DE60026166T2

DE60026166T2 - Vetozellen die wirksam in der prävention von transplantatabstossung sind und kein graft-versus-host potential aufweisen

Info

Publication number: DE60026166T2
Application number: DE60026166T
Authority: DE
Inventors: Yair Reisner; Massimo Martelli
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2000-01-05
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2020-12-29
Also published as: EP1244803B1; US20030003083A1; HK1046928B; US20030049235A1; WO2001049243A3; US6544506B2; IL150440A0; AU2023101A; DE60026166D1; ATE318320T1; HK1046928A1; CA2396222A1; EP1244803A4; AU783429B2; WO2001049243A2; US20070264274A1; US7270810B2; EP1244803A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Dosis gemäß Anspruch 1, die Anwendung einer Dosis gemäß Ansprüchen 2 und 27, ein Verfahren gemäß Anspruch 55, ein Zellpräparat gemäß Ansprüchen 73 und 83.
Die vorliegende Erfindung betrifft Vetozellpräparate, Verfahren zu deren Herstellung und ein dieselben anwendendes Transplantationsverfahren, die zur Verhinderung oder Abmilderung von Immunabstoßung durch Spenderorgane, -Zellen oder -Gewebe verwendet werden können, ohne eine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion (Graft versus host disease, GVHD) auszulösen. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellpräparat zur Anwendung bei der Transplantation, welches Präparat Zellen enthält, die als Vetozellen funktionieren, welche jedoch im Wesentlichen frei von alloreaktiven Zellen sind.
Transplantation von allogenen und xenogenen Organen, Gewebe und Zellen wird allgemein bei Menschen vorgenommen, um zahlreiche Störungen und Krankheiten zu mildern.
Beispielsweise wird Knochenmarktransplantation in steigendem Maß verwendet, um eine Reihe schwerer Erkrankungen bei Menschen zu behandeln, wie beispielsweise Leukämie. Knochenmarktransplantation wird jedoch durch die Verfügbarkeit geeigneter Spender begrenzt, da transplantierte Gewebe größere Histokompatibilitätsbarrieren durchqueren müssen, die ansonsten zu Transplantatabstoßung führen können.
Angesichts solcher Beschränkungen sind mehrere Herangehensweisen zur Verbesserung der Transplantatakzeptanz vorgeschlagen worden.
In einer Herangehensweise wurden Krebspatienten, die autologe Knochenmarktransplantation empfingen, mit Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF) behandelt, was zur Mobilisierung pluripotenter Stammzellen vom Knochenmark zum Blut führte, wodurch die Anzahl von Zellen, die zur autologen Transplantation gesammelt werden kann, erhöht wurde.
In einer anderen Herangehensweise wurden größere Histokompatibilitätsbarrieren in der Knochenmarktransplantation bei Leukämiepatienten durch Verwendung einer sehr großen Stammzellendosis überwunden, vorzugsweise einer Dosis, die zumindest 3 Mal größer als bei T-Zellen-verarmter Knochenmarktransplantation verwendete konventionelle Dosen waren, insbesondere eine Megadosis CD34+ hämatopoetischer Progenitoren (US-Patent Nr. 5 806 529 an Reisner et al.).
Obwohl die Megadosis-Herangehensweise die permanente Akzeptanz von Hauttransplantaten vom allogenen Spendertyp bei Mäusen¹ erleichterte, ist eine solche Herangehensweise nicht so einfach bei der Humantransplantation anwendbar, da die Anzahl von Stammzellen, die erforderlich sind, um dieses wünschenswerte Ziel zu erreichen, von menschlichen Spendern nicht leicht gesammelt werden kann.
Eine schwierige Barriere für die Einpflanzung hematopoetischer Spender-Zelltransplantation ergibt sich aus dem deutlichen Niveau von wirt-hämatopoetischen und Immunzellen, die sanfte vorbereitende Behandlungen überleben. Mehrere Studien haben gezeigt, dass diese Herausforderung bei Nagetieren erfolgreich angegangen werden kann, indem große Dosen Knochenmarkzellen verwendet werden, die auf adäquate Weise T-Zellen-verarmt sind und in Zusammenwirken mit der einen oder anderen Form toleranzinduzierender Zellen, auch als Vetozellen bezeichnet, angewendet werden.
Vetozellaktivität ist als die Fähigkeit definiert, spezifisch zytotoxische T-Zellen-Vorläufer (CTL-p) zu underdrücken, die gegen Antigene der Vetozellen selbst, jedoch nicht gegen Antigene Dritter gerichtet sind². Mehrere Vetozellen oder Knochenmarktransplantation erleichternde Zellen, die in der Lage sind, zytotoxische T-Zellen-Vorläufer zu unterdrücken, sind beschrieben worden^3-11.
Interessanterweise wurde gezeigt, dass einige der potentesten Vetozellen von T-Zellen abstammen, und insbesondere wurde eine sehr starke Veto-Aktivität für CD8+ CTL-Linien- oder Klone dokumentiert^12-16.
Es wurde durch mehrere Studien demonstriert, dass die Spezifität von CTL-Vetozellen nicht mit ihrer T-Zellen-Rezeptorspezifität in Zusammenhang steht^17-19.
Die Suppression von gegen die Vetozellen gerichtetem Effektor-CTL-p ist sowohl antigenspezifisch als auch MHC-eingeschränkt. Die Suppression resultiert aus der unidirektionalen Erkennung der Vetozelle durch die ansprechenden zytotoxischen T-Lymphozyten¹⁸. Weiterhin wurde gezeigt, dass diese Suppression durch Apoptose vermittelt wird^18,20.
