CN117413051A - 细胞组合物、细胞组合物的制造方法和含有细胞组合物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供对增殖能力和/或分化能力高的血细胞系细胞进行浓缩的技术。本发明涉及细胞组合物的制造方法和细胞组合物，所述细胞组合物的制造方法包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达G蛋白偶联受体56(GPR56)的细胞的步骤，所述细胞组合物含有表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％。

Description

细胞组合物、细胞组合物的制造方法和含有细胞组合物的药 物组合物
技术领域
本发明涉及得到增殖能力和/或分化能力高的血细胞系细胞的方法、以及含有增殖能力和/或分化能力高的血细胞系细胞的细胞组合物等。
背景技术
胚胎干细胞(ES细胞、Embryonic Stem Cells、ESC)和诱导多能干细胞(iPS细胞、induced Pluripotent Stem Cell、iPSC)等多能干细胞(Pluripotent Stem Cell、PSC)保持了能够分化成多种多样的细胞的性质(多能性)，在再生医疗领域中，被期待作为用于制造细胞的供给源。
近年来，多种多样的方法能够实现从PSC向目标细胞的分化。另一方面，PSC由于遗传多样性和表观遗传多样性而在克隆内产生功能的不均匀性。因此，在实际的分化过程中，并不是PSC的全部细胞均分化成目标细胞(非专利文献1)。而且，处于分化过程中的细胞是不稳定的(非专利文献2)，因此分化后形成更加不均匀的细胞集合。因此，正在积极地开发旨在制造均匀的细胞集合的从PSC起的分化控制技术。
在血细胞系细胞系统的发生过程中，PSC分化为造血干细胞(Hematopoietic StemCell、HSC)和造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cell、HPC)等被称为多能造血干细胞(Multipotent Hematopoietic Stemcell、MHSC)的未成熟的血细胞系细胞，之后分化为各种成熟的血细胞系细胞(非专利文献3、4)。据报道，在体外PSC也向HSC和HPC分化(非专利文献5)。HSC和HPC通常通过细胞表面标志物CD34和/或CD43的表达来表征(非专利文献5、6)。
另一方面，近年来报道了G蛋白偶联受体56(G Protein-coupled Receptor56、以下记为GPR56)在生物体内的发生期的HSC中表达。已知GPR56是生物体内的发生过程中的HSC的簇形成所必需的、并且对于由血管内皮细胞生成HSC很重要等(非专利文献7)。还已知，GPR56虽然在小鼠胚胎中或成体骨髓中的造血步骤中限定于初期的造血干细胞/祖细胞而丰富表达，但是随着从造血干细胞/祖细胞向成熟血液系统分化，GPR56的表达水平急剧下降，GPR56的表达不影响造血干细胞/祖细胞的维持和其功能(非专利文献8)。
但是，与CD34或CD43等表征MHSC的现有细胞表面标志物不同，GPR56在从MHSC向成熟的血细胞系细胞的分化过程中与细胞的增殖或分化相关，这一点尚属未知。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Patrick Cahan&George Q,Daley,Origins and implications ofpluripotent stem cell variability and heterogeneity；Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2013Jun,14(6),357-368
非专利文献2：Taro Ichimura et al.,Visualizing the appearance anddisappearance of the attractor of differentiation using Raman spectralimaging；Sci.Rep.,2015,5,11358,1-10
非专利文献3：Elisabetta Dejana et al.,The molecular basis ofendothelial cell plasticity；Nat.Commun.,2017Feb 9,8,14361,1-11
非专利文献4：Leo D Wang&Amy J Wagers,Dynamic niches in the originationand differentiation of haematopoietic stem cells；Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2011Sep 02,12(10),643-655
非专利文献5：Christopher M.Sturgeon et al.,Wnt Signaling Controls theSpecification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From HumanPluripotent Stem Cells；Nat.Biotechnol.,2014Jun,32(6),554-561
非专利文献6：Maxim A.Vodyanik et al,Leukosialin(CD43)defineshematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiationcultures；Blood,2006Sep 15,108(6),2095-2105
非专利文献7：Parham Solaimani Kartalaei et al.,Whole-transcriptomeanalysis of endothelial to hematopoietic stem cell transition reveals arequirement for Gpr56 in HSC generation；J.Exp.Med.,2015Jan 12,212(1),93-106
非专利文献8：Tata Nageswara Rao et al.,High-level Gpr56expression isdispensable for the maintenance and function of hematopoietic stem andprogenitor cells in mice；Stem Cell Res.,2015May,14(3),307-322
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，在实际的PSC的分化过程中，并不是其全部均分化为目标细胞。而且，处于分化过程中的细胞是不稳定的，分化后形成更加不均匀的细胞集合。因此，正在积极地开发旨在制造均匀的细胞集合的、控制从PSC起的分化的技术，但尚未发现在工业上能够利用的技术。
本发明人首次发现，以往通过表达CD34和/或CD43而被表征为MHSC的细胞集合中含有在此后的培养中不充分增殖的细胞或不分化为目标细胞的细胞、以及因此无法稳定且大量地制造含有使以往的MHSC分化而成的血细胞系细胞的细胞组合物。
因此，本发明的目的在于，提供对增殖能力和/或分化能力高的血细胞系细胞进行浓缩的技术。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，在从未成熟的血细胞系细胞向成熟的血细胞系细胞的分化过程中的细胞的增殖能力和/或分化能力与GPR56有关，另外，通过从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞，能够浓缩增殖能力和/或分化能力高的血细胞系细胞，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下发明。
[1]一种细胞组合物的制造方法，其包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤。
[2]根据[1]所述的制造方法，其中，上述表达GPR56的细胞为人细胞。
[3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，上述表达GPR56的细胞为表达GPR56的同时还表达CD34的细胞。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的制造方法，其中，上述表达GPR56的细胞表达GPR56的同时还表达CD43和CD45中的至少一者。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的制造方法，其中，上述细胞集合为源自多能干细胞的细胞集合。
