WO2023176986A1

WO2023176986A1 - 免疫寛容誘導用組成物及びその製造方法

Info

Publication number: WO2023176986A1
Application number: PCT/JP2023/011018
Authority: WO
Inventors: 研一郎清野; 智己村田
Original assignee: 国立大学法人北海道大学; 住友ファーマ株式会社
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2023-03-20
Publication date: 2023-09-21

Abstract

本発明は、Lhx2遺伝子が強制発現された、あるいはLhx2及びHoxB4が強制発現された、多能性幹細胞由来の造血幹・前駆細胞を含有する、免疫寛容誘導用組成物を提供する。本発明はまた、多能性幹細胞を、Lhx2の強制発現下で、あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下で、造血幹・前駆細胞に分化させることを含む、免疫寛容誘導用組成物を製造する方法を提供する。免疫寛容誘導用組成物は、主要組織適合性抗原適合性のある、又は主要組織適合性抗原適合性のない同種異系移植において免疫寛容を誘導するために、用いることができる。

Description

免疫寛容誘導用組成物及びその製造方法

　本発明は、免疫寛容を誘導するための組成物、その製造方法、及びその利用に関する。

　患者に他者由来の細胞又は組織を移植する同種移植治療において、レシピエントの免疫機構がドナー由来の細胞又は組織を異物と認識することによって生じる拒絶反応を抑制することは、治療の成否を左右する重要な課題である。

　拒絶反応を抑制するための主なアプローチは、シクロスポリン、タクロリムス等の薬剤投与によるレシピエントの免疫応答抑制である。しかしながら、免疫抑制剤は、免疫抑制によって感染症や悪性腫瘍を発生させたり、さらには長期服用によって腎毒性、高血圧、高脂血症、糖尿病等の合併症を引き起こしたりすることがあるため、免疫抑制剤によらない、又は免疫抑制剤の使用量を低減した拒絶反応の抑制が望まれている。

　同種移植においてレシピエントの拒絶反応を抑制し得る手段として、免疫寛容誘導が注目されており、例えば、制御性T細胞を有効成分として含有する免疫寛容誘導用の免疫調節剤（特許文献１）、造血幹細胞、造血前駆細胞又はそれらの混合物を寛容原有効成分とする免疫寛容誘導剤（特許文献２）、ドナー由来のB細胞又は樹状細胞を移植前のレシピエントに投与することで、同種移植における組織定着率が改善されること（非特許文献１及び２）等が報告されている。免疫寛容の誘導は、同種移植における拒絶反応の抑制のみならず、アレルギー性疾患や自己免疫疾患に対する治療又は予防のための手段としても期待されている。

WO2006/107101 特開平11-180892号公報

Gao J. et al., 2013, PLOS ONE, 8 (10): e77761 Yamano T. et al., 2011, blood, 117 (9): 2640-2648

　本発明者らは、特定の遺伝子を導入した、多能性幹細胞から誘導される造血幹・前駆細胞が、免疫寛容を誘導する能力を有することを見いだした。

　本開示は以下の発明を提供する。
項１　Lhx2遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来の造血幹・前駆細胞を含有する、免疫寛容誘導用組成物。
項２　造血幹・前駆細胞において、さらにHoxB4遺伝子が強制発現されている、項１に記載の組成物。
項３　多能性幹細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、項１又は２に記載の組成物。
項４　主要組織適合性抗原適合性のある同種異系移植において、又は主要組織適合性抗原適合性のない同種異系移植において、免疫寛容を誘導するためにレシピエントに対して用いられる、項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
項５　多能性幹細胞が有する主要組織適合性抗原のハプロタイプと、同種異系移植のドナーが有する主要組織適合性抗原のハプロタイプとが完全に一致する、項４に記載の組成物。
項６　多能性幹細胞が、ドナー由来である、項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
項７　多能性幹細胞を、Lhx2の強制発現下で造血幹・前駆細胞に分化させることを含む、免疫寛容誘導用組成物を製造する方法。
項８　多能性幹細胞の造血幹・前駆細胞への分化が、多能性幹細胞から胚様体を形成させた後、造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下で培養することによって行われる、項７に記載の方法。
項９　中胚葉細胞への分化が可能な条件下で多能性幹細胞を培養することを含む、項７又は８に記載の方法。
項１０　多能性幹細胞に胚様体を形成させた後、Lhx2を強制的に発現させて造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下で培養する、項７～９のいずれか一項に記載の方法。
項１１　造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下での培養が、幹細胞因子及びIL-6存在下で培養することを含む、項１０に記載の方法。
項１２　多能性幹細胞を、Lhx2及びHoxB4の強制発現下で造血幹・前駆細胞に分化させる、項７～９のいずれか一項に記載の方法。
項１３　多能性幹細胞に胚様体を形成させた後、Lhx2及びHoxB4を強制的に発現させて造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下で培養する、項１２のいずれか一項に記載の方法。
項１４　造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下での培養が、幹細胞因子及びトロンボポエチン存在下で培養することを含む、項１３に記載の方法。
項１５　多能性幹細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、項７～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１６　組成物が、主要組織適合性抗原適合性のある同種異系移植、又は主要組織適合性抗原適合性のない同種異系移植において、免疫寛容を誘導するためにレシピエントに対して用いられる、項７～１５のいずれか一項に記載の方法。
項１７　多能性幹細胞が有する主要組織適合性抗原のハプロタイプと、同種異系移植のドナーが有する主要組織適合性抗原のハプロタイプとが完全に一致する、項１６に記載の方法。
項１８　多能性幹細胞が、ドナー由来である、項７～１７のいずれか一項に記載の方法。
項１９　Lhx2遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来の造血幹・前駆細胞の有効量を、免疫寛容が望まれる哺乳動物個体に投与することを含む、哺乳動物個体において免疫寛容を誘導する方法。
項２０　造血幹・前駆細胞において、さらにHoxB4遺伝子が強制発現されている、項１９に記載の方法。
項２１　哺乳動物個体が、主要組織適合性抗原適合性のある同種異系移植における、又は主要組織適合性抗原適合性のない同種異系移植における、レシピエントである、項１９又は２０に記載の方法。
項２１Ａ　多能性幹細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
項２１Ｂ　多能性幹細胞が、ドナー由来である、項１９～２１及び２１Ａのいずれか一項に記載の方法。
項２２　Lhx2遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来の造血幹・前駆細胞の有効量を、レシピエントに投与すること、及びレシピエントにドナー由来細胞、組織又は臓器を移植することを含む、レシピエントにおけるドナー由来細胞、組織又は臓器の生着率を向上させる方法。
項２３　造血幹・前駆細胞において、さらにHoxB4遺伝子が強制発現されている、項２２に記載の方法。
項２４　移植が、主要組織適合性抗原適合性のある移植、又は主要組織適合性抗原適合性のない移植である、項２２又は２３に記載の方法。
項２５　多能性幹細胞が有する主要組織適合性抗原のハプロタイプと、ドナーの主要組織適合性抗原のハプロタイプとが完全に一致する、項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
項２５Ａ　多能性幹細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
項２５Ｂ　多能性幹細胞が、ドナー由来である、項２２～２５及び２５Ａのいずれか一項に記載の方法。

　本発明によれば、免疫寛容の誘導が望まれる哺乳動物個体、特に同種移植を受けるレシピエントにおいて、免疫寛容を誘導することができ、拒絶反応の少ない同種移植治療を行うことが可能となる。

Lhx2遺伝子導入を伴うiPS細胞からHSPCへの分化誘導培養の際の細胞数の変化を示すグラフである。 Lhx2遺伝子導入を伴うiPS細胞からHSPCへの分化誘導培養により得られた細胞（Day 17）のフローサイトメトリー解析結果を示すドットプロットである。右側のドットプロットは、中央のドットプロットを四角枠内でゲーティングして解析したものである。 Lhx2遺伝子導入を伴うiPS細胞からHSPCへの分化誘導培養により得られた細胞（Day 17）におけるCD45⁺KSL（CD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lineage^-）の割合を示すグラフである。 Lhx2遺伝子が導入されたiPS細胞由来HSPC（以下、Lhx2⁺-iHSPC）を移入したシンジェニックレシピエントマウスの末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞（ドナー細胞由来細胞）の割合の変化を示すグラフである。 Lhx2⁺-iHSPCを移入してから9週目のシンジェニックレシピエントマウスの末梢血単核細胞のフローサイトメトリー解析結果を示すドットプロットである。 Lhx2⁺-iHSPCを移入したアロジェニックレシピエントマウスの末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞（ドナー細胞由来細胞）の割合の変化を示すグラフである。 Lhx2⁺-iHSPCを移入してから2週目及び6週目のアロジェニックレシピエントマウスの末梢血単核細胞のフローサイトメトリー解析結果を示すドットプロットである。 Lhx2⁺-iHSPCを移入したC3129F1マウスにBALB/cマウス、C3129F1マウス又はB6マウスの皮膚片を移植したときの、移植皮膚片の生着期間を示すグラフである。 Lhx2⁺-iHSPCを移入したC3129F1マウスにB6マウスの皮膚片を移植したときの、各マウス個体における移植皮膚片のサイズの変化を示すグラフ（図９左）、Lhx2⁺-iHSPC移入群のうち移植皮膚片のサイズが変わらなかったマウス及び移植皮膚片の退縮が認められたマウスの末梢血単核細胞のフローサイトメトリー解析によるドットプロット（図９中央）、並びに移植後45日目の皮膚片の画像（図９右）である。 Lhx2遺伝子導入及び4-ヒドロキシタモキシフェン（4-HT）によるHoxB4の発現誘導を伴うiPS細胞からHSPCへの分化誘導培養の際の細胞数の変化を示すグラフである。グラフの縦軸は、誘導5日目（レトロウイルス感染時）の細胞数を1としたときの相対値である。グラフは、各条件の3反復分の平均値を示している。また、ドットプロットで反復ごとの値を示している。 Lhx2遺伝子導入及び4-HTによるHoxB4の発現誘導を伴うiPS細胞からHSPCへの分化誘導培養により得られた細胞（Day 20）のフローサイトメトリー解析結果を示すドットプロットである。 Lhx2遺伝子導入及び4-HTによるHoxB4の発現誘導を伴うiPS細胞からHSPCへの分化誘導培養により得られた細胞（Day 20）におけるCD45⁺Lineage^-細胞、CD45⁺c-Kit⁺Sca-1⁺Lineage^-（CD45⁺KSL）細胞、CD45⁺CD150⁺CD34^-KSL細胞の割合を示すグラフである。各条件、3反復で実験を行い、グラフはMean±SDを示している。TukeyのHSD検定により統計解析を行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。 4-HTによってHoxB4の発現が誘導された又は誘導されていない、Lhx2遺伝子が導入されたiPS細胞由来HSPC（以下、それぞれaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC、aHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPC）を移入したシンジェニックレシピエントマウス（一次レシピエント）の末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞（ドナー細胞由来細胞）の割合の変化を示すグラフである。折れ線グラフは平均値を、ドットプロットは各マウスの実測値を表す。各計測時点においてStudent’s t-testにより統計解析を行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。一次レシピエントの骨髄細胞を移植したシンジェニックレシピエントマウス（二次レシピエント）の末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞（ドナー細胞由来細胞）の割合の変化を示すグラフである。折れ線グラフは平均値を、ドットプロットは各マウスの実測値を表す。各計測時点においてStudent’s t-testにより統計解析を行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。 Lhx2⁺-iHSPC又はaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCを移入したアロジェニックレシピエントマウスの末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞（ドナー細胞由来細胞）の割合の変化を示すグラフである。折れ線グラフは平均値を、ドットプロットは各マウスの実測値を表す（各群n=5。ただしLhx2⁺-iHSPC投与群は、細胞投与後12週目以降、n=3で実験を行った）。 4-HTによってHoxB4の発現が誘導されたiPS細胞由来HSPC（以下、aHoxB4^on-iHSPC）、Lhx2⁺-iHSPC又はaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCを移入したC3129F1マウスに、BALB/cマウス、C3129F1マウス又はB6マウスの皮膚片を移植したときの、移植皮膚片の生着期間を示すグラフである。2群間における移植片の生着期間をLog-rank test（Bonferroni法で補正済み）により統計解析した。**p<0.01を表す。 aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCから分取したc-Kit⁺Sca-1^-Lineage^-（KL）細胞又はc-Kit⁺Sca-1⁺Lineage^-（KSL）細胞を移入したシンジェニックレシピエントマウスの末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞（ドナー細胞由来細胞）の割合の変化を示すグラフである。グラフは平均値±標準誤差を表す。各計測時点においてtwo-tailed Student’s t-testを行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。 aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCを移入したC3Hマウスに、C3Hマウス、BALB/cマウス又はB6マウスの皮膚片を移植したときの、移植皮膚片の生着期間を示すグラフである。移植片の生着期間をLog-rank testにより統計解析した。*p<0.05を表す。 aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを移入し、共刺激遮断薬（CB）を併用したC3Hマウスに、C3Hマウス、BALB/cマウス又はB6マウスの皮膚片を移植したときの、移植皮膚片の生着期間を示すグラフである。移植片の生着期間をLog-rank test（Bonferroni法で補正済み）により統計解析した。*p<0.05、**p<0.01を表す。 aHoxB4^onLhx2⁺-iHSPCを移入し、CBを併用したC3Hマウスの末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞（ドナー細胞由来細胞）の割合の変化を示すグラフである。グラフは平均値±標準誤差を表す。 aHoxB4^onLhx2⁺-iHSPCを移入し、CBを併用したC3Hマウスの体重変化を示すグラフである。グラフは平均値を表す。各計測時点においてtwo-tailed Student’s t-testにより統計解析を行った。 aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入から8週後のC3129F1マウスの末梢血中の、CD11b⁺Gr-1⁺細胞（MDSC）、MDSCサブセットのCD11b⁺Gr-1^high及びCD11b⁺Gr-1^lowにおけるGFP陽性細胞の割合を示すグラフである。棒グラフは平均値及び標準誤差を、ドットプロットは各マウスの実測値を表す。Tukey’s HSD testにより統計解析を行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。 aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入から8週後のC3129F1マウスの末梢血中の、MDSCサブセットCD11b⁺Gr-1^high及びCD11b⁺Gr-1^lowにおけるPD-L1陽性細胞の割合を示すグラフである。棒グラフは平均値及び標準誤差を、ドットプロットは各マウスの実測値を表す。Tukey’s HSD testにより統計解析を行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。 aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入から8週後のC3129F1マウスの末梢血中の、MDSCサブセットCD11b⁺Gr-1^high及びCD11b⁺Gr-1^lowにおけるPD-L1のMFI（平均蛍光強度）を示すグラフである。棒グラフは平均値及び標準誤差を、ドットプロットは各マウスの実測値を表す。Tukey’s HSD testにより統計解析を行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。 HoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入から16週後のC3129F1マウスの脾臓中の、CD4⁺ T細胞におけるFoxp3⁺細胞（Treg）の割合を示すグラフである。棒グラフは平均値及び標準誤差を、ドットプロットは各マウスの実測値を表す。Tukey’s HSD testにより統計解析を行った。*p<0.05、**p<0.01を表す。図２６Ａは、B6由来ルシフェラーゼ発現iPS細胞を皮下移植したaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC移入C3129F1マウスのiPS細胞移植部におけるルシフェリンの発光を示す画像である。図２６Ｂは、図２６ＡのマウスのiPS細胞移植部の発光シグナル強度（total flux）の変化を示すグラフである。グラフは平均値及び標準誤差を表す。各計測時点においてtwo-tailed Student’s t-testにより統計解析を行った。*p<0.05を表す。図２７Ａは、B6由来ルシフェラーゼ発現iPS細胞を皮下移植後21日目のaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC移入C3129F1マウスから採取されたテラトーマの画像である。図中のN.D.はnot detected（検出されなかった）を表す。図２７Ｂは、採取されたテラトーマの重量を示すグラフである。グラフは平均値及び標準誤差を表す。two-tailed Student’s t-testにより統計解析を行った。*p<0.05を表す。

　以下に示す説明は、代表的な実施形態又は具体例に基づくことがあるが、本発明はそのような実施形態又は具体例に限定されるものではない。本明細書において示される各数値範囲の上限値及び下限値は、任意に組み合わせることができる。また、本明細書において「～」又は「-」を用いて表される数値範囲は、特に断りがない場合、その両端の数値を上限値及び下限値として含む範囲を意味する。

　本開示において、多能性幹細胞とは、自己複製能と、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に属する細胞系列すべてに分化し得る能力である多能性（pluripotency）とを有する細胞をいう。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）等を挙げることができる。本開示において用いられる多能性幹細胞は、好ましくはES細胞又はiPS細胞であり、より好ましくはiPS細胞である。

　本開示において用いられる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり得る。多能性幹細胞は、免疫寛容の誘導が望まれる対象と同種の哺乳動物の多能性幹細胞であることが好ましい。

　本開示における哺乳動物は、ヒト及び非ヒト哺乳動物であり、非ヒト哺乳動物の例としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、サル、チンパンジーを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物等を挙げることができる。好ましい哺乳動物はマウス又はヒトであり、より好ましくはヒトである。

　ES細胞は、例えば、着床前の胚盤胞期胚に存在する内部細胞塊を、フィーダー細胞上で、又はLIF若しくはFGF2を含む培地中で培養することによって作製することができる。なお、ヒト胚性幹細胞としては、受精１４日以内のヒト胚から樹立されたものが挙げられる。

　誘導多能性幹細胞（iPS細胞）は、体細胞を初期化（reprogramming）して多能性を誘導した細胞である。iPS細胞は、当業者に知られた初期化方法によって作製することができる。初期化方法の一例は、体細胞、例えば線維芽細胞、血球系細胞（例えば末梢血由来単核細胞）等に、初期化因子と称される遺伝子又はそれにコードされるタンパク質、例えばOct 3/4、Sox 2、Klf 4及びMyc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）の4種の遺伝子を導入し、適切な条件下で培養することで多能性を有する細胞を誘導する方法である。初期化方法の別の例は、上記遺伝子を低分子化合物等の薬剤で代用する方法（例えば、Hou P. et al., 2013, Science, 9; 341(6146), 651-4）や、マイクロRNAを用いる方法（Miyoshi N. et al., Cell Stem Cell, 2011, 8, 633-638）である。

　本開示においては、任意の方法によって、任意の細胞から調製された多能性幹細胞を用いることができる。また、細胞バンクから分譲されている多能性幹細胞、市販されている多能性幹細胞を用いることもできる。例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト誘導多能性幹細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。

　多能性幹細胞は、フィーダー細胞の存在下で作製し、維持培養し、拡大培養することができる。フィーダー細胞は、多能性幹細胞の未分化維持培養の際に用いられる、当該多能性幹細胞以外の細胞であり、例えばマウス線維芽細胞（MEF）、ヒト線維芽細胞、SNL細胞等を挙げることができる。フィーダー細胞は、例えばマイトマイシンC等の増殖抑制剤、ガンマ線照射等の増殖抑制処理を施してから使用することが好ましい。

　多能性幹細胞はまた、フィーダー細胞の非存在下（フィーダーフリー）で作製し、維持培養し、拡大培養することもできる。フィーダーフリーは、フィーダー細胞を添加しない、又はフィーダー細胞が実質的に含まれない条件である。フィーダーフリー培養のための培地としては、例えばEssential 8培地、Essential 6培地、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、Stabilized Essential 8培地、StemFit（登録商標）等を挙げることができる。

　また、特に指示がないかぎり、本開示における細胞の培養は、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地又はこれらの混合培地等を用いて行うことができる。その他、これら以外であっても、多能性幹細胞から造血幹細胞へ分化させるための培地、造血幹細胞へ分化させた後の維持するための培地であれば適宜選択できる。

　本開示において、造血幹細胞（Hematopoietic Stem Cell; HSC）とは、自己複製能と、白血球、赤血球及び血小板等の血液細胞に分化し得る多分化能とを有する細胞をいう。造血幹細胞には、長期にわたって自己複製能を有する長期造血幹細胞（LT-HSC）と、LT-HSCから生じる、短期的な自己複製能しか有さない短期造血幹細胞（ST-HSC）が含まれる。

　本開示において、造血前駆細胞とは、造血幹細胞から成熟血液細胞に至るまでの中間段階の未分化な血液細胞をいう。造血前駆細胞には、ST-HSCから生じる、自己複製能を有さない多能性前駆細胞（Multipotent Progenitor; MPP）、MPPから生じる骨髄系共通前駆細胞（Common Myeloid Progenitor; CMP）及びリンパ系共通前駆細胞（Common Lymphoid Progenitor; CLP）が含まれる。

　本開示において、造血幹・前駆細胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cell; HSPC）は、造血幹細胞及び造血前駆細胞の少なくとも一方を含む細胞集団をいう。HSPCは、造血幹細胞のみを含む細胞集団であってもよく、造血前駆細胞のみを含む細胞集団であってもよく、造血幹細胞と造血前駆細胞の両方を含む細胞集団であってもよい。

　HSPCは、複数の細胞表面マーカーの組み合わせを利用することで他の細胞と識別することができる。例えば、マウスのHSPCは、CD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lineage^-の細胞集団として検出することができ、ここでLineage^-（Lin^-とも表す）とは、マウスの分化血液細胞マーカーであるCD4、CD8、B220、Gr-1及びTer119がいずれも陰性であることを意味する。CD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lineage^-細胞は、CD45⁺KSL細胞とも呼ばれる。ヒトのHSPCは、Lineage^-CD34⁺の細胞集団として検出することができ、ここでLineage^-とは、ヒトの分化血液細胞マーカーであるCD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66bおよびglycophorin Aがいずれも陰性であることを意味する。

　また造血幹細胞も複数の細胞表面マーカーの組み合わせを利用することで他の細胞と識別することができる。例えば、マウスの造血幹細胞は、CD45^＋CD150^＋CD34^low/-c-Kit⁺Sca-1⁺Lineage^-の細胞集団として検出することができる。ヒトの造血幹細胞は、Lineage^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺の細胞集団として検出することができる。

　本開示は、Lhx2遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来のHSPCを含有する、免疫寛容誘導用組成物を提供する。本開示はまた、Lhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来HSPCを含有する免疫寛容誘導用組成物を提供する。これらの多能性幹細胞由来のHSPCは、Lhx2を強制発現させた、あるいはLhx2及びHoxB4の両方を強制発現させた多能性幹細胞をHSPCに分化させることを含む方法によって製造することができる。多能性幹細胞からHSPCへの分化は、インビトロで、公知のHSPC分化誘導条件下での培養によって行うことができ、例えば、多能性幹細胞から中胚葉細胞を誘導し、得られた中胚葉細胞をHSPCに分化させることによって行うことができる。多能性幹細胞から中胚葉細胞を仲介したHSPCへの分化方法は、特に限定はなく当業者に知られた培養方法を採用することができる。具体的には、胚様体形成法、または接着培養法が挙げられる。中胚葉細胞を介した多能性幹細胞からHSPCへの分化は、好ましくは、胚様体形成法によって行われる。

　胚様体（Embryoid Body; EB）は、多能性幹細胞を浮遊培養することによって形成される三次元の細胞凝集塊であり、その内部に外胚葉、中胚葉及び内胚葉の全ての細胞系譜を包含する。胚様体形成法は、多能性幹細胞が分化初期段階から各胚葉への分化の方向性が決定付けられることに着目し、目的細胞の系列の胚葉への分化指向性を有する細胞が多く含まれるEBを形成させることで、多能性幹細胞を目的細胞に効率的に分化させる方法である。すなわち、本開示においては、多能性幹細胞から形成されるEBは、中胚葉への分化指向性を有する細胞及び中胚葉細胞のうちの少なくとも一方を含み得る。

　EB形成法の例としては、細胞非接着性培養容器に多能性幹細胞を分散した細胞懸濁液を加えてEBを形成する方法、多能性幹細胞をコロニー又は小集塊として剥離し、組織細胞の接着性が低い細菌培養用のディッシュ上で浮遊培養する方法等を挙げることができる。

　本開示において、中胚葉への分化指向性を有する細胞とは、他の胚葉の細胞よりも中胚葉細胞に分化しやすい性質を有する細胞をいう。中胚葉への分化指向性を有する細胞は、中胚葉誘導条件下での培養により分化誘導を行うことで、中胚葉への分化指向性を有さない細胞よりも、高い確率で、あるいはより多くの中胚葉細胞をもたらし得る。

　本開示においては、多能性幹細胞を、中胚葉細胞への分化が可能な条件（中胚葉誘導条件と称する）の下で浮遊培養することでEBを形成させ、当該EBに含まれる中胚葉への分化指向性を有する細胞から、又は中胚葉細胞から、又は中胚葉への分化指向性を有する細胞及び中胚葉細胞の両方からHSPCを分化させることが好ましい。中胚葉誘導条件の例としては、後述の実施例で使用した中胚葉誘導培地（α-MEM（GIBCO）に20% ウシ胎仔血清（Nichirei）、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、55 μM 2-メルカプトエタノールを添加した培地）での培養や、Salvagiotto G., et al., PLoS One, 2011, 6(3), e17829、Lange, L. et al., Cellular and Molecular Life Sciences, 2021, 78 (9): 4143-4160、Daniel, M et al., Trends in Cell Biology, 2016, 26 (3): 202-214といった文献に記載の条件等を挙げることができる。

　多能性幹細胞からEBを形成させるために必要とされる中胚葉誘導条件下での培養時間は、2日間以上であれば特に限定されない。また、EB形成が確認された後、EBの培養をそのまま継続してもよい。多能性幹細胞からEBを形成させるための中胚葉誘導条件下での培養時間は、例えば、2日間以上、3日間以上、4日間以上、5日間以上、6日間以上、7日間以上であり得て、また14日間以下、13日間以下、12日間以下、11日間以下、10日間以下、9日間以下、8日間以下、7日間以下、6日間以下、5日間以下であり得る。

　多能性幹細胞からEBを形成させるための中胚葉誘導条件下での培養時間は、例えば、2～14日間、好ましくは3～10日間、より好ましくは4～8日間であり得る。

　形成されたEBは、分散、好ましくは単細胞化した後、HSPC分化誘導条件下で培養される。EBの分散とは、EBを、より細かい構成体、例えば、より小さい細胞塊又は単一細胞にすることを意味する。EBの分散は、公知の方法によって、例えば、トリプシン/EDTA、プロナーゼ、ディスパーゼ、コラゲナーゼ等の酵素を用いた化学的方法、ピペッティング、スクレイピング等の操作による物理的方法によって行うことができる。

　分散後のEBは、そのまま、又は中胚葉細胞を濃縮した後に、HSPC分化誘導条件下で培養することができる。中胚葉細胞の濃縮は、公知の中胚葉マーカー、例えばVEGF受容体であるFlk-1（VEGFR-2とも呼ぶ）等の発現を指標として、セルソーター等の細胞分離手段を用いて行うことができる。

　HSPC分化誘導条件下での培養は、中胚葉誘導条件下で、造血幹細胞の生存又は増殖に必要とされる因子を培地に添加して行うことが好ましい。このような因子としては、幹細胞因子（Stem Cell Factor; SCF）、トロンボポエチン（Thrombopoietin; TPO）、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド（FMS-like tyrosine kinase 3 Ligand; Flt3L）、IL-6等を挙げることができ、これらの因子を単独で又は組み合わせて使用することができる。使用するこれらの因子は、好ましくは、多能性幹細胞が由来する生物種と同じ生物種に由来するものである。

　HSPC分化誘導条件下での培養において使用される培地中のSCFの濃度は、例えば、1 ng/ml以上、5 ng/ml以上、10 ng/ml以上、15 ng/ml以上、20 ng/ml以上、25 ng/ml以上、50 ng/ml以上であり得て、また500 ng/ml以下、400 ng/ml以下、300 ng/ml以下、200 ng/ml以下、150 ng/ml以下、100 ng/ml以下であり得る。HSPC分化誘導条件下での培養において使用される培地中のTPOの濃度は、例えば、0.1 ng/ml以上、1 ng/ml以上、2 ng/ml以上、5 ng/ml以上、6 ng/ml以上、7 ng/ml以上、8 ng/ml以上、9 ng/ml以上、10 ng/ml以上であり得て、また50 ng/ml以下、40 ng/ml以下、30 ng/ml以下、20 ng/ml以下、15 ng/ml以下、10 ng/ml以下であり得る。HSPC分化誘導条件下での培養において使用される培地中のIL-6の濃度は、例えば、0.1 ng/ml以上、1 ng/ml以上、2 ng/ml以上、5 ng/ml以上、6 ng/ml以上、7 ng/ml以上、8 ng/ml以上、9 ng/ml以上、10 ng/ml以上であり得て、また50 ng/ml以下、40 ng/ml以下、30 ng/ml以下、20 ng/ml以下、15 ng/ml以下、10 ng/ml以下であり得る。

　ある実施形態において、HSPC分化誘導条件下での培養において使用される培地中のSCFの濃度は、例えば10～500 ng/ml、好ましくは20～300 ng/ml、より好ましくは50～200 ng/mlであり得る。別の実施形態において、HSPC分化誘導条件下での培養において使用される培地中のSCFの濃度は、例えば1～200 ng/ml、好ましくは5～100 ng/ml、より好ましくは10～50 ng/mlであり得る。

　ある実施形態において、HSPC分化誘導条件下での培養において使用される培地中のTPOの濃度は、例えば1～50 ng/ml、好ましくは2～30 ng/ml、より好ましくは5～20 ng/mlであり得る。

　ある実施形態において、HSPC分化誘導条件下での培養において使用される培地中のIL-6の濃度は、例えば1～50 ng/ml、好ましくは2～30 ng/ml、より好ましくは5～20 ng/mlであり得る。

　HSPC分化誘導条件下での培養時間は、所望のHSPCが得られるかぎり制限はなく、例えば、7日間以上、8日間以上、9日間以上、10日間以上、11日間以上、12日間以上であり得て、また28日間以下、21日間以下、20日間以下、19日間以下、18日間以下、17日間以下、16日間以下、15日間以下、14日間以下、13日間以下、12日間以下であり得る。

　ある実施形態において、HSPC分化誘導条件下での培養時間は、例えば7～28日間、好ましくは9～21日間、より好ましくは10～18日間であり得る。別の実施形態において、HSPC分化誘導条件下での培養時間は、例えば7～28日間、好ましくは10～21日間、より好ましくは12～18日間であり得る。

　多能性幹細胞からHSPCへの分化は、骨髄ストロマ細胞、例えばOP9ストロマ細胞等のフィーダー細胞の存在下で、又はフィーダーフリーで行うことができる。

　多能性幹細胞からHSPCへの分化は、EBを形成させずに中胚葉細胞を誘導し、当該中胚葉細胞を上述のHSPC分化誘導条件下で培養することによって行われてもよい。例えば、多能性幹細胞をOP9ストロマ細胞へ直接播種して共培養する等の接着培養法によって、中胚葉細胞を誘導することが可能である。

　本開示において、多能性幹細胞からHSPCへの分化は、Lhx2の強制発現下で、あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下で行われる。ここで強制発現とは、人為的操作により特定の遺伝子の発現を亢進させることをいい、外部から導入した遺伝子を発現させること、及び内在性遺伝子の発現を亢進させることの両方を包含する。外部から導入した遺伝子を発現させることは、外来性遺伝子をゲノムにノックインする方法も含む。また、内在性遺伝子の発現を亢進させることは、プロモータ等発現制御領域を活性化する等により内在性遺伝子の活性を亢進する方法でもよい。このプロモータ等発現制御領域の活性化は、プロモータ等発現制御領域を活性化すれば、どのような方法でもよい。

　Lhx2の強制発現下、あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下とは、それぞれ、Lhx2の遺伝子発現が人為的操作を加えない場合と比較して亢進した状態にあること、あるいはLhx2及びHoxB4の遺伝子発現が人為的操作を加えない場合と比較して亢進した状態にあることを意味する。例えば、Lhx2をコードする核酸を、あるいはLhx2をコードする核酸及びHoxB4をコードする核酸を、多能性幹細胞又はEB由来細胞に導入することによって、多能性幹細胞からHSPCへの分化をLhx2の強制発現下で、あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下で行うことができる。

　Lhx2（LIM Homeobox Protein 2）は、システインリッチな亜鉛結合ドメイン（LIMドメイン）を有する転写因子として知られており、iPS細胞からHSPCへの分化誘導の制御への関与が報告されている（Kitajima et al., BLOOD, 2011, vol. 117, no. 1, pp. 3748-3758）。ヒトLhx2のアミノ酸配列はNCBIにAAD20013として、ヒトLhx2のcDNAの塩基配列はNCBIにAF124735として登録されている。また、マウスLhx2のアミノ酸配列はNCBIにAAD20012として、マウスLhx2のcDNAの塩基配列はNCBIにAF124734として登録されている（いずれも2022年1月13日に検索）。

　HoxB4（Homeobox B4）は、Antpホメオボックスファミリーのメンバーである転写因子として知られており、iPS細胞からHSPCへの分化誘導の制御への関与が報告されている（Izawa et al., Experimental Hematology, 2020, vol. 89, pp. 68-79）。ヒトHoxB4のアミノ酸配列はNCBIにNP_076920として、ヒトHoxB4のcDNAの塩基配列はNCBIにNM_024015として登録されている。また、マウスHoxB4のアミノ酸配列はNCBIにNP_034589として、マウスHoxB4のcDNAの塩基配列はNCBIにNM_010459として登録されている（いずれも2022年1月13日に検索）。

　Lhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子の導入は、細胞に外来遺伝子を発現可能に導入する一般的な方法によって、例えば、ゲノム編集等の遺伝子改変手法を用いて外来遺伝子をゲノムにノックインする方法によって行うことができる。このような方法の例としては、Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press（1993）；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）等に記載されている方法を挙げることができる。

　また、Lhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子の導入は、例えば、外来遺伝子を含むベクターを多能性幹細胞に導入する方法によって行うことができる。このような方法の例としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、RNAベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）等を挙げることができる。

　ある実施形態において、Lhx2遺伝子の導入は、上記のKitajimaら（BLOOD, 2011, vol. 117, no. 1, pp. 3748-3758）に報告されている、Lhx2遺伝子を有する組み換えレトロウイルスベクターをiPS細胞に感染させる方法によって行うことができる。また、ある実施形態において、HoxB4遺伝子の導入は、上記のIzawaら（Experimental Hematology, 2020, vol. 89, pp. 68-79）に報告されている、HoxB4遺伝子を有する組み換えレンチウイルスベクターをiPS細胞に感染させる方法によって行うことができる。Lhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子は、培地への薬剤等の添加によって発現調節が可能なプロモーターの制御下に置かれていてもよい。

　Lhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子が導入された細胞の作製において、遺伝子の導入の順序に制限はなく、いずれが先であってもよく、例えばLhx2をコードする核酸とHoxB4をコードする核酸を混合状態で含有する遺伝子導入試薬を用いて細胞を処理して、両方の遺伝子を同時に導入してもよい。また、両方の遺伝子を同じ方法で細胞に導入しても、異なる方法で細胞に導入してもよい。さらに、Lhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子が導入された細胞は、一方の遺伝子が導入された細胞として保存され又は入手可能な細胞に、もう一方の遺伝子を導入することで作製されたものであってもよい。

　好ましい実施形態において、HSPCは、多能性幹細胞にEBを形成させた後、EBにLhx2遺伝子を強制発現させ、HSPC分化誘導条件下で培養することで調製される。ここでEBの形成は中胚葉誘導条件下での浮遊培養によって行われることが好ましい。また、HSPC分化誘導条件下での培養は、SCF及びIL-6存在下で培養することを含んでもよい。SCF及びIL-6存在下での培養は、例えば10～500 ng/ml、好ましくは20～300 ng/ml、より好ましくは50～200 ng/mlのSCFと、例えば1～50 ng/ml、好ましくは2～30 ng/ml、より好ましくは5～20 ng/mlのIL-6とを含む培地を用いて行うことができる。また、培養は、例えば、7～28日間、好ましくは9～21日間、より好ましくは10～18日間行えばよい。

　別の好ましい実施形態において、HSPCは、多能性幹細胞にEBを形成させた後、EBにLhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子を強制発現させ、HSPC分化誘導条件下で培養することで調製される。ここでEBの形成は中胚葉誘導条件下での浮遊培養によって行われることが好ましい。また、HSPC分化誘導条件下での培養は、SCF及びTPO存在下で培養することを含んでもよい。SCF及びTPO存在下での培養は、例えば1～200 ng/ml、好ましくは5～100 ng/ml、より好ましくは10～50 ng/mlのSCFと、例えば1～50 ng/ml、好ましくは2～30 ng/ml、より好ましくは5～20 ng/mlのTPOとを含む培地を用いて行うことができる。また、培養は、例えば、7～28日間、好ましくは10～21日間、より好ましくは12～18日間行えばよい。

　マウス由来多能性幹細胞のHSPCへの分化は、HSPC分化誘導条件下での培養により得られた細胞集団全体に占めるCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合が、培養前の多能性幹細胞集団全体に占めるCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合よりも大きいことによって確認することができる。HSPC分化誘導条件下での培養により得られた細胞集団全体に占めるCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合は、例えば、1%以上、3％以上、5％以上、又は7％以上であり得る。

　また、マウス由来多能性幹細胞のHSPCへの分化は、HSPC分化誘導条件下での培養により得られた細胞集団全体に占めるCD45^＋CD150^＋CD34^-c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合が、培養前の多能性幹細胞集団全体に占めるCD45^＋CD150^＋CD34^-c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合よりも大きいことによって確認することもできる。HSPC分化誘導条件下での培養により得られた細胞集団全体に占めるCD45^＋CD150^＋CD34^-c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合は、例えば、0.5％以上、1％以上、2％以上、又は3％以上であり得る。

　細胞表面マーカーの検出は、細胞をフローサイトメトリーで解析することで行われ得る。また、多能性幹細胞がヒトに由来する場合、CD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合に代えてLineage^-CD34⁺の割合を、CD45^＋CD150^＋CD34^-c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞に代えてLineage^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺の割合を指標として、多能性幹細胞のHSPCへの分化を確認することができる。

　多能性幹細胞を、Lhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られる細胞集団は、通常、生体内に存在する骨髄細胞集団と比較して多くのHSPCを含有しており、遺伝型が異なる細胞と血液キメラを形成させて免疫寛容を誘導する能力を有する。したがって、本開示は、Lhx2遺伝子が強制発現された、あるいはLhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来HSPCを含有する免疫寛容誘導用組成物を提供する。本開示はまた、Lhx2遺伝子が強制発現された、あるいはLhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来HSPCを含有する、免疫寛容誘導剤を提供する。

　免疫寛容とは、免疫応答を起こす可能性のある抗原に対する免疫系の不応答状態を意味する。免疫寛容には、自己抗原に対する免疫不応答である自己寛容と、非自己抗原に対する免疫不応答である獲得寛容（誘導免疫寛容とも呼ばれる）がある。獲得寛容は、所定の条件下で非自己抗原を投与することによって誘導されることが知られており、制御性T細胞による非自己抗原に対する免疫応答抑制が関与するものと考えられている。また、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患は、それぞれ自己、非自己に対する免疫寛容が破綻することにより引き起こされるものと考えられている。

　血液キメラ（血液キメリズムともいう）は、生物個体において、自己の血液細胞と異なる生物個体由来の血液細胞とが同時に存在する状態をいう。非自己の細胞又は組織の移植を受けるレシピエントに、自己の血液細胞とドナー由来の血液細胞とが同時に存在する血液キメラを形成させることによって、ドナー抗原に対する免疫寛容を誘導することができることが知られている。

　本開示において、免疫寛容の誘導とは、特定抗原に対する免疫不応答状態を誘導することをいい、例えば、免疫応答の発生又は進行を遅らせること、免疫応答の強度を弱めること等を包含する。本開示において、免疫寛容は自己抗原、非自己抗原のいずれに対するものでもよいが、上述の免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、特に非自己抗原に対する獲得寛容を誘導するために、例えば同種移植においてドナー由来移植物に対する免疫寛容を誘導するために、好適に用いることができる。

　本開示における免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、免疫寛容の誘導が望まれる哺乳動物個体（例えば、細胞移植又は臓器移植を受けるレシピエント）に対して用いることができる。同種移植における免疫寛容誘導のために用いられる場合、HSPCは、ドナーに由来する多能性幹細胞から、又はレシピエント及びドナーと同じ生物種であるがいずれとも異なる個体に由来する多能性幹細胞から、上述の製造方法によって調製することができる。後者の多能性幹細胞は、その主要組織適合性抗原（Major Histocompatibility Complex（MHC）、ヒトではHuman Leukocyte Antigen（HLA）とも称される）のハプロタイプが、移植ドナーのそれと完全に一致することが好ましい。

　本開示において、MHC適合性のある移植（MHC compatible transplantation）とは、ドナーのMHC遺伝子型がレシピエントに適合性のある移植を意味し、このとき、ドナーは、主要なMHC遺伝子座の一部又は全部において、レシピエントと異なるアレルを持たない。MHC適合性のない移植（MHC incompatible transplantation）とは、ドナーのMHC遺伝子型がレシピエントに適合性のない移植を意味し、このとき、ドナーは、主要なMHC遺伝子座の全てにおいて、レシピエントと異なるアレルを持つ。

　ヒトにおける臨床応用では、免疫抑制剤では抑制できない拒絶反応により重篤な予後をもたらす可能性があるため、ドナーの主要なMHC遺伝子座（HLA遺伝子座）の一部であっても、レシピエントと異なるアレルを持たないことが望ましい。

　MHCの適合性は、慣用的な方法として、ドナーとレシピエントの相性をみるHLAタイピング、リンパ球クロスマッチなどの、組織適合性検査によって確認することができる。

　マウスにおける主要なMHC遺伝子座としては、H-2K、H-2D、H-2L、I-A及びI-Eを挙げることができ、さらに、これらに加えて、Qa-2及びQa-1のうちのいずれか１つ、好ましくは全てを含んでもよい。なお、マウスのMHCハプロタイプは、主要な遺伝子座における特定のアレルのセットに応じた呼称を有する。例えば、MHCハプロタイプb（H-2bとも呼ぶ）はH-2K^b、H-2D^b、H-2L^null、I-A^b、I-E^nullというアレルセットを有するハプロタイプに、MHCハプロタイプd（H-2dとも呼ぶ）はH-2K^d、H-2D^d、H-2L^d、I-A^d、I-E^dというアレルセットを有するハプロタイプに、MHCハプロタイプk（H-2kとも呼ぶ）は、遺伝子型がH-2K^k、H-2D^k、H-2L^null、I-A^k、I-E^kというアレルセットを有するハプロタイプに相当する。

　ヒトにおける主要なMHC遺伝子座としては、HLA-A、HLA-B及びHLA-DRを挙げることができ、さらに、これらに加えてHLA-C、HLA-DQ及びHLA-DPのうちのいずれか１つ、好ましくは全てを含んでもよい。

　MHC適合性のある移植のヒトにおける例として、ヒトのHLAタイプにおいて、HLA-A, HLA-B, HLA-DRの３遺伝子座における遺伝子型がそれぞれホモ接合型である移植物を、対応する遺伝子座における少なくとも片方のアレルが当該遺伝子座におけるアレルと一致した組み合わせを有する移植物を移植する場合が該当するが、３遺伝子座に限られない。具体的にはHLA半合致移植があり、ドナーのHLA-A, HLA-B, HLA-DR が、*24:02-*52:01-*15:02、*33:03-*44:03-*13:02、*24:02-*07:02-*01:01、又は*24:02-*54:01-*04:05のホモ接合体である末梢血あるいは臍帯血に含まれる細胞から作製したiPS細胞から作製した細胞、組織、又は臓器をHLA-A, HLA-B, HLA-DRが、*24:02-*52:01-*15:02、*33:03-*44:03-*13:02、*24:02-*07:02-*01:01、又は*24:02-*54:01-*04:05のレシピエントに移植する場合である。なお、HLA-A, HLA-B, HLA-DRが、*24:02-*52:01-*15:02、*33:03-*44:03-*13:02、*24:02-*07:02-*01:01、又は*24:02-*54:01-*04:05は、日本国内で頻度の高いHLAとして知られている（WO2015/125941、およびiPS細胞ストックの細胞（HLAホモドナー）公益財団法人京都大学iPS細胞研究財団(https://www.cira-foundation.or.jp/j/research-institution/ips-stock-project/homozygous.html)参照）。

　免疫寛容誘導用組成物は、多能性幹細胞をLhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られる細胞集団そのものを含有してもよく、当該細胞集団に対してHSPCの細胞表面マーカー、例えばマウスの場合はCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-又はCD45＋CD150＋CD34-c-Kit+Sca-1+Lin^-等、ヒトの場合はLineage^-CD34⁺又はLineage^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49 f⁺等を指標とした細胞分離又は濃縮を行うことにより得られる、HSPCが濃縮された細胞集団を含有してもよい。ここでHSPCが濃縮された細胞集団とは、濃縮前の細胞集団、すなわち多能性幹細胞をLhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られる細胞集団と比較して、マウスの場合はCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞又はCD45^＋CD150^＋CD34^-c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合が、ヒトの場合はLineage^-CD34⁺細胞又はLineage^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49 f⁺細胞の割合が高められた細胞集団を意味する。

　マウス由来の多能性幹細胞から調製されるHSPCを含有する免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤に関して、組成物及び剤に含有される細胞集団全体に占めるCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合は、例えば、1%以上、3％以上、5％以上、又は7％以上であり得る。また、マウス由来の多能性幹細胞から調製されるHSPCを含有する免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤に関して、組成物及び剤に含有される細胞集団全体に占めるCD45^＋CD150^＋CD34^-c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合は、例えば、0.5％以上、1％以上、2％以上、又は3％以上であり得る。

　ヒト由来の多能性幹細胞から調製されるHSPCを含有する免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤に関して、組成物及び剤に含有される細胞集団全体に占めるLineage^-CD34⁺細胞の割合は、例えば、1%以上、3％以上、5％以上、又は7％以上であり得る。また、ヒト由来の多能性幹細胞から調製されるHSPCを含有する免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤に関して、組成物及び剤に含有される細胞集団全体に占めるLineage^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺細胞の割合は、例えば、0.5％以上、1％以上、2％以上、又は3％以上であり得る。

　免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤において用いられるHSPCは、投与された生体内において、Lhx2遺伝子の強制発現状態を維持することが好ましい。ある実施形態において、免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、外来のLhx2遺伝子が染色体に組み込まれたHSPCを含有する。

　免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、免疫寛容の誘導が望まれる哺乳動物個体に対して、免疫寛容誘導に有効な量あるいは血液キメラ形成に有効な量で投与される。マウスに投与される免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、マウス1個体あたりのHSPC投与量が1×10³個～1×10⁷個程度、好ましくは1×10⁴個～1×10⁶個程度になるようにHSPCを含有すればよい。ヒトに投与される免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤に含有されるHSPCの量は、上記のマウスの投与量に準じて決定することができる。ヒトに投与される免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、例えばヒトの体重1kgあたりのHSPC投与量が1×10²個～1×10⁹個程度、例えば1×10²個～1×10⁸個程度、1×10³個～1×10⁸個程度、1×10⁴個～1×10⁸個程度、好ましくは4×10⁵個～4×10⁷個程度となるようにHSPCを含有するものであり得る。

　免疫寛容誘導用組成物は、HSPCと、HSPCが生存可能な液体を含む組成物であれば限定はない。HSPCが生存可能な液体は、細胞製剤において通常使用される液体であればよく、例えば、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養培地等を挙げることができる。免疫寛容誘導用組成物は、HSPC以外の細胞を含んでもよく、またアジュバント、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、賦形剤、担体等の薬学的に許容される成分、及び他の医薬有効成分を含んでもよい。薬学的に許容される成分は当業者に周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、適宜選択して使用することができる。

　免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、注射剤、点滴剤等の非経口製剤の形態で用いることが好ましい。免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤の投与方法は特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与等を挙げることができる。

　好ましい実施形態において、免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、同種移植においてドナー由来移植物に対する免疫寛容をレシピエントに誘導するために、レシピエントに投与される。同種移植は、同種異系移植であってよい。同種異系移植の場合、MHC適合性のある移植であることが好ましいが、MHC適合性のない移植であってもよい。免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、MHC適合性はあるがマイナー組織適合性抗原の不一致の程度が大きい移植であっても、またMHC適合性のない移植であってもレシピエントに免疫寛容を誘導可能であることから、同種異系移植において、マイナー組織適合性抗原の一致は求められず、MHC適合性も求められない。また、移植物は、細胞（例えば、網膜色素上皮、ドパミン神経前駆細胞、グリア細胞等であるが、これらに限られない）、組織（例えば、皮膚、骨、膵島、心臓弁、血管、角膜、網膜等であるが、これらに限られない）、臓器（例えば、心臓、腎臓、肝臓等であるが、これらに限られない）のいずれであってもよい。

　ヒトにおいては、骨髄細胞を用いて免疫寛容を誘導可能であることが知られている（American Journal of Transplantation 2014; 14: 1599-1611、Transplantation 2020;104: 1472-1482）。したがって、HLAの主要な遺伝子座のアレルが完全に一致する、部分的に一致する又は全く一致しないヒト個体間で、一方のヒト個体由来のiPS細胞から作製したHSPCを他方のヒト個体へ移植することで、当該iPS細胞から作製した任意の細胞（例えば、網膜色素上皮、ドパミン神経前駆細胞、グリア細胞等であるが、これらに限られない）、組織（例えば、皮膚、骨、膵島、心臓弁、血管、角膜、網膜等であるが、これらに限られない）、臓器（例えば、心臓、腎臓、肝臓等であるが、これらに限られない）を移植した際に、従来よりも免疫抑制剤を低減した条件又は免疫抑制剤を不使用な条件で移植を行うことが可能となると期待される。このように、本開示は、HLA適合性のある、又はHLA適合性のないヒトの同種異系移植において免疫寛容を誘導するためにレシピエントとなるヒト個体に対して用いられる、Lhx2遺伝子が強制発現された、あるいはLhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子が強制発現された、ヒト多能性幹細胞由来HSPCを含有する免疫寛容誘導用組成物を提供する。

　免疫寛容誘導用組成物及び免疫寛容誘導剤は、免疫系を抑制するための処置と組み合わせて用いることができ、そのような処置の例としては、免疫抑制薬の投与、放射線照射、T細胞除去処置等を挙げることができる。

　免疫抑制薬の例としては、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ステロイド（例えばメチルプレドニゾロン等）、T細胞活性化阻害薬等を挙げることができる。T細胞活性化阻害薬の例としては、T細胞上の共刺激分子CD28と抗原提示細胞上のCD80/CD86との結合を阻害する薬剤、例えばCTLA-4の細胞外部分とIgGのFc部分との融合タンパク質であるCTLA-4Ig（例としてアバタセプト）；T細胞上の共刺激分子CD40L8と抗原提示細胞上のCD40との結合を阻害する薬剤、例えば抗CD40L（CD154）抗体；T 細胞上のIL-2受容体α鎖（CD25）とIL-2との結合を阻害する薬剤、例えば抗CD25モノクローナル抗体（例としてバシリキシマブ）等を挙げることができる。T細胞活性化阻害薬は、共刺激遮断薬（Co-stimulatory blockade; CB）とも呼ばれる。免疫系の抑制のため、一種類の免疫抑制薬を単独で、又は複数種類の免疫抑制薬を組み合わせて用いることができる。

　放射線照射は、移植治療を行う際にレシピエントに施される前処置の一つとして通常行われる放射線照射であればよく、レシピエントへの全身照射（Total Body Irradiation）又は胸腺への照射が好ましい。照射量は、例えばヒトへの全身照射の場合は１回の照射線量として1Gy以上、胸腺への照射の場合は3Gy以上で、かつ致死量に至らない量を目安として、適宜調節することができる。

　T細胞除去処置は、移植治療を行う際にレシピエントに施される前処置の一つとして通常行われる処置であればよく、抗T細胞抗体やステロイドの投与が挙げられる。抗T細胞抗体の例は、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD3抗体、抗TCR抗体及び抗胸腺細胞グロブリン（ATG）を包含し、これらの１種又は複数を組み合わせてレシピエントに投与することが好ましい。好ましい実施形態において、抗T細胞抗体は、抗CD4抗体及び抗CD8抗体の組み合わせであり、これらを同時に又は連続してレシピエントに静脈内投与又は腹腔内投与することが好ましい。投与量は、レシピエントの体内においてT細胞を除去するのに十分な量であればよい。

　レシピエントは、免疫寛容誘導用組成物又は免疫寛容誘導剤が投与される前に、放射線照射又はT細胞除去処置を受けることが好ましく、放射線照射とT細胞除去処置の両方を受けることがより好ましい。免疫寛容誘導用組成物又は免疫寛容誘導剤をこれらの免疫系抑制処置と組み合わせることで、ドナー由来移植物に対する免疫寛容をレシピエントにおいて効率的に誘導することができ、これによりレシピエントにおけるドナー由来移植物の生着率を向上させることができる。また、レシピエントへの免疫抑制薬の投与を回避する又は投与量を減らすことも可能になる。

　放射線照射及びT細胞除去処置は、移植実施前に免疫寛容を誘導することが望まれる場合は移植の直前までに、移植実施後に免疫寛容を誘導すること、すなわち遅延型免疫寛容（Delayed Tolerance Induction）の誘導が望まれる場合は寛容を誘導したい所望のタイミングで、１回又は複数回繰り返して行うことができる。また、放射線照射及びT細胞除去処置の順序に特に制限はないが、T細胞除去処置を放射線照射に先行して行うことが好ましい。

　本開示における、多能性幹細胞をLhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られるHSPCは、個体における免疫反応の制御が可能であることから、免疫寛容の誘導に加えて、血液キメラの形成のために、また血液キメラ形成により治療可能な疾患、例えば自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の治療又は予防のために用いることもできる。

　本開示は、多能性幹細胞をLhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られるHSPCの有効量を、免疫寛容が望まれる哺乳動物個体に投与することを含む、哺乳動物個体において免疫寛容を誘導する方法を提供する。本開示はまた、多能性幹細胞をLhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られるHSPCをレシピエントに投与すること、及びレシピエントにドナー由来細胞、組織又は臓器を移植することを含む、レシピエントにおけるドナー由来細胞、組織又は臓器の生着率を向上させる方法であって、多能性幹細胞がドナーに由来する、又はレシピエント及びドナーと同じ生物種であるがいずれとも異なる哺乳動物個体に由来する、前記方法を提供する。各用語の意義は、先に説明したとおりである。

　また、本開示は、免疫寛容誘導用の医薬組成物の製造のためのHSPCの使用を提供する。この場合、HSPCは、Lhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られるHSPCである。

　また、本開示は、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患の治療又は予防のためのHSPCの使用を提供する。この場合、HSPCは、多能性幹細胞を、Lhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下で造血幹・前駆細胞に分化させて製造したHSPCである。

　本開示はさらに、免疫抑制性細胞を増殖又は活性化させるための、HSPCの使用を提供する。この場合、HSPCは、多能性幹細胞を、Lhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下で造血幹・前駆細胞に分化させて製造したHSPCである。免疫抑制性細胞としては、制御性T細胞（regulatory T cell; Treg）、骨髄由来抑制細胞（myeloid derived suppressor cell; MDSC）等を挙げることができる。

　以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。

１．材料及び方法
（１）マウス
　C57BL/6J（B6、MHCハプロタイプ：b/b）、BALB/c（MHCハプロタイプ：d/d）、C3H/He（C3H、MHCハプロタイプ：k/k）、129X1/SvJ Jms Slc（129、MHCハプロタイプ：b/b）は、日本SLC株式会社より購入した。C3129F1（MHCハプロタイプ：k/b）マウスはC3H雌と129雄の交配によって得た。移植実験にはすべて雄マウスを用いた。また、本研究における動物実験は、「北海道大学動物実験に関する規定」に基づいて取り扱った（承認番号：17-0110）。なお、MHC遺伝子型の表記について、b/bはMHCハプロタイプbのホモ接合、d/dはMHCハプロタイプdのホモ接合、k/kはMHCハプロタイプkのホモ接合、k/bはMHCハプロタイプkとbのヘテロ接合であることを示す。

（２）細胞培養
　B6マウス由来iPS細胞は、成獣B6マウス耳介皮膚組織から常法に従って分離したマウス繊維芽細胞にOct4、Sox2、Klf4及びc-Mycの4因子をレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入することで新たに樹立した（Takahashi et al., Cell, 2006, Vol. 126, pp. 663-676. DOI 10.1016/j.cell.2006.07.024）。マウスHoxB4をコードするDNA（配列番号１）が導入されたB6由来iPS細胞であるactivated-HoxB4-Gata2-KI-GFP (AHGG)-iPS細胞（Izawa et al., Experimental Hematology, 2020, vol. 89, pp. 68-79）は、筑波大学医学医療系教授（東京大学医科学研究所　特任准教授）山崎聡先生から供与された。AHGG-iPS細胞は、HoxB4をエストロゲン受容体（ER）リガンド結合ドメインとの融合タンパク質とすることで、エストロゲンアナログである4-ヒドロキシタモキシフェン（4-hydroxytamoxifen、4-HT）によるHoxB4の可逆的な発現誘導を可能にした細胞である。なお、HoxB4-ERを含むレンチウイルスベクターの作製に用いたCSII-EF-MCSは理化学研究所バイオリソース研究センターより提供を受けたものである。

　iPS細胞は、培養液としてDMEM（WAKO）に20% StemSure WAKO、0.1 mM非必須アミノ酸（ナカライテスク）、100 U/ml ペニシリン（ナカライテスク）、100 μg/ml ストレプトマイシン（ナカライテスク）、55 μM 2-メルカプトエタノール（ナカライテスク）、組換えヒトLIF（in house）を添加したもの（以下、iPS細胞培地と呼ぶ）を用いて、37℃、5% CO₂ インキュベーター内で、MEFをフィーダー細胞として培養した。

　iPS細胞の継代は以下の通りに行った。iPS細胞培地で培養した培養液から培養上清を除去し、残存培養液をPBSで洗浄した後、トリプシン（0.5g/lトリプシン/0.53mmol/l-EDTA溶液、ナカライテスク）を1000 μl添加し、インキュベーター内に静置した。5分経過後、iPS細胞培地を5 ml添加し、トリプシンを中和した。培地を吹き付けて単細胞懸濁液化し、40 μmのフィルターを通じてチューブに回収し、1500 rpm、4℃、5分で遠心した。遠心後に上清を除去し、iPS細胞培地で再懸濁した。懸濁液の細胞濃度を計測し、必要な細胞数を新しいMEFの上に播き直し、再びiPS細胞培地を用いて培養した。

　OP9/N細胞は、中胚葉誘導培地（α-MEM（GIBCO）に20% ウシ胎仔血清（Nichirei）、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、55 μM 2-メルカプトエタノールを添加した培地）で37℃、5% CO₂ インキュベーター内で単層培養した。OP9/N細胞は、iPS細胞からHSPCを誘導する際のフィーダー細胞として使用した。

　PlatE細胞（Morita et al., Gene Therapy, 2000, Vol. 7, pp.1063-1066.）は、DMEM（WAKO）に10% ウシ胎仔血清、0.1 mM非必須アミノ酸、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、55 μM 2-メルカプトエタノールを添加したものを用いて37℃、5% CO₂ インキュベーターで培養した。PlatE細胞は、遺伝子導入用レトロウイルスのパッケージング細胞として使用した。

（３）Lhx2遺伝子導入用レトロウイルスの作製
　公益財団法人東京都医学総合研究所の北島博士から供与された、マウスLhx2をコードするDNA（配列番号３）を有するレトロウイルスベクターpMY-FLAG-Lhx2-IRES-EGFP（Kitajima et al., BLOOD, 2011, vol. 117, no. 1, pp. 3748-3758）及びEmpty plasmid（pMY-IRES-EGFP）を、トランスフェクション試薬TransIT-X2（登録商標）（Mirus）のプロトコールに従ってPlatE細胞株にトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後、培養上清を回収し、培養上清の体積の1/3量のPEG溶液を加えて混合し、4℃で一晩静置した。混合液を1500g、4℃、30分間遠心して上清を除去した後、再び1500g、4℃、5分間遠心し、残存している培養上清を除去した。ウイルスを含むペレットに2 mlの中胚葉誘導培地を加えて撹拌した懸濁液を、ウイルス液として使用した。なお、レトロウイルスベクター（pMY-IRES-EGFP）は東京大学医科学研究所北村俊雄教授よりご供与いただいた。

（４）フローサイトメトリー
　フローサイトメトリーはBD FACSCelesta（Becton dickinson）を、解析ソフトウェアはFlowjoソフトウェア（Tree Star）を用いて行い、Forward scatter、Side Scatter及び4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride（DAPI）の取り込みによって生細胞と死細胞を判別した。使用した蛍光色素結合モノクローナル抗体を表１に示す。コントロールとしては、アイソタイプ・コントロール抗体又はFluorescence minus one（FMO）を用いた。また、分化血液細胞マーカーであるCD4、CD8、B220、Gr-1及びTer119がいずれも陰性である細胞をLineageマーカー陰性（以下、Lineage^-又はLin^-と表す）細胞として扱った。

（５）統計解析
　統計学的解析は、特に断らない限り、JMP 16（SAS Institute Inc.）を用いて行った。本研究における有意水準は5%とし、p値が5%を下回る場合に統計学的に有意差ありと判断した。各図内には、p<0.05の場合にアスタリスク1つ (*) 、p<0.01の場合にアスタリスク2つ (**) を付与した。

実施例１　Lhx2遺伝子が導入されたiPS細胞由来HSPCの調製
　トリプシン処理によって単細胞懸濁液化したB6マウス由来iPS細胞を中胚葉誘導培地（α-MEM（GIBCO）に20% ウシ胎仔血清（Nichirei）、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、55 μM 2-メルカプトエタノールを添加した培地）10 mlに6×10⁵個含まれるように調整し、低接着性培養皿（アズワン）で5日間浮遊培養してEmbryoid Body（EB）を誘導した。誘導3日目に、PBSを吹き付けて培養皿上の細胞を回収し、1500rpm、4℃、5分間遠心して上清を除去した後に、新鮮な中胚葉誘導培地10 mlで新しい培養皿に播き直してさらに2日間浮遊培養した。

　EBを回収し、1500 rpm、4℃、5分間遠心した。遠心後、上清を除去し、トリプシンで5分間処理してピペッティングによって単細胞懸濁液化した。中胚葉誘導培地で中和処理を施し、70 μmフィルターを通してEBを回収した。回収したEBをPE-抗mFlk1抗体で染色し、BD FACSAriaII（Becton dickinson）を用いてFlk1陽性細胞を分取し、その後の分化誘導に用いた。Flk1陽性EB 3×10⁵個を、レトロウイルスベクター（pMY-FLAG-Lhx2-IRES-EGFP又はpMY-IRES-EGFP）を含む2 mlの中胚葉誘導培地に懸濁し、100 ng/ml マウスSCF（Biolegend）、10 ng/ml マウスIL-6、及び8 μg/ml Polybraneを添加し、24-wellプレートに播種して1100×g、33℃、2時間遠心することによってレトロウイルスを感染させた。

　レトロウイルスを感染させた細胞を、事前にOP9/N細胞を播いた6-wellプレートの1 wellにウイルスを含む培養液ごと播種して一晩インキュベーターに静置した。インキュベーション後、培養液を100 ng/ml マウスSCF及び10 ng/ml マウスIL-6を含む新鮮な中胚葉誘導培地に交換して、12日間の浮遊培養を行った。この培養の際、4-5日に１回の頻度で以下の通りに継代を行った。浮遊細胞をチューブに回収し、PBSで培養皿を洗浄し、洗浄に用いたPBSもチューブに回収した。トリプシン 1000 μlを加えてインキュベーターに静置し、5分経過後にピペッティングにより細胞間接着を壊し、OP9/N細胞ごとチューブに回収した。1500 rpm、4℃、5分間で遠心した後、上清を除去し、中胚葉誘導培地を添加し、OP9/N細胞を除去するために培養皿（日本ジェネティクス）に播種した。20分経過後、顕微鏡を用いてOP9/N細胞が培養皿に接着していることを確認し、70 μmフィルターを通して、浮遊細胞を回収し、1500rpm、4℃、5分間遠心した。上清を除去し、100 ng/ml マウスSCF及び10 ng/ml マウスIL-6を含む新鮮な中胚葉誘導培地で再懸濁し、事前に播種したOP9/N細胞上に継代した。

　レトロウイルス感染から12日間の浮遊培養によって、Lhx2遺伝子が導入されたiPS細胞由来のHSPC（以下、Lhx2⁺-iHSPCと呼ぶ）を調製した。中胚葉誘導培地でのiPS細胞の培養開始をDay 0として、レトロウイルス感染（Day 5）から培養終了（Day 17）までの間、経時的に細胞を回収し、総細胞数をカウントした（図１）。レトロウイルス感染（Day 5）後、細胞数は一旦低下するものの、その後増加していた。

　Day 17の細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、50％以上の細胞がCD45^＋Lineage^-であった（図２中央のドットプロットの四角枠内）。このことは、Day 17の細胞の半数以上が未成熟の造血系細胞であることを示している。また、CD45^＋Lineage^-の細胞集団には13.1％のSca-1⁺c-Kit⁺細胞が含まれており（図２右側のドットプロットの右側の四角枠内）、Day 17の細胞全体に占めるCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合は約7.5％であった（図３）。

実施例２　Lhx2 ⁺ -iHSPCの造血能解析
（１）シンジェニックレシピエントへの移植
　移入細胞として実施例１で調製したLhx2⁺-iHSPCを、レシピエントとしてB6マウス（n＝3）を、造血補助用骨髄細胞としてB6マウスの大腿骨及び脛骨から採取した骨髄細胞を用いた。Lhx2⁺-iHSPC投与当日にレシピエントマウスに9 Gyの全身放射線照射を行い、2.5×10⁶個のLhx2⁺-iHSPC及び2.0×10⁶個の造血補助用骨髄細胞を200 μl 生理食塩水に懸濁して尾静脈より投与した。Lhx2⁺-iHSPC移入から3、6、9週目の末梢血より末梢血単核細胞を調製し、GFP陽性血液細胞（Lhx2⁺-iHSPC由来血液細胞）の割合をフローサイトメトリーにより解析した。

　マウス3個体中2個体において、Lhx2⁺-iHSPC移入から9週後であってもドナー細胞に由来する血液細胞が検出された（図４）。代表的な結果として、2個体のレシピエントマウス末梢血単核細胞のドットプロットを図５に示す。#1のマウスではドナー由来のCD45陽性細胞（白血球）、CD3ε陽性細胞（T細胞）、CD19陽性細胞（B細胞）、CD11b陽性細胞（骨髄細胞）のいずれも検出されたが、#2のマウスではこれらの細胞はほとんど又は全く検出されなかった。以上から、Lhx2⁺-iHSPCが移入されたシンジェニック（同種同系）レシピエントマウスにおいて血液キメラの形成が確認された。

（２）アロジェニック（同種異系）レシピエントへの移植
　移入細胞として実施例１で調製したLhx2⁺-iHSPCを、レシピエントとしてC3129F1マウス（n＝5）を用いた。Lhx2⁺-iHSPC投与前処置として、レシピエントマウス体内からCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞を除去するため、iHSPC投与の6日前と1日前に、十分な量のCD4除去抗体（GK1.5）とCD8α除去抗体（53-6.7）を腹腔内投与した。iHSPC投与当日にレシピエントマウスに3 Gyの全身放射線照射を行った後、5.0×10⁶個のLhx2⁺-iHSPCを200 μl 生理食塩水に懸濁して尾静脈より投与した。Lhx2⁺-iHSPC移入から2、4、6週目の末梢血より末梢血単核細胞を調製し、GFP陽性血液細胞（Lhx2⁺-iHSPC由来血液細胞）の割合をフローサイトメトリーにより解析した。

　マウス5個体中3個体において、Lhx2⁺-iHSPC移入から6週後であってもドナー細胞に由来する血液細胞が検出された（図６）。代表的な結果として、Lhx2⁺-iHSPC移入から2週目及び6週目の2個体のレシピエントマウス末梢血単核細胞のドットプロットを図７に示す。#1のマウスではドナー由来のCD45陽性細胞（白血球）、CD3ε陽性細胞（T細胞）、CD19陽性細胞（B細胞）、CD11b陽性細胞（骨髄細胞）のいずれも検出されたが、#2のマウスではこれらの細胞は少量しか検出されなかった。以上から、Lhx2⁺-iHSPCが移入されたアロジェニックレシピエントマウスにおいて血液キメラの形成が確認された。

実施例３　Lhx2 ⁺ -iHSPCによる移植免疫寛容誘導
　実施例２（２）でLhx2⁺-iHSPCの移入から7日経過したC3129F1マウス、及びコントロールとしてLhx2⁺-iHSPCの代わりに生理食塩水を投与したこと以外は同じ処置を施したC3129F1マウスを、皮膚移植のレシピエントとして用いた。十分に麻酔したレシピエントマウスの背部皮膚を円形状に切除して移植床を形成し、ドナーであるB6マウス、BALB/cマウス及びC3129F1マウスの耳介皮膚片を移植した。皮膚移植から7日間、移植皮膚片を保護した後に、移植皮膚片のサイズを経時的に計測した。移植当日の移植皮膚片のサイズ（長径の長さ）の30%未満に移植皮膚片が退縮した時点を拒絶日とし、移植日から拒絶日までの期間を移植皮膚片の生着期間とした。

　移植皮膚片の生着期間を図８に示す。レシピエントのC3129F1マウスに対して自家移植となるC3129F1マウスからの移植皮膚片は、Lhx2⁺-iHSPCの移入の有無にかかわらず完全に生着した。また、MHCハプロタイプがレシピエントと不一致であるBALB/cマウスからの移植皮膚片は、Lhx2⁺-iHSPCの移入の有無にかかわらず、移植後30日前後で完全に退縮した。これらに対し、MHCハプロタイプがレシピエントと完全一致であり、iPS細胞の由来と同一系統であるB6マウスからの移植皮膚片は、生理食塩水投与群では移植後40日で完全に退縮したが、Lhx2⁺-iHSPCが移入された群では移植後40日で75％程度が生着していた。

　B6マウスからの皮膚片を移植したC3129F1マウスの個体ごとの移植皮膚片のサイズの変化を図９左側に示す。Lhx2⁺-iHSPCが移入された群では移植後30日までは移植皮膚片のサイズはおおむね維持されていたが、30日を経過すると一部の個体で移植皮膚片の退縮が認められた。移植後30日を過ぎても移植皮膚片のサイズが変わらなかった個体と、移植後30日経過後に移植皮膚片の退縮が認められた個体について、末梢血単核細胞に含まれるGFP陽性細胞をフローサイトメトリーで解析した。移植皮膚片のサイズが変わらなかった個体（図９中央上段）ではCD45陽性細胞が検出されたが、移植皮膚片の退縮が認められた個体（図９中央下段）ではCD45陽性細胞は検出されず、血液キメラが消失していた。

　レシピエントをC3129F1マウス、ドナーをB6マウスとした移植は、MHC適合性があるにもかかわらず、マイナー抗原の不一致により、MHC適合性のない移植と同程度の早さで移植片が拒絶されることが報告されている（Murata, et al., Scientific Reports, 2020, Vol.10, 13560, https://doi.org/10.1038/s41598-020-69784-4）。Lhx2⁺-iHSPCは、このようなマイナー抗原不一致による拒絶反応を生じるアロジェニック移植においても、免疫寛容を誘導可能であることが確認され、また、その免疫寛容の誘導には血液キメラ形成が重要であることが示唆された。

実施例４　Lhx2遺伝子及びHoxB4遺伝子が導入されたiPS細胞由来HSPCの調製
　AHGG-iPS細胞を用いて、Flk1陽性細胞の分取を行わないこと以外は実施例１と同様にしてEBを調製し、レトロウイルスベクターによってEBにLhx2遺伝子を導入した。なお、レトロウイルス感染以降の培養に使用される中胚葉誘導培地には、実施例１で使用されていた100 ng/ml マウスSCF及び10 ng/ml マウスIL-6に代えて、10 ng/ml マウスTPO（Biolegend）及び25 ng/ml マウスSCF（Biolegend）を添加し、さらにHoxB4の発現を誘導する場合（aHoxB4^on）には600 nMの(Z)-4-Hydroxytamoxifen（4-HT）（Sigma）を、HoxB4の発現を誘導しない場合（aHoxB4^off）には溶媒の99.5％ EtOHを添加した。

　レトロウイルス感染から15日間の浮遊培養によって、HoxB4の発現が誘導され、Lhx2遺伝子が導入されたiPS細胞由来のHSPC（以下、aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC、又は単にaHoxB4^on -Lhx2⁺と呼ぶ）、HoxB4の発現が誘導され、Lhx2遺伝子を有さないiPS細胞由来のHSPC（以下、aHoxB4^on -Lhx2^--iHSPC、又は単にaHoxB4^on -Lhx2^-と呼ぶ）、HoxB4の発現が誘導されておらず、Lhx2遺伝子が導入されたiPS細胞由来のHSPC（以下、aHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPC、又は単にaHoxB4^off -Lhx2⁺と呼ぶ）、及びHoxB4の発現が誘導されておらず、Lhx2遺伝子を有さないiPS細胞由来のHSPC（以下、aHoxB4^off -Lhx2^--iHSPC、又は単にaHoxB4^off -Lhx2^-と呼ぶ）の4種類の細胞を調製した。

　中胚葉誘導培地でのiPS細胞の培養開始をDay 0として、レトロウイルス感染（Day 5）から培養終了（Day 20）までの間、経時的に細胞を回収し、総細胞数をカウントした（図１０）。Lhx2遺伝子の導入により、細胞増殖の著しい増強が認められた。

　Day 20の細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、Lhx2遺伝子の導入によって、Day 20の細胞全体に占めるCD45^＋Lineage^-細胞の割合が増加していた（図１２左側）。CD45^＋Lineage^-でゲーティングして解析したところ、Lhx2遺伝子の導入によってCD45^＋c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合は減少したが（図１１上段、図１２中央）、造血幹細胞に相当するCD45^＋CD150^＋CD34^-c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-細胞の割合は顕著に増加していた（図１１下段、図１２右側）。

実施例５　aHoxB4 ^on -Lhx2 ⁺ -iHSPCの造血能解析
（１）シンジェニックレシピエントへの一次移植
　移入細胞として実施例４で調製したaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC及びaHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPCを、一次レシピエントとしてB6マウス（各群n＝5）を、造血補助用骨髄細胞としてB6マウスの大腿骨及び脛骨から採取した骨髄細胞を用いた。iHSPC投与当日にレシピエントマウスに9 Gyの全身放射線照射を行い、2.5×10⁶個のaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC又はaHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPC、及び1.0×10⁶個の造血補助用骨髄細胞を200 μl 生理食塩水に懸濁して尾静脈より投与した。iHSPC移入から3、6、9、12、15、18、20週目の末梢血より末梢血単核細胞を調製し、GFP陽性血液細胞（aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC又はaHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPC由来血液細胞）の割合をフローサイトメトリーにより解析した。

　aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCを移入した群では、aHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPCを移入した群と比べて、より多くのGFP陽性血液細胞（CD45陽性細胞（白血球）、CD3ε陽性細胞（T細胞）、CD19陽性細胞（B細胞）及びCD11b陽性細胞（骨髄細胞））が検出された（図１３）。以上から、aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCは、より優れた造血能によって、シンジェニックレシピエントマウスにおいてより高いドナー血液細胞の置換率で血液キメラを形成することが確認された。

（２）シンジェニックレシピエントへの二次移植
　（１）の一次レシピエントのうち、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを移入した2個体およびaHoxB4^off-Lhx2⁺-iHSPCを移入した2個体の大腿骨および脛骨から骨髄細胞を回収した。それぞれの一次レシピエントに由来する1.0×10⁷個の骨髄細胞を200 μlの生理食塩水に懸濁し、細胞投与日に全身放射線照射処理（9 Gy）を施したB6二次移植レシピエントマウス3個体ずつに尾静脈より投与した。二次移植から3、6、9、12週目の末梢血中のGFP陽性のiHSPC由来血液細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した。

　aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCの二次レシピエント及びaHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPCの二次レシピエントのいずれからも、GFP陽性血液細胞が検出された（図１４）。この結果は、一次レシピエントの骨髄細胞に含まれるaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC及びaHoxB4^off -Lhx2⁺-iHSPCが造血能を有し、幹細胞性（stemness）を維持していることを示す。

（３）アロジェニックレシピエントへの移入
　移入細胞として実施例１で調製したLhx2⁺-iHSPC及び実施例４で調製したaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCを、レシピエントとしてC3129F1マウス（各群n＝5）を用いた。iHSPC投与前処置として、レシピエントマウス体内からCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞を除去するため、iHSPC投与の6日前と1日前に、十分な量のCD4除去抗体（GK1.5）とCD8α除去抗体（53-6.7）を腹腔内投与した。iHSPC投与当日にレシピエントマウスに3 Gyまたは4 Gyの全身放射線照射を行った後、5.0×10⁶個のLhx2⁺-iHSPC又はaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを200 μl 生理食塩水に懸濁して尾静脈より投与した。iHSPC移入から2、4、6、8、12、14、16週目の末梢血より末梢血単核細胞を調製し、GFP陽性血液細胞（Lhx2⁺-iHSPC又はaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC由来血液細胞）の割合をフローサイトメトリーにより解析した。

　Lhx2⁺-iHSPCを移入した群、aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCを移入した群のいずれにおいてもGFP陽性血液細胞（CD45陽性細胞（白血球）、CD3ε陽性細胞（T細胞）、CD19陽性細胞（B細胞）及びCD11b陽性細胞（骨髄細胞））は検出されたが、検出された細胞数は、移入から4週目以降、aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC移入群のほうが多かった（図１５）。以上から、Lhx2⁺-iHSPC 及びaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCはいずれもアロジェニックレシピエントマウスにおいて血液キメラを形成すること、またaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCはLhx2⁺-iHSPCより優れた造血能を有することが確認された。

実施例６　aHoxB4 ^on -Lhx2 ⁺ -iHSPCによる移植免疫寛容誘導
　実施例５（３）でiHSPCの移入から7日経過したaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPC移入C3129F1マウス及びLhx2⁺-iHSPC移入C3129F1マウス、移入細胞としてaHoxB4^on -Lhx2^--iHSPCを用いて同様に作製したaHoxB4^on-iHSPC移入C3129F1マウス、並びにコントロールとして生理食塩水を投与したこと以外は同じ処置を施したC3129F1マウスを、皮膚移植のレシピエントとして用いた。十分に麻酔したレシピエントマウスの背部皮膚を円形状に切除して移植床を形成し、ドナーであるB6マウス、BALB/cマウス及びC3129F1マウスの耳介皮膚片を移植した。皮膚移植から7日間、移植皮膚片を保護した後に、移植皮膚片のサイズを経時的に計測した。移植当日の移植皮膚片のサイズ（長径の長さ）の30%未満に移植皮膚片が退縮した時点を拒絶日とし、移植日から拒絶日までの期間を移植皮膚片の生着期間とした。

　移植皮膚片の生着期間を図１６に示す。レシピエントのC3129F1マウスに対して自家移植となるC3129F1マウスからの移植皮膚片は、各種iHSPCの移入の有無または放射線照射量にかかわらず完全に生着した。また、MHCハプロタイプがレシピエントと不一致であるBALB/cマウスからの移植皮膚片は、どの実験群においても移植後30日前後までに完全に退縮した。これらに対し、MHCハプロタイプがレシピエントと完全一致であり、iPS細胞の由来と同一系統であるB6マウスからの移植皮膚片は、aHoxB4^on-iHSPCを移入した群および生理食塩水投与群では移植後40日程度で完全に退縮したが、Lhx2⁺-iHSPCが移入された群では移植後100日で60％が生着した。一方で、aHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCを移入した群では、放射線照射量が3 Gyの群および4 Gyの群の両群で皮膚移植後100日目に80%の個体でB6マウス由来皮膚片が生着していた。以上から、Lhx2⁺-iHSPC及びaHoxB4^on -Lhx2⁺-iHSPCは、マイナー抗原不一致による拒絶反応を生じるアロジェニック移植においても免疫寛容を誘導可能であることが確認された。

実施例７　aHoxB4 ^on -Lhx2 ⁺ -iHSPCサブセットの造血能解析
　実施例４で調製したaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCから、BD FACSAria（商標） II（ベクトン・ディッキンソン）を用いて、c-Kit⁺Sca-1^-Lineage^-（KL）細胞、c-Kit⁺Sca-1⁺Lineage^-（KSL）細胞の２種類のiHSPCサブセットを分取し、移入細胞として用いた。造血補助用骨髄細胞としてB6マウスの大腿骨及び脛骨から採取した骨髄細胞を用いた。レシピエントとしてB6マウス（各群n=5-6）を用いて、細胞投与当日に9 Gyの全身放射線照射を行い、1.0×10⁵個のKL細胞又はKSL細胞、及び1×10⁶個の造血補助用骨髄細胞を200 μlの生理食塩水に懸濁して尾静脈より投与した。細胞移入から3、6、9、12週目の末梢血より末梢血単核細胞を調製し、GFP陽性血液細胞（aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC由来血液細胞）の割合をフローサイトメトリーにより解析した。

　KSL細胞を移入した群では、KL細胞を移入した群と比べて、より多くのGFP陽性血液細胞（CD45陽性細胞（白血球）、CD3ε陽性細胞（T細胞）、CD19陽性細胞（B細胞）及びCD11b陽性細胞（骨髄系細胞））が検出される傾向があった（図１７）。以上から、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCの中でKSL細胞中に長期的な造血能を有する細胞が含まれることが確認された。

実施例８　aHoxB4 ^on -Lhx2 ⁺ -iHSPCによる移植免疫寛容誘導（MHC適合性のない移植）
（１）iHSPCの単独移入
　移入細胞として実施例４で調製したaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを、レシピエントとしてC3Hマウス（各群n＝4-6）を用いた。iHSPC投与前処置として、レシピエントマウス体内からCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞を除去するため、iHSPC投与の6日前と1日前に、十分な量のCD4除去抗体（GK1.5）とCD8α除去抗体（53-6.7）を腹腔内投与した。iHSPC投与当日にレシピエントマウスに3 Gyの全身放射線照射を行った後、1.0×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC/200 μl 生理食塩水を、又はコントロールとして200 μl 生理食塩水を尾静脈より投与した。

　iHSPC又は生理食塩水投与の7日後、十分に麻酔したレシピエントマウスの背部皮膚を円形状に切除して移植床を形成し、ドナーであるB6マウス、BALB/cマウス及びC3Hマウスの耳介皮膚片を移植した。皮膚移植から7日間、移植皮膚片を保護した後に、移植皮膚片のサイズを経時的に計測した。移植当日の移植皮膚片のサイズ（長径の長さ）の30%未満に移植皮膚片が退縮した時点を拒絶日とし、移植日から拒絶日までの期間を移植皮膚片の生着期間とした。

　移植皮膚片の生着期間を図１８に示す。レシピエントのC3Hマウスに対して自家移植となるC3Hマウスからの移植皮膚片は、全個体で生着した。また、第三者であるBALB/cマウスからの移植皮膚片は、両群において移植後20日前後までに拒絶された。MHCハプロタイプがレシピエントと不一致であり、iPS細胞の由来と同一系統であるB6マウスからの移植皮膚片は、生理食塩水投与群で移植後30日程度までに拒絶されたが、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入群において、生着期間の若干の延長が認められた。

（２）iHSPC移入と共刺激遮断薬との併用
　移入細胞として実施例４で調製したaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを、レシピエントとしてC3Hマウス（各群n＝8-11）を用いた。iHSPC投与前処置として、レシピエントマウス体内からCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞を除去するため、iHSPC投与の6日前と1日前に、十分な量のCD4除去抗体（GK1.5）とCD8α除去抗体（53-6.7）を腹腔内投与した。iHSPC投与当日にレシピエントマウスに3 Gyの全身放射線照射を行った後、1.0×10⁷個または3.0×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC/200 μl 生理食塩水を、又はコントロールとして200 μl 生理食塩水を尾静脈より投与した。加えて、共刺激遮断薬（CB）として、iHSPC投与と同日に生理食塩水で希釈した抗CD154抗体（InVivoMAb anti-mouse CD40L (CD154)、BioxCell）500 μgを腹腔内に投与し、さらに2日後および9日後に生理食塩水で希釈したCTLA4-Ig（オレンシア（登録商標）点滴静注用、ブリストル・マイヤーズスクイブ）500 μgを腹腔内に投与した。

　iHSPC又は生理食塩水投与の7日後、上記（１）と同様にして、レシピエントマウスにB6マウス、BALB/cマウス及びC3Hマウスの耳介皮膚片を移植し、生着を観察した。移植皮膚片の生着期間を図１９に示す。レシピエントのC3Hマウスに対して自家移植となるC3Hマウスからの移植皮膚片は、全個体で生着した。また、第三者であるBALB/cマウスからの移植皮膚片は、全群において移植後20日前後までに拒絶された。MHCハプロタイプがレシピエントと不一致であり、iPS細胞の由来と同一系統であるB6マウスからの移植皮膚片は、CBを併用した生理食塩水投与群では移植後20日程度で全個体で拒絶された。一方で、CBを併用した1×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入群では、8個体中1個体で移植片が100日以上生着した。また、CBを併用した3×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入群では、11個体中4個体で100日以上生着し、移植片生着率は他の2群と比較して有意に向上した。このように、CBを併用することで、MHC適合性のない移植においてもaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを用いた免疫寛容の誘導が可能であり、またiHSPCの投与量を増加することで免疫寛容の誘導効率が向上することが確認された。

実施例９　aHoxB4 ^on -Lhx2 ⁺ -iHSPCの造血能解析（MHC適合性のない移植）
　実施例８（２）と同様にして、CB併用下で3×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを移入したC3Hマウスを作製した。iHSPC移入後2、4、6、8、12、16週目に末梢血を採取し、フローサイトメトリーにより末梢血単核細胞中のGFP陽性血液細胞（aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC由来血液細胞）の割合を解析した（8週目まではn=11、以降はn=6）。iHSPC移入から16週目まで、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入マウスの末梢血中にGFP陽性血液細胞が存在しており、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCはMHC適合性のない移植のレシピエントにおいても血液キメラを形成可能であることが確認された（図２０）。

　また、実施例８（２）と同様にして、CB併用下で3×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを移入したC3Hマウス、及びaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCの代わりにコントロールとして生理食塩水を投与したこと以外は同じ処置を施したC3Hマウスを作製した。iHSPC投与日の全身放射線照射前の値を基準（100）とした体重の変化を図２１に示す。iHSPC投与群と生理食塩水投与群間で体重に有意な差は認められず、iHSPC投与が体重低下を引き起こさないことが示された。

実施例１０　aHoxB4 ^on -Lhx2 ⁺ -iHSPCによる免疫寛容誘導メカニズムに関する解析
　移入細胞として実施例４で調製したaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを、レシピエントとしてC3129F1マウスを用いた。iHSPC投与前処置として、レシピエントマウス体内からCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞を除去するため、iHSPC投与の6日前と1日前に、十分な量のCD4除去抗体（GK1.5）とCD8α除去抗体（53-6.7）を腹腔内に投与した。iHSPC投与当日にレシピエントマウスに4 Gyの全身放射線照射を行った後、1.0×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを200 μl 生理食塩水に懸濁して尾静脈より投与した。iHSPC移入から8週後に採取した末梢血より末梢血単核細胞を調製し、フローサイトメトリーにより解析した。aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCの代わりにコントロールとして生理食塩水を投与したこと以外は同じ処置を施したC3129F1マウス、及び未処置のC3129F1マウス（ナイーブマウス）の末梢血単核細胞についても同様に解析した。

　aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入マウス（n=6）の末梢血中の、CD11b⁺Gr-1⁺細胞（MDSC）、及びさらにGr-1の蛍光強度で分画した2つのMDSCサブセットCD11b⁺Gr-1^high、CD11b⁺Gr-1^lowにおけるGFP陽性細胞の割合を図２２に示す。aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを移入したマウスの末梢血中にはGFP陽性のMDSCが存在しており、CD11b⁺Gr-1^lowサブセットに高い割合でGFP陽性細胞が存在していたことが確認された。

　ナイーブマウス（n=5）、生理食塩水投与マウス（n=4）、及びaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入マウス（n=5）の末梢血中の、2つのMDSCサブセットにおけるPD-L1陽性細胞の割合を図２３に示す。HoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入マウスの末梢血において、PD-L1陽性細胞の割合は、GFP陽性MDSCにおいてGFP陰性MDSCよりも有意に高いことが認められた。さらに、PD-L1のMFI（平均蛍光強度）はGFP陽性のCD11b⁺Gr-1^lowサブセットで選択的に上昇していた（図２４）。

　また、iHSPC移入から16週後、各マウスから脾臓を摘出し、常法に従って脾臓細胞懸濁液を調製してフローサイトメトリーにより解析した。ナイーブマウス、生理食塩水投与マウス、及びaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入マウスの脾臓中のCD4⁺ T細胞におけるFoxp3⁺細胞（Treg）の割合を図２５に示す。HoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC移入マウスでは、ナイーブマウスと比較して、脾臓におけるTregの割合が増加していることが明らかになった。以上からHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを用いた免疫寛容誘導メカニズムとしてTregおよびHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC由来MDSCが寄与した可能性が示唆された。

実施例１１　ルシフェラーゼ発現iPS細胞の移植実験
　移入細胞として実施例４で調製したaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCを、レシピエントとしてC3129F1マウスを用いた。iHSPC投与前処置として、レシピエントマウス体内からCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞を除去するため、iHSPC投与の6日前と1日前に、十分な量のCD4除去抗体（GK1.5）とCD8α除去抗体（53-6.7）を腹腔内に投与した。iHSPC投与当日にレシピエントマウスに4 Gyの全身放射線照射を行った後、1.0×10⁷個のaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC/200 μl 生理食塩水を、又はコントロールとして200 μl 生理食塩水を尾静脈より投与した。

　iHSPC又は生理食塩水投与から5週間後、十分に麻酔したレシピエントマウスに対して、B6由来ルシフェラーゼ発現iPS細胞 5×10⁵個をマトリゲル20 μl に懸濁して皮下に移植した（n=4-5）。iPS細胞の移植から7、14、21日経過後にD-ルシフェリンを腹腔内に投与し、Spectrum-FL-TKHD（キャリパーライフサイエンス）を用いて、シグナルを解析した。なお、B6由来ルシフェラーゼ発現iPS細胞は、Kamatani, T. et al.（Inflammation and Regeneration, (2022) 42:4. https://doi.org/10.1186/s41232-021-00190-7）に記載される、B6胎児線維芽細胞由来iPS細胞にレンチウイルスベクター（pHIV-Luc-ZsGreen (Addgene)）を用いてルシフェラーゼ遺伝子を導入して作製した細胞である。

　D-ルシフェリン投与後のマウスのiPS細胞移植部の発光を示す画像を図２６Ａに、発光シグナル強度（total flux）の変化を図２６Ｂに示す。生理食塩水投与群では、移植後21日目に4個体中3個体でシグナルが検出下限を下回った。これに対してB6由来aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC投与群では5個体中4個体でシグナルが検出された。ルシフェラーゼ発現iPS細胞の移植後21日目に検出されたシグナルは、生理食塩水投与群と比較してaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC投与群において有意に高い値であった。

　また、iPS細胞移植から21日後、形成されたテラトーマを採取した。採取されたテラトーマの画像を図２７Ａに、テラトーマの重量を図２７Ｂに示す。生理食塩水投与群においては4個体中1個体でテラトーマ形成が認められなかったが、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC投与群では全個体でテラトーマが認められ、テラトーマ重量はaHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPC投与群の方が有意に高い値であった。

　以上のように、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCの投与によりドナー由来iPS細胞の生着が促進されたことから、aHoxB4^on-Lhx2⁺-iHSPCによる免疫寛容誘導は、皮膚移植以外にも、特にiPS細胞由来の移植片に対しても有効である可能性が示唆された。

　また、上の実施例において示されるように、多能性幹細胞をLhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られるHSPCは、マウスにおけるマイナー抗原不一致による拒絶反応を生じる同種異系移植、MHC不一致による拒絶反応を生じる同種異系移植のいずれにおいても免疫寛容を誘導可能であることから、他の哺乳動物（ヒトを含む）においても、多能性幹細胞から誘導されるHSPCは免疫寛容を誘導することができると期待される。

　さらに、多能性幹細胞をLhx2の強制発現下あるいはLhx2及びHoxB4の強制発現下、HSPC分化誘導条件下で培養することにより得られるHSPCは、免疫寛容の誘導によって、免疫抑制剤の使用量を低減することが可能であり、また、免疫抑制剤の不使用下で同種他家由来の生体物（細胞、組織、臓器）を効果的に維持することが期待される。

Claims

　Lhx2遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来の造血幹・前駆細胞を含有する、免疫寛容誘導用組成物。
　造血幹・前駆細胞において、さらにHoxB4遺伝子が強制発現されている、請求項１に記載の組成物。
　多能性幹細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、請求項１又は２に記載の組成物。
　主要組織適合性抗原適合性のある同種異系移植において、又は主要組織適合性抗原適合性のない同種異系移植において、免疫寛容を誘導するためにレシピエントに対して用いられる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
　多能性幹細胞が有する主要組織適合性抗原のハプロタイプと、同種異系移植のドナーが有する主要組織適合性抗原のハプロタイプとが完全に一致する、請求項４に記載の組成物。
　多能性幹細胞が、ドナー由来である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
　多能性幹細胞を、Lhx2の強制発現下で造血幹・前駆細胞に分化させることを含む、免疫寛容誘導用組成物を製造する方法。
　多能性幹細胞の造血幹・前駆細胞への分化が、多能性幹細胞から胚様体を形成させた後、造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下で培養することによって行われる、請求項７に記載の方法。
　中胚葉細胞への分化が可能な条件下で多能性幹細胞を培養することを含む、請求項７又は８に記載の方法。
　多能性幹細胞に胚様体を形成させた後、Lhx2を強制的に発現させて造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下で培養する、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
　造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下での培養が、幹細胞因子及びIL-6存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
　多能性幹細胞を、Lhx2及びHoxB4の強制発現下で造血幹・前駆細胞に分化させる、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
　多能性幹細胞に胚様体を形成させた後、Lhx2及びHoxB4を強制的に発現させて造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下で培養する、請求項１２に記載の方法。
　造血幹・前駆細胞への分化誘導条件下での培養が、幹細胞因子及びトロンボポエチン存在下で培養することを含む、請求項１３に記載の方法。
　多能性幹細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、請求項７～１４のいずれか一項に記載の方法。
　組成物が、主要組織適合性抗原適合性のある同種異系移植、又は主要組織適合性抗原適合性のない同種異系移植において、免疫寛容を誘導するためにレシピエントに対して用いられる、請求項７～１５のいずれか一項に記載の方法。
　多能性幹細胞が有する主要組織適合性抗原のハプロタイプと、同種異系移植のドナーが有する主要組織適合性抗原のハプロタイプとが完全に一致する、請求項１６に記載の方法。
　多能性幹細胞が、ドナー由来である、請求項７～１７のいずれか一項に記載の方法。
　Lhx2遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来の造血幹・前駆細胞の有効量を、免疫寛容が望まれる哺乳動物個体に投与することを含む、哺乳動物個体において免疫寛容を誘導する方法。
　造血幹・前駆細胞において、さらにHoxB4遺伝子が強制発現されている、請求項１９に記載の方法。
　哺乳動物個体が、主要組織適合性抗原適合性のある同種異系移植における、又は主要組織適合性抗原適合性のない同種異系移植における、レシピエントである、請求項１９又は２０に記載の方法。
　Lhx2遺伝子が強制発現された、多能性幹細胞由来の造血幹・前駆細胞の有効量を、レシピエントに投与すること、及びレシピエントにドナー由来細胞、組織又は臓器を移植することを含む、レシピエントにおけるドナー由来細胞、組織又は臓器の生着率を向上させる方法。
　造血幹・前駆細胞において、さらにHoxB4遺伝子が強制発現されている、請求項２２に記載の方法。
　移植が、主要組織適合性抗原適合性のある移植、又は主要組織適合性抗原適合性のない移植である、請求項２２又は２３に記載の方法。
　多能性幹細胞が有する主要組織適合性抗原のハプロタイプと、ドナーの主要組織適合性抗原のハプロタイプとが完全に一致する、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。