WO2024010053A1 - 胚葉体細胞組成物、分化細胞組成物及び分化細胞組成物の製造方法 - Google Patents

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WO2024010053A1
WO2024010053A1 PCT/JP2023/025045 JP2023025045W WO2024010053A1 WO 2024010053 A1 WO2024010053 A1 WO 2024010053A1 JP 2023025045 W JP2023025045 W JP 2023025045W WO 2024010053 A1 WO2024010053 A1 WO 2024010053A1
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cells
cell composition
cell
differentiated
embryoid
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PCT/JP2023/025045
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一紀 中園
成亮 和佐野
元 野澤
裕子 栗本
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キリンホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to an embryoid somatic cell composition
  • an embryoid somatic cell composition comprising embryoid bodies having a specific circumference, a differentiated cell composition obtained by differentiating the embryoid somatic cell composition in vitro, and/or a method for producing the differentiated cell composition.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells, Embryonic Stem Cells, ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPS cells, iPSCs) ll, PSC) differentiate into various cells It is expected to be used as a source for cell production in the field of regenerative medicine.
  • Non-Patent Document 1 techniques for controlling differentiation from PSCs are being actively developed with the aim of producing high-yield and high-quality target cell populations in vitro.
  • an embryoid somatic cell composition having a specific circumference is related to proliferation ability or differentiation ability in the subsequent differentiation process into target cells.
  • the present invention provides an embryoid somatic cell composition that exhibits high proliferation ability and/or differentiation ability in the subsequent differentiation step into target cells, a differentiated cell composition obtained by differentiating the embryoid somatic cell composition in vitro, and/or Alternatively, the present invention aims to provide a method for producing the differentiated cell composition.
  • embryoid somatic cell compositions with a specific circumference are more effective in the subsequent differentiation process into target cells. It was discovered for the first time that it exhibits high proliferation ability and/or differentiation ability, leading to the completion of the present invention.
  • the differentiated cell composition according to [1] wherein the embryoid body has a specific circumference within ⁇ 30% of the median value.
  • a pharmaceutical composition comprising the differentiated cell composition according to any one of [1] to [7].
  • a method for producing a differentiated cell composition which comprises in vitro differentiating an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference.
  • a hematopoietic progenitor cell composition obtained by in vitro differentiation of an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference.
  • [1'] A differentiated cell composition obtained by in vitro differentiation of an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference.
  • [2'] The differentiated cell composition according to [1'], which is an embryoid body whose specific circumference is in the range of ⁇ 30% of the median value.
  • [3'] The differentiated cell composition according to [2'], wherein the median value is any value from 10 ⁇ m to 10,000 ⁇ m.
  • the differentiated cell composition according to [1'] wherein the differentiated cell composition is a blood cell composition.
  • [5'] The differentiated cell composition according to [1'], wherein the embryoid body is derived from a pluripotent stem cell.
  • a pharmaceutical composition comprising the differentiated cell composition according to any one of [1'] to [7'].
  • [9'] A method for producing a differentiated cell composition, which comprises in vitro differentiating an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference.
  • the manufacturing method according to [9'] wherein the differentiated cell composition is a blood cell composition.
  • an embryoid somatic cell composition exhibiting high proliferation ability and/or differentiation ability in the subsequent differentiation step into target cells a differentiated cell composition obtained by in vitro differentiation of the embryoid somatic cell composition, and/or a differentiated cell composition obtained by in vitro differentiation of the embryoid somatic cell composition.
  • a method for producing a differentiated cell composition, etc. can be provided.
  • FIG. 1 shows, as a boxplot, the distribution of EB size (perimeter) in a cell composition containing EBs formed from iPS cells.
  • the vertical axis indicates the peripheral length ( ⁇ m).
  • the top and bottom of the boxplot lines indicate the maximum and minimum perimeter, respectively, and the top, internal dividing line, and bottom of the box indicate the third and second quartiles (center) of the perimeter, respectively. values) and the first quartile are shown, respectively.
  • a to E on the horizontal axis correspond to three lots with conditions A to E, respectively.
  • FIG. 1 shows, as a boxplot, the distribution of EB size (perimeter) in a cell composition containing EBs formed from iPS cells.
  • the vertical axis indicates the peripheral length ( ⁇ m).
  • the top and bottom of the boxplot lines indicate the maximum and minimum perimeter, respectively,
  • the vertical axis indicates the number of viable cells (expansion rate) at the end of culture, where the number of viable cells at the start of culture is 1.
  • a to E on the horizontal axis correspond to conditions A to E, respectively.
  • the vertical axis indicates the percentage (%) of CD56(+)CD3(-) cells representing NK cells in the cell composition.
  • a to E on the horizontal axis correspond to conditions A to E, respectively.
  • the vertical axis indicates the number of NK cells (expansion rate) at the end of culture, where the number of viable cells at the start of culture is 1.
  • a to E on the horizontal axis correspond to conditions A to E, respectively.
  • FIG. 5 shows the amount of total cell proliferation when differentiation-induced CD4(+)CD8(+) T cells were induced from HPCs obtained from EB.
  • the vertical axis indicates the number of viable cells (expansion rate) at the end of culture, where the number of viable cells at the start of culture is 1.
  • Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • FIG. 6 shows the expression ratio of CD4(+)CD8(+) T cell markers in a cell composition containing CD4(+)CD8(+) T cells induced to differentiate from HPCs obtained from EB.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of CD45(+)CD3(+)CD4(+)CD8beta(CD8b)(+) cells, which represent CD4(+)CD8(+) T cells, in the cell composition. show. Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • FIG. 7 shows the amount of proliferation of CD4(+)CD8(+) T cells when differentiation was induced into CD4(+)CD8(+) T cells from HPCs obtained from EB.
  • the vertical axis indicates the number of CD4(+)CD8(+) T cells (expansion rate) at the end of culture, with the number of viable cells at the start of culture being 1.
  • Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • FIG. 8 shows the amount of total cell proliferation when differentiation of HPCs obtained from CD34-positive cells inside EBs was induced to differentiate into CD4(+)CD8(+) T cells.
  • the vertical axis indicates the number of viable cells (expansion rate) at the end of culture, where the number of viable cells at the start of culture is 1.
  • Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • Figure 9 shows the expression ratio of CD4(+)CD8(+) T cell markers in a cell composition containing CD4(+)CD8(+) T cells induced to differentiate from HPCs obtained from CD34-positive cells inside EB. show.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of CD45(+)CD3(+)CD4(+)CD8beta(CD8b)(+) cells indicating CD4(+)CD8(+) T cells in the cell composition.
  • Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • Figure 10 shows the proliferation amount of CD4(+)CD8(+) T cells in a cell composition containing CD4(+)CD8(+) T cells induced to differentiate from HPCs obtained from CD34-positive cells inside EB.
  • the vertical axis indicates the number of CD4(+)CD8(+) T cells (expansion rate) at the end of culture, where the number of viable cells at the start of culture is 1. Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • FIG. 11 shows the amount of total cell proliferation when HPCs obtained from CD34-positive cells inside EB were induced to differentiate into CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells.
  • FIG. 10 shows the proliferation amount of CD4(+)CD8(+) T cells in a cell composition containing CD4(+)CD8(+) T cells induced to differentiate from HPCs obtained from CD34-positive cells inside EB.
  • the vertical axis indicates the number of viable cells (expansion rate) at the end of culture, where the number of viable cells at the start of culture is 1.
  • Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • Figure 12 shows the expression ratio of CD8beta(+)CD8alpha(+) T cell marker in a cell composition containing CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells differentiated from HPCs obtained from CD34-positive cells inside EB. show.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells in the cell composition, indicating CD45(+)CD3(+)CD4(-)CD8bata(+)CD8alpha(+) cells. shows. Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • Figure 13 shows the proliferation amount of CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells in a cell composition containing CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells differentiated from HPCs obtained from CD34-positive cells inside EB. .
  • the vertical axis indicates the number of CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells (expansion rate) at the end of culture, where the number of viable cells at the start of culture is 1.
  • Plate and 0.5 mm on the horizontal axis correspond to plate conditions (control) and well bag conditions, respectively.
  • the present invention relates to a differentiated cell composition obtained by in vitro differentiation of an embryoid body cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference, or a method for producing the differentiated cell composition.
  • an embryoid body is a cell mass that can be differentiated into three germ layers obtained by floating culture of pluripotent stem cells.
  • the morphology of the embryoid body includes, for example, a spherical three-dimensional aggregate, and the structure thereof includes, for example, a two-layered structure of definitive ectoderm and primitive endoderm.
  • pluripotent stem cells are cells that retain the ability to differentiate into various cells, and include, for example, ESCs, iPSCs, embryonic tumor cells, and embryonic germ stem cells, but are preferably It is iPSC.
  • the origin and method of obtaining pluripotent stem cells are not particularly limited, and include, for example, methods of producing them from somatic cells using known methods, or methods of collecting them from living tissues using known methods.
  • the animals from which pluripotent stem cells, somatic cells or living tissues are derived are not particularly limited, and include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, monkeys, orangutans, chimpanzees, and humans, Preferably it is a human.
  • the biological tissue is not particularly limited as long as it contains immature cells, and examples thereof include peripheral blood, lymph nodes, bone marrow, thymus, pancreas, and umbilical cord blood.
  • the somatic cells are not limited, and include, for example, T cells, cells derived from peripheral blood, or cells derived from umbilical cord blood.
  • the somatic cell is a T cell
  • the T cell may be a cell expressing a chimeric antigen receptor described below.
  • the iPSCs may be produced from somatic cells by a known production method described below, or from the National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition, JCRB Cell Bank, American Type Culture Collection, etc. It may be obtained and used from a public bank that has already been established and stocked, or it may be obtained as a commercially available reagent from Takara Bio Co., Ltd., etc., and used.
  • iPSCs can be produced by introducing reprogramming factors into any somatic cells.
  • initialization factors include Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, Eras, ECAT15-2, Examples include genes or gene products such as Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, or Glis1. These initialization factors may be used alone, or a plurality of factors may be used in combination.
  • Examples of the iPSC manufacturing method include WO 2008/118820, WO 2009/007852, WO 2009/032194, WO 2009/058413, WO 2009/057831, and WO 2009/057831.
  • Publication No. 2009/075119 International Publication No. 2009/079007, International Publication No. 2009/091659, International Publication No. 2009/101084, International Publication No. 2009/101407, International Publication No. 2009/102983, International Publication No. International Publication No. 2009/114949, International Publication No. 2009/117439, International Publication No. 2009/126250, International Publication No. 2009/126251, International Publication No. 2009/126655, International Publication No. 2009/157593, International Publication No.
  • Endoderm is a cell that can differentiate into endodermal organs, and examples of endodermal organs include liver, pancreas, intestinal tract, lung, thyroid, parathyroid gland, and urinary tract.
  • Mesoderm is a cell that can differentiate into mesodermal organs, and examples of mesodermal organs include kidney, ureter, heart, blood, gonads, adrenal cortex, muscle, skeleton, dermis, connective tissue, and mesothelium. Can be mentioned.
  • Ectoderm is a cell that can differentiate into ectodermal organs, and examples of ectodermal organs include the brain, spinal cord, adrenal medulla, epidermis, hair, nails, skin glands, sensory organs, peripheral nerves, and crystalline lenses.
  • a cell composition means a composition containing one or more cells.
  • the cells contained in the cell composition may be composed of only a single type of cell, or may be composed of multiple types of cells.
  • the cell composition may also contain components other than cells, such as a culture medium or a storage solution.
  • an embryoid body cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference is defined as an embryoid body cell composition having a specific circumference among all embryoid bodies (number) contained in the cell composition.
  • the specific circumference is the length of the outer circumference of one embryoid body included in a specific range, and 50% or more of the embryoid bodies have the above-mentioned specific circumference.
  • the median value ⁇ 30% preferably the median value ⁇ 20%, particularly preferably the median value ⁇ 10%.
  • the specific circumference is preferably ⁇ 50% of the median value, more preferably ⁇ 30% of the median value, and particularly preferably is ⁇ 15% of the median value, and in a cell composition containing 90% or more of embryoid bodies having the aforementioned specific circumference, the specific circumference is preferably ⁇ 70% of the median value, more preferably ⁇ 70% of the median value.
  • the value is ⁇ 50%, particularly preferably the median value ⁇ 20%.
  • the median value is preferably any value between 10 ⁇ m and 10000 ⁇ m, more preferably any value between 100 ⁇ m and 5000 ⁇ m, and particularly preferably any value between 200 ⁇ m and 2000 ⁇ m.
  • the method for measuring the circumference of the embryoid body is not particularly limited as long as it is a known method for measuring the circumference of cell aggregates, but for example, a method of measuring the diameter of the outer circumference of the projection plane from a microscopic image of the cell aggregate, A method of measuring the diameter or area of a surface and calculating the perimeter, or a cell motion imaging system (Sony Imaging Products & Solutions), a planar/three-dimensional cell imaging system, an optical coherence tomography system, or a dynamic particle image analysis system (the above, Examples include measurement methods using commercially available cell imaging devices such as those manufactured by Shimadzu Corporation.
  • the median circumference of the embryoid bodies in the cell composition obtained by the above-mentioned measurement method, by performing statistical processing such as the well-known box plot method, the median circumference of the embryoid bodies in the cell composition, It is possible to confirm the distribution and the proportion of embryoid bodies having a specific circumference.
  • the median value calculated in the box plot method either an inclusive median value or an exclusive median value can be used, but an inclusive median value is preferably used.
  • the embryoid bodies are known embryonic bodies (for example, pluripotent stem cells can be obtained using a cell differentiation (differentiation induction) method including EB) formation, for example, under culture conditions that differentiate into embryoid bodies and/or culture conditions that form embryoid bodies. It can be obtained by suspension culture in a medium and differentiation. Examples of methods for obtaining embryoid bodies include the hanging drop method, the bacterial dish method, which is floating culture on a non-cell contact single cell culture dish, or the multiwell plate method using a cell non-contact multiwell plate. It will be done. Specifically, iPSCs are cultured for 1 to 10 days in a culture medium containing a ROCK inhibitor such as Y-27632 and/or basic fibroblast growth factor (bFGF) in a non-cell contact culture container. methods, etc.
  • a ROCK inhibitor such as Y-27632 and/or basic fibroblast growth factor (bFGF)
  • An embryoid somatic cell composition containing embryoid bodies having a specific circumference at a rate of 50% or more can be obtained by transferring the embryoid somatic cell composition containing embryoid bodies having various circumferences obtained by the above-mentioned method to a spheroid sorting device ( Selectively purify embryoid bodies with a specific circumference using a commercially available spheroid picking method such as Mito Kogyo, Hyundai Motor, etc., a commercially available cell sorter, or a filter described in Japanese Patent Application Publication No. 2018-102169, etc. and/or can be concentrated and obtained, and the desired ratio can be obtained by appropriately selecting the conditions for purification and/or concentration.
  • a spheroid sorting device Selectively purify embryoid bodies with a specific circumference using a commercially available spheroid picking method such as Mito Kogyo, Hyundai Motor, etc., a commercially available cell sorter, or a filter described in Japanese Patent Application Publication No. 2018-102
  • a differentiated cell composition obtained by differentiating an embryoid body cell composition is a cell composition obtained by differentiating a cell composition containing embryoid bodies, and includes, for example, hepatocytes, pancreatic cells, intestinal cells, Lung cells, thyroid cells, parathyroid cells, urinary tract cells, renal cells, ureteral cells, cardiomyocytes, blood cells, reproductive cells, adrenal cortex cells, muscle cells, skeletal muscle cells, dermal cells, connective tissue cells, mesothelium Cell compositions include cells, brain cells, spinal cord cells, adrenal medulla cells, epidermal cells, hair matrix cells, sensory organ cells, nerve cells, lens cells, or their precursor cells, and are preferably blood cells or their precursor cells.
  • a cell composition consisting of progenitor cells.
  • Blood cells or their progenitor cells are not limited to mature cells or immature cells, and include, for example, natural killer (NK) cells, B cells, T cells, NK/T cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, and neutrophils.
  • NK natural killer
  • Blood cells such as erythrocytes, eosinophils, eosinophils, basophils, mast cells, granulocytes, megakaryocytes or red blood cells, hematopoietic progenitor cells (HPC), hematopoietic stem cells (HSC), multipotent hematopoietic stem cells (MHSC), lymphocytes
  • HPC hematopoietic progenitor cells
  • HSC hematopoietic stem cells
  • MHSC multipotent hematopoietic stem cells
  • lymphocytes examples include common progenitor cells, myeloid common progenitor cells, B cells-NK cell progenitor cells, erythroid progenitor cells, granulocyte-monocyte progenitor cells, and the like.
  • the NK cell or T cell may be a cell expressing a chimeric antigen receptor (CAR) described below.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • positive markers for identifying HSC, HPC, and MHSC include CD34, CD43, CD45, or GPR56.
  • positive markers for identifying T cells include CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD8a (CD8alpha, CD8 ⁇ ), CD8b (CD8beta, CD8 ⁇ ), CD45, TCR ⁇ , or TCR ⁇ .
  • positive markers for identifying NK cells include CD3, CD7, CD8, CD16, CD27, CD56, CD57, CD45, CD94, or CD161.
  • Positive markers for identifying B cells include, for example, CD19, CD20, or CD45.
  • Examples of positive markers for identifying macrophages include CD11b (CD11beta, CD11 ⁇ ), CD14, CD16, CD45, CD64, CD68, CD80, CD86, CD163, CD206, and CD209.
  • Examples of positive markers for identifying monocytes include CD14 and CD45.
  • Positive markers for identifying dendritic cells include, for example, CD11c, CD14, CD45, CD83, CD123, or HLA-DR.
  • Positive markers for identifying neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, or granulocytes include, for example, CD11b, CD13, CD15, CD32, or CD33.
  • a positive marker is also called a cell surface marker and is a molecule that can be expressed on the surface of a target cell.
  • Target cells can be detected by detecting or not detecting the expression of at least one positive marker, specifically by not being able to detect the target positive marker within the detection sensitivity range of the detection method used.
  • antibodies specific for the desired positive marker labeled with various fluorescent dyes such as known green fluorescent protein (GFP), fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), or allophycocyanin (APC) are used. Reagents containing can be used.
  • Examples of methods used to detect target cells include methods using flow cytometry such as BD FACSymphony flow cytometer (BD Bioscience), mass cytometry such as Helios mass cytometer (Fluidigm), or Examples include a method using the CD34 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec) or a magnetic cell separation method such as the method described in Miltenyi S, et al.; Cytometry, 1990, 11, 231.
  • flow cytometry such as BD FACSymphony flow cytometer (BD Bioscience)
  • mass cytometry such as Helios mass cytometer (Fluidigm)
  • Examples include a method using the CD34 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec) or a magnetic cell separation method such as the method described in Miltenyi S, et al.; Cytometry, 1990, 11, 231.
  • the desired differentiated cells are blood cell lineage cells
  • differentiation In the process, the cells are differentiated into MHSCs such as HSCs or HPCs, which are precursor cells, and then further differentiated into blood cells for various purposes, and can be obtained.
  • MHSCs such as HSCs or HPCs
  • the cells may be used in the form of cell aggregates, or the cell aggregates may be disrupted in advance by chemical or physical means before use.
  • in vitro includes any action outside the living body, and there are no particular restrictions on the scale of the action, such as in a test tube, on a plate, in a bag, in a reactor, or in a culture tank, or on the purpose of research or industry.
  • Examples of methods for differentiating embryoid bodies into mesoderm and further culturing in a medium to differentiate into MHSC include the methods described in WO 2020/116606 or WO 2020/138371.
  • the concentration of stem cell factor (SCF) in the medium in the differentiation step is preferably 1 ng/ml to 200 ng/ml, particularly preferably about 50 ng/ml.
  • the concentration of thrombopoietin (TPO) in the medium in the differentiation step is preferably 1 ng/ml to 100 ng/ml, particularly preferably about 30 ng/ml.
  • the concentration of fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) in the medium in the differentiation step is preferably 1 ng/ml to 100 ng/ml, particularly preferably about 10 ng/ml.
  • about means including a range of ⁇ 10%.
  • examples of methods for differentiating MHSCs into CD8-positive cells include the methods described in WO 2016/076415, WO 2020/116606, or WO 2017/221975.
  • Examples of the method for differentiating MHSCs into CD4CD8 double-positive T cells include the method described in International Publication No. 2017/221975.
  • Methods for differentiating MHSCs into T cells include methods that are the same as or similar to those described above, and specifically, for example, as described in Ross N, et al.; Blood, 2005, 105(4), 1431. Methods include:
  • HSCs or HPCs into erythroid cells such as red blood cells or megakaryocytes or granulocytic cells
  • erythropoietin EPO
  • G-CSF Granulocyte Colony Stimulating Factor
  • a step of culturing or proliferating the cells may be included before or after each differentiation step.
  • the cells are cultured or grown in vitro.
  • MHSCs can be differentiated from Iriguchi S., et al.; Nat. Commun., 2021, 12 or Fernandez L., et al.; Front. Immunol., 2019, 10, etc.
  • DLL Delta-like
  • the differentiated T cells can be proliferated for 3 to 28 days under CD3 antibody stimulation.
  • Cells that express CAR are cells that have been genetically modified to express CAR and have increased specificity for cancer cells.
  • Examples of cells that express CAR include T cells that express CAR (CAR-T cells) and NK cells that express CAR (CAR-NK cells or CAR-ILCs).
  • CAR-T cells cytotoxic T cells expressing CAR are preferred.
  • CAR is a fusion protein that includes an extracellular domain that binds to an antigen and an intracellular domain derived from a polypeptide different from the extracellular domain.
  • a CAR for example, the antigen recognition site of an antibody against a specific antigen (for example, the light chain (L chain) of the variable region and the heavy chain (H chain) of the variable region), for example, A fusion protein, etc. bound to the intracellular domain of a T cell receptor such as CD3 or the intracellular domain of a T cell receptor such as CD3 and the intracellular domain of a co-stimulatory molecule such as CD28 or 4-1BB is described in the publication No. Can be mentioned.
  • the antigen recognition site of CAR can be selected depending on the target antigen, thereby making it possible to generate NK cells or T cells specific for the target antigen.
  • CD19 is used as an antigen by the method described in Stephan M., et al.; Cancer. Res., 2006, 66, 10995
  • the antigen recognition site of an anti-CD19 antibody is cloned and CAR can be created by binding to the intracellular domain of the CD3 molecule.
  • the type or number of co-stimulatory molecules to be bound can be appropriately selected by the method described in Michael C., et al.; Mol. Ther. You can adjust the duration etc.
  • the CAR gene may be introduced into cells at any step in the production of the cell composition. Specifically, in the production of a CAR-T cell composition, CAR may be introduced into somatic cells from which iPSCs are derived, and then the CAR-introduced somatic cells may be differentiated into T cells via iPSCs. After introducing CAR, the obtained iPSCs may be differentiated into T cells, or after the iPSCs are differentiated into T cells, CAR may be introduced into the obtained T cells.
  • the differentiated cell composition differentiated in vitro from the embryoid somatic cell composition of the present invention contains differentiated cells with high proliferation and/or differentiation ability, and is obtained by forming aggregates naturally. Its ability can be confirmed by comparing the embryoid somatic cell composition with a differentiated cell composition differentiated by a similar method.
  • the comparison method for example, the above-mentioned culture method and/or analysis method can be used.
  • One embodiment of the differentiated cell composition of the present invention preferably contains 50% or more of differentiated cells obtained by in vitro differentiation of embryoid bodies having a specific circumference.
  • the ratio is more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, particularly preferably 80% or more, and most preferably 90% or more. For example, percentages in the range 50-100%, 60-90% or 70-80% may be mentioned.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing a differentiated cell composition obtained by in vitro differentiation of an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference.
  • the differentiated cell composition of the present invention can be used as a cell product as a medicine, a pharmaceutical composition, or a manufacturing intermediate for the cell product or pharmaceutical composition.
  • Examples of cell products or pharmaceutical compositions used as pharmaceuticals include preventive or therapeutic agents for cancer, immune diseases, blood diseases, etc., blood products, and tissue preparations for transplantation.
  • cancer examples include renal cell carcinoma, Kaposi's sarcoma, chronic leukemia, prostate cancer, breast cancer, sarcoma, pancreatic cancer, rectal cancer, pharyngeal cancer, melanoma, colon cancer, bladder cancer, lymphoma, mast cell tumor, lung cancer, and mammary gland cancer.
  • cancer pharyngeal squamous cell carcinoma, testicular cancer, Hodgkin's lymphoma, gastrointestinal cancer, gastric cancer, and ovarian cancer.
  • immune diseases include multiple sclerosis, type I diabetes, Crohn's disease, asthma, and disorders associated with allergic antibody components (eg, rheumatoid arthritis).
  • blood diseases include aplastic anemia and the like.
  • prophylactic or therapeutic agents or blood products for blood diseases include red blood cell products, plasma products, platelet products, whole blood products, etc., and may further contain human-derived blood or contain human-derived blood. You don't have to.
  • the dosage form is not particularly limited as long as it is suitable for the subject to be administered, but examples include injections, internal medicines, etc. , external preparations, solid preparations, liquid preparations, etc.
  • the subject to be administered is not particularly limited as long as it is an animal, but examples include monkeys, mice, humans, etc., with humans being preferred.
  • the frequency and dosage per time are appropriately determined depending on the disease, sex, body weight, surface area, etc. of the subject to be administered, but the frequency is, for example, 1 to 10 times/dose.
  • the dose per dose is, for example, 10,000 to 10,000,000,000 cells/dose.
  • the cell composition of the present invention includes, in addition to the cells, culture medium components, buffers, or excipients that can be normally added, for example, to maintain the stability of the cell product for medical administration to patients or as a manufacturing intermediate in cell manufacturing. It may also contain excipients and the like.
  • the cell composition of the present invention includes, for example, cell culture medium components containing heparin or cytokines, components secreted from cells, components constituting cells such as nucleic acids, proteins, or amino acids, or extracellular components. It may also contain components constituting a matrix. Furthermore, the cell composition of the present invention may contain components for medically administering the cell product to patients, such as components such as immunosuppressants.
  • the present invention also relates to an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference.
  • the method for producing an embryoid somatic cell composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a method for producing an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference. It can be produced using a method for producing an embryoid somatic cell composition containing 50% or more of embryoid bodies having a specific circumference of .
  • Example 1 Induction of differentiation into NK cells with or without size control during EB formation
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • EBs embryoid bodies
  • Feeder-free iPS cells were maintained by culturing on a culture surface coated with iMatrix-511 (Takara Bio) and using StemFit (registered trademark) AK02N medium (Ajinomoto). iPS cells were removed using a detachment agent [1 ⁇ TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific) diluted to 1/2 with PBS, and 0.5 mol/l-EDTA solution (Thermo Fisher Scientific) was added to give a final concentration of 0.5 ⁇ TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific).
  • Hematopoietic progenitor cells were produced by inducing differentiation of iPS cells by an EB formation method. After detaching feeder-free iPS cells with a solution of 0.5x TrypLE Select and 0.75mM EDTA, they were placed on a 6-well plate (CORNING) treated with ultra-low adhesion and with diameters of 0.35, 0.50, 0. The cells were seeded at 33,237 cells/cm 2 in culture bags (Well bags) configured with well diameters of .87 mm and 1.26 mm, respectively.
  • CORNING 6-well plate
  • the cells were cultured using Stemfit (registered trademark) AK02N medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 and 10 ⁇ M CHIR99021 (Tocris Bioscience) (Day 0, 37° C., 5% CO 2 ). Further, the notation regarding each condition is as shown in Table 1.
  • the EBs prepared in the Well bag were transferred to a 6-well plate newly treated with ultra-low adhesion, and each was treated with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, The cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, and 10 ng/ml FLT3L, and the medium was replaced under the same plate conditions (Day 8, 37° C., 5% CO 2 ). Thereafter, the cells were cultured at 37° C. under 5% CO 2 until Day 15 while exchanging the medium with the same EB medium as on Day 8 once every 2 to 3 days, and HPCs were collected.
  • Figure 1 shows a boxplot of the EB perimeter obtained by the calculation method using the comprehensive median for conditions A to E (3 lots each). value, the minimum value, the difference between the median and the third quartile, the difference between the median and the first quartile, and the ratio of the difference between the median and the third quartile to the median [[( 3rd quartile) - (median)] / (median)] ⁇ 100 (%) and the ratio of the difference between the median and the 1st quartile to the median [[(1st quartile) - ( Median value)]/(median value)] ⁇ 100 (%) are shown in Tables 2 to 6, respectively.
  • the percentage of the difference between the median and the first to third quartiles of the cell composition containing EBs is , -14.5% to +15.6% for condition B (0.35mm), -12.4% to +15.3% for condition C (0.5mm), and -1 for condition D (0.87mm), respectively. 18.9% to +14.0%, -7.3% to +7.1% under condition E (1.26mm), and the EB size is controlled more uniformly than in the plate condition under all conditions where size control is performed. It was confirmed that it was done.
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • cell compositions obtained under each condition were analyzed for expression of cell surface markers by FCM (Flow Cytometry).
  • Cells were stained with CD56-FITC (Biolegend) and CD3-APC-Cy7 (Biolegend), and the expression ratio of CD56 (+) CD3 (-), a marker of NK cells, in the propidium iodide (PI) negative cell population. It was confirmed.
  • Figure 3 shows the comparison results of NK cell marker expression rates under conditions A to E.
  • Theoretical NK cell proliferation is calculated by multiplying the cell proliferation amount shown in Figure 2 by the NK cell marker expression rate shown in Figure 3. The amounts are shown in Figure 4.
  • Example 2 Induction of differentiation into CD4(+)CD8(+) T cells by presence or absence of size control during EB formation
  • RPChiPS8023G1 strain REPROCELL
  • Differentiation of iPS cells into CD4(+)CD8(+) T cells was induced.
  • HPCs were produced by the EB formation method and induced to differentiate into T cells.
  • feeder-free iPS cells were maintained by culturing on a culture surface coated with iMatrix-511 and using StemFit (registered trademark) AK02N medium. Using. iPS cells were removed using a detachment agent [1x TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific) diluted to 1/2 with PBS, and 0.5 mol/l-EDTA solution was added to give a final concentration of 0.5x TrypLE Select and 0.75 mM EDTA.
  • a detachment agent [1x TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific) diluted to 1/2 with PBS, and 0.5 mol/l-EDTA solution was added to give a final concentration of 0.5x TrypLE Select and 0.75 mM EDTA.
  • HPCs were produced by inducing differentiation of iPS cells using the EB formation method.
  • a 6-well plate (plate condition) treated with ultra-low adhesion was constructed with a well diameter of 0.50mm in the bottom surface of 50cm2.
  • Each well bag (well bag condition) was seeded at 55396 cells/cm 2 .
  • Culture was performed using Stemfit (registered trademark) AK02N medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 and 10 ⁇ M CHIR99021 (Day 0, 37° C., 5% CO 2 ).
  • VEGF-A165/ml and 50 ng/ml bFGF were added and cultured (Day 1, 37°C, 5% CO 2 ).
  • the cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, and 10 ng/ml FLT3L (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ( Day 6, 37°C, 5% CO2 ).
  • the EBs prepared in the Well bag were transferred to a 6-well plate newly treated with ultra-low adhesion, and each was treated with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, The cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, and 10 ng/ml FLT3L, and the medium was replaced under the same plate conditions (Day 8, 37° C., 5% CO 2 ). Thereafter, the cells were cultured at 37° C. under 5% CO 2 until Day 13 while exchanging the medium with the same EB medium as on Day 8 once every 2 to 3 days, and HPCs were collected.
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • CD4(+)CD8(+) T cells CD4(+)CD8 using HPCs obtained under plate conditions and well bag conditions at Day 13 Differentiation was induced into (+) T cells.
  • the collected HPCs were cultured for 28 days using STEMdiff® T Cell Kit (STEMCELL Technologies) according to the product protocol to obtain CD4(+)CD8(+) T cells.
  • Example 2 Similar to the method described in Example 1 (4), the number of living cells was counted after 28 days, and the amount of cell proliferation over 28 days under plate conditions and well bag conditions was quantified. The results are shown in FIG. 5.
  • Figure 6 shows the comparison results of the CD4(+)CD8(+) T cell marker expression ratio between the Plate condition and the Well bag condition, and the cell proliferation amount shown in Figure 5 and the CD4(+)CD8(+) The theoretical proliferation amount of CD4(+)CD8(+) T cells multiplied by the expression ratio of T cell markers is shown in FIG.
  • Example 3 Induction of differentiation into CD4(+)CD8(+) T cells using CD34-positive cells inside EB with or without size control during EB formation CD34-positive cells inside EB produced by controlling EB size
  • CD34-positive cells inside EB produced by controlling EB size
  • RPChiPS8023G1 REPROCELL
  • feeder-free iPS cells were maintained by culturing on a culture surface coated with iMatrix-511 and using StemFit (registered trademark) AK02N medium.
  • iPS cells were removed using a detachment agent [1 ⁇ TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific) diluted to 1/2 with PBS, and 0.5 mol/l-EDTA solution was added to give a final concentration of 0.5 ⁇ TrypLE Select and 0.75 mM EDTA. solution], and subcultured and cultured in a medium containing StemFit® AK02N plus 10 ⁇ M Y-27632 (37° C., 5% CO 2 ). The next day, the medium was replaced with Stemfit (registered trademark) AK02N. This operation was repeated once a week to maintain the iPS cells for 21 days.
  • Stemfit registered trademark
  • CD34-positive cells were produced by inducing differentiation of iPS cells using the EB formation method in the same manner as in the method described in Example 1 (2). .
  • a 6-well plate (plate condition) treated with ultra-low adhesion was constructed with a well diameter of 0.50mm in the bottom surface of 50cm2.
  • Each well bag (well bag condition) was seeded at 55396 cells/cm 2 .
  • Culture was performed using Stemfit (registered trademark) AK02N medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 and 10 ⁇ M CHIR99021 (Day 0, 37° C., 5% CO 2 ).
  • VEGF-A165/ml and 50 ng/ml bFGF were added and cultured (Day 1, 37°C, 5% CO 2 ).
  • 6 ⁇ M SB431542 was added and cultured (Day 2, 37° C., 5% CO 2 ).
  • the cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, and 50 ng/ml SCF (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Day 4, 37° C., 5% CO 2 ). .
  • the cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, and 10 ng/ml FLT3L (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ( Day 6, 37°C, 5% CO2 ).
  • the EBs prepared in the Well bag were transferred to a 6-well plate newly treated with ultra-low adhesion, and each was treated with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, The cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, and 10 ng/ml FLT3L, and the medium was replaced under the same plate conditions (Day 8, 37° C., 5% CO 2 ).
  • EBs were collected using a 40 ⁇ m cell strainer, and the cells inside each EB were collected in total by enzymatic treatment with Acctase (Innovative Cell Technologies). After collection, the cells were stained with CD34-PE (BD Biosciences), and each CD34-positive cell was isolated using a cell sorter (SONY).
  • Acctase Innovative Cell Technologies
  • CD34-positive cells were cultured for 28 days using STEMdiff (registered trademark) T Cell Kit (STEMCELL Technologies) according to the product protocol to obtain CD4(+)CD8(+) T cells.
  • Example 1 Similarly to the method described in Example 1 (4), the number of living cells was counted after 28 days, and the amount of cell proliferation was quantified in the plate condition and the well bag condition over 28 days. The results are shown in FIG. 8.
  • Figure 9 shows the comparison results of the CD4(+)CD8(+) T cell marker expression ratio between the Plate condition and the Well bag condition, and the cell proliferation amount shown in Figure 8 and the CD4(+)CD8(+) The theoretical proliferation amount of CD4(+)CD8(+) T cells multiplied by the expression ratio of T cell markers is shown in FIG.
  • Example 4 Induction of differentiation into CD8beta (+) CD8alpha (+) T cells using CD34-positive cells inside EB with or without size control during EB formation CD34-positive cells inside EB produced by controlling EB size
  • CD34-positive cells inside EB produced by controlling EB size
  • A18945 Thermo
  • iPS cells differentiation into CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells was induced. After culturing iPS cells without using a feeder, CD34-positive cells were produced by an EB formation method and induced to differentiate into T cells.
  • feeder-free iPS cells were maintained by culturing on a culture surface coated with iMatrix-511 and using StemFit (registered trademark) AK02N medium.
  • iPS cells were removed using a detachment agent [1 ⁇ TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific) diluted to 1/2 with PBS, and 0.5 mol/l-EDTA solution was added to give a final concentration of 0.5 ⁇ TrypLE Select and 0.75 mM EDTA. solution], and subcultured and cultured in a medium containing StemFit® AK02N plus 10 ⁇ M Y-27632 (37° C., 5% CO 2 ). The next day, the medium was replaced with Stemfit (registered trademark) AK02N. This operation was repeated once a week to maintain the iPS cells for 21 days.
  • Stemfit registered trademark
  • CD34-positive cells were produced by inducing differentiation of iPS cells using the EB formation method in the same manner as in the method described in Example 1 (2). .
  • a 6-well plate (plate condition) treated with ultra-low adhesion was constructed with a well diameter of 0.50mm in the bottom surface of 50cm2.
  • Each well bag (well bag condition) was seeded at 33237 cells/cm 2 .
  • Culture was performed using Stemfit (registered trademark) AK02N medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 and 10 ⁇ M CHIR99021 (Day 0, 37° C., 5% CO 2 ).
  • VEGF-A165/ml and 50 ng/ml bFGF were added and cultured (Day 1, 37°C, 5% CO 2 ).
  • 6 ⁇ M SB431542 was added and cultured (Day 2, 37° C., 5% CO 2 ).
  • the cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, and 50 ng/ml SCF (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Day 4, 37° C., 5% CO 2 ). .
  • the cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, and 10 ng/ml FLT3L (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ( Day 6, 37°C, 5% CO2 ).
  • the EBs prepared in the Well bag were transferred to a 6-well plate newly treated with ultra-low adhesion, and each was treated with 50 ⁇ g/ml PAA, 50 ng/ml VEGF-A165, 50 ng/ml bFGF, The cells were cultured in EB medium supplemented with 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, and 10 ng/ml FLT3L, and the medium was replaced under the same plate conditions (Day 8, 37° C., 5% CO 2 ).
  • Example 3 (2) Similarly to the method described in Example 3 (2), after 3 days, only the EBs were collected using a 40 ⁇ m cell strainer, and the cells inside each EB were completely removed by enzymatic treatment with Acctase (Innovative Cell Technologies). Recovered. After collection, the cells were stained with CD34-PE (BD Biosciences), and CD34-positive cells were isolated using a cell sorter (SONY).
  • Acctase Innovative Cell Technologies
  • CD34-positive cells were differentiated into CD4(+)CD8(+) T cells guided.
  • the collected CD34-positive cells were cultured for 28 days using STEMdiff (registered trademark) T Cell Kit (STEMCELL Technologies) according to the product protocol to obtain CD4(+)CD8(+) T cells. After culturing for 28 days, the obtained cells were used to induce differentiation into CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells.
  • Example 1 Similar to the method described in Example 1 (4), the number of viable cells was counted after 9 days, and the number of viable cells was counted in a total of 37 days from CD34 positive cells to CD8beta (+) CD8alpha (+) T cells under plate conditions and well bag conditions. The results of quantifying the amount of cell proliferation are shown in FIG.
  • FIG. 12 shows the comparison results of the CD8beta (+) CD8alpha (+) T cell marker expression ratio between the plate condition and the well bag condition.
  • FIG. 13 shows the theoretical proliferation amount of CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells multiplied by the expression ratio of T cell markers.
  • CD34-positive cells whose EB size was controlled using the well bag conditions were better than CD34-positive cells whose EB size was not controlled using the plate conditions. It was revealed that the proliferation ability in differentiation of CD34-positive cells into CD8beta(+)CD8alpha(+) T cells was improved, and the differentiation ability was equivalent or higher.

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Abstract

本発明は、その後の目的細胞への分化工程において高い増殖能又は及び／又は分化能を示す胚葉体細胞組成物、該胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物及び／又は該分化細胞組成物の製造方法等の提供を目的とする。本発明は、特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物、該胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物及び／又は該分化細胞組成物の製造方法等に関する。

Description

胚葉体細胞組成物、分化細胞組成物及び分化細胞組成物の製造方法
　本発明は、特定の周囲長を有する胚葉体からなる胚葉体細胞組成物、該胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物及び／又は該分化細胞組成物の製造方法等に関する。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）等の多能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、ＰＳＣ）は、多様な細胞へ分化する事が可能な性質（多能性）を保持しており、再生医療分野において、細胞製造の為の供給源として期待されている。
　近年は多種多様な方法がＰＳＣから目的細胞への分化を可能としている。再生医療分野において、目的細胞の純度等の品質は薬効及び安全性に直接影響する（非特許文献１）。その為、高収率且つ高品質な目的細胞集合のインビトロでの製造を目指したＰＳＣからの分化制御技術の開発が盛んに行われている。
　ＰＳＣから目的細胞への分化において、中間体として三次元の細胞凝集塊（スフェロイド）である胚葉体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｙ、ＥＢ）を形成する方法が一般的に広く用いられている。一方で、通常インビトロでのＰＳＣから胚葉体形成は培養皿上等で自然発生的に凝集体を形成させる為、粒子状である胚葉体の大きさが不均一になりやすく、胚葉体の製造の度に品質が異なる可能性があり、十分な再現性が得られない問題が指摘されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献２、非特許文献３）。
　また、胚葉体の大きさの違いにより三胚葉分化の方向性に影響を与えること、また心筋細胞への分化において胚葉体の円形度（形状）により拍動性心筋細胞への発生確率を推測できることが知られている（特許文献２、非特許文献３）。
日本国特許第6814380号公報 日本国特許第6786077号公報
Nature Biotechnology, 2009, 27(8), 743-745 Journal of Visualized Experiments, 2019, 143(e57922), 1-5 ケミカルタイムス, 2016, 3(241), 12-16
　上述したように、ＰＳＣから目的細胞への分化において、中間体として三次元の細胞凝集塊である胚葉体を形成する方法が一般的に用いられている。しかし、不均一な胚葉体細胞組成物に比べ、特定の周囲長を有する胚葉体細胞組成物が、その後の目的細胞への分化工程における増殖能又は分化能に関係することは知られていない。
　上記状況を踏まえ、高収率且つ高品質な目的細胞集合のインビトロでの製造を目指したＰＳＣからの分化を制御する技術が望まれている。即ち、本発明は、その後の目的細胞への分化工程において高い増殖能又は及び／又は分化能を示す胚葉体細胞組成物、該胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物及び／又は該分化細胞組成物の製造方法等の提供を目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、不均一な胚葉体細胞組成物に比べ、特定の周囲長を有する胚葉体細胞組成物がその後の目的細胞への分化工程において高い増殖能及び／又は分化能を示すことを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
［１］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物。
［２］前記胚葉体が特定の周囲長が中央値±３０％の範囲である胚葉体である、[１]に記載の分化細胞組成物。
［３］前記中央値が１０μｍ～１００００μｍの任意の値である、[２]に記載の分化細胞組成物。
［４］前記分化細胞組成物が血液細胞組成物である、[１]～[３]のいずれか１に記載の分化細胞組成物。
［５］前記胚葉体が多能性幹細胞由来である、[１]～[４]のいずれか１に記載の分化細胞組成物。
［６］前記胚葉体がヒト由来である、[１]～[５]のいずれか１に記載の分化細胞組成物。
［７］前記特定の周囲長を有する胚葉体をインビトロで分化させた分化細胞を５０％以上の割合で含む、[１]～[７]のいずれか１に記載の分化細胞組成物。
［８］[１]～[７]のいずれか１に記載の分化細胞組成物を含む医薬組成物。
［９］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させることを含む、分化細胞組成物の製造方法。
［１０］前記分化細胞組成物が血液細胞組成物である、[９]に記載の製造方法。
［１１］前記胚葉体細胞組成物をインビトロで造血前駆細胞組成物に分化させ、更に得られた前記造血前駆細胞組成物をインビトロで血液細胞組成物に分化させることを含む、［１０］に記載の製造方法。
［１２］更にインビトロで培養または増殖を行うことを含む、[９]～[１１]のいずれか１項に記載の製造方法。
［１３］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた造血前駆細胞組成物。
［１４］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物。
［１’］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物。
［２’］特定の周囲長が中央値±３０％の範囲である胚葉体である、［１’］に記載の分化細胞組成物。
［３’］前記中央値が１０μｍ～１００００μｍの任意の値である、［２’］に記載の分化細胞組成物。
［４’］前記分化細胞組成物が血液細胞組成物である、［１’］に記載の分化細胞組成物。
［５’］前記胚葉体が多能性幹細胞由来である、［１’］に記載の分化細胞組成物。
［６’］前記胚葉体がヒト由来である、［１’］に記載の分化細胞組成物。
［７’］前記特定の周囲長を有する胚葉体をインビトロで分化させた分化細胞を５０％以上の割合で含む、［１’］に記載の分化細胞組成物。
［８’］［１’］～［７’］のいずれか１項に記載の分化細胞組成物を含む医薬組成物。
［９’］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させることを含む、分化細胞組成物の製造方法。
［１０’］前記分化細胞組成物が血液細胞組成物である、[９’]に記載の製造方法。
［１１’］前記胚葉体細胞組成物をインビトロで造血前駆細胞組成物に分化させ、更に得られた前記造血前駆細胞組成物をインビトロで血液細胞組成物に分化させることを含む、［１０’］に記載の製造方法。
［１２’］更にインビトロで培養または増殖を行うことを含む、［９’］に記載の製造方法。
［１３’］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた造血前駆細胞組成物。
［１４’］特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物。
　本発明により、その後の目的細胞への分化工程において高い増殖能又は及び／又は分化能を示す胚葉体細胞組成物、該胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物及び／又は該分化細胞組成物の製造方法等を提供することができる。
図１は、ｉＰＳ細胞から形成したＥＢを含む細胞組成物中のＥＢサイズ（周囲長）の分布を箱ひげ図として示す。図１において、縦軸は周囲長（μｍ）を示す。箱ひげ図の線の上端及び下端はそれぞれ周囲長の最大値及び最小値をそれぞれ示し、箱の上端、内部区切り線及び下端はそれぞれ周囲長の第３四分位、第２四分位（中央値）及び第１四分位をそれぞれ示す。横軸のＡ～Ｅは条件Ａ～Ｅの３ロットにそれぞれ対応する。 図２は、ＥＢより取得したＨＰＣｓからＮＫ細胞に分化誘導した際の細胞全体の増殖量を示す（ｎ＝３）。図２において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時の生細胞数（拡大率）を示す。横軸のＡ～Ｅは条件Ａ～Ｅにそれぞれ対応する。 図３は、ＥＢより取得したＨＰＣｓから分化されたＮＫ細胞を含む細胞組成物のＮＫ細胞マーカーの発現割合を示す（ｎ＝３）。図３において、縦軸は細胞組成物中のＮＫ細胞を示すＣＤ５６（＋）ＣＤ３（－）細胞の割合（％）を示す。横軸のＡ～Ｅは条件Ａ～Ｅにそれぞれ対応する。 図４は、ＥＢより取得したＨＰＣｓからＮＫ細胞に分化誘導した際のＮＫ細胞の増殖量を示す（ｎ＝３）。図４において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時のＮＫ細胞数（拡大率）を示す。横軸のＡ～Ｅは条件Ａ～Ｅにそれぞれ対応する。 図５は、ＥＢより取得したＨＰＣｓからＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞に分化誘導した際の細胞全体の増殖量を示す。図５において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時の生細胞数（拡大率）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図６は、ＥＢより取得したＨＰＣｓから分化誘導されたＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を含む細胞組成物のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカーの発現割合を示す。図６において、縦軸は細胞組成物中のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を示すＣＤ４５（＋）ＣＤ３（＋）ＣＤ４（＋）ＣＤ８ｂｅｔａ（ＣＤ８ｂ）（＋）細胞の割合（％）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図７は、ＥＢより取得したＨＰＣｓからＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞に分化誘導した際のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の増殖量を示す。図７において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞数（拡大率）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図８は、ＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞より取得したＨＰＣｓからＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞に分化誘導した際の細胞全体の増殖量を示す。図８において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時の生細胞数（拡大率）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図９は、ＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞より取得したＨＰＣｓから分化誘導されたＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を含む細胞組成物のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカーの発現割合を示す。図９において、縦軸は細胞組成物中のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を示すＣＤ４５（＋）ＣＤ３（＋）ＣＤ４（＋）ＣＤ８ｂｅｔａ（ＣＤ８ｂ）（＋）細胞の割合（％）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図１０は、ＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞より取得したＨＰＣｓから分化誘導されたＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を含む細胞組成物のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の増殖量を示す。図１０において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞数（拡大率）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図１１は、ＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞より取得したＨＰＣｓからＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞に分化誘導した際の細胞全体の増殖量を示す。図１１において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時の生細胞数（拡大率）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図１２は、ＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞より取得したＨＰＣｓから分化誘導されたＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞を含む細胞組成物のＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞マーカーの発現割合を示す。図１２において、縦軸は細胞組成物中のＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞を示すＣＤ４５（＋）ＣＤ３（＋）ＣＤ４（－）ＣＤ８ｂａｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）細胞の割合（％）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。 図１３は、ＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞より取得したＨＰＣｓから分化誘導されたＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞を含む細胞組成物のＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞の増殖量を示す。図１３において、縦軸は培養開始時の生細胞数を１とした際の培養終了時のＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞数（拡大率）を示す。横軸のｐｌａｔｅ及び０．５ｍｍはそれぞれｐｌａｔｅ条件（コントロール）及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にそれぞれ対応する。
　本発明を以下に詳細に説明する。
　本発明は、特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物、又は該分化細胞組成物の製造方法に関する。
　本発明において、胚葉体とは多能性幹細胞を浮遊培養することによって得られる三胚葉に分化可能な細胞塊である。胚葉体の形態としては、例えば、球状の三次元の凝集塊が挙げられ、構造としては、例えば、胚体外胚葉及び原始内胚葉の二層構造が挙げられる。
　本発明において、多能性幹細胞は、多様な細胞への分化が可能な性質を保持した細胞であり、例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、胚性腫瘍細胞及び胚性生殖幹細胞等が挙げられるが、好ましくはｉＰＳＣである。
　多能性幹細胞の由来及び取得方法は、特に制限はなく、例えば、公知の手法により体細胞等から作製する方法、または、生体組織から公知の手法により採取する方法等が挙げられる。
　多能性幹細胞、体細胞又は生体組織の由来となる動物としては、特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー及びヒト等の哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。また、生体組織としては、未成熟な細胞を含有する限り特に限定されないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、すい臓及び臍帯血等が挙げられる。
　多能性幹細胞の由来が体細胞である場合、該体細胞に制限はないが、例えばＴ細胞、末梢血由来の細胞又は臍帯血由来の細胞等が挙げられる。前記体細胞がＴ細胞である場合、当該Ｔ細胞は後述のキメラ抗原受容体を発現する細胞でもよい。
　多能性幹細胞がｉＰＳＣである場合、ｉＰＳＣは後述の公知の製造方法により体細胞から作製してもよいし、国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所　ＪＣＲＢ細胞バンク若しくはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ等の既に樹立され、ストックされている公的バンクから入手し、使用してもよく、又はタカラバイオ株式会社等から市販試薬等として入手し、使用してもよい。
　ｉＰＳＣは、任意の体細胞へ初期化因子を導入し製造できる。初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３又はＧｌｉｓ１等の遺伝子又は遺伝子産物が挙げられる。これらの初期化因子を単独で用いてもよく、また複数の因子を組み合わせて用いてもよい。
　ｉＰＳＣの製造方法としては、例えば、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４号、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２号、Huangfu D., et al.; Nat. Biotechnol., 2008, 26, 795、Shi Y., et al.; Cell Stem Cell, 2008, 2, 525、Eminli S., et al.; Stem Cells, 2008, 26, 2467、Huangfu D, et al.; Nat. Biotechnol., 2008, 26, 1269、Shi Y., et al.; Cell Stem Cell, 2008, 3, 568、Zhao Y., et al.; Cell Stem Cell, 2008, 3, 475、Marson A.; Cell Stem Cell, 2008, 3, 132、Feng B., et al.; Nat. Cell Biol., 2009, 11, 197、Judson R. L., et al.; Nat. Biotechnol., 2009, 27, 459、Lyssiotis C. A., et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. U S A; 2009, 106, 8912、Kim J. B., et al.; Nature, 2009, 461, 649、Ichida J. K., et al.; Cell Stem Cell., 2009, 5, 491、Heng J. C., et al.; Cell Stem Cell, 2010, 6, 167、Han J., et al.; Nature, 2010, 463, 1096、Mali P., et al.; Stem Cells, 2010, 28, 713又はMaekawa M., et al.; Nature, 2011, 474, 225等に記載の方法が挙げられる。これらの製造方法を単独で用いてもよく、また複数の製造方法を組み合わせて用いてもよい。
　三胚葉は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉からなり、胚葉体は分化の条件により内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかに選択的に分化させることができる。
　内胚葉は、内胚葉性器官に分化可能な細胞であり、内胚葉性器官としては、例えば、肝臓、膵臓、腸管、肺、甲状腺、副甲状腺又は尿路等が挙げられる。
　中胚葉は、中胚葉性器官に分化可能な細胞であり、中胚葉性器官としては、例えば、腎臓、尿管、心臓、血液、生殖腺、副腎皮質、筋肉、骨格、真皮、結合組織又は中皮等が挙げられる。
　外胚葉は、外胚葉性器官に分化可能な細胞であり、外胚葉性器官としては、脳、脊髄、副腎髄質、表皮、毛髪・爪・皮膚腺、感覚器、末梢神経又は水晶体等が挙げられる。
　本発明において、細胞組成物とは、１又は複数の細胞を含む組成物を意味する。細胞組成物に含まれる細胞は単一の種類の細胞のみで構成されても、複数の種類の細胞から構成されてもよい。また、細胞組成物は、培地又は保存液等の細胞以外の成分を含んでもよい。
　本発明において、特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物とは、細胞組成物中に含まれる全胚葉体（個数）のうち、特定の周囲長を有する胚葉体（個数）が５０％以上の割合で含まれる細胞組成物である。該割合としては、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。例えば、５０～１００％、６０～９０％又は７０～８０％の範囲の割合が挙げられる。
　本発明において、特定の周囲長（サイズ）とは、特定の範囲に含まれる１の胚葉体の外周の長さであり、前述の特定の周囲長を有する胚葉体が５０％以上の割合で含まれる細胞組成物において、好ましくは中央値±３０％、より好ましくは中央値±２０％、特に好ましくは中央値±１０％である。
　また、前述の特定の周囲長を有する胚葉体が８０％以上の割合で含まれる細胞組成物において、特定の周囲長は好ましくは中央値±５０％、より好ましくは中央値±３０％、特に好ましくは中央値±１５％であり、前述の特定の周囲長を有する胚葉体が９０％以上の割合で含まれる細胞組成物において、特定の周囲長は好ましくは中央値±７０％、より好ましくは中央値±５０％、特に好ましくは中央値±２０％である。
　中央値としては特に制限はないが、好ましくは１０μｍ～１００００μｍの任意の値、より好ましくは１００μｍ～５０００μｍの任意の値、特に好ましくは２００μｍ～２０００μｍの任意の値である。
　胚葉体の周囲長の測定方法は、公知の細胞凝集塊の周囲長を測定方法であれば特に制限はないが、例えば、細胞凝集塊の顕微鏡画像から投影面の外周を直径計測する方法、投影面の直径若しくは面積を計測し周囲長を算出する方法又はセルモーションイメージングシステム（ソニーイメージングプロダクツ＆ソリューションズ）、平面／３次元細胞イメージングシステム、光干渉式断層撮像システム若しくはダイナミック粒子画像解析システム（以上、島津製作所）等の市販の細胞イメージング装置を用いる測定方法等が挙げられる。
　前述の測定方法で取得された細胞組成物中の全ての胚葉体の周囲長について、例えば公知の箱ひげ図法等の統計処理することにより、細胞組成物中の胚葉体の周囲長の中央値、分布及び特定の周囲長を有する胚葉体の割合等を確認することが出来る。箱ひげ図法において算出される中央値は、包括的な中央値又は排他的な中央値のいずれも用いることができるが、好ましくは包括的な中央値が挙げられる。
　胚葉体は、国際公開第２０２０／１１６６０６号、Cell, 2007, 131(5), 861、Molecular Medicine, 2000, 6, 88、又はNature Biotechnology, 2008, 26, 313等に記載の公知の胚葉体（ＥＢ）形成を含む細胞分化（分化誘導）方法を用いて取得することができるが、例えば、胚葉体に分化する培養条件及び／又は胚葉体を形成する培養条件で、多能性幹細胞を分化用培地中で浮遊培養し、分化させることで取得することができる。胚葉体の取得方法は、例えば、ハンギングドロップ法、細胞非接触性シングルセル培養皿上での浮遊培養であるバクテリアルディッシュ法又は細胞非接触性マルチウェルプレートを用いたマルチウェルプレート法等が挙げられる。具体的には、細胞非接触性培養容器内で、Ｙ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤及び／又は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）等を含む培地中にてｉＰＳＣを１～１０日間培養する方法、等が挙げられる。
　特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物は、上述の方法で取得した様々な周囲長を有する胚葉体を含む胚葉体細胞組成物をスフェロイド分取装置（水戸工業、ヤマハ発動機）等の市販のスフェロイドピッキング方法、市販のセルソーター又は日本国特開2018-102169号公報等に記載のフィルタ等を用いて特定の周囲長を有する胚葉体を選択的に精製及び／又は濃縮し、取得することができ、精製及び／又は濃縮の条件を適宜選択することで目的の割合とすることができる。
　また、多能性幹細胞を分化用培地中で浮遊培養する際に、市販の一定の細胞塊の大きさに維持制御できるような、回転羽根を有する培養装置［例えば、ｉＰＳ細胞培養用シングルユースバイオリアクター（エイブル、バイオット）］若しくは容器自身が回転する培養容器［例えば、回転浮遊培養装置（水戸工業）］等、又は特定の径を有する細胞非接触性マイクロウェルプレート、若しくはJournal of Visualized Experiments, 2019, 143, e57922、日本国特開2009-011260号公報、日本国特開2017-148001号公報、日本国特開2018-029488号公報若しくは日本国特開2019-118319号公報等に記載の公知の培養用バッグ、培養容器若しくは培養装置等を用いて培養することで、特定の周囲長を有する胚葉体を任意の割合で含む胚葉体細胞組成物を選択的に取得してもよい。
　本発明において、胚葉体細胞組成物を分化させた分化細胞組成物とは、胚葉体を含む細胞組成物から分化させて得られる細胞組成物であり、例えば、肝細胞、膵臓細胞、腸管細胞、肺細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、尿路細胞、腎細胞、尿管細胞、心筋細胞、血液細胞、生殖細胞、副腎皮質細胞、筋細胞、骨格筋細胞、真皮細胞、結合組織細胞、中皮細胞、脳細胞、脊髄細胞、副腎髄質細胞、表皮細胞、毛母細胞、感覚器細胞、神経細胞、水晶体細胞又はそれらの前駆細胞等からなる細胞組成物が挙げられ、好ましくは血液細胞又はそれらの前駆細胞からなる細胞組成物である。
　血液細胞又はその前駆細胞は、成熟細胞又は未成熟細胞の制限はなく、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、顆粒球、巨核球若しくは赤血球等の血球系細胞、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性造血幹細胞（ＭＨＳＣ）、リンパ球系共通前駆細胞、骨髄球系共通前駆細胞Ｂ細胞－ＮＫ細胞前駆細胞、赤芽球系前駆細胞、顆粒球－単球前駆細胞等が挙げられる。
　血球系細胞がＮＫ細胞又はＴ細胞である場合、当該ＮＫ細胞又はＴ細胞は後述のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞でもよい。ＨＳＣ、ＨＰＣ及びＭＨＳＣを識別するポジティブマーカーとしては、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５又はＧＰＲ５６等が挙げられる。Ｔ細胞を識別するポジティブマーカーとしては、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ８ａ（ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８α）、ＣＤ８ｂ（ＣＤ８ｂｅｔａ、ＣＤ８β）、ＣＤ４５、ＴＣＲαβ又はＴＣＲγδ等が挙げられる。ＮＫ細胞を識別するポジティブマーカーとしては、例えばＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ４５、ＣＤ９４又はＣＤ１６１等が挙げられる。Ｂ細胞を識別するポジティブマーカーとしては、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０又はＣＤ４５等が挙げられる。マクロファージを識別するポジティブマーカーとしては、例えばＣＤ１１ｂ（ＣＤ１１ｂｅｔａ、ＣＤ１１β）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６又はＣＤ２０９等が挙げられる。単球を識別するポジティブマーカーとしては、例えばＣＤ１４又はＣＤ４５等が挙げられる。樹状細胞を識別するポジティブマーカーとしては、例えばＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ８３、ＣＤ１２３又はＨＬＡ－ＤＲ等が挙げられる。好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞又は顆粒球を識別するポジティブマーカーとしては、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ３２又はＣＤ３３等が挙げられる。
　ポジティブマーカーとは、細胞表面マーカーとも称され、目的細胞の表面に発現しうる分子である。少なくとも１以上のポジティブマーカーの発現を検出する、又は検出しない、具体的には用いた検出方法の検出感度の範囲において目的のポジティブマーカーを検出できない、ことで目的細胞の検出等が可能である。ポジティブマーカーの検出には、公知の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）又はＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）等の各種蛍光色素で標識された目的のポジティブマーカーに特異的な抗体等を含有する試薬を使用できる。
　目的細胞の検出に使用する方法としては、例えば、ＢＤ　ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）等のフローサイトメトリー若しくはＨｅｌｉｏｓマスサイトメーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社）等のマスサイトメトリー等を用いた方法、又は、例えばＣＤ３４　ＭｉｃｒｏＢｅａｄ　Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いる方法若しくはMiltenyi S, et al.; Cytometry, 1990, 11, 231に記載の方法等の磁気細胞分離法等が挙げられる。
　胚葉体から目的の分化細胞にインビトロで分化させる方法は、目的とする分化細胞に応じて公知の方法を適切に選択でき、例えば、目的とする分化細胞が血球系細胞の場合には、分化の過程において、前駆細胞であるＨＳＣ又はＨＰＣ等のＭＨＳＣに分化させた後、さらに種々の目的の血球系細胞へ分化させ、取得することができる。また、胚葉体から分化する際に細胞塊の状態のまま用いても、化学的又は物理的な手段により予め細胞塊を崩壊させてから用いてもよい。
　本発明において、インビトロとは生体外であればいかなる行為も含まれ、試験管内、プレート、バッグ、リアクター若しくは培養槽等の行為のスケール、又は研究若しくは工業的等の目的等による制限は特にない。
　胚葉体を中胚葉に分化させ、さらに培地中で培養してＭＨＳＣに分化させる方法としては、例えば、国際公開第２０２０／１１６６０６号又は国際公開第２０２０／１３８３７１号に記載の方法が挙げられる。分化工程における幹細胞因子（ＳＣＦ）の培地中の濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌが好ましく、特に約５０ｎｇ／ｍｌが好ましい。分化工程におけるトロンボポエチン（ＴＰＯ）の培地中の濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、特に約３０ｎｇ／ｍｌが好ましい。分化工程におけるｆｍｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３　ｌｉｇａｎｄ（Ｆｌｔ３Ｌ）の培地中の濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、特に約１０ｎｇ／ｍｌが好ましい。ここで約とは±１０％の範囲を含むことを意味する。
　さらに、ＭＨＳＣからＣＤ８陽性細胞に分化させる方法としては、例えば、国際公開第２０１６／０７６４１５号、国際公開第２０２０／１１６６０６号又は国際公開第２０１７／２２１９７５号に記載の方法が挙げられる。ＭＨＳＣからＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞に分化させる方法としては、例えば、国際公開第２０１７／２２１９７５号等に記載の方法が挙げられる。ＭＨＳＣからＴ細胞に分化させる方法には、上述の方法と同一又は類似の方法が挙げられ、具体的には、例えば、Ross N, et al.; Blood, 2005, 105(4), 1431に記載の方法が挙げられる。
　また、ＨＳＣ又はＨＰＣから赤血球又は巨核球等の赤血球系細胞又は顆粒球系細胞に分化させる方法としては、例えば、コロニー形成試験等に用いるＥｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）及び／若しくはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　Ｃｏｌｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ（Ｇ－ＣＳＦ）等を含有した培地を用いた方法又はNotta F., et al.; Science, 2016, 351, 139に記載の方法等が挙げられる。
　本発明において、胚葉体から目的とする分化細胞に分化させる際に、それぞれの分化工程の前又は後に細胞を培養又は増殖させる工程を含んでもよい。該細胞の培養又は増殖はインビトロで行うことが好ましい。
　例えば、ＭＨＳＣからＴ細胞に分化させる方法において、ＭＨＳＣをIriguchi S., et al.; Nat. Commun., 2021, 12又はFernandez L., et al.; Front. Immunol., 2019, 10等の記載の方法にて、Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ（ＤＬＬ）４を用いた培養の条件にて、約３週間細胞を増殖させ、その後上述の方法でＴ細胞に分化させることができる。また、上述の方法で予めＭＨＳＣからＴ細胞に分化させた後に、ＣＤ３抗体刺激下にて、３日～２８日間、分化させたＴ細胞を増殖させることができる。
　ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、がん細胞への特異性を高めた細胞である。ＣＡＲを発現する細胞としては、例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）又はＣＡＲを発現するＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞又はＣＡＲ－ＩＬＣ）等が挙げられる。ＣＡＲ－Ｔ細胞としては、ＣＡＲを発現する細胞傷害性Ｔ細胞が好ましい。
　ＣＡＲとは、抗原に結合する細胞外ドメインと、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する細胞内ドメインとを含む融合タンパク質である。ＣＡＲとしては、例えば、特定の抗原に対する抗体の抗原認識部位（例えば、可変領域の軽鎖（Ｌ鎖）及び可変領域の重鎖（Ｈ鎖）等）を、例えば、日本国特表２０１５－５０９７１６号公報に記載ＣＤ３等のＴ細胞受容体の細胞内ドメイン又はＣＤ３等のＴ細胞受容体の細胞内ドメイン及びＣＤ２８又は４－１ＢＢ等の共刺激分子の細胞内ドメインと結合させた融合タンパク質等が挙げられる。
　ＣＡＲの抗原認識部位は目的とする抗原に応じて選択でき、それにより目的の抗原に対して特異的なＮＫ細胞又はＴ細胞を作製できる。例えば、Claudia M., et al.; Cancer. Res., 2006, 66, 10995に記載の方法等により、ＣＤ１９を抗原とする場合、抗ＣＤ１９抗体の抗原認識部位をクローニングし、該抗原認識部位とＣＤ３分子の細胞内ドメインとを結合し、ＣＡＲを作製できる。また、例えば、Michael C., et al.; Mol. Ther., 2009, 17, 1453に記載の方法等により、結合する共刺激分子の種類又は数等を適宜選択し、活性化の強さ又は持続時間等を調整できる。
　細胞へのＣＡＲ遺伝子の導入は、細胞組成物の製造におけるいかなる工程でなされてもよい。具体的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞組成物の製造において、ｉＰＳＣの由来となる体細胞にＣＡＲを導入した後に、ＣＡＲを導入した体細胞からｉＰＳＣを経てＴ細胞に分化させてもよく、ｉＰＳＣにＣＡＲを導入した後に、得られたｉＰＳＣをＴ細胞に分化させてもよく、また、ｉＰＳＣからＴ細胞まで分化させた後に、得られたＴ細胞にＣＡＲを導入してもよい。
　本発明の胚葉体細胞組成物からインビトロで分化させた分化細胞組成物は、増殖能及び／又は分化能が高い分化細胞を含有しており、従来の自然発生的に凝集体を形成させ取得した胚葉体細胞組成物を同様の方法により分化させた分化細胞組成物と比較することでその能力を確認できる。比較方法としては、例えば、上述の培養方法及び／又は分析方法等を用いることができる。
　本発明の分化細胞組成物の一態様としては、特定の周囲長を有する胚葉体をインビトロで分化させた分化細胞を５０％以上の割合で含むことが好ましい。該割合は、より好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。例えば、５０～１００％、６０～９０％又は７０～８０％の範囲の割合が挙げられる。
　また、本発明は、特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物を含む医薬組成物に関する。
　本発明の分化細胞組成物は、医薬としての細胞製品、医薬組成物又は該細胞製品若しくは医薬組成物の製造中間体等として用いることができる。医薬としての細胞製品又は医薬組成物としては、例えば、癌、免疫疾患又は血液疾患等の予防剤もしくは治療剤、血液製剤又は移植用組織製剤が挙げられる。
　癌としては、例えば、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、ホジキンリンパ腫、消化管癌、胃癌及び卵巣癌等が挙げられる。
　免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、クローン病、喘息、およびアレルギー抗体成分に関連する障害（例えば、関節リウマチ）等が挙げられる。血液疾患としては、例えば、再生不良貧血等が挙げられる。
　血液疾患の予防剤もしくは治療剤又は血液製剤としては、例えば、赤血球製剤、血漿製剤、血小板製剤又は全血製剤等が挙げられ、更にヒト由来の血液を含んでもよいし、ヒト由来の血液を含まなくてもよい。
　本発明の細胞組成物を医薬としての細胞製品又は医薬組成物に用いる場合、剤形としては、投与する対象に適切な剤形であれば特に制限はないが、例えば、注射剤、内用剤、外用剤、固形製剤又は液状製剤等が挙げられる。
　投与対象としては、動物であれば特に制限はないが、例えばサル、マウス、ヒト等が挙げられ、好ましくはヒトである。本発明の細胞組成物をヒトに投与する場合、頻度及び１回あたりの投与量は投与する対象の疾患、性別、体重又は表面積等により適切に設定されるが、頻度は例えば１～１０回／日であり、１回あたりの投与量は例えば１００００～１００００００００００細胞数／回である。
　本発明の細胞組成物は、細胞に加えて、例えば、細胞製品を医学的に患者に投与する為又は細胞製造に製造中間体として安定に維持する為に通常添加できる培地成分、緩衝剤又は賦形剤等を含んでもよい。
　本発明の細胞組成物は、具体的には、例えば、ヘパリン若しくはサイトカイン類を含む細胞培養用の培地成分、細胞から分泌された成分、核酸、タンパク質若しくはアミノ酸等の細胞を構成する成分又は細胞外マトリクスを構成する成分等を含んでもよい。また、本発明の細胞組成物には、細胞製品を医学的に患者に投与する為の成分、例えば免疫抑制剤等の成分を含んでもよい。
　また、本発明は、特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物に関する。
　本発明の胚葉体細胞組成物の製造方法は、特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物を製造する方法であれば、特に限定されないが、例えば、上述の特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物の製造方法を用いて製造できる。
　以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ＥＢ形成時のサイズ制御の有無によるＮＫ細胞への分化誘導
　胚葉体（ＥＢ）のサイズを制御して作製した造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）の分化能力を評価するために２０１Ｂ７株ｉＰＳ細胞からＮＫ細胞への分化誘導を行った。フィーダーを用いずにｉＰＳ細胞を培養後、ＥＢ形成法によるＨＰＣｓ作製を行い、ＮＫ細胞に分化誘導した。
　（１）フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持
　フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（タカラバイオ）をコートした培養表面で培養し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を用いた。ｉＰＳ細胞を剥離剤［１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで１／２に希釈し、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、終濃度０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液］を用いて剥離し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎに１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）を加えた培地に継代、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、Ｓｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎで培地交換を行った。この操作を週に一度繰り返し、２１日間ｉＰＳ細胞を維持した。
　（２）ｉＰＳ細胞からのＥＢ形成及びＥＢから造血前駆細胞への分化
　ｉＰＳ細胞をＥＢ形成法で分化誘導することにより、造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）を作製した。フィーダーフリーｉＰＳ細胞を０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液で剥離した後、超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＣＯＲＮＩＮＧ）及び底面５０ｃｍ２中に直径０．３５、０．５０、０．８７、１．２６ｍｍのＷｅｌｌ径で構成された培養ｂａｇ（Ｗｅｌｌ　ｂａｇ）にそれぞれ３３２３７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１０μＭ　Ｙ－２７６３２及び１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加したＳｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地を用いて培養した（Ｄａｙ０、３７℃、５％ＣＯ２）。また、各条件に関する表記は表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　翌日、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２％ＰＳＧ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、４００μＭモノチオグリセロ一ル（富士フィルム和光純薬）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地（ＥＢ培地）に５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５（富士フィルム和光純薬）及び５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（富士フィルム和光純薬）を加えて培養した（Ｄａｙ１、３７℃、５％ＣＯ２）。
　翌日、６μＭ　ＳＢ４３１５４２（富士フィルム和光純薬）を添加して培養した（Ｄａｙ２、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ４、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ（富士フィルム和光純薬）及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ６、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件では、Ｗｅｌｌ　ｂａｇで作製したＥＢを新たに超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにそれぞれ移した後、それぞれを５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌを添加したＥＢ培地で培養し、ｐｌａｔｅ条件は同培地条件で培地交換を行った（Ｄａｙ８、３７℃、５％ＣＯ２）。
　その後、さらに２～３日に１回Ｄａｙ８時と同様のＥＢ培地で培地交換を行いながらＤａｙ１５まで細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、ＨＰＣｓを回収した。
　（３）ＥＢの周囲長測定
　（２）Ｄａｙ８時におけるｐｌａｔｅ条件およびＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にてそれぞれ得られた細胞組成物中に含まれるＥＢの周囲長を測定し、ＥＢのサイズを定量化した。測定及びサイズ定量化にはキーエンス社の蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ８００）及び同機種の解析ソフト（ＢＺ－Ｘ８００　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いた。
　条件Ａ～Ｅ（各３Ｌｏｔ）における、包括的中央値を用いた計算方法により取得されたＥＢ周囲長の箱ひげ図を図１に、ＥＢ周囲長の中央値（第２四分位）、最大値、最小値、中央値と第３四分位との差分、中央値と第１四分位との差分、並びに中央値に対する中央値と第３四分位との差分の割合〔［（第３四分位）－（中央値）］／（中央値）〕×１００（％）及び中央値に対する中央値と第１四分位との差分の割合〔［（第１四分位）－（中央値）］／（中央値）〕×１００（％）を表２～６にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＥＢのサイズ制御を行っていない条件Ａ（ｐｌａｔｅ条件）で得られたＥＢを含む細胞組成物のうち、５０％の割合のＥＢは中央値を挟んで第１四分位～第３四分位の間に含まれており、中央値に対する差分の割合は－３１．３％～＋６２．６％の範囲であった。
　同様に、ＥＢのサイズ制御を行った条件Ｂ～Ｅ（Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件）において、ＥＢを含む細胞組成物のうち、中央値と第１四分位～第３四分位との差分の割合は、それぞれ、条件Ｂ（０．３５ｍｍ）で－１４．５％～＋１５．６％、条件Ｃ（０．５ｍｍ）で－１２．４％～＋１５．３％、条件Ｄ（０．８７ｍｍ）で－１８．９％～＋１４．０％、条件Ｅ（１．２６ｍｍ）で－７．３％～＋７．１％であり、サイズ制御を行ったすべての条件でｐｌａｔｅ条件よりもＥＢサイズが均一に制御できていることが確認された。
　（４）造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）からＮＫ細胞への分化
　（２）Ｄａｙ１５時におけるｐｌａｔｅ条件およびＷｅｌｌ　ｂａｇ条件（条件Ａ～Ｅ）にてそれぞれ得られたＨＰＣｓを用いてＮＫ細胞に分化誘導した。
　ＤＭＥＭ培地（富士フィルム和光純薬）に２０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％ＰＳＧを添加した基礎培地に、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）を添加した分化培地で３～４日に１回培地交換しながら４９日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
　４９日後に生細胞数をカウントし、条件Ａ～Ｅにおける４９日間での細胞の増殖量を定量化した結果を図２に示す。
　また、それぞれの条件で得られた細胞組成物について、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）による細胞表面マーカーの発現解析を行った。細胞は、ＣＤ５６－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性細胞集団中のＮＫ細胞のマーカーであるＣＤ５６（＋）ＣＤ３（－）の発現割合を確認した。
　条件Ａ～ＥにおけるＮＫ細胞マーカー発現割合の比較結果を図３に、図２で示した細胞増殖量と図３で示したＮＫ細胞マーカーの発現割合とを掛け合わせた理論上のＮＫ細胞の増殖量を図４に示す。
　図２、３及び４の結果より、条件Ａ（ｐｌａｔｅ条件）により得られたＥＢのサイズが制御されていないＨＰＣｓより、ＥＢ形成時の大きさに関わらず、条件Ｂ～Ｅ（Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件）により得られたＥＢのサイズが制御されたＨＰＣｓの方が、ＨＰＣｓからＮＫ細胞への分化における増殖能および分化能が向上することが明らかとなった。
［実施例２］ＥＢ形成時のサイズ制御の有無によるＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化誘導
　ＥＢサイズを制御して作製したＨＰＣｓの分化能力を評価するためにＲＰＣｈｉＰＳ８０２３Ｇ１株（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ）ｉＰＳ細胞からＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化誘導を行った。フィーダーを用いずにｉＰＳ細胞を培養後、ＥＢ形成法によるＨＰＣｓ作製を行い、Ｔ細胞に分化誘導した。
　（１）フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持
　実施例１（１）記載の方法と同様に、フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をコートした培養表面で培養し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地を用いた。ｉＰＳ細胞を剥離剤［１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで１／２に希釈し、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液を添加し、終濃度０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液］を用いて剥離し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎに１０μＭ　Ｙ－２７６３２を加えた培地に継代、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、Ｓｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎで培地交換を行った。この操作を週に一度繰り返し、２１日間ｉＰＳ細胞を維持した。
　（２）ｉＰＳ細胞からのＥＢ形成及びＥＢから造血前駆細胞への分化
　実施例１（２）記載の方法と同様に、ｉＰＳ細胞をＥＢ形成法で分化誘導することにより、ＨＰＣｓを作製した。フィーダーフリーｉＰＳ細胞を０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液で剥離した後、超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ｐｌａｔｅ条件）及び底面５０ｃｍ２中に直径０．５０ｍｍのＷｅｌｌ径で構成されたＷｅｌｌ　ｂａｇ（Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件）にそれぞれ５５３９６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１０μＭ　Ｙ－２７６３２及び１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＳｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地を用いて培養した（Ｄａｙ０、３７℃、５％ＣＯ２）。
　翌日、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．２％ＰＳＧ、４００μＭモノチオグリセロ一ルを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地（ＥＢ培地）に５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ－４、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５及び５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを加えて培養した（Ｄａｙ１、３７℃、５％ＣＯ２）。
　翌日、６μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加して培養した（Ｄａｙ２、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ４、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ６、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件では、Ｗｅｌｌ　ｂａｇで作製したＥＢを新たに超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにそれぞれ移した後、それぞれを５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌを添加したＥＢ培地で培養し、ｐｌａｔｅ条件は同培地条件で培地交換を行った（Ｄａｙ８、３７℃、５％ＣＯ２）。
　その後、さらに２～３日に１回Ｄａｙ８時と同様のＥＢ培地で培地交換を行いながらＤａｙ１３まで細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、ＨＰＣｓを回収した。
　（３）造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）からＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化
　（２）Ｄａｙ１３時におけるｐｌａｔｅ条件およびＷｅｌｌ　ｂａｇ条件にてそれぞれ得られたＨＰＣｓを用いてＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞に分化誘導した。
　回収したＨＰＣｓからＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製品プロトコルに従って２８日間培養し、ＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を取得した。
　実施例１（４）記載の方法と同様に、２８日後に生細胞数をカウントし、ｐｌａｔｅ条件及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件における２８日間での細胞の増殖量を定量化した結果を図５に示す。
　また、それぞれの条件で得られた細胞組成物について、ＦＣＭによる細胞表面マーカーの発現解析を行った。細胞は、ＣＤ８ｂｅｔａ－ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４５－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性細胞集団中のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカーであるＣＤ４５（＋）ＣＤ３（＋）ＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）の発現割合を確認した。
　Ｐｌａｔｅ条件及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカー発現割合の比較結果を図６に、図５で示した細胞増殖量と図６で示したＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカーの発現割合とを掛け合わせた理論上のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の増殖量を図７に示す。
　図５、６及び７の結果より、ｐｌａｔｅ条件により得られたＥＢのサイズが制御されていないＨＰＣｓより、Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件により得られたＥＢのサイズが制御されたＨＰＣｓの方が、ＨＰＣｓからＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化における増殖能および分化能が向上することが明らかとなった。
［実施例３］ＥＢ形成時のサイズ制御の有無によるＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞を用いたＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化誘導
　ＥＢサイズを制御して作製したＥＢ内部ＣＤ３４陽性細胞の分化能力を評価するためにＲＰＣｈｉＰＳ８０２３Ｇ１株（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ）ｉＰＳ細胞からＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化誘導を行った。フィーダーを用いずにｉＰＳ細胞を培養後、ＥＢ形成法によるＣＤ３４陽性細胞作製を行い、Ｔ細胞に分化誘導した。
　（１）フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持
　実施例１（１）記載の方法と同様に、フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をコートした培養表面で培養し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地を用いた。ｉＰＳ細胞を剥離剤［１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで１／２に希釈し、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液を添加し、終濃度０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液］を用いて剥離し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎに１０μＭ　Ｙ－２７６３２を加えた培地に継代、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、Ｓｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎで培地交換を行った。この操作を週に一度繰り返し、２１日間ｉＰＳ細胞を維持した。
　（２）ｉＰＳ細胞からのＥＢ形成及びＥＢからＣＤ３４陽性細胞への分化
　実施例１（２）記載の方法と同様に、ｉＰＳ細胞をＥＢ形成法で分化誘導することにより、ＣＤ３４陽性細胞を作製した。フィーダーフリーｉＰＳ細胞を０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液で剥離した後、超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ｐｌａｔｅ条件）及び底面５０ｃｍ２中に直径０．５０ｍｍのＷｅｌｌ径で構成されたＷｅｌｌ　ｂａｇ（Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件）にそれぞれ５５３９６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１０μＭ　Ｙ－２７６３２及び１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＳｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地を用いて培養した（Ｄａｙ０、３７℃、５％ＣＯ２）。
　翌日、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．２％ＰＳＧ、４００μＭモノチオグリセロ一ルを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地（ＥＢ培地）に５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ－４、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５及び５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを加えて培養した（Ｄａｙ１、３７℃、５％ＣＯ２）。
　翌日、６μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加して培養した（Ｄａｙ２、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ４、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ６、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件では、Ｗｅｌｌ　ｂａｇで作製したＥＢを新たに超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにそれぞれ移した後、それぞれを５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌを添加したＥＢ培地で培養し、ｐｌａｔｅ条件は同培地条件で培地交換を行った（Ｄａｙ８、３７℃、５％ＣＯ２）。
　３日後、４０μｍ　セルストレーナーを用いて、それぞれＥＢのみを回収し、さらにＡｃｃｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による酵素処理を行うことでＥＢ内部の細胞をそれぞれ全量回収した。
　回収後、ＣＤ３４－ＰＥ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を染色し、セルソーター（ＳＯＮＹ）を用いてＣＤ３４陽性細胞をそれぞれ単離した。
　（３）ＣＤ３４陽性細胞からＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化
　（２）にてそれぞれの条件で得られたＣＤ３４陽性細胞を用いてＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞に分化誘導した。
　回収したＣＤ３４陽性細胞からＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製品プロトコルに従って２８日間培養し、ＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を取得した。
　実施例１（４）記載の方法と同様に、２８日後に生細胞数をカウントし、ｐｌａｔｅ条件及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件における２８日間での細胞の増殖量を定量化した結果を図８に示す。
　また、それぞれの条件で得られた細胞組成物について、ＦＣＭによる細胞表面マーカーの発現解析を行った。細胞は、ＣＤ８ｂｅｔａ－ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４５－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性細胞集団中のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカーであるＣＤ４５（＋）ＣＤ３（＋）ＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）の発現割合を確認した。
　Ｐｌａｔｅ条件及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカー発現割合の比較結果を図９に、図８で示した細胞増殖量と図９で示したＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞マーカーの発現割合とを掛け合わせた理論上のＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の増殖量を図１０に示す。
　図８、９及び１０の結果より、ＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞を用いた場合においても、ｐｌａｔｅ条件により得られたＥＢのサイズが制御されていないＣＤ３４陽性細胞より、Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件により得られたＥＢのサイズが制御されたＣＤ３４陽性細胞の方が、ＣＤ３４陽性細胞からＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化における増殖能および分化能が向上することが明らかとなった。
［実施例４］ＥＢ形成時のサイズ制御の有無によるＥＢ内部のＣＤ３４陽性細胞を用いたＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞への分化誘導
　ＥＢサイズを制御して作製したＥＢ内部ＣＤ３４陽性細胞の分化能力を評価するためにＡ１８９４５株（Ｔｈｅｒｍｏ）ｉＰＳ細胞からＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞への分化誘導を行った。フィーダーを用いずにｉＰＳ細胞を培養後、ＥＢ形成法によるＣＤ３４陽性細胞作製を行い、Ｔ細胞に分化誘導した。
　（１）フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持
　実施例１（１）記載の方法と同様に、フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をコートした培養表面で培養し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地を用いた。ｉＰＳ細胞を剥離剤［１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで１／２に希釈し、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液を添加し、終濃度０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液］を用いて剥離し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎに１０μＭ　Ｙ－２７６３２を加えた培地に継代、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、Ｓｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎで培地交換を行った。この操作を週に一度繰り返し、２１日間ｉＰＳ細胞を維持した。
　（２）ｉＰＳ細胞からのＥＢ形成及びＥＢからＣＤ３４陽性細胞への分化
　実施例１（２）記載の方法と同様に、ｉＰＳ細胞をＥＢ形成法で分化誘導することにより、ＣＤ３４陽性細胞を作製した。フィーダーフリーｉＰＳ細胞を０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ及び０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液で剥離した後、超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ｐｌａｔｅ条件）及び底面５０ｃｍ２中に直径０．５０ｍｍのＷｅｌｌ径で構成されたＷｅｌｌ　ｂａｇ（Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件）にそれぞれ３３２３７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１０μＭ　Ｙ－２７６３２及び１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＳｔｅｍｆｉｔ（登録商標）　ＡＫ０２Ｎ培地を用いて培養した（Ｄａｙ０、３７℃、５％ＣＯ２）。
　翌日、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．２％ＰＳＧ、４００μＭモノチオグリセロ一ルを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地（ＥＢ培地）に５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ－４、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５及び５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを加えて培養した（Ｄａｙ１、３７℃、５％ＣＯ２）。
　翌日、６μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加して培養した（Ｄａｙ２、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ４、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（富士フィルム和光純薬）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ６、３７℃、５％ＣＯ２）。
　２日後、Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件では、Ｗｅｌｌ　ｂａｇで作製したＥＢを新たに超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにそれぞれ移した後、それぞれを５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－Ａ１６５、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌを添加したＥＢ培地で培養し、ｐｌａｔｅ条件は同培地条件で培地交換を行った（Ｄａｙ８、３７℃、５％ＣＯ２）。
　実施例３（２）記載の方法と同様に、３日後、４０μｍ　セルストレーナーを用いてそれぞれＥＢのみを回収し、さらにＡｃｃｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による酵素処理を行うことでＥＢ内部の細胞をそれぞれ全量回収した。
　回収後、ＣＤ３４－ＰＥ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を染色し、セルソーター（ＳＯＮＹ）を用いてＣＤ３４陽性細胞を単離した。
　（３）ＣＤ３４陽性細胞からＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞への分化
　（２）にてそれぞれの条件で得られたＣＤ３４陽性細胞を用いてＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞に分化誘導した。
　回収したＣＤ３４陽性細胞からＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製品プロトコルに従って２８日間培養し、ＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を取得した。
　２８日間の培養後、得られた細胞を用いてＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞に分化誘導した。Ａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１５％ＦＢＳ、１％ＰＳＧを添加した基礎培地に、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（富士フィルム和光純薬）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）、５００ｎｇ／ｍｌ　Ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｎＭ　Ｄｅｘａｍｔｈａｓｏｎｅ（デキサート注射液、富士製薬工業）を添加して培養した（Ｄａｙ０、３７℃、５％ＣＯ２）。
　３日後、基礎培地に１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（富士フィルム和光純薬）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）を添加して培養した（Ｄａｙ３、３７℃、５％ＣＯ２）。以降、同じ培地条件で２～３日に１回培地交換しながら９日目まで培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
　実施例１（４）記載の方法と同様に、９日後に生細胞数をカウントし、ｐｌａｔｅ条件及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件におけるＣＤ３４陽性細胞からＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞までの合計３７日間での細胞の増殖量を定量化した結果を図１１に示す。
　また、それぞれの条件で得られた細胞組成物について、ＦＣＭによる細胞表面マーカーの発現解析を行った。細胞は、ＣＤ８ｂｅｔａ－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ＣＤ８ａｌｐｈａ－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４５－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性細胞集団中のＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞マーカーであるＣＤ４５（＋）ＣＤ３（＋）ＣＤ４（－）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）ＣＤ８ｂｅｔａ（＋）の発現割合を確認した。
　Ｐｌａｔｅ条件及びＷｅｌｌ　ｂａｇ条件のＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞マーカー発現割合の比較結果を図１２に、図１１で示した細胞増殖量と図１２で示したＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞マーカーの発現割合とを掛け合わせた理論上のＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞の増殖量を図１３に示す。
　図１１、１２及び１３の結果より、ｐｌａｔｅ条件により得られたＥＢのサイズが制御されていないＣＤ３４陽性細胞より、Ｗｅｌｌ　ｂａｇ条件により得られたＥＢのサイズが制御されたＣＤ３４陽性細胞の方が、ＣＤ３４陽性細胞からＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞への分化における増殖能が向上し、またその分化能は同等以上となることが明らかとなった。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２２年７月６日付けで出願された日本特許出願（特願２０２２－１０９２２１）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (14)

  1. 　特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた分化細胞組成物。
  2. 　前記胚葉体が特定の周囲長が中央値±３０％の範囲である胚葉体である、請求項１に記載の分化細胞組成物。
  3. 　前記中央値が１０μｍ～１００００μｍの任意の値である、請求項２に記載の分化細胞組成物。
  4. 　前記分化細胞組成物が血液細胞組成物である、請求項１に記載の分化細胞組成物。
  5. 　前記胚葉体が多能性幹細胞由来である、請求項１に記載の分化細胞組成物。
  6. 　前記胚葉体がヒト由来である、請求項１に記載の分化細胞組成物。
  7. 　前記特定の周囲長を有する胚葉体をインビトロで分化させた分化細胞を５０％以上の割合で含む、請求項１に記載の分化細胞組成物。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の分化細胞組成物を含む医薬組成物。
  9. 　特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させることを含む、分化細胞組成物の製造方法。
  10. 　前記分化細胞組成物が血液細胞組成物である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 前記胚葉体細胞組成物をインビトロで造血前駆細胞組成物に分化させ、更に得られた前記造血前駆細胞組成物をインビトロで血液細胞組成物に分化させることを含む、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　更にインビトロで培養または増殖を行うことを含む、請求項９に記載の製造方法。
  13. 　特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物をインビトロで分化させた造血前駆細胞組成物。
  14. 　特定の周囲長を有する胚葉体を５０％以上の割合で含む胚葉体細胞組成物。
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