[6]根据[5]所述的制造方法，其中，上述细胞集合为将上述多能干细胞分化诱导为中胚层后用含有干细胞因子(以下记为SCF)、血小板生成素重组蛋白(Thrombopoietinrecombinant protein，以下记为TPO)和Fms相关酪氨酸激酶3配体(Fms-related tyrosinekinase 3ligand，以下记为Flt3-L)的培养基进行了培养的细胞集合。
[7]根据[5]所述的制造方法，其中，上述源自多能干细胞的细胞集合为将上述多能干细胞分化诱导为造血干细胞或造血祖细胞而得的细胞集合。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的制造方法，其中，上述细胞集合为含有造血干细胞和造血祖细胞中的至少一者的细胞集合。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的制造方法，其中，上述细胞集合为含有表达选自CD34、CD43和CD45中的至少一者的细胞的细胞集合。
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的制造方法，其中，还包括将上述表达GPR56的细胞分化诱导为成熟的血细胞系细胞的步骤。
[11]根据[10]所述的制造方法，其中，上述成熟的血细胞系细胞为淋巴细胞系细胞。
[12]根据[11]所述的制造方法，其中，上述淋巴细胞系细胞为T细胞或自然杀伤细胞。
[13]根据[11]所述的制造方法，其中，上述淋巴细胞系细胞为表达嵌合抗原受体的细胞。
[14]根据[10]所述的制造方法，其中，上述成熟的血细胞系细胞为髓系细胞。
[15]根据[10]至[14]中任一项所述的制造方法，其中，还包括培养分化诱导为上述成熟的血细胞系细胞之前或之后的细胞并使其增殖的步骤。
[16]一种细胞组合物，其含有表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％。
[17]根据[16]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为人细胞。
[18]根据[16]或[17]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
[19]根据[16]至[18]中任一项所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为表达GPR56的同时还表达CD34的细胞。
[20]根据[16]至[19]中任一项所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为表达GPR56的同时还表达CD43和CD45中的至少一者的细胞。
[21]根据[16]至[20]中任一项所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为源自多能干细胞的细胞。
[22]根据[21]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为将上述多能干细胞分化诱导为中胚层后用含有SCF、TPO和Flt3-L的培养基进行了培养的细胞。
[23]根据[21]或[22]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为将上述多能干细胞分化诱导为造血干细胞或造血祖细胞后的细胞。
[24]一种药物组合物，其含有通过[1]至[15]中任一项所述的制造方法制造的细胞组合物。
[25]根据[24]所述的药物组合物，其中，上述药物组合物为选自癌症、免疫疾病和血液疾病中的至少一种的治疗剂或血液制剂。
[26]一种药物组合物，其含有[16]至[23]中任一项所述的细胞组合物。
[27]根据[26]所述的药物组合物，其中，上述药物组合物为选自癌症、免疫疾病和血液疾病中的至少一种的治疗剂或血液制剂。
[1’]一种细胞组合物的制造方法，其包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达G蛋白偶联受体56(G Protein-coupled Receptor56，以下记为GPR56)的细胞的步骤。
[2’]根据[1’]所述的制造方法，其中，上述表达GPR56的细胞为人细胞。
[3’]根据[1’]所述的制造方法，其中，上述表达GPR56的细胞为表达GPR56的同时还表达CD34的细胞。
[4’]根据[1’]所述的制造方法，其中，上述表达GPR56的细胞表达GPR56的同时还表达CD43和CD45中的至少一者。
[5’]根据[1’]所述的制造方法，其中，上述细胞集合为源自多能干细胞的细胞集合。
[6’]根据[5’]所述的制造方法，其中，上述细胞集合为将上述多能干细胞分化诱导为中胚层后用含有干细胞因子(SCF)、血小板生成素重组蛋白(TPO)和Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)的培养基进行了培养的细胞集合。
[7’]根据[5’]所述的制造方法，其中，上述源自多能干细胞的细胞集合为将上述多能干细胞分化诱导为造血干细胞或造血祖细胞而得的细胞集合。
[8’]根据[1’]所述的制造方法，其中，上述细胞集合为含有造血干细胞和造血祖细胞中的至少一者的细胞集合。
[9’]根据[1’]所述的制造方法，其中，上述细胞集合为含有表达选自CD34、CD43和CD45中的至少一种的细胞的细胞集合。
[10’]根据[1’]所述的制造方法，其中，还包括将上述表达GPR56的细胞分化诱导为成熟的血细胞系细胞的步骤。
[11’]根据[10’]所述的制造方法，其中，上述成熟的血细胞系细胞为淋巴细胞系细胞。
[12’]根据[11’]所述的制造方法，其中，上述淋巴细胞系细胞为T细胞或自然杀伤细胞。
[13’]根据[11’]所述的制造方法，其中，上述淋巴细胞系细胞为表达嵌合抗原受体的细胞。
[14’]根据[10’]所述的制造方法，其中，上述成熟的血细胞系细胞为髓系细胞。
[15’]根据[10’]所述的制造方法，其中，还包括培养分化诱导为上述成熟的血细胞系细胞之前或之后的细胞并使其增殖的步骤。
[16’]一种细胞组合物，其含有表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％。
[17’]根据[16’]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为人细胞。
[18’]根据[16’]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
[19’]根据[16’]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为表达GPR56的同时还表达CD34的细胞。
[20’]根据[16’]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为表达GPR56的同时还表达CD43和CD45中的至少一者的细胞。
[21’]根据[16’]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为源自多能干细胞的细胞。
[22’]根据[21’]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为将上述多能干细胞分化诱导为中胚层后用含有SCF、TPO和Flt3-L的培养基进行了培养的细胞。
[23’]根据[21’]所述的细胞组合物，其中，上述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为将上述多能干细胞分化诱导为造血干细胞或造血祖细胞后的细胞。
[24’]一种药物组合物，其含有通过[1’]至[15’]中任一项所述的制造方法制造的细胞组合物。
[25’]根据[24’]所述的药物组合物，其中，上述药物组合物为选自癌症、免疫疾病和血液疾病中的至少一种的治疗剂或血液制剂。
[26’]一种药物组合物，其含有[16’]至[23’]中任一项所述的细胞组合物。
[27’]根据[26’]所述的药物组合物，其中，上述药物组合物为选自癌症、免疫疾病和血液疾病中的至少一种的治疗剂或血液制剂。
发明效果
根据本发明的细胞组合物的制造方法，通过包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤，从而能够浓缩增殖能力和/或分化能力高的血细胞系细胞，能够稳定且大量地制造含有血细胞系细胞的细胞组合物。
