦＣでは４１％から１１％に、Ｃｏｌｏ細胞では３６％から１１％に減少したが、空ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクター及びＤｏｘ（＋Ｄｏｘ）を用いたか、又はＤｏｘを備えていないｍｉｒ−３０２を発現させるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクター（＋ｍｉｒ−３０２ｓ−Ｄｏｘ）を用いた形質移入後、細胞形態又は細胞増殖速度においては顕著な変化はない。これらの検討結果によって、本発明者らは、ｍｉｒ−３０２ｓ異所性発現が正常や癌性のヒト体細胞をＥＳ様細胞形態と細胞分裂速度に再プログラムできることを立証した。
種々のｍｉｒＰＳ細胞由来の胚様体の形成
すべてのｍｉｒＰＳ細胞は、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞由来の胚様体（ＥＢ）を思わせる密集したコロニーを形成できる（図５Ｂ）。すなわち、これは、本発明にかかる再プログラムされた多能性幹様細胞によって胚様体が形成できることを確認した。トリプシン−ＥＤＴＡとコラゲナーゼＩＶの混合物で解離させて１０％のＦＢＳのみが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地において培養する場合に、これらのＥＢ様細胞は神経前駆細胞に分化し、その中、多くの前駆細胞が神経細胞マーカーＴｕｊ１及び／又はＡＢＣＡ２を発現する。限界希釈して１０％の木炭除去済みのＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのアクチビン、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び０．５μＭのＹ−２７６３２と０．５μＭのＧＳＫ−３抑制因子ＸＶの等量混合物が補充された無フィーダーＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において更に培養された後、各ｍｉｒＰＳ細胞は、引き続き継代培養及び／又は移植／植入測定のための純粋なＥＢを形成できる（図５Ｃ）。これらのＥＳ様幹細胞の性質を考えると、本発明者らは続いてこれらのｍｉｒＰＳ細胞内のｍｉｒ−３０２ｓ及びＥＳ細胞マーカーの発現を調べ、ヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１及びＷＡ０９−Ｈ９細胞と比較した。
ｍｉｒＰＳ細胞内のｍｉｒ−３０２ｓ発現のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）マイクロアレイ分析
ｍｉｒＰＳ細胞内の導入遺伝子ｍｉｒ−３０２の発現を確認するために、実施例９に述べられたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）マイクロアレイ分析を行う。図６Ａに示すように、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析は、Ｄｏｘ処理（１００μＭ）後、始原体細胞（対照）に比べて、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞において、全てのｍｉｒ−３０２要素（最右下、白枡円）はいずれも発現率が顕著に増加したことを示している。ノーザンブロットで測定されたように、ｍｉｒＰＳ細胞内のｍｉｒ−３０２ｓの発現量は、Ｄｏｘ誘導の濃度に比例的に対応する（図４Ｂ）。ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ細胞においても同様な結果が認められた（Ｌｉｎら，２００８ｂ）。初期ＥＢ段階において、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標） ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）によって各細胞株から短鎖ＲＮＡを単離した。３．５％ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動及び分光光度計の計測（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）によって、単離した短鎖ＲＮＡの純度及び量を評価し、ついでマイクロアレイ分析のためにＬＣＳｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に送付した。Ｃｙ３及びＣｙ５強度画像（青いバックグラウンド）において、シグナル強度がレベル１からレベル６５，５３５に増えた場合、対応色は青色から緑色、黄色及び赤色に変わった。Ｃｙ５／Ｃｙ３比率画像（黒いバックグラウンド）において、Ｃｙ３レベルがＣｙ５レベルより高い場合、色は緑色であり、Ｃｙ３レベルがＣｙ５レベルに等しい場合、色は黄色であり、Ｃｙ５レベルがＣｙ３レベルより高い場合、色は赤色である。成熟ＲＮＡ配列は、天然ｍｉｒ−３０２ファミリー要素と手動再設計したｍｉｒ−３０２ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ因子との間に極めた高い相同性（＞９１％）を有するから、その結果、再設計したｍｉｒ−３０２因子は天然ｍｉｒ−３０２ｓの代わりに機能できる。
この結果より、本発明者らは、ｍｉｒ−３０２発現上昇が更に、ｍｉｒ−９２、ｍｉｒ−９３、ｍｉｒ−２００ｃ、ｍｉｒ−３６７、ｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２、ｍｉｒ−３７３、ｍｉｒ−３７４及びｍｉｒ−５２０ファミリーの全要素のような、いくつかの他のｍｉＲＮＡの発現を増加させる可能性があることを見出した。ＳａｎｇｅｒｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓウェッブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）にリンクされた「ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／ｖｅｒｔ_４２／）及び「ＰＩＣＴＡＲ−ＶＥＲＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．ｎｙｕ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＰｉｃＴａｒ_ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ．ｃｇｉ?）プログラムを用いたこれらのｍｉＲＮＡの予知標的遺伝子の分析によって、ｍｉｒ−３０２ｓは４００個以上の標的遺伝子をこれらのｍｉＲＮＡと共有していることが証明され、これらのｍｉＲＮＡが幹細胞の多能性及び更新の維持に重要な役割を担っていることが示唆された。これらの保存標的遺伝子は、ＲＡＢ／ＲＡＳ関連癌遺伝子、ＥＣＴ関連癌遺伝子、多形腺腫遺伝子、Ｅ２Ｆ転写因子、サイクリンＤ結合Ｍｙｂ様転写因子、ＨＭＧボックス転写因子、Ｓｐ３転写因子、転写因子ＣＰ２様タンパク質、ＮＦｋＢ活性化タンパク質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、ＭＡＰＫ関連キナーゼ、ＳＮＦ関連キナーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼ、ＴＮＦ−α誘導タンパク質遺伝子、ＤＡＺ関連タンパク質遺伝子、ＬＩＭ関連ホメオボックス遺伝子、ＤＥＡＤ／Ｈボックスタンパク質遺伝子、フォークヘッドボックスタンパク質遺伝子、ＢＭＰ調節因子、Ｒｈｏ／Ｒａｃグアニンヌクレオチド交換因子、ＩＧＦ受容体、エンドセリン受容体、左右決定因子、サイクリン、ｐ５３誘導性核タンパク質遺伝子、ＲＢ様１、ＲＢ結合タンパク質遺伝子、Ｍａｘ結合タンパク質遺伝子、ｃ−ＭＩＲ免疫認識調節因子、Ｂｃｌ２様アポトーシス促進因子、プロトカドヘリン、インテグリンβ４／β８、インヒビン、アンキリン、ＳＥＮＰ１、ＮＵＦＩＰ２、ＦＧＦ９／１９、ＳＭＡＤ２、ＣＸＣＲ４、ＥＩＦ２Ｃ、ＰＣＡＦ、ＭＥＣＰ２、ヒストンアセチルトランスフェラーゼＭＹＳＴ３、核ＲＮＰＨ３、及び多くの核受容体や因子を含むが、これらの要素に制限されない。これらの遺伝子の大部分は、胚の発生及び／又は腫瘍／癌症の腫瘍形成能と高度に関連している。
標準なヒトＥＳ様マーカーの発現、すなわち、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇの同定
図６Ｂ及び９Ｂに示すように、ｍｉｒＰＳ細胞は、例えばＯｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇのような、多くの標準なヒトＥＳ様細胞マーカーを強く発現するが、始原体細胞（ｈＨＦＣ対照）や、空ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクターとドキシサイクリンによって形質移入する体細胞（ｈＨＦＣ＋Ｄｏｘ）、又はドキシサイクリンを備えていないｍｉｒ−３０２ｓベクターによって形質移入する体細胞（ｍｉｒＰＳ−Ｄｏｘ）においては、これらのマーカーが検出されていない。ノーザンブロット及びウェスタンブロット分析によりｍＲＮＡ及びタンパク質含量について測定したように、これらのＥＳマーカーの発現パターンは、ヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１及びＷＡ０９−Ｈ９細胞に非常に類似している。これらの結果は、ｍｉｒ−３０２ｓの異所性発現が成体体細胞／癌細胞を、多くの標準なヒトＥＳ様マーカーを呈する多能性ＥＳ様幹細胞に再プログラムできることを表明している。ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ細胞においても同様な結果が観察された（図８Ｃ）。
Ｏｃｔ３／４（Ｏｃｔ−３又はＯｃｔ−４ともいう）は、主に全能性胚性幹細胞及び生殖細胞において高度に発現するＰＯＵ転写因子の１つである（Ｓｃｈｏｌｅｒら， （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８： ２５４３−２５５０；Ｒｏｓｎｅｒら， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４５： ６８６−６９２）。臨界レベルのＯｃｔ３／４発現が幹細胞の自己更新及び多能性の維持に必要である。Ｏｃｔ３／４の下方制御は結果的に発生プログラムを分岐させ、胚性幹細胞の分化につながる。ＳＳＥＡタンパク質であるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４は、元々その分化誘導体ではなく着床前段階のネズミ胚及び奇形癌幹細胞の表面にあるラクト系及びグロボ系糖脂質を認識するモノクローナル抗体によって同定される（Ｓｏｌｔｅｒら， （１９７８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： ５５６５−５５６９）。霊長類の未分化胚性幹（ＥＳ）細胞であるヒト胚性癌（ＥＣ）及びＥＳ細胞は、いずれもＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４を発現するが、ＳＳＥＡ−１を発現しない（Ｔｈｏｍｓｏｎら， （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２： １１４５−１１４７）。ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４は、卵形成中に合成され、主に卵母細胞、接合体及び初期卵割期の胚芽において出現した（Ｓｈｅｖｉｎｓｋｙら， （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０： ６９７−７０５）。Ｓｏｘ２は多能性を維持するコア転写因子として機能するが、この機能は、胚性幹細胞に独特なものではない（Ｂｏｙｅｒら， （２００５） Ｃｅｌｌ １２２： ９４７−９５６）。従って、上記の知見より、ｍｉｒＰＳ細胞はこれらのヒトＥＳ様マーカーの特徴を表す可能性がある。
ゲノムＤＮＡ脱メチル化（再プログラム）の評価
後成的修飾の変化、特にゲノムの脱メチル化は、ＥＳ細胞のもう１つの独特な特徴である（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら， （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１： １０６１−１０６７）。細胞をそのＥＳ状態に再プログラムするために、Ｏｃｔ３／４のような多くの胚性遺伝子をＤＮＡ脱メチル化によって再活性化する必要がある。ｍｉｒＰＳ細胞内の上記後成的作用を評価するために、まず、ＣｐＧメチル化に対して感度が高く、メチル化のＣＣＧＧ部位を分解せずに、非メチル化のＣＣＧＧだけを分解する制限酵素であるＨｐａＩＩによってゲノム全体の消化をした。図７Ａは、体細胞対照からの消化されたＤＮＡ断片がｍｉｒＰＳ細胞からの消化されたＤＮＡ断片より２倍以上も大きいことを示し、ｍｉｒＰＳ細胞ゲノム全体が高度に脱メチル化されたことを表明した。重亜硫酸塩−ゲノムＰＣＲ及び配列決定によって、更にＯｃｔ３／４遺伝子プロモーター領域を評価した（Ｔａｋａｈａｓｈｉａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ， ２００６）。重亜硫酸塩が全ての非メチル化のシトシンをウラシルに変換させた。非メチル化のＡＣＧＴ部位がＡＵＧＴ部位になったから、ＡＣＧＴを切断する制限酵素の消化は、ｍｉｒＰＳ細胞ゲノム内のこれらの単離領域を分解できない（図７Ｂ）。重亜硫酸塩ＤＮＡ配列決定に示した詳細な脱メチル化マップにより、ヒトＥＳ様ＷＡ０９−Ｈ９細胞において認められたように、ｍｉｒＰＳ細胞中のＯｃｔ３／４遺伝子プロモーター領域が９０％以上のメチル化部位を失ってしまうことを更に証明し（図７Ｃ）、全ゲノム再プログラムのイベントが発生し、Ｏｃｔ３／４遺伝子発現が再活性化されたことを示唆している。実施例８は、上記ＣｐＧ脱メチル化測定を示す。
Ｏｃｔ３／４遺伝子プロモーター内の脱メチル化部位を測定する実験において、まず全ての非メチル化のシトシンをウラシルに変換させる重亜硫酸塩（ＣｐＧｅｎｏｍｅＤＮＡ修飾キット，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）によって、単離ゲノムＤＮＡを処理し、そして、ポリメラーゼ連鎖反応（長鋳型ＰＣＲ延長キット，Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）によってＯｃｔ３／４の５’上流プロモーター領域を単離した。その後、ＰＣＲ産物を収集し、ＡｃｌＩ（ＡＡＣＧＴＴ）、ＢｍｇＢＩ（ＣＡＣＧＴＣ）、ＰｍｌＩ（ＣＡＣＧＴＧ）、ＳｎａＢＩ（ＴＡＣＧＴＡ）及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ（ＡＣＧＴ）を含む、ＡＣＧＴを切断する複数の制限酵素の等量混合物（各５Ｕ）で消化した。この領域内の非メチル化のＡＣＧＴ部位が重亜硫酸塩によってＡＵＧＴ部位になったが、ＡＣＧＴを切断する制限酵素によってＡＵＧＴ部位を分解することはできないので、図７Ｂの結果より、対照ｈＨＦＣ、ＰＣ３及びＣｏｌｏ細胞内の４つ以上のメチル化ＡＣＧＴ部位が対応するｍｉｒＰＳ細胞内の脱メチル化部位になったことを示している。従って、Ｏｃｔ３／４遺伝子プロモーターの上記ｍｉｒ−３０２媒介性脱メチル化は、ｍｉｒＰＳ細胞内のＯｃｔ３／４遺伝子発現の再活性化を促進できる。
転移性癌に由来するｍｉｒＰＳ細胞の移動能の失い
ヒトＥＳ様細胞は移動しない。高速転移の癌細胞株に由来するｍｉｒＰＳ細胞（例えばｍｉｒＰＳ−ＰＣ３細胞）において細胞移動の失いがよく観察される。ＥＳ細胞がある所に静止してその場で胚様体を形成する傾向があると、転移性ヒト前立腺癌ＰＣ３細胞はなぜ異所的ｍｉｒ−３０２の形質移入後でその移動力を失うかを解釈できる。又は、ｍｉｒ−３０２は、マイクロチューブ結合タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）、アクチン様タンパク質（ＡＣＴＬ６Ａ）、アンキリン２（ＡＮＫ２）、βアミロイド前駆体タンパク質Ａ４（ＡＰＰ）、ミオシン軽鎖ポリペプチドキナーゼ（ＭＹＬＫ）の遺伝子のような、細胞移動に関連する若干の遺伝子をサイレンシングさせ、正常細胞の移動や癌細胞の侵入を防止することができる。図７Ｄ及び実施例１２に示すように、転移性ＰＣ３細胞は、経時に速やかに移動しているが、ｍｉｒＰＳ−ＰＣ３細胞は静止している。他の全ての対照物においても形態変化が観察されていない。従って、本発明の導入遺伝子ｍｉｒ−３０２ｓは、ヒト癌細胞のさらなるＥＳ様細胞形態への形質転換及び細胞分裂速度に十分で、癌治療において非常に好適に用いられることを表明した。この結果より、悪性癌症／腫瘍細胞を有用なＥＳ様幹細胞に再プログラムできるだけでなく、癌症転移の可能性を低減できる、ｍｉｒ−３０２ｓを癌症／腫瘍細胞へ送達する潜在的な治療応用を示している。もっと有利なのは、これらのｍｉｒＰＳ細胞は患者自身の細胞から生成されるから患者免疫に適合できるため、これらのｍｉｒＰＳ細胞によって新規な移植療法を発展し、免疫拒絶反応のリスクがなくて癌症／腫瘍損傷の組織を修復することができる。
遺伝子マイクロアレイ分析によるＥＳマーカー発現全体の同定
ｍｉｒ−３０２媒介性再プログラムイベントによる遺伝子変異は、ゲノム全体の遺伝子発現パターンによって了解される。標準ＥＳ細胞マーカーと遺伝子導入ｍｉｒ−３０２ｓの同時発現を確かめた後、本発明者らは、異所的ｍｉｒ−３０２発現前後の細胞内ゲノム全体遺伝子発現パターンの変化、及びｍｉｒＰＳと他のヒトＥＳ様細胞（例えばＷＡ０１−Ｈ１及びＷＡ０９−Ｈ９）との間のゲノム全体遺伝子発現パターンの変化を調べるために、ヒトゲノムマイクロアレイ分析を行った。実施例１０は、詳細なプロトコルを示す。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の遺伝子マイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３Ａ&Ｂ及びＵ１３３ｐｌｕｓ ２．０アレイ）を用いて、４７，０００種以上のヒト遺伝子発現パターンの変化を評価した。まず、同じｍｉｒＰＳ試料を用いて2回マイクロアレイ分析を実施し、一方の分析からで最も変異しやすい遺伝子（白いドット）を２００個選択して、さらに比較した。図８Ａ（ｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ）及び９Ａ（ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ）に示すように、もう一方の分析よりもすべての変化が１倍未満であり（最左）、バックグラウンドの変動が極めて限られていることを表明している。その後、マイクロアレイ同定された全ての遺伝子の分散パターンに基づいて、比較された２つのトランスクリプトームライブラリー間の相関係数（ＣＣ）を算出した。CC比を求め、閾値が１倍の変化であるゲノム全体遺伝子発現パターンの類似率を示す。上記厳しいＣＣ比の定義下、ｍｉｒＰＳ細胞の遺伝子発現パターンはヒトＥＳ様ＷＡ０１−Ｈ１（＞８９％）及びＷＡ０９−Ｈ９（＞８６％）細胞の遺伝子発現パターンと非常に類似しているが、ｍｉｒＰＳ細胞とその元としての体細胞／癌細胞では、４７％〜５３％の低いＣＣ比しか示されていないことが見出された。このようなヒトＥＳ様細胞とｍｉｒＰＳ細胞との間の強い遺伝関連性は、ｍｉｒ−３０２ｓが体細胞／癌細胞をＥＳ様のｍｉｒＰＳ細胞に再プログラムする肯定に関する数千種類の細胞遺伝子発現を変更する必要がありうることを表明している。例えば、図８Ｂに示すように、ｍｉｒＰＳとヒトＥＳ様細胞の結果においては、多くのＥＳ遺伝子の発現上昇、及び癌性、発生、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期に関連する大量の遺伝子の閉鎖は一貫して同時に観察された。図９Ｂを参照すれば、ｍｉｒＰＳ細胞の遺伝子発現パターンについては、ＳＳＥＡ−１はｍｉｒＰＳ細胞において適度に発現するが、Ｋｌｆ４はそうではないことも注意された。
図８Ｂは、Ｃｏｌｏ細胞とｍｉｒＰＳ−Ｃｏｌｏ細胞との間のいくつかの主な差異発現遺伝子のリストを示す。図８Ｂにおいて、細胞周期チェックポイント遺伝子であるＣＤＫ２、サイクリンＤ１、Ｄ２、及びＤＮＡメチル化促進因子であるＭＥＣＰ２、ＭＥＣＰ１−ｐ６６は、ｍｉｒ−３０２ｓの強い標的として確認されたことが注意された。すなわち、多能性幹様細胞は、ｍｉｒ−３０２マイクロＲＮＡ及びＯｃｔ４を多量に発現する一方、ＣＤＫ２、サイクリンＤ１、ＭＥＣＰ１−ｐ６６及びＭＥＣＰ２を制限的に発現する。図８Ｃ及び９Ｂにおいても同様な結果が観察された。周知のように、サイクリンＥ依存性ＣＤＫ２は、Ｓ期細胞周期への進入に必要なものであり、ＣＤＫ２を抑制すると、Ｇ１期チェックポイントが停止することになるが、サイクリンＤ１はＤＮＡの損傷に応じてＧ１期停止を乗り越えることができる。この原理に基づいて、図５Ａに示すように、ｍｉｒＰＳ細胞内のＣＤＫ２及びサイクリンＤ１の抑制は、ｍｉｒ−３０２により形質移入した癌細胞の細胞周期が非常に遅い細胞分裂速度に達成することを開示した。従って、上記癌性幹細胞周期変換の結果、癌治療に顕著な利点を提供できる。また、ＭＥＣＰ２及びＭＥＣＰｌ−ｐ６６が抑制されたことは、図７Ａ〜Ｃの結果と一致し、悪性の癌細胞が良性のｍｉｒＰＳ細胞に後生的再プログラムされたことを表明した。このように患者から得られたｍｉｒＰＳ細胞は、更に腫瘍／癌症組織損傷の修復を促進できると考えられる。要するに、これらの全ての検討結果は、本発明のｍｉｒ−３０２遺伝子導入法が、ヒト体細胞／癌細胞の遺伝状況を、ヒトＥＳ様細胞の発現パターンに類似する高度のＥＳ様の発現パターンに再プログラムするように用いることができることを示唆している。
ｍｉｒＰＳ細胞の多分化能
多能性は、ＥＳ細胞の最も重要な特徴を定義する。異なる因子及び／又はホルモンでインビトロ処理を行うことによって、ヒトＥＳ様細胞は、全ての成体組織の創始者、すなわち外胚葉、中胚葉及び定形内胚葉という３つの胚葉に分化されることができる。どんな処理もない場合、ｍｉｒＰＳに由来する胚様体を異種移植によって雌性の偽妊娠の免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスの子宮又は腹膜腔に移植することは、奇形腫様組織嚢腫を形成できる（図１０）。他の組織位置においてはこのような嚢腫が観察されていない。しかし、これらの組織嚢腫は奇形腫と異なり、その周辺の組織と非常によくて明らかな境界が形成された。また、マウスにおけるこれらの嚢腫構造は、移植後約２．５週間にその発生が遅くなってきた。これらのｍｉｒＰＳ細胞内のインビボでのランダム発生を制限する自動調節のメカニズムがあるかのようである。この自動調節のメカニズムは、これらのｍｉｒＰＳ細胞による腫瘍形成を予防し、腫瘍のない多能性幹細胞を設計して発生させる手段を臨床試験や治療に提供することができる。
ｍｉｒＰＳ細胞分化のインビトロ分子誘導
定義で、多能性幹細胞は、胚性の外胚葉、中胚葉及び／又は内胚葉に由来する組織細胞と同様な様々な細胞種に分化できる。例えば、種々の成長因子及び／又はホルモンによるインビトロでの処理を用いて、本発明者らは、ＥＳ様のｍｉｒＰＳ細胞を、神経前駆細胞（図５Ｂ）、精原細胞様の細胞（図１１Ａ−Ｅ）、線維芽細胞（図１１Ｆ−Ｊ）、及び軟骨細胞（図１１Ｋ−Ｏ）を含む、若干の体細胞及び／又は生殖系組織細胞種に分化誘導することに成功した。免疫組織化学（ＩＨＣ）検査によってこれらの特定の組織系統のマーカーを同定したが、それぞれ神経細胞の特異的Ｔｕｊ１とＡＢＣＡ２、生殖系の特異的ＤａｚｌａとＥＥ２、線維芽細胞の特異的ａｔｌａｓｔｉｎ１とＩ型プロコラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、及び軟骨細胞の特異的トロポエラスチン及びＩＩ型プロコラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）を示した。すなわち、本発明による多能性幹様細胞は、生殖系列様細胞、精原細胞様細胞、正常体細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、及びこれらの組み合わせに分化できる。これらの分化されたｍｉｒＰＳ細胞においては腫瘍形成の兆しが観察されていない。Ｓａｎｇｅｒウェッブサイトでの「ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ」及び「ＰＩＣＴＡＲ−ＶＥＲＴ」というプログラムの予測に基づいて、実際には、多くの癌遺伝子はｍｉｒ−３０２ｓの標的であることが知られた。それに、ｍｉｒ−３０２ｓは、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリンＤ１、Ｄ２を抑制し、腫瘍細胞の速やかな発生を防止することができる（Ｌｉｎら，２００８ｂ）。これらの検討結果は、ｍｉｒＰＳ細胞の腫瘍のない多能性と意味する。種々の分子処理によってｍｉｒＰＳ細胞からより多くの組織細胞種を誘導することができると考えられる。
無フィーダー培養条件下でインビトロにて実験を行ったが、ｍｉｒＰＳ細胞を相対的に相同な３種類の体細胞種に分化させるための誘導に成功したことを示した（図１１Ａ〜Ｏ及び実施例１１）。まず、無フィーダー培養皿において、天然アンドロゲンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ５０ ｎｇ／ｍｌ）によってｍｉｒＰＳ細胞を６時間処理し、ついで処理された細胞（１０５）を６週齢の雌性の免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスの子宮にインビボ移植したところ、１週間後、移植部位に精原細胞様の細胞の嚢腫が生成された（図１１Ａ〜Ｅ）。次に、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１１００ ｎｇ／ｍｌ）で１２時間処理し、同じような移植工程を行うと、ｍｉｒＰＳ細胞は線維芽細胞に分化し、ただ１週間内でコラーゲンを分泌し始めた（図１１Ｆ−Ｊ）。最後に、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４１００ ｎｇ／ｍｌ）で１２時間処理し、これらの細胞を６週齢の免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスの肝臓に異種移植すると、ｍｉｒＰＳ細胞は石灰化沈殿で囲む軟骨細胞に分化した（図１１Ｋ−Ｏ）。免疫不全の裸マウスの使用は、移植療法を模倣するインビボ環境を提供する。これらの検討結果は強力な証拠を提示し、本発明のｍｉｒ−３０２遺伝子導入法によって、インビトロ及びインビボの無フィーダー細胞培養条件で多種の組織細胞種に誘導できる新しい多能性ＥＳ様幹細胞株の生成に成功したことを示している。従って、本発明は、分化した体細胞／癌細胞をＥＳ様状態に再プログラムすることができるだけでなく、無フィーダー培養条件下でＥＳ様の更新と多能性を維持することができる。
従って、ｍｉｒ−３０２を誘導的発現させる導入遺伝子を用いることによって、本発明は特に、ヒト体細胞及び癌細胞の一次培養細胞からｍｉｒ−３０２誘導型多能性ＥＳ様幹（ｍｉｒＰＳ）細胞を生成する強力な新しい道具と方策を提供する。ヒト正常毛嚢が取得しやすいから、ｍｉｒＰＳ細胞はヒト正常毛嚢に由来することが最も好ましい。ｍＲＮＡ転写、ＲＮＡスプライシング、エキソソームプロセシング及びＮＭＤメカニズムの各構成要素を含む複数の細胞内モニターシステムが、イントロンｍｉＲＮＡの生合成経路を十分に調節するので、本発明のイントロンｍｉｒ−３０２発現は、従来のＰｏｌ−ＩＩＩ（Ｕ６／Ｈ１）誘導性のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現系に比べてずっと安全であると考えられる。実際には、本発明者は、Ｐｏｌ−ＩＩＩ誘導性の発現系が、ｍｉｒ−３０２を過度発現させ、Ｇ１期の細胞周期停止及び死滅を引き起こす傾向があると注意した。本発明は、薬剤誘導性（Ｔｅｔ−Ｏｎ／Ｏｆｆ）ベクターと結合し、ほ乳類体細胞／癌細胞をＥＳ様のｍｉｒＰＳ細胞に再プログラムし、有用な正常組織細胞を形成するように誘導する制御可能な手段をさらに提供できる。ｍｉｒ−３０２は強い腫瘍抑制因子であることが発見されたので、本発明によるｍｉｒＰＳ細胞は腫瘍形成のリスクがない。
有利なことは、本発明においては少なくとも５つの突破がある。第１に、従来のｉＰＳ方法に用いられる４種類の大きい転写因子遺伝子に代わって、ｍｉｒ−３０２を発現させる１つの導入遺伝子を用いることができ、患者の幾つかの体細胞だけからより多くの相同な多能性ＥＳ様幹細胞を生成でき、幹細胞の純度及び患者の免疫システムとの適合性が改良される。第２に、ｍｉｒ−３０２を発現させる導入遺伝子は全サイズが比較的小さい（約１０００塩基）から、その導入遺伝子の送達はｉＰＳ方法における最大２％に比べて極めて高いである（９１％以上の成功率）。第３に、ｍｉｒＰＳ細胞の生成及び培養は、完全に無フィーダー条件下で行われ、フィーダー抗原汚染のリスクはない。第４に、癌遺伝子を使用しないから、細胞の突然変異と腫瘍形成のリスクが予防される。最後に、レトロウイルス感染の代わりに電気穿孔を用いてｍｉｒ−３０２を発現させる単一の導入遺伝子を送達し、宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスランダム挿入による、挿入突然変異の誘発をよく引き起こすリスクが予防される。とにかく、これらの利点により、レトロウイルス感染、癌突然変異、及び不定の腫瘍発生能力のリスクの予防というｉＰＳ方法の３つの問題を解決した。
Ａ．定義
本発明の理解を深めるために、次のように多くの用語を定義する。
ヌクレオチド：糖部分（五炭糖）、リン酸及び窒素系複素環塩基からなるＤＮＡ又はＲＮＡの単量体単位である。その塩基は、グリコシド結合した炭素（五炭糖の1’炭素）によって糖部分と結合するが、この塩基と糖の組み合わせはヌクレオシドである。五炭糖の３’又は５’の位置に少なくとも１つのリン酸基が結合しているヌクレオシドがヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチド：２個以上の、好ましくは３個以上の、そして通常は１０個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成される分子である。正確なサイズは多くの要因によって決まり、さらにこれらの要因はそのオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用法によって決まる。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はこれらの組み合わせを含むいずれかの方法で生成してもよい。
核酸：１本鎖又は２本鎖のヌクレオチドのポリマーである。
ヌクレオチド類似体：Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵとは構造的に異なるが、核酸分子中で通常のヌクレオチドと十分に置換できるほど類似しているプリンやピリミジンヌクレオチドである。
核酸成分：１本鎖又は者２本鎖分子構造のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドである。
遺伝子：RNA及び/又はポリペプチド（タンパク質）のためのヌクレオチド配列コードをもつ核酸である。遺伝子はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかである。
塩基対（ｂｐ）：２本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の組合である。ＲＮＡでは、チミンの代わりウラシル（Ｕ）となる。一般に、その組合は水素結合を介して実現される。
メッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）：真核細胞においてII型RNAポリメラーゼ（Pol-II）機構による転写と呼ばれる細胞内メカニズムによって作られる遺伝子のリボヌクレオチド一次転写産物である。ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列は、５’末端非翻訳領域、３’末端非翻訳領域、エクソン、及びイントロンを含む。
イントロン：インフレーム内イントロン、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び３’−ＵＴＲのような、タンパク質読み枠ではない遺伝子転写配列の一部分又は複数の部分である。
エクソン：タンパク質読み枠をコードする遺伝子転写配列の一部分又は複数の部分である。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：核内スプライセオソーム機構によるイントロン除去後に形成され、タンパク質合成のためタンパク質をコードするRNAとして機能するpre-mRNAのエクソン集合体である。
ｃＤＮＡ：、ｍＲＮＡ配列と相補的で、イントロン配列がまったく含まれていない１本鎖ＤＮＡである。
センス：相同なｍＲＮＡと配列順及び組成が同じ核酸分子である。センス構造は「+」、「s」、又は「センス」シンボルで示す。
アンチセンス：各mRNA分子と相補的な核酸分子。アンチセンス構造は、例えば「aDNA」又は「aRNA」のように、DNA又はRNAの前に「-」シンボル、又は「a」もしくは「アンチセンス」を付けて示す。
５’末端：1つのヌクレオチドの5’ヒドロキシル基が次のヌクレオチドの3’ヒドロキシル基とリン酸ジエステル結合によって連結している連続したヌクレオチドにおいて、5’位置でヌクレオチドが欠損している末端。1つ以上のリン酸のような他の基は、この末端に存在することがある。
３’末端：1つのヌクレオチドの5’ヒドロキシル基が次のヌクレオチドの3’ヒドロキシル基とリン酸ジエステル結合によって連結している連続したヌクレオチドにおいて、3’位置でヌクレオチドが欠損している末端。最もよく見られるのはヒドロキシル基であるが、他の基がこの末端に存在することもある。
鋳型：核酸ポリメラーゼによってコピーされる核酸分子。鋳型はポリメラーゼによって決まり、1本鎖、2本鎖、又は部分的に2本鎖である。合成されたコピーはこの鋳型又は2本鎖もしくは部分的に2本鎖の鋳型の少なくとも1本の鎖と相補的である。RNA及びDNAの両者が5’から3’方向に合成される。核酸デュプレックスの2本の鎖は常にアラインメントしているので、2本鎖の5’末端はデュプレックスの反対側の末端に位置する（従って必然的に3’末端も同様）。
核酸鋳型：2本鎖DNA分子、2本鎖RNA分子、DNA-RNAもしくはRNA-DNA雑種等の雑種分子、又は1本鎖のDNAもしくはRNA分子である。
保存：ヌクレオチド配列を非無作為に予め選択した（参照した）配列と正確に相補的な配列にハイブリダイゼーションする場合、このヌクレオチド配列はこの予め選択した配列に関して保存されていることになる。
相補的、相補性、又は相補作用：塩基対規則によって関連し合うポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を指す場合に用いる。例えば、配列「A-G-T」は配列「T-C-A」と相補的であり、また、「T-C-U」とも相補的である。相補性は、2本のDNA鎖間、1本のDNA鎖と1本のRNA鎖間、又は2本のRNA鎖間で生じる可能性がある。相補性には「部分的」又は「完全」な場合がある。部分相補性は、核酸塩基のいくつかだけが塩基対規則に従って適合する場合である。完全相補性は、核酸鎖間で塩基が完全に適合する場合である。核酸鎖間の相補性の程度は核酸鎖間のハイブリダイゼーションにおける効率と強度に大きく影響する。これは、増幅反応、さらに核酸間の結合に依存した検出方法において特に重要である。相補性率（％）とは、核酸の1本鎖における全塩基に対してミスマッチを示した塩基数のことである。従って、50％の相補性とは、塩基の半分がミスマッチで、半分が適合していることを意味する。核酸の2本鎖は、この2本鎖の塩基数が異なっている場合でさえも相補的となり得る。この場合、長い方の鎖の一部の塩基が、相当する短い方の鎖の塩基と対を成した時に相補性が生じる。
相同又は相同性：遺伝子又はmRNA配列と類似したポリヌクレオチド配列。核酸配列は例えば、特定の遺伝子又はmRNAと部分的又は完全に相同である可能性がある。相同性はまた、全ヌクレオチド数のうちの同じヌクレオチドの数で決定する比率（％）として表すことができる。
相補的塩基：DNA又はRNAが2本鎖の形状となる場合に、通常対を形成するヌクレオチドである。
相補的ヌクレオチド配列：1本鎖のDNA又はRNA分子におけるヌクレオチド配列で、もう一方の1本鎖の配列と十分に相補的なために、結果的に水素結合によって、2本鎖間で特異的にハイブリダイゼーションする。
ハイブリダイゼーション：塩基対形成によって複合体を形成するのに十分相補的なヌクレオチド配列間のデュプレックスの形成。プライマー（又はスプライス鋳型）が標的（鋳型）と「ハイブリダイゼーション」する場合、このような複合体（又は雑種）は十分に安定しているので、DNA合成を開始するDNAポリメラーゼが求める開始機能を提供する。競争的に阻害できる2つの相補的ヌクレオチド間には特異的、すなわち非無作為な相互作用がある。
転写後遺伝子サイレンシング：一般に外来／ウィルスＤＮＡ導入遺伝子又は短鎖抑制ＲＮＡによって引き起こされる、ｍＲＮＡ分解又は翻訳抑制レベル下での標的遺伝子除去又はノックダウン作用である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：真核細胞において、マイクロRNA及び短鎖干渉RNAのような短鎖RNA分子によって引き起こされる翻訳後の遺伝子サイレンシングメカニズムのこと。これらの短鎖RNA分子は遺伝子サイレンサーとして通常機能し、この短鎖RNAに対して完全又は部分的に相補的な配列を含む細胞内遺伝子の発現に干渉する。
非コードＲＮＡ：細胞内翻訳機構によってペプチド又はタンパク質の合成に用いることができないＲＮＡ転写産物である。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：このmiRNAに部分的に相補的な標的遺伝子転写産物に結合できる1本鎖RNAである。miRNAは通常長さが約17〜27個のオリゴヌクレオチドで、miRNAとその標的mRNAとの相補性によって、細胞内のmRNA標的を直接分解するか、又はその標的mRNAのタンパク質翻訳を抑制できる。天然のmiRNAはほぼ全ての真核細胞で見つかっており、ウイルス感染に対する防御、及び動植物の発生における遺伝子発現を制御するものとして機能している。
Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ：細胞内RNaseIIIエンドRNA分解酵素と相互作用するステムアーム及びステムループを含むヘアピン状の1本鎖RNAで、1つ又は複数のマイクロRNAを産生し、標的遺伝子又はこのマイクロRNA配列と相補的な遺伝子をサイレンシングできる。pre-miRNAのステムアームは完全（100％）又は部分的（ミスマッチ）にハイブリダイゼーションしたデュプレックス構造を形成できるが、ステムループはステムアームの1端と結合し、円形又はヘアピンループ構造を形成する。
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：ほぼ完全な相補性の標的遺伝子転写産物を分解できる、リボヌクレオチドデュプレックスが完全に塩基対形成しているサイズが約18〜25個の短鎖2本鎖RNAである。
小又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）：不適合ループ状オリゴヌクレオチドによって分けられた部分的又は完全に適合したステムアームヌクレオチド配列を含み、ヘアピン状構造を形成する1本鎖RNAである。多くの天然miRNAはヘアピン状RNA前駆体、すなわちマイクロRNA前駆体（pre-miRNA）に由来する。
ベクター：異なる遺伝子環境において移動及び定着が可能な組換えDNA（rDNA）等の組換え核酸分子である。一般に、別の核酸の中に操作によって連結させる。ベクターは細胞内で自律増殖可能で、この場合、ベクターとその連結した部位が複製される。好ましいベクターの1種類はエピソーム、すなわち染色体外で複製可能な核酸分子である。好ましいベクターは自律複製及び/又はこれらに連結した核酸の発現が可能なベクターである。1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導できるベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。特に重要なベクターは、逆転写酵素を用いて作製したmRNAからcDNAをクローニングできる。
シストロン：DNA分子内においてアミノ酸残基配列をコードし、上流及び下流にDNA発現調節配列を含むヌクレオチド配列である。
プロモーター：ポリメラーゼ分子により認識され、おそらく結合することで合成を開始させる核酸である。本発明用のプロモーターには、既知のポリメラーゼ結合部位、エンハンサー、及び所望のポリメラーゼによって合成を開始できるこれらに類似したあらゆる配列が可能である。
抗体：予め選択したリガンドと結合できる受容体をコードする予め選択した保存領域構造をもつペプチド又はタンパク質分子である。
Ｂ．成分
ほ乳類細胞において単離されたｍｉｒ−３０２因子を発現させ、ｍｉｒ−３０２媒介性遺伝子サイレンシングを誘導する組換え核酸成分は、
ａ）ｍｉｒ−３０２ファミリー要素と相同な組換え非コードＲＮＡをコードする組換え導入遺伝子と、
ｂ）ほ乳類細胞において組換え導入遺伝子を送達して発現させることに用いることができる発現可能なベクターと、
を含む。
上記組換え導入遺伝子は、
ａ）所望の機能をもつ遺伝子転写産物を形成するように結合できる複数のエクソンと、
ｂ）組換えｍｉｒ−３０２相同体を含み、細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセシング機構によってエクソンから切断できる少なくとも１つイントロンと
を更に含む。
上記組換え導入遺伝子のイントロンは、
ａ）スプライセオソーム結合のための５’供与スプライス部位と、
ｂ）ｍｉｒ−３０２ファミリー要素と相同な遺伝子サイレンシングエフェクター挿入配列と、
ｃ）スプライセオソーム認識のための分岐点モチーフと、
ｄ）スプライセオソーム相互作用のためのポリピリミジントラクトと、
ｅ）スプライセオソーム結合のための３’受容スプライス部位と、
ｆ）５’から３’方向に上記構成要素のそれぞれを連結する複数のリンカーと
を更に含む。
遺伝子サイレンシングエフェクターは、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）と相同な核酸成分をコードすることが好ましい。５’供与スプライス部位は、５’ＧＴＡＡＧＡＧＫ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）又はＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵモチーフ（例えば５’ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３７）、５’ＧＴＡＡＧＡＧＴ−３’、５’ＧＴＡＧＡＧＴ−３’及び５’ＧＴＡＡＧＴ−３’）を含むか、又はこれらと相同なヌクレオチド配列であり、３’受容スプライス部位は、ＧＷＫＳＣＹＲＣＡＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５）又はＣＴ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＮＧモチーフ（例えば５’ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４２）、５’ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’及び５’ＣＣＡＣＡＧ−３’）を含むか、又はそれと相同なヌクレオチド配列である。また、分岐点配列は、５’スプライス部位と３’スプライス部位との間に位置しており、５’ＴＡＣＴＡＡＣ−３’及び５’ＴＡＣＴＴＡＴ−３’のような、５’ＴＡＣＴＷＡＹ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）と相同なモチーフを含む。更に、ポリピリミジントラクトは、分岐点と３’スプライス部位との間に近接して位置しており、５’（ＴＹ）ｍ（Ｃ／-）（Ｔ）ｎＳ（Ｃ／-）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７）又は５’（ＴＣ）ｎＮＣＴＡＧ（Ｇ／-）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）と相同なＴ又はＣ高含量の配列を含む。シンボル「ｍ」及び「ｎ」は、１以上（≧１）の複数の反復配列を示しており、好ましくは、数ｍは１〜３、数ｎは７〜１２である。シンボル「-」は、配列内に1つの空ヌクレオチドがあることを示す。米国特許法施行規則（37 CFR）第1.822条のヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列データに使用するシンボル及び書式に関するガイドラインに基づき、シンボルＷは、アデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＫはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＳはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）、シンボルＹはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、シンボルＲはアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）、シンボルＮはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味する。上記のスプライセオソーム認識構成要素の全てにおいて、デオキシチミジン（Ｔ）ヌクレオチドはウリジン（Ｕ）に置換可能である。
Ｃ．方法
ｍｉｒ−３０２の標的となる遺伝子に対する特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導できる組換え核酸成分によって、ほ乳類細胞を多能性幹細胞に再プログラムする方法であって、
ａ）ｉ）ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の発生及び細胞分化関連遺伝子を発現させる細胞基質、及びｉｉ）細胞基質内のｍｉｒ−３０２と相同な非コードＲＮＡに送達、転写及びプロセシングできる組換え核酸成分を提供する工程と、
ｂ）細胞基質におけるｍｉｒ−３０２の標的となる遺伝子の機能が抑制された条件で組換え核酸成分によって細胞基質を処理する工程と
を含む方法である。
組換え核酸成分は、組換えｍｉｒ−３０２ファミリークラスター（ｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ｓ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２９−３６の連結雑種）又は手動再設計したｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡ相同体（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７と２８の雑種）をコードする組換え導入遺伝子を発現させることできる薬剤誘導性Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆベクターであることが好ましい。細胞基質は、インビトロ、エクスビボ又はインビボでｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ｓ／ｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡ及びその標的遺伝子を発現させることができる。
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を例示するものであるが、本発明の範囲を制限するものではない。
以下の実験に関する開示において、次の略語を適用する。Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、μｍ（マイクロモル濃度）、ｍｏｌ（モル）、ｐｍｏｌ（ピコモル濃度）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、℃（摂氏温度）、ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド−3リン酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液食塩水）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝液食塩水）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩）、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。
実施例１
ＳｐＲＮＡｉ含有組換えＲＧＦＰ遺伝子（ＳｐＫＮＡｉ−ＲＧＦＦ）の構築
センス、アンチセンス−、又はヘアピン状のＥＧＦＰ挿入配列を含むＳｐＲＮＡｉイントロンの生成に用いられる合成オリゴヌクレオチドとしては、Ｎ１−センス：５’ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＣＡＧ ＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡ ＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡ ＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４）、Ｎ１−アンチセンス：５’ＣＧＣＧＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣ ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣ ＴＣＴＴＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５）、Ｎ２−センス：５’ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＣＴＴ ＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧ ＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴ ＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６）、Ｎ２−アンチセンス：５’ＣＧＣＧＴＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣ ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣ ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣ ＴＣＴＴＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７）、Ｎ３−センス：５’ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＣＡＧ ＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡ ＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡ ＧＴＴＡＡＣＴＴＧＡ ＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８）、Ｎ３−アンチセンス：５’ＣＧＣＧＴＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣ ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴ ＴＡＡＣＴＴＧＡＡＧ ＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＧＡ ＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣ ＴＴＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９）、Ｎ４−センス：５’ＣＧＣＧＴＴＡＣＴＡ ＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴ ＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴ ＣＣＴＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０）、Ｎ４−アンチセンス：５’ＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡ ＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴ ＡＧＴＡＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１）が挙げられる。ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４からＳＥＱＩＤ ＮＯ．２１まで挙げられた全配列は、その５’末端がリン酸化されている。
それに加え、赤色蛍光RGFP遺伝子（SEQ.ID.NO.22）における208番目のヌクレオチド（nt）部位で、制限酵素DraIIによる開裂によって2つのエクソン断片が生成した。そして、５’ＲＧＦＰエクソンはさらにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑終端化された。上記ＲＧＦＰは新たな赤色偏移蛍光色素タンパク質遺伝子で、シライトイソギンチャク（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＣＡ）からのＨｃＲｅｄ１色素タンパク質の６９番目のアミノ酸（ａ．ａ．）部位に追加のアスパラギン酸塩を挿入することによって生成され、そのタンパク質は凝集が少なく、570nmの波長でほぼ2倍の強度の遠赤色蛍光を放射する。
センス及びアンチセンス配列の相補的混合物（1：1）を1×PCR緩衝液（例えば、50 mM Tris-HCl（25℃でpH 9.2）、16 mM (NH4)2SO4、1.75 mM MgCl2）において、94℃で2分間、その後70℃で10分間加熱することで、N1アンチセンスに対するN1センス、N2アンチセンスに対するN2センス、N3アンチセンスに対するN3センス、及びN4アンチセンスに対するN4センスのハイブリダイゼーションを別々に行った。その直後、N1+N4、N2+N4、又はN3+N4（1：1）雑種混合物をそれぞれ50℃から10℃に1時間かけて冷却して、N1、N2、又はN3のいずれかをN4雑種へ順次ライゲーションし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと緩衝液（Ｒｏｃｈｅ， ＩＮ）をこの混合物に添加し、12℃で12時間反応させた。こうして、ＳｐＲＮＡｉイントロンを得た。次に、２つのＲＧＦＰエクソンを反応物（１：１：１）に加えた後、T4 DNAリガーゼ及び緩衝液で適宜調整しながら、さらに12℃で12時間ライゲーション反応を行った。
組換えSpRNAi挿入RGFP遺伝子を正しくクローニングするために、1対のＲＧＦＰ特異的プライマーである５’ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣ ＴＧＣＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２３）及び５’ＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＧ ＧＧＣＡＧＧＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２４）を用いて、９４℃で１分間、５２〜５７℃で１分間、そして６８℃で２分間、２５〜３０サイクルのＰＣＲを行い、連結したヌクレオチド配列10 ngを増幅させた。単離されて得たＰＣＲ産物を２％のアガロースゲル上で分画し、９００〜１１００ｂｐヌクレオチド配列をゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）で抽出、精製した。この約１ｋｂのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子の組成を、更に配列決定によって確認した。好ましくは、イントロンを挿入しない状態で、ＳｐＲＮＡｉイントロン配列のセンス鎖は５’ＧＴＡＡＧＴＧＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＧＣ ＧＡＣＧＣＧＴＣＡＴ ＴＡＣＴＡＡＣＴＡＴ ＣＡＡＴＡＴＣＴＴＡ ＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣ ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣ ＡＣＡＧＴＡＧＧＡＣ ＣＴＴＣＧＴＧＣＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２５）である一方、ＳｐＲＮＡｉイントロン配列のアンチセンス鎖は５’ＴＧＣＡＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＡＣＴＧＴＧ ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧ ＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴ ＡＡＧＡＴＡＴＴＧＡ ＴＡＧＴＴＡＧＴＡＡ ＴＧＡＣＧＣＧＴＣＧ ＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧ ＡＣＣＡＣＴＴＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２６）である。
又は、上記に示したのと同じプロトコルに従い、直接にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２５及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２６の雑種（ＳｐＲＮＡｉ）をＤｒａＩＩ切断型ＲＧＦＰエクソンの制限切断部位に組み込むことによって、組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子を作製してもよい。手動再設計したｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡ挿入配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９をコード）を試験するためのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子をこのように形成した。
組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子はその５’末端及び３’末端にそれぞれＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限部位を有するので、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩクローニング部位に付着できる末端を有するベクターに挿入して簡単にクローニングできる。ベクターは、ＤＮＡ導入遺伝子、プラスミド、ジャンピング遺伝子、トランスポゾン及びウィルスベクターからなる群から選ばれる発現可能有機体又は下位有機体でなければならない。さらに、イントロン内の挿入部位は、その５’末端及び３’末端にそれぞれＰｖｕＩ及びＭｌｕＩ制限部位も並んでいるので、上記イントロン挿入配列を除去したり、別のＰｖｕＩ及びＭｌｕＩクローニング部位に付着する末端を有する異なる挿入配列と置換したりすることが可能である。挿入した配列は、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｌａｃ−Ｚ遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子、植物遺伝子、動物遺伝子、及びヒト遺伝子からなる群から選ばれる標的遺伝子に対して高度に相補的なヘアピン状遺伝子サイレンシングエフェクターであることが好ましい。遺伝子サイレンシングエフェクターとその標的遺伝子との相補率及び／又は相同率は、ヘアピンshRNA挿入配列で約30〜100％の範囲で、より好ましくは35〜49％、センスRNA及びアンチセンスRNA挿入配列の両者で90〜100％である。
実施例２
発現可能ベクターへのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子のクローニング及びＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子への組換えｍｉｒ−３０２相同体の挿入
組換えSpRNAi-RGFP遺伝子にはその5’及び3’末端にそれぞれXhoI及びXbaI制限部位があるので、XhoI及びXbaI制限部位に比較的付着できる末端をもつベクターに挿入して簡単にクローニングできる。図３Ａに示すように、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子をＸｈｏＩ／ＸｂａＩ直線化した約６，９００ｂｐのｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳプラスミドと１：１（ｗ／ｗ）の比で混合し、得られた混合物を６５℃から１５℃に５０分間かけて冷却し、次にＴ４リガーゼ及び緩衝液を混合物に添加し、１２℃にて１２時間ライゲーションさせた。これによって、誘導性ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクターが形成された。1対のＲＧＦＰ特異的プライマーであるＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２３及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２４を用いて、９４℃１分間、そして６８℃２分間による３０サイクルのＰＣＲでベクターの組成を確認し、さらに配列を決定した。レトロウイルスベクターでのクローニングは、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ直線化ｐＬＮＣＸ２レトロウイルスベクター（ＢＤＣｌｏｎｔｅｃｈ）を代わりに用いる以外、同じライゲーション手順で実施できた。ＳｐＲＮＡｉイントロン内の挿入部位は、その５’末端及び３’末端にそれぞれＰｖｕＩ及びＭｌｕＩ制限部位が並んでいるので、本発明者らは抗ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ挿入配列を除去し、別のＰｖｕＩ及びＭｌｕＩクローニング部位に付着する末端をもつ手動再設計したｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡ挿入配列と置換することができる。再設計したｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡ挿入配列は、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＵＡＧ ＵＧＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵＵＧＧ ＵＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０）、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＵＡＧ ＵＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１）、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣＡＧ ＵＧＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２）又は５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵＧＡＧ ＵＧＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３）と類似した、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）相同配列を含む。再設計されるｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡ挿入配列は、５’ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵＵＡＧ ＵＧＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）を含むことが最も好ましい。すなわち、遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３、及びこれらの組み合わせからなる群と相同な少なくとも１つの組換えＲＮＡ配列を含む。
組換えｍｉｒ−３０２ファミリーｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又は手動再設計したｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡ挿入配列のＤＮＡ組換えのための合成オリゴヌクレオチドとしては、ｍｉｒ−３０２ａ−センス：５’ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴ ＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴ ＡＡＡＣＧＴＧＧＡＴ ＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴ ＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡ ＧＡＡＧＴＡＡＧＴＧ ＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧ ＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２９）、ｍｉｒ−３０２ａ−アンチセンス：５’ＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡ ＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣ ＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡ ＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴ ＴＡＡＧＴＧＧＴＧＧ ＧＡＣＧＡＴＣＧＧＡ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３０）、ｍｉｒ−３０２ｂ−センス：５’ＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴ ＣＧＣＴＣＣＣＴＴＣ ＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡ ＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴ ＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴ ＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＧ ＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧ ＣＧＣＴＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３１）、ｍｉｒ−３０２ｂ−アンチセンス：５’ＴＡＧＣＧＣＴＡＧＣ ＧＡＣＴＣＣＴＡＣＴ ＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴ ＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡ ＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧ ＧＡＧＣＧＡＧＣＴＣ ＧＡＧＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３２）、ｍｉｒ−３０２ｃ−センス：５’ＣＧＣＴＡＧＣＧＣＴ ＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴ ＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧ ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧ ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴ ＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣ ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３３）、ｍｉｒ−３０２ｃ−アンチセンス：５’ＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＧＣＣＴＣＣＡＣＴＧ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡ ＣＡＧＣＡＧＧＴＡＣ ＣＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＣＡＡＡＧＧＴ ＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３４）、ｍｉｒ−３０２ｄ−センス：５’ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＣＣＡＧＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣ ＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３５）、ｍｉｒ−３０２ｄ−アンチセンス：５’ＡＴＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧ ＧＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡ ＣＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３６）、ｍｉＲ−３０２ｓ−センス：５’ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴ ＡＧＴＧＴＧＣＴＡＡ ＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡ ＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧ ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡ ＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣ ＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７）、ｍｉｒ−３０２ｓ−アンチセンス：５’ＡＴＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴ ＡＧＴＧＴＧＣＣＴＧ ＧＣＴＴＡＧＣＡＣＡ ＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧ ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡ ＴＧＡＣＧＡＴＣＧＧ ＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２８）（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＭＯ）が挙げられる。これらの全ての合成配列は、ライゲーションの前にＰＡＧＥゲル抽出法によって精製された。すなわち、遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２９、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３０、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３２、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３３、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３４、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３５、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３６、及びこれらの組み合わせの雑種のライゲーション連結によって形成された。
