KR101532442B1 - 효율적인 핵 초기화 방법 - Google Patents

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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 인공 다능성 줄기 세포의 효율적인 제조 방법으로서, miRNA의 존재하에서 핵 초기화 인자에 의해 핵 초기화하는 공정을 포함하고, 상기 miRNA가 (a) 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되고, 또한 (b) 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA인 방법을 제공한다.
배아 줄기 세포, miRNA, 인공 다능성 줄기 세포, 핵 초기화

Description

효율적인 핵 초기화 방법{EFFICIENT METHOD FOR NUCLEAR REPROGRAMMING}
본 발명은 분화된 체세포를 초기화하여 효율적으로 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
배아 줄기 세포(ES 세포)는 인간이나 마우스의 초기 배아(embryo)로부터 수립된 줄기 세포로서, 생체에 존재하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다능성을 유지한 채 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다는 특징을 갖고 있다. 이 성질을 이용하여 인간 ES 세포는 파킨슨병, 청년성 당뇨병, 백혈병 등 많은 질환에 대한 세포 이식 요법의 자원으로서 기대되고 있다. 그러나, ES 세포의 이식은 장기 이식과 마찬가지로 거부 반응을 야기한다는 문제가 있다. 또한, 인간 배아를 파괴하여 수립되는 ES 세포의 이용에 대해서는 윤리적 측면에서 반대 의견도 많다.
환자 자신의 분화체 세포를 이용하여 탈분화를 유도하고, ES 세포에 가까운 다능성이나 증식능을 갖는 세포(이 세포를 본 명세서에 있어서 "인공 다능성 줄기 세포" 또는 "iPS 세포"라 하지만, 이 세포는 "유도 다능성 줄기 세포", "배아 줄기 세포 유사 세포" 또는 "ES 유사 세포"라 불리는 경우도 있음)를 수립할 수 있으면, 거부 반응이나 윤리적 문제가 없는 이상적인 다능성 세포로 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 최근 들어, 이 iPS 세포를 마우스 및 인간의 분화 세포로부터 제조할 수 있다고 보고되어 매우 큰 반향을 부르고 있다(국제공개 WO2007/69666; Cell, 126, pp.1-14, 2006; Cell, 131, pp.1-12, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007; Nature, 451, pp.141-146, 2008).
이들 방법에서는 복수의 특정 인자(Cell, 126, pp.1-14, 2006에서는 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 4개 인자가 이용되고 있음)를 체세포에 도입하여 초기화를 행하는 공정을 포함하고 있고, 인자의 도입에는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 등의 바이러스 벡터가 이용되고 있다. 그러나, 종래에 보고된 유전자 도입에 의한 핵 초기화 방법은 모두 효율이 낮아, 인공 다능성 줄기 세포가 약간밖에 얻어지지 않는다는 문제를 갖고 있다. 특히, 인공 다능성 줄기 세포로부터 분화된 조직이나 개체에 있어서 종양화가 우려되는 c-Myc를 제외한 3개 인자(Oct3/4, Sox2, 및 Klf4)를 체세포에 도입하여 초기화를 행한 경우에는 인공 다능성 줄기 세포의 취득 효율이 매우 낮다는 문제가 있다.
한편, 세포에는 다양한 스몰 RNA(small RNA)가 발현되어 있다고 알려져 있다. 스몰 RNA로서는, 예를 들면 2본쇄 RNA 특이적 RNase인 다이서(Dicer)에 의해 절취되는 18 내지 25 염기 정도의 RNA 분자 등을 들 수 있지만, 이 스몰 RNA는 주로 siRNA(small interfering RNA)와 miRNA(마이크로 RNA, 이하, 본 명세서에 있어서"miRNA"라 약칭함)로 분류된다. 스몰 RNA는 RNA 간섭(RNAi)/miRNA 분자 메커니즘을 통해 번역의 억제, mRNA의 분해, 또는 염색질의 구조 변화 등의 과정에서 표적을 발견하기 위한 가이드 분자로서 기능한다고 알려져 있다. 또한, 스몰 RNA가 발생 과정의 제어에도 중요한 기능을 갖고 있다는 것도 알려져 있다(예를 들면, 총 설로서 실험 의학, 24, pp.814-819, 2006; 마이크로 RNA 실험 프로토콜, pp20-35, 2008, 요도샤 등을 참조할 것).
배아 줄기 세포(ES 세포)와 miRNA의 관계에 대해서는, 마우스 ES 세포에 있어서 여러 종류의 miRNA를 포함하는 마이크로 RNA 클러스터가 ES 세포 특이적으로 발현된 것이 보고되어 있고(Developmental cell, 5, pp.351-358, 2003), miRNA-295가 암 억제 유전자 Rb 패밀리 중 하나인 Rbl2의 발현을 억제하고, 또한 메틸화 효소의 발현을 상승시킴으로써 DNA의 메틸화에 관련되어 있다는 보고도 있다(Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp.259-267, 2008; Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp.268-279, 2008). 그러나, 스몰 RNA가 체세포의 핵 초기화에 있어서 어떠한 기능을 갖는지는 종래에 전혀 알려져 있지 않았다.
특허 문헌 1: 국제공개 WO2007/69666
비특허 문헌 1: [Cell, 126, pp.1-14, 2006]
비특허 문헌 2: [Cell, 131, pp.1-12, 2007]
비특허 문헌 3: [Science, 318, pp.1917-1920, 2007]
비특허 문헌 4: [Nature, 451, pp.141-146, 2008]
비특허 문헌 5: [Developmental cell, 5, pp.351-358, 2003]
비특허 문헌 6: [Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp.259-267, 2008]
비특허 문헌 7: [Nature Structural & Molecular Biology, 15, pp.268-279, 2008]
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
본 발명의 과제는 체세포를 초기화하여 인공 다능성 줄기 세포를 제조함에 있어서, 효율적으로 인공 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 수단을 제공하는 데에 있다. 특히, 종양화가 우려되는 c-Myc를 이용하지 않고 효율적인 인공 다능성 줄기 세포의 제조를 가능하게 하는 수단을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 특정 miRNA의 존재하에서 핵 초기화를 유도하는 유전자를 체세포에 도입하면 효율적으로 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 상기 발견을 기초로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의해, miRNA의 존재하에서 핵 초기화 인자에 의해 핵 초기화하는 공정을 포함하고, 상기 miRNA가 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA인, 인공 다능성 줄기 세포의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 miRNA가 (a) 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되고, 또한 (b) 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA인 상기 방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 핵 초기화 인자가 국제공개 WO 2005/80598에 기재된 핵 초기화 인자의 스크리닝 방법에 의해 양성을 나타내는 단일 물질 또는 복수 물질의 조합인 상기 방법; 핵 초기화 인자가 국제공개 WO 2005/80598에 기재된 핵 초기화 인자의 스크리닝 방법에 의해 양성을 나타내는 단일 유전자의 유전자 산물 또는 복수 유전자의 유전자 산물의 조합인 상기 방법; 핵 초기화 인자에 의한 핵 초기화를 체세포로의 상기 유전자의 도입에 의해 행하는 상기 방법; 체세포로의 상기 유전자의 도입을 재조합 벡터에 의해 행하는 상기 방법; 핵 초기화 인자에 의한 핵 초기화를 체세포로의 상기 유전자의 유전자 산물의 도입에 의해 행하는 상기 방법이 제공된다.
상기 발명의 더욱 바람직한 양태에 따르면, 초기화 인자를 코딩하는 유전자가 Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, 및 Nanog 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자, 바람직하게는 Myc 패밀리를 제외한 유전자로부터 선택되는 2종의 유전자의 조합, 더욱 바람직하게는 3종의 유전자의 조합, 특히 바람직하게는 4종 또는 4종 이상의 유전자가 조합인 상기 방법이 제공된다.
보다 바람직한 조합은 (a) Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자로 이루어지는 2종의 유전자의 조합; (b) Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자로 이루어지는 3종의 유전자의 조합; (c) Oct 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, 및 Nanog 유전자로 이루어지는 4종의 유전자의 조합 등이다. 또한, TERT 유전자 및/또는 SV40 라지(Large) T 항원 유전자를 조합하는 것도 바람직하다. 경우에 따라, Klf 패밀리 유전자를 제외하는 것이 바람직한 경우도 있다. 경우에 따라서는 이들의 조합에 Myc 패밀리 유전자를 포함할 수도 있지만, 본 발명에 있어서는 Myc 패밀리 유전자를 포함하지 않는 조합을 바람직하게 사용할 수 있다.
이들 중에서 특히 바람직한 조합은 Oct3/4 및 Sox2로 이루어지는 2종의 유전자의 조합; Oct3/4, Klf4, 및 Sox2로 이루어지는 3종의 유전자의 조합; 및 Oct3/4, Sox2, Lin28, 및 Nanog로 이루어지는 4종의 유전자가 조합이며, 이들에 TERT 유전자 및/또는 SV40 라지 T 항원 유전자를 조합하는 것도 바람직하다. 경우에 따라 Klf4를 제외하는 것이 바람직한 경우도 있다. 경우에 따라서는 이들의 조합에 c-Myc를 조합할 수도 있지만, 본 발명에 있어서는 c-Myc를 포함하지 않는 조합을 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 다른 바람직한 양태에 따르면, 체세포가 인간을 포함하는 포유류 동물의 체세포, 바람직하게는 인간 또는 마우스의 체세포, 특히 바람직하게는 인간의 체세포인 상기 방법; 체세포가 인간 태아 세포 또는 성인 인간 유래의 체세포인 상기 방법; 체세포가 환자로부터 채취한 체세포인 상기 방법이 제공된다.
또 다른 바람직한 양태에 따르면, miRNA가 표 1 또는 표 2에 기재된 miRBase 데이터 베이스의 등록명 또는 접속(accession) 번호로 특정되는 RNA 서열에 포함되는 1 또는 2 이상의 miRNA인 상기 방법; 표 1 또는 표 2에 기재된 miRBase 데이터 베이스의 등록명(및 접속 번호)으로 특정되는 RNA 서열이 hsa-miR-372 (MI0000780), hsa-miR-373(MI0000781), hsa-miR-302b(MI0000772), hsa-miR-302c(MI0000773), hsa-miR-302a(MI0000738), hsa-miR-302d(MI0000774), hsa-miR-367(MI0000775), hsa-miR-520c(MI0003158), mmu-miR-291a(MI0000389), mmu-miR-294(MI0000392), 및 mmu-miR-295(MI0000393)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 RNA인 상기 방법; miRNA가 hsa-miR-302b-367로 특정되는 RNA에 포함되는 miRNA인 상기 방법; miRNA가 서열 목록의 서열 번호 1 내지 12로 표시되는 RNA 서열로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 RNA 서열에 포함되는 1 또는 2 이상의 miRNA인 상기 방법이 제공된다.
다른 측면에서는 상기 방법에 의해 얻어질 수 있는 인공 다능성 줄기 세포가 본 발명에 의해 제공된다. 또한, 상기 인공 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 체세포도 본 발명에 의해 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 줄기 세포 요법으로서, 환자로부터 분리 채취한 체세포를 이용하여 상기 방법에 의해 얻어진 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 얻어지는 체세포를 상기 환자에게 이식하는 공정을 포함하는 요법이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 상기 방법에 의해 얻어진 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 얻어지는 각종 세포를 이용하여 화합물, 약제, 독극물 등의 생리 작용이나 독성을 평가하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되는 miRNA이며, 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA를 이용하는 인공 다능성 줄기 세포의 제조 방법; 및 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되는 miRNA이며, 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA를 이용하는 체세포의 핵 초기화 방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되는 miRNA이며, 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA의 인공 다능성 줄기 세포의 제조를 위한 사용; 및 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되는 miRNA이며, 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA의 체세포의 핵 초기화를 위한 사용이 제공된다.
도 1은 각각 1종의 miRNA의 존재하에서 Oct3/4, Klf4, 및 Sox2로 이루어지는 3개 유전자의 조합(이 조합을 "3f"라 표기하고, "c-Myc(-)"는 핵 초기화 효율이 우수한 Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 c-Myc로 이루어지는 4개 유전자의 조합으로부터 c-Myc를 제외한 것을 의미함)에 의해 마우스의 태아 섬유 아세포의 핵 초기화를 유도하고, 인공 다능성 줄기 세포의 생성 효율을 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 3f+DsRed는 대조군으로서 상기 3개 유전자의 조합에 DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein)를 가한 조합을 나타낸다. 표는 3f+DsRed로 다능성 줄기 세포 유도를 행한 경우의 콜로니 수를 100으로 했을 때의 값이다.
도 2는 인공 다능성 줄기 세포의 생성 효율을 나타낸 도면이다. 상단은 Oct3/4, Klf4, 및 Sox2로 이루어지는 3개 유전자의 조합(4개 유전자의 조합으로부터 c-Myc를 제외한 3개 유전자의 조합에 DsRed를 추가한 조합(대조군)의 결과를 나 타내고, 하단은 mmu-miR-295의 존재하에서 Oct3/4, Klf4, 및 Sox2로 이루어지는 3개 유전자의 조합에 의해 마우스 꼬리 섬유 아세포 TTF(tail tip fibroblasts)의 핵 초기화를 유도한 결과를 나타낸다. 도면 중의 숫자는 Nanog GFP 양성 콜로니 수/전체 콜로니 수를 나타낸다.
도 3은 인간 성인 피부 세포를 다양한 miRNA의 존재하에서 Oct3/4, Klf4, 및 Sox2로 이루어지는 3개 유전자의 조합(Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 c-Myc로 이루어지는 4 유전자의 조합으로부터 c-Myc를 제외한 3개 유전자의 조합: Myc(-)3f), 및 Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 c-Myc로 이루어지는 4개 유전자의 조합(Y4f)에 의해 핵 초기화를 유도하고, 인공 다능성 줄기 세포의 생성 효율을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명의 방법은 인공 다능성 줄기 세포의 제조 방법으로서, miRNA의 존재하에서 핵 초기화 인자에 의해 핵 초기화하는 공정을 포함하고, 상기 miRNA가 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 양태에서는 상기 miRNA가 (a) 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되고, 또한 (b) 상기 miRNA의 존재하에 있어서 상기 miRNA의 부재하의 경우보다 높은 핵 초기화 효율을 제공하는 성질을 갖는 miRNA인 것을 특징으로 한다.
miRNA에 대해서는, 예를 들면 문헌 [실험 의학, 24, pp.814-819, 2006; 마이크로 RNA 실험 프로토콜, pp 20-35, 2008, 요도샤] 등에 분류, 생체 내에서의 기능 등이 설명되어 있다. miRNA의 염기수는, 예를 들면 18 내지 25, 바람직하게는 19 내지 23 정도이다. 현 시점에 약 1,000개 정도의 miRNA 정보를 저장한 데이터 베이스를 이용할 수 있고(예를 들면 miRBase, http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml), 당업자는 이 데이터 베이스로부터 임의의 miRNA 정보를 인출할 수 있고, 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되는 miRNA를 용이하게 추출하는 것이 가능하다. 또한, miRNA 마이크로 어레이나 실시간 PCR 등 당업자에게 이용 가능한 수법을 이용하여 배아 줄기 세포와 체세포 사이에서 miRNA의 발현의 차이를 확인함으로써, 배아 줄기 세포에서 체세포보다 고도로 발현되는 miRNA를 용이하게 특정하는 것이 가능하다.
또한, miRNA의 존재하 및 부재하에서의 핵 초기화 효율의 변화에 대해서는, 본 명세서의 실시예에 구체적으로 나타난 바와 같이, ES 세포로 특이적으로 발현된 Nanog 유전자의 프로모터 영역의 하류에 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)와 퓨로마이신의 내성 유전자를 코딩하는 서열을 연결한 형질전환 마우스를 제조하고, 이 마우스 유래의 섬유 아세포에, 예를 들면 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3종의 유전자와 각종 miRNA를 도입하여 핵 초기화를 유도하고, 인공 다능성 줄기 세포의 생성 효율을 확인하면 좋다. 생성 효율은, 예를 들면 콜로니 수를 계측함으로써 행할 수 있지만, 보다 구체적으로는, 상기 유전자 및 miRNA 도입 후 21일째부터 약제 선택을 개시하고, 28일째에 전체의 콜로니 수와 Nanog GFP 양성 콜로니 수(Nanog 유전자좌에 의해 발현이 유도되는 GFP를 형광현미경으로 확인할 수 있음)를 관찰하여 콜로니 수를 비교할 수 있다. 물론, 핵 초기화 효율의 확인은 상 기 방법으로 한정되는 것은 아니며, 상기 방법에는 적절한 변형이나 변경이 가능하고, 당업자가 적절한 방법을 채용할 수 있음은 물론이다.
miRNA로서는, 초기화해야 할 체세포와 동일한 동물종 유래의 miRNA를 이용하는 것이 바람직하다. miRNA로서는 야생형의 miRNA 외에도 수개(예를 들면 1 내지 6개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 1 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 염기가 치환, 삽입, 및/또는 결실된 miRNA로서, 생체 내에서 야생형 miRNA와 동일한 기능을 발휘 가능한 miRNA를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에서 바람직하게 이용되는 miRNA로서, 예를 들면 miRBase에 등록된 하기의 RNA 서열: hsa-miR-372(MI0000780), hsa-miR-373(MI0000781), hsa-miR-302b(MI0000772), hsa-miR-302c(MI0000773), hsa-miR-302a(MI0000738), hsa-miR-302d(MI0000774), hsa-miR-367(MI0000775), hsa-miR-520c(MI0003158), mmu-miR-291a(MI0000389), mmu-miR-294(MI0000392), 및 mmu-miR-295(MI0000393)(괄호 안은 각각 miRBase의 접속 번호를 나타내고, hsa-miR-는 인간 miRNA, mmu-miR-는 마우스 miRNA를 나타냄)에 포함되는 1 또는 2 이상의 miRNA를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서는, 이와 같이 하여 핵 초기화 효율을 높이는 것이 확인된 miRNA를 단독으로 사용할 수도 있지만, 2종 이상 조합하여 사용할 수도 있다. 또한, 클러스터를 형성하고 있는 복수의 miRNA를 이용할 수도 있고, 예를 들면 miRNA 클러스터를 포함하는 RNA 서열로서 입수 가능한 hsa-miR-302b-367 등을 이용할 수도 있다. 이들 miRNA를 이용하기 위한 RNA 서열의 예를 서열 목록의 서열 번호 1 내지 12에 나타내었다. 서열 번호 1: mmu-mir-294 (MI0000392); 서열 번호 2: mmu-mir-295(MI0000393); 서열 번호 3: hsa-mir-372(MI0000780); 서열 번호 4: hsa-mir-373(MI0000781); 서열 번호 5: hsa-mir-302b(MI0000772); 서열 번호 6: hsa-mir-302c(MI0000773); 서열 번호 7: hsa-mir-302a(MI0000738); 서열 번호 8: hsa-mir-302d(MI0000774); 서열 번호 9: hsa-mir-367(MI0000775); 서열 번호 10: hsa-mir-520c(MI0003158); 및 서열 번호 11: mmu-mir-291a MI0000389. 또한, 서열 번호 12로 표시되는 RNA도 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 RNA 서열 중에는 1개의 서열 중에 복수의 miRNA를 포함하는 RNA 서열이 포함되어 있고, 이러한 RNA 서열을 이용함으로써 효율적인 iPS 세포의 제조가 가능해진다. 또한, 1개의 서열 중에 복수의 miRNA를 포함하는 RNA 서열과 그 밖의 1 또는 2 이상의 miRNA를 포함하는 1 또는 2 이상의 RNA 서열을 조합하여 사용하는 것도 가능하다.
miRNA는 단백질로 번역되지 않는 비코딩 RNA이다. miRNA는 대응하는 유전자로부터 pri-miRNA가 우선 전사되고, 다음으로 이 pri-miRNA로부터 특징적인 헤어핀 구조를 갖는 약 70 염기의 pre-miRNA가 생성되고, 추가로 이 pre-miRNA가 다이서(Dicer)가 개재된 프로세싱을 받음으로써 생성된다. 본 발명에 있어서는 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 한, 성숙형의 miRNA뿐만 아니라, pri-miRNA, 또는 pre-miRNA를 이용할 수도 있다. 또한, 본 발명에서 이용하는 miRNA는 천연형의 RNA뿐만 아니라 비천연형의 RNA일 수도 있다.
본 발명에서 이용하는 miRNA의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 화학 합성 방법, 또는 유전자 재조합 기술에 의한 방법으로 제조할 수 있다. 유전자 재조합 기술에 의한 방법으로 제조하는 경우에는 유전자 재조합에 의해 취득한 DNA 템플릿과 RNA 폴리머라아제를 이용하여 전사 반응을 행함으로써 본 발명에서 이용하는 miRNA를 제조할 수 있다. RNA 폴리머라아제로서는, 예를 들면 T7 RNA 폴리머라아제, T3 RNA 폴리머라아제 또는 SP6 RNA 폴리머라아제 등을 사용할 수 있다.
또는, miRNA를 코딩하는 DNA를 발현 조절 서열(프로모터, 인핸서 등)의 제어하에 놓이도록 적당한 벡터 내에 조립함으로써, miRNA를 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제조할 수 있다. 여기서 이용하는 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 DNA 벡터이고, 예를 들면 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터 등을 들 수 있다. 바이러스 벡터로서는 특별히 한정되지 않지만, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반(associated) 바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 플라스미드로서는 당업자에 잘 알려진 포유류의 발현 플라스미드를 사용할 수 있다.
핵 초기화 공정에서 miRNA를 존재시킬 수단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 miRNA를 직접 체세포의 핵 내에 주입하는 방법이나 miRNA를 발현 가능한 적절한 재조합 벡터를 체세포에 도입하는 방법 등을 들 수 있다. 물론, 이들 방법으로 한정되는 것은 아니다.
재조합 벡터를 체세포에 도입하는 방법도 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 공지된 방법으로 행할 수 있다. 일시적 형질감염, 미세 주사, 인산칼슘 침전법, 리포솜 매개 형질감염, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 전기 천공(electroporation), 유전자총에 의한 방법 등을 사용할 수 있다.
핵 초기화 인자를 확인하는 수단으로서는, 예를 들면 국제공개 WO 2005/80598에 기재된 핵 초기화 인자의 스크리닝 방법을 이용할 수 있다. 상기 간행물의 모든 개시를 참조에 의해 본 명세서의 개시에 포함한다. 당업자는 상기 간행물을 참조함으로써 핵 초기화 인자를 스크리닝하여 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법에 적절한 변형 내지 변경을 가한 방법을 이용하여 핵 초기화 인자를 확인할 수도 있다.
초기화 인자를 코딩하는 유전자 조합의 일례가 국제공개 WO2007/69666에 개시되어 있다. 상기 간행물의 모든 개시를 참조에 의해 본 명세서의 개시에 포함한다. 당업자는 상기 간행물을 참조함으로써 본 발명의 방법에 바람직하게 사용 가능한 유전자를 적절히 선택하는 것이 가능하다. 또한, 초기화 인자를 코딩하는 유전자 조합의 다른 예가 문헌 [Science, 318, pp.1917-1920, 2007]에 기재되어 있다. 따라서, 당업자는 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자의 조합의 다양성을 이해할 수 있고, 국제공개 WO2005/80598에 기재된 핵 초기화 인자의 스크리닝 방법을 이용함으로써, 국제공개 WO2007/69666 및 문헌 [Science, 318, pp.1917-1920, 2007]에 기재된 조합 이외의 적절한 유전자의 조합을 본 발명의 방법에서 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 사용 가능한 초기화 인자를 코딩하는 유전자로서, Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, 및 Nanog 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 들 수 있지만, 바람직하게는 Myc 패밀리 유전자를 제외한 Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, 및 Nanog 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자, 보다 바람직하게는 2종의 유전자의 조합, 더욱 바람직하게는 3종의 유전자의 조합, 특히 바람직하게는 4종의 유전자의 조합을 들 수 있다.
Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자에 대해서는 국제공개 WO2007/69666에 패밀리 유전자의 구체예가 개시되어 있다. Lin 패밀리 유전자에 대해서도 당업자는 마찬가지로 패밀리 유전자를 추출하는 것이 가능하다.
또한, Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, 및 Nanog 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자에 의해 코딩되는 초기화 인자를 예를 들면 사이토카인 등으로 치환할 수 있는 경우가 있고, 또는 다른 1종 또는 2종 이상의 저분자 화합물로 치환할 수 있는 경우도 있다. 이러한 저분자 화합물로서는, 예를 들면 Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, 및 Nanog 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 작용을 갖는 저분자 화합물을 사용할 수 있지만, 이러한 저분자 화합물은 당업자가 용이하게 스크리닝하는 것이 가능하다.
보다 바람직한 유전자의 조합으로서는,
(a) Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자로 이루어지는 2종의 유전자의 조합;
(b) Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자로 이루어지는 3종의 유전자의 조합;
(c) Oct 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, 및 Nanog 유전자로 이루어지는 4종의 유전자의 조합
등을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
이들 유전자는 모두 인간을 포함하는 포유류 동물에 있어서 공통적으로 존재하는 유전자로서, 본 발명에 있어서 상기 유전자를 이용하기 위해서는 임의의 포유류 동물 유래(예를 들면 인간, 마우스, 래트, 소, 양, 말, 원숭이 등의 포유류 동물 유래)의 유전자를 이용하는 것이 가능하다. 또한, 야생형의 유전자 산물 외에도 수개(예를 들면 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 바람직하게는 1 내지 4개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 바람직하게는 1 또는 2개)의 아미노산이 치환, 삽입, 및/또는 결실된 변이 유전자 산물로서, 야생형의 유전자 산물과 동일한 기능을 갖는 유전자 산물도 이용 가능하다. 예를 들면, c-Myc의 유전자 산물로서는 야생형 외에도 안정형(T58A) 등을 이용할 수 있다. 다른 유전자 산물에 대해서도 마찬가지이다.
또한, 상기 유전자에 더하여, 세포의 불멸화(immortalization)를 유도하는 인자를 코딩하는 유전자를 추가로 조합할 수도 있다. 국제공개 WO2007/69666에 개시되어 있는 바와 같이, 예를 들면 TERT 유전자, 및 하기 유전자: SV40 라지 T 항 원, HPV16 E6, HPV16 E7, 및 Bmil로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
바람직한 조합으로서, 예를 들면
(e) Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, 및 TERT 유전자로 이루어지는 4종의 유전자의 조합;
(f) Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, 및 SV40 라지 T 항원 유전자로 이루어지는 4종의 유전자의 조합;
(g) Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, TERT 유전자, 및 SV40 라지 T 항원 유전자로 이루어지는 5종의 유전자의 조합을 들 수 있다.
필요에 따라, 상기 조합으로부터 Klf 패밀리 유전자를 제외시킬 수 있는 경우도 있다.
또한, 상기 유전자에 더하여, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 β-카테닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 조합할 수도 있고/있거나 ECAT1, Esg1, D㎚t3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sall4, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 조합할 수도 있다. 이들의 조합에 대해서는 국제공개 WO2007/69666에 구체적으로 설명되어 있다.
특히 바람직한 유전자의 조합은
(1) Oct3/4 및 Sox2로 이루어지는 2종의 유전자의 조합;
(2) Oct3/4, Klf4, 및 Sox2로 이루어지는 3종의 유전자의 조합;
(3) Oct3/4, Sox2, Lin28, 및 Nanog로 이루어지는 4종의 유전자의 조합;
(4) Oct3/4, Sox2, TERT, 및 SV40 라지 T 항원으로 이루어지는 4종의 유전자의 조합;
(5) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, 및 SV40 라지 T 항원으로 이루어지는 5종의 유전자의 조합
등이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
상기 유전자 산물을 포함하는 인자는 하기의 군: Fbx15, Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 β-카테닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 중 1종 또는 2종 이상의 유전자 산물과 조합할 수 있다. 또한, 예를 들면 하기의 군: ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sall4, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 유전자 산물과 조합할 수도 있다. 이들 유전자 산물에 대해서는 국제공개 WO2007/69666에 개시되어 있다. 물론, 본 발명의 핵 초기화 인자에 포함할 수 있는 유전자 산물은 상기에 구체적으로 설명한 유전자의 유전자 산물로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 핵 초기화 인자에는 핵 초기화 인자로서 기능할 수 있는 다른 유전자 산물 외에도, 분화, 발생, 또는 증식 등에 관계하는 인자 또는 그 밖의 생리 활성을 갖는 인자를 1개 또는 2개 이상 포함할 수 있고, 그와 같은 양태도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 물론이다.
초기화해야 할 체세포에 있어서 이들 유전자 중의 1종 또는 2종 이상의 유전자의 유전자 산물이 이미 발현된 경우에는, 그와 같은 유전자 산물을 도입해야 할 인자로부터 제외할 수 있다. 예를 들면, 이미 발현된 유전자 이외의 1종 또는 2종 이상의 유전자를 체세포에 적절한 유전자 도입 방법, 예를 들면 재조합 벡터를 이용하는 방법 등으로 도입할 수 있다. 또는, 이들 유전자의 유전자 산물 중의 1종 또는 2종 이상을 융합 단백질이나 핵 내로의 미세주입법(microinjection) 등의 수법에 의해 핵 내에 도입하는 경우에는 나머지 1개 또는 2개 이상의 유전자를 적절한 유전자 도입 방법, 예를 들면 재조합 벡터를 이용하는 방법 등에 의해 도입할 수 있다.
또한, 핵 초기화 인자인 유전자 산물은, 예를 들면 상기 유전자로부터 생산되는 단백질 자체 외에도, 상기 단백질과 그 밖의 단백질 또는 펩티드 등과의 융합 유전자 산물의 형태일 수 있다. 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP)과의 융합 단백질이나 히스티딘 태그 등의 펩티드와의 융합 유전자 산물을 이용할 수도 있다. 또한, HIV 바이러스에서 유래하는 TAT 펩티드와의 융합 단백질을 제조하여 이용함으로써, 세포막으로부터의 핵 초기화 인자의 세포내 이입(endocytosis)을 촉진시킬 수 있고, 유전자 도입 등의 번잡한 조작을 회피하여, 융합 단백질을 배지에 첨가하는 것만으로 초기화를 유도하는 것이 가능해진다. 이러한 융합 유전자 산물의 제조 방법은 당업자에 잘 알려져 있기 때문에, 당업자는 목적에 맞게 적절한 융합 유전자 산물을 용이하게 설계하여 제조하는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서 "인공 다능성 줄기 세포"(iPS 세포)란 ES 세포에 가까운 성질을 갖는 세포를 말하며, 보다 구체적으로는, 체세포로부터 초기화된 미분화 세포로서 다능성 및 증식능을 갖는 세포를 포함하지만, 이 용어를 어떠한 의미에 있 어서도 한정적으로 해석해서는 안되며, 가장 광의로 해석할 필요가 있다. 핵 초기화 인자를 이용하여 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법에 대해서는 국제공개 WO2005/80598에 설명되어 있고(상기 공보에 있어서는 ES 유사 세포라는 용어가 이용되고 있음), 인공 다능성 줄기 세포의 분리 수단에 대해서도 구체적으로 설명되어 있다. 또한, 국제공개 WO2007/69666에는 초기화 인자의 구체예 및 그 초기화 인자를 이용한 체세포의 초기화 방법의 구체예가 개시되어 있다. 따라서, 본 발명을 실시함에 있어서 당업자는 이들 간행물을 참조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 체세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 체세포 및 인공 다능성 줄기 세포가 증식 가능한 환경에서 miRNA의 존재하에서 핵 초기화 인자에 의해 체세포를 핵 초기화할 수 있는 방법이면 어떠한 방법을 채용하든 좋다. 예를 들면, 핵 초기화 인자를 발현 가능한 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 상기 유전자를 체세포에 도입하고, 동시에, 또는 시간을 변경하여 miRNA를 발현 가능한 재조합 벡터를 체세포에 도입하는 등의 수단을 채용할 수 있다. 이러한 벡터를 이용하는 경우에는, 벡터에 2종 이상의 유전자를 조합하여 각각의 유전자 산물을 체세포에 있어서 동시에 발현시킬 수 있다.
상기 유전자를 발현 가능한 벡터를 이용하여 유전자 및/또는 miRNA를 체세포에 도입하는 경우에는, 피더(feeder) 세포 상에 배양된 체세포에 대하여 발현 벡터의 도입을 행할 수 있지만, 체세포에만 발현 벡터 도입을 행할 수도 있다. 발현 벡터의 도입 효율을 높이기 위해 후자의 방법이 적합한 경우가 있다. 피더 세포로서는 배아 줄기 세포의 배양에 이용되는 피더 세포를 적절히 사용할 수 있지만, 예 를 들면 마우스 14 내지 15일 배아 섬유 아세포 초대 배양 세포나 섬유 아세포 유래 세포주인 STO 세포 등을 미토마이신 C 등의 약제로 처리한 세포나 방사선 처리한 세포 등을 사용할 수 있다.
핵 초기화 인자를 도입한 체세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 자율적으로 핵 초기화가 진행되어, 체세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있다. 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자 및/또는 miRNA를 발현 벡터를 이용하여 체세포에 도입하여 인공 다능성 줄기 세포를 얻는 공정은, 예를 들면 레트로바이러스를 이용하는 방법에 준하여 행할 수 있고, 예를 들면 문헌 [Cell, 126, pp.1-14, 2006; Cell, 131, pp.1-12, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007] 등의 간행물에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다. 인간 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 경우에는, 발현 벡터 도입 후의 세포의 배양 밀도를 통상의 동물 세포 배양의 경우보다 낮게 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 세포 배양용 접시당 1 내지 10만개, 바람직하게는 5만개 정도의 세포 밀도로 배양을 계속하는 것이 바람직하다. 배양에 이용하는 배지는 특별히 한정되지 않고 당업자에 의해 적절히 선택 가능하지만, 예를 들면 인간 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 경우에는 인간 ES 세포 배양에 적합한 배지를 이용하는 것이 바람직한 경우가 있다. 배지의 선택 및 배양 조건 등에 대해서도 상기 간행물을 참조할 수 있다.
생성된 인공 다능성 줄기 세포는 미분화 세포에 특유의 각종 마커로 확인할 수 있지만, 그의 수단에 대해서도 상기 각 간행물에 구체적이고 상세하게 설명되어 있다. ES 세포의 미분화성 및 다능성을 유지 가능한 배지 또는 그의 성질을 유지 할 수 없는 배지는 당업계에서 다양하게 알려져 있고, 적절한 배지를 조합하여 사용함으로써, 인공 다능성 줄기 세포를 효율적으로 분리할 수 있다. 분리된 인공 다능성 줄기 세포의 분화능 및 증식능은 ES 세포에 대하여 범용되고 있는 확인 수단을 이용함으로써 당업자가 용이하게 확인 가능하다. 또한, 생성된 인공 다능성 줄기 세포를 적절한 조건하에서 증식시키면 인공 다능성 줄기 세포의 콜로니가 얻어지지만, 콜로니의 형상으로부터 인공 다능성 줄기 세포의 존재를 특정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 마우스 인공 다능성 줄기 세포는 부풀어 오른 콜로니를 형성하는 데 반하여, 인간 인공 다능성 줄기 세포는 편평한 콜로니를 형성한다고 알려져 있고, 이들 콜로니 형상은 각각 마우스 ES 세포 및 인간 ES 세포의 콜로니와 매우 유사하기 때문에, 당업자는 콜로니 형상으로부터 생성된 인공 다능성 줄기 세포를 특정하는 것이 가능해진다.
본 발명의 방법에 의해 초기화해야 할 체세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들면, 임의의 포유류 동물 유래(예를 들면 인간, 마우스, 래트, 소, 양, 말, 원숭이 등의 포유류 동물 유래)의 체세포를 이용할 수 있고, 태아기의 체세포 외에도 신생아의 체세포, 성숙한 체세포 및 조직 줄기 세포를 이용할 수 있다. 또한, 피부 세포, 간장 세포, 위점막 세포 등, 다양한 체세포를 초기화하는 것이 가능하다. 인공 다능성 줄기 세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리한 체세포를 이용하는 것이 바람직하고, 예를 들면 질병에 관여하는 체세포나 질병 치료에 관여하는 체세포 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 인공 다능성 줄기 세포의 용도는 특별히 한정되지 않고, ES 세포를 이용하여 행해지고 있는 모든 시험·연구나 ES 세포를 이용한 질병의 치료 등에 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 인공 다능성 줄기 세포를 레티노산, EGF 등의 증식 인자, 또는 당질코르티코이드 등으로 처리함으로써, 원하는 분화 세포(예를 들면 신경 세포, 심근 세포, 혈구 세포 등)을 유도할 수 있어 적절한 조직을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 분화 세포나 조직을 환자에게 되돌림으로써 자가 세포 이식에 의한 줄기 세포 요법을 달성할 수 있다. 물론, 본 발명의 인공 다능성 줄기 세포의 용도는 상기 특정한 양태로 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
예 1: 마우스 태아 섬유 아세포의 핵 초기화에 의한 인공 다능성 줄기 세포의 제조
마우스 유래 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3종의 유전자, 대조군용의 DsRed, 및 18종의 miRNA의 각각을 코딩하는 pMXs-베이스의 레트로바이러스 벡터를 PLAT-E 세포에 Fugene6(로슈)을 이용하여 형질감염시켰다. 다음날, Nanog 유전자의 프로모터 영역의 하류에 EGFP와 퓨로마이신의 내성 유전자를 코딩한 서열을 연결한 형질전환 마우스 유래의 태아 섬유 아세포(Nanog GFP MEF, WO2007/69666)를 6 웰 플레 이트에 1×105개씩 뿌렸다. 다음날, 이 세포에 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4, 및 18종의 miRNA로부터 선택되는 각 1종의 miRNA를 발현하는 레트로바이러스를 3인자의 발현 바이러스의 혼합액 1 ml+miRNA 발현 바이러스액 1 ml의 비율로 감염시켜 핵 초기화에 의해 인공 다능성 줄기 세포의 제조를 행하였다.
Figure 112009015116153-pct00001
감염 후 3일째부터 LIF를 포함하는 ES 세포용 배지로 배양하고, 감염 후 4일째에 세포를 박리하여 피더 세포 상에 전량 다시 뿌렸다. 그 후 1일 걸러 LIF를 포함하는 ES 세포용 배지를 교환하고, 감염 후 21일째부터 최종 농도 1.5 μg/ml가 되도록 퓨로마이신을 가하여 약제 선택을 개시하였다. 28일째에 Nanog GFP 양성(Nanog 유전자좌에 의해 발현이 유도되는 GFP를 형광 현미경으로 관찰할 수 있음) 콜로니 수를 관찰하였다. 대조군으로서 miRNA 대신에 DsRed를 이용하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. mmu-miR-294 및 mmu-miR-295는 각각 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3개의 인자와 함께 마우스 태아 섬유 아세포에 도입한 경우에 핵 초기화의 효율을 높일 수 있어, 효율적인 인공 다능성 줄기 세포의 제조를 가능하게 함을 알 수 있었다.
예 2: 마우스 꼬리 섬유 아세포의 핵 초기화에 의한 인공 다능성 줄기 세포의 제조
마우스 유래 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3종의 유전자, DsRed(대조군), mmu-miR-295의 각각을 코딩하는 pMXs-베이스의 레트로바이러스 벡터를 PLAT-E 세포에 Fugene6(로슈)을 이용하여 형질감염시켰다. 다음날, Nanog 유전자의 프로모터 영역의 하류에 EGFP와 퓨로마이신의 내성 유전자를 코딩한 서열을 연결한 형질전환 마우스 유래의 꼬리 섬유 아세포(Nanog GFP tailtip fibroblasts)를 6 웰 플레이트에 1×105개씩 뿌렸다. 다음날, 이 세포에 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3 인자와 DsRed 또는 mmu-miR-295를 발현하는 레트로바이러스를 (1:1:1:1)의 비율로 감염시켜 핵 초기화에 의해 인공 다능성 줄기 세포의 제조를 행하였다.
감염 후 3일째부터 LIF를 포함하는 ES 세포용 배지로 배양하고, 감염 후 4일째에 세포를 박리하여 피더 세포 상에 전량 다시 뿌렸다. 그 후 1일 걸러 LIF를 포함하는 ES 세포용 배지를 교환하고, 감염 후 7일째, 21일째 또는 28일째로부터 최종 농도 1.5 μg/ml가 되도록 퓨로마이신을 가하여 약제 선택을 개시하였다. 39일째에 전체의 콜로니 수와 Nanog GFP 양성(Nanog 유전자좌에 의해 발현이 유도되는 GFP를 형광 현미경으로 관찰할 수 있음) 콜로니 수를 관찰하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. mmu-miR-295는 각각 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3개의 인자와 함께 마우스 꼬리 섬유 아세포에 도입한 경우에 핵 초기화의 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 초기화의 스피드를 빠르게 하여, 효율적인 인공 다능성 줄기 세포의 제조를 가능하게 함을 알 수 있었다.
예 3: 인간 성인 피부 세포의 핵 초기화에 의한 인공 다능성 줄기 세포의 제조
인간 유래 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3종의 유전자에 더하여, 대조군용의 DsRed와 23종의 miRNA 또는 miRNA 클러스터를 코딩하는 pMXs-베이스의 레트로바이러스 벡터를 PLAT-E 세포에 Fugene6(로슈)을 이용하여 형질감염시켰다. 다음날, 설치류에게만 감염되는 바이러스의 수용체인 Slc7a1을 발현하도록 한 인간 성인 피부 세포(adult human dermal fibroblasts)를 6 cm 접시에 3×105개씩 뿌렸다. 다음날, 이 세포에 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3종의 유전자와 각종 miRNA를 발현하는 레트로바이러스를 1:1:1:1의 비율로 감염시켜 핵 초기화에 의한 인공 다능성 줄기 세포의 생성을 시도하였다.
Figure 112009015116153-pct00002
감염 후 6일째에 세포를 박리하고, 5×105개의 세포를 피더 세포 상에 전량 다시 뿌렸다. 그 후 1일 걸러 bFGF를 포함하는 인간 ES 세포용 배지(리프로셀 배지)를 교환하고, 24일째, 32일째, 및 40일째에 전체의 콜로니 수와 인간 ES 세포 유사 형태를 한 콜로니 수를 관찰하였다. 대조군으로서 miRNA 대신에 DsRed를 이용하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. hsa-miR-372, 373, 302b, 302b-367(302b, 302c, 302a, 302d, 및 367을 포함), 520c, mmu-miR-291a, 294, 또는 295의 존재하에서 3 유전자를 도입한 경우에 인공 다능성 줄기 세포의 콜로니 수가 대조군에 비하여 2배 이상으로 증가함을 알 수 있었다.
본 발명에 의해 인공 다능성 줄기 세포의 효율적인 제조 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비하여 핵 초기화 효율이 우수하여, 예를 들면 c-Myc 또는 그의 유전자 산물을 이용하지 않고 안전한 인공 다능성 줄기 세포를 효율적으로 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해, 예를 들면 환자 자신의 체세포로부터 안정성이 높은 인공 다능성 줄기 세포를 효율적으로 제조할 수 있고, 이 세포를 분화시킴으로써 얻어지는 세포(예를 들면 심근세포, 인슐린 생산 세포, 또는 신경 세포 등)를 심부전, 인슐린 의존성 당뇨병, 파킨슨병이나 척수 손상 등 다양한 질환에 대한 줄기 세포 이식 요법에 있어서 안전하게 이용할 수 있다.
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Claims (11)

  1. hsa-miR-372, hsa-miR-373, hsa-miR-302b, hsa-miR-302c, hsa-miR-302a, hsa-miR-302d, hsa-miR-367, hsa-miR-520c, mmu-miR-291a, mmu-miR-294, 및 mmu-miR-295로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA에 포함되는 miRNA 1개 이상을 포함하는 핵 초기화 인자 세트를 체세포로 도입함으로써 체세포를 핵 초기화하는 공정을 포함하는, 인공 다능성 줄기 세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 핵 초기화 인자가 Oct3/4 및 Sox2로 이루어지는 2종의 유전자 또는 유전자 산물을 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 핵 초기화 인자가 Klf4 유전자 또는 유전자 산물을 더 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA가 hsa-miR-302b-367로 특정되는 RNA 서열에 포함되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA가 서열 번호 1 내지 12로부터 선택되는 RNA 서열에 포함되는 것인 방법.
  6. hsa-miR-372, hsa-miR-373, hsa-miR-302b, hsa-miR-302c, hsa-miR-302a, hsa-miR-302d, hsa-miR-367, hsa-miR-520c, mmu-miR-291a, mmu-miR-294, 및 mmu-miR-295로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA에 포함되는 miRNA 1개 이상을 포함하는, 체세포의 초기화를 위한 핵 초기화 인자 세트.
  7. 제6항에 있어서, Oct3/4 및 Sox2로 이루어지는 2종의 유전자 또는 유전자 산물을 더 포함하는 핵 초기화 인자 세트.
  8. 제7항에 있어서, Klf4 유전자 또는 유전자 산물을 더 포함하는 핵 초기화 인자 세트.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA가 hsa-miR-302b-367로 특정되는 RNA 서열에 포함되는 것인 핵 초기화 인자 세트.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA가 서열 번호 1 내지 12로부터 선택되는 RNA 서열에 포함되는 것인 핵 초기화 인자 세트.
  11. hsa-miR-372, hsa-miR-373, hsa-miR-302b, hsa-miR-302c, hsa-miR-302a, hsa-miR-302d, hsa-miR-367, hsa-miR-520c, mmu-miR-291a, mmu-miR-294, 및 mmu-miR-295로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA에 포함되는 miRNA를 체세포에 도입하는 공정을 포함하는, 체세포로부터 인공 다능성 줄기 세포의 제조에서 핵 초기화의 효율을 높이는 방법.
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