根据本发明的细胞组合物，通过含有表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞且表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％，从而显示优良的增殖能力和/或分化能力，能够稳定且高效地制造含有血细胞系细胞的细胞组合物。
附图说明
图1为示出通过将源自T细胞的iPS细胞株(TkT3V1-7)分化诱导为造血干细胞而得到的拟胚体(EB)的细胞表面标志物的分析结果的图。如箭头所示，按照左图、中图、右图的顺序分别对方框内的细胞集合设门，供于用下一个细胞标志物的分析。各图的纵轴和横轴表示各细胞表面标志物的表达水平。另外，各图中的方框内的数值表示该区域内的细胞数在全部细胞数中的比例。
图2为示出评价集落形成能力的结果的图，其中，从由源自T细胞的iPS细胞株(TkT3V1-7)得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合中，对CD34(-)GPR56(-)双阴性(图中记为DN)的细胞集合、CD34(+)GPR56(-)单阳性(图中记为SP)的细胞集合、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(图中记为DP)的细胞集合分别设门，分化诱导为髓系细胞后，评价集落形成能力。各纵轴表示形成了集落的细胞数相对于全部细胞数的比例，*表示在图示数据之间具有统计上的显著性差异。
图3为示出对各细胞集合的活细胞数进行计数的结果的图，其中，从由源自T细胞的iPS细胞株(TkT3V1-7)得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合中，对CD34(-)GPR56(-)双阴性(图中记为DN)的细胞集合、CD34(+)GPR56(-)单阳性(图中记为SP)的细胞集合、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(图中记为DP)的细胞集合设门，分化诱导为T细胞后，对各细胞集合的活细胞数进行计数。纵轴表示将培养后的最终的活细胞数除以最初接种的细胞数而得的值，**表示在图示数据之间具有统计上的显著性差异。
图4为示出对各细胞集合的细胞表面标志物进行分析的结果的图，其中，从由源自T细胞的iPS细胞株(TkT3V1-7)得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合(图中记为Whole)中，对CD34(+)GPR56(-)单阳性(图中记为SP)的细胞集合、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(图中记为DP)的细胞集合设门，分化诱导为T细胞后，对各细胞集合的细胞表面标志物进行分析。如箭头所示，在上段的左图、中图、右图各自所示的细胞集合中，对右上方框内的细胞集合设门而分别展开为下段的左图、中图、右图，供于下一个细胞表面标志物分析。各图的纵轴和横轴分别示出细胞表面标志物的表达水平。另外，各图中的方框内的数值表示该区域内的细胞数在全部细胞数中的比例。
图5为示出对通过将作为Non-T-iPSC的Ff-I01s04、Ff-WJs513和Ff-WJs524分化诱导为造血干细胞而得到的EB的细胞表面标志物进行分析的结果的图。如箭头所示，在各细胞株中，按照左图、中图、右图的顺序分别对方框内的细胞集合设门，供于用下一个细胞标志物的分析。各图的纵轴和横轴分别表示细胞表面标志物的表达水平。另外，各图中的方框内的数值表示该区域内的细胞数在全部细胞数中的比例。
图6为示出对集落形成能力进行评价的结果的图，其中，从由作为Non-T-iPSC的Ff-I01s04、Ff-WJs513和Ff-WJs524得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合中，对CD34(-)GPR56(-)双阴性(图中记为DN)的细胞集合、CD34(+)GPR56(-)单阳性(图中记为SP)的细胞集合、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(图中记为DP)的细胞集合分别设门，分化诱导为髓系细胞后，对集落形成能力进行评价。各图的纵轴分别表示形成了集落的细胞数相对于全部细胞数的比例，*分别表示在图示数据之间具有统计上的显著性差异。
图7为示出对各细胞集合的活细胞数进行计数的结果的图，其中，从由作为Non-T-iPSC的Ff-I01s04得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合中，对CD34(-)GPR56(-)双阴性(图中记为DN)的细胞集合、CD34(+)GPR56(-)单阳性(图中记为SP)的细胞集合、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(图中记为DP)的细胞集合设门，分化诱导为NK细胞后，对各细胞集合的活细胞数进行计数。图中所示的“实验1”和“实验2”分别表示独立的2次实验结果。各图的纵轴分别表示将培养后的最终的活细胞数除以最初接种的细胞数而得到的值。
图8为示出对各细胞集合的细胞表面标志物进行分析的结果的图，其中，从由作为Non-T-iPSC的Ff-I01s04株得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合(图中记为Whole)中，对CD34(+)GPR56(-)单阳性(图中记为SP)的细胞集合、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(图中记为DP)的细胞集合设门，分化诱导为NK细胞后，对各细胞集合的细胞表面标志物进行分析。对上段的左图、中图、右图各自所示的细胞集合中的右上方框内的细胞集合设门，分别展开为下段的左图、中图、右图，供于下一个细胞表面标志物分析。各图的纵轴和横轴分别表示细胞表面标志物的表达水平。另外，各图中的方框内的数值表示该区域内的细胞数在全部细胞数中的比例。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
＜细胞组合物的制造方法＞
本发明涉及细胞组合物的制造方法，其包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤。
本发明中，“血细胞系细胞”是指由MHSC和MHSC分化成的各种细胞，可列举包括未成熟的血细胞系细胞和成熟的血细胞系细胞的所有血细胞系细胞。作为血细胞系细胞，可列举例如HSC、HPC、淋巴细胞系共同祖细胞、骨髓细胞系共同祖细胞B细胞-NK细胞祖细胞、成红细胞系祖细胞、粒细胞-单核细胞祖细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、T细胞、NK/T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、巨核细胞和红细胞等。上述血细胞系细胞为NK细胞或T细胞时，该NK细胞或T细胞可以为后述的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
本发明中，“未成熟的血细胞系细胞”是指血细胞系细胞中的由MHSC和MHSC分化成的各种祖细胞。作为未成熟的血细胞系细胞，可列举例如HSC、HPC、淋巴细胞系共同祖细胞、B细胞-NK细胞祖细胞、骨髓细胞系共同祖细胞、成红细胞系祖细胞和粒细胞-单核细胞祖细胞等，优选为HSC或HPC。
HSC为具有分化为包括HPC的所有血细胞系细胞的能力和自复制能力的干细胞。HPC为由HSC分化成的血细胞系的祖细胞，具有分化为除HSC以外的所有血细胞系细胞的能力。作为识别HSC和HPC的阳性标志物，可列举例如CD34、CD43和CD45等。
阳性标志物也被称为细胞表面标志物，为可在目标细胞的表面表达的分子。通过检测该阳性标志物的表达，能够进行目标细胞的检测和分离等。在检测阳性标志物时，可以使用含有公知的绿色荧光蛋白(GFP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)等各种荧光色素标记的目标阳性标志物特异性抗体等的试剂。
作为目标细胞的检测和分离中使用的方法，可列举例如：使用BD FACSymphony流式细胞仪(BD Bioscience公司)等的流式细胞术或Helios质谱流式细胞仪(Fluidigm公司)等质谱流式细胞术等的方法；或者例如使用CD34微珠试剂盒(Miltenyi Biotec公司)的方法；或者Miltenyi S,et al.；Cytometry,1990,11,231中记载的方法等磁性细胞分离法等。另外，使用目标细胞的检测和分离中使用的方法，可以对表达目标阳性标志物的细胞进行选择、提取和/或浓缩。
本发明中，“表达”是指通过上述的目标细胞的检测和分离中使用的方法，能够检测出目标阳性标志物。相反，“不表达”是指通过上述目标细胞的检测和分离中使用的方法，在该方法的检测灵敏度范围内检测不到目标阳性标志物。
本发明中，“细胞集合”是指两个以上细胞的聚集体。另外，本发明中，“细胞组合物”是指含有细胞或细胞集合的组合物。细胞集合可仅由单独一种细胞构成，也可以由两种以上细胞构成。细胞组合物可以包含培养基、保存液等细胞以外的成分。
即，“含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合”是指含有上述的未成熟的血细胞系细胞的两种以上细胞的聚集体。作为含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合，可列举例如含有HSC、HPC、淋巴细胞系共同祖细胞、B细胞-NK细胞祖细胞、骨髓细胞系共同祖细胞、成红细胞系祖细胞或粒细胞-单核细胞祖细胞等的两种以上细胞的聚集体，优选含有HSC和HPC中的至少一者的两种以上细胞的聚集体。另外，含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合例如可以为含有表达选自作为阳性标志物的CD34、CD43和CD45中的至少一种的细胞的细胞集合。
本发明的制造方法中，在从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤之前，可以包括准备或制备含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合的步骤。
含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合的来源和制备方法没有特别限制，可列举例如根据Suzuki N,et al.；Mol.Ther.,2013,7,1424、Takayama M,et al.；J.Exp.Med.,2010,207,2817等中记载的公知的方法在体内或体外对多能干细胞进行分化诱导的方法、或利用公知的方法从生物组织中采集的方法等。
含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合的来源为多能干细胞时，该细胞集合优选为将多能干细胞分化诱导为HSC或HPC等MHSC而得的细胞集合或将多能干细胞分化诱导为中胚层后用含有干细胞因子(SCF)、血小板生成素重组蛋白(TPO)和Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)的培养基进行了培养的细胞集合，更优选为将多能干细胞分化诱导为HSC或HPC而得的细胞集合。
本发明中，“分化诱导而得的细胞集合”是指进行了以分化诱导为目的的处理的细胞集合。另外，本发明中，“分化诱导而得的细胞”是指进行了以分化诱导为目的的处理的细胞。
作为将多能干细胞分化诱导为中胚层后在体外在培养基中进行培养而分化诱导为MHSC的方法，可列举例如下述公知方法：从iPSC分化诱导为中胚层后在体外在培养基中进行培养而分化诱导为MHSC。作为该方法，具体而言，可列举例如使用国际公开第2020/138371号中记载的拟胚体(EB)形成法的方法。
作为上述分化诱导步骤中的SCF在培养基中的浓度，优选为1ng/ml～200ng/ml，特别优选为约50ng/ml。作为上述分化诱导步骤中的TPO在培养基中的浓度，优选为1ng/ml～100ng/ml，特别优选为约30ng/ml。作为上述分化诱导步骤中的Flt3-L在培养基中的浓度，优选为1ng/ml～100ng/ml，特别优选为约10ng/ml。在此，约是指包括±10％的范围。
多能干细胞为保持了能够分化为多种多样的细胞的性质的细胞，可列举例如ESC、iPSC、胚胎肿瘤细胞和胚胎生殖干细胞等，优选为iPSC。多能干细胞的来源和获得方法没有特别限制，可列举例如利用公知的方法由体细胞等制作的方法、或者利用公知的方法从生物组织采集的方法等。
作为成为多能干细胞、体细胞或生物组织的来源的动物，没有特别限制，可列举例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猴、猩猩、黑猩猩和人等哺乳动物，优选人。另外，作为生物组织，只要含有未成熟的血细胞系细胞则没有特别指定，可列举例如外周血、淋巴结、骨髓、胸腺、胰腺和脐带血等。
多能干细胞的来源为体细胞时，该体细胞没有限制，可列举例如T细胞、源自外周血的细胞或源自脐带血的细胞等。上述体细胞为T细胞时，该T细胞可以为后述的表达嵌合抗原受体的细胞。
多能干细胞为iPSC时，iPSC可以通过后述的公知的制造方法由体细胞制作，也可以从国立研究开发法人医药基础健康营养研究所JCRB细胞库或美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)等已经建立、储备的公共细胞库获得并使用，或者可以从宝生物株式会社等以市售试剂等形式获得并使用。
iPSC可以通过向任意的体细胞中导入初始化因子而制造。作为初始化因子，可列举例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、Eras、ECAT15-2、Tcl1、β连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物。这些初始化因子可以单独使用，另外也可以将多种因子组合使用。
作为iPSC的制造方法，可列举例如国际公开第2008/118820号、国际公开第2009/007852号、国际公开第2009/032194号、国际公开第2009/058413号、国际公开第2009/057831号、国际公开第2009/075119号、国际公开第2009/079007号、国际公开第2009/091659号、国际公开第2009/101084号、国际公开第2009/101407号、国际公开第2009/102983号、国际公开第2009/114949号、国际公开第2009/117439号、国际公开第2009/126250号、国际公开第2009/126251号、国际公开第2009/126655号、国际公开第2009/157593号、国际公开第2010/009015号、国际公开第2010/033906号、国际公开第2010/033920号、国际公开第2010/042800号、国际公开第2010/050626号、国际公开第2010/056831号、国际公开第2010/068955号、国际公开第2010/098419号、国际公开第2010/102267号、国际公开第2010/111409号、国际公开第2010/111422号、国际公开第2010/115050号、国际公开第2010/124290号、国际公开第2010/147395号、国际公开第2010/147612号、Huangfu D,et al.；Nat.Biotechnol.,2008,26,795、Shi Y,et al.；Cell StemCell,2008,2,525、Eminli S,et al.；Stem Cells,2008,26,2467、Huangfu D,et al.；Nat.Biotechnol.,2008,26,1269、Shi Y,et al.；Cell Stem Cell,2008,3,568、Zhao Y,etal.；Cell Stem Cell,2008,3,475、Marson A.；Cell Stem Cell,2008,3,132、Feng B,etal.；Nat.Cell Biol.,2009,11,197、R.L.Judson et al.；Nat.Biotechnol.,2009,27,459、Lyssiotis CA,et al.；Proc.Natl.Acad.Sci.U S A；2009,106,8912、Kim J.B.,et al.；Nature,2009,461,649、Ichida J.K.,et al.；Cell Stem Cell.,2009,5,491、Heng J.C.,et al.；Cell Stem Cell,2010,6,167、Han J,et al.；Nature,2010,463,1096、Mali P,etal.；Stem Cells,2010,28,713或Maekawa M,et al.；Nature,2011,474,225等中记载的方法。这些制造方法可以单独使用，另外也可以将两种以上制造方法组合使用。
本发明中，“表达GPR56的细胞”是指表达GPR56作为阳性标志物的细胞。
GPR56是也被称为粘附G蛋白偶联受体G1(ADHESION GPROTEIN-COUPLED RECEPTORG1，ADGRG1)、无EGF样N端结构域的七次跨膜蛋白1(7-TRANSMEMBRANE PROTEIN WITH NOEGF-LIKE N-TERMINAL DOMAINS1，TM7XN1)、双侧额顶骨多小脑回畸形(BILATERALFRONTOPARIETAL POLYMICROGYRIA，BFPP)、双侧外侧裂常染色体隐性多小脑回畸形(POLYMICROGYRIA,BILATERAL,PERISYLVIAN,AUTOSOMAL,RECESSIVE，BPPR)或TM7LN4的基因产物。
