CN107429232B - 免疫调节性提高的细胞及其使用和生产方法 - Google Patents

免疫调节性提高的细胞及其使用和生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及增加细胞群中PD‑L1和/或IDO‑1的表达的组合物和方法，表达增加的PD‑L1和/或IDO‑1的经调节的细胞，以及与通过表达增加的PD‑L1和/或IDO‑1的细胞所获得的免疫抑制作用有关的方法。

Description

免疫调节性提高的细胞及其使用和生产方法
相关申请的引用
本发明申请主张2015年1月26日提交的美国临时专利申请第 62/107,517号和2015年2月6日提交的美国临时专利申请第62/112,653号的35U.S.C.§119(e)的权益，以上每项专利以其全部内容作为参考并入本文。
发明背景
不受控制的免疫激活可能是致死的，并因此免疫系统是密切调节的，其部分通过对改变免疫细胞功能的炎症起反应的途径进行调节。
PD-L1也称为B7-H1，它是属于T细胞共抑制分子B7家族的跨膜蛋白质。PD-L1与其受体PD-1的结合减弱了T细胞的激活、降低了细胞毒性增殖并引起了细胞凋亡。一旦PD-L1表达增加，则造血干细胞和祖细胞 (HSPC)的免疫调节性也提高。已在癌症免疫疗法中描述了PD-L1阻断T 细胞激活和增殖的作用。更具体地，PD-L1能够通过竞争T细胞上的共刺激分子(例如，B7-1和/或B7-1)和通过T细胞上PD1的直接接合防止T 细胞激活。因此，PD-L1能够以细胞接触依赖性方式调节T细胞激活。此外，HSPC-基免疫疗法的治疗潜能似乎受PD-L1的内在低表达水平的限制。
尽管在离体培养后观察到HSPCs上PD-L1水平的提高，但是延长培养期可以导致复制应激反应、随机细胞缺陷和染色体异常。
IDO-1(吲哚胺2,3-加双氧酶)是催化必需氨基酸色氨酸(TRP)降解的酶。微环境中色氨酸的减少使T细胞增殖停止、引起TH1细胞凋亡并激活调控T细胞。这种免疫抑制方法还被多种其他免疫抑制细胞天然地使用，并且还被多种肿瘤使用来逃避免疫激活作用。尽管IDO酶是胞内的并且是非分泌的，但是由于邻近细胞对TRP接近降低起反应，IDO-1的代谢作用起初提供局部作用，然而，由于微环境缺少TRP，邻近但不与IDO-1表达细胞接触的细胞受影响。因此，在自身免疫情况中，IDO-1通过消除来自炎症性微环境的TRP来防止T细胞激活和增殖，并且激活调控T细胞的免疫应答抑制。在正常情况下，造血干细胞或祖细胞中IDO-1的表达是极低的。因此，造血干细胞和祖细胞中IDO-1水平的调节提供了影响那些细胞的免疫调节性的机会，并且一旦施用，影响患者细胞的免疫学性质。
因此，本领域所需要的是用于产生PD-L1和/或IDO-1表达增加的 HSPCs，但不将细胞暴露于体外过程和延长的细胞培养的应激的方法。
本发明通过一些分子或化合物的鉴别解决了这些限制，所述分子或化合物独立或组合地在短期孵育中药理学上调细胞，包括HSPCs上的PD-L1 和/或IDO-1表达。
发明概述
本发明公开提供了通过表达增加水平的程序性死亡配体1(PD-L1)和吲哚胺2,3-加双氧酶1(IDO-1)的细胞的免疫调节性调节免疫系统的组合物和方法。本发明公开涉及提高细胞群中PD-L1和/或IDO-1的表达的组合物和方法，表达增加的PD-L1和/或IDO-1的受调节的细胞和与通过表达增加的PD-L1和/或IDO-1的细胞所获得的免疫抑制作用有关的方法。
本发明的第一目标包括用于调节细胞群的方法，其包括：在存在能够增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种外源试剂的情况下孵育所述细胞群以获得PD-L1和/或IDO-1表达增加的细胞群。
在一个方面，所述孵育是体外的或离体的。
在一个方面，所述孵育在约5分钟至约72小时之间。在另一个方面，所述孵育在约4小时至约48小时之间。
在一个方面，在约4℃至约37℃之间的温度下进行所述孵育。在另一个方面，所述孵育是在约37℃的温度下进行的。
在一个方面，受调节的细胞中PD-L1和/或IDO-1表达的提高为至少3 倍。在一个方面，与未与外源试剂孵育的细胞相比，PD-L1和/或IDO-1的提高为约3倍至约80倍。
在一个方面，所述外源试剂选自一种或多种多核苷酸、一种或多种多肽、一种或多种小分子及其组合。在一个方面，所述多肽为干扰素受体激动剂。在另一个方面，所述干扰素受体激动剂选自IFN-α、IFN-β、IFN-ε、 IFN-κ、IFN-ω、IFN-γ或它们的组合。在具体的方面，所述细胞群受IFN-β和IFN-γ的调节。
在另一个方面，所述多核苷酸选自多聚(I:C)、编码PD-L1的多核苷酸和/或编码IDO-1的多核苷酸。
在一个具体方面，施用至少2个、至少3个或更多个外源试剂。在具体的方面，施用IFN-β、IFN-γ和多聚(I:C)。
在一个方面，所述多核苷酸选自多聚(I:C)、编码PD-L1的多核苷酸和/ 或编码IDO-1的多核苷酸。
在一个方面，所述小分子包括糖皮质激素、前列腺素途径激动剂、抗肿瘤药、多巴胺受体激动剂、粘液酸异美汀、硫酸双氢链霉素、普罗替林、替仑西平、环苯扎林、4-对氨水杨酸及其组合。在一个方面，所述前列腺素途径激动剂选自PGE2、dmPGE2、5(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2、8-异 -16-环己基-四去甲PGE2、16,16-二甲基PGE2(“dmPGE2”)，p-(p-乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯、11-脱氧-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-酮-氟前列醇、5-反式PGE2、17-苯基 -ω-三去甲PGE2、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四去甲PGE2、 15(S)-15-甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE2、8-异-15-酮PGE2、8-异PGE2异丙酯、8-异-16-环己基-四去甲PGE2、20-羟基PGE2、20-乙基PGE2、11-脱氧PGE1、诺氯前列素、硫前列酮、布他前列素、15-酮PGE2和19(R)羟基PGE2。
在一个方面，所述糖皮质激素选自甲羟松、阿氯米松、二丙酸阿氯米松、安西奈德、倍氯米松、二丙酸氯地米松、倍他米松、倍他米松苯甲酸酯、倍他米松戊酸酯、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、氯倍他索丁酸酯、丙酸氯氟美松、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质醇、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、去氧皮质酮、去羟米松(desoxymethasone)、地塞米松、二氟拉松、二氟拉松双乙酸酯、二氟可龙、二氟可龙戊酸酯、二氟可龙(difluorocortolone)、二氟泼尼酯、氟氯缩松、氟氯奈德、氟氢缩松、氟米松、氟米松、氟米松新戊酸酯、氟尼缩松、氟尼缩松半水化合物、肤轻松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、丁基氟可丁 (fluocoritin butyl)、氟可龙、氟可的松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟泼尼定乙酸酯、氟泼尼龙、氟替卡松、氟替卡松丙酸酯、福莫可他、哈西奈德、卤米松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋丙氢可的松、丙丁氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、氯替泼诺、甲泼尼松、6a-甲泼尼龙、甲泼尼龙、甲泼尼龙乙酸酯、醋丙甲泼尼龙、莫米松、莫米松糠酸酯、莫米松糠酸酯一水合物、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安西龙、曲安奈德和乌倍他索及其组合。在另一个方面，所述糖皮质激素选自倍他米松、丙酸氯倍他索、氟米松、氟轻松醋酸酯、甲羟松、氢化可的松、曲安西龙、阿氯米松和地塞米松。
在一个方面，所述抗肿瘤药选自吉西他滨、来曲唑和氟达拉滨并且所述多巴胺受体拮抗剂为羟哌氟丙嗪。
在一个方面，所述细胞群包含造血细胞。
在一个方面，所述细胞群是分离的。在具体的方面，所述造血细胞群来源于脐带血、外周血、骨髓或诱导的多潜能干细胞(iPSCs)。
在另一个方面，所述造血细胞群获自iPSCs。
在一个方面，所述群包含造血干/祖细胞(HSPCs)。
在一个方面，所述群包含至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约 99％的HSPCs。在一个方面，所述群包含基本纯的HSPCs群。
在一个方面，在与外源试剂接触前，对CD34+HPSCs富集细胞群。
本发明的第二目标包括通过所述第一方面及其方面中所述的方法获得的PD-L1和/或IDO-1表达增加的细胞群。
本发明的第三目标包括治疗免疫学病症的方法，其包括：向对其有需要的患者施用治疗有效量的通过任何上述实施方式和/或方面中所述的方法获得的细胞群。
在一个方面，所述细胞群包含造血细胞。在一个方面，所述造血细胞群来源于脐带血、外周血、骨髓或iPSCs。
在其他方面，所述细胞群包含HSPCs。
在另一个方面，所述细胞群包含至少约50％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的HSPCs。在具体的方面，所述细胞群包含基本纯的 HSPCs群。
在其他方面，在与外源试剂接触前，对CD34+HPSCs富集细胞群。
在一个方面，所述细胞群对患者是同种异体的。在另一个方面，所述细胞群与患者是HLA匹配的。在其他方面，所述细胞群包含单倍型增强的 HSPCs(haplotyped enchancedHSPCs)。在另一个方面，所述细胞群与患者是部分HLA-匹配或不匹配的。
在一个方面，所述治疗有效量的细胞群包含约2×106至约2×1010个 CD34+造血细胞。
在一个方面，所述方法包括不止一次施用治疗有效量的细胞。在一个方面，施用频率在约每隔一周至约每6个月的范围内。在另一个方面，与后续施用相比，初次施用为较多的细胞数目。
在一种实施方式中，所述免疫学病症为自身免疫病，其选自急性心肌梗塞、缺血性中风、1型糖尿病、糖尿病、多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、炎症性脱髓鞘病、狼疮、克罗恩氏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、溃疡性结肠炎、皮炎、过敏性肠综合征、白癜风、突眼性甲状腺肿、桥本氏病(Hashimoto's dosease)、阿狄森氏病、多肌炎、皮肤肌炎、重症肌无力、自身免疫肝炎、干燥综合征、自身免疫胃炎、硬化症、银屑病、哮喘或韦格纳肉芽肿。
在具体的方面，所述免疫学病症为移植物抗宿主病或移植排斥。在另一个方面，所述移植排斥起因于骨髓移植、实体器官移植或细胞疗法(例如，包含分离的干细胞的任何组合物)。
在一个方面，所述患者已经历至少一种高剂量、低强度或非清髓性处理。在一个方面，所述患者未经历至少一种高剂量、低强度或非清髓性处理。在其他方面，所述患者未经历处理。
在一个方面，所述患者不是细胞移植的候选者或者未接受移植。
本发明的第四目标包括治疗患者中炎症的方法，其包括：向对其有需要的患者施用治疗有效量的通过任何上述实施方式和/或方面中所述的方法获得的细胞群。
在一个方面，所述细胞群包含造血细胞。
在一个方面，所述造血细胞群来源于脐带血、外周血、骨髓或iPSCs。在具体的方面，所述群包含HSPCs。
在一个方面，所述群包含至少约50％的HPSCs、至少约50％、至少约 60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的HSPCs。在另一个方面，所述群包含基本纯的 HSPCs群。
在一个方面，在与外源试剂接触前，对CD34+HPSCs富集所述群。
在另一个方面，所述细胞群对患者是同种异体的。
在一个方面，所述细胞群与患者是HLA匹配的。在另一个方面，所述细胞群与患者是部分HLA-匹配或不匹配的。在另一个方面，所述细胞群包含单倍型增强的HSPCs。
在一个方面，所述治疗有效量的细胞群包含约2×106个细胞至约2×1010个CD34+造血细胞。
在一个方面，所述方法包括不止一次施用治疗有效量的细胞。在另一个方面，施用频率在约每隔一周至约每6个月的范围内。在一个方面，与后续施用相比，初次施用为较多的细胞数目。
在一个方面，所述炎症性病症选自肺、关节、结缔组织、眼、鼻、肠、肾、肝、皮肤、中枢神经系统、内分泌系统、心血管系统和心脏的炎症。
在一个方面，肺炎症选自哮喘、成人呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺部炎症、肺纤维化和囊性纤维化。
在一个方面，关节炎症选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、儿童类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎及其他关节炎病况。
在一个方面，眼部炎症选自葡萄膜炎(包括虹膜炎)、结膜炎、巩膜炎、干性角膜结膜炎和视网膜疾病，其包括，但不限于，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎以及干性和湿性年龄相关性黄斑变性。
在一个方面，肠炎症选自克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和远端直肠炎。
在一个方面，皮肤炎症选自银屑病、湿疹和皮炎(例如，湿疹性皮炎、特应性皮炎和面游风、过敏性或刺激性接触性皮炎、裂隙性湿疹、光变应性皮炎、光毒性皮炎、植物光化性皮炎、放射性皮炎和淤滞性皮炎)、硬皮病、由皮肤或粘膜创伤、灼伤、大疱性病症或缺血造成的溃疡和糜烂、一些形式的鱼鳞癣、大疱性表皮松解、肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、皮肤的内在衰老变化、光老化、由皮肤的机械剪切引起的摩擦性水疱、局部使用皮质类固醇引起的皮肤萎缩、唇炎、唇裂、鼻刺激、粘膜炎和外阴阴道炎。
在一个方面，内分泌系统炎症选自自身免疫性甲状腺炎(桥本氏病)、 I型糖尿病、II型糖尿病以及肾上腺皮质的急性和慢性炎症。
在一个方面，心血管系统炎症选自冠状动脉梗死损伤、周围性血管疾病、心肌炎、血管炎、血管再形成狭窄、动脉粥样硬化和与II型糖尿病有关的血管病。
在一个方面，肾炎症选自血管球性肾炎、间质性肾炎、狼疮肾炎、继发于韦格氏病的肾炎、继发于急性肾炎的急性肾功能衰竭、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture'ssyndrome)、阻塞后综合征和肾小管缺血(tubular ischemia)。
在一个方面，肝炎症选自肝炎(由病毒感染、自身免疫反应、药物治疗、毒素、环境剂引起，或者作为原发性病症的继发性结果)、胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化(primarybiliary cirrhosis)和原发性硬化性胆管炎。
在一个方面，中枢神经系统炎症选自多发性硬化和神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或与HIV感染有关的痴呆。
在一个方面，所述施用是全身性的。在另一个方面，所述施用是局部的。
在一个方面，所述施用是静脉内、动脉内、肌内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下(皮下)、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、胸骨内注射或通过输注。
在一个方面，所述方法是组合疗法的一部分。
本发明的第五目标包括药物组合物，其包含与未调节造血细胞群中 PD-L1和/或IDO-1的表达水平相比，表达约3倍至约80倍增加的PD-L1 和/或IDO-1表达水平的调节的造血细胞群。
在一个方面，所述药物组合物还包含药物可用的载体。
在一个方面，造血细胞群来源于脐带血、外周血、骨髓或iPSCs。
在具体的方面，所述造血细胞群来源于分化的iPSCs。
在一个方面，所述群包含HSPCs。在另一个方面，所述群包含至少约 50％的HPSCs、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的HSPCs。在另一个方面，所述造血细胞群包含基本纯的HSPCs群。
在一个方面，对CD34+HPSCs富集所述群。
在一个方面，将所述组合物配制用于静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、鞘内施用、囊内施用、眶内施用、心内施用、皮内施用、腹膜内施用、经气管施用、皮下(皮下)施用、表皮下施用、关节内施用、被膜下施用、蛛网膜下施用、脊柱内施用、胸骨内施用和输注。
在一个方面，所述药物组合物配制用于局部或非静脉内施用。
在一个方面，所述细胞群包含约2×106至约2×1010个CD34+造血细胞。
本发明的第六目标包括试剂盒，其包含获自本发明的第一目标的调节细胞或者根据本发明的第五目标的药物组合物和用于在组合疗法中使用的第二活性剂。
附图说明
图1A-图1E示出了在用于增加PD-L1表达的造血干细胞和祖细胞调节后的基因表达。
图2A-图2D示出了在用于增加PD-L1表达的调节后造血干细胞和祖细胞上PD-L1的表面表达。
图3示出了在存在具有调节的PD-L1表达的HSC的情况下的T细胞增殖。
图4示出了在用于增加PD-L1表达的造血干细胞和祖细胞调节后的基因表达。
图5A-图5D示出了在用于增加IDO-1表达的调节后造血干细胞和祖细胞中的IDO-1基因表达水平。
图6示出了在37℃，使用其他外源试剂用于增加IDO-1表达的24小时调节。
图7示出了在用于增加PD-L1表达的6、24或48小时调节后，造血干细胞和祖细胞的PD-L1表面表达。
图8示出了在调节后，受调节的细胞是活的并且在多种条件中维持时，在细胞表面表达PD-L1。
图9A和图9B示出了离体处理的人干细胞和祖细胞抑制自体同源和同种异体T细胞的增殖。
图10示出了人CD34+干细胞和祖细胞中PD-L1的基因过表达增加了T 细胞增殖的抑制。
图11示出了人CD34+干细胞和祖细胞中IDO-1的基因过表达增加了T 细胞增殖的抑制。
图12示出用来自表现出IDO-1表达上调的受调节的造血细胞群的培养基处理的T细胞显著抑制T细胞增殖。
发明详述
I.定义
冠词“一个”和“所述”在本文中用于表示1个或不止1个(即至少1个) 所述冠词的语法上的对象。举例来说，“1个元素”表示1个元素或不止1个元素。
替代物的使用(例如，“或”)应理解为表示所述替代物中的任一个、两者或它们的任意组合。
如本文所使用的，术语“约”或“大约”是指相比于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，改变多至15％、10％、 9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一种实施方式中，术语“约”或“大约”是指参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的约±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
如本文所使用的，术语“基本上”是指参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的90％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或更高的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一种实施方式中，“基本相同”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同的产生作用，例如，生理作用的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
如本文所使用的，术语“基本上不含”和“本质上不含”是可互换使用的，并且当用于描述组合物，如细胞群或培养基时，表示不含特定物质，如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含特定物质或者如通过传统方法所测量的是不可检测的组合物。在一种实施方式中，“基本纯的”可以用于表示所述组合物或组分基本不含污染物，如其他细胞类型。当提及不含组合物的特定物质或组分时，可以将类似含义应用于术语“不含”。
在整个说明书中，对“一种实施方式”、“实施方式”、“具体实施方式”、“相关实施方式”、“某些实施方式”、“其他实施方式”或者“其他实施方式”或它们的组合的提及表示结合所述实施方式所描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一种实施方式中。因此，在整个说明书的不同位置出现上述短语不必需全部表示相同的实施方式。此外，具体特征、结构或特性可以以任何适合的方式合并在一种或多个种实施方式中。
在整个说明书中，除非上下文需要，否则单词“包含”将被理解为表示包括所指明的步骤或元素或者步骤或元素的组，但是不排除任何其他步骤或元素或者步骤或元素的组。如本文所使用的，术语“包括”和“包含”以同义使用。
“由……组成”表示包括并且限于短语“由……组成”中所列的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列元素是所需的或强制的，并且不可以出现其他元素。
“基本由……组成”表示包括该短语中所列的任何元素，并且限于不防碍或者有助于发明公开中对所列元素指定的活动或动作的其他元素。因此，短语“基本由……组成”表示所列元素是所需的或强制的，但是没有其他元素是可选的并且基于它们是否会影响所列元素的活动或动作，其他元素可以或可以不出现。
术语“离体”通常是指发生在生物之外的活动，如在生物之外的人工环境中在活组织中或上进行的实验或测量，优选地，以最小的自然条件变化进行。在具体的实施方式中，“离体”程序包括通常在无菌条件下，从在实验仪器中培养或调控几小时或长达约24小时，但是根据情况，包括长达48或 72小时的生物中采取的活细胞或组织。在某些实施方式中，可以收集和冷冻这些组织或细胞，并且随后融化用于离体处理。在一种实施方式中，离体调节为至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9 小时、至少约12小时、至少约18小时、至少约24小时或至少约36小时。在一种实施方式中，离体调节为时间段，其范围在约1小时至约72小时、约2小时至约48小时、约4小时至约48小时、约6小时至约48小时、约 12小时至约48小时、约1小时至约24小时、约2小时至约24小时、约4 小时至约24小时、约6小时至约24小时、约12小时至约24小时、约1 小时至约12小时、约4小时至约12小时、约6小时至约12小时或约8小时至约12小时。通常将使用活细胞或组织进行的持续长于几天的组织培养实验或程序认为是“体外的”，尽管在某些实施方式中，该术语可以与离体互换使用。
术语“体内”通常是指在生物体内发生的活动。
“离体施用”、“离体治疗”或“离体调节”的描述一般是指其中一种或多种器官、细胞或组织获自活的或近期死亡的受试者，任选地是纯化/富集的，暴露于治疗或程序(例如，离体施用步骤，其包括将细胞与本发明所述的组合物或试剂孵育以提高特定细胞，如造血干细胞或祖细胞的移植)的医学程序。可以将离体处理的细胞施用于供体或不同活受试者。
这些离体治疗应用还可以包括任选的体内处理或程序步骤，如通过向活受试者施用一次或多次具有治疗潜能的细胞。根据本领域中熟知的技术并且如在本文其他地方所述的，对这些实施方式考虑了局部和全身施用两者。施用于受试者的治疗细胞的量将取决于受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性以及对药物和/或细胞移植的反应程度、严重性和类型。
如本文所使用的，术语“孵育”用于描述调控细胞或细胞群的特定步骤。孵育步骤可以包括调控细胞或细胞群的具体温度、试剂或条件。
如本文所使用的，术语“外源的”与术语“异源的”是可互换使用的，并且表示来自天然来源之外的一些来源的物质。例如，术语“外源蛋白质”或“外源细胞”表示来自非天然来源或位置并且已人工提供给生物系统的蛋白质或细胞。相反，术语“內源蛋白”或“内源细胞”表示对于生物系统、物种或个体是天然的蛋白质或细胞。
如本文所使用的短语“干细胞”是指具有以下能力的未分化细胞：(1)能够长期自更新，或者能够产生原始细胞的至少一种相同复制，(2)能够在单细胞水平分化为多种，并且在一些情况下，仅一种特化细胞类型和(3) 能够使组织体内功能性再生。根据它们的发育可能，将干细胞亚分类为全能、多潜能、多能和寡能/单能干细胞。“祖细胞”还具有自更新和分化为更多成熟细胞的能力，但是其定型为特定的系(例如，造血祖代定型为血液系；骨髓祖代定型为骨髓系；淋巴祖代定型为淋巴系)，尽管干细胞不必需这样限制。“自更新”是指具有产生不变的子代细胞并因此补充和维持其群数目并且产生特化细胞类型(潜能)的独特能力的细胞。可以通过两种方式实现自更新。不对称细胞分裂生产了一个与亲代细胞相同的子代细胞和一个与亲代细胞不同的子代细胞，并且是更定型的祖细胞或分化的细胞。对称细胞分裂生产了两个相同的子代细胞。细胞的“增殖”或“扩增”是指对称分裂细胞。
如本文所使用的，术语“祖代”或“祖细胞”是指具有自更新和分化为更多成熟细胞的能力的细胞。与多潜能干细胞和多能干细胞相比，祖细胞具有降低的效力。多个祖细胞沿单一系分化，但是还可以具有相当广泛的增殖能力。
如本文所使用的，术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指通过抗原标志物CD34(CD34+)的存在所鉴别的并因此表现出CD34+细胞特性的细胞，以及这些细胞的群。在具体的实施方式中，术语“HSPC”是指通过抗原标志物CD34(CD34+)的存在和系(Lin)标志物的不存在所鉴别的并因此表现出CD34+/Lin(-)细胞特性的细胞，以及这些细胞的群。已认识到包含 CD34+和/或Lin(-)细胞的细胞群还包含造血祖细胞。术语“造血细胞”是指从 HSPC到完全分化的血细胞的范围内的细胞连续区，其包括骨髓和淋巴系的所有细胞。
如本文所使用的，术语“诱导的多潜能干细胞”或者iPSCs表示从分化的成年、新生或胎儿细胞产生干细胞，所述细胞已被诱导或改变，即重编程为能够分化为所有三种胚层或皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。所产生的iPSCs不表示如自然中所存在的细胞。
如本文所使用的，“未接触的”或“未处理的”细胞是未用对照试剂之外的试剂处理，例如，培养、接触或孵育的细胞。与DMSO(对照试剂)接触或与另一种媒介物接触的细胞是未接触的细胞。
如本文所使用的，术语“分离的”是指从其原始环境中除去的材料。例如，如本文所使用的“分离的细胞群”、“分离的细胞源”或“分离的HSPCs”等表示一个或多个细胞与其天然细胞环境和与组织或器官的其他组分的结合的体外或离体分离，即它未与体内物质明显结合。
如本文所使用的，术语“试剂”和“外源试剂”是可互换使用的，以表示能够增加与所述试剂接触的细胞中PD-L1和/或IDO-1表达的化合物或分子。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物，优选地人患者、家畜或其他驯养动物。
如本文所使用的，术语“治疗”是指获得所需的药理学和/或生理学作用，其无限制地包括实现疾病症状的改善或去除。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述作用可以是预防性的，和/或就实现症状的改善或去除或者提供疾病和/或可归因于该疾病的不利作用的部分或完全治愈而言，所述作用可以是治疗性的。如本文所使用的“治疗”涵盖了哺乳动物，具体地人中任何疾病的治疗，并且包括：(a)防止疾病在对所述疾病易感但尚未诊断为患病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)减轻疾病，例如，导致疾病消退，例如，完全或部分消除疾病症状；和(d)使个体恢复至疾病前状态，例如，重构造血系统。
术语“增加”、“促进”、“提高”和“激活”一般地是指与媒介物或对照分子 /组合物所引起的反应，例如，细胞，如(例如)造血干细胞和祖细胞中PD-L1 和/或IDO-1表达增加相比，试剂产生或导致细胞中更大生理反应(即下游作用)的能力。可测量的生理反应可以包括细胞调节受试者中免疫应答的能力的提高。“提高”或“增加”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括媒介物(没有试剂)或者对照组合物所产生的反应的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括它们之间并且大于1的所有整数和小数的点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等) 的提高。
术语“减少”、“降低”、“减轻”、“降低”和“减少”一般地是指与媒介物或者对照分子/组合物所引起的反应相比，试剂产生或导致细胞中较少生理反应(即下游作用)的能力。“减少”或“降低”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括媒介物(没有试剂)或者对照组合物所产生的反应的1.1、1.2、 1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括它们之间并且大于1的所有整数和小数的点，例如，1.5、 1.6、1.7、1.8等)的降低。
细胞的“治疗潜能”是指细胞的治疗质量，当施用于受试者时，细胞提供治疗益处的能力。在具体的实施方式中，可以通过PD-L1和/或IDO-1表达的提高来测量、定量、确定、鉴别或验证细胞的治疗潜能。治疗潜能包括但不限于细胞抑制受试者中免疫应答的能力。
术语“基因”表示参与产生多肽链的DNA部分；它包括编码区之前和之后的区域(前导和尾随)以及各个编码段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文所使用的“基因表达”或“表达”是指RNA(例如，mRNA、rRNA、 tRNA、miRNA或snRNA)产生中的基因转录，以及蛋白质产生中mRNA 的翻译或者转录基因的翻译产物的相对水平。可以在生物样品，如造血细胞、干细胞和祖细胞或者包含干细胞或祖细胞，包括但不限于造血干细胞和祖细胞的细胞群中检测基因表达和/或基因表达方式。
“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许在宿主细胞中转录特定核酸的一系列指明的核酸元件。所述表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包括可操作性地连接至启动子的待转录的核酸。
术语“PD-L1”是指编程死亡-配体1，它是由CD274基因编码的40kDa 1 型跨膜蛋白质。PD-L1结合至其受体PD-1，该受体存在于激活的T细胞、 B细胞和骨髓细胞上。PD-L1也称为“CD274”、“B7同源物1”和“B7-H1”。
“IDO-1”是指吲哚胺2,3-加双氧酶，它是催化必需氨基酸色氨酸(TRP) 氧化分解并产生犬尿氨酸(KYN)途径代谢产物的46kDA的酶。
如本文所使用的术语“调节”是指细胞生理状态的变化或者改变或修改细胞性质。例如，增加所需靶标基因，如PD-L1和/或IDO-1的表达，或者提高或降低细胞的免疫应答。
II.细胞调节
本发明提供了通过表达增加水平的程序性死亡配体1(PD-L1)和吲哚胺2,3-加双氧酶1(IDO-1)的细胞的免疫调节性调节免疫系统的组合物和方法。本发明一般地涉及使用外源试剂调节细胞以实现细胞中PD-L1和/或 IDO-1表达增加的方法和组合物。本发明还涉及PD-L1和/或IDO-1表达增加的细胞，以及在治疗应用，包括免疫学病症和炎症治疗中使用这些细胞的方法。
本发明的一些方面涉及调节细胞以实现PD-L1和/或IDO-1表达增加的条件。在一些实施方式中，这些条件包括将所述细胞与能够增加细胞中 PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种外源试剂接触。在一种实施方式中，将所述细胞与至少两种或至少三种外源试剂接触。
可以(例如)通过在存在能够增加细胞中PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种外源试剂的情况下孵育所述细胞来发生这种接触。用于接触细胞的条件可以体外或离体发生，例如，如在标准培养条件下。
本发明的另一个方面涉及细胞与能够增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种试剂接触的时间段。在一些实施方式中，细胞与所述一种或多种试剂接触约5分钟至约96小时。在其他实施方式中，细胞与所述一种或多种试剂接触约1小时、约2小时、约3小时、约5小时、约10小时、约24 小时、约48小时、约96小时或者这些具体提及的时间之间的任何时间段。在一种实施方式中，细胞接触约4小时至约48小时。在本发明的一些方面，细胞在存在能够增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种试剂的情况下扩增。本发明的另一个方面涉及使用至少一种外源试剂调节细胞的温度。因此，可以在导致细胞中PD-L1和/或IDO-1表达增加的任何温度调节细胞。在本发明的一些非限制性实施方式中，在约4℃至约37℃之间的温度下调节细胞。在一种实施方式中，在约37℃调节细胞。
本发明的一个方面涉及由能够增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种试剂调节所引起的细胞中PD-L1和/或IDO-1表达的定量提高。据考虑这种提高可以是与处理前细胞相比的约10％、约20％、约30％、约40％、约 50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200％或以上。在具体的实施方式中，在与对照细胞相比足以将受调节的细胞中 PD-L1和/或IDO-1的表达增加至少2、3、5、10、20、30、40、50、60、 70或80倍或以上的条件下，调节PD-L1和/或IDO-1表达增加的细胞。这种增加可以与基因表达的增加或者蛋白质表达的提高有关。
用于确定样品中基因表达水平的适合方法包括，但不限于，核酸扩增，例如，通过RT-PCR(美国专利No.4,683,202)、连接酶链式反应(Barany, Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-93,1991)、自主序列复制(Guatelli等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-78,1990)、转录扩增系统(Kwoh等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-77,1989)、Q-β复制酶(Lizardi等人, Bio/Technology 6:1197,1988)、滚环复制(美国专利No.5,854,033)或者任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增分子。
如本文所使用的，术语“足以……条件”或者“在足以……条件下”是指与对照、媒介物或未处理细胞相比，用一种或多种试剂处理细胞使细胞中 PD-L1和/或IDO-1的表达增加至出人意料和意外的水平的条件。条件包括，但不限于，用于处理细胞的试剂和试剂浓度、细胞暴露于试剂的时间和处理温度。
A.调节试剂
本发明的方面涉及用于调节细胞以增加PD-L1表达的试剂。这些试剂包括(但不限于)多核苷酸、多肽、小分子或它们的组合。用于调节细胞的小分子包括，但不限于，糖皮质激素和/或前列腺素途径激动剂、抗肿瘤药、多巴胺受体激动剂及其他试剂。
i.肽
a.干扰素受体激动剂
在本发明的一些方面，通过与一种或多种干扰素受体激动剂接触来调节细胞。适合本发明使用的干扰素受体激动剂包括，但不限于，I型、II型、 III型干扰素受体的任何天然存在的或非天然存在的配体，其结合至并导致通过所述受体的信号转导。这些干扰素受体激动剂包括干扰素，其包括天然存在的干扰素、修饰的干扰素、合成的干扰素、聚乙二醇化的干扰素、包含干扰素和异源蛋白质的融合蛋白、对干扰素受体特异的抗体、非肽化学激动剂等。
在本发明的一些方面，干扰素受体激动剂包括干扰素，其选自IFN-α、 IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-γ或它们的组合。在本发明的一种非限制性实施方式中，用IFN-β调节细胞。在本发明的另一个非限制性实施方式中，用IFN-γ调节细胞。在另一种实施方式中，用IFN-β和IFN-γ调节细胞。
b.多核苷酸编码肽
在本发明的一些方面，用包含多聚(I:C)的多核苷酸调节细胞。多聚(I:C)，也称为多聚肌苷酸-多聚胞嘧啶核苷酸，它是合成的双链RNA，由聚核糖肌苷酸(多聚I)链和聚核糖胞苷酸(多聚C)链组成。已知多聚(I:C)与Toll 样受体3(TLR3)相互作用，而Toll样受体3在B细胞、巨噬细胞和树突状细胞的膜中表达。用于本发明使用的商品化多聚(I:C)来源包括，但不限于，InvivogenTM(CAS号31852-29-6)；TocrisTM(CAS号24939-03-5)、 GE HealthcareLife SciencesTM(产品编码27-4732-01)和Sigma-AldrichTM (CAS号42424-50-0)
在本发明的一些方面，用能够增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种多核苷酸调节细胞。适合的多核苷酸包括编码一种或多种功能性PD-L1 多肽的外源多核苷酸。适合的多核苷酸可以包括编码一种或多种功能性 IDO-1多肽的外源多核苷酸。这些多核苷酸可以构成表达盒的一部分，其用于遗传修饰细胞以表达外源PD-L1或者IDO-1多肽。用于本发明使用的多核苷酸包括，但不限于，编码人、小鼠、兔、大鼠、牛、马、山羊或非人灵长类PD-L1或者IDO-1多肽的那些。
在一种实施方式中，所述表达盒包含在载体中。因此，在一个方面，用包含能够增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种多核苷酸的载体调节细胞。用于这些目的的载体的实例包括能够指导靶细胞中核酸表达的表达质粒。在其他实例中，所述载体是病毒载体系统，其中将所述核酸引入能够转染靶细胞的病毒基因组。在优选的实施方式中，所述多核苷酸可以可操作性地连接至可以指导所述基因在所需靶标宿主细胞中表达的表达和对照序列。因此，可以在适当的条件下在靶细胞中实现所述核酸的表达。
在本发明核酸的表达中有用的病毒载体系统包括(例如)天然存在的或重组病毒载体系统。基于具体应用，适合的病毒载体包括复制型、复制缺陷型和条件复制型病毒载体。例如，病毒载体可以来源于人或牛腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、腺病毒相关病毒、小鼠细小病毒(MVM)、HIV、辛德毕斯病毒和反转录病毒(包括但不限于劳氏肉瘤病毒)、仙台病毒和 MoMLV的基因组。通常，将所关心的基因插入到这些载体中以允许基因构件体的包装，通常与伴行病毒DNA一起包装，然后感染敏感宿主细胞并表达所关心的基因。因此，在一种实施方式中，将要调节的细胞与包含能够增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种多核苷酸的病毒载体接触。
ii.前列腺素途径激动剂
在本发明的一些方面，通过与一种或多种前列腺素途径激动剂接触调节细胞以增加PD-L1和/或IDO-1的表达。这些前列腺素途径激动剂包括，但不限于，cAMP类似物或增强剂、Gα-s激活剂、选择性结合PGE2EP2或 PGE2EP4受体的化合物、糖皮质激素及其组合。
如本文所使用的，术语“前列腺素途径激动剂”是指刺激前列腺素细胞信号通路的试剂，包括刺激PGE2R2和/或PGE2R4细胞信号通路的试剂。适合在根据本发明的调节细胞中使用的前列腺素途径激动剂的说明性实例包括，但不限于，PGE2、dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2、8- 异-16-环己基-四去甲PGE2和PGE2类似物。在某些实施方式中，PGE2R2和PGE2R4激动剂及其类似物是特别关心的，并且在一些实施方式中，所述试剂优选地结合并激活PGE2EP2或PGE2EP4受体。
如本文所使用的，术语“前列腺素E2”或“PGE2”无限制地包括任何天然存在的或化学合成的PGE2分子及其“类似物”。如本文所使用的，术语“类似物”涉及在结构和功能上与另一种化学物质类似的化学分子，例如，PGE2，通常其在结构上存在单个元素或基团的差异，但是如果保留了与母体化合物相同的功能，则可以相差不止一个基团(例如，2、3或4个基团)的修饰。
PGE2“类似物”的说明性实例无限制地包括16,16-二甲基PGE2 (“dmPGE2”)，p-(p-乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯、11-脱氧-16,16-二甲基 PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-酮- 氟前列醇、5-反式PGE2、17-苯基-ω-三去甲PGE2、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四去甲PGE2、15(S)-15-甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE2、8-异-15-酮PGE2、8-异PGE2异丙酯、8-异-16-环己基-四去甲PGE2、20-羟基 PGE2、20-乙基PGE2、11-脱氧PGE1、诺氯前列素、硫前列酮、布他前列素、15-酮PGE2和19(R)羟基PGE2。还包括具有与PGE2类似的结构并且在 9-位被卤素取代的前列腺素类似物(参见，例如，WO2001112596，其以其全部内容作为参考并入本文)和2-脱羧-2-磷酸亚基前列腺素衍生物，如美国专利公开No.2006/0247214中所述的那些，其以其全部内容作为参考并入本文)。
还可以使用PGE1类似物(其无限制地包括前列地尔)激活PGE2R2(EP2) 和PGE2R4(EP4)细胞信号通路，并且考虑用作在本发明所述的方法中有用的试剂。
不受任何具体理论和机制的限制，PGE2R2(EP2)和PGE2R4(EP4)细胞信号通路的刺激/激活导致PD-L1和/或IDO-1表达的增加。因此，在一种实施方式中，考虑了结合至并刺激PGE2R2和PGE2R4受体的“非-PGE2-基配体”(即PGE2R2/PGE2R4激动剂)在本发明所述的方法中的使用。非PGE2基EP2受体激动剂的说明性实例包括CAY10399、ON0O_8815Ly、 ONO-AE1-259、CP-533,536和在WO 2007/071456中公开的咔唑和芴。
非PGE2基EP4激动剂的说明性实例包括ONO-4819、APS-999Na、 AH23848、ONO-AE1-329以及在WO/2000/038663；美国专利No. 6747037；和美国专利No.6610719中公开的其他非-PGE2基EP4激动剂)。
在本发明的一些方面，使用对PGE2EP4受体具有选择性并优先结合的试剂调节细胞。这些试剂对EP4受体的亲合力高于对任何其他三种EP受体 (即EP1、EP2和EP3)的亲合力。选择性结合PGE EP4受体的试剂包括，但不限于，选自下列的试剂：5-[(lE,3R)-4,4-二氟-3-羟基-4-苯基-1-丁烯-1- 基]-1-[6-(2H-四唑-5R-基)己基]-2-吡咯烷酮；2-[3-[(lR,2S,3R)-3-羟基 -2-[(E,3S)-3-羟基-5-[2-(甲氧基甲基)苯基]戊-1-烯基]-5-氧环戊基磺酰基丙基磺酰基]乙酸；甲基4-[2-[(lR,2R,3R)-3-羟基-2-[(E,3S)-3-羟基-4-[3-(甲氧基甲基)苯基]丁-1-烯基]-5-氧环戊基]乙基磺酰基]丁酸酯；16-(3-甲氧基甲基)苯基-ro-四降-5-thiaPGE；5-{3-[(2S)-2-{(3R)-3-羟基-4-[3-(三氟甲基)苯基]丁基}-5-氧吡咯烷-1-基]丙基]噻吩-2-羧酸酯；[4'-[3-丁基-5-氧-1-(2-三氟甲基- 苯基)-1,5-二氢-[1,2,4]三唑-4-基甲基]-二苯基-2-磺酸(3-甲基-噻吩-2-羰基)- 酰胺]；和((Z)-7-{(lR,4S,5R)-5-[(E)-5-(3-氯-苯并[b]噻吩-2-基)-3-羟基-戊-1- 烯基]-4-羟基-3,3-二甲基-2-氧-环戊基}-庚-5-烯酸)以及任何这些试剂的药物可用的盐。
在具体的实施方式中，所述前列腺素途径激动剂包括PGE2、 16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2或8-异-16-环己基-四去甲PGE2。
iii.糖皮质激素
在本发明的一些方面，通过与糖皮质激素和/或糖皮质激素受体激动剂接触来调节细胞对PD-L1和/或IDO-1表达的增加。
适合本发明使用的糖皮质激素和糖皮质激素受体激动剂的说明性实例包括，但不限于，甲羟松、阿氯米松、二丙酸阿氯米松、安西奈德、倍氯米松、二丙酸氯地米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、戊酸倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、丁酸氯倍他索、丙酸氯氟美松、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质醇、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、去氧皮质酮、去羟米松(desoxymethasone)、地塞米松、二氟拉松、双乙酸二氟拉松、二氟可龙、戊酸二氟可龙、二氟可龙 (difluorocortolone)、二氟泼尼酯、氟氯缩松、氟氯奈德、氟氢缩松、氟米松、氟米松、新戊酸氟米松、氟尼缩松、氟尼缩松半水化合物、肤轻松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、丁基氟可丁、氟可龙、氟可的松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、乙酸氟泼尼定、氟泼尼龙、氟替卡松、氟替卡松丙酸酯、福莫可他、哈西奈德、卤米松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋丙氢可的松、丙丁氢化可的松、丁酸氢化可的松、氯替泼诺、甲泼尼松、6a- 甲泼尼龙、甲泼尼龙、乙酸甲泼尼龙、醋丙甲泼尼龙、莫米松、莫米松糠酸酯、莫米松糠酸酯一水合物、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安西龙、曲安奈德和乌倍他索及其组合。
在具体的实施方式中，所述糖皮质激素包括倍他米松、丙酸氯倍他索、氟米松、氟轻松醋酸酯、甲羟松、氢化可的松、曲安西龙、阿氯米松或地塞米松。在更具体的实施方式中，糖皮质激素是甲羟松。
iv.其他试剂
对于IDO-1特别关心的其他试剂包括抗肿瘤药(如吉西他滨、来曲唑和氟达拉滨)、多巴胺受体拮抗剂(例如，羟哌氟丙嗪)和多种其他试剂，如粘液酸异美汀、硫酸双氢链霉素、普罗替林、替仑西平、环苯扎林和4- 对氨水杨酸。
B.细胞
本发明的方面涉及调节以实现PD-L1和/或IDO-1表达增加的细胞。因此，可以使用对通过能够提高细胞或细胞组合中PD-L1表达的一种或多种试剂的调节起反应的任何细胞或细胞组合来实践本发明。
对于它们所施用的受试者，用于本发明使用的细胞可以是自体同源的、同种异体的、同基因的或异基因的。如本文所使用的“自体同源的”是指来自相同受试者的细胞。如本文所使用的“同种异体的”是指与相比较的细胞在遗传上不同的相同种的细胞。如本文所使用的“同基因的”是指与相比较的细胞在遗传上相同的不同受试者的细胞。如本文所使用的“异基因的”是指与相比较的细胞不同种的细胞。在优选的实施方式中，本发明所述的细胞是同种异体的。
用于本发明使用的细胞包括，但不限于，干细胞、祖细胞和分化的细胞。本文所述的干细胞可以包括胚胎干细胞、诱导的多潜能干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、胎盘干细胞、间质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、心脏干细胞、T细胞、肾干细胞、造血干细胞和肌肉干细胞。所述细胞可以获自组织分离块、细胞原代培养、无性系细胞或逐次扩增的细胞。
所述细胞可以存在于细胞群中。细胞群包括全血样品，例如，全脐带血、全动员外周血、全骨髓样品；表达特定标志物的分离细胞，例如，CD34+；和造血干细胞和祖细胞。适合用于本发明方法中使用的细胞源包括，但不限于，分离或获自含有造血源细胞的身体的器官或组织的细胞。“分离的”是指从其原始环境中除去的材料。例如，如果与其天然状态中通常相伴的一些或全部组分分离，则细胞是分离的。例如，如本文所使用的“分离的细胞群”、“分离的细胞源”或“分离的造血干细胞”等表示一个或多个细胞与其天然细胞环境和与组织或器官的其他组分的结合的体外或离体分离，例如，它未与体内物质明显结合。
本文所述的细胞群可以获自骨髓、脐带血、动员的外周血、华顿氏胶质、胎盘、胎儿血液或获自诱导的多潜能干细胞(iPSC)。
在一种实施方式中，本发明的组合物和方法可以使用“造血细胞”，例如，选自从HSPC到完全分化的血细胞的范围内的细胞连续区的细胞，其包括骨髓和淋巴系的所有细胞。因此，在一种实施方式中，适合用于本发明方法中使用的细胞源包括，但不限于，分离或获自含有造血源细胞的身体的器官或组织的细胞。在另一种实施方式中，所述细胞可以获自iPSC或者 iPSCs群，其中iPSC分化以形成造血细胞。
因此，用于本文所述方法中的调节和使用的造血细胞可以获自骨髓。用于本文所述方法中的调节和使用的造血细胞可以获自脐带血。用于本文所述方法中的调节和使用的造血细胞可以获自动员的外周血。用于本文所述方法中的调节和使用的造血细胞可以获自华顿氏胶质。用于本文所述方法中使用的造血细胞可以获自胎盘。用于本文所述方法中的调节和使用的造血细胞可以获自胎儿血液。
本文所述的造血细胞可以获自或分离自未分级或分级的成人骨髓，其包括股骨、髋骨(例如，骼脊)、肋骨、胸骨或任何其他含有骨髓的骨骼。本文所述的造血细胞可以通过使用针头和注射器从髋骨中移除来直接获得或分离，或者其获自或分离自血液，通常在用引起细胞从骨髓隔室释放或动员的细胞因子(如G-CSF(粒性白细胞集落-刺激因子))预处理后进行。本文所述的其他造血细胞源包括脐带血、胎盘血和动员的外周血。
本文所述的造血细胞可以收获(例如，分离)自造血源，例如，骨髓细胞、脐带血或动员外周血细胞。将“收获”造血干细胞和祖细胞定义为细胞从基质中移去或分离。这可以使用本领域中已知的一些方法完成，其包括 (例如)酶促、非酶促、离心、电或尺寸-基方法，或者优选地通过使用媒介物(例如，其中孵育细胞的培养基)冲洗细胞。在具体的实施方式中，可以通过动员供体中的干细胞和祖细胞来获得收获足够量的用于移植的细胞。
在本发明的一些方面，HPSCs获自动员的外周血。“造血干细胞动员”是指在移植之前，出于白细胞除去的目的将干细胞从骨髓释放到外周血循环中。造血生长因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF))或化疗剂通常用于刺激动员。商品化干细胞动员药物，例如，MOZOBILTM可以结合 G-CSF使用以动员足够量的HPSCs用于向受试者移植。可以通过用促进造血干细胞/祖细胞(HPSC)从骨髓向外周血的募集的试剂处理供体来获得动员的外周血。适合用于在本发明中使用的用于动员外周血的试剂和方法包括，但不限于，以下参考文献中公开的那些，这些文献的公开内容以其全部内容作为参考并入：Lemoli et al.,Haematologica,2008Mar:93:321-324； Pelus,Curr Opin Hematol.2008Jul；15(4):285-92；和US 2012/0003189。
用于在本发明的治疗性组合物和方法中使用的造血细胞可以获自多潜能干细胞源(例如，诱导的多潜能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs))。如本文所使用的，术语“诱导的多潜能干细胞”或“iPSC”是指已重编程为多潜能状态的非多潜能细胞。一旦受试者的细胞重编程为多潜能状态，则细胞可以分化为所需的细胞类型，如造血干细胞或祖细胞。如本文所使用的，术语“重编程”是指将细胞的潜能提高至较少分化的状态的方法。适合用于重编程细胞(例如，体细胞)至iPSC的方法和材料包括，但不限于，以下文档所公开的那些，这些文档的全部内容作为参考并入：美国专利公开No. 2011/0076678；美国专利公开No.2013/0102074；美国专利公开No. 2010/0310525；美国专利公开No.2011/0110899；美国专利公开No. 2007/0254884；US 2012/0028351；美国专利公开No.2012/0264218；美国专利No.8,932,856；Yamanaka等人.Cell.2006Aug 25；126(4):663-76、Zhou 等人.Cell StemCell Stem Cell.2009May 8；4(5):381-4；Wemig等人.Nature. 2007Jul 19；448(7151):318-24；Okita等人.Science.2008Nov 7；322(5903):949-53；Woltjen等人,Nature.2009Apr 9；458(7239):766-70；美国专利公开No.2010/0233804；美国专利公开No.2012/0264218；美国专利 No.7,592,177；美国专利No.7,951,592；美国专利No.8,071,369；美国专利 No.8,309,555；和美国专利No.8,906,677。
可以使用本领域中熟知的技术纯化本文所述的造血细胞。例如，可以使用如本领域所理解的和在(例如)美国系列号No.13/257,290(US 20120202288)中举例说明的FACS或流式细胞术纯化本文所述的人造血细胞(例如，HSPCs)，以上专利作为参考完全并入本文。用于本发明使用的 HSPCs还可以来源于克隆细胞系。
本文所述的造血细胞，无论获自脐带血、骨髓、外周血还是其他来源，可以在任何适合的根据需要添加或未添加血清的可商购或常规成分确定的培养基中生长、处理或扩增(参见，例如，美国专利No.Hartshorn等人,Cell Technology for Cell Products,pages221-224,R.Smith,Editor；Springer Netherlands,2007，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。例如，在某些实施方式中，无血清培养基可以使用白蛋白和/或转铁蛋白，其可以对(例如)CD34+细胞在无血清培养基中的生长和扩增有用。可以包含细胞因子，如，但不限于，Flt-3配体、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO) 和IL-6等。造血细胞(例如，HSPCs)可以在容器，如生物反应器中生长 (参见，例如，Liu等人,Journal ofBiotechnology 124:592-601,2006，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。适合HSPCs离体扩增的培养基可以包含HSPC支持细胞，如基质细胞(例如，淋巴网状内皮细胞基质细胞)。基质细胞可以来源于(例如)淋巴组织的解聚。基质细胞可以支持HSPCs及其子代的体外、离体和体内维持、生长和分化。
当移植到辐照的人中时，本文所述的造血细胞(例如，调节的造血细胞)可以重建红系细胞、嗜中性白细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞混合物。可以根据某些表型或遗传型标志物鉴别本文所述的HSPCs。例如，可以通过它们较小的尺寸、缺少系(lin)标志物、使用活体染料，如罗丹明123(罗丹明DULL，也称为rholo)或者Hoechst 33342的低染色(侧群)和通过它们表面上多种抗原性标志物的存在，其中多种标志物属于分化簇系列(例如，CD34、CD38、CD90、CD133、CD105和c-kit，干细胞因子受体)来鉴别HSPCs。在一些方面，HSPCs是CD34+细胞。本文所述的HSPCs可以认为对通常用于检测谱系提交的标志物是阴性的，并因此通常称为Lin(-)细胞。大部分人HSPCs(例如，hHSPCs)可以鉴定为CD34+、 CD59+、Thy1/CD90+、CD38101-、C-kit/CD117+和Lin(-)。然而，由于某些HSPCs是CD34-/CD38-，因此这些组合不能覆盖所有干细胞。另外，一些研究表明最早期干细胞可能在细胞表面上缺少c-kit。对于HSPCs，CD133 可以代表早期标志物。在某些实例中，CD34+和CD34-HSPCs已显示为 CD133+。CD34+和Lin(-)细胞还可以包括造血祖细胞。
本文所述的细胞可以是HLA型的，并且可以与用于施用的特定受试者匹配或部分匹配。作为另外一种选择，所述细胞可以不与用于施用的特定受试者向匹配。HLA-型是指被称为人类白细胞抗原的独特的蛋白质组。这些蛋白质存在于每个个体的细胞上并且允许免疫系统将“自身”与“外源”相区分。认为是外源的细胞或组织的施用可以导致相容性问题，其包括(例如)免疫排斥或者移植物抗宿主病(GVHD)。存在6种主要的HLAs(HLA-A、 HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLADP和HLA-DQ)。在人群中，每种HLA 抗原具有多种同种型，并且由于我们基因组的二倍体性，每个个体对于每种HLA可以具有两种不同的同种型。因此，完全匹配将匹配12个同种型中的12个。预期受体的相同个体或同卵双胞胎提供的细胞或组织将具有完美的HLA-型并且认为是同基因的或者自体同源的。还理解某些因素，包括，但不限于，种族背景和种族与某些HLA-型相关。
存在多种主要和次要HLA同种型，并且应理解适当的匹配可以包括减轻免疫排斥或者GVHD的主要HLA、全部主要HLA、一些或全部主要和次要HLA的亚组之间的匹配或者本领域已知的任何组合。还应理解构成良好HLA-型匹配的具体指导原则取决于多种因素。因此，本领域技术人员必须做出判断以评价给定细胞或组织样品对于向给定个体移植的适合性。
可以使用本领域中已知的方法确定HLA型，其包括(例如)低分辨率方法，如通过血清分型，或者使用抗体基方法。血清分型基于HLA型的抗体识别。血清分型可以区别28种不同的HLA-A基因，59种HLA-B基因和21种HLA-C基因。通过血清分型法的完全匹配将是6个中的6个匹配，所述6个是指存在于每个个体中的每个HLA(A、B和C)的两个等位基因。在某些情况下，6个中5个匹配或更少的匹配可以认为是良好匹配，如本领域技术人员所确定的。
确定HLA型的其他低或中等分辨率方法检查个体的HLA同种型，但是不依赖于确定个体HLA等位基因的真实序列。通常，供体与接受样品的个体有关，并且在这些实例中，单独的血清分型或与其他低或中等分辨率方法的组合可以足以确定样品是否适合于施用。在供体与受体无关的情况下，HLA型可以是6个中5个匹配或更少的匹配。在这些情况下，使用较低匹配的细胞或组织而不是消耗时间和精力来找到更好的HLA型匹配可以是有用的。
高分辨率方法包括检验HLA基因或者基因表达产物(蛋白质或RNA) 的具体序列。高分辨率方法可以区别数千种不同的同种型。可以(例如) 在低分辨率/分裂抗原水平，对6个HLA位点，HLA-A、-B和-DR进行 HSPCs和增加的HSPCs的HLA-分型。
可以将DNA-基测试法用于HLA-DR分型。可以将DNA-基测试法用于 HLA-A和-B。用于受试者、家族分型和确认潜在不相关供体的HLA型的移植中心指导方针包括在等位基因水平分辨率主要使用DNA-基测试方法对HLA-A、B和-DR位点分型，以及在低分辨率/分裂抗原水平对HLA-A 和-B分型。可以使用相同的一组试剂、方法和解释准则使用新鲜的组织样品进行受试者和所选供体的分型以保证HLA的相同性。遵守HLA测试的质量保证和质量控制。
因此，在本文所述的方法中使用的组合物可以包括单倍型增强的 -HSPCs。所述增加的-HSPCs可以是基于HLA-A、HLA-B、HLA-C和 HLA-DRB1分型的HLA。所述增加的-HSPCs可以是基于与特定人受试者匹配的HLA组分型的HLA。HLA单倍型增强的HSPCs可以包括在与特定人受试者的6个HLA匹配中的6个。HLA单倍型增强的HSPCs可以包括在与特定人受试者的6个HLA匹配中的5个。HLA单倍型增强的HSPCs 可以包括在与特定人受试者的6个HLA匹配中的4个。HLA匹配可以基于等位基因或抗原及其组合。
细胞群中按类型的细胞百分比
本文所述的方法和组合物可以包括多种细胞(例如，细胞群)，其为约 0.1％至约1％，约1％至约3％，约3％至约5％，约10％至约15％，约15％-20％，约20％-25％，约25％-30％，约30％-35％，约35％-40％，约40％-45％，约 45％-50％，约60％-70％，约70％-80％，约80％-90％，约90％-95％或者约 95％至约100％的HSPCs。所述细胞群可以为约0.1％至约1％的HSPCs。所述细胞群可以为约1％至约3％的HSPCs。所述细胞群可以为约3％至约5％的HSPCs。所述细胞群可以为约10％至约15％的HSPCs。所述细胞群可以为约15％-20％的HSPCs。所述细胞群可以为约20％-25％的HSPCs。所述细胞群可以为约25％-30％的HSPCs。所述细胞群可以为约30％-35％的HSPCs。所述细胞群可以为约35％-40％的HSPCs。所述细胞群可以为约40％-45％的 HSPCs。所述细胞群可以为约45％-50％的HSPCs。所述细胞群可以为约 60％-70％的HSPCs。所述细胞群可以为约70％-80％的HSPCs。所述细胞群可以为约80％-90％的HSPCs。所述细胞群可以为约90％-95％的HSPCs。所述细胞群可以为约95％至约100％的HSPCs。
本文所述的方法和组合物可以包含多种造血细胞(例如，细胞群)，其为约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的HSPCs。所述细胞群可以为约1％的HSPCs。所述细胞群可以为约5％的HSPCs。所述细胞群可以为约 10％的HSPCs。所述细胞群可以为约20％的HSPCs。所述细胞群可以为约 30％的HSPCs。所述细胞群可以为约40％的HSPCs。所述细胞群可以为约 50％的HSPCs。所述细胞群可以为约60％的HSPCs。所述细胞群可以为约 70％的HSPCs。所述细胞群可以为约80％的HSPCs。所述细胞群可以为约 85％的HSPCs。所述细胞群可以为约90％的HSPCs。所述细胞群可以为约 95％的HSPCs。所述细胞群可以为约96％的HSPCs。所述细胞群可以为约97％的HSPCs。所述细胞群可以为约98％的HSPCs。所述细胞群可以为约 99％的HSPCs。所述细胞群可以为约100％的HSPCs。
如上所述的细胞群可以包括约0.1％至约1％，约1％至约3％，约3％至约5％，约10％-约15％，约15％-20％，约20％-25％，约25％-30％，约30％-35％，约35％-40％，约40％-45％，约45％-50％，约60％-70％，约70％-80％，约 80％-90％，约90％-95％或者约95％至约100％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约1％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约3％的 CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约5％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约10％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约20％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约30％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约40％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约 50％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约60％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约70％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约80％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约85％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约90％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约95％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约96％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约97％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约98％的CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约99％的 CD34+细胞。如上所述的细胞群可以包含约100％的CD34+细胞。
在调节前，细胞可以经历一些调控。例如，在用一种或多种试剂调节以提高细胞群的治疗潜能和/或扩增之前或之后，细胞可以纯化、扩增、分裂、冷冻保存或酶促消化。
在一种实施方式中，可以通过消除其他细胞类型或者对所期望的细胞标志物进行纯化来富集或纯化造血细胞。用于在本文所述的方法中使用的本文所述的造血细胞可以消除成熟造血细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、粒性白细胞、红细胞样细胞以及来自骨髓吸出液、脐带血或动员的外周血(动员的白细胞除去产物)的它们定型前体。可以使用本领域中已知的方法通过免疫耗竭消除成熟的谱系定型细胞。例如，可以通过用结合至一组系抗原：(例如，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、 CD16、CD19、CD56、CD123或CD235a)的抗体标记固体基底来进行免疫耗竭。可以进行后续步骤来进一步纯化细胞群。后续步骤包括用结合至 CD34+抗原的抗体标记基底。这些技术可以用于分离原生造血干细胞和祖细胞。用于纯化来自多个细胞源的造血干细胞和祖细胞的试剂盒是可商购的，并且在具体的实施方式中，这些试剂盒适合于本发明方法的使用。用于纯化造血干细胞和祖细胞的示例性可商购试剂盒包括，但不限于，Lineage (Lin)Depletion Kit(MiltenyiBiotec)；CD34+富集试剂盒(Miltenyi Biotec)； RosettaSep(Stem Cell Technologies)。
多种造血细胞(例如，“细胞群”或者“群”)可以包含小于约30％、25％、 20％、15％、10％或5％的间质干细胞。多种造血细胞可以包含不超过约10％的间质干细胞。间质干细胞(MSCs)是多能干细胞，其可以容易地分化为以下系，其包括成骨细胞、肌细胞、软骨细胞和脂肪细胞(Pittenger等人, Science,Vol.284,pg.143(1999)；Haynesworth等人,Bone,Vol.13,pg.69 (1992)；Prockop,Science,Vol.276,pg.71(1997))。
多种造血细胞可以包含小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的内皮祖细胞。多种造血细胞可以包含小于约10％的内皮祖细胞。如本文所使用的，术语“内皮祖细胞”是指具有分化为血管内皮细胞的潜能的多能或单能细胞。多种造血细胞可以包含不超过约10％的间质干细胞或者内皮祖细胞。
获自供体(例如，分离自供体)或另外提供的多种造血细胞可以基本不含间质干细胞和/或内皮祖细胞(例如，小于约10％的间质干细胞和小于约10％的内皮祖细胞)。作为另外一种选择，可以使用本领域中已知的方法，例如，使用免疫磁珠选择技术、荧光激活细胞分选术或其组合消除多种造血细胞中的间质干细胞和/或内皮祖细胞。所述消除方法还可以包括使用对至少一种本文所述的细胞-表面标志物特异的至少一种抗体。
可以消除多种造血细胞中的内皮祖细胞，包括对CD14细胞表面标志物为阳性并且对CD45为阴性的内皮祖细胞(CD14+/CD45-)和/或对VWF(血管假性血友病因子)为阳性的细胞(VWF+)。可以消除多种HSPCs中对 CD73和/或CD140B细胞表面标志物为阳性的细胞(CD73+/CD140B+)。多种造血细胞可以包含对细胞表面标志物CD34为阳性的细胞，并且包含小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的对选自CD73、CD140B、CD14 和VWF的细胞表面标志物为阳性的细胞。
多种造血细胞可以包含CD34+细胞并且包含小于约30％、25％、20％、 15％、10％或5％的CD14+/CD45-细胞。多种造血细胞可以包含CD34+细胞并且包含小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的VWF+细胞。多种 HSPCs可以包含CD34+细胞并且包含小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的CD140B+细胞。
多种人造血细胞可以包含CD34+造血细胞并且包含小于约30％、25％、 20％、15％、10％或5％的CD14+/CD45-细胞、VWF+细胞、CD73+细胞和 CD140B+细胞。多种人造血细胞可以对细胞表面标志物CD34为阳性并且对选自CD14、VWF、CD73和CD140B的至少一种细胞表面标志物为阴性。多种人造血细胞可以对细胞表面标志物CD34为阳性并且对细胞表面标志物CD14、VWF、CD73和CD140B为阴性。
在施用之前，本文所述的造血细胞可以或可以不扩增或分裂。在施用于受试者之前，所述造血细胞可以或可以不离体或体外扩增。可以获得未扩增的多个调节的造血细胞并将其施用于受试者，其中使用本文所述的方法(例如，如本文所述离体处理造血细胞)获得所述多个调节的造血细胞。产生多个调节的造血细胞的方法还可以包括在施用之前除去外源试剂的清洗步骤。所述细胞可以获自供体(例如，通过脐带血)并在如本文所述的细胞离体处理之前或之后或者在施用于受试者之前的任何时间未扩增。因此，如本文所述可以离体接触未扩增的多个造血细胞，借此产生如本文所述的多个调节的造血细胞，并在群中在细胞任何大量离体细胞分裂之前或者在需要任何大量离体细胞分裂的时间之前施用于受试者。如本文所述可以离体接触未扩增的细胞群并在群中在细胞任何大量离体有丝分裂之前或者在需要任何大量离体有丝分裂的时间之前施用于受试者。如本文所述可以离体处理未扩增的多个造血细胞并在群中在细胞倍增时间之前施用于受试者。如本文所述可以离体处理未扩增的多个造血细胞并在使用本文所述的方法的细胞处理的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24小时内以及在这些具体时间点之间的任何时间施用于受试者。如本文所述可以离体接触未扩增的多个造血细胞并在细胞处理的约2小时内施用于受试者。此外，如本文所述可以离体接触未扩增的多个造血细胞，并随后在施用于受试者之前冷冻保存一段时间。所述调节的造血细胞的冷冻保存可以发生在使用本文所述的方法的细胞处理的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24小时内以及在这些具体时间点之间的任何时间。
如本文所述，在与外源试剂(例如，糖皮质激素)离体接触之前，可以或可以不培养造血细胞。在其中在与外源试剂离体接触之前培养造血细胞的方面，可以将造血细胞培养小于约24小时、小于约12小时、小于约 10小时、小于约8小时、小于约6小时、小于约4小时或小于约2小时。在施用于受试者之前，造血细胞可以或可以不培养。当在施用于受试者之前培养造血细胞时，所述造血细胞可以培养小于约24小时或小于约12小时、小于约10小时、小于约8小时、小于约6小时、小于约4小时或小于约2小时。所述造血细胞可以培养约2小时。所述造血细胞可以培养小于约24小时。所述造血细胞可以培养小于约12小时、10小时、8小时、6小时、4小时或2小时。所述造血细胞可以培养约2小时。
在造血细胞与外源试剂接触以获得如本文所述的调节的造血细胞之前，可以或可以不扩增所述造血细胞。造血细胞，无论获自脐带血、骨髓、外周血、华顿氏胶质、胎盘血还是其他来源，可以在任何适合的根据需要添加或未添加血清的可商购或常规成分确定的培养基中生长或扩增(参见，例如，Hartshorn等人,Cell Technology for Cell Products,pages 221-224,R. Smith,Editor；Springer Netherlands,2007，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。例如，无血清培养基可以使用白蛋白和/或转铁蛋白，其已显示对 CD34+细胞在无血清培养基中的生长和扩增有用。
与如本文所述的试剂离体接触并随后施用于受试者的造血细胞可以是异种细胞群(例如，多个异种造血细胞)。多个异种造血细胞可以包括全骨髓、脐带血、动员的外周血、造血干细胞、造血祖细胞和造血干细胞和祖细胞的子代，其包括(例如)粒性白细胞(例如，前髓细胞、髓细胞、晚幼粒细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、血小板(例如，成巨核细胞、血小板产生巨核细胞、血小板)和单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)。
将具有造血细胞的人脐带血、骨髓细胞或动员外周血细胞与本文所述的增加PD-L1和/或IDO-1的外源试剂接触可以提高施用于受试者的HSPC 的体内免疫调节性。将具有造血细胞的人脐带血、骨髓细胞或动员外周血细胞与本文所述的外源试剂在高于约室温的温度下接触可以提高施用于受试者的HSPC群的体内免疫调节性。将具有造血细胞的人脐带血、骨髓细胞或动员外周血细胞与本文所述的外源试剂在高于约室温的温度下接触约 120分钟可以提高施用于受试者的造血细胞群的体内免疫调节性。
将纯化的Lin(-)CD34+HSPCs群与本文所述的外源试剂接触可以提高施用于受试者的造血干细胞或祖细胞群的体内扩增。将纯化的Lin(-)CD34+ HSPCs群与本文所述的外源试剂在高于约室温的温度下接触可以提高施用于受试者的造血干细胞或祖细胞群的免疫调节性。将纯化的Lin(-)CD34+ HSPCs群与本文所述的外源试剂在高于约室温的温度下接触约120分钟可以提高施用于受试者的造血干细胞或祖细胞群的免疫调节性。
在多种实施方式中，所述细胞不是遗传修饰的细胞。在其他实施方式中，用多核苷酸遗传修饰所述细胞，如(例如)包含蛋白质编码基因序列的反转录病毒或慢病毒载体。在一些实施方式中，遗传修饰所述细胞以纠正遗传缺陷，而在其他实施方式中，遗传修饰所述细胞以增加或减少野生型或突变型蛋白质的产生。用于提高细胞中蛋白质表达的多核苷酸可以包括指导细胞中适当表达的多核苷酸序列和编码所述多肽序列的多核苷酸。用于减少细胞中蛋白质表达的多核苷酸可以包括靶向编码野生型多肽序列的多核苷酸以用于降解的多核苷酸序列。在一些实施方式中，根据本发明调节的细胞是纯化的细胞或包含细胞类型混合物的细胞群。在本发明的一些实施方式中，调节造血干细胞和祖细胞(HSPCs)以提高PD-L1和/或IDO-1 的表达。造血干细胞是导致产生所有生物血细胞类型的多能干细胞，其包括髓系(例如，单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴系(例如，T细胞、B 细胞、自然杀伤细胞)和本领域中已知的其他细胞(参见Fei,R.等人,美国专利No.5,635,387；McGlave等人,美国专利No.5,460,964；Simmons,P等人,美国专利No.5,677,136；Tsukamoto等人,美国专利No.5,750,397；Schwartz等人,美国专利No.5,759,793；Tsukamoto等人,美国专利No. 5,716,827)。造血祖细胞导致产生了能够在生物寿命内产生全部成熟血细胞库(repertoire of mature bloodcells)的定型造血祖细胞。在本发明的一些方面，调控CD34+HSPCs以实现PD-L1和/或IDO-1表达的提高。
III.使用方法
调节的细胞可以在多种临床环境中有用，包括细胞移植、病症和疾病的治疗以及基因疗法。因此，短语“对其有需要的受试者”是指如本说明书所公开的对疾病或病症进行治疗的个体。在具体的实施方式中，调节的细胞在治疗免疫学或炎症性病症中有用。在一些方面，调节的细胞通过抑制受试者中的免疫应答治疗免疫学或炎症性病症。如本文所使用的，短语“免疫学病症”包括，但不限于，自身免疫病、移植物抗宿主病和移植排斥。
本发明所述的调节的细胞在治疗对施用PD-L1和/或IDO-1表达增加的细胞起反应的任何自身免疫病中得到应用。可以使用所述调节的细胞治疗的自身免疫病的实例包括，但不限于，急性心肌梗塞、缺血性中风、1型糖尿病、糖尿病、多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、炎症性脱髓鞘病、狼疮、克罗恩氏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、溃疡性结肠炎、皮炎、过敏性肠综合征、白癜风、突眼性甲状腺肿、桥本氏病、阿狄森氏病、多肌炎、皮肤肌炎、重症肌无力、自身免疫肝炎、干燥综合征、自身免疫胃炎、硬化症、银屑病、哮喘或韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)。
在一种实施方式中，所述调节的细胞治疗炎症性病况或病症。如本文所使用的，炎症性病况或病症是具有炎症基础或炎症组分的病况或病症。已认识到一些免疫学病症具有炎症性基础或组分，并因此还将它们分类为炎症性病况，如以下所讨论的。可以通过施用本发明所述的调节的细胞治疗的炎症性病况的实例包括，但不限于，肺、关节、结缔组织、眼、鼻、肠、肾、肝、皮肤、中枢神经系统、内分泌系统、血管系统和心脏的炎症。在某些实施方式中，可以通过本发明治疗的炎症性病况包括由于白细胞或其他免疫效应细胞向受影响组织的浸 润所造成的炎症。可以通过本发明治疗的炎症性病况的其他相关实例包括由传染剂引起的炎症，其包括，但不限于，病毒、细菌、真菌和寄生虫。
炎症性肺病况包括，但不限于，哮喘、成人呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺部炎症、肺纤维化和囊性纤维化(其可能另外或可选择地包括胃肠道或其他组织)。炎症性关节病况包括类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、儿童类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎及其他关节炎病况。具有炎症性组分的眼疾病包括，但不限于，葡萄膜炎(包括虹膜炎)、结膜炎、巩膜炎、干性角膜结膜炎和视网膜疾病，其包括，但不限于，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎以及干性和湿性年龄相关性黄斑变性。炎症性肠病况包含克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和远端直肠炎。
炎症性皮肤疾病包括，但不限于，与细胞增殖有关的病况，如银屑病、湿疹和皮炎(例如，湿疹性皮炎、特应性皮炎和面游风、过敏性或刺激性接触性皮炎、裂隙性湿疹、光变应性皮炎、光毒性皮炎、植物光化性皮炎、放射性皮炎和淤滞性皮炎)。其他炎症性皮肤疾病包括，但不限于，硬皮病、由皮肤或粘膜创伤、灼伤、大疱性病症或缺血造成的溃疡和糜烂、一些形式的鱼鳞癣、大疱性表皮松解、肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、皮肤的内在衰老变化、光老化、由皮肤的机械剪切引起的摩擦性水疱以及局部使用皮质类固醇引起的皮肤萎缩。其他炎症性皮肤病况包括粘膜炎症，如唇炎、唇裂、鼻刺激、粘膜炎和外阴阴道炎。
内分泌系统的炎症性病症包括，但不限于，自身免疫性甲状腺炎(桥本氏病)、I型糖尿病、II型糖尿病以及肾上腺皮质的急性和慢性炎症。心血管系统的炎症性病况包括，但不限于，冠状动脉梗死损伤、周围性血管疾病、心肌炎、血管炎、血管再形成狭窄、动脉粥样硬化和与II型糖尿病有关的血管病。
肾炎症性病况包括，但不限于，血管球性肾炎、间质性肾炎、狼疮肾炎、继发于韦格氏病的肾炎、继发于急性肾炎的急性肾功能衰竭、古德帕斯彻氏综合征、阻塞后综合征和小管缺血。
肝炎症性病况包括，但不限于，肝炎(由病毒感染、自身免疫反应、药物治疗、毒素、环境剂引起，或者作为原发性病症的继发性结果)、胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎。
中枢神经系统炎症性病况包括，但不限于，多发性硬化和神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或与HIV感染有关的痴呆。
其他炎症性病况包括牙周病、慢性炎症中的组织坏死、内毒素休克、平滑肌增殖病症、移植物抗宿主病、缺血再灌注损伤后的组织损伤和移植手术后的组织排斥。
本发明还提供了治疗患者中与创伤愈合，包括术后创伤愈合有关的炎症的方法，其包括向所述患者施用包含本发明所述的调节的细胞的组合物。
应注意本发明所述的调节的细胞可以用于治疗具有炎症性组分的任何疾病，如以上提及的那些疾病。此外，以上提及的炎症性病况旨在是示例性的而不是穷举的。
本领域技术人员将认识到使用本发明的调节细胞可以治疗其他炎症性病况(例如，由于受试者生理上的外伤、损伤、感染、遗传病症或环境毒物或干扰物所造成的全身或局部免疫失衡或功能障碍)。因此，本发明的方法可以用于治疗具有炎症性组分的任何疾病，其包括但不限于上文提及的那些疾病。
在一种实施方式中，预期接受所述调节的细胞的患者不进行或需要移植。在一个方面，接受所述调节的细胞的患者未接受移植。在一个方面，接收所述调节的细胞的患者不是造血移植以重建造血隔室的候选者。在一种非限制性实施方式中，将调节的细胞施用于在施用所述细胞之前未接受预处理的受试者。如本文所使用的“预处理(conditioning)”是指提供通常在造血干细胞移植之前施用的治疗。通常，通过放射疗法或化学疗法进行这种预处理。在一个方面，将所述调节的细胞施用于未接受高剂量(清髓) 预处理的受试者。在另一个方面，将所述调节的细胞施用于未接受高剂量或低强度预处理的患者。在又一个方面，将所述调节的细胞施用于未接受任何高剂量、低强度或非清髓性预处理(nonmyeloablative conditioning)的患者。
在另一种实施方式中，所述调节的细胞还在由移植疗法引起的免疫学病症，如(例如)移植物抗宿主病和移植排斥的治疗中应用。因此，可以将所述调节的细胞用于治疗由骨髓移植、实体器官移植或细胞疗法(例如，包含分离的干细胞的任何组合物)所造成的移植物抗宿主病或者移植排斥。细胞疗法背景中的移植包括，但不限于，已修饰从而在受试者中产生所需的蛋白质或多核苷酸的基因工程细胞的施用。在本发明的方面中，在移植前或移植时将所述调节的细胞施用于受试者以防止移植物抗宿主病和/或移植排斥。不受任何具体理论或机制的限制，在移植前或移植时使用调节的细胞治疗受试者减弱了移植受体中的免疫学反应并且改善了移植接受度和定植。
在一种非限制性实施方式中，将调节的细胞施用于接受骨髓移植(或细胞疗法)的受试者，其中所述移植涉及造血移植或重建。这些受试者包括，但不限于，经历癌症化疗或放射疗法的受试者以及经受非恶性血液病症(例如，受非恶性血液病症困扰)的受试者，具体地，免疫缺陷(例如， SCID、范康尼氏贫血症、重型再生障碍性贫血，或先天性血红蛋白病，或代谢蓄积性疾病，如赫尔勒氏症、亨特氏病、甘露糖苷过多症等)或癌症，具体地，血液学恶性肿瘤，如急性白血病、慢性白血病(骨髓或淋巴)、淋巴瘤(霍奇金或非霍奇金)、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征，或非血液学癌症，如实体瘤(包括乳腺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、皮肤癌、肝癌或胰癌)。在一些实施方式中，所述调节的细胞是HSCs，或者出于在受试者中提供造血移植或重建的目的，施用调节的骨髓移植，其中所述调节的细胞或骨髓避免了移植物抗宿主病或移植排斥，或者对它们不太敏感。
受试者还包括在再生障碍性贫血、脊髓发育不良、地中海贫血、镰刀形细胞病或威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)的治疗中已接受骨髓移植或细胞疗法的个体。在一些实施方式中，受试者经受了作为另一种一次处理，如放射疗法、化疗或使用骨髓抑制性药物，如齐多夫定、氯霉素或更昔洛韦的治疗的不期望的副作用或并发症的结果的病症。这些病症包括中性白细胞减少、贫血症、血小板减少和免疫功能障碍。
向受试者施用“一定量”的调节的细胞是指对于实现所期望的治疗或预防效果“有效的量”的施用，其无限制地包括受试者的治疗。因此，出于本文的目的，通过本领域中已知的这些考虑确定了细胞的“治疗有效量”，并且所述“治疗有效量”可以根据以下因素，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及细胞在个体中引起所需反应的能力而改变。术语“治疗有效量”包括“治疗”受试者(例如，患者)有效的量。治疗有效量还是其中与治疗有益作用相比，细胞的任何毒性或不利作用是微不足道的量。
“预防有效量”是指具有对实现所需预防结果有效的治疗潜能的细胞的量。通常，但是不必需的，由于在疾病之前或疾病早期在受试者中使用了预防剂量，因此预防有效量将小于治疗有效量。
施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是(例如)部分或单一脐带血中HSPC的量。调节的造血细胞的量可以是至少2×106个细胞，至少 2.5×106个细胞，至少3×106个细胞，至少4×106个细胞，至少5×106个细胞，至少1×107个细胞，至少1.5×107个细胞，至少2×107个细胞，至少2.5×107个细胞或至少3×107个细胞。
施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是约2×106个细胞，约3×106个细胞，约5×106个细胞，约7×106个细胞，约10×106个细胞，约15×106个细胞，约1.7×107个细胞，约2.0×107个细胞，约2.5×107个细胞，约3.0×107个细胞，约5.0×107个细胞，约1.0×108个细胞，约3.0×108个细胞，约5.0×108个细胞，约1.0×109个细胞，约3.0×109个细胞，约5.0×109个细胞或约1.0×1010个细胞。
施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是(例如)约2×106个细胞至约2×1010个细胞；约2×106个细胞至约7×109个细胞；约2×106个细胞至约 5×107个细胞；约2×106个细胞至约3×107个细胞；或者约2×106个细胞至约2.5×107个细胞。施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是(例如)约 2×106个细胞。施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是(例如)约5×106个细胞。施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是(例如)约1×107个细胞。施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是(例如)约5×107个细胞。可以将调节的造血细胞以小于约2×108个细胞的量施用于受试者。可以将调节的造血细胞以小于约2×107个细胞的量施用于受试者。
施用于受试者的调节的造血细胞的量可以是至少约1×106个细胞/kg体重、至少约1.25×106个细胞/kg体重、至少约1.5×106个细胞/kg体重、至少约1.75×106个细胞/kg体重、至少约2×106个细胞/kg体重、至少约2.5×106个细胞/kg体重、至少约3×106个细胞/kg体重、至少约4×106个细胞/kg体重、至少约5×106个细胞/kg体重、至少约1×107个细胞/kg体重、至少约 1.5×107个细胞/kg体重、至少约2×107个细胞/kg体重、至少约2.5×107个细胞/kg体重、至少约3×107个细胞/kg体重、至少约5×107个细胞/kg体重、至少约7×107个细胞/kg体重、至少约1×108个细胞/kg体重、至少约3×108个细胞/kg体重、至少约5×108个细胞/kg体重、至少约7×108个细胞/kg体重、至少约1×109个细胞/kg体重、至少约3×109个细胞/kg体重、至少约 5×109个细胞/kg体重、至少约7×109个细胞/kg体重或至少约3×1010个细胞 /kg体重。
在另一种实施方式中，施用于受试者的调节的造血细胞的量是部分或单一脐带血中造血细胞的量，或约1×105个细胞至约2×108个细胞；约 1.0×106个细胞至约2×107个细胞；约2×106个细胞至约1×107个细胞；约 2×106个细胞至约7×106个细胞；约2×106个细胞至约5×106个细胞或约2×106个细胞至约3×106个细胞。
可以将本发明的调节的细胞施用于受试者一次或多次。例如，本发明的方法考虑了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次施用。在一种实施方式中，重复施用可以持续直至自身免疫病的一种或多种症状减少。在另一种实施方式中，重复施用可以持续受试者终生以维持特定水平的症状。
在一种实施方式中，所述施用可以是范围在每周两次至每六个月一次之间的间隔。例如，施用可以是每两周、每三周、每四周、每个月、每隔1 个月、每3个月、每4个月或每6个月。在一种实施方式中，调节的细胞的施用之间的间隔是每2周。在一种实施方式中，调节的细胞的施用之间的间隔是每6周。
在一种实施方式中，可以在初始间隔使用初始剂量向患者施用初始疗法循环或指定疗法方案，并且此后以维持剂量和维持间隔施用另一种疗法循环。在一种实施方式中，初始剂量是比维持剂量更高的剂量。作为另外一种选择，由于观察到可能的副作用，初始剂量可以低于维持剂量。此外，在一种实施方式中，在疗法循环中维持间隔可以长于初始间隔，如通过“增效剂”施用。在另一种实施方式中，维持间隔可以短于初始间隔。
施用在本文所述的方法中使用的调节的细胞的适合的方法包括肠胃外施用，其包括，但不限于，血管内施用方法，如静脉内和动脉内施用。施用本发明的细胞的其他说明性方法包括肌内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹胸骨内、经气管、皮下(皮下)、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
在一种实施方式中，局部施用调节的细胞。在另一种实施方式中，全身施用调节的细胞。
在一种实施方式中，施用途径不是用于造血移植的途径。例如，造血移植通常是全身静脉内输注。因此，局部施用或非静脉内施用不是用于造血移植的途径。
可以通过包含本发明的组合物的组合方案实现治疗优势。本领域技术人员将理解可以作为免疫调节疾病或炎症性病况治疗的组合疗法的一部分施用本文所述的调节的细胞。例如，本发明表达增加水平的PD-L1和/或 IDO-1的调节的造血细胞可以与第二活性剂组合。在组合疗法中，可以同时或以任何顺序依次施用各个试剂。当依次施用时，优选地通过相同途径施用组分。
作为另外一种选择，可以作为组合产品将所述组分一同配置在单一剂量单位中。可以结合本发明所述组合物使用的适合试剂将是本领域技术人员所知的。
在某些实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包含：a)包含本发明的调节的造血细胞群的一个或多个单一剂量形式；b)用于在组合疗法中使用的一个或多个单一剂量形式的第二活性剂和c)用于施用本发明的调节的造血细胞群和所述第二活性剂的说明书。
在一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含：a)包含本发明的调节的造血细胞群的药物制剂(例如，一个或多个单一剂量形式)；和b)施用(例如)用于治疗或预防如以上所讨论的病症或病况，例如，炎性疾病的药物制剂的说明书。
现将通过以下实施例更充分地描述本发明的具体实施方式。然而，本发明可以以多种不同形式体现并且不应将其视为受限于本文所说明的实施方式；相反，提供这些实施方式从而使本发明公开更深入和完整，并且将向本领域技术人员充分展示本发明的范围。
实施例1-人干细胞和祖细胞中PD-L1(CD274)或IDO-1升高的基因表达水平
将分离自来自三个供体的动员的外周血的人CD34+干细胞和祖细胞在 STEMSPAN(StemCell Technologies)中在37℃用一种或多种外源试剂离体处理24小时。细胞处理后，在RT-qPCR之前，将粗mRNA水平对来自未处理细胞的粗mRNA水平进行归一化。使用Assay onDemand TAQMAN RT-qPCR测定(Life Technologies)，根据PICOPURE分离的mRNA(LifeTechnologies)定量PD-L1或IDO-1mRNA的水平。
调节后PD-L1表达的结果如表1所示。
Figure BDA0001417558530000341
图1示出了作为使用单一外源试剂处理的CD34+细胞的三个个体供体的平均值的PD-L1基因表达水平的结果：(A)10μM地塞米松；(B)1000 U/mL干扰素β(IFNβ)；(C)5ng/mL干扰素γ(IFNγ)；(D)10μg/mL高分子量多聚肌苷酸-多聚胞嘧啶核苷酸(多聚(I:C))或者多种外源试剂；(E) 1000U/mL IFNβ，5ng/mL IFNγ和10μg/mL多聚(I:C)。图4示出了37℃时使用其他糖皮质激素调节24小时的结果。
调节后IDO-1表达的结果如表2所示。
Figure BDA0001417558530000342
图5A-图5D示出了作为使用单一外源试剂处理的CD34+细胞的三个个体供体的平均值的IDO-1基因表达水平的结果：(A)1000U/mL干扰素β (IFNβ)；(B)5ng/mL干扰素γ(IFNγ)；(C)10μg/mL高分子量多聚肌苷酸-多聚胞嘧啶核苷酸(多聚(I:C))或者多种外源试剂；(D)1000U/mL IFNβ， 5ng/mL IFNγ和10μg/mL多聚(I:C)。图6显示了37℃与其他外源试剂，包括抗肿瘤剂，多巴胺受体拮抗剂等孵育24小时。
实施例2-人干细胞和祖细胞上PD-L1(CD274)或IDO-1表面蛋白的升高水平
将分离自动员的外周血的人CD34+干细胞和祖细胞(HSCs)在具有干细胞因子(SCF)、Flt-3-配体、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6) 的STEMSPAN无血清扩增培养基(SFEM)(StemCell Technologies)中在 37℃用一种或多种外源试剂离体处理24小时。细胞处理后，通过用抗-CD34、抗-PD-L1或抗-IDO-1和7-氨基放线菌素D(7-AAD)对细胞染色，测量活CD34+细胞上的PD-L1或IDO-1细胞表面蛋白水平。在FORTESSA X-20(BectonDickinson)上采集数据，并使用FLOWJO(TreeStar)分析。
图2示出了相对于使用单一外源试剂处理的CD34+细胞的三个个体供体的未处理样品，通过中值荧光强度(MFI)的PD-L1平均变化倍数，所述外源试剂为(A)1000U/mL IFNβ；(B)5ng/mL IFNγ；(C)10μg/mL 多聚(I:C)或者多种外源试剂；(D)1000U/mL IFNβ，5ng/mLIFNγ和10μg/mL 多聚(I:C)。
实施例3-在存在调节的HSPC的情况下，T细胞增殖降低。
在含有1000U/mL IFNβ、5ng/mL IFNγ和10μg/mL多聚I:C的培养基中或者在含有媒介物的培养基中孵育HSCs 24小时。然后，清洗细胞并与自体同源的T细胞以1:1的比例合并。加入T细胞有丝分裂原并将共培养物孵育5天。图3显示了如通过流式细胞术所测量的T细胞增殖。
实施例4-PD-L1表达的时间过程
将分离自动员的外周血的人CD34+干细胞和祖细胞(HSCs)在具有干细胞因子(SCF)、Flt-3-配体、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6) 的STEMSPAN无血清扩增培养基(SFEM)(StemCell Technologies)中在 37℃用一种或多种外源试剂离体处理6、24或48小时。细胞处理后，通过用抗-CD34、抗-PD-L1和7-氨基放线菌素D(7-AAD)对细胞染色，测量活CD34+细胞上的PD-L1细胞表面蛋白水平。在FORTESSA X-20(Becton Dickinson)上采集数据，并使用FLOWJO(TreeStar)分析。
外源试剂：
1000U/mL IFNβ；
5ng/mL IFNγ；
10μg/mL多聚(I:C)；
1000U/mL IFNβ+5ng/mL IFNγ；
5ng/mL IFNγ+10μg/mL多聚(I:C)；或
1000U/mL IFNβ+5ng/mL IFNγ+10μg/mL多聚(I:C)。
图7示出了相对于CD34+细胞三个个体供体的未处理样品，通过中值荧光强度(MFI)的PD-L1平均变化倍数。
实施例5-调节后的储存和PD-L1表达
将分离自动员的外周血的人CD34+干细胞和祖细胞(HSCs)在具有干细胞因子(SCF)、Flt-3-配体、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6) 的STEMSPAN无血清扩增培养基(SFEM)(StemCell Technologies)中在 37℃用一种或多种外源试剂离体处理24小时。细胞处理后，洗去培养基/ 试剂，将细胞再悬浮在HBSS(对于“直接”组)、SFEM或适当的低温培养基中。随后，测量细胞(“直接”)或者将细胞在37℃、4℃放置24小时或冷冻保存。24小时后，将细胞融化并回到室温，并且通过用抗-CD34或抗 -PD-L1和7-氨基放线菌素D(7-AAD)对细胞染色，测量活CD34+细胞上的PD-L1细胞表面蛋白水平。在FORTESSA X-20(BectonDickinson)上采集数据，并使用FLOWJO(TreeStar)分析。
图8显示出在调节后，受调节的细胞是活的并且在多种条件中维持时，表达PD-L1。因此，可以在调节后储存所述调节的细胞。
实施例6-匹配和不匹配的CD34+细胞群中的免疫抑制
将分离自动员的外周血的人CD34+干细胞和祖细胞在补充有干细胞因子(SCF)、Flt-3-配体、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)的STEMSPAN (StemCellTechnologies)中在37℃用IFNβ+IFNγ(γ+β)或者IFNβ+IFNγ+ 聚(I:C)(也称为"Trifecta"组)离体处理6、24或48小时。细胞处理后，清洗CD34细胞并将其与CD3/28珠激活的T细胞共培养。在5天共培养结束时，通过用抗-CD4、抗-CD8和7氨基放线菌素D(7-AAD)对细胞染色来定量活CD4和CD8T细胞的数目。在FORTESSA X-20(Becton Dickinson) 上采集数据，并使用FLOWJO(TreeStar)分析。数据表示为对每个共培养条件归一化为DMSO处理的CD34条件中T细胞数目的CD4+和CD8+T细胞数目的变化倍数。
图9A和图9B示出了离体处理的人干细胞和祖细胞抑制自体同源和同种异体T细胞的增殖。
实施例7-用PD-L1多核苷酸调节PD-L1和免疫抑制
在补充有干细胞因子(SCF)、Flt-3-配体、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)的StemSpan(StemCell Technologies)中，对人PD-L1的转基因表达，在37℃用慢病毒载体转导分离自动员的外周血的人CD34+ 干细胞和祖细胞24小时。使用GFP报告子表达通过流式细胞术分离转导的 CD34+细胞，并且将转导(PD-L1+)或未转导(PD-L1-)的细胞与CD3/28珠激活的T细胞共培养。在5天共培养结束时，通过用抗-CD4、抗-CD8 和7氨基放线菌素D(7-AAD)对细胞染色来定量活CD4和CD8T细胞的数目。在FORTESSAX-20(Becton Dickinson)上采集数据，并使用FLOWJO (TreeStar)分析。数据表示为对每个共培养条件归一化为DMSO处理的 CD34条件中T细胞数目的CD4+和CD8+T细胞数目的变化倍数。
图10显示出人CD34+干细胞和祖细胞中PD-L1的基因过表达增加了T 细胞增殖的抑制。
实施例8-使用IDO1多核苷酸的IDO-1的基因过表达和免疫抑制
在补充有干细胞因子(SCF)、Flt-3-配体、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)的StemSpan(StemCell Technologies)中，对人IDO1的转基因表达，在37℃用慢病毒载体转导分离自动员的外周血的人CD34+ 干细胞和祖细胞24小时。使用GFP报告子表达通过流式细胞术分离转导的 CD34+细胞，并且在存在或不存在IDO1抑制剂1-甲基-D-色氨酸(1MT)的情况下将细胞与CD3/28珠激活的自体同源或同种异体的T细胞共培养。在5天共培养结束时，通过用抗-CD4、抗-CD8和7氨基放线菌素D(7-AAD) 对细胞染色来定量活CD4和CD8T细胞的数目。在FORTESSAX-20(Becton Dickinson)上采集数据，并使用FLOWJO(TreeStar)分析。数据表示为对每个共培养条件归一化为未转导的CD34条件中T细胞数目的CD4+和 CD8+T细胞数目的变化倍数。
图11显示出人CD34+干细胞和祖细胞中IDO-1的基因过表达增加了T 细胞增殖的抑制。
实施例9-调节细胞不依赖于接触的影响
在补充有干细胞因子(SCF)、Flt-3-配体、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)的StemSpan(StemCell Technologies)中，对人IDO-1的转基因表达，在37℃用慢病毒载体转导分离自动员的外周血的人CD34+ 干细胞和祖细胞24小时。使用GFP报告子表达通过流式细胞术分离转导的 CD34+细胞，并且在存在或不存在IDO-1抑制剂1-甲基-D-色氨酸(1MT) 的情况下将细胞与CD3/28珠激活的自体同源或同种异体的T细胞共培养。按体积1:1将来自转导的HSC的培养基加入至人T细胞群并孵育。在5天孵育结束时，通过用抗-CD4、抗-CD8和7氨基放线菌素D(7-AAD)对细胞染色来定量活CD4和CD8T细胞的数目。在FORTESSA X-20(Becton Dickinson)上采集数据，并使用FLOWJO(TreeStar)分析。
数据表示为对每个共培养条件归一化为未转导的CD34条件中T细胞数目的CD4+和CD8+T细胞数目的变化倍数。
结果：
如图12所示，用来自表现出IDO-1表达上调的受调节的造血细胞群的培养基处理的T细胞显著抑制T细胞增殖。T细胞的抑制表明调节的细胞群以不依赖于接触的方式抑制T细胞反应。
实施例10-在1型糖尿病模型中糖皮质激素处理的CD34+细胞降低了T 细胞增殖和效应因子功能
方法
造血细胞的修饰：
在37℃，将CD34+细胞群在HSC培养基中与一些不同的糖皮质激素接触24小时。这种接触显著上调T细胞共抑制蛋白PDL-1的表达。PD-1/PDL-1 免疫检查点途径在自体反应T细胞增殖抑制中起重要作用，其反过来降低了自身免疫性并促进了自体耐受性。清洗CD34+细胞群，并在注射前在 HBSS中再悬浮以除去痕量的糖皮质激素和培养基。
体内免疫抑制：
为了确定人CD34+细胞对致糖尿病T细胞的体内免疫抑制可能，对8 周大的免疫缺陷型NSG-HLA-A2/HHD突变小鼠(其表达人HLA的1类重链和轻链)腹膜内注射(i.p.)10×106个来自1型糖尿病患者(T1D)的 HLA-A2+周围血单核细胞(PBMCs)。在T1D PBMCs的继承性转移后3天，用Hanks平衡盐溶液(HBSS)、106个在造血干细胞(HSC)培养基中生长 24小时的分离自健康患者的动员的外周血的CD34+细胞(未处理的-CD34) 或者106个在补充有糖皮质激素的HSC培养基中生长24小时的CD34+细胞 (GC-CD34)(即调节的细胞)注射动物。
在注射PBMCs后7和14天，收获脾、骨髓和胰腺。使用抗体染色的细胞制备物的人特异性基因表达谱以及流式细胞术分析定量人CD34+和T 细胞在那些组织中的积累。此外，通过流式细胞术评价存在于胰腺中的人T 细胞的免疫表型和效应因子功能以鉴定存在于靶组织中的人T细胞的分化和激活谱。
最后，使用单独的小鼠分组，收集胰腺并制备用于胰岛的免疫荧光分析以确定β-细胞胰岛素的产生和炎症性浸润的本质。如上，使用人特异性基因表达谱以及流式细胞术分析定量人CD34+和T细胞在那些组织中的积累。通过流式细胞术评价存在于胰腺中的人T细胞的免疫表型和效应因子功能以鉴定存在于靶组织中的人T细胞的分化和激活谱。
结果：
在第7天和第14天，与媒介物-处理的CD34相比，在注射了GC-CD34 细胞的T1DPBMC动物的胰腺中，T细胞增殖和效应因子功能显著降低。这将通过人T细胞增殖的减少以及它们在再刺激之后分泌INFγ的能力的降低来显示。另外，由于GC-CD34介导的胰腺T细胞毒性的降低，胰腺β- 细胞的胰岛素产生增加。
总之，与该人源化T1D模型中未处理的CD34细胞相比，糖皮质激素处理的CD34细胞是T细胞介导的胰腺β-细胞毒性更有效的处理。
可以将如上所述的多种实施方式合并以提供其他实施方式。在本说明书中提及的和/或在专利申请数据页中所列的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以其全部内容作为参考并入本文。如有必要，可以修改实施方式的方面以使用多个专利、专利申请和专利公开的概念以提供其他实施方式。
可以根据上述详细说明，对实施方式做出这些及其他改变。一般地，在以下权利要求中，所使用的术语不应视为对说明书和权利要求中公开的具体实施方式的主张的限制，而应视为包括了所有可能的实施方式以及与这些权利要求所赋予的权利等价的全部范围。因此，本发明公开未限制权利要求。

Claims (38)

1.用于生产药物组合物的方法，所述药物组合物包含：包含免疫抑制CD34+造血干细胞和/或祖细胞(HSPCs)的调节的细胞群；所述方法包含：在存在能够在包含CD34+ HSPCs的细胞群中增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种小分子的情况下离体孵育包含CD34+HSPCs的细胞群，从而生产所述包含免疫抑制CD34+ HSPCs的调节的细胞群，其中，与未与所述小分子一起孵育的CD34+ HSPCs细胞群相比，所述调节的细胞群中PD-L1和/或IDO-1表达具有至少3倍的增加,
其中所述一种或多种小分子选自：酪氨酸磷酸化抑制剂AG 835、氨己烯酸、呋喃西林、氯可托龙新戊酸酯、氟奋乃静、吉西他滨、粘液酸异美汀、硫酸双氢链霉素、普罗替林、替仑西平、环苯扎林、来曲唑、氟达拉滨和4-对氨水杨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育为至少2小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育为至少4小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育为至少6小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育为至少18小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育在4小时至48小时之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育在高于室温的温度下进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育在4ºC至37ºC之间的温度下进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，与未与所述小分子一起孵育的CD34+HSPCs细胞群相比，所述调节的细胞群中PD-L1和/或IDO-1表达具有3倍至80倍的增加。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述调节的细胞群包含2 x 106 至2 x1010 的CD34+ HSPCs。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述小分子选自粘液酸异美汀、硫酸双氢链霉素、普罗替林、替仑西平、环苯扎林、4-对氨水杨酸和它们的组合。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述小分子选自吉西他滨、来曲唑、氟达拉滨、氟奋乃静及其组合。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述细胞群来源于脐带血、外周血、骨髓或诱导的多潜能干细胞（iPSCs）。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述细胞群获自iPSCs。
15.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述细胞群包含至少50%的HSPCs。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少60%的HSPCs。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少70%的HSPCs。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少80%的HSPCs。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少85%的HSPCs。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少90%的HSPCs。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少95%的HSPCs。
22.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少98%的HSPCs。
23.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞群包含至少99%的HSPCs。
24.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，在与所述小分子接触前，对CD34+HSPCs富集所述细胞群。
25.用于生产用于治疗患者中的免疫学病症或炎症性病症的药物组合物的方法，所述药物组合物包含：包含免疫抑制CD34+造血干细胞和/或祖细胞(HSPCs)的调节的细胞群；所述方法包含：在存在能够在包含CD34+ HSPCs的细胞群中增加PD-L1和/或IDO-1表达的一种或多种小分子的情况下离体孵育包含CD34+ HSPCs的细胞群，从而生产所述包含免疫抑制CD34+ HSPCs的调节的细胞群，其中，与未与所述小分子一起孵育的CD34+ HSPCs细胞群相比，所述调节的细胞群中PD-L1和/或IDO-1表达具有至少3倍的增加,
其中所述一种或多种小分子选自：酪氨酸磷酸化抑制剂AG 835、氨己烯酸、呋喃西林、氯可托龙新戊酸酯、氟奋乃静、吉西他滨、粘液酸异美汀、硫酸双氢链霉素、普罗替林、替仑西平、环苯扎林、来曲唑、氟达拉滨和4-对氨水杨酸。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述调节的细胞群对所述患者是同种异体的。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述调节的细胞群与所述患者至少部分地是HLA匹配的。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述调节的细胞群包含单倍型增强的HSPCs。
29.根据权利要求25所述的方法，其中，所述调节的细胞群包含2×106至2×1010个CD34+HSPCs。
30.根据权利要求25所述的方法，其中，所述免疫学病症选自急性心肌梗塞、缺血性中风、糖尿病、多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、炎症性脱髓鞘病、狼疮、克罗恩氏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、溃疡性结肠炎、皮炎、过敏性肠综合征、白癜风、突眼性甲状腺肿、淋巴细胞性甲状腺肿、阿狄森氏病、多肌炎、皮肤肌炎、重症肌无力、自身免疫肝炎、干燥综合征、自身免疫胃炎、硬化症、银屑病、哮喘或韦格纳肉芽肿。
31.根据权利要求25所述的方法，其中，所述免疫学病症是I 型糖尿病或移植排斥。
32.根据权利要求25所述的方法，其中，所述免疫学病症是移植物抗宿主病。
33.根据权利要求25所述的方法，其中，所述炎症性病症选自肺、关节、结缔组织、眼、鼻、肠、肾、肝、皮肤、中枢神经系统、内分泌系统和心血管系统的炎症。
34.根据权利要求25所述的方法，其中，所述炎症性病症是心脏的炎症。
35.根据权利要求25-34中任一项所述的方法，其中，所述患者没有经历高剂量、低强度或非清髓性预处理。
36.根据权利要求33所述的方法，其中：
(a) 所述肺的炎症选自哮喘、成人呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺纤维化和囊性纤维化；
(b) 所述关节的炎症选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎及其他关节炎病况；
(c) 所述眼的炎症选自葡萄膜炎、结膜炎、巩膜炎、干性角膜结膜炎和视网膜疾病；
(d) 所述肠的炎症选自克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和远端直肠炎；
(e) 所述皮肤的炎症选自银屑病、皮炎和硬皮病；
(f)所述内分泌系统的炎症选自自身免疫性甲状腺炎、I型糖尿病、II型糖尿病以及肾上腺皮质的急性和慢性炎症；
(g) 所述心血管系统的炎症选自冠状动脉梗死损伤、周围性血管疾病、心肌炎、血管再形成狭窄和与II型糖尿病有关的血管病；
(h) 所述肾的炎症选自血管球性肾炎、间质性肾炎、狼疮肾炎、继发于韦格氏病的肾炎、继发于急性肾炎的急性肾功能衰竭、古德帕斯彻氏综合征、阻塞后综合征和肾小管缺血；
(i)所述肝的炎症选自肝炎、胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎；
(j)所述中枢神经系统的炎症选自多发性硬化和神经变性疾病。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述关节的炎症是儿童类风湿性关节炎，或者，所述心血管系统的炎症选自血管炎或动脉粥样硬化。
38.根据权利要求36所述的方法，其中：
所述葡萄膜炎选自虹膜炎；或者
视网膜疾病选自糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎以及干性和湿性年龄相关性黄斑变性；或者
所述皮炎选自湿疹性皮炎、特应性皮炎和面游风、过敏性或刺激性接触性皮炎、裂隙性湿疹、光变应性皮炎、光毒性皮炎、植物光化性皮炎、放射性皮炎和淤滞性皮炎；或者
所述自身免疫性甲状腺炎选自桥本氏病；或者
所述肝炎是由病毒感染、自身免疫反应、药物治疗、毒素、环境剂引起，或者作为原发性病症的继发性结果；或者
所述神经变性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或与HIV感染有关的痴呆。
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