Mit Anti-CD8- oder Anti-Klasse-I-Antikörpern durchgeführte Blockierungsexperimente deuteten an, dass die Eliminierung von Wirt-Anti-Spender-CTL-p mittels einer Wechselwirkung von CD8-Molekülen an den CTL-Vetozellen mit der a3-Domäne von Klasse I-Molekülen an den Wirt-CTL-p's ausgelöst wurde¹⁸. Unterstützung für diese Beobachtung wurde durch Studien erbracht, worin CD8 cDNA in Klone, denen CD8 fehlte, eingebracht wurde¹⁸. Weitere Unterstützung wurde durch Experimente erbracht, die demonstrierten, dass CD8-Moleküle an den Vetozellen direkt Apoptose in Effektorzellen auslösen können²¹. Rezenter demonstrierten Asiedu et al. dass Antikörper-vermittelte Vernetzung von CD8 an Primaten-Knochenmarkvetozellen zu einer erhöhten TGFβ-Produktion führt, die Apoptose in den Effektorzellen auslöst²². Alternativ wurde suggeriert, dass Mäuseknochenmark-Vetozellen Apoptose mittels Fas-Fas-L-Wechselwirkung auslösen können²³.
Die hierin vorangehend beschriebenen Studien demonstrierten, dass Veto-T-Zellpräparate die Transplantattoleranz bei der Knochenmarktransplantation stark erleichtern kann. Die Veto-T-Zellpräparate sind jedoch inadäquat zur Erzeugung von Transplantattoleranz, da solche Präparate noch stets eine beträchtliche Menge alloreagierender Spender-T-Zellen enthalten, die zu Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion führen können, wodurch die erfolgreiche Verwirklichung dieser Herangehensweise eingeschränkt wird.
Reisner et al.,²⁴, ²⁸ beschreiben die Herstellung nicht-alloreaktiver Anti-Dritte-CTLs, die zur Verbesserung von Transplantatakzeptanz bei Mäusen verwendet werden können. Anschließend an die Publikation dieser Zusammenfassung und eine sorgfältigere Studie wurde festgestellt, dass das darin beschriebene CTL-Präparat nicht verarmt an T-Zellen ist, die in der Lage sind, sich nach der Transplantation zu Anti-Wirt-CTLs zu entwickeln, die eine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion bewirken. Somit ist diese Herangehensweise per se nicht auf die Anwendung bei Menschen anwendbar.
HOLAN V. et al. 1980 offenbart Haut-Allografttoleranz, ausgelöst durch in vitro trainierte Suppressorzellen (Immunology Letters, 1: 265–267).
RAMMENSEE H.-G. et al. 1982 beschreibt die Suppression zellvermittelter Lymphozyttoxizität gegen Minor-Histokompatibilitätsantigene, vermittelt durch Lyt-1-plus Lyt-2-plus-T-Zellen von Stimulatorstammursprung (European Journal of Immunology, 12: 930–934).
ZHANG LI et al. 1994 bezieht sich auf die Rolle infundierter CD8+-Zellen bei der Induktion peripherer Toleranz (Journal of Immunology, 152: 2222–2228).
BURLINGHAM WILLIAM J. et al. 1995 offenbart Mikrochimärentum, das an zytotoxisches T-Lymphozyten-funktionelles Nichtansprechen (klonale Anergie) in einem toleranten Nierentransplantatempfänger gebunden ist (Transplantation, 59: 1147–1155).
Reisner et al. 1988 betrifft nicht-alloreaktive Spender-Anti-Dritte-CTLs, welche Knochenmarkallotransplantate über Histohauptkompatibilitätsbarrieren in sublethal bestrahlten Mäusen erleichtern (Blood, 265A, Zusammenfassung 1088).
Es besteht somit ein weithin anerkannter Bedarf, und es wäre höchst vorteilhaft, dieses zu haben, an einem neuen Vetozellpräparat, das frei von Alloreaktivität ist, das verwendet werden kann, um die Abstoßung transplantierter Organe, Gewebe oder Zellen im Wesentlichen zu reduzieren, ohne eine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion hervorzurufen, wodurch eine dauerhafte Toleranz gegenüber den transplantierten Organen, Geweben oder Zellen herbeigeführt wird.