本发明中的GPR56的来源没有特别限制，可列举例如人、猴、小鼠等，优选为人。细胞中表达的GPR56可以是作为蛋白质的全长序列，也可以是部分序列。关于GPR56，作为蛋白质，可列举例如粘附G蛋白偶联受体G1同种型b前体(Adhesion G-protein CoupledReceptor G1isoform b Precursor)(National Center for BiotechnologyInformation、NCBI ACCESSION No.NP_001139242.1)等，作为编码蛋白质的核酸，可列举例如ADGRG1,转录变异体5,mRNA(National Center for Biotechnology Information、NCBIACCESSION No.NM_001145770.3)等。
作为表达GPR56的细胞，没有特别限制，可列举例如血细胞系的细胞等。作为表达GPR56的细胞，具体而言，可列举例如HSC或HPC等，进而可列举表达GPR56的同时还表达识别HSC和HPC的阳性标志物的细胞等。具体而言，可列举例如表达GPR56的同时还表达CD34的细胞、表达GPR56的同时还表达CD45的细胞、表达GPR56的同时还表达CD43的细胞、或表达GPR56的同时还表达CD34、以及CD43和/或CD45的细胞、表达GPR56的同时还表达CD43和CD45的细胞等。
本发明中的表达GPR56的细胞的增殖能力和/或分化能力高，可以通过公知的增殖方法或分化方法使其增殖或分化、并且与不表达GPR56的细胞进行比较来确认其能力。
作为表达GPR56的细胞的增殖方法，可以使用使人或其它动物的细胞增殖的公知的方法，该细胞为CD4+T细胞时，可列举例如使用抗CD3抗体的增殖方法等，该细胞为HSC或HPC时，可列举例如使用含有SCF和/或TPO的培养基的增殖方法等。
本发明的表达GPR56的细胞为各种祖细胞等未成熟的细胞时，也可以使该细胞进一步分化而形成成熟的细胞。
作为表达GPR56的细胞的分化诱导方法，该细胞为MHSC且要分化诱导为CD8阳性细胞时，可列举例如国际公开第2016/076415号或国际公开第2017/221975号中记载的方法等。另外，该细胞为HSC或HPC且要分化诱导为红细胞系细胞或粒细胞系细胞等比较成熟的细胞时，可列举例如使用含有用于集落形成试验等的促红细胞生成素(EPO)和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等的培养基的方法或Notta F,et al.；Science,2016,351,139中记载的方法等。
成熟的血细胞系细胞是指由未成熟的血细胞系细胞进一步进行分化而形成的细胞。作为成熟的血细胞系细胞，可列举例如：作为淋巴细胞系细胞的NK细胞、辅助性T细胞、细胞杀伤性T细胞和B细胞等；以及，作为髓系细胞的巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨核细胞和红细胞等。成熟的血细胞系细胞为NK细胞或T细胞时，该NK细胞或T细胞可以为表达嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)的细胞。
表达CAR的细胞为以表达CAR的方式进行了基因改造、对癌细胞的特异性得到提高的细胞。作为表达CAR的细胞，可列举例如表达CAR的T细胞(称为CAR-T细胞)或表达CAR的NK细胞(称为CAR-NK细胞或CAR-ILC)等。作为CAR-T细胞，优选表达CAR的细胞杀伤性T细胞。
CAR是指含有与抗原结合的胞外结构域和源自不同于上述胞外结构域的多肽的胞内结构域的融合蛋白。作为CAR，可列举例如：使针对特定抗原的抗体的抗原识别部位(例如可变区的轻链(L链)和可变区的重链(H链)等)与例如CD3等T细胞受体的胞内结构域或者与CD3等T细胞受体的胞内结构域和CD28或4-1BB等共刺激分子的胞内结构域结合而成的融合蛋白等(例如，日本特表2015-509716号公报中有记载)。
CAR的抗原识别部位可根据目标抗原来选择，由此可以制作目标抗原特异性的NK细胞或T细胞。例如以CD19为抗原时，可以克隆抗CD19抗体的抗原识别部位并将该抗原识别部位与CD3分子的胞内结构域结合，由此制作CAR(例如Claudia M,et al.；Cancer.Res.,2006,66,10995中有记载)。另外，可以适当选择所结合的共刺激分子的种类或数量等，控制活化的强度或持续时间等(例如Michael C,et al.；Mol.Ther.,2009,17,1453中有记载)。
CAR基因向细胞的导入可以在细胞组合物制造中的任意步骤中进行。具体而言，在CAR-T细胞组合物的制造中，可以在向成为iPSC的来源的体细胞中导入CAR后从导入了CAR的该体细胞经由iPSC而分化诱导为T细胞，也可以在向iPSC中导入CAR后将该iPSC分化诱导为T细胞，另外，还可以由iPSC分化诱导为T细胞后向该T细胞中导入CAR。
本发明的含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合、表达GPR56的细胞或成熟的血细胞系细胞可以通过上述方法分别获得，另外也可以通过以下方法获得。
＜＜从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤＞＞
本发明中，作为从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤的一个方式，包括从该细胞集合中选择性地提取表达GPR56的细胞的步骤。另外，作为选择性地提取表达GPR56的细胞的步骤的一个方式，包括检测表达GPR56的细胞、并将该检测出的细胞从该细胞集合分离的步骤。
从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤中，可以使用与GPR56特异性结合的物质、以及利用包括细胞分析仪、细胞分选仪等的流式细胞术或质谱流式细胞术的上述方法或上述的磁性细胞分离法等。
例如，作为与GPR56特异性结合的物质，可以使用在PE抗人GPR56抗体(BioLegend公司)等公知的抗GPR56抗体上附加了可检测的绿色荧光蛋白(GFP)等标记而形成的物质。
使用附加了标记的物质时，可以使该物质与含有表达GPR56的细胞的细胞集合接触后，通过细胞分选仪来检测标记，分离结合有该附加了标记的物质的细胞。
使用例如抗GPR56抗体等未附加标记的物质时，使该物质与含有表达GPR56的细胞的细胞集合接触后，进一步使附加了直接或间接地识别该物质的可检测的标记的其它物质与含有表达GPR56的细胞的细胞集合接触，从而能够与上述同样地分离。
具体而言，未附加标记的物质为抗体时，使FITC、PE或APC等荧光色素、169Tm或164Dm等金属同位素、或者Dynabeads(Thermo Fisher公司)或磁性细胞分选(MagneticCell Sorting，MACS)等的磁珠等与该抗体直接或间接结合，从而能够对细胞表面的GPR56进行标记和/或分离表达GPR56的细胞。
作为使荧光色素、金属同位素或磁珠等与上述未附加标记的抗体直接结合的方法，可列举例如使用结合有荧光色素、金属同位素或磁珠的针对该抗体的抗体等的方法(国际公开第2009/026168号等中有记载)等。作为使荧光色素、金属同位素或磁珠等与上述未附加标记的抗体间接结合的方法，可列举例如与氨基的共价键合(Baumgart S,et al.；Eur.J.Immunol.,2017,47,1377等中有记载)等。
＜＜将表达GPR56的细胞分化诱导为成熟的血细胞系细胞的步骤＞＞
本发明的制造方法可以还包括将表达GPR56的细胞分化诱导为成熟的血细胞系细胞的步骤。作为将表达GPR56的细胞分化诱导为成熟的血细胞系细胞的步骤，可以使用将MHSC分化诱导为各种血细胞系细胞的公知的方法。例如，作为CD4CD8双阳性T细胞的制造方法，可列举例如国际公开第2017/221975号等中记载的方法。另外，作为红细胞、巨核细胞等细胞的制造方法，可列举例如Notta F,et al.；Science,2016,351,139等中记载的方法。
作为将MHSC分化诱导为T细胞的方法，可列举与上述方法相同或类似的方法，具体而言，可列举例如Ross N,et al.；Blood,2005,105(4),1431等中记载的方法。
本发明的制造方法中，在将表达GPR56的细胞分化诱导为成熟的血细胞系细胞的步骤之前或之后，可以包括进一步培养细胞、使其增殖的步骤。例如，如果是CAR-T细胞制剂的制造，则可以在提取表达GPR56的细胞后，利用Iriguchi S,et al.；Nat.Commun.,2021,12或Fernandez L,et al.；Front.Immunol.,2019,10等记载的方法在使用Delta-like(DLL)4的培养条件下使细胞增殖约3周，之后通过上述方法分化诱导为T细胞。另外，在用上述方法预先将表达GPR56的细胞分化诱导为T细胞后，可以在CD3抗体刺激下使分化的T细胞增殖3天～28天。
＜细胞组合物＞
作为通过本发明的制造方法制造的细胞组合物，可列举例如含有利用上述方法提取的表达GPR56的细胞的细胞组合物、或含有对利用上述方法提取的表达GPR56的细胞进一步进行分化诱导而得的成熟的血细胞系细胞等的细胞组合物等。
通过本发明的制造方法制造的细胞组合物中含有的表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例没有特别限制，优选为全部细胞的50～100％，更优选为全部细胞的80～100％。
另外，本发明涉及含有表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞、并且该表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％的细胞组合物。本发明的细胞组合物中，表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％，优选为全部细胞的80％～100％。通过使表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％，可以成为增殖能力和/或分化能力高的未成熟的血细胞系细胞以高精度被浓缩的细胞组合物。
作为本发明的细胞组合物中所含的细胞或细胞集合的构成细胞，没有特别限制，可列举例如血细胞系细胞等，具体而言，可列举例如MHSC、HSC、HPC、T细胞或NK细胞等。
本发明的细胞组合物含有增殖能力和/或分化能力高的细胞，可以通过利用上述增殖方法或分化诱导方法进行增殖或分化诱导、并且与表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例低的细胞组合物进行比较来确认其能力。
本发明的细胞组合物可用作作为药物的细胞制品、药物组合物或者该细胞制品或药物组合物的制造中间体等。关于作为药物的细胞制品或药物组合物，可列举例如癌症、免疫疾病或血液疾病等的预防剂或治疗剂或血液制剂等。
作为癌症，可列举例如肾细胞癌、卡波西肉瘤、慢性白血病、前列腺癌、乳癌、肉瘤、胰腺癌、直肠癌、咽癌、黑素瘤、结肠癌、膀胱癌、淋巴瘤、肥大细胞瘤、肺癌、乳腺癌、咽喉鳞状细胞癌、睾丸癌、霍奇金淋巴瘤、消化道癌、胃癌和卵巢癌等。
作为免疫疾病，可列举例如多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、克罗恩病、哮喘、和变态反应抗体成分相关障碍(例如类风湿性关节炎)等。作为血液疾病，可列举例如再生障碍性贫血等。
作为血液疾病的预防剂或治疗剂或血液制剂，可列举例如红细胞制剂、血浆制剂、血小板制剂或全血制剂等，可以进一步含有源自人的血液，也可以不含源自人的血液。
在将本发明的细胞组合物用于作为药物的细胞制品或药物组合物时，作为剂型，只要是适合于要给药的对象的剂型则没有特别限制，可列举例如注射剂、内用剂、外用剂、固体制剂或液体制剂等。
作为给药对象，只要是动物则没有特别限制，可列举例如猴、小鼠、人等，优选为人。将本发明的细胞组合物给药于人时，频率和每1次的给药量可以根据要给药的对象的疾病、性别、体重或表面积等来适当设定，频率例如为1～10次/天，每1次的给药量例如为10000～100000000细胞数/次。
本发明的细胞组合物中，除了含有细胞以外，也可以含有例如为了将细胞制品以医学方式给药于患者或为了在细胞制造中作为制造中间体维持稳定而通常可添加的培养基成分、缓冲剂或赋形剂等。
具体而言，本发明的细胞组合物可以含有例如：含有肝素或细胞因子类的细胞培养用培养基成分；由细胞分泌的成分；核酸、蛋白质或氨基酸等构成细胞的成分；或构成胞外基质的成分等。另外，本发明的细胞组合物中，可以含有为了将细胞制品以医学方式给药于患者的成分、例如免疫抑制剂等成分。
本发明的细胞组合物的制造方法只要是制造表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例高的细胞组合物的方法则没有特别限定，例如，可以使用上述的包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤的制造方法来制造。
即，使用上述的包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞的步骤的制造方法制造的细胞组合物也包括在本发明的细胞组合物中。
＜试剂盒＞
作为本发明的一个方式，可列举用于本发明的制造方法的试剂盒。本发明的试剂盒只要含有能够提取表达GPR56的细胞的化合物则没有特别限制，可列举例如含有抗GPR56抗体的试剂盒。特别优选列举除了含有抗GPR56抗体以外还含有抗CD34抗体、抗CD43抗体和/或抗CD45抗体的试剂盒。
本发明的试剂盒例如可以通过使用流式细胞术、微珠(例如微球)等载体或亲和层析等从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达GPR56的细胞。
通过流式细胞术提取表达GPR56的细胞时，本发明的试剂盒例如优选含有经荧光标记的抗GPR56抗体。
使用微珠等载体提取表达GPR56的细胞时，本发明的试剂盒例如优选含有结合有能够提取表达GPR56的细胞的化合物的载体，特别优选含有结合有抗GPR56抗体的载体。抗体与载体的结合可以为共价键、氢键等，没有特别限定。抗GPR56抗体不需要与载体直接结合，也可以间接结合。
载体可以为微珠、例如磁珠，但是不限于此。也可以使用琼脂糖等其它单体来代替微珠，微珠可以为磁性琼脂糖微珠。市售有各种微珠(例如微球)，可用于本发明中。
使用亲和层析提取表达GPR56的细胞时，本发明的试剂盒例如优选包含填充了结合有能够提取表达GPR56的细胞的化合物的载体的柱，特别优选包含填充了结合有抗GPR56抗体的载体的柱。进而，可以包含例如用于洗脱柱上所结合的细胞的缓冲液。
实施例
以下示出实施例来具体说明本发明，但是本发明不受这些实施例限定。
[实施例1]使用源自T细胞的iPS细胞株的研究
＜无饲养层iPS细胞的培养＞
作为源自T细胞的iPS细胞株(以下也称为T-iPSCs)，使用TkT3V1-7株(由东京大学提供、Nishimura et al.,Cell Stem Cell.12:774-786,2013中有记载)。使用StemFitAK02N培养基(Ajinomoto)培养T-iPS细胞后，加入剥离剂，将T-iPSCs剥离。
作为剥离剂，使用如下溶液：向用PBS(Nacalai Tesque)将1×TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)稀释至1/2的溶液中添加0.5M-EDTA溶液(pH8)(NacalaiTesque)而调整成终浓度0.5×TrypLE Select、0.75mM EDTA的溶液。
向包被有iMatrix-511silk(Laminin-511E8)(Nippi)的培养器中，加入在StemFitAK02N中添加有10μM Y-27632(Nacalai Tesque)的培养基，接种所剥离的细胞，继续进行培养(37℃、5％ CO2)。次日，将培养基交换成未添加Y-27632的StemFit AK02N培养基。每周重复一次该操作，在无饲养层条件下对iPSCs进行维持培养。
＜拟胚体形成法＞
以下记载由iPSC形成含有造血干细胞的拟胚体(EB)的方法、即“拟胚体形成法(以下称为EB法)”。
将获得的无饲养层T-iPS细胞用0.5×TrypLE Select和0.75mM EDTA剥离后，以3×105个细胞/孔接种在超低粘附表面6孔板(CORNING)中。之后使用添加了10μM Y-27632、10μM CHIR99021(Tocris Bioscience)的StemFit AK02N培养基，在低氧条件(5％ O2)下开始进行培养。将培养开始日设为第0天。
次日(第1天)，加入向添加有1×胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(Insurin,Transferrin,Selenium Solution)(Thermo Fisher Scientific)、1×Glutamax(ThermoFisher Scientific)、0.2×PSG(Sigma)、0.4mM单硫代甘油(Wako)和50μg/ml L(+)-抗坏血酸(PAA)(Sigma)的StemPro34(Thermo Fisher Scientific)培养基(以下称为EB培养基)中添加50ng/ml BMP-4(Miltenyi Biotec)、50ng/ml VEGF-165A(Wako)、50ng/ml bFGF(Wako)而成的培养基，在低氧条件(5％ O2)下进行培养。
再次日(第2天)向培养基中添加6μM SB431542(Wako)，在低氧条件(5％ O2)下进行培养。再两天后(第4天)交换为添加有50ng/ml VEGF-165A、50ng/ml bFGF、50ng/ml SCF(Wako)的EB培养基，在低氧条件(5％ O2)下进行培养。
再2天后(第6天)，交换成添加有50ng/ml VEGF-165A、50ng/ml bFGF、50ng/mlSCF、30ng/ml TPO(Wako)、10ng/ml Flt3-L(Wako)的EB培养基。
此后每隔2～3天进行培养基交换，在常规条件(5％CO2)下将细胞培养至第11天或第12天，由此制作含有造血干细胞的EB。
＜EB中的细胞表面标志物的表达分析＞
通过以下步骤来分析通过将源自T细胞的iPS细胞株(TkT3V1-7)分化诱导为造血干细胞而得到的EB的细胞表面标志物。
对获得的EB中的细胞(第11天或第12天)进行吹打后，使其通过细胞滤网。用含有2％ FBS(Gibco)的PBS(以下也称为FACS缓冲液)清洗后，用CD235a-FITC(BD Bioscience)、CD14-APC-eFluor780(eBioscienc e)、APC-CD43(BD Bioscience)、CD45-BV510(BioLegend)、CD34-PE-Cy7(Abcam)和GPR56-PE(BioLegend)进行共染色。
清洗后，用含有碘化丙啶(PI)(Sigma)的FACS缓冲液重新悬浮，使用BD AriaII细胞分选仪(BD Bioscience)和FlowJo v9(BD Bioscience)分析细胞表面标志物。将分析结果示于图1。
如图1所示，PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)细胞的一部分表达CD34，进一步确认了其一部分表达GPR56。以下，将表达GPR56的源自EB的细胞称为GPR56阳性细胞。
＜GPR56阳性细胞向髓系细胞的分化能力的评价＞
为了评价GPR56阳性细胞向髓系细胞的分化能力，以GPR56和CD34的表达为指标对EB中的细胞(以下也称为EB细胞)进行分选，作为向髓系细胞的分化能力的评价而实施集落形成试验。
从由源自T细胞的iPS细胞株(TkT3V1-7)得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合中，使用BD AriaII细胞分选仪分别对CD34(-)GPR56(-)双阴性(以下也称为DN)的细胞集合、CD34(+)GPR56(-)单阳性(以下也称为SP)的细胞集合、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(以下也称为DP)的细胞集合进行设门。
集落形成试验中，使用MethoCult(注册商标)H4034 Optimum(Stem CellTechnologies)。将得到的DN、SP和DP各个细胞集合与Methocult混合，以1ml/培养皿接种于3.5cm培养皿。各培养皿中的细胞数分别为DP：大约300个细胞/培养皿、SP：大约1000个细胞/培养皿、DN：大约3000个细胞/培养皿。将接种后的培养皿在37℃、5％ CO2的条件下静置。
16天后，在显微镜下测量所形成的集落数。将集落直径大于1mm且细胞数为约10000以上的集落称为大集落，将除此以外的、小且细胞数少的集落称为小集落。
大集落是由粒细胞和巨噬细胞构成的集落(CFU-GM)或由粒细胞、红细胞和巨噬细胞构成的集落(CFU-GEM)等主要包含两种以上细胞系统的集落。小集落是主要由粒细胞构成的集落(CFU-G)或由巨噬细胞构成的集落(CFU-M)等包含单一细胞系统的集落。将结果示于图2。
如图2所示，与SP细胞级分相比，在DP细胞级分中确认到大集落显著多，DP的情况下每100个细胞为4.6个、SP的情况下每100个细胞为1.7个。另外，与SP细胞级分相比，在DP细胞级分中，确认到小集落多，DP的情况下每100个细胞为5.5个，SP的情况下每100个细胞为3.9个。作为显著性检验，使用t检验(*：p＜0.05)。由该结果可知，在向髓系细胞的分化过程中显示更高的增殖能力和/或分化能力的血细胞系细胞被浓缩到了GPR56阳性级分中。
＜GPR56阳性细胞向淋巴细胞系细胞的分化能力的评价＞
为了评价GPR56阳性细胞向淋巴细胞系细胞的分化能力，以GPR56和CD34的表达为指标对EB细胞进行设门，进行向T细胞的分化诱导。
与上述的向髓系细胞的分化能力的评价同样地，从由源自T细胞的iPS细胞株(TkT3V1-7)得到的EB细胞中的PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合(以下也称为Whole)中，使用BD AriaII细胞分选仪对CD34(-)GPR56(-)双阴性的细胞集合(DN)、CD34(+)GPR56(-)单阳性的细胞集合(SP)、和CD34(+)GPR56(+)双阳性(DP)的细胞集合分别进行设门。
对于进行了设门的各细胞集合，分别如以下那样诱导向T细胞的分化。将各细胞集合以4000个细胞/孔的方式接种于预先包被有DLL4(5μg/ml、R&D systems)和Retronectin(5μg/ml、宝生物)的48孔板。
使用添加有50ng/ml SCF(Wako)、50ng/ml IL-7(Wako)、50ng/ml Flt3L(Wako)、100ng/ml TPO、30nM SDF-1α(Wako)、15μMSB203580(Tocris Bioscience)、55μM 2-巯基乙醇(Wako)、50μg/ml PAA、15％ FBS和1％ PSG的alpha-MEM培养基(Life Technologies)进行培养。将培养开始日设为第0天。每周制作新的包被有DLL4和Retronectin的板并重新接种细胞。每隔2～3天进行培养基交换并培养至第21天。
在第21天使用台盼蓝(Nacalai Tesque)对活细胞数进行计数。统计分析中，使用学生t检验(*：p＜0.05、**：p＜0.01)。将结果示于图3。
如图3所示，与DN和SP相比，DP的情况下细胞数显著增加。
将经分化诱导处理的细胞(第21天)用CD3-BV510(BioLegend)、CD5-PE-Cy7(Invitrogen)、CD4-BV421(BioLegend)和APC-CD8(BioLegend)进行共染色。清洗后用含有碘化丙啶(PI)的FACS缓冲液重新悬浮。使用BD LSRFortessa流式细胞仪(BD Bioscience)和FlowJo v9来分析细胞表面标志物。将PI(-)CD3(+)CD5(+)的细胞集合中的CD4(+)CD8(+)细胞的比例的分析结果示于图4。
如图4所示，在DP、SP、和PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合(称为Whole)中观察到同样的倾向。具体而言，在DP、SP和Whole中的任意一种细胞级分中，CD3(+)CD5(+)细胞均占80％左右，另外，在CD3(+)CD5(+)细胞级分中，CD4(+)CD8(+)细胞占80％左右。
由这些结果可知，在向T细胞的分化过程中显示更高的增殖能力和/或分化能力的血细胞系细胞被浓缩到了GPR56阳性级分中。另外可知，在使用源自T细胞的iPS细胞株的髓系细胞的制造和T细胞的制造中，通过提取GPR56阳性细胞，能够稳定且大量地制造目标细胞。
[实施例2]使用源自T细胞以外的血细胞系细胞的iPS细胞株的研究
使用3株由T细胞以外的血细胞系细胞建立的iPS细胞株(以下称为Non-T-iPSC)，进行与实施例1相同的研究。作为Non-T-iPSC，使用源自外周血的iPS细胞株(Ff-I01s04、由京都大学iPS细胞研究所提供)和源自脐带血的iPS细胞株(Ff-WJs513和Ff-WJs524、均由京都大学iPS细胞研究所提供)。
＜EB细胞的表面标志物的表达分析＞
通过与实施例1相同的方法，对由Non-T-iPSC诱导的EB细胞进行共染色，通过与实施例1相同的方法来分析细胞表面标志物。将分析结果示于图5。
如图5所示，3株Non-T-iPSC中的任一株中，与T-iPSCs同样地，均确认到PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)细胞的一部分表达CD34，进而其一部分表达GPR56。
由该结果可知，不论iPS细胞株的来源如何，通过将iPS细胞分化诱导为造血干细胞而得到的EB细胞中均存在表达GPR56的细胞。
＜GPR56阳性细胞向髓系细胞的分化能力的评价＞
使用由3株Non-T-iPSC得到的EB细胞，通过与实施例1相同的方法评价向髓系细胞的分化能力。将结果示于图6。
如图6所示，3株均是DP细胞级分与SP细胞级分相比形成了更多的大集落，Ff-I01s04的DP细胞级分中确认到SP细胞级分的9.25倍的大集落数，Ff-WJs513中确认到SP细胞级分的7.68倍的大集落数，Ff-WJs524中确认到SP细胞级分的3.62倍的大集落数。另外，3株均是DP细胞级分与SP细胞级分相比形成了显著多的小集落，Ff-I01s04的DP细胞级分中确认到SP细胞级分的2.775倍的小集落数，Ff-WJs513中确认到SP细胞级分的1.69倍的小集落数，Ff-WJs524中确认到SP细胞级分的2.18倍的小集落数。
由该结果可知，对于源自Non-T-iPSC的EB细胞，在向髓系细胞的分化过程中显示更高的增殖能力和/或分化能力的血细胞系细胞也被浓缩到GPR56阳性级分中。
＜GPR56阳性细胞向淋巴细胞系细胞的分化能力的评价＞
对由Non-T-iPSC(Ff-I01s04)得到的EB细胞集合中的GPR56阳性细胞向NK细胞的分化能力进行评价。通过与实施例1相同的方法，从由Non-T-iPSC得到的EB细胞集合中对DN、SP和DP各自的细胞集合进行设门。
向NK细胞的分化诱导使用了与实施例1记载的向T细胞的分化诱导同样的方法。在第21天，使用台盼蓝对活细胞数进行计数。将关于2次独立实验的分析结果示于图7。
如图7所示，任一分析结果均表明，与DN细胞集合和SP细胞集合相比，DP细胞集合的细胞数进一步增加。
将经分化诱导处理的细胞(第21天)用CD3-BV510(Biolegend)、CD7-FITC(BioLegend)、CD56-APC-Cy7(BioLegend)、以及APC-CD8(BioLegend)进行共染色。
清洗后，用含有PI的FACS缓冲液重新悬浮，使用BD LSRFortessa流式细胞仪和FlowJo9来分析细胞表面标志物。将PI(-)CD3(-)CD7(+)细胞集合中的CD56(+)CD161(+)细胞的比例的分析结果示于图8。
如图8所示，从DP、SP和PI(-)CD14(-)CD235a(-)CD43(+)CD45(low+)的细胞集合(称为Whole)的任一细胞级分中，均从一部分细胞集合中检测到NK细胞，任一细胞级分中CD3(-)CD7(+)细胞均占80％左右。
进而，在CD3(-)CD7(+)细胞级分的一部分细胞集合中观察到CD56(+)CD161(+)细胞，其比例在DP中为20.2％、在SP中为6.18％、在Whole中为16％。DP细胞集合为SP细胞集合的3倍左右，NK细胞的存在率高。
由这些结果可知，在向NK细胞的分化过程中显示更高的增殖能力和/或分化能力的血细胞系细胞被浓缩到了GPR56阳性级分中。由以上可知，在使用Non-T-iPSC株的髓系细胞的制造和NK细胞的制造中，通过提取GPR56阳性细胞，能够稳定且大量地制造目标细胞。
参照特定方式详细地说明了本发明，但在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行各种变更和修正，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。需要说明的是，本申请基于2021年6月4日申请的日本专利申请(日本特愿2021-094716)，通过引用而援引其整体。另外，在此引用的所有参照均以整体形式并入。

Claims (27)

1.一种细胞组合物的制造方法，其包括从含有未成熟的血细胞系细胞的细胞集合中提取表达G蛋白偶联受体56(以下记为GPR56)的细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述表达GPR56的细胞为人细胞。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述表达GPR56的细胞为表达GPR56的同时还表达CD34的细胞。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述表达GPR56的细胞表达GPR56的同时还表达CD43和CD45中的至少一者。
5.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述细胞集合为源自多能干细胞的细胞集合。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，所述细胞集合为将所述多能干细胞分化诱导为中胚层后用含有干细胞因子(SCF)、血小板生成素重组蛋白(TPO)和Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)的培养基进行了培养的细胞集合。
7.根据权利要求5所述的制造方法，其中，所述源自多能干细胞的细胞集合为将所述多能干细胞分化诱导为造血干细胞或造血祖细胞而得的细胞集合。
8.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述细胞集合为含有造血干细胞和造血祖细胞中的至少一种的细胞集合。
9.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述细胞集合为含有表达选自CD34、CD43和CD45中的至少一种的细胞的细胞集合。
10.根据权利要求1所述的制造方法，其中，还包括将所述表达GPR56的细胞分化诱导为成熟的血细胞系细胞的步骤。
11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述成熟的血细胞系细胞为淋巴细胞系细胞。
12.根据权利要求11所述的制造方法，其中，所述淋巴细胞系细胞为T细胞或自然杀伤细胞。
13.根据权利要求11所述的制造方法，其中，所述淋巴细胞系细胞为表达嵌合抗原受体的细胞。
14.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述成熟的血细胞系细胞为髓系细胞。
15.根据权利要求10所述的制造方法，其中，还包括培养分化诱导为所述成熟的血细胞系细胞之前或之后的细胞并使其增殖的步骤。
16.一种细胞组合物，其含有表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞的比例为全部细胞的50～100％。
17.根据权利要求16所述的细胞组合物，其中，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为人细胞。
18.根据权利要求16所述的细胞组合物，其中，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
19.根据权利要求16所述的细胞组合物，其中，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为表达GPR56的同时还表达CD34的细胞。
20.根据权利要求16所述的细胞组合物，其中，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为表达GPR56的同时还表达CD43和CD45中的至少一者的细胞。
21.根据权利要求16所述的细胞组合物，其中，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为源自多能干细胞的细胞。
22.根据权利要求21所述的细胞组合物，其中，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为将所述多能干细胞分化诱导为中胚层后用含有SCF、TPO和Flt3-L的培养基进行了培养的细胞。
23.根据权利要求21所述的细胞组合物，其中，所述表达GPR56的未成熟的血细胞系细胞为将所述多能干细胞分化诱导为造血干细胞或造血祖细胞后的细胞。
24.一种药物组合物，其含有通过权利要求1至15中任一项所述的制造方法制造的细胞组合物。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为选自癌症、免疫疾病和血液疾病中的至少一种的治疗剂或血液制剂。
26.一种药物组合物，其含有权利要求16至23中任一项所述的细胞组合物。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为选自癌症、免疫疾病和血液疾病中的至少一种的治疗剂或血液制剂。
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