ｍｉｒ−３０２ａ−アンチセンスに対するｍｉｒ−３０２ａ−センス、ｍｉｒ−３０２ｂ−アンチセンスに対するｍｉｒ−３０２ｂ−センス、ｍｉｒ−３０２ｃ−アンチセンスに対するｍｉｒ−３０２ｃ−センス、及びｍｉｒ−３０２ｄ−アンチセンスに対するｍｉｒ−３０２ｄ−センスを含む４種類のｍｉｒ−３０２ａ−ｄ雑種のハイブリダイゼーションによって、組換えｍｉｒ−３０２ファミリーｐｒｅ−ｍｉＲＮＡクラスターが形成された。ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、及びｍｉｒ−３０２ｄの雑種をそれぞれ制限酵素ＰｖｕＩ／ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩ、及びＸｂａＩ／ＭｌｕＩで消化し、ゲル抽出フィルターカラムによって高圧滅菌のｄｄＨ２Ｏ（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）３５ μｌで収集した。その直後に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ， ２０Ｕ）で混合雑種を連結し、ｍｉｒ−３０２ファミリーｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入配列クラスターを形成させ、更にＰｖｕＩ／ＭｌｕＩ直線化ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクターに挿入した。又は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２８の２つの合成配列をハイブリダイゼーションさせることによって、手動再設計したｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡを製作し、ＰｖｕＩ／ＭｌｕＩ直線化ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクターに挿入するように、ＰｖｕＩ／ＭｌｕＩ制限酵素で分解した。図２Ａ及び２Ｂに挙げられた工程に基づいて、組換えｍｉｒ−３０２ファミリーｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む誘導性ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクター（すなわちｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓ）は遺伝子導入法によってｈＨＦＣ細胞に送達されるが、再設計されるｍｉｒ−３０２ｓｈＲＮＡを含むベクターはＣｏｌｏ ８２９細胞に導入された。
ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクターは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む大腸菌ＤＨ５α ＬＢ培養細胞において増殖できた。増殖したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクターは、ミニプレップ又はマキシプレッププラスミド抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）によって単離して精製された。ｐＬＮＣＸ２レトロウイルスベクターに関しては、感染能はあるが複製能がないウィルスを作製するために、パッケージング細胞株ＧＰ２−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を用いてもよい。4 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、100 μg/ml硫酸ストレプトマイシン、及び50 μg/mlネオマイシン（Sigma Chemical, MO）を添加し、さらに活性炭処理済み10％ウシ胎児血清（FBS）を追加した1×DMEM培地において、形質移入したGP2-293細胞を5％ CO2、37℃で増殖させた。ｒｅｔｒｏ−Ｘ ｑＲＴ−ＰＣＲ滴定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＣＡ）によって、形質移入前のウィルス力価は、感染多重度（MOI）３０以上であることを測定した。
実施例３
ｍｉｒ−３０２ｓの細胞の培養及び導入遺伝子の送達
ヒト癌症ＰＣ３及びＣｏｌｏ ８２９細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手したが、ｈＨＦＣ及びｈｐＥＳＣ細胞は、コラゲナーゼ／トリプシン（４：１）によってそれぞれ本発明者のヘア又はアームからの２〜１０個の毛嚢ルート又は２ｍｍ３皮膚外植体から解離して得た。これらの細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ， ＭＯ）を追加したＲＰＭＩ １６４０培地において培養された。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液に１分間曝させてＲＰＭＩで１回洗浄することによって、培養細胞を７０％〜８０％コンフルエントになるように継代させ、剥き離れた細胞を新鮮な培地で１：１０で希釈して更新させた。電気穿孔法による導入遺伝子ｍｉｒ−３０２ｓの送達を行うために、低浸透圧性のＰＨ緩衝液（４００μｌ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓベクター（１０〜３０μｇ）と宿主細胞（２００〜２０００）を混合し、４００〜４５０Ｖで１００μｓｅｃ電気穿孔し、ベクターを宿主細胞ゲノムに送達した。７２時間後、ＦＡＣＳフローサイトメトリー選択及び抗ＲＧＦＰモノクローナル抗体によって、陽性の導入遺伝子ｍｉｒＰＳ細胞を単離して収集した（図３Ｃ）。このような新規なｍｉｒ−３０２ｓ遺伝子導入法の成功率は９１％以上と測定された。
又は、レトロウイルスベクター送達については、まず、ｐＶＳＶ−Ｇが共に形質移入したＧＰ２−２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を、組換えｍｉｒ−３０２ファミリーｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入配列を含むＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰが挿入されたｐＬＮＣＸ２レトロウイルスベクターによって培養した。３７℃、５％ＣＯ２で３６時間培養した後、３７℃、５％ＣＯ２で、１２時間かけてＧＰ２−２９３細胞の培地（それぞれ１０ｍｌ）をろ過（０．２５μｍ）し、直接に被験細胞培養細胞に移した。その後、ウィルス培地の代わりに新鮮なｍｉｒＰＳ細胞培地を加え、３日ごとに１回取り替えた。培地は極めて高い力価の設計されたレトロウイルスベクターを含むため、２４時間内、ほぼ全ての被験細胞（９９．４％〜９９．８％）は遺伝子導方法によってベクター感染されてイントロン挿入配列及びＲＧＦＰを発現し始めた。感染後２４時間に、ＦＡＣＳフローサイトメトリーによる選別及び抗ＲＧＦＰモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）によって陽性の導入遺伝子ｍｉｒＰＳ細胞を単離して収集した。
実施例４
ノーザンブロット分析
全てのＲＮＡ（２０μｇ）を１％のホルムアルデヒド・アガロースゲル上で分画して単離し、ナイロンメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ &Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）上に移した。ＲＧＦＰの５’エクソンと設計されるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ挿入配列との間に並んだ７５ ｂｐの接合配列、又は標的遺伝子転写産物に相補的な合成ＬＮＡ−ＤＮＡプローブ（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＭＯ）を、［３２Ｐ］−ｄＡＴＰ（>３０００ Ｃｉ／ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）の存在下にて、ランダムプライマーによって増幅させ、Ｐｒｉｍｅ−ＩｔＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて標識し、１０ ｂｐカットオフのＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎクロマトグラフィカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）で精製した。５０％の新鮮な脱イオンホルムアミド（ｐＨ７．０）、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ、４×のＳＳＰＥ、及び２５０ｍｇ／ｍＬのサケ精子変性ＤＮＡ断片の混合液中にてハイブリダイゼーションを実施した（４２℃で１８時間）。メンブランを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２５℃で１５分間）で２回、０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ（３７℃で４５分間）で１回、連続的に洗浄し、オートラジオグラフィーを実施した。その結果を、図４Ｂ及び６Ｂに示す。
実施例５
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析
標的タンパク質の免疫ブロット（図８Ｃ及び９Ｂ）のために、発生培地を除去した後、約７０％コンフルエントの単離された細胞を氷冷したＰＢＳですすぎ、ついでプロテアーゼ阻害剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ及びＰＭＳＦを追加したＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ溶解／抽出試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）で溶解した。細胞を室温で振盪器を用いて１５分間インキュベーションし、マイクロチューブに剥がし入れ、細胞片塊を得るために１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。タンパク質を含む細胞ライセートを回収し、使用まで-７０℃で保存した。Ｅ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）のＳＯＦＴｍａｘソフトウエアパッケージを用いてタンパク質を定量した。各３０μｇの細胞ライセートを、還元された（＋５０ ｍＭ ＤＴＴ）、及び還元されていない（ＤＴＴがない）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液に添加し、沸騰水浴中で３分間加熱してから、６％〜８％ポリアクリルアミドゲルに添加し、標準タンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）と比較して分子量を測定した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、標準プロトコルに従って実施した。ＰＡＧＥ分解タンパク質をニトロセルロース膜上に電気ブロットし、室温で２時間Odysseyブロッキング試薬（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉｎｃｏｌｎ， ＮＢ）で培養した。次に、Ｏｃｔ３／４（１：５００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＳＥＡ−３（１：５００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＳＥＡ−４（１：５００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｓｏｘ２（１：５００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｎａｎｏｇ（１：５００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｋｌｆ４（１：２００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、β−アクチン（１：２０００， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ）、及びＲＧＦＰ（１：１０００，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む一次抗体を、試薬に加えて４℃で混合物を培養した。翌日、ＴＢＳ−Ｔを用いて膜を３回すすぎ、ヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲートした二次抗体である、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０反応性染料（１：２，０００; Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に、室温で１時間暴露した。ＴＢＳ−Ｔで更に３回すすいだ後、Ｌｉ−ＣｏｒOdyssey Infrared Imager及びOdyssey Softwareｖ．１０を用いて免疫ブロット及び画像解析の蛍光スキャニングを行った。
実施例６
ゼブラフィッシュにおけるイントロンＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシング
形質移入中、Ｔｇ（アクチン−ＧＡＬ４：ＵＡＳ−ｇｆｐ）系統のゼブラフィッシュの幼生を、魚箱で１０ｍｌの０．２×血清無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で飼育した。１ｍｌの１×血清無添加ＲＰＭＩ １６４０培地中に、６０μｌのＦｕＧｅｎｅリポソームの形質移入試薬（ＲｏｃｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を緩やかに溶解して、形質移入用事前混合液を調製した。実施例１〜２に記載したように、抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入配列を含むＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクター（２０ μｇ）を事前混合液と混合し、氷上にて３０分間静置してから、箱中のＴｇ（アクチン−ＧＡＬ４：ＵＡＳ−ｇｆｐ）幼生魚に直接適用した。１２時間の間隔で、合わせて３回（総量６０μｇ）投与した。最初の形質移入から６０時間後に試料を採取した。結果を図１Ｂに示す。
実施例７
フローサイトメトリー分析
必要な実験をした後、細胞が予め冷却した７０％メタノールＰＢＳ溶液１ ｍｌ中に−２０℃で１時間再浮遊されることで、トリプシン処理されて細胞塊を集めて固定された。細胞塊を得た後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。再び細胞塊を得た後、３７℃で、ＰＢＳ内の１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム１ ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅにおいて３０分間再浮遊させた。次に、ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で約１５，０００個の細胞を分析した。細胞ダブレットは、パルス面積に対するパルス幅の曲線を描いて単一細胞をゲーティングすることによって除外された。収集したデータを「ＷａｔｓｏｎＰｒａｇｍａｔｉｃ」アルゴリズムを用いたソフトウエアパッケージＦｌｏｗｊｏを使用して解析した。図５Ａに示すように、フローサイトメトリーチャートの１番目（左）及び２番目（右）のピークは、それぞれ被験細胞集団全体における休止期Ｇ０／Ｇ１及び有糸分裂期Ｍの細胞集団のレベルを示している。
実施例８
ＤＮＡ脱メチル化の測定
ＤＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２００，００００個の細胞からゲノムＤＮＡを単離し、２つのアリコートに分けられた。ゲノム全体脱メチル化を測定するために、一方のＤＮＡアリコート（２μｇ）を、ＣＣＧＧ切断制限酵素ＨｐａＩＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動で評価した（図７Ａ）。他方のアリコート（２μｇ）を用いてＰＣＲを行い、重亜硫酸塩修飾の前後、Ｏｃｔ３／４プロモーターの完全な９，４００個の塩基対（ｂｐ）の５’調節領域（ＮＴ_００７５９２ヌクレオチド２１９９２１８４−２２００１６８８）をクローニングした。ＣｐＧｅｎｏｍｅＤＮＡ修飾キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， ＣＡ）を用いて重亜硫酸塩修飾を行われた。ＤＮＡに対する重亜硫酸塩処理では、非メチル化の全てのシトシンはウラシルに変換される一方、メチル化のシトシンはシトシンのままである。例えば、非メチル化のＡＣＧＴ部位がＡＵＧＴ部位に変わったが、メチル化のＡＣＧＴは変わっていない。重亜硫酸塩修飾の前後で標的Ｏｃｔ３／４５’プロモーター領域に対して特異性をもつ、２つの順方向プライマー５’ＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡ ＧＧＧＴＡＣＴＧＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４４）（重亜硫酸塩修飾したＤＮＡ用）や５’ＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡ ＧＧＧＣＡＣＴＧＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４５）（修飾されていないＤＮＡ用）、及び１つの逆方向プライマー５’ＧＴＡＧＡＡＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４６）を含むＰＣＲプライマーは、既に設計して試験した。ＰＣＲクローニングについては、まず１×のＰＣＲ緩衝液に、重亜硫酸塩で処理された、又は処理されていないゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）をプライマー（合計１５０ピコモル）と混合し、４分間かけて９４℃に加熱した直後、氷上にて冷却した。その後、長鋳型ＰＣＲ延長キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、９２℃で１分間、５５℃で１分間、そして７０℃で５分間、２５サイクルでＰＣＲを行った。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で得られた産物を収集し、ＡｃｌＩ（ＡＡＣＧＴＴ）、ＢｍｇＢＩ（ＣＡＣＧＴＣ）、ＰｍｌＩ（ＣＡＣＧＴＧ）、ＳｎａＢＩ（ＴＡＣＧＴＡ）、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ（ＡＣＧＴ）を等量（各５ Ｕ）ずつ含む、複数種類のＡＣＧＴ切断制限酵素で２μｇのＤＮＡを消化した。ついで、３％アガロースゲル電気泳動で消化された断片を評価した（図７Ｂ）。
重亜硫酸塩ＤＮＡ配列決定分析（図７Ｃ）については、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて更にＯｃｔ３／４転写起点に並ぶ４６７ｂｐ標的領域（ＮＴ_００７５９２ヌクレオチド２１９９６５７７−２１９９７０４３）を増幅した。使用したプライマーは１つの順方向プライマーである５’ＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＡＧＡＡＧＧＡＴＴ ＧＣＴＴＴＧＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４７）、及び１つの逆方向プライマーである５’ＣＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣ ＣＡＣＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４８）である。以上のようにクローニングされた９，４００ｂｐ Ｏｃｔ３／４ ５’プロモーター領域（５０ｎｇ）とｑＰＣＲプライマー（合計１００ピコモル）を、１×のＰＣＲ緩衝液において混合し、２分間かけて９４℃に加熱した直後、氷上にて冷却した。次に、高感度のＰＣＲ延長キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、９４℃で３０秒間、６８℃で１分間、２０サイクルでＰＣＲを行った。正確な４６７ｂｐのサイズの増幅ＤＮＡ産物を、３％アガロースゲル電気泳動によって更に分画し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＤＮＡ配列決定に用いられる。重亜硫酸塩で修飾されたＤＮＡ内及び修飾されていないＤＮＡ配列内の変わっていないシトシンを比較することによって、ＤＮＡメチル化部位の詳細な状況が得られた。
実施例９
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のマイクロアレイ分析
細胞飽和密度７０％で、各細胞株からの短鎖RNAをmirVana（登録商標） miRNA単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて単離した。単離した短鎖ＲＮＡの純度及び量を１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動及び分光光度計の測定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって評価した直後、ドライアイス中にて凍結し、ＲＮＡマイクロアレイ分析のためにＬＣＳｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に送付した。各マイクロアレイチップを、それぞれＣｙ３又はＣｙ５で標識した単一の試料、又はＣｙ３及びＣｙ５で標識した試料とハイブリダイゼーションさせる。バックグラウンドを差し引き、正規化した。二重分析用にｐ値を算出し、３倍より大きい差で発現した転写産物の一覧を作成した。図６ＡのＣｙ３及びＣｙ５強度画像（青色バックグラウンド）において、シグナル強度がレベル１からレベル６５，５３５に増えた場合、対応色が青色から緑色、黄色及び赤色になった。２３，０００以上のレベルは、遺伝子発現の陽性シグナル（ｐｏｓｉｔｉｖｅｃａｌｌ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）であると考えられた。Ｃｙ５／Ｃｙ３の比の画像（黒色バックグラウンド）において、Ｃｙ３レベルがＣｙ５レベルより高い場合、色は緑色であり、Ｃｙ３レベルがＣｙ５レベルに等しい場合、色は黄色であり、Ｃｙ５レベルがＣｙ３レベルより高い場合、色は赤色である。
実施例１０
細胞全体遺伝子発現パターンのゲノム全体のマイクロアレイ分析
５４，０００を超えたオリゴヌクレオチドプローブを含むヒトゲノムＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｕ１３３Ａ&Ｂ及びｐｌｕｓ２．０ アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）を用いて、図８Ａ及び９Ａに示すように、ｍｉｒＰＳ細胞内のゲノム全体の４７，０００のヒト遺伝子転写産物の発現パターンを検出した。試料毎に測定を３回繰り返し、同じ実験を４回繰り返した。ＲＮｅａｓｙスピンカラム（ＲＮｅａｓｙｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各試験試料から全ＲＮＡを単離した。マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション用の標識プローブの調製のために、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＣｈｏｉｃｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５’ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡ ＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＧＡＧＧＣＧＧ−（ｄＴ）２４−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４９）のような修飾オリゴ（ｄＴ）２４−Ｔ７プロモータープライマーを用いて、抽出した全ＲＮＡ（２μｇ）を２本鎖ｃＤＮＡに変換した。得られたｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出法で精製し、エタノールで沈殿させ、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理済みｄｄＨ２Ｏに０．５μｇ／μｌの濃度で再浮遊させた。１μｇのｄｓＤＮＡ、７．５ｍＭの非標識ＡＴＰとＧＴＰ、５ ｍＭの非標識ＵＴＰとＣＴＰ、さらに２ ｍＭのビオチン標識ＣＴＰとＵＴＰ（ビオチン−１１−ＣＴＰ、ビオチン−１６−ＵＴＰ：ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、及び２０ Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロ転写し、３７℃で４時間反応させてから、ＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）によって得られたｃＲＮＡを精製した。ｃＲＮＡ試料の一部を１％アガロースゲル上で単離してサイズ範囲を調べた後、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩（ｐＨ８．０）、１００ ｍＭのＫＯＡｃ／３０ ｍＭのＭｇＯＡｃ中で、９４℃で、３５分間加熱し、１０μｇのｃＲＮＡを５０個塩基の平均サイズに無作為に断片化した。ハイブリダイゼーションは、２００μｌのＡＦＦＹ緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中において４０℃で１６時間、一定の撹拌を加えて完了させた。ハイブリダイゼーション後、アレイを２００μｌの６×ＳＳＰＥ−Ｔ緩衝液（１×０．２５Ｍ塩化ナトリウム／１５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）／１ｍＭＥＤＴＡ／０．００５％トリトン）で３回すすぎ、ついで２００μｌの６×ＳＳＰＥ−Ｔにおいて５０℃で１時間洗浄した。アレイをさらに０．５×ＳＳＰＥ−Ｔで２回すすぎ、０．５×ＳＳＰＥ−Ｔにおいて５０℃で１５分間洗浄した。その後、６×ＳＳＰＥ−Ｔ（ｐＨ７．６）に溶解した２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。アレイを７．５μｍにおいて共焦点スキャナー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で読み取った。
バックグラウンドの変化を決定するために、同様な試料で2回のマイクロアレイ分析を実施し、２００の遺伝子（図８Ａにおける白点）を選択し、一方の分析でわずかに差が示されたこれらの遺伝子を選択して、さらに比較した。完全に適合したプローブ及びミスマッチプローブとの全体的平均差を用いて、試料シグナルを正規化した。ついで、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０版、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｎｓｏｌｅ（登録商標） １．１．１版（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、及びＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇｓ（ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアを用いて、ゲノム全体の遺伝子発現パターンの変化を分析した（図８Ａにおける緑点）。遺伝子発現率の変化が１倍より大きい場合は、陽性差異遺伝子と見なされた。遺伝子クラスター測定において、プラグインプログラムＧｅｎｅｔｒｉｘ（ＥｐｉｃｅｎｔｅｒＳｏｆｔｗａｒｅ）とＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアを結合して使用した。各マイクロアレイ内の内部ハウスキーピン対照平均値を用いて、試料シグナルを正規化した。正規化の後、シグナル強度がレベル１からレベル６５，５３５に増えた場合、対応色は緑色から黒色と赤色になった。２３，０００以上のレベル（赤色）の場合は、ノーザンブロット測定において陽性検出できるので、陽性シグナルと見なされる。
実施例１１
細胞分化及び免疫検出分析
無フィーダーのｍｉｒＰＳ培地の他にいずれの処理もない場合、ｍｉｒＰＳ由来の胚様体を異種移植で6週齢の雌性の偽妊娠の免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスの子宮又は腹膜腔に移植すると、奇形腫様嚢腫が形成される（図１０）。免疫不全の裸マウスの利用は、移植療法に模倣するインビボ環境を提供している。１ＩＵのヒト閉経期ゴナドトロピン（ＨＭＧ）を２日間腹膜内注射し、またヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を１日間注射することによって、偽妊娠マウスを作成した。インビトロで幹細胞を生殖系列様細胞に分化させるように分子誘導するために、３７℃、５％ＣＯ２で、ポリオルニチン／ラミニンに塗布された皿内のＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１；高グルコース）培地にｍｉｒＰＳ細胞を１２時間維持し、上記培地には、１０％の木炭除去済みＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのアクチビン、及び５０ｎｇ／ｍｌのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）が追加された。ついで、細胞をトリプシン処理し、１×ＰＢＳで洗浄して、冷却マトリゲルの４つのアリコート（それぞれ１００μｌ）及び１００μｌの１×ＰＢＳの１つのアリコート中に分注した。その後、すぐに6週齢の免疫不全ＳＣＩＤベージュ色裸マウスの後肢筋肉、腹膜、子宮、皮下の頚部皮膚（マトリゲルと共に）、及び尾部静脈（ＰＢＳと共に）に細胞を移植した。実験処理中、ジエチルエーテルでマウスを麻酔した。１週間後、精原細胞様の細胞は子宮領域のみにおいて認められた。線維芽細胞分化については、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのノギン及び１００ｎｇ／ｍｌの形質転換成長因子−βｌ（ＴＧＦ−β１）を追加した通常のフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地を用いて６時間経てから、異種移植を行うこと以外、以上に示す方法と同様に処理した。１週間後、線維芽細胞は子宮において認められた。軟骨細胞分化については、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１００ｎｇ／ｍｌの骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を追加した通常のＲＰＭＩ １６４０培地を用いて６時間経ること以外、以上に示す方法と同様に処理した。軟骨細胞は肝臓領域のみにおいて認められた。
特定の組織マーカーの免疫検出のため、４℃で、組織試料を４％パラホルムアルデヒドに一晩取り付けた。試料を順に１×ＰＢＳ、メタノール、イソプロパノール、及びテトラヒドロナフタレンで洗浄し、次にパラフィンワックスに包んだ。マイクロトームで７〜１０μｍの厚さで包まれた試料を切断し、清潔なＴＥＳＰＡ塗布スライドガラス上に取り付けた。ついで、キシレンを用いてスライドガラスを脱ろうし、取付け媒体（ＲｉｃｈａｒｄＡｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ， ＭＩ）によってカバーガラスの下に取り付け、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ&Ｅ， Ｓｉｇｍａ）で染色して形態を観察した。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色キットは、Ｉｍｇｅｎｅｘ（ＳａｎＤｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。製造元のプロトコルに従い、抗体の希釈及び免疫染色工程を行った。用いられた一次抗体は、Ｔｕｊ１（１：５００，Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＡＢＣＡ２（１：１００， Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、Ｄａｚｌａ（１：１００， Ａｂｅａｍ）、ＥＥ２（１：１００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ａｔｌａｓｔｉｎ１（１：２００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＣＯＬ１Ａ１（１：５００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＣＯＬ２Ａ１（１：５００， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、トロポエラスチン（１：２００， Ａｂｅａｍ）、及びＲＧＦＰ（１：５００， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。二次抗体としては、蛍光染料標記ヤギ抗ウサギ又はウマ抗マウス抗体（１：２，０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。１００×顕微鏡で全視野スキャニングし、陽性結果が観察された。定量分析のために、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈイメージングプログラム（Ｎｉｋｏｎ８０ｉ及びＴＥ２０００微視的定量システム）によって２００×、又は４００×倍率で計測した。
実施例１２
細胞移動の測定
９６ウェルの培養板において、ウェルごとに１つのＰＣ３細胞と１つのｍｉｒＰＳ−ＰＣ３細胞を入れ、その移動及び相互作用を記録した。２つの細胞はいずれも、３７℃、５％ＣＯ２で１０％の木炭除去済みＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのアクチビン、５ｎｇ／ｍｌのノギン、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び０．５μＭのＧＳＫ−３抑制因子ＸＶを追加したＲＰＭＩ１６４０培地において発生した。セルホルダーを有する1対のＭＯ−１８８ＮＥ ３Ｄ油圧ファインマイクロマニピュレータを用いて、ＴＥ２０００倒立型顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ）で細胞を個別的に単離して採取した。マイクロマニピュレータ及び顕微鏡システム全体を防振ステージに位置した。４００×、及び６００×倍率で、６時間かけて、１５秒おきに写真を撮った。写真における細胞運動及び細胞形態を追いかけることによって、細胞移動を確認した。図７Ｄに示すように、転移癌ＰＣ３細胞は、ＡＴＣＣのような速やかな軸形状移動になったが、ｍｉｒＰＳ−ＰＣ３細胞は円形状静止表現型を示して、放置された位置に保持されている。
実施例１３
統計解析
結果は平均±ＳＥで示した。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によってデータを統計解析した。主効果が有意な場合、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓポストホック検定を用いて、対照群と有意に異なる群を同定した。２処理群間の一対比較には、両側スチューデントｔ検定を用いた。２群以上の処理群に関する実験では、ＡＮＯＶＡを行った後ポストホック多重範囲検定を行った。確率Ｐ＜０．０５を有意とみなした。両側検定から全ｐ値を決定した。
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３３． Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１： １０６１−１０６７。
３４． Ｓｔｉｔｚｅｌら （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６： ４０７−４０８。
３５． Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら （２００４） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １４： Ｒ３５−４５。
３６． Ｔｈｏｍｓｏｎによる米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号及び第７，２２０，５８４号。
３７． Ｇｅａｒｈａｒｔによる米国特許第６，０９０，６２２号、第６，２４５，５６６号及び第６，３３１，４０６号。
３８． Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆによる米国特許第６，８７５，６０７号。
３９． Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａによる米国特許第７，２５０，２５５号。
本明細書に記載された実施例及び実施形態は単に例証目的のためであり、これらの範囲内での様々な改良又は変更が当業者によって提示され、これらは添付の請求項に記載される本発明の精神及び範囲内に含まれることが当然である。本明細書で引用した全ての刊行物及び特許は、全ての目的に関してその全体の参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

  1. 少なくとも１つの非インビボ細胞を少なくとも１つの腫瘍のない多能性幹細胞に再プログラムする方法であって、
    （ａ）ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子に干渉する少なくとも１つの遺伝子サイレンシングエフェクターに送達及びプロセシングできる組換え核酸成分を構成する工程であって、前記細胞遺伝子にはＣＤＫ２、サイクリンＤ、ＭＥＣＰ１−ｐ６６及びＭＥＣＰ２遺伝子が含まれ、前記遺伝子サイレンシングエフェクターはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２、及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３から選ばれる配列を少なくとも含んでいることと、
    （ｂ）少なくとも１つの非インビボ細胞を腫瘍のない多能性幹細胞に再プログラミングするために、薬剤誘導性ベクターを介して非インビボ細胞基質に前記組換え核酸成分を導入し、前記組換え核酸成分で非インビボ細胞基質を処理してゲノムＤＮＡの全体の脱メチル化及び細胞周期のレートの低下を誘導する工程と
    を含む方法。
  2. 前記細胞は、ほ乳類細胞、ヒト細胞、正常体細胞、病的体細胞、腫瘍細胞、癌細胞、ヒト毛嚢、ヒト皮膚細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞基質は、ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子を発現する請求項１に記載の方法。
  4. 前記組換え核酸成分は、薬剤誘導性遺伝子発現プロモーターを含む請求項１に記載の方
    法。
  5. 前記薬剤誘導性遺伝子発現プロモーターは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はその他のテトラサイクリン誘導体により制御される請求項４に記載の方法。
  6. 前記組換え核酸成分は、５’供与スプライス部位、イントロン挿入部位、分岐点モチーフ、ポリピリミジントラクト、及び３’受容スプライス部位を含む請求項１に記載の方法。
  7. 前記組換え核酸成分は更に、蛍光タンパク質マーカー遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｌａｃ−Ｚレポーター遺伝子、胚性幹細胞マーカー遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子、細胞マーカー遺伝子、ジャンピング遺伝子、トランスポゾン、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複数のエクソンを含む請求項１に記載の方法。
  8. 前記遺伝子サイレンシングエフェクターは医薬又は治療用途に有用である請求項１に記載の方法。
  9. 前記遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９の配列を含む組換えヘアピン様ＲＮＡである請求項１に記載の方法。
  10. 前記組換え核酸成分は、テトラサイクリン応答要素、ウィルス又はＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターもしくはその両者、Ｋｏｚａｋ翻訳開始共通配列、ポリアデニル化シグナル、複数の制限／クローニング部位、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるものを含む請求項１に記載の方法。
  11. 前記組換え核酸成分は、ｐＵＣ複製起点、複製可能な原核細胞で抗生物質耐性遺伝子を少なくとも１つ発現するＳＶ４０初期プロモーター、ほ乳類細胞の選択的ＳＶ４０複製起点、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるものを含む請求項１に記載の方法。
  12. 前記組換え核酸成分は、リポソーム形質移入、化学的形質移入、ＤＮＡ組換えによる遺伝子導入、ウィルス感染、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、マイクロインジェクション、電気穿孔法、遺伝子銃による貫入、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子送達法によって、前記細胞に導入される請求項１に記載の方法。
  13. 前記多能性幹細胞は、生殖系列様細胞に分化される請求項１に記載の方法。
  14. 前記多能性幹細胞は、正常体細胞に分化される請求項１に記載の方法。
  15. 前記多能性幹細胞は、ｍｉｒ−３０２マイクロＲＮＡとＯｃｔ３／４をマーカーとして用いて選択的に単離される請求項１に記載の方法。
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