JPWO2018199186A1 - 造血前駆細胞マーカー - Google Patents
造血前駆細胞マーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018199186A1 JPWO2018199186A1 JP2019514588A JP2019514588A JPWO2018199186A1 JP WO2018199186 A1 JPWO2018199186 A1 JP WO2018199186A1 JP 2019514588 A JP2019514588 A JP 2019514588A JP 2019514588 A JP2019514588 A JP 2019514588A JP WO2018199186 A1 JPWO2018199186 A1 JP WO2018199186A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- positive
- cell
- cell population
- hematopoietic progenitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 83
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 431
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 101000773743 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 101000961065 Homo sapiens Interleukin-18 receptor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102100039340 Interleukin-18 receptor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 31
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 102000001760 Notch3 Receptor Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108010029756 Notch3 Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102100037086 Bone marrow stromal antigen 2 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 101000740785 Homo sapiens Bone marrow stromal antigen 2 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101001133085 Homo sapiens Sialomucin core protein 24 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 102100034258 Sialomucin core protein 24 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 71
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 68
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 64
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 64
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 claims description 60
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 claims description 60
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 claims description 56
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 claims description 56
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 56
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 56
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims description 47
- 101000599858 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 claims description 43
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 claims description 43
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 claims description 41
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 32
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 32
- 102100029761 Cadherin-5 Human genes 0.000 claims description 29
- 101000794587 Homo sapiens Cadherin-5 Proteins 0.000 claims description 29
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 claims description 27
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 claims description 27
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 claims description 27
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 claims description 27
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 claims description 20
- 102100036364 Cadherin-2 Human genes 0.000 claims description 20
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 20
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 claims description 20
- 101000714537 Homo sapiens Cadherin-2 Proteins 0.000 claims description 20
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 20
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 claims description 20
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 claims description 20
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 claims description 20
- 102100032999 Integrin beta-3 Human genes 0.000 claims description 20
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 20
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 claims description 20
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 claims description 20
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 claims description 19
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 claims description 19
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 8
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 73
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 73
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 27
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 16
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 5
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 5
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 102100037917 CD109 antigen Human genes 0.000 description 4
- 101000738399 Homo sapiens CD109 antigen Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 4
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 4
- 210000003317 double-positive, alpha-beta immature T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 CD426 Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000012083 mass cytometry Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 101150011813 DLL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 2
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150109170 dll4 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000006573 Chemokine CXCL12 Human genes 0.000 description 1
- 108010008951 Chemokine CXCL12 Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-UHFFFAOYSA-N [2-(1,2-dihydroxyethyl)-3-hydroxy-5-oxo-2h-furan-4-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OCC(O)C1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- NBMKJKDGKREAPL-DVTGEIKXSA-N beclomethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(Cl)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O NBMKJKDGKREAPL-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 229940092705 beclomethasone Drugs 0.000 description 1
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 208000014616 embryonal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N fludrocortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N 0.000 description 1
- 229960003336 fluorocortisol acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000000540 fraction c Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940125697 hormonal agent Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 210000002861 immature t-cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001978 pro-t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 235000011649 selenium Nutrition 0.000 description 1
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 description 1