Die Dosis der vorliegenden Erfindung ist in Anspruch 1 definiert, die Anwendung einer Dosis ist in den Ansprüchen 2 und 27 definiert, das Verfahren ist in Anspruch 55 definiert, das Zellpräparat ist in den Ansprüchen 73 und 83 definiert.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Transplantieren eines von einem Spender gewonnenen Transplantats in einen Empfänger verschafft, wobei das Verfahren die Schritte umfasst des (a) Transplantierens des Transplantats in den Empfänger; und (b) dem Empfänger Verabreichens einer Dosis einschließlich nicht-alloreaktiver anti-Dritter zytotoxischer T-Lymphozyte (CTLs), wobei die nicht-alloreaktiven Anti-Dritte-CTLs erzeugt werden durch Lenken von T-Lymphozyten des Spenders auf ein Antigen oder Antigene Dritter, die Dosis im Wesentlichen an T-Lymphozyten verarmt ist, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, wodurch sowohl Transplantatabstoßung durch den Empfänger als auch Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion verhindert oder abgemildert wird.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln eines Empfängers verschafft, der an einer Krankheit leidet, welche die Transplantation unreifer hämatopoetischer Zellen erfordert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst des (a) Vorbehandelns des Empfängers unter sublethalen, (b) dem lethalen oder supralethalen Bedingungen; Empfänger Verabreichens einer ersten Dosis einschließlich unreifer hämatopoetischer Zellen einschließlich Stammzellen von einem allogenen oder xenogenen Spender; und (c) dem Empfänger Verabreichens einer zweiten Dosis einschließlich nicht-alloreaktiver allogener anti-Dritter zytotoxischer T-Lymphozyte (CTLS), wobei die CTLs erzeugt werden durch Richten von von dem Spender gewonnenen T-Lymphozyten gegen ein Antigen oder Antigene Dritter, wobei die zweite Dosis im Wesentlichen an T-Lymphozyten verarmt ist, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, wodurch sowohl Transplantatabstoßung als auch Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion verhindert oder abgemildert werden.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung nicht-alloreaktiver Anti-Dritter zytotoxischer T-Lymphozyte (CTLs) verschafft, wobei das Verfahren den Schritt des Lenkens von T-Lymphozyten gegen ein Antigen oder Antigene Dritter und das im Wesentlichen Verarmen an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, umfasst.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Zellpräparat zur Transplantation bei einem Empfänger verschafft, wobei das Zellpräparat von einem Spender gewonnene nicht-alloreaktive anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) umfasst, die gegen ein Antigen oder Antigene Dritter gerichtet sind, wobei das Zellpräparat im Wesentlichen an T-Lymphozyten verarmt ist, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Zellpräparat zur Transplantation bei einem Empfänger verschafft, wobei das Zellpräparat (a) von einem Spender gewonnene unreife hämatopoetische Zellen einschließlich Stammzellen, und (b) von einem Spender gewonnene, nicht-alloreaktive anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) umfasst, die gegen ein Antigen oder Antigene Dritter gerichtet sind, wobei das Zellpräparat im Wesentlichen an T-Lymphozyten verarmt ist, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln.
Gemäß weiteren Merkmalen in nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungen der Erfindung sind Dosis, T-Lymphozyten oder Präparat im Wesentlichen an CD4-T-Zellen und/oder CD56 natürlichen Killerzellen verarmt.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen wird die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Vorenthalten eines Faktors bewirkt, der (i) zur Reifung von CTLs benötigt wird; und (ii) von heranreifenden CTLs abgesondert wird.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen ist der Faktor ein Zytokin.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen ist das Zytokin IL2.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen wird die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsmarkierung, gefolgt von Separation auf Basis der Markierung, bewirkt.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen wird die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsreinigung bewirkt.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen wird der Spender aus der aus einem allogenen Spender, der entweder HLA-identisch oder nicht-HLA-identisch ist, und einem xenogenen Spender bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen ist der Empfänger ein Mensch.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen sind sowohl der Empfänger als auch der Spender Menschen.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen ist besagtes Antigen oder Antigene von dritter Seite aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Zellen von dritter Seite, einem Zellantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Proteinextrakt und einem gereinigten Protein. In einer derzeit bevorzugten Ausführung ist das Antigen von dritter Seite synthetische Peptide, die virale Antigene darstellen und die durch damit gepulste autologe antigenpräsentierende Zellen präsentiert werden.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen ist das virale Antigen ein EBV- oder ein CMV-Antigen.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen ist das gereinigte Protein Ovalbumin.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen sind die Zellen von dritter Seite allogene oder xenogene Zellen in Bezug auf den Empfänger.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen haben die allogenen Zellen HLA-Antigene, die von denen des Spenders unterschiedlich sind, die jedoch nicht kreuzreaktiv mit den Empfänger-HLA-Antigenen sind.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen sind die allogenen Zellen stimulatorische Zellen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, gereinigt aus peripheren Blutlymphozyten, Milz oder Lymphknoten, zytokinmobilisierten PBLs und in vitro expandierten antigendarstellenden dendritischen Zellen (APC).
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen sind die unreifen hämatopoetischen Zellen einschließlich Stammzellen aus dem Knochenmark, mobilisiertem peripherem Blut, fötaler Leber, Dottersack und/oder Nabelschnurblut des Spenders gewonnen, jedoch nicht aus menschlichen Embryos.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen sind die mobilisierten peripheren Blutzellen durch Leukapherese peripheren Bluts des Spenders nach Stimulation mit einem geeigneten Zytokin erhalten.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen sind die unreifen hämatopoetischen Zellen T-Zellen-verarmte hämatopoetische Progenitorzellen.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen sind die T-Zellen-verarmten hämatopoetischen Zellen CD34+-Progenitor-hämatopoetische Zellen.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen beträgt ein Zellverhältnis zwischen besagten zytotoxischen T-Lymphozyten und besagten unreifen hämatopoetischen Zellen einschließlich Stammzellen zumindest 1 bis 100, bevorzugt 1,5 bis 100.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen beträgt die Zellanzahl der einem Empfänger infundierten zytotoxischen T-Lymphozyten mehr als 5 × 10⁶/kg Körpergewicht und beträgt die der unreifen hämatopoetischen Zellen einschließlich Stammzellen (CD34-Zellen) mehr als 1,0 × 10⁶/kg Körpergewicht.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen werden Transplantations- und Verabreichungsschritte gleichzeitig bewirkt, oder alternativ wird der Transplantationsschritt entweder vor oder nach dem Verabreichungsschritt durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung spricht erfolgreich die Mängel der derzeit bekannten Konfigurationen an, indem sie Vetozellen zur Verfügung stellt, die hocheffizient bei der Verhinderung von Transplantatabstoßung, jedoch frei von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionspotential sind.
Die Erfindung wird hierin nur als Beispiel beschrieben, unter Verweis auf die begleitenden Zeichnungen. Unter spezifischer Bezugnahme auf die Zeichnungen im einzelnen wird hervorgehoben, dass die dargestellten Besonderheiten beispielhaft sind und nur zu Zwecken illustrativer Erläuterung der bevorzugten Ausführungen der vorliegenden Erfindung dienen und aufgrund der Verschaffung dessen, was für die nützlichste und am leichtesten verständliche Beschreibung der Grundsätze und Konzeptaspekte der Erfindung gehalten wird, vorgelegt werden. In dieser Hinsicht wird kein Versuch unternommen, Einzelheiten der Erfindung detaillierter darzustellen, als dies für ein fundamentelles Verständnis der Erfindung erforderlich ist, wobei die Beschreibung zusammengenommen mit den Zeichnungen es den Fachleuten deutlich macht, wie die verschiedenen Formen der Erfindung in der Praxis ausgeführt werden können.
In den Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das den Gehalt von Anti-Wirt-CTLp in Spender-anti-Dritte-CTL-Linien abbildet, die mit und ohne IL2-Entzug hergestellt sind.
2a ist ein Histogramm, das die Veto-Aktivität nicht-alloreaktiver Anti-Dritter-CTLs abbildet. Die Figur zeigt Aktivität Anti-Dritter-CTLs als eine Funktion von Vetozellenkonzentration, wie aus 17 verschiedenen Experimenten zusammengetragen. Von Responderzellen (C3H/Hej) gezeigte spezifische Lyse wurde dokumentiert bei Stimulation gegen Balb/c (massive Quadrate) oder SJL(μoffene Quadrate)-Splenozyten, in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Zellen aus einer Balb/c-anti-Dritte(C57BL/6)-CTL-Linie.
2b ist ein Diagramm, das den Vetoeffekt nicht-alloreaktiver Anti-Dritter-CTLs als eine Funktion effektiver Veto-Responderzellenverhältnisse abbildet. Das Abtöten von Responderzellen (CTL-Progenitoren) (C3H/Hej), die gegen Balb/c (massiver Kreis)- oder SJL(offener Kreis)-Splenozyten stimuliert waren, wurde in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von einer Balb/c-anti-Dritte(C57BL/6)-CTL-Linie getestet.
3 ist ein Diagramm, das die Veto-Aktivität von Anti-Dritte-CTLs als eine Funktion der Zeit des Vetozellenzusatzes abbildet. Der Prozentsatz des Abtötens von Responderzellen (C3H/Hej), die durch eine Balb/c-anti-Dritte(C57BL/6)-CTL-Linie (auf einem 1 : 50 Veto-Responderzellenverhältnis) gegen Balb/c-Splenozyten stimuliert waren, wurde in Funktion der Zeit des CTL-Zusatzes getestet.
4 ist ein Histogramm, das die Inhibierung des Vetoeffekts durch einen monoklonalen Anti-CD8-Antikörper abbildet. Anti-CD8 mAb (Anti Ly-2,2) wurde in verschiedenen Konzentrationen zu gemischter Lymphozytenreaktion (MLR) zugesetzt, die aus Responderzellen (C3H/Hej) bestand, die gegen Balb/c-Splenozyten stimuliert waren, und Zellen aus einer Balb/c-anti-Dritte(C57BL/6)-CTL-Linie (auf einem 1 : 50-Veto-Responderzellenverhältnis). Die
5a–c bilden das spezifische Entfernen von Responder-CTL-p ab, das gegen das H-2-Antigen der Vetozellen gerichtet ist. Splenozyten von 2c-transgenen Mäusen (H-2^b), die transgenes TCR spezifisch gegen H-2^d (1B2⁺) tragen, wurden in MLR gegen Balb/c-Splenozyten (H-2^d) stimuliert. Die Häufigkeit von 1B2⁺CD8-Zellen vor (5a) und nach dem Zusatz zu der MLR-Kultur von Balb-anti-C3H(5b)- oder SJL-anti-C3H(5c)-CTLs wurde mittels FACS 5 Tage nach Initiieren der MLR ermittelt.
6a ist ein Histogramm, das die Rolle von Fas-Ligand (Fas-L) und Perforin bei der Veto-Aktivität anti-Dritter-CTLs abbildet. Aus Wildtyp-C3H-Splenozyten generierte Anti-Dritte-CTLs wurden mit CTLs verglichen, die aus Fas-L-defizienten gld/C3H oder aus perforindefizienten PO-Splenozyten generiert wurden. Kulturen zur Vetoermittlung bestanden aus Balb-anti-C3H-MLR (massive Säule), während Balb-anti-SJL als eine Kontrolle zur Hintergrundinhibierung (offene Säule) diente. Im Fall von PO-CTLs bestanden Kulturen zur Vetobestimmung aus C3H-anti-PO-MLR (massive Säule), während C3H-anti-SJL als Kontrolle diente (offene Säule).
6b ist ein Histogramm, das die Umkehrung von Veto-Aktivität in Fas-L-defizienten CTLs durch Gentransfer von Fas-L abbildet. Aus Wildtyp-C3H-Splenozyten generierte Anti-Dritte-CTLs wurden mit CTLs verglichen, die aus Fas-L-defizienten gld/C3H generiert worden waren, vor, a, und nach Transfektion mit Fas-L-haltigem retroviralen Vektor, b, oder mit einer Vektorattrappe, c.
7a ist ein Histogramm, das die Rolle von Fas in der Veto-Aktivität von Anti-Dritte-CTLs abbildet. Responder-CTL-Progenitoren von Wildtyp-C3H oder von Fas-defizientem 1pr/C3H-Hintergrund wurden auf ihre Empfindlichkeit für den Vetoeffekt von Balb-anti-C57BL/6-CTLs verglichen. Kulturen zur Vetoermittlung bestanden aus C3H-anti-Balb-MLR (massive Säulen) oder 1pr/C3H-anti-SJL (offene Säulen), die als Kontrolle zur Ermittlung der Hintergrundinhibierung dienten.
7b ist ein Histogramm, das den Effekt eines Fas-L-Antagonisten auf den Veto-Effekt von CTLs abbildet. Kulturen zur Vetoermittlung bestanden aus Balb-anti-C3H-MLR (massive Säulen) oder Balb-anti-SJL (offene Säule), die als Kontrolle zur Ermittlung von Hintergrundinhibierung dienten. Die
8a–d bilden das Entfernen von Anti-H2^d-T-Zellen durch nicht-alloreaktive Anti-Dritte-CTLs ab. Splenozyten von 2c-transgenen Mäusen (H-2^b), die transgene TCR spezifisch gegen H-2^d trugen, wurden in MLR gegen Balb/c-Splenozyten (H-2^d) stimuliert. Ausdruck von Fas auf CD8-transgenen (1B2⁺)-T-Zellen wurde durch FACS vor MLR (8a) und bei 48 Std. (8b) analysiert. Das Entfernen von Fas⁺1B2⁺CD8-T-Zellen nachfolgend an den Zusatz zu der MLR-Kultur von Balb-anti-C3H(8c)- oder SJL-anti-C3H(8d)-CTLs wurde bei 48 Stunden nach Initiierung der MLR ermittelt.
9 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Zellen pro Kultur und dem Prozentsatz nicht ansprechender Zellen unmanipulierter Peripherblutlymphozyten (PBLs) abbildet, die einem Spender (R) entnommen und gegen potentielles Wirttyp-PBL (Patient Nr. 38) stimuliert worden waren. Es wurde gezeigt, dass die spezifische Abtötung nicht-HLA-bezogener Zelltypen (Patient Nr. 40) zu vernachlässigen war (Quadrat), während die Abtötung gegen die ursprünglichen Stimulatoren (Raute und Kreis) auf hoher Potenz aufrechterhalten wurde.
10 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Zellen pro Kultur und dem Prozentsatz nicht ansprechender Zellen einer aus PBL von Spender R (in 1 beschrieben) durch Stimulation gegen EVB-transformierte Stimulatoren von seiten Dritter (S genannt) erstellten CTL-Linie abbildet. Beim Stimulieren der Zellen dieser CTL-Linie gegen das Wirttyp-PBL (Patient Nr. 38) wurde demonstriert, dass die spezifische Abtötung vernachlässigbar war (Kreis) im Vergleich zu derjenigen gegen Kontrollzellen (Patient Nr. 40, unspezifischer Hintergrund) (Quadrat) festgestellten. Die
11a–b sind Säulendiagramme, die die Veto-Aktivität menschlicher Anti-Dritter-CTLs demonstrieren. 11a zeigt die Inhibierung spezifischer Lyse bei einem Verhältnis von 1 : 25 und 1 : 50 Veto- zu Effektorzellen, im Vergleich zu einem Kontrollexperiment (11b), das dieselben Vetozellen in einer nicht relevanten MLR, gerichtet gegen einen irrelevanten Stimulator, der verschiedene HLA-Antigene trägt, verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft Vetozellpräparate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei Transplantationen, welche Vetozellen zur Auslösung dauerhafter Toleranz von Spenderorganen, -geweben oder -zellen ohne Auslösung von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion verwendet werden können. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung Vetozellpräparate zur Verwendung bei Transplantationen, welche Vetozellpräparate Zellen beinhalten, die als Vetozellen funktionell sind, die jedoch im Wesentlichen frei von alloreaktiven Zellen sind und als solche diese Vetozellen, wenn sie in einen Empfänger eingebracht sind, Transplantatabstoßung verhindern, ohne eine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion auszulösen.
Die Prinzipien und Wirkungsweise der vorliegenden Erfindung können unter Verweis auf die Zeichnungen und begleitenden Beschreibungen besser verstanden werden.
Bevor zumindest eine Ausführung der Erfindung detailliert erläutert wird, ist anzumerken, dass die Erfindung in ihrer Anwendung nicht auf die in der nachfolgenden Beschreibung ausgeführten Einzelheiten beschränkt ist. Die Erfindung ist zu anderen Ausführungen fähig oder dazu, auf verschiedene Weisen praktiziert oder ausgeführt zu werden. Es ist auch anzumerken, dass die hierin verwendete Phraseologie und Terminologie dem Zweck der Beschreibung dient und nicht als einschränkend anzusehen ist.
Frühe Studien bei Mäusemodellen und rezentere klinische Daten bei schwer vorbehandelten Leukämiepatienten haben gezeigt, dass die Eskalation hämatopoetischer Progenitorzellen größere genetische Barrieren überwinden und die rasche und dauerhafte Transplantierung haploidentischer 3-Loci-fehlangepasster Transplantate ohne Auslösung von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion ermöglichen kann. In vitro-Studien suggerieren, dass Vetozellen innerhalb der CD34-Progenitorenpopulation wahrscheinlich diesen erleichternden Effekt vermitteln.
Auch wurde rezent gezeigt, dass das "Megadosis"-Konzept nützlich war zur Toleranzinduktion bei sublethal bestrahlten Mäusen, indem es den deutlichen Widerstand überwand, der durch die große Anzahl von Lymphozyten geboten wurde, die die sublethale Vorbehandlung überlebten. Durch Transplantation einer Megadosis von Sca1⁺Lin^–-Zellen generierte allogene Chimären akzeptieren dauerhaft allogene Spendertyp-Hauttransplantate.
Es kann jedoch sein, dass die zur Erreichung dieses wünschenswerten Ziels erforderlichen Anzahlen nicht leicht von menschlichen Spendern gesammelt werden können.
Es wurde auch gezeigt, dass nicht-alloreaktive, Erdnuss-Agglutinin-negative Thymozyten von (Wirt × Spender) F1, die aufgrund ihrer genetischen Zusammensetzung nicht-alloreaktiv sind, die Einpflanzung T-Zellen-verarmten Knochenmarks verbesserten.
Rezenter wurde gezeigt, dass diese Zellen mit Mäuse-Sca1⁺Lin^–-Zellen synergieren, um die Mindestanzahl von Zellen zu verringern, die erforderlich sind, um die Herbeiführung wesentlichen gemischten Chimärentums in dem sub-lethalen Mäusemodell zu erzielen.
Beim Menschen können nicht-alloreaktive T-Zellen durch Purgieren von Interleukin-2-Rezeptor(CD25)-MLR-reaktiven T-Zellen oder durch Anergie-Induktion bei Inkubation mit CTLA-4 generiert werden. Diese Herangehensweisen, die T-Zellen-Stimulation mit genau den Antigenen anwenden, gegen die Toleranz erwünscht ist, könnten ein gewisses Risiko der Erzeugung geprägter CTLs beinhalten, falls jedwede CTL-Progenitoren der Löschung oder Anergie-Induktion entkommen. Sobald solche Anti-Wirt-CTLs generiert sind, ist es sehr schwierig, ihre Alloreaktivität in vivo zu unterdrücken.
Eine alternative Herangehensweise basiert auf früheren Studien, die zeigten, dass CD8⁺CTL-Klone eine extrem hohe Veto-Aktivität besitzen.
Von einem Spender gewonnene T-Lymphozyten, die einem Antigen von dritter Seite ausgesetzt waren, erwiesen sich als nützlich bei der Erzeugung von CTLs, die bei der Verhinderung oder Abmilderung von Transplantatabstoßung effektiv waren, jedoch enthielten solche CTL-Präparate eine wesentliche Fraktion von einem Spender gewonnener T-Lymphozyten, die sich zu alloreaktiven Spender-CTLs entwickeln könnten, die eine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion auslösen.
Während des Reduzierens der vorliegenden Erfindung auf die Praxis wurden Spender-Anti-Dritte-CTLs, die an Anti-Wirt-Alloreaktivität verarmt sind, generiert. In den bevorzugten Ausführungen der Erfindung sind Zellpräparate auch im Wesentlichen verarmt an CD4-T-Zellen und/oder CD56-natürlichen Killerzellen, vorzugsweise beides.
Wie weiter in den Beispielen 1 und 2 des unten angeführten Abschnitts Beispiele beschrieben ist, bezog die Verarmung von Zellen mit einem Potential, alloreaktive (Anti-Wirt)CTLs aus einer Spender-Anti-Dritte-CTLs-Kultur zu werden, in dem vorgesehenen spezifischen Beispiel, einen anfänglichen IL-2-Entzug ein, der zur Apoptose von in der Kultur vorhandenen nicht-induzierten T-Zellen führte. Studien, die solche Mäuse- und Human-CTL-Präparate nutzten, die in vitro durchgeführt wurden, demonstrierten, dass solche nicht-alloreaktiven CTL-Präparate an Zellen verarmt sind, die das Potential haben, zu Anti-Wirt-CTLs heranzureifen.
Somit wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Transplantieren eines von einem Spender gewonnenen Transplantats in einen Empfänger verschafft.
Wie hierin verwendet, beziehen die Begriffe "Transplantat" oder "Graft" sich auf entweder allogene oder xenogene Transplantate oder Grafts, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, ganzer Organe, wie beispielsweise Niere, Herz, Leber oder Haut; Gewebe, wie beispielsweise aus einem Organ, wie etwa der Leber, gewonnene Gewebe oder Zellen, wie beispielsweise unreife hämatopoetische Zellen.
Wie hierin verwendet, bezieht der Begriff "allogen" sich auf derselben Spezies angehörend. Als solches ist ein "Allograft" ein Transplantat zwischen zwei Individuen derselben Spezies, welche Individuen starke (nicht verwandte Individuen) oder schwache (haploidentische Geschwister) Histokompatibilitätsunterschiede aufweisen.
Wie hierin, beziehen die Begriffe "xenogen" oder "heterogen" sich auf zwei verschiedenen Spezies angehörend. Als solches ist ein "Xenograft" oder ein "Heterograft" ein Transplantat zwischen zwei Individuen einer verschiedenen Spezies.
Somit kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das hierin nachstehend weiter beschrieben und beispielhaft dargestellt wird, zur Transplantation eines Organs, wie etwa einer Niere oder eines Herzens, auf einen Empfänger verwendet werden, der beispielsweise an Nieren- oder Herzversagen leidet, oder zur Transplantation von Leber, Lunge oder Hautgewebe auf einen Empfänger, der an Leber- oder Lungenversagen oder Hautbeschädigung (z.B. Verbrennungen) leidet.
Das nachstehend beschriebene Verfahren kann auch beispielsweise zur Behandlung eines Empfängers verwendet werden, der an einer Erkrankung leidet, die die Transplantation unreifer hämatopoetischer Zellen erfordert.
Im letzteren Fall sind dies unreife allogene oder xenogene hämatopoetische Zellen (einschließlich Stammzellen), die beispielsweise aus Knochenmark, mobilisiertem peripherem Blut (beispielsweise durch Leukapherese), fötaler Leber, Dottersack und/oder Nabelschnurblut des Spenders, jedoch nicht aus menschlichen Embryos, gewonnen sein können. Sie sind vorzugsweise T-Zellen-verarmte CD34⁺ unreife hämatopoetische Zellen und können auf einen an einer bösartigen Erkrankung leidenden Empfänger transplantiert werden. Eine solche Erkrankung kann sein, ist jedoch nicht beschränkt auf, Leukämie wie etwa akute Lymphoblastenleukämie (ALL), akute Nichtlymphoblastenleukämie (ANLL), akute myeloische Leukämie (AML) oder chronische myeloische Leukämie (CML), und schwere kombinierte Immundefizienzsyndrome (SCID), einschließlich Adenosindeaminase (ADA), Osteopetrose, aplastische Anämie, Gaucher-Krankheit, Thalassämie und andere angeborene oder genetisch bestimmte hämatopoetische Abweichungen.
Ungeachtet des Transplantattyps nutzt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, um Transplantatabstoßung zu vermeiden, auch ein neues Vetozellpräparat, das nicht-alloreaktive anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) beinhaltet. Solche CTLs werden durch Konditionieren von einem Spender gewonnener T-Zellen gegen Antigene von dritter Seite generiert. Dieses CTL-Zellpräparat wirkt so, das es Transplantatabstoßung beim Empfänger verringert. Weitere Einzelheiten eines solchen CTL-Präparats sind in den Beispielen 1–3 des Abschnitts Beispiele angegeben. Solche Präparate sind verarmt an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, wodurch sowohl Transplantatabstoßung durch den Empfänger als auch Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion verhindert oder abgemildert werden.
Wie hierin verwendet, bezieht der Ausdruck "nicht-alloreaktiv" sich auf im Wesentlichen keine Reaktivität gegen den Spender oder Empfänger aufweisend.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden diese CTLs entweder gleichzeitig mit, vor der oder anschließend an die Transplantation des Spendertransplantats verabreicht.
Im Fall hämatopoetischer Zelltransplantation beträgt das Zellverhältnis zwischen den zytotoxischen T-Lymphozyten und den unreifen hämatopoetischen Zellen einschließlich Stammzellen zumindest 1 zu 100, vorzugsweise im Bereich von 1 zu 1–5 zu 1, bevorzugter etwa. Vorzugsweise beträgt die Zellenanzahl der einem Empfänger infundierten zytotoxischen T-Lymphozyten mehr als 5 × 10⁶/kg Körpergewicht und beträgt die der unreifen hämatopoetischen Zellen einschließlich Stammzellen (CD34-Zellen) mehr als 1,0 × 10⁶/kg Körpergewicht.
Wie hierin verwendet, bezieht der Ausdruck "Antigen oder Antigene Dritter" sich auf Antigene, die weder bei Spender noch Empfänger vorhanden sind.
Beispielsweise können Antigene von dritter Seite Antigene von Viren sein, wie beispielsweise Epstein-Barr-Virus (EBV) oder Zytomegalievirus (CMV) oder Zellen von dritter Seite (Zellen nicht vom Spender oder Empfänger). Virale Antigene können durch Zellen (z.B. Zelllinie) präsentiert werden, die damit infiziert sind oder anderweitig dazu gebracht sind, virale Proteine auszudrücken. Autologe Antigene präsentierende Zellen können verwendet werden, um darangeschweißte oder daraufgeladene kurze synthetische Peptide zu präsentieren. Solche kurzen Peptide können viral gewonnene Peptide oder Peptide, die ein anderes Antigen darstellen, sein. Speziell entworfene Software kann zum Analysieren viraler oder anderer Sequenzen verwendet werden, um immunogene kurze Peptide zu identifizieren, d.h. Peptide, die im Kontext von Klasse I-MHC oder Klasse II-MHC präsentierbar sind.
Zellen von dritter Seite können in Bezug auf den Empfänger entweder allogen oder xenogen sein. Vorzugsweise haben, im Fall allogener Zellen von dritter Seite, solche Zellen HLA-Antigene, die sich von denen des Spenders unterscheiden, die jedoch nicht mit den Empfänger-HLA-Antigenen kreuzreaktiv sind, sodass gegen solche Zellen generierte CTLs nicht gegen Transplantat- oder Empfängerantigene reaktiv sind.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die allogenen Zellen von dritter Seite stimulatorische Zellen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, die aus PBL, Milz- oder Lymphknoten gereinigt sind, zytokinmobilisierten PBLs und in vitro expandierten antigen-präsentierenden dendritischen Zellen (APC).
Antigene von dritter Seite können auf den zellulären, viralen oder bakteriellen Oberflächen präsentiert oder von dort gewonnen und/oder gereinigt werden. Zusätzlich kann ein virales Antigen auf einer infizierten Zelle ausgestellt werden und ein zelluläres Antigen kann auf einem künstlichen Träger, wie etwa einem Liposom, ausgestellt werden.
Zusätzlich können Antigene von dritter Seite beispielsweise Proteine sein, die aus einer breiten Spanne von Quellen extrahiert oder gereinigt wurden. Ein Beispiel für ein gereinigtes Protein, das als ein Antigen von dritter Seite gemäß der vorliegenden Erfindung dienen kann, ist Ovalbumin. Andere Beispiele sind geplant.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die CTLs vorzugsweise gegen Zellen von dritter Seite oder Viren oder viral infizierte oder virale Peptide präsentierende Zellen generiert und als solches sind die durch die vorliegende Erfindung genutzten Antigene von dritter Seite verschiedene native zelluläre oder virale Antigene oder eine Kombination von beiden, die an der Oberfläche der Zelle oder des Virus angeordnet sind.
Die Nutzung von Zellen, Viren, viral infizierten oder virale Peptide präsentierenden Zellen als Antigene von dritter Seite ist besonders vorteilhaft, da solche Antigene von dritter Seite eine diverse Anordnung antigener Determinanten beinhalten und als solche die Bildung von CTLs einer diversen Population lenken, was weiter zu einer rascheren Rekonstitution von T-Zellen dienen kann, in Fällen, wo eine solche Rekonstitution erforderlich ist, z.B. anschließend an eine lethale oder sublethale Bestrahlungsprozedur. Weiterhin ist es, wenn CTLs gegen viral infizierte Zellen gerichtet werden, plausibel, zumindest einige Aktivität von Transplantat gegenüber Krebszellen aufgrund von Kreuzreaktivität zwischen viralen Antigenen und mit Krebszellen zusammenhängenden oder spezifischen Antigenen zu erhalten.
Somit wird, wie vorangehend bereits erwähnt, das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung durch Transplantieren des Transplantats in den Empfänger zusammen mit nicht-alloreaktiven anti-Dritte zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), die verarmt sind an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, bewerkstelligt, wodurch sowohl Transplantatabstoßung durch den Empfänger als auch Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion verhindert oder abgemildert wird.
Da die nicht-alloreaktiven Anti-Dritte-CTLs durch das Lenken von vom Spender gewonnener T-Lymphozyte gegen Antigen oder Antigene von dritter Seite generiert werden, verhindern oder mildern die resultierenden CTLs Transplantatabstoßung durch den Empfänger, indem sie Empfänger-CTL-Progenitoren (Responder), die gegen das Transplantat gebildet werden, abfangen und abtöten. Weiterhin sind, da die CTLs gegen Antigene von dritter Seite generiert werden, solche CTLs nicht gegen Empfängergewebe oder gegen das Spendertransplantat aktiv. Da die Anti-Dritte-CTLs verarmt sind an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, verhindern oder mildern sie eine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Verfahren zum Transplantieren eines Spendertransplantats weiter einen zusätzlichen Schritt, wobei der Empfänger vor der Transplantation unter sublethalen, lethalen oder supralethalen Bedingungen vorbehandelt wird.
Eine solche Vorbehandlung ist von der Natur des Transplantats und dem Zustand des Empfängers abhängig. Der Empfänger kann beispielsweise durch Ganzkörperbestrahlung (TBI) und/oder durch Behandlung mit myeloablativen und immunsuppressiven Mitteln gemäß Standardprotokollen unter sublethalen, lethalen oder supralethalen Bedingungen vorbehandelt werden.
Beispielsweise liegt eine sublethale Bestrahlungsdosis im Bereich von 1–7,5 Gy TBI, eine lethale Dosis liegt im Bereich von 7,5–9,5 Gy TBI und eine supralethale Dosis liegt im Bereich von 9,5–16,5 Gy TBI. Beispiele für myeloablative Mittel sind Busulphan, Dimethylmileran und Thiotepa, und für immunsuppressive Mittel sind es Prednison, Methylprednisolon, Azathioprin, Cyclosporin, Cyclophosphamidin, Fludarabin, etc.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der Empfänger vorzugsweise unter sublethalen Bedingungen vorbehandelt.
Wie bereits mehrfach festgestellt, sind die nicht-alloreaktiven Anti-Dritte-CTLs gemäß der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen verarmt an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, und werden daher als "nicht-alloreaktiv" bezeichnet. Als solches unterscheiden sie sich von und sind sie vorteilhaft gegenüber Vetozellen des Standes der Technik. Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, ist von besonderem Vorteil, da das Vorhandensein alloreaktiver Zellen im Empfänger zur Entwicklung von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion führen kann.
Ein nicht-alloreaktives anti-Dritte CTLs-Zellpräparat wird generiert wie oben beschrieben, indem von einem Spender gewonnene T-Lymphozyten gegen Antigene von dritter Seite gelenkt und das Präparat verarmt wird an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, bewirkt, indem T-Lymphozyten, die in Gegenwart von Antigenen von dritter Seite kultiviert wurden, ein Faktor vorenthalten wird, der (i) zur Heranreifung von CTLs oder Schutz vor Apoptose benötigt wird; und (ii) von heranreifenden CTLs abgesondert wird. Under solchen Kultivationsbedingungen erfahren T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, Apoptose, wobei in der Kultur vorhandene heranreifende CTLs den Faktorentzug überleben, da solche Zellen selbst diesen Faktor (autokrin) absondern.
Der Faktor gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise ein Zytokin sein, wie etwa, jedoch nicht beschränkt auf, IL2. IL2-Entzug von CTL-Präparaten ist im einzelnen in den Beispielen 1–3 des nachstehenden Abschnitts Beispiele beschrieben.
Gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickln, durch Affinitätsmarkierung, gefolgt von markierungsbasierter Abscheidung, bewirkt. Somit können, wenn gegen Wirtantigene stimuliert, ein fluoreszierend markierter Anti-CD69- oder Anti-CD25-Antikörper, der spezifisch das eindeutige Aktivierungsantigen von T-Lymphozyten bindet, und/oder ein fluoreszierend markiertes Anti-IL2 oder Anti-yINF, das spezifisch Zellen bindet, die diese Zytokine absondern, verwendet werden, um Anti-Wirt-T-Lymphozyten von Anti-Dritte-CTLs abzuscheiden und dadurch T-Lymphozyten zu verarmen, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln. Solche spezifische Markierung kann verwendet werden, um Anti-Dritte-CTL-Vorläufer vor einem IL-2-Entzug oder als Ersatz für IL-2-Entzug zu selektieren.
Solch spezifisches Markieren kann verwendet werden, um Anti-Dritte-CTL-Vorläufