CN116134130A - 多能细胞的未分化维持培养用组合物、多能细胞的未分化维持培养用培养基、多能细胞的未分化状态下的维持培养方法、和多能细胞的制造方法 - Google Patents

多能细胞的未分化维持培养用组合物、多能细胞的未分化维持培养用培养基、多能细胞的未分化状态下的维持培养方法、和多能细胞的制造方法 Download PDF

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CN116134130A CN202180060533.7A CN202180060533A CN116134130A CN 116134130 A CN116134130 A CN 116134130A CN 202180060533 A CN202180060533 A CN 202180060533A CN 116134130 A CN116134130 A CN 116134130A
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内藤宗和
平井宗一
福重香
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Aichi Medical University
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Aichi Medical University
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Abstract

提供一种多能细胞的未分化维持培养用组合物以及使用其的培养方法，所述未分化维持培养用组合物在多能细胞的未分化状态下的维持培养中，能够提高所述多能细胞的增殖率、或者能够降低所述多能细胞的细胞死亡频率。本发明的多能细胞的未分化维持培养用组合物包含微小气泡。

Description

多能细胞的未分化维持培养用组合物、多能细胞的未分化维 持培养用培养基、多能细胞的未分化状态下的维持培养方法、 和多能细胞的制造方法
技术领域
本发明涉及多能细胞的未分化维持培养用组合物、多能细胞的未分化维持培养用培养基、多能细胞的未分化状态下的维持培养方法、和多能细胞的制造方法。
背景技术
在再生医疗中，尝试着由具有多能性的细胞(多能细胞)向目标细胞进行分化诱导(非专利文献1)，使用得到的细胞或细胞集团(治疗用细胞)进行治疗。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Hyunjin Choi等、《多能性幹細胞の大量培養法の現状：透析浮遊培養を用いたヒトiPS細胞の分化誘導》(多能干细胞的大量培养方法的现状：使用了透析悬浮培养的人iPS细胞的分化诱导)2019、Organ Biology、VOL.26、NO.2、85～94页
发明内容
发明要解决的问题
将所述治疗用细胞适用于人的治疗的情况下，需要大量的多能细胞。所述多能细胞具有自我复制能力，因此能够通过在未分化状态下进行维持培养而增加所述多能细胞的数目。因此，研究了通过抑制所述多能细胞的分化能力，在未分化状态下对所述多能细胞进行维持培养的方法。
因此，期望能够维持所述多能细胞的未分化状态并且更加效率良好地使所述多能细胞增殖的方法。
因此，本发明的目的在于提供在，多能细胞的未分化状态下的维持培养中，能够提高所述多能细胞的增殖率、或能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率的多能细胞的未分化维持培养用组合物，以及使用了该未分化维持培养用组合物的培养方法。
用于解决问题的方案
为了达成所述目的，本发明的多能细胞的未分化维持培养用组合物(以下称为“维持组合物”)包含微小气泡。
本发明的多能细胞的未分化维持培养用培养基(以下，也称为“维持培养基”)包含本发明的多能细胞的未分化维持培养用组合物。
本发明的多能细胞的未分化状态下的维持培养方法(以下，称为“维持培养方法”)包括在微小气泡的存在下在未分化状态下对多能细胞进行维持培养的维持培养工序。
本发明的多能细胞的制造方法(以下称为“制造方法”)包括通过对多能细胞在未分化状态下进行维持培养，从而制造多能细胞的制造工序，
所述制造工序通过所述本发明的多能细胞的未分化状态下的维持培养方法来实施。
发明的效果
通过本发明，与实质上不包含微小气泡的、多能细胞的未分化维持培养用组合物相比较，能够提高所述多能细胞的增殖率、或能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率。
附图说明
图1是示出实施例1中的维持组合物的制造装置的示意图。
图2是表示实施例1中的维持培养的流程的图。
图3是表示实施例1中的线粒体活性的相对值(存活率)的图。
图4是表示实施例1中的细胞数的相对值的图。
图5是表示实施例1中的碱性磷酸酶染色的结果的照片。
图6是表示实施例1中的利用抗TRA-1-60抗体的染色结果的图。
图7是表示实施例1中的利用抗SSEA-4抗体的染色结果的图。
具体实施方式
＜未分化维持培养用组合物＞
本发明的多能细胞的未分化维持培养用组合物如前所述包含微小气泡。本发明的维持组合物的特征在于包含微小气泡，对其他构成和条件没有特别的限制。通过本发明的维持组合物，能够在维持未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。
本发明人等进行深入研究的结果发现，通过使微小气泡共存，在所述多能细胞的维持培养中，能够提高所述多能细胞的增殖率、或能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率，从而确立了本发明。通过本发明，在所述多能细胞的维持培养中，由于能够提高所述多能细胞的增殖率或者能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率，因此与多能细胞的未分化维持培养用组合物进行比较，能够更加效率良好地在维持未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。
本发明中，“多能性”是指具有向例如包含内胚层、中胚层和外胚层的三胚层的分化能力。另外，本发明中，“多能性”也包含例如具有向所有细胞的分化能力、即具有全能性。对于所述多能细胞，没有特别的限定，可列举出例如胚胎干细胞(Embryonic Stem cell：ES细胞)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells：iPS细胞)、核移植ES细胞(ntES细胞)、生殖性干细胞、体性干细胞、胚性肿瘤细胞等，优选为iPS细胞。对于所述多能细胞的来源，没有特别的限定，可列举出例如人和除了人以外的非人动物。所述非人动物可列举出例如猴子、大猩猩、黑猩猩、绒猴等灵长类；小鼠、大鼠、狗、兔子、绵羊、马、豚鼠等。
本发明中，“分化能力”是指例如在使其分化为目标的分化细胞的条件下对所述多能细胞进行培养时，所述多能细胞的一部分或全部能够分化成所述目标的分化细胞。
本发明中，“未分化”是指例如在培养的前后分化能力没有变化、或多能细胞没有分化。
本发明中“多能细胞的未分化维持”是指例如在没有分化状态下维持多能细胞。具体而言，“多能细胞的未分化维持”是指例如保持了所述多能细胞所具有的分化能力的状态，即，维持向三胚层的分化能力的状态。所述多能细胞是否维持未分化状态可以通过例如对对象的多能细胞进行维持培养，利用得到的细胞中的细胞表面标记物等标记物评价。作为具体例，所述多能细胞为iPS细胞的情况下，所述细胞表面标记物可列举出阶段特异胚抗原-4(SSEA-4)、TRA-1-60等。TRA-1-60为例如局部存在于细胞表面的足细胞标志蛋白(糖蛋白)上的硫酸角蛋白(糖链)。因此，在所述维持培养后的细胞中，SSEA-4或TRA-1-60表达的情况下，即，SSEA-4或TRA-1-60为阳性的情况下，所述多能细胞能够评价为例如在所述维持培养后维持了未分化状态。另一方面，在所述维持培养后的细胞中，在SSEA-4和TRA-1-60没有表达的情况下，即，SSEA-4和TRA-1-60为阴性的情况下，所述多能细胞能够评价为例如在所述维持培养后没有维持未分化状态。所述细胞表面标记物的表达根据后述的实施例1，能够通过流式细胞仪进行评价。作为所述标记物，也可以使用例如碱性磷酸酶活性。所述多能细胞为iPS细胞的情况下，作为所述细胞表面标记物，也可以使用例如SSEA-3、八聚体结合转录因子4(OCT4)、SRY(性别决定区Y)-box 2(SOX2)、NANOG、TRA-1-81等。TRA-1-81是例如局部存在于细胞表面的足细胞标志蛋白(糖蛋白)上的硫酸角蛋白(糖链)。
本发明中，“多能细胞的未分化维持培养”是指例如在维持培养后，以维持多能细胞的未分化状态的方式进行培养。本发明中，例如在所述维持培养后包含有多能细胞的情况下，所述维持培养能够评价为多能细胞的未分化维持培养。另外，本发明中，所述“多能细胞的未分化维持培养”也可以通过例如维持培养前后的、多能细胞的个数进行评价。该情况下，在与所述维持培养前的细胞数量相同(无显著性差异)或比数量相同更多的情况下，所述维持培养能够评价为例如多能细胞的未分化维持培养。所述“多能细胞的未分化维持培养”也可以通过例如维持培养后的、所述标记物表达细胞的比例进行评价。作为具体例，所述标记物为TRA-1-60的情况下，所述iPS细胞的培养后的细胞中的TRA-1-60阳性细胞的比例为例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的情况下，所述维持培养可以评价为例如多能细胞的未分化维持培养。所述标记物为SSEA-4的情况下，所述iPS细胞的培养后的细胞中的SSEA-4阳性细胞的比例具有例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的情况下，所述维持培养可以评价为例如多能细胞的未分化维持培养。
所述“阳性(+)”是指，通过利用抗原抗体反应进行检测的流式细胞仪等的解析方法，与使用了不表达所述抗原的阴性对照细胞或不与所述抗原反应的抗体的阴性对照反应相比较，检测出了高的信号。另外，“阴性(-)”是指，通过利用抗原抗体反应进行检测的流式细胞仪等的解析方法，与使用了不表达所述抗原的阴性对照细胞或不与所述抗原反应的抗体的阴性对照反应相比较，检测出了同等或其以下的信号。
本发明中，“微小气泡”是指被气体以外所包围的、包含气体的密闭的微小空间，也可以称为例如微细气泡。所述微小气泡可列举出例如细泡。所述细泡通常是指气泡直径小于100μm的微小气泡。所述气泡直径是指气泡的球当量直径。所述气泡直径也可以是通过后述的测定方法而得到的微小气泡的平均直径(算术平均直径)。所述细泡可以是微泡(FB)，也可以是超级细泡(UFB)。所述微泡通常是指气泡直径为1μm以上且小于100μm的微小气泡。所述超级细泡通常是指气泡直径小于1μm的微小气泡。所述微小气泡优选为所述气体成分被水性溶剂包围，即，所述气体成分在所述微小气泡的外周与水性介质接触的状态下被所述水性介质包围。
所述微小气泡在介质中分散而存在。所述微小气泡在所述介质的全体或一部中分散而存在。后者的情况下，所述微小气泡也可以在所述介质的一部分中局部存在。所述介质可列举出例如液体或固体。所述液体可列举出例如包含水的水性溶剂、油性溶剂、或它们的混合溶剂等。另外，所述液体包含溶胶。所述固体可列举出例如使所述液体凝固而成的物质。另外，所述固体包含凝胶。所述液体可列举出例如生理盐水；磷酸缓冲液等缓冲液；细胞外液、细胞内液等的输注液；蒸馏水、纯水等水；多能细胞的维持培养基(培养液)、细胞培养基(培养液)；脏器保存液；等。所述固体可列举出例如所述液体的固化物。所述多能细胞的维持培养基也可以使用自家制备的培养基或市售的培养基，作为具体例，可列举出Cellartis(注册商标)DEF-CS 500基本培养基(Cellatis公司制)、StemFit(注册商标、味之素公司制)、mTeSR-1(STEMCELL公司制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制)、StemPRO hESC SFM(Life Technologies公司制)、E8(Life Technologies公司制)、ReproStem(REPROCELL公司制)等。所述细胞培养液可列举出例如以达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)、最低必须培养基(Minimalessential Medium，MEM)、伊格尔培养基(基本培养基Eagle,BME)、RPMI1640、Ham’s F-10、Ham’s F-12、α最低必须培养基(αMEM)、格拉斯哥极限必需培养基(Glasgow’s Minimalessential Medium,GMEM)、艾斯考夫改良杜贝克培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium,IMDM)等作为基础成分的培养基。
所述微小气泡包含任意的气体作为气体(气体成分)。作为具体例，所述微小气泡可列举出例如一氧化碳(CO)、硫化氢(H2S)、氢气(H2)等生物气体；氦气(He)、氩气(Ar)、氪气(Kr)、氙气(Xe)等稀有气体；氧气(O2)、二氧化碳(CO2)、一氧化二氮(N2O)、二氧化碳(CO2)、氮气(N2)、甲烷(CH4)、乙烷(CH3CH3)、丙烷(CH3CH2CH3)、氟甲烷(CH3F)、二氟甲烷(CH2F2)、四氟化碳(CF4)、环氧乙烷(C2H4O)、空气等。所述微小气泡排除了例如气体仅为空气的情况。本发明中，所述“空气”是指例如在制造所述微小气泡时所使用的空气(大气)。所述微小气泡中的气体为存在有医疗用气体级别气体的情况下，优选为来自于医疗用气体的气体。
所述微小气泡的密度是指微小气泡的个数相对于所述介质的体积。所述“密度”也可以称为个数浓度。所述微小气泡的密度的下限值为例如5×105个/ml、1×106个/ml、5×106个/ml、1×107个/ml、5×107个/ml、1×108个/ml、5×108个/ml、1×109个/ml，优选为1×106个/ml、5×106个/ml、1×107个/ml、5×107个/ml、1×108个/ml、5×108个/ml。所述微小气泡的密度的上限值为例如1.5×109个/ml、2×109个/ml、3×109个/ml、5×109个/ml、7×109个/ml、9×109个/ml、1×1010个/ml、5×1010个/ml、1×1011个/ml、5×1011个/ml、1×1012个/ml、5×1012个/ml。所述微小气泡的密度的范围为例如5×105个/ml～5×1012个/ml、5×105个/ml～1×1012个/ml、5×105个/ml～5×1011个/ml、5×105个/ml～1×1011个/ml、5×105个/ml～5×1010个/ml、5×105个/ml～1×1010个/ml、1×106个/ml～9×109个/ml、5×106个/ml～9×109个/ml、1×107个/ml～7×109个/ml、5×107个/ml～7×109个/ml、1×108个/ml～5×109个/ml、5×108个/ml～5×109个/ml、1×109个/ml～3×109个/ml、5×108个/ml～2×109个/ml、5×108个/ml～1.5×109个/ml。
所述微小气泡的密度、气泡直径和平均直径(以下也称为“特性”)根据分散有所述微小气泡的介质而适宜测定。所述微小气泡分散于液体的介质的情况下，所述微小气泡的特性可以通过针对本发明的维持组合物中的气泡利用粒子轨迹解析法进行解析而计算出。所述粒子轨迹解析法可以例如根据后述的实施例1、使用NanoSight(注册商标)NS300(Malvern Instrument公司制)进行实施。所述微小气泡的特性也可以通过粒子轨迹解析法以外的其他的解析方法算出。该情况下，用其他的解析方法得到的微小气泡的特性在转换为用所述粒子轨迹解析法得到的算出值时，满足前述的例示。所述微小气泡分散于固体的介质的情况下，所述微小气泡的特性可以基于所述介质的固化前的液体中的微小气泡的特性和通过溶解固体的介质而得到的液体中的微小气泡的特性而计算出。
所述微小气泡包含氧气作为气体成分的情况下，O2在所述气体中所占的比例为例如大于0％、100％以下、10～100％，优选为20～100％、30～100％、40～100％、50～100％、60～100％、70～100％、80～100％、90～100％、95～100％、96～100％、97～100％、98～100％、99～100％。
本发明的维持组合物也可以例如还含有多能细胞的未分化维持因子。所述未分化维持因子是例如在所述多能细胞的维持培养中、用于维持多能细胞的未分化状态而添加的因子。所述未分化维持因子可列举出例如白介素(IL)-3、IL-6、干细胞因子(Stem cellfactor、SCF)、血小板生成素(TPO)、FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor、LIF)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、NODAL、胰岛素等。本发明中，所述未分化维持因子的配混量只要不妨碍微小气泡的功能，就没有特别的限定。
本发明的维持组合物任选包含其他成分。所述其他成分任选包含例如细胞培养液所含有的成分，作为具体例，可列举出包含钠、钾、钙、镁、磷、氯等的盐类；维生素类；细胞因子、趋化因子、成纤维细胞生长因子、上皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、肝细胞生长因子等生长因子或造血因子；维生素B1、维生素C等维生素类；胎牛血清、人血清、马血清、鸡血清等血清；胆固醇等脂质类；乳铁蛋白等糖类；单硫代甘油、2-巯基乙醇等还原剂；乙醇胺、氨基酸、丙酮酸钠、亚硒酸钠等其他添加剂等。本发明中，所述其他成分的配混量只要不妨碍微小气泡的功能，就没有特别的限制。
本发明的维持组合物可以例如使用气体、通过细泡等微小气泡的制造方法制造。因此，本发明的维持组合物的制造方法包括使用例如气体和介质制造微小气泡的气泡制造工序。作为具体例，本发明的维持组合物为液体的情况下，所述液体的组合物可以通过例如对气体和所述介质使用旋回流方式、喷射式、文丘里式、静态混合器方式、细孔方式、加压溶解式、或超声波空化式的微小气泡的制造装置来制造。另外，本发明的维持组合物为固体的情况下，所述固体的组合物可以通过将所述液体的组合物用公知的方法进行凝固而制造。所述固体为凝胶的情况下，凝胶的组合物通过例如将所述液体的组合物与凝胶化剂混合而制造。在所述气泡制造工序开始时，所述气体的状态是气体、液体、或固体。所述气体也可以包含多种气体。该情况下，可以将各气体分别供于所述气泡制造工序，也可以将所述气体的全部或一部分同时供于所述气泡制造工序。另外，本发明的维持组合物包含未分化维持因子和/或其他成分的情况下，所述未分化维持因子和/或其他成分可以在所述气泡制造工序前、中、或后的任意阶段添加。
本发明的维持组合物可以在例如体内(in vivo)使用，也可以在体外(in vitro)使用。本发明的维持组合物可以例如作为研究用试剂使用，也可以作为药品或细胞制剂制造用而使用。
本发明的维持组合物能够效率良好地在维持未分化状态的状态下维持培养多能细胞。因此，本发明的维持组合物可以适宜地作为例如多能细胞的维持培养用的培养基(培养液)而使用。
＜未分化维持培养用培养基＞
本发明的多能细胞的未分化维持培养用培养基如前所述，包含本发明的多能细胞的未分化维持培养用组合物。本发明的维持培养基的特征在于包含所述本发明的维持组合物，对其他的构成和条件，没有特别的限制。通过本发明的维持培养基，与实质上不包含微小气泡的多能细胞的未分化维持培养用培养基相比较，能够效率更良好地在维持未分化状态的状态下维持培养多能细胞。本发明的维持培养基可以援用所述本发明的维持组合物的说明。
本发明的维持培养基可以例如为固体，也可以为液体。本发明的培养基为液体的情况下，本发明的维持培养基也可以称为例如维持培养液。
本发明的维持培养基优选包含例如所述本发明的维持组合物和所述多能细胞的维持培养基，更优选包含所述本发明的维持组合物、所述多能细胞的维持培养基、和所述未分化维持因子。
本发明的维持培养基包含多种构成的情况下，各构成也可以保存在各个容器中。该情况下，本发明的维持培养基也可以称为例如维持培养基试剂盒。该情况下，本发明的维持培养基试剂盒在例如使用时可以将各构成混合而使用。
＜维持培养方法＞
本发明的多能细胞的维持培养方法如前所述，包含在微小气泡的存在下对多能细胞进行维持培养的维持培养工序。本发明的维持培养方法的特征在于，在所述微小气泡的存在下维持培养多能细胞，对于其他的工序和条件，没有特别的限制。通过本发明的维持培养方法，与实质上不包含微小气泡的多能细胞的未分化维持培养条件相比较，能够效率更良好地在维持未分化状态的状态下维持培养多能细胞。本发明的维持培养方法可以援用所述本发明的维持组合物和维持培养基的说明。
所述多能细胞可以例如自家制备，也可以使用市售品。在自家制备所述多能细胞的情况下，本发明的维持培养方法也可以在所述维持培养工序之前诱导供于维持培养的多能细胞。该情况下，本发明的维持培养方法包括诱导多能细胞的诱导工序。对于所述诱导工序中诱导的多能细胞，没有特别的限定，可列举出胚胎干细胞(Embryonic Stem cell：ES细胞)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells：iPS细胞)、核移植ES细胞(ntES细胞)、生殖性干细胞、体性干细胞、胚性肿瘤细胞等，优选为ES细胞或iPS细胞。
对于所述多能细胞的诱导方法，没有特别的限定，例如可以从活体、器官、脏器或组织、或者受精卵中分离，也可以向细胞中导入重编程因子而实施。
作为具体例，所述多能细胞为iPS细胞的情况下，可列举出以下的例子。
所述诱导工序可以通过例如使诱导iPS细胞的细胞(对象细胞)与重编程因子接触后、进行培养来实施。具体而言，所述诱导工序可以例如在培养基(培养液)的存在下实施。所述培养基可以是例如与所述细胞的种类相应的培养基，也可以是前述的多能细胞的维持培养基。所述培养基优选例如在培养开始后定期(例如每1或2天)进行培养基更换。所述接触可以通过例如将所述重编程因子导入至对象细胞内而实施，可以使用例如脂质转染、电穿孔、显微注射、将病毒载体等核酸或蛋白质导入细胞中的导入方法。
对象细胞没有特别的限定，可列举出例如胎儿(fetus)、新生儿(newborninfant)、或成体来源的体细胞或健康者或疾病患者来源的体细胞；原代培养细胞、传代细胞、株化细胞等培养细胞；神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)；前体细胞；淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞等分化细胞等。所述对象细胞的来源可以援用例如前述的多能细胞来源的说明。
所述诱导工序开始时的对象细胞的密度，没有特别的限定，用平板等细胞培养容器进行培养的情况下，所述密度为例如1×101～1×105细胞/cm2、1×101～5×104细胞/cm2，优选为4×104～5×104细胞/cm2。
所述重编程因子可列举出在ES细胞中特异表达的基因、其基因产物或非编码RNA、或ES细胞的与维持未分化相关的基因、其基因产物或非编码RNA、或起到同样效果的低分子化合物等。能够成为所述重编程因子的基因可列举出例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-联蛋白(beta-catenin)、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等。能够成为所述重编程因子的基因可以单独使用，也可以组合多种。所述组合可以援用例如国际公开第2007/069666号公报、国际公开第2008/118820号公报、国际公开第2009/007852号公报、国际公开第2009/032194号公报、国际公开第2009/058413号公报、国际公开第2009/057831号公报、国际公开第2009/075119号公报、国际公开第2009/079007号公报、国际公开第2009/091659号公报、国际公开第2009/101084号公报、国际公开第2009/101407号公报、国际公开第2009/102983号公报、国际公开第2009/114949号公报、国际公开第2009/117439号公报、国际公开第2009/126250号公报、国际公开第2009/126251号公报、国际公开第2009/126655号公报、国际公开第2009/157593号公报、国际公开第2010/009015号公报、国际公开第2010/033906号公报、国际公开第2010/033920号公报、国际公开第2010/042800号公报、国际公开第2010/050626号公报、国际公开第2010/056831号公报、国际公开第2010/068955号公报、国际公开第2010/098419号公报、国际公开第2010/102267号公报、国际公开第2010/111409号公报、国际公开第2010/111422号公报、国际公开第2010/115050号公报、国际公开第2010/124290号公报、国际公开第2010/147395号公报、国际公开第2010/147612号公报等的记载。
对于所述诱导工序中的培养条件，没有特别的限制。培养温度可列举出例如30～40℃。培养中的CO2浓度可列举出例如2～10％。培养基的pH为例如6.5～7.8，优选为7～7.8或7.2～7.6。所述培养优选在湿润环境下进行。作为具体例，所述培养条件为例如所述培养温度为约37℃、CO2浓度为约5％，在湿润环境下。所述培养工序中的培养天数为例如10～30天。由此，所述诱导工序中，例如可以在所述培养后使之产生ES细胞样的集落。
所述诱导工序可以在例如饲养细胞非存在下实施，也可以在饲养细胞存在下(例如、饲养细胞上)实施。后者的情况下，所述饲养细胞优选被预先处理成不会增殖的饲养细胞，作为具体例，优选用丝裂霉素C等增殖抑制剂进行了处理的饲养细胞。作为所述饲养细胞，可列举出例如小鼠胎儿成纤维细胞等胎儿成纤维细胞、STO细胞、SNL细胞、SL10细胞等成纤维细胞；PA6细胞(小鼠基质细胞株)、MS-5细胞、OP9细胞等基质细胞；等。所述饲养细胞可以为例如供于所述诱导工序的细胞中的、不与重编程因子接触的细胞。该情况下、所述诱导工序可以援用例如国际公开第2010/137746号公报的记载。
所述诱导工序可以在例如低氧条件下实施。所述低氧条件为例如O2浓度为15％以下，优选为0.1～15％的范围。该情况下，所述诱导工序可援用例如国际公开第2010/013845号公报的记载。
本发明的维持培养方法可以在例如所述诱导工序后选拔所述iPS细胞。所述选拔可以利用例如前述的标记物，作为具体例，可以基于所形成的集落的形状进行选拔，也可以通过重编程诱导的标记物基因(Oct3、Oct4、Nanog等)或与该基因的表达联动的标记物的表达进行选拔，也可以以碱性磷酸酶的活性作为指标进行选拔。
作为其他的具体例，所述多能细胞为ES细胞的情况下，可列举出以下的例子。
所述诱导工序可以通过例如对从动物的囊胚分离的细胞块进行培养来实施。作为具体例，所述ES细胞的诱导方法可以参照下述参考文献1。所述对象细胞的来源可以援用例如前述的多能细胞的来源的说明。
参考文献1：Thomson JA et al.,“Embryonic stem cell lines derived fromhuman blastocysts.”,Science,1998,vol.282,pages 1145-1147
所述诱导工序中的培养条件可以援用例如iPS细胞的诱导工序中的培养条件的说明。
本发明的维持培养方法可以在例如所述诱导工序后选拔所述ES细胞。所述选拔可以利用例如前述的标记物，作为具体例，可以基于所形成的集落的形状进行选拔，也可以通过ES细胞的标记物基因(Oct3、Oct4、Nanog、ECAD等)或与该基因的表达联动的标记物的表达进行选拔，也可以以碱性磷酸酶的活性作为指标进行选拔。
接着，所述维持培养工序中，在微小气泡的存在下对多能细胞进行维持培养。具体而言，所述维持培养工序可以通过例如在包含所述微小气泡的培养基(培养液)存在下对多能细胞进行维持培养来实施。该情况下，使所述培养基中含有所述微小气泡。因此，所述培养基也可以使用例如本发明的维持组合物或维持培养基。所述培养基优选例如在培养开始后定期(例如每1或2天)进行培养基更换。所述培养基更换是更换培养中的培养基的一部分或全部。
所述维持培养工序中，所述微小气泡在维持培养的整个期间或一部分期间存在，优选在维持培养的整个期间存在。在所述维持培养工序中，在一部分期间存在有微小气泡的情况下，所述维持培养工序中，所述微小气泡存在的期间以所述维持培养工序的整个期间作为基准计，为例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％。所述维持培养工序中的微小气泡的密度和特性可以援用例如前述的说明。
在所述维持培养工序的整个期间存在有所述微小气泡的情况下，可以在所述维持培养工序的开始时使用包含所述微小气泡的培养基，也可以在所述维持培养工序开始时添加所述本发明的维持组合物或维持培养基。另外，在所述维持培养工序的整个期间存在有所述微小气泡的情况下，所述培养基更换中，更换成含有所述微小气泡的培养基。所述微小气泡的密度是在例如所述维持培养工序的开始时和/或培养基更换时添加的培养基或刚添加之后的培养基中的微小气泡的密度。
在所述维持培养工序的一部分期间存在有所述微小气泡的情况下，可以在所述维持培养工序开始时使用包含所述微小气泡的培养基，也可以在所述维持培养工序的开始时或开始后添加所述本发明的维持组合物或维持培养基。另外，在所述维持培养工序的一部分期间存在有所述微小气泡的情况下，在所述培养基更换中，可以更换成含有所述微小气泡的培养基，也可以更换为实质上不含有所述微小气泡的培养基。所述“实质上不含有微小气泡”是指例如在所述培养基中微小气泡的密度为检测限以下。所述微小气泡的密度是例如在所述维持培养工序的开始时和/或培养基更换时，含有所述微小气泡的、所添加的培养基或刚添加之后的培养基中的微小气泡的密度。
对于所述维持培养工序开始时的多能细胞的密度，没有特别的限定，用平板等细胞培养容器进行培养的情况下，所述密度为例如1×101～1×105细胞/cm2、1×101～5×105细胞/cm2，优选为1×105～5×105细胞/cm2。
所述维持培养工序例如可以通过针对所述诱导工序中得到的多能细胞直接供给而开始，也可以通过对所述诱导工序中得到的多能细胞或传代中的多能细胞等进行回收、接种而开始。后者的情况下，所述多能细胞可以例如分离成单个细胞而进行接种，也可以接种回收的细胞块。在分离成所述单个细胞的情况下，所述单个细胞可以例如通过蛋白酶、钙螯合物等对所述回收的多能细胞进行处理来制备。所述蛋白酶可列举出例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶等。在接种所述单个细胞的情况下，所述维持培养工序例如由于能够提高所述多能细胞的存活率，所以优选在ROCK抑制剂的存在下实施。所述ROCK抑制剂可列举出例如Y-27632(CAS No.：146986-50-7)、Fasudil/HA1077(Cas No.:105628-07-7)、H-1152(CASNo.:871543-07-6)、WF-5362(CAS No.:539857-64-2)等。
对于所述维持培养工序中的培养条件，没有特别的限定，可以采用多能细胞的维持培养中的一般条件。作为具体例，培养温度可列举出例如30～40℃。培养中的CO2浓度可列举出例如2～10％。pH为例如6.5～7.8，优选为7～7.8或7.2～7.6。所述培养优选在湿润环境下进行。作为具体例，所述培养条件为例如所述培养温度为约37℃、CO2浓度为约5％，湿润环境下。所述维持培养工序中的培养天数为例如1～10天。
所述维持培养工序可以在饲养细胞非存在下实施，也可以在饲养细胞存在下(例如、饲养细胞上)实施。后者的情况下，所述饲养细胞优选预先被处理成不会增殖的饲养细胞，作为具体例，优选为用丝裂霉素C等增殖抑制剂进行了处理的饲养细胞。所述饲养细胞可以援用前述的说明。
在饲养细胞非存在下实施所述维持培养工序的情况下，所述维持培养工序优选在细胞外基质的存在下进行实施。该情况下、所述维持培养工序可以例如使用用所述细胞外基质包覆的细胞培养器具等实施。所述细胞外基质是指例如成为细胞支架的分子。
所述细胞外基质可列举出例如：弹性蛋白；副层连蛋白；I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白等胶原蛋白；腱生蛋白；原纤蛋白；纤维粘连蛋白；层粘连蛋白；玻连蛋白(Vitronectin)；由硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角蛋白、硫酸皮肤素等硫酸化糖胺聚糖与核蛋白质构成的蛋白聚糖；硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角蛋白、硫酸皮肤素、透明质酸等糖胺聚糖；Synthemax(注册商标、玻连蛋白衍生物)、Matrigel(注册商标、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、副层连蛋白/巢蛋白等的混合物)等；优选为层粘连蛋白。所述层粘连蛋白可列举出例如层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白211、层粘连蛋白213、层粘连蛋白222、层粘连蛋白311(层粘连蛋白3A11)、层粘连蛋白332(层粘连蛋白3A32)、层粘连蛋白321(层粘连蛋白3A21)、层粘连蛋白3B32、层粘连蛋白411、层粘连蛋白421、层粘连蛋白423、层粘连蛋白521、层粘连蛋白522、层粘连蛋白523等。需要说明的是，各层粘连蛋白中的3个数字从开头起分别是α链、β链、和γ链的构成亚基的名字。作为具体例，层粘连蛋白111由α1链、β1链、和γ1链构成。另外，层粘连蛋白3A11由α3A链、β1链和γ1链构成。所述细胞培养基材也可以包含所述蛋白质的肽片段或所述糖链的片段。作为具体例，所述蛋白质的肽片段可列举出例如层粘连蛋白的片段。所述层粘连蛋白的片段(fragment)可列举出例如前述的层粘连蛋白的片段，作为具体例，可列举出层粘连蛋白211-E8、层粘连蛋白311-E8、层粘连蛋白411-E8、层粘连蛋白511-E8。所述层粘连蛋白211-E8由层粘连蛋白的α2链、β1链、和γ1链的片段构成。所述层粘连蛋白311-E8由层粘连蛋白的α3链、β1链和γ1链的片段构成。所述层粘连蛋白411-E8由层粘连蛋白的α4链、β1链、和γ1链的片段构成。所述层粘连蛋白511-E8由例如层粘连蛋白的α5链、β1链、和γ1链的片段构成。所述层粘连蛋白片段为具有整合素结合活性的片段。
所述维持培养工序中，为了维持所述多能细胞的未分化状态，优选在所述未分化维持因子的存在下进行实施。所述未分化维持因子可以援用例如前述的说明。
本发明的维持培养方法中，所述维持培养工序可以实施1次，也可以实施多次。实施多次所述维持培养工序的情况下，各维持培培养工序之间，也可以对多能细胞进行传代(传代工序)。所述传代可以例如从所述维持培养工序后的细胞培养器具等中回收细胞、并且将多能细胞接种到新的细胞培养器具中而实施。
所述传代工序中，可以从回收的细胞中评价或选拔多能细胞而进行传代。所述评价可以通过例如前述的标记物进行评价。所述选拔可以援用例如所述诱导工序中的选拔的说明。
本发明的维持培养方法例如还可以包括从维持培养的多能细胞中对目标分化细胞进行分化诱导的分化工序。所述分化细胞可以援用前述的说明。所述多能细胞～所述分化细胞的诱导方法可以例如根据所述分化细胞的种类而适宜实施。
通过本发明的维持培养方法，与实质上不包含微小气泡的、多能细胞的未分化维持培养条件相比较，能够效率更良好地在维持了未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。
＜多能细胞的制造方法＞
本发明的多能细胞的制造方法如前所述，包括通过对多能细胞在未分化状态下进行维持培养来制造多能细胞的制造工序，所述制造工序通过所述本发明的多能细胞的未分化状态下的维持培养方法进行实施。本发明的制造方法的特征在于，所述制造工序通过本发明的维持培养方法实施，其他的工序和条件没有特别的限制。通过本发明的制造方法，与实质上不包含微小气泡的、多能细胞的未分化维持培养条件相比较，能够效率更良好地在维持了未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。因此，通过本发明的制造方法，能够效率良好地制造多能细胞。本发明的制造方法可以援用所述本发明的维持组合物、维持培养基和维持培养方法的说明。
＜组合物或培养基的应用＞
本发明是用于多能细胞的未分化维持培养的、组合物或其应用，所述组合物包含微小气泡。本发明是用于多能细胞的未分化维持培养的、培养基或其应用，所述组合物包含微小气泡。本发明可以援用所述本发明的维持组合物、维持培养基、维持培养方法和制造方法的说明。
实施例
接着，针对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不限定为下述实施例。
[实施例1]
能够确认，通过本发明的维持组合物，与实质上不包含微小气泡的、多能细胞的未分化维持培养用组合物相比较，能够效率更良好地在维持了未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。
(1)材料
作为多能细胞，利用iPS细胞(人类iPS细胞系12(ChiPSC12)、Cellartis公司制)，作为多能细胞的维持培养基，使用在饲养细胞非存在下能够维持培养的培养基试剂盒(Cellartis(注册商标)DEF-CS(商标)500培养系统、Cellartis公司制)。所述培养基试剂盒具备Cellartis DEF-CS 500基本培养基(培养基)、Cellartis DEF-CS 500 COAT-1(平板包覆剂)和Cellartis DEF-CS 500Additives(培养基添加剂、DEF-CS GF-1、DEF-CS GF-2和DEF-CS GF-3)。进行冷冻的多能细胞的解冻和传代的情况下，以下述培养基组成1对上述培养基试剂盒进行混合后，在37℃下加温约30分钟后使用(传代用培养基)。需要说明的是，如后所述，实施例的维持培养基添加包含O2作为气泡成分的组合物而使用。具体而言，通过实施例1的(2)中后述的方法，在Cellartis DEF-CS 500基本培养基中导入了微小气泡之后，使用含有微小气泡的培养基，制备了维持培养用培养基和更换用培养基(维持培养基)。
(培养基组成1)
Figure BDA0004113776420000181
另外，在多能细胞的维持培养中进行培养基更换的情况下，将上述培养基试剂盒以下述培养基组成2混合后，在37℃下加温约30分钟后使用(更换用培养基)。
(培养基组成2)
Figure BDA0004113776420000191
(2)维持组合物的制造
本发明的维持组合物使用图1所示的微小气泡的制造装置100制造。如图1所示，制造装置100在三通活栓31的两通中配置有注射器32、33。制造装置100中通过三通活栓31与注射器32、33联通。首先，将注射器32从三通活栓31解除，向其内部导入20ml的CellartisDEF-CS 500基本培养基。接着，将注射器32再次与三通活栓31连接，将三通活栓31内的气体去除。所述去除后，将注射器33从三通活栓31解除，向其内部导入20ml的氧气(O2浓度：99.999(v/v)％)。然后，将注射器33再次与三通活栓31连接。所述连接之后，使注射器32、33的柱塞在外筒内连续进行10分钟活塞移动，从而制造包含O2作为气体成分的微小气泡，从而制造实施例1的维持组合物。进一步，作为参考例1的维持组合物，使所述氧气溶解于Cellartis DEF-CS 500基本培养基中，由此进行了制备。具体而言，以所述培养基与氧气的体积比成为1：1的方式分别向注射器中导入培养基与氧气。所述导入后，将所述注射器用三通活栓密封、颠倒混合，在室温(约25℃)下静置1小时。接着，将注射器内的气体更换成新的氧气之后，将注射器颠倒混合，进一步在室温下静置4小时。由此，制备了参考例1的维持组合物。然后，使用参考例1的维持组合物，制备了参考例1的维持培养用培养基和更换用培养基(维持培养基)。
针对得到的实施例1的维持组合物，静置约1小时后，使用NanoSight(注册商标)NS300(Malvern Instrument公司制)，以Default的参数对所述组合物的物性进行了测定。需要说明的是，所述测定以25℃进行。其结果，所述组合物中的微小气泡的平均直径和微小气泡的密度如以下。需要说明的是，向得到的组合物中添加少量的培养基添加剂，制备了传代用培养基和更换用培养基；添加剂的量可以实质上无视，因此下述实施例1的维持组合物可以称为维持培养用培养基和更换用培养基(维持培养基)中的微小气泡的平均直径和密度。
(实施例1的维持组合物)
平均直径：162.1±12.5nm、密度：2.94×109±6.63×108个/ml
(3)多能细胞的传代
首先，向96孔平皿(MTT分析用、Sarstedt K.K.制)、24孔平皿(碱性磷酸酶分析用、Sarstedt K.K.制)、或12孔平皿(细胞数计数和流式细胞仪用、Sarstedt K.K.制)中添加Cellartis DEF-CS COAT-1稀释液，在37℃下孵育20分钟以上，由此进行各平皿的孔的包覆。所述稀释液通过将DEF-CS COAT-1用含有Ca和Mg的Dulbecco PBS(D-PBS+/+)(PromoCell公司制、Cat No.:C-40230)进行20倍稀释而制备。
接着，从培养了所述iPS细胞的T75烧瓶中去除培养基之后，使用1ml的D-PBS(-/-)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制、Cat No.:166-23555)，进行了1次清洗。所述清洗后，添加了1.5ml的胰蛋白酶溶液(TrypLE Select、Life Technologies公司制、Cat.No.:12563-029)。将所述胰蛋白酶溶液以覆盖iPS细胞的表面整体的方式扩散之后，37℃下静置4～5分钟。在显微镜下确认iPS细胞的剥离情况后，通过轻敲而将iPS细胞剥离。所述剥离后，向所述T75烧瓶中添加13.5ml的传代用培养基，使细胞悬浮。将所述胰蛋白酶溶液和所述传代用培养基的混合液回收后、采集一部分，用台盼蓝染色后，使用细胞计数器(CountessII、Thermo Fisher Scientific公司制)计数细胞数。
在所述包覆后的平皿，以成为4.0×104细胞/cm2的方式接种计数后的iPS细胞。接种时的培养基为所述传代用培养基。所述接种后，在37℃、5％CO2的湿润环境下进行了培养。
(4)多能细胞的维持培养
接着，如图2所示，在所述培养开始后，在3～6小时和1天(24小时)、2天(48小时)和3天(72小时)，对各孔的培养基实施与实施例1的维持培养基或参考例1的维持培养基的培养基更换。
然后，在所述培养开始后96小时，将各孔的细胞在回收后供于细胞数计数、MTT分析、或流式细胞仪。另外，对于24孔平皿，直接供于碱性磷酸酶分析。需要说明的是，培养后的细胞的回收与传代时的回收同样地实施。
(5)MTT分析
MTT分析使用MTT分析试剂盒(CellTiter 96(注册商标)AQueous One SolutionCell Proliferation Assay(MTS)、Promega公司制、Cat.No.:G358A)，按照附加的流程实施。另外，关于对照，代替所述实施例1或参考例1的维持培养基而使用不含有所述微小气泡的更换用培养基，除此以外，同样地实施。然后，将对照的测定值设为100％，计算出线粒体活性的相对值。将同样的试验进行总计5次、将其平均值的结果示于图3。需要说明的是，统计处理使用了One-way ANOVA(以下，同样)。
图3是表示线粒体活性的相对值(存活率)的图。图3中，横轴表示维持培养基的种类，纵轴表示线粒体活性的相对值。如图3所示，用实施例1的维持培养基进行培养的情况下，与对照和参考例1的维持培养基相比较，线粒体活性的相对值显著地上升了。即，可知通过实施例1的维持培养基，在iPS细胞的维持培养中，使iPS细胞的存活率提高了。
(6)细胞数计数
针对从各孔中回收的细胞，使用所述细胞计数器进行计数。另外，关于对照，代替所述实施例1或参考例1的维持培养基使用所述更换用培养基，除此以外，同样地进行计数。然后，将对照的细胞数设为100％，计算出细胞数的相对值。将同样的试验进行总计3次，将其平均值的结果示于图4。
图4是表示细胞数的相对值的图。图4中，横轴表示维持培养基的种类，纵轴表示细胞数的相对值。如图4所示，用实施例1的维持培养基进行培养的情况下，与对照和参考例1的维持培养基相比较，细胞数的相对值显著地上升。与所述(3)的存活率的提高率相比较的情况下，用实施例1的维持培养基培养的情况下的iPS细胞的细胞数的增加比例大。由此可知，通过实施例1的维持培养基，在iPS细胞的维持培养中提高了iPS细胞的增殖效率。
(7)碱性磷酸酶分析
针对24孔平皿，使用碱性磷酸酶分析试剂盒(TRACP&ALP double-stain Kit、Takara Bio Inc.制、Cat.No.:MK300)，按照附加的流程进行实施。关于对照，代替所述实施例1或参考例1的维持培养基而使用所述更换用培养基，除此以外，同样地实施。将其结果示于图5。
图5是表示碱性磷酸酶染色的结果的照片。图5中的(A)表示平皿全体的照片，(B)表示平皿内的放大照片。如图5所示，针对用实施例1的维持培养基培养的iPS细胞，与用包含对照的其他维持培养基培养的iPS细胞同样地，能够确认到碱性磷酸酶活性。
(8)细胞表面标记物
针对回收的细胞，使用抗SSEA-4抗体(人/小鼠SSEA 4荧光素结合单克隆抗体、R&DSystems公司制、Cat.No.:FAB1435F)或同种型对照抗体(小鼠IgG3荧光素结合抗体、R&DSystems公司制、Cat.No.:IC007F)、抗TRA-1-60抗体(Alexa Fluor(注册商标)647小鼠抗人TRA-1-60抗原、BD Pharmingen(商标)、Cat.No.:560850)或同种型对照抗体(Alexa Fluor(注册商标)647小鼠IgM,κ同种型对照、BD Pharmingen(商标)、Cat.No.:560806)，进行了染色。所述染色后，针对得到的细胞，使用流式细胞仪(FACSCanto II、BD Biosciences公司制)测定各标记物的表达。关于对照，代替所述实施例1或参考例1的维持培养基而使用所述更换用培养基，除此以外，同样地实施。将这些结果示于图6和图7。
图6表示抗TRA-1-60抗体的染色结果，图7表示抗SSEA-4抗体的染色结果。图6和图7中，横轴表示FSC-A或荧光强度(Alexa Flour-488或647)，纵轴表示SSC-A或细胞的计数，图中的数值表示TRA-1-60阳性或SSEA-4阳性的细胞的比例。如图6和图7所示，可以确认，用实施例1的维持培养基培养后得到的iPS细胞与用包含对照的其他维持培养基培养的iPS细胞同样地，SSEA-4阳性和TRA-1-60阳性，并且阳性细胞的比例也是相同程度。即，可以确认，用实施例1的维持培养基培养后的iPS细胞维持了未分化状态。
由以上可知，通过本发明的维持组合物，与实质上不包含微小气泡的多能细胞的未分化维持培养用组合物相比较，能够效率更良好地在维持了未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。另外，可知效率良好的维持培养起因于多能细胞的存活率和增殖效率的提高。
以上，参照实施方式和实施例对本发明进行了说明，但本发明不限定于上述实施方式和实施例。本发明的构成、详细内容可以在本发明的范围内进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
本申请主张以2020年7月20日申请的日本申请特愿2020-123653为基础的优先权，可以将其公开内容全部组入。
＜附记＞
上述的实施方式和实施例的一部分或全部如以下附记所记载那样，但不限定于以下。
(附记1)
一种多能细胞的未分化维持培养用组合物，其包含微小气泡。
(附记2)
根据附记1所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述微小气泡包含选自由氢气(H2)、一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)、氧气(O2)、臭氧(O3)、氦气(He)、氩气(Ar)、氪气(Kr)、氙气(Xe)、氮气(N2)、空气、甲烷(CH4)、乙烷(CH3CH3)、丙烷(CH3CH2CH3)、氟甲烷(CH3F)、二氟甲烷(CH2F2)、四氟化碳(CF4)、和环氧乙烷(C2H4O)组成的组中的至少一种作为气体成分。
(附记3)
根据附记1或2所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述微小气泡包含氧气作为气体成分。
(附记4)
根据附记1～3中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述微小气泡中，所述气体成分被水性溶剂包围。
(附记5)
根据附记1～4中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述微小气泡的密度为5×105～5×1012个/ml。
(附记6)
根据附记1～5中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其还包含介质，所述介质为液体和固体中的至少一者。
(附记7)
根据附记1～6中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述多能细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)。
(附记8)
一种多能细胞的未分化维持培养用培养基，其包含附记1～7中任一项所述的多能细胞的未分化维持培养用组合物。
(附记9)
一种多能细胞的未分化状态下的维持培养方法，其包括：在微小气泡的存在下对多能细胞进行维持培养的维持培养工序。
(附记10)
根据附记9所述的维持培养方法，其中，所述微小气泡包含选自由氢气(H2)、一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)、氧气(O2)、臭氧(O3)、氦气(He)、氩气(Ar)、氪气(Kr)、氙气(Xe)、氮气(N2)、空气、甲烷(CH4)、乙烷(CH3CH3)、丙烷(CH3CH2CH3)、氟甲烷(CH3F)、二氟甲烷(CH2F2)、四氟化碳(CF4)、和环氧乙烷(C2H4O)组成的组中的至少一种作为气体成分。
(附记11)
根据附记9或10所述的维持培养方法，其中，所述微小气泡包含氧气作为气体成分。
(附记12)
根据附记9～11中任一项所述的维持培养方法，其中，所述微小气泡的密度为5×105～5×1012个/ml。
(附记13)
根据附记9～12中任一项所述的维持培养方法，其中，所述多能细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)。
(附记14)
一种多能细胞的制造方法，其包括：
制造工序，通过在未分化状态下维持培养多能细胞而制造多能细胞，
所述制造工序通过附记9～13中任一项所述的多能细胞的未分化状态下的维持培养方法实施。
(附记15)
一种用于多能细胞的未分化维持培养的组合物，其中，所述组合物包含微小气泡。
(附记16)
一种用于多能细胞的未分化维持培养的培养基，其中，所述培养基包含微小气泡。
产业上的可利用性
如以上说明那样，通过本发明，与实质上不包含微小气泡的多能细胞的未分化维持培养用组合物相比较，能够提高所述多能细胞的增殖率或能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率。因此，本发明在例如再生医疗领域等中是极其有用的。

Claims (13)

1.一种多能细胞的未分化维持培养用组合物，其包含微小气泡。
2.根据权利要求1所述的未分化维持培养用组合物，其中，
所述微小气泡包含选自由氢气(H2)、一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)、氧气(O2)、臭氧(O3)、氦气(He)、氩气(Ar)、氪气(Kr)、氙气(Xe)、氮气(N2)、空气、甲烷(CH4)、乙烷(CH3CH3)、丙烷(CH3CH2CH3)、氟甲烷(CH3F)、二氟甲烷(CH2F2)、四氟化碳(CF4)、和环氧乙烷(C2H4O)组成的组中的至少一种作为气体成分。
3.根据权利要求1或2所述的未分化维持培养用组合物，其中，
所述微小气泡包含氧气作为气体成分。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其中，
所述微小气泡的密度为5×105～5×1012个/ml。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其还包含介质，所述介质为液体和固体中的至少一者。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其中，
所述多能细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)。
7.一种多能细胞的未分化维持培养用培养基，其包含权利要求1～6中任一项所述的多能细胞的未分化维持培养用组合物。
8.一种多能细胞的未分化状态下的维持培养方法，其包括：
在微小气泡的存在下对多能细胞进行维持培养的维持培养工序。
9.根据权利要求8所述的维持培养方法，其中，
所述微小气泡包含选自由氢气(H2)、一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)、氧气(O2)、臭氧(O3)、氦气(He)、氩气(Ar)、氪气(Kr)、氙气(Xe)、氮气(N2)、空气、甲烷(CH4)、乙烷(CH3CH3)、丙烷(CH3CH2CH3)、氟甲烷(CH3F)、二氟甲烷(CH2F2)、四氟化碳(CF4)、和环氧乙烷(C2H4O)组成的组中的至少一种作为气体成分。
10.根据权利要求8或9所述的维持培养方法，其中，
所述微小气泡包含氧气作为气体成分。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的维持培养方法，其中，
所述微小气泡的密度为5×105～5×1012个/ml。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的维持培养方法，其中，
所述多能细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)。
13.一种多能细胞的制造方法，其包括：
制造工序，对多能细胞在未分化状态下进行维持培养，从而制造多能细胞，
所述制造工序通过权利要求8～12中任一项所述的多能细胞的未分化状态下的维持培养方法来实施。
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