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/505—CD4; CD8
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、次の工程を含む、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞を製造する方法を提供する。工程１：造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、 CD317、CD200 及びCD218a からなる群より選択される１種以上の分子を発現する細胞を分離する工程、及び工程２：工程１により分離された細胞を、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞に分化する工程
Description
本発明は、１種以上の造血前駆細胞マーカー（HPCマーカー）を用いたCD8ポジティブ細胞を製造する方法及び１種以上のHPCマーカーを発現する細胞集団などに関する。
（発明の背景）
T細胞は、細菌やウイルスなどの外来の病原体や癌細胞などの異常な細胞に対する免疫システムにおいて中心的な役割を果たしている。なかでも、細胞傷害性T細胞（CTL）は、その細胞表面上に存在するT細胞受容体（TCR）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原と共に提示された、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して、特異的に細胞傷害活性を発揮する。
T細胞は、細菌やウイルスなどの外来の病原体や癌細胞などの異常な細胞に対する免疫システムにおいて中心的な役割を果たしている。なかでも、細胞傷害性T細胞（CTL）は、その細胞表面上に存在するT細胞受容体（TCR）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原と共に提示された、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して、特異的に細胞傷害活性を発揮する。
ここで、大部分のCTLは、CD8シングルポジティブ（SP）細胞である。上記CD8SP細胞は、胸腺内において、TCRを発現しておらず、CD4もCD8も有さない未成熟な細胞（CD4/CD8ダブルネガティブ（本明細書では、ダブルネガティブをDNと表記することがある。）細胞）から、CD8及びCD4を発現する細胞（CD4/CD8ダブルポジティブ（本明細書では、ダブルポジティブをDPと表記することがある。）細胞）を経て、分化してくることが知られている。
上述のように、T細胞は免疫システムにおいて中心的な役割を果たしているため、T細胞の補充や再生をすることができれば、腫瘍、感染症、自己免疫不全等の疾患の予防又は治療などに極めて有効な手段となる。そのため、iPS細胞から造血前駆細胞(Hematopoietic Progenitor Cell；本明細書中、HPCと称することがある。)を誘導する方法や、さらにCD4/CD8DP細胞を誘導する方法などにより、造血前駆細胞やT細胞系列の細胞を得る試みが行われている。例えば、非特許文献１には、iPS細胞をフィーダー細胞（具体的には、OP9細胞）と共培養することで、CD34/CD43DP細胞を誘導できることが記載されている。特許文献１や非特許文献２には、ヒト多能性幹細胞から誘導したHPCを含む細胞集団から、CD43と、CD34、CD31又はCD144との発現を指標としてHPCを分離する方法、分離した細胞をT細胞系列の細胞へ分化させる方法や、多能性幹細胞からHPCへ分化させる際に、誘導初期にActivin/Nodalを作用させるか否かにより、誘導される造血系細胞の性質が異なることが記載されている。特許文献２には、フィーダーフリー条件下でCD4/CD8DPを製造する方法が記載されている。また、非特許文献３には、ヒト多能性幹細胞から造血前駆細胞を含む血液系細胞を誘導する様々な方法や、in vitroで誘導した血液系細胞の臨床での使用が進まない理由として、誘導効率の低さが挙げられている。
Choi K.D. et al., Stem Cells, 27 (2009);559-567
Kennedy M. et al., Cell Reports, 2 (2012);1722-1735
Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358
本発明は、安定的に細胞治療を提供するため、T細胞系列の細胞（例えば、CD8ポジティブ細胞(例えば、CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞)）をより多く及び/又はより高い濃度で得ること（すなわち、該細胞の製造方法を提供すること）を課題とする。また、本発明は、上記課題を解決するための造血前駆細胞を含む細胞集団を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するCD4/CD8DP細胞を製造方法の開発を行うため、HPCの表面に発現するマーカー（HPCマーカー）を同定した。さらに、HPCを含む細胞集団から、１種以上の該マーカーを用いて分離したHPCは、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞）に分化する効率が高く、増殖能力も高いこと、即ち、１種以上のHPCマーカーを用いることで、CD8ポジティブ細胞(例えば、CD4/CD8DP細胞)をより多く得ることができ、及び/又は細胞集団内により高い濃度で得ることができることを見出した。さらに、本発明の製法により、収率のバラツキが少なく、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞）を安定して提供することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］ 以下の工程を含む、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞を製造する方法。
工程１：造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程、並びに
工程２：工程1により分離された細胞を、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞に分化させる工程
［２］ 前記工程１において選択される細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、［１］に記載の方法。
［３］ 前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞を分離する工程である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記工程１に示される第１の群が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる群である、［３］に記載の方法。
［５］ 前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程である、［１］又は［２］に記載の方法。
［６］ 前記工程１に示される第２の群が、CD49f、CD51及びCD102からなる群である、［５］に記載の方法。
［７］ 前記工程１の造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［７］に記載の方法。
［９−１］ ［１］〜［８］のいずれかの方法により得られたCD4/CD8 ダブルポジティブ細胞をCD8 シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む、CD8 シングルポジティブ細胞の製造方法。
[９−２] 前記誘導する工程が、例えば、副腎皮質ホルモン剤、抗体及び/又はサイトカインの存在下でCD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養する工程を含む方法であって、好ましくは、該副腎皮質ホルモン剤がデキサメタゾンであり、及び/又は該抗体が抗CD3抗体であり、及び/又はサイトカインはIL-2である、[９−１]に記載の方法。
［１０］ 前記CD8 シングルポジティブ細胞が細胞傷害性T細胞である、［９−１］又は［９−２］に記載の方法。
［１１］ 造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離して得られる細胞集団。
［１２］ 分離された細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、［１１］に記載の細胞集団。
［１３］ 前記造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、［１１］又は［１２］に記載の細胞集団。
［１４］ 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１３］に記載の細胞集団。
［１５］ CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する造血前駆細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない造血前駆細胞の割合（該造血前駆細胞数／細胞集団に含まれる全細胞数）が40％以上である細胞集団。
［１６］ 前記割合が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる第１の群より選択される１種以上の分子をさらに発現する造血前駆細胞の割合である、［１５］に記載の細胞集団。
［１７］ 前記割合が、CD49f、CD51及びCD102 からなる第２の群より選択される１種以上の分子をさらに発現しない造血前駆細胞の割合である、［１５］に記載の細胞集団。
［１８］ CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる群より選択される１種以上の分子の各々に対する抗体を含んでなる、造血前駆細胞の分離用試薬。
［１９］ さらにCD235a、CD14、CD45、CD34及び/又はCD43に対する抗体を１種以上含んでなる、［１８］に記載の試薬。
[２０] 造血前駆細胞の表面タンパク質を検出する方法であって、該造血前駆細胞と、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109又はCD156cに特異的に結合する物質とを接触させる工程を含む、方法。
[２１] 前記物質が抗体又はその断片を含む、［２０］に記載の方法。
[２２] 前記物質がさらにフルオロフォアを含む、[２０]又は[２１]に記載の方法。
[２３] 前記造血前駆細胞に、CD34、CD43、CD14又はCD235aに特異的に結合する物質を接触させる工程をさらに含む、[２０]〜[２２]のいずれかに記載の方法。
［２４］ 造血前駆細胞の表面上の複数のタンパク質を検出する方法であって、該方法は、造血前駆細胞を、複数のタンパク質の各々に特異的に結合する物質と接触させる工程を含み、該複数のタンパク質が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156cの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７若しくは２８つの、又は全２９つの任意の組み合わせを含む、方法。
[２５] 造血前駆細胞を含む細胞集団から造血前駆細胞を選択する方法であって、［２０］〜[２４]のいずれかの方法により細胞の表面上の１種以上のタンパク質の存在又は非存在を検出する工程、並びに該１種以上のタンパク質の存在又は非存在に基づき該細胞を選択する工程であって、(i)次のタンパク質：CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325：の任意の１つ又は任意の組み合わせが該細胞の表面で検出される場合、及び／又は(ii)次のタンパク質：CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156c：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせが該細胞の表面で検出されない場合に、該細胞を選択する工程、を含む方法。
［２６］ 次のタンパク質：CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144：の任意の１つ又は任意の組み合わせが細胞の表面上で検出される場合に、該細胞を選択する、[２５]に記載の方法。
[２７] 次のタンパク質：CD49f、CD51及びCD102：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせが細胞の表面上で検出されない場合に、該細胞を選択する、[２５]又は［２６］に記載の方法。
［２８］ 造血前駆細胞を含む細胞集団から造血前駆細胞を選択する方法であって、［２０］〜[２４]のいずれかの方法により細胞の表面上の１種以上のタンパク質の存在又は非存在を検出する工程、並びに該１種以上のタンパク質の存在又は非存在に基づき、(i)CD45、CD34及び／又はCD43と、次のタンパク質：CD24、CD62L、C90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせとが、該細胞の表面上で検出された場合、並びに／又は(ii)CD14及び／若しくはCD235aが該細胞の表面上で検出されず、かつ次のタンパク質：CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156c：も検出されなかった場合に、該細胞を選択する工程を含む、方法。
［１］ 以下の工程を含む、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞を製造する方法。
工程１：造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程、並びに
工程２：工程1により分離された細胞を、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞に分化させる工程
［２］ 前記工程１において選択される細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、［１］に記載の方法。
［３］ 前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞を分離する工程である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記工程１に示される第１の群が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる群である、［３］に記載の方法。
［５］ 前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程である、［１］又は［２］に記載の方法。
［６］ 前記工程１に示される第２の群が、CD49f、CD51及びCD102からなる群である、［５］に記載の方法。
［７］ 前記工程１の造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［７］に記載の方法。
［９−１］ ［１］〜［８］のいずれかの方法により得られたCD4/CD8 ダブルポジティブ細胞をCD8 シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む、CD8 シングルポジティブ細胞の製造方法。
[９−２] 前記誘導する工程が、例えば、副腎皮質ホルモン剤、抗体及び/又はサイトカインの存在下でCD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養する工程を含む方法であって、好ましくは、該副腎皮質ホルモン剤がデキサメタゾンであり、及び/又は該抗体が抗CD3抗体であり、及び/又はサイトカインはIL-2である、[９−１]に記載の方法。
［１０］ 前記CD8 シングルポジティブ細胞が細胞傷害性T細胞である、［９−１］又は［９−２］に記載の方法。
［１１］ 造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離して得られる細胞集団。
［１２］ 分離された細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、［１１］に記載の細胞集団。
［１３］ 前記造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、［１１］又は［１２］に記載の細胞集団。
［１４］ 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１３］に記載の細胞集団。
［１５］ CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する造血前駆細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない造血前駆細胞の割合（該造血前駆細胞数／細胞集団に含まれる全細胞数）が40％以上である細胞集団。
［１６］ 前記割合が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる第１の群より選択される１種以上の分子をさらに発現する造血前駆細胞の割合である、［１５］に記載の細胞集団。
［１７］ 前記割合が、CD49f、CD51及びCD102 からなる第２の群より選択される１種以上の分子をさらに発現しない造血前駆細胞の割合である、［１５］に記載の細胞集団。
［１８］ CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる群より選択される１種以上の分子の各々に対する抗体を含んでなる、造血前駆細胞の分離用試薬。
［１９］ さらにCD235a、CD14、CD45、CD34及び/又はCD43に対する抗体を１種以上含んでなる、［１８］に記載の試薬。
[２０] 造血前駆細胞の表面タンパク質を検出する方法であって、該造血前駆細胞と、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109又はCD156cに特異的に結合する物質とを接触させる工程を含む、方法。
[２１] 前記物質が抗体又はその断片を含む、［２０］に記載の方法。
[２２] 前記物質がさらにフルオロフォアを含む、[２０]又は[２１]に記載の方法。
[２３] 前記造血前駆細胞に、CD34、CD43、CD14又はCD235aに特異的に結合する物質を接触させる工程をさらに含む、[２０]〜[２２]のいずれかに記載の方法。
［２４］ 造血前駆細胞の表面上の複数のタンパク質を検出する方法であって、該方法は、造血前駆細胞を、複数のタンパク質の各々に特異的に結合する物質と接触させる工程を含み、該複数のタンパク質が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156cの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７若しくは２８つの、又は全２９つの任意の組み合わせを含む、方法。
[２５] 造血前駆細胞を含む細胞集団から造血前駆細胞を選択する方法であって、［２０］〜[２４]のいずれかの方法により細胞の表面上の１種以上のタンパク質の存在又は非存在を検出する工程、並びに該１種以上のタンパク質の存在又は非存在に基づき該細胞を選択する工程であって、(i)次のタンパク質：CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325：の任意の１つ又は任意の組み合わせが該細胞の表面で検出される場合、及び／又は(ii)次のタンパク質：CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156c：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせが該細胞の表面で検出されない場合に、該細胞を選択する工程、を含む方法。
［２６］ 次のタンパク質：CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144：の任意の１つ又は任意の組み合わせが細胞の表面上で検出される場合に、該細胞を選択する、[２５]に記載の方法。
[２７] 次のタンパク質：CD49f、CD51及びCD102：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせが細胞の表面上で検出されない場合に、該細胞を選択する、[２５]又は［２６］に記載の方法。
［２８］ 造血前駆細胞を含む細胞集団から造血前駆細胞を選択する方法であって、［２０］〜[２４]のいずれかの方法により細胞の表面上の１種以上のタンパク質の存在又は非存在を検出する工程、並びに該１種以上のタンパク質の存在又は非存在に基づき、(i)CD45、CD34及び／又はCD43と、次のタンパク質：CD24、CD62L、C90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325：の任意の１つ若しくは任意の組み合わせとが、該細胞の表面上で検出された場合、並びに／又は(ii)CD14及び／若しくはCD235aが該細胞の表面上で検出されず、かつ次のタンパク質：CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102、CD109及びCD156c：も検出されなかった場合に、該細胞を選択する工程を含む、方法。
本発明の１種のHPCマーカーを用いた製法により、より多くのCD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞）を提供することができ、及び/又はCD8ポジティブ細胞をより高い濃度で作製することができる。さらに、本発明の製法により、収率のバラツキが少なく、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞）を安定して提供することができる。従って、本発明の製造方法は、細胞集団から造血前駆細胞を分離するための改良された方法を提供する。これは、CD8ポジティブ細胞を作製するための改良された細胞供給源を提供する。この新規な製造方法は、HPC由来のCD8ポジティブ細胞集団の質及び/又は量を大きく改善するために、特定のHPCポジティブマーカー及びHPCネガティブマーカーを用いることができるという本発明者らの驚くべき、そして予期できない知見に基づいている。本発明のCD8ポジティブ細胞のこの有益な供給源は、臨床応用（例えば、細胞療法、診断目的、及びインビトロでの用途）のための改良されたCD8ポジティブ細胞集団を提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、（工程１）造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上の造血前駆細胞マーカー（本明細書中、「HPCマーカー」と略記することがある。）を発現する細胞、及び／又は１種以上のHPCマーカーを発現しない細胞を分離する工程、及び（工程２）工程１により分離された細胞を、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞（本明細書中、「CD4/CD8DP細胞」と略記することがある。）に分化させる工程を含む、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞）を製造する方法（以下「本発明の製法」と略記する。）などを提供する。
本発明は、（工程１）造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上の造血前駆細胞マーカー（本明細書中、「HPCマーカー」と略記することがある。）を発現する細胞、及び／又は１種以上のHPCマーカーを発現しない細胞を分離する工程、及び（工程２）工程１により分離された細胞を、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞（本明細書中、「CD4/CD8DP細胞」と略記することがある。）に分化させる工程を含む、CD8ポジティブ細胞（例えば、CD4/CD8DP細胞）を製造する方法（以下「本発明の製法」と略記する。）などを提供する。
本発明において、「CD8ポジティブ細胞」とは、CD8を発現しているT細胞を意味し、該細胞としては、例えば、CD4/CD8DP細胞及びCD8シングルポジティブ細胞（本明細書中、「CD8SP細胞」と略記することがある。）が挙げられる。本発明において、「CD4/CD8DP細胞」とは、CD4及びCD8が共に発現しているT細胞を意味し、「CD8SP細胞」とは、CD4を発現せず、CD8を発現しているT細胞を意味する。CD8SP細胞としては、例えば、細胞傷害性T細胞及びその前駆細胞が挙げられる。また、本発明において、「T細胞」とは、例えば、表面にT細胞受容体（T cell receptor、TCR）と称される抗原受容体を発現している細胞、及びその前駆細胞（例：TCR（TCRαβ）を発現していないプロT細胞、TCRβとプレTCRαとが会合しているプレT細胞）を意味する。
本発明において、「造血前駆細胞」とは、CD34陽性細胞を意味し、好ましくは、CD34/CD43DP細胞である。本発明に用いる造血前駆細胞の由来は制限されず、例えば、公知の手法（例えば、特許文献１、２、非特許文献１〜３に記載の手法）により、in vitroで誘導された造血前駆細胞（例えば、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる造血前駆細胞）であってもよく、また、生体組織から、公知の手法により単離した造血前駆細胞であってもよい。
前記多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）が挙げられるが、好ましくはiPS細胞(より好ましくはヒトiPS細胞)である。上記多能性幹細胞がES細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
前記iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって製造することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（例えば、Takahashi K.及びYamanaka S. (2006） Cell，126；663-676：Takahashi K. et al． (2007) Cell，131;861-872：Yu J. et al． (2007） Science，318;1917-1920：Nakagawa M．et al．(2008) Nat．Biotechnol．26;101-106）。iPS細胞を用いる場合、該iPS細胞は、自体公知の方法により体細胞から作製してもよいし、既に樹立され、ストックされているiPS細胞を用いてもよい。本発明に用いるiPS細胞の由来となる体細胞に制限はないが、好ましくは末梢血由来の細胞または臍帯血由来の細胞である。多能性幹細胞の由来となる動物に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
前記多能性幹細胞を自体公知の方法に供することにより、造血前駆細胞を製造することができる。前記多能性幹細胞がiPS細胞である場合、例えば、国際公開第2017/221975号に記載された方法により、造血前駆細胞を製造することができる。
また、前記生体組織としては、造血前駆細胞を含有する限り制限されないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血が挙げられる。これらの中では、動物に対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。
本発明で用いる造血前駆細胞や多能性幹細胞は、治療への適用の観点からは、GMP（Good Manufacturing Practice）規格の細胞であることが好ましい。
本発明において、「HPCマーカー」とは、造血前駆細胞の表面に発現し得る分子である、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325のいずれかの分子（明細書中、これらのマーカーを「HPCポジティブマーカー」、「ポジティブHPC選択マーカー」、又は「ポジティブHPCマーカー」と称することがある）、あるいは、造血前駆細胞の表面に通常発現しない分子である、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cのいずれかの分子（明細書中、これらのマーカーを「HPCネガティブマーカー」、「ネガティブHPC選択マーカー」、又は「ネガティブHPCマーカー」と称することがある）を意味する（明細書中、HPCポジティブマーカーとHPCネガティブマーカーをまとめて「本発明のHPCマーカー」と称することがある）。本発明のHPCポジティブマーカーのなかでも、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD200、CD７又はCD144が好ましく、CD90、CD143、CD218a又はCD200がより好ましい。また別の態様では、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200又はCD218aが好ましく、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200 又はCD218aがより好ましい。また、本発明において、前記HPCポジティブマーカーを発現する細胞を、HPCマーカー陽性細胞（又はHPCマーカーポジティブ細胞）と呼ぶことがあり、例えば、CD24分子を発現する細胞の場合、CD24陽性細胞と呼ぶことがある。本発明のHPCネガティブマーカーのなかでも、CD49f、CD51又はCD102が好ましい。本発明において、前記HPCネガティブマーカーを発現しない細胞を、HPCマーカー陰性細胞（又はHPCマーカーネガティブ細胞）と呼ぶことがある。
典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD62L、CD24、CD90、CD143、CD218a、CD263又はNotch3のいずれかを発現し、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD90、CD143、CD200、CD218a又はCD263のいずれかを発現し、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD7、CD144、CD56、CD226、CD262又はCD325のいずれかを発現し、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
典型的な実施態様において、CD8ポジティブ細胞、好ましくはCD4/CD8ダブルポジティブ細胞は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、(a)CD34及びCD43を発現し、（b）CD49f、CD51、CD426、CD61、CD62P、CD69又はCD156cのいずれも発現せず、かつ（c）CD235a及びCD14を発現しない細胞を分離することにより製造される。
本発明において、「発現する」とは、細胞を分離する際に使用する方法で発現が検出できることを意味し、「発現しない」とは、細胞を分離する際に使用する方法の検出感度では検出できないことを意味する。細胞を分離する際に使用する方法としては、下述のフローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などが挙げられる。
前記工程１により分離される細胞としては、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する細胞、１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞。本発明の一実施態様において、前記工程１により分離される細胞は、１種以上の本発明のHPCポジティブマーカーに加えて、CD34及び／又はCD43を発現する細胞、及び／又は１種以上の本発明のHPCネガティブマーカーを発現せず、かつCD34及び／又はCD43を発現する細胞である。さらに、該分離される細胞は、CD235a陰性、CD14陰性及び／又はCD45陽性であることが好ましい。従って、本発明の好ましい実施態様において、前記工程１は、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD235a陰性、CD14陰性、CD45陽性、CD34陽性及びCD43陽性であり、かつ１種以上の本発明のHPCポジティブマーカー陽性及び／又は１種以上の本発明のHPCネガティブマーカー陰性の細胞を分離することにより行われる。
本発明において、「細胞を分離する」には、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を選択し、該選択した細胞を単離する態様、及び該選択した細胞を次の分化工程へ供する態様が包含される。
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」又は「含む（comprises）」のような各用語は、任意選択でに、「からなる（consisting of）」又は「からなる(consists of)」で置き換えられてもよい。
造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を分離する方法としては、フローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などが挙げられ、これらの方法は、公知の方法を用いて実施することができる。例えば、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する細胞、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞は、当該細胞と各HPCマーカーに特異的に結合する物質（例えば、抗体）とを接触させる工程を含む方法により分離することができる。上記物質には、それ自体に検出可能な標識（例：GFP）が付加されているもの、およびそれ自体には標識が付加されていないものも含まれる。上記物質が、それ自体に標識が付加されていないものである場合、当該物質を直接または間接的に認識する検出可能な標識が付加された物質をさらに使用することで前記分離が可能となる。例えば、前記物質が抗体である場合には、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）を当該抗体に直接的又は間接的に担持させ、それにより細胞表面のHPCマーカーを標識することが可能であり、当該標識に基づいて細胞を分離することが可能である。この際用いる抗体は、１種類のみ、又は２種類以上の抗体であってもよい。
造血前駆細胞を含む細胞集団から本発明の１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又はHPCネガティブマーカーを発現しない細胞として分離された細胞を、CD8ポジティブ細胞に分化させる方法としては、例えば公知の方法（例えば、国際公開第2016/076415号、Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175、Cell Reports 2(2012)1722-1735、国際公開第2017/221975号に記載された方法）が挙げられる。
１．CD4/CD8DP細胞の製造方法
本発明の製法の工程２で用いる細胞培養用の基礎培地としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地が挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、含有されていなくてもよい。必要に応じて、培地には、例えば、ビタミンC類(例：アスコルビン酸、リン酸ビタミンC)、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質を含有させてもよい。
本発明の製法の工程２で用いる細胞培養用の基礎培地としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地が挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、含有されていなくてもよい。必要に応じて、培地には、例えば、ビタミンC類(例：アスコルビン酸、リン酸ビタミンC)、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質を含有させてもよい。
前記培地は、サイトカインを含んでいることが好ましい。サイトカインとしては、IL-7、FLT-3L、SCF、TPO及びこれらの組合せなどが挙げられ、FLT-3L及びIL-7が好ましい。IL-7の培地中における濃度は、1 ng/ml〜50 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml）が好ましく、なかでも、5 ng/mlが好ましい。FLT-3Lの培地中における濃度は、1 ng/ml〜100 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）が好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。その他のサイトカインの濃度についても、当業者は、培養条件等に基づき、適宜決定することができる。また、培地は、Notchリガンド（例：Dll1、Dll4、Dll1又はDll4とFcの融合タンパク質）を含んでいることが好ましい。Notchリガンドを用いる場合は、培地に添加してもよく、培養容器にコーティングしてもよい。また、Notchリガンドを発現するフィーダー細胞を用いてもよい。
本発明の製法においては、工程１により得られた造血前駆細胞を接着培養又は浮遊培養してもよい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、またフィーダー細胞等と共培養してもよい。治療への適用の観点からは、フィーダーフリーであることが好ましい。培養容器をコーティングする場合の基材としては、例えば、フィブロネクチン断片（例：レトロネクチン）、プロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲル（BD）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。また、共培養するフィーダー細胞として、例えば、骨髄間質細胞株のOP9細胞、マウス間葉系細胞株の10T1/2細胞、Tst-4細胞が挙げられる。フィーダー細胞を用いる場合には、該フィーダー細胞を適宜交換して培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞の交換は、予め播種したフィーダー細胞上へ培養中の対象細胞を移すことによって行い得る。当該交換は、2日〜5日毎に行うことが好ましい。
本発明において、造血前駆細胞を培養してCD4/CD8 DP細胞を誘導する際の培養温度条件は、特に制限されないが、37℃〜42℃程度が好ましく、37〜39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD4/CD8DP細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することができる。CD4/CD8DP細胞が得られる限り、造血前駆細胞からCD4/CD8 DP細胞を誘導する培養日数は特に限定されないが、10日間以上（例：12日、14日、16日、18日、20日又はそれ以上）が好ましく、また、60日以下が好ましい。後述の実施例で示す通り、特定の実施態様において、21日間〜28日間の培養により、CD4/CD8DP細胞を大量に効率よく得ることができる。
本発明において、得られたCD4/CD8DP細胞は、単離して用いてもよく、他の細胞種（例えば、CD8SP細胞）が含有される細胞集団として用いてもよい。単離する場合、CD4、CD8、CD3、CD45分子などを指標として、単離することができる。当該単離の方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、指標とする分子に対する抗体により標識し、上述のフローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法、又は所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。
２．CD8シングルポジティブ細胞の製造方法
本発明の製法により得られたCD4/CD8DP細胞をCD8SP細胞に分化誘導する工程に付すことにより、CD8SP細胞を製造することができる（このようにCD8SP細胞を製造する方法を、「本発明のCD8SP細胞の製法」と略記することがある。）。CD4/CD8DP細胞を製造する方法については、１．に記載の通りである。
本発明の製法により得られたCD4/CD8DP細胞をCD8SP細胞に分化誘導する工程に付すことにより、CD8SP細胞を製造することができる（このようにCD8SP細胞を製造する方法を、「本発明のCD8SP細胞の製法」と略記することがある。）。CD4/CD8DP細胞を製造する方法については、１．に記載の通りである。
本発明のCD8SP細胞の製法に用いる基礎培地および培地としては、1.に記載された基礎培地および培地と同様のものが挙げられる。
前記培地は、副腎皮質ホルモン剤を含んでいてもよい。副腎皮質ホルモン剤としては、例えば、糖質コルチコイド及びその誘導体などが挙げられ、該糖質コルチコイドとしては、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。なかでも、デキサメタゾンが好ましい。従って、一実施態様において、CD8シングルポジティブ細胞を製造する方法は、副腎皮質ホルモン剤、好ましくはデキサメタゾンの存在下で、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養することにより、前記CD4/CD8ダブルポジティブ細胞をCD8シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む。
副腎皮質ホルモン剤としてデキサメタゾンを用いる場合、培養液中におけるその濃度は、1nM〜100nM（例：1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM）が好ましく、なかでも、10nMが好ましい。
前記培地は、抗体（例：抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD2抗体）、サイトカイン（例：IL-7、IL-2、IL-15）などを含有していてもよい。
本発明に用いる抗CD3抗体としては、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗CD3抗体は、磁気ビーズ等が結合されているものであってもよく、また、前記抗CD3抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体を表面に結合させた培養容器上で該Tリンパ球を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。抗CD3抗体の培地中における濃度は、10ng/ml〜1000ng/ml（例：10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/ml、1000 ng/ml）が好ましく、なかでも、500 ng/mlが好ましい。その他の抗体の濃度についても、当業者は、培養条件等に基づき、適宜決定することができる。従って、一実施態様において、CD8シングルポジティブ細胞を製造する方法は、抗体、好ましくは抗CD3抗体の存在下で、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養することにより、前記CD4/CD8ダブルポジティブ細胞をCD8シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む。
本発明に用いるIL-2の培地中における濃度は、10 U/ml〜1000 U/ml（例：10 U/ml、20 U/ml、30 U/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/ml、100 U/ml、500 U/ml、1000 U/ml）が好ましく、なかでも、100 U/mlが好ましい。本発明に用いるIL-7又はIL15の培地中における濃度は、1 ng/ml〜100 ng/ml（例：1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）が好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。従って、一実施態様において、CD8シングルポジティブ細胞を製造する方法は、サイトカイン、好ましくはIL-2の存在下で、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞を培養することにより、前記CD4/CD8ダブルポジティブ細胞をCD8シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む。
本発明のCD8SP細胞の製法において、CD4/CD8DP細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、37℃〜42℃程度が好ましく、37〜39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することができる。CD8SP細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、1日以上、3日以上、7日以上が好ましく、60日以下が好ましい。
本発明の製法により製造されるCD8SP細胞は、CD4/CD8DP細胞から分化させて得られる細胞（例えば、上記２．により得られる細胞）に限定されない。したがって、例えば、造血前駆細胞を含む細胞集団から本発明の１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞として分離された細胞からCD4/CD8DP細胞を経ずに誘導されるCD8SP細胞も本発明の製法により製造されるCD8SP細胞に含まれる。
３．１種以上のHPCマーカーを発現する造血前駆細胞を含有する細胞集団
本発明は、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない造血前駆細胞を高頻度で含む細胞集団（以下「本発明の細胞集団」と略記する。）を提供する。前記細胞集団は、例えば、造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を上記に記載の分離方法を用いて分離することで得ることができる。HPCマーカーの定義、具体的な分子、及び造血前駆細胞の定義については、上記に記載の通りである。
本発明は、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない造血前駆細胞を高頻度で含む細胞集団（以下「本発明の細胞集団」と略記する。）を提供する。前記細胞集団は、例えば、造血前駆細胞を含む細胞集団から、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を上記に記載の分離方法を用いて分離することで得ることができる。HPCマーカーの定義、具体的な分子、及び造血前駆細胞の定義については、上記に記載の通りである。
本発明の細胞集団は、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない造血前駆細胞の割合（該造血前駆細胞数／細胞集団に含まれる全細胞数）が、従来法（例えば、CD34陽性、CD34陽性及びCD43陽性、あるいはCD43陽性及びCD34、CD31もしくはCD144陽性を指標に分離する方法）により得られる造血前駆細胞集団に含まれる割合よりも高い割合であれば特に制限はないが、40%以上（例：50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%）であることが好ましい。本発明の細胞集団は、本発明の製法の工程１で記載した方法により得ることができる。１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない造血前駆細胞の割合は、フローサイトメトリーにより測定することができる。
後述の実施例で示す通り、本発明の細胞集団は、１種以上のHPCポジティブマーカーを発現する、及び／又は１種以上のHPCネガティブマーカーを発現しない細胞を分離しなかった細胞集団と比較して、CD4/CD8DP細胞及びCD8SP細胞へ分化する効率が高く、増殖能にも優れている。
４．「本発明の細胞集団」の分離用試薬
本発明はまた、本発明のHPCマーカー、即ち、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156c、好ましくは、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200CD218a、CD7、CD144、CD49f、CD51及びCD102からなる群より選択される１種以上のマーカーの各々に対する抗体を含んでなる、本発明の細胞集団の分離用試薬（以下、「本発明の試薬」と略記する）を提供する。本発明の試薬が２種以上のHPCマーカーに対する抗体を含む場合、該試薬は、各抗体を別個の試薬中に含む試薬キットとして提供され得る。本発明の試薬に含まれる抗体は、本発明の製法の工程１に用いられる分離手段に応じて、例えば、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）に結合した形態で提供され得る。
本発明はまた、本発明のHPCマーカー、即ち、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156c、好ましくは、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200CD218a、CD7、CD144、CD49f、CD51及びCD102からなる群より選択される１種以上のマーカーの各々に対する抗体を含んでなる、本発明の細胞集団の分離用試薬（以下、「本発明の試薬」と略記する）を提供する。本発明の試薬が２種以上のHPCマーカーに対する抗体を含む場合、該試薬は、各抗体を別個の試薬中に含む試薬キットとして提供され得る。本発明の試薬に含まれる抗体は、本発明の製法の工程１に用いられる分離手段に応じて、例えば、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）に結合した形態で提供され得る。
また、本発明の試薬は、抗CD4抗体及び／又は抗CD8抗体、並びに、必要に応じてCD4/CD8DP細胞及び／又はCD8SP細胞で発現する又は発現しないことが既知の他の細胞表面マーカー（例えば、CD3、CD45、CD235a、CD14、CD45、CD34、CD43）に対する１種以上の抗体をさらに含むことができ、本発明の細胞集団から分化誘導されたCD4/CD8DP細胞やCD8SP細胞の分離用試薬として使用することができる。
また、本発明の試薬は、造血前駆細胞をCD4/CD8DP細胞に、さらにはCD8SP細胞に分化誘導するための試薬類（例えば、基礎培地、培地添加物など）をさらに含んでもよく、当該試薬類としては、上記１．及び上記２．で例示された物質が同様に挙げられる。
また、本発明の試薬は、造血前駆細胞をCD4/CD8DP細胞に、さらにはCD8SP細胞に分化誘導するための試薬類（例えば、基礎培地、培地添加物など）をさらに含んでもよく、当該試薬類としては、上記１．及び上記２．で例示された物質が同様に挙げられる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明はこれらに限定されない。
実施例１（TKT3V1-7株を用いた検討）
造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（TKT3V1-7株）を公知の方法（例えば、Cell Reports 2(2012)1722-1735や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて分化させた浮遊細胞集団を用いた。具体的には、超低接着処理された6weｌｌ plateにTKT3V1-7株を3 ｘ 105個/ウェルで播種し（Day0)、EB培地(StemPro34に10 μg/mlヒトインスリン、5. 5 μg/mlヒトトランスフェリン、5 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、45mM α-モノチオグリセロー ル、および50 μg/mlアスコルビン酸を添加）に10 ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF 、15ng/ml VEGF、2μM SB431542、を加えて、低酸素条件下（5% 02)にて5日間 培養を行った(Day5)。 続いて、50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3Lを添加し、さらに5〜9 日間培養を行い（〜Day14)、浮遊細胞集団を得た。なお、培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、サンプル群ごとに以下の抗体セットを用いて染色した。
造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（TKT3V1-7株）を公知の方法（例えば、Cell Reports 2(2012)1722-1735や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて分化させた浮遊細胞集団を用いた。具体的には、超低接着処理された6weｌｌ plateにTKT3V1-7株を3 ｘ 105個/ウェルで播種し（Day0)、EB培地(StemPro34に10 μg/mlヒトインスリン、5. 5 μg/mlヒトトランスフェリン、5 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、45mM α-モノチオグリセロー ル、および50 μg/mlアスコルビン酸を添加）に10 ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF 、15ng/ml VEGF、2μM SB431542、を加えて、低酸素条件下（5% 02)にて5日間 培養を行った(Day5)。 続いて、50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3Lを添加し、さらに5〜9 日間培養を行い（〜Day14)、浮遊細胞集団を得た。なお、培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、サンプル群ごとに以下の抗体セットを用いて染色した。
上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記各サンプル群から取得した細胞分画を以下に示す。
上表において、分画A〜Gは各々以下を示す。
分画A：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性
分画B：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62L陽性
分画C：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62L陰性
分画D：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD24陽性
分画E：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD24陰性
分画F：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陽性
分画G：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陰性
分画H：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陽性
分画I：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陰性
分画J：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陽性
分画K：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陰性
分画L：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陽性
分画M：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陰性
分画N：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、Notch3陽性
分画O：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、Notch3陰性
分画A：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性
分画B：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62L陽性
分画C：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62L陰性
分画D：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD24陽性
分画E：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD24陰性
分画F：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陽性
分画G：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陰性
分画H：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陽性
分画I：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陰性
分画J：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陽性
分画K：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陰性
分画L：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陽性
分画M：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陰性
分画N：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、Notch3陽性
分画O：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、Notch3陰性
上記分画A〜Oに含まれる細胞を、公知の方法（例えば、Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて、リンパ球系細胞へ分化させた。具体的には、分画A〜Oの各細胞集団を、2000 cells/wellで、Recombinat h-DLL4/Fc chimera（Sino Biological）とRetronectin（タカラバイオ）をコートした48-well-plateに播種し、5%CO2、37℃条件下に培養した。培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。なお、培地としては、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30 ng/ml SDF-1α を添加したOP9培地（15% FBS、2mM L-グルタミン、100Umlペニシリン、100ng /mlストレプトマイシン、55μΜ 2-メルカプトエタノール、50μg/mlアスコ ルビン酸、10 μg/mlヒトインスリン、5. 5 μg/mlヒトトランスフェリン、 5ng/ml亜セレン酸ナトリウムを含む）を用いた。培養開始から7日目および14日目に同様のコートをした48-well-plateに継代した。培養開始21日目にすべての細胞を回収し、血球板を用いて細胞数を数えた後、以下の抗体セットを用いて染色した。
上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記ソーティングにより取得した細胞分画を以下に示す。なお、本明細書においてリンパ球分画とは、Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 18(1994)199-208に記載された方法と同様に、FSC（forward scatter）およびSSC(side scatter)を指標として分離した分画をいう。
分画P：リンパ球分画
分画Q：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
分画R：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
分画S：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
分画P：リンパ球分画
分画Q：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
分画R：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
分画S：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
分画A〜O由来の各サンプルにおける培養開始21日目の細胞数（分画A由来のサンプルにおける細胞数との比率）を表４に示す。
表４より、分画A由来のサンプルに含まれる細胞集団に比べて、分画B（CD62L陽性）、分画D(CD24陽性)、分画F（CD90陽性）、分画H（CD143陽性）、分画J（CD218a陽性）、分画L(CD263陽性)または分画N(Notch3陽性)由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に優れていることがわかった。
培養21日目のFACS Ariaによるソーティングにより得られた細胞分画P〜Sの細胞数（分画A由来のサンプルにおける細胞分画P〜Sの細胞数との比率）を表５に示す。
この結果、分画F由来の細胞を用いることにより、分画Gまたは分画A由来の細胞を用いた場合に比して、(a) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞、あるいは(b) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陰性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。同様に、分画H由来の細胞を用いることにより、分画Iまたは分画A由来の細胞を用いた場合に比して、(a) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞、あるいは(b) CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陰性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。また分画J由来の細胞を用いることにより、分画Kまたは分画A由来の細胞を用いた場合に比して、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。すなわち、造血前駆細胞を含む細胞集団として、CD90、CD143またはCD218aを発現する細胞を分離して、分離された細胞を分化させることにより、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞（またはCD8ポジティブ細胞）を高い割合で含む細胞集団を製造することができることが示された。
実施例２（Ff-I01s04株を用いた検討）
造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（Ff-I01s04株）を実施例１に記載された方法に供して得られた浮遊細胞集団を用いた。
HPCを含む細胞集団は、サンプル群ごとに実施例１に示した抗体セット3、4、5、6（本実施例では、それぞれ3b、4b、5b、6bと表記する）、または以下に示す抗体セット8bを用いて染色した。
造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（Ff-I01s04株）を実施例１に記載された方法に供して得られた浮遊細胞集団を用いた。
HPCを含む細胞集団は、サンプル群ごとに実施例１に示した抗体セット3、4、5、6（本実施例では、それぞれ3b、4b、5b、6bと表記する）、または以下に示す抗体セット8bを用いて染色した。
上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記各サンプル群から取得した細胞分画を以下に示す。
上表において、分画f〜m、ｔおよびuは各々以下を示す。
分画f：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陽性
分画g：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陰性
分画h：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陽性
分画i：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陰性
分画j：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陽性
分画k：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陰性
分画l：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陽性
分画m：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陰性
分画t：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD200陽性
分画u：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD200陰性
分画f：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陽性
分画g：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD90陰性
分画h：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陽性
分画i：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD143陰性
分画j：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陽性
分画k：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD218a陰性
分画l：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陽性
分画m：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD263陰性
分画t：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD200陽性
分画u：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD200陰性
上記分画f〜m、tおよびuに含まれる細胞を、実施例１に記載された方法に供してリンパ球系細胞へ分化させた。培養開始28日目にすべての細胞を回収し、以下の抗体セットを用いて染色した。
上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記ソーティングにより取得した細胞分画を以下に示す。
分画p：リンパ球分画
分画q：リンパ球分画、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
分画r：リンパ球分画、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
分画s：リンパ球分画、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
分画p：リンパ球分画
分画q：リンパ球分画、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
分画r：リンパ球分画、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
分画s：リンパ球分画、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
分画f〜m、tおよびu由来の各サンプルにおける培養開始28日目の細胞数（培養開始時の細胞数との比率）を表９に示す。
表９より、分画fは分画gに対して、分画hは分画iに対して、分画jは分画kに対して、分画lは分画mに対して、分画tは分画uに対していずれも増殖能に優れていることがわかった。すなわち、CD90陽性、CD143陽性、CD218a陽性、CD263陽性またはCD200陽性由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に優れていることがわかった。
分画f〜m、tおよびuに含まれる細胞を1000 cells/wellで播種した場合における、培養28日目のFACS Ariaによるソーティングにより得られた細胞分画p〜sの細胞数を表１０に示す。
表１０に示す培養28日目のFACSによる解析により、各マーカー陽性細胞由来の細胞を用いた場合、各マーカー陰性細胞由来の細胞を用いた場合に比して、(a) CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陽性細胞、あるいは(b) CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性、CD8a陽性、及びCD4陰性細胞を高い収率で調製可能であることが示された。
これらの結果から、造血前駆細胞を含む細胞集団として、CD90、CD143、CD200、CD218aまたはCD263を発現する細胞を分離して、分離された細胞を分化させることにより、CD8ポジティブ細胞（例：CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞）を高い割合で含む細胞集団を製造することができることが示された。
これらの結果から、造血前駆細胞を含む細胞集団として、CD90、CD143、CD200、CD218aまたはCD263を発現する細胞を分離して、分離された細胞を分化させることにより、CD8ポジティブ細胞（例：CD4/CD8DP細胞、CD8SP細胞）を高い割合で含む細胞集団を製造することができることが示された。
実施例３（Ff-I01s04株を用いた検討）
造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（Ff-I01s04株）を実施例１に記載された方法に供して得られた浮遊細胞集団を用いた。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、サンプル群ごとに以下の抗体セットを用いて染色した。
造血前駆細胞（以下、HPCと称することがある）を含む細胞集団として、iPS細胞（Ff-I01s04株）を実施例１に記載された方法に供して得られた浮遊細胞集団を用いた。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、サンプル群ごとに以下の抗体セットを用いて染色した。
上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記各サンプル群から取得した細胞分画を以下に示す。
上表において、分画Aｃ〜Pｃは各々以下を示す。
分画Aｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性
分画Bｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD7陽性
分画Cｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD144陽性
分画Dｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD56陽性
分画Eｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD226陽性
分画Fｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD262陽性
分画Gｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD325陽性
分画Hｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD49f陽性
分画Iｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD51陽性
分画Jｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD102陽性
分画Kｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD42b陽性
分画Lｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD61陽性
分画Mｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62P陽性
分画Nｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD69陽性
分画Oｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD102陽性
分画Pｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD156c陽性
分画Aｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性
分画Bｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD7陽性
分画Cｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD144陽性
分画Dｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD56陽性
分画Eｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD226陽性
分画Fｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD262陽性
分画Gｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD325陽性
分画Hｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD49f陽性
分画Iｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD51陽性
分画Jｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD102陽性
分画Kｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD42b陽性
分画Lｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD61陽性
分画Mｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD62P陽性
分画Nｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD69陽性
分画Oｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD102陽性
分画Pｃ：CD235a陰性、CD14陰性、CD34陽性、CD43陽性、CD156c陽性
上記分画Aｃ〜Pcに含まれる細胞を、実施例１に記載された方法に供してリンパ球系細胞へ分化させた。培養開始21日目にすべての細胞を回収し、血球板を用いて細胞数を数えた後、以下の抗体セットを用いて染色した。
上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。上記ソーティングにより取得した細胞分画を以下に示す。
分画Qｃ：リンパ球分画
分画Rｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
分画Sｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
分画Tｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
分画Qｃ：リンパ球分画
分画Rｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD5陽性、CD7陽性
分画Sｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陽性
分画Tｃ：リンパ球分画、CD3陽性、CD45陽性、CD7陽性、CD8a陽性、CD4陰性
分画Aｃ〜Pc由来の各サンプルにおける培養開始21日目の細胞数（分画Aｃ由来のサンプルにおける細胞数との比率）を表１４に示す。
表１４より、分画Aｃ由来のサンプルに含まれる細胞集団に比べて、分画Bｃ（CD7陽性）、分画Cｃ(CD144陽性)、分画Dｃ（CD56陽性）、分画Eｃ（CD226陽性）、分画Fｃ（CD262陽性）および分画Gｃ (CD325陽性) 由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に優れていることがわかった。また、分画Hｃ（CD49f陽性）、分画Iｃ (CD51陽性)、分画Kｃ（CD42b陽性）、分画Lｃ（CD61陽性）、分画Mｃ (CD62P陽性)、分画Nｃ (CD69陽性) および分画Pc (CD156c陽性) 由来のサンプルに含まれる細胞集団はいずれも増殖能に劣っていることがわかった。
培養21日目のFACS Ariaによるソーティングにより得られた細胞分画Qc〜Tcの細胞数（分画Aｃ由来のサンプルにおける細胞分画Qc〜Tcの細胞数との比率）を表１５に示す。
この結果、分画Bｃ、分画Cｃ、分画Dｃ、分画Eｃ、分画Fｃ、または分画Gｃ由来の細胞を用いることにより、分画Aｃ由来の細胞を用いた場合に比して、CD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陽性細胞、あるいはCD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陰性細胞を高い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。また、分画Hｃ、分画Iｃ、分画Jｃ、分画Kｃ、分画Lｃ、分画Mｃ、分画Nｃ、分画Oｃ、または分画Pｃ由来の細胞を用いることにより、分画Aｃ由来の細胞を用いた場合に比して、CD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陽性細胞、あるいはCD3陽性CD45陽性CD7陽性CD8a陽性CD4陰性細胞を低い割合で含む細胞集団を調製可能であることが示された。すなわち、造血前駆細胞を含む細胞集団として、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、及びCD325のいずれか１種以上を発現する細胞、あるいはCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cのいずれか１種以上を発現しない細胞を分離して、分離された細胞を分化させることにより、CD4/CD8ダブルポジティブ細胞（またはCD8シングルポジティブ細胞）を高い割合で含む細胞集団を製造することができることが示された。
本出願は、日本国で出願された特願２０１７−０８７７２３（出願日：２０１７年４月２６日）を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は本明細書に全て包含される。
本発明により、未成熟T細胞や成熟T細胞をより多く及び／又はより高い濃度で得ることができ、このようにして得られた細胞は、腫瘍、感染症、自己免疫不全等の疾患の予防又は治療に有用である。
Claims (19)
- 以下の工程を含む、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞を製造する方法。
工程１：造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程、並びに
工程２：工程1により分離された細胞を、CD4/CD8 ダブルポジティブ細胞に分化させる工程 - 前記工程１において選択される細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞を分離する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記工程１に示される第１の群が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる群である、請求項３に記載の方法。
- 前記工程１が、造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記工程１に示される第２の群が、CD49f、CD51及びCD102からなる群である、請求項５に記載の方法。
- 前記工程１の造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
- 請求項１〜８のいずれかの方法により得られたCD4/CD8 ダブルポジティブ細胞をCD8 シングルポジティブ細胞に誘導する工程を含む、CD8 シングルポジティブ細胞の製造方法。
- 前記CD8 シングルポジティブ細胞が細胞傷害性T細胞である、請求項９に記載の方法。
- 造血前駆細胞を含む細胞集団から、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない細胞を分離して得られる細胞集団。
- 分離された細胞が、CD235a及びCD14を発現しておらず、かつ、CD45、CD34及びCD43を発現している細胞である、請求項１１に記載の細胞集団。
- 前記造血前駆細胞を含む細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞集団である、請求項１１又は１２に記載の細胞集団。
- 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１３に記載の細胞集団。
- CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262及びCD325からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する造血前駆細胞、及び/又はCD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない造血前駆細胞の割合（該造血前駆細胞数／細胞集団に含まれる全細胞数）が40％以上である細胞集団。
- 前記割合が、CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD200、CD218a、CD7及びCD144からなる第１の群より選択される１種以上の分子を発現する造血前駆細胞の割合である、請求項１５に記載の細胞集団。
- 前記割合が、CD49f、CD51及びCD102からなる第２の群より選択される１種以上の分子を発現しない造血前駆細胞の割合である、請求項１５に記載の細胞集団。
- CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262、CD325、CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102及びCD156cからなる群より選択される１種以上の分子の各々に対する抗体を含んでなる、造血前駆細胞の分離用試薬。
- さらにCD235a、CD14、CD45、CD34及び/又はCD43に対する抗体を１種以上含んでなる、請求項１８に記載の試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023139109A JP2023164892A (ja) | 2017-04-26 | 2023-08-29 | 造血前駆細胞マーカー |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017087723 | 2017-04-26 | ||
| JP2017087723 | 2017-04-26 | ||
| PCT/JP2018/016864 WO2018199186A1 (ja) | 2017-04-26 | 2018-04-25 | 造血前駆細胞マーカー |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023139109A Division JP2023164892A (ja) | 2017-04-26 | 2023-08-29 | 造血前駆細胞マーカー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2018199186A1 true JPWO2018199186A1 (ja) | 2020-05-14 |
| JP7430877B2 JP7430877B2 (ja) | 2024-02-14 |
Family
ID=63918584
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019514588A Active JP7430877B2 (ja) | 2017-04-26 | 2018-04-25 | 造血前駆細胞マーカー |
| JP2023139109A Pending JP2023164892A (ja) | 2017-04-26 | 2023-08-29 | 造血前駆細胞マーカー |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023139109A Pending JP2023164892A (ja) | 2017-04-26 | 2023-08-29 | 造血前駆細胞マーカー |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210102167A1 (ja) |
| EP (1) | EP3617307A4 (ja) |
| JP (2) | JP7430877B2 (ja) |
| KR (1) | KR20200002909A (ja) |
| CN (1) | CN110691843B (ja) |
| AU (1) | AU2018257307A1 (ja) |
| BR (1) | BR112019022288A2 (ja) |
| CA (1) | CA3061289A1 (ja) |
| EA (1) | EA201992483A1 (ja) |
| SG (1) | SG11201909795RA (ja) |
| TW (1) | TW201843301A (ja) |
| WO (1) | WO2018199186A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023247722A1 (en) * | 2022-06-22 | 2023-12-28 | Fondazione Telethon Ets | Method for isolating hemogenic endothelial cells |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011041912A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | University Health Network | Self-renewing single human hematopoietic stem cells, an early lymphoid progenitor and methods of enriching the same |
| JP2014533494A (ja) * | 2011-11-21 | 2014-12-15 | ユニバーシティ・ヘルス・ネットワーク | 造血前駆体の集団および造血前駆体のための幹細胞を富化する方法 |
| WO2016076415A1 (ja) * | 2014-11-13 | 2016-05-19 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からｔ細胞への誘導方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8034613B2 (en) | 2005-06-01 | 2011-10-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Multipotent lymphohematopoietic progenitor cells |
| JP6517190B2 (ja) * | 2014-04-24 | 2019-05-22 | 学校法人関西医科大学 | ヒト造血幹細胞濃縮画分の製造方法 |
| SG11201803145RA (en) * | 2015-11-04 | 2018-05-30 | Fate Therapeutics Inc | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
| US10350873B2 (en) | 2015-11-11 | 2019-07-16 | Xerox Corporation | System and method for removing support structure from three-dimensional printed objects using microwave energy and nanoparticles |
| US11578310B2 (en) | 2016-06-23 | 2023-02-14 | Kyoto University | Method for producing CD4/CD8 double-positive T cells |
-
2018
- 2018-04-25 JP JP2019514588A patent/JP7430877B2/ja active Active
- 2018-04-25 CA CA3061289A patent/CA3061289A1/en active Pending
- 2018-04-25 EA EA201992483A patent/EA201992483A1/ru unknown
- 2018-04-25 EP EP18791069.0A patent/EP3617307A4/en active Pending
- 2018-04-25 TW TW107114033A patent/TW201843301A/zh unknown
- 2018-04-25 CN CN201880027852.6A patent/CN110691843B/zh active Active
- 2018-04-25 WO PCT/JP2018/016864 patent/WO2018199186A1/ja unknown
- 2018-04-25 BR BR112019022288A patent/BR112019022288A2/pt unknown
- 2018-04-25 KR KR1020197033583A patent/KR20200002909A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-04-25 AU AU2018257307A patent/AU2018257307A1/en active Pending
- 2018-04-25 SG SG11201909795R patent/SG11201909795RA/en unknown
- 2018-04-25 US US16/607,967 patent/US20210102167A1/en active Pending
-
2023
- 2023-08-29 JP JP2023139109A patent/JP2023164892A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011041912A1 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | University Health Network | Self-renewing single human hematopoietic stem cells, an early lymphoid progenitor and methods of enriching the same |
| JP2014533494A (ja) * | 2011-11-21 | 2014-12-15 | ユニバーシティ・ヘルス・ネットワーク | 造血前駆体の集団および造血前駆体のための幹細胞を富化する方法 |
| WO2016076415A1 (ja) * | 2014-11-13 | 2016-05-19 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からｔ細胞への誘導方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 182, no. 11, JPN6018029375, 19 May 2009 (2009-05-19), pages 6879 - 6888, ISSN: 0004897883 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SG11201909795RA (en) | 2019-11-28 |
| JP2023164892A (ja) | 2023-11-14 |
| US20210102167A1 (en) | 2021-04-08 |
| AU2018257307A1 (en) | 2019-11-21 |
| BR112019022288A2 (pt) | 2020-05-19 |
| CN110691843B (zh) | 2023-10-20 |
| EP3617307A4 (en) | 2021-01-27 |
| CA3061289A1 (en) | 2019-10-23 |
| KR20200002909A (ko) | 2020-01-08 |
| JP7430877B2 (ja) | 2024-02-14 |
| EP3617307A1 (en) | 2020-03-04 |
| WO2018199186A1 (ja) | 2018-11-01 |
| CN110691843A (zh) | 2020-01-14 |
| TW201843301A (zh) | 2018-12-16 |
| EA201992483A1 (ru) | 2020-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6529541B2 (ja) | 幹細胞よりナチュラルキラー細胞を発生させる方法 | |
| KR102151210B1 (ko) | 규정된 조건하에서 인간 만능성 줄기 세포의 조혈내피세포 분화를 위한 방법 및 재료 | |
| CN108350429B (zh) | 用于将多能干细胞定向分化为免疫细胞的方法 | |
| JP7212615B2 (ja) | 多能性幹細胞からｈｌａホモ接合免疫細胞への指向分化方法 | |
| JP2024054194A (ja) | 造血細胞分化を誘導するための方法および組成物 | |
| CN107429232B (zh) | 免疫调节性提高的细胞及其使用和生产方法 | |
| JPWO2017221975A1 (ja) | Ｃｄ４ｃｄ８両陽性ｔ細胞の製造方法 | |
| JP2005512592A (ja) | 細胞性組成物ならびに細胞性組成物の作製法および細胞性組成物の使用法 | |
| JP2023164892A (ja) | 造血前駆細胞マーカー | |
| CN110997904A (zh) | 改进造血移植物的方法 | |
| EP3693456A1 (en) | Production method for ips cell-derived genetically diverse t cell colony | |
| CN114729318A (zh) | T细胞的制备方法 | |
| KR20240005792A (ko) | B 계통 세포의 분화 및 확장을 위한 조성물 및 방법 | |
| EA045419B1 (ru) | Маркер гемопоэтических клеток-предшественников | |
| WO2023001833A1 (en) | Method of producing a population of immune cells from pluripotent stem cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210407 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220419 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220616 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221018 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221216 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230217 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230530 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230829 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230919 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231107 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231215 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240124 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7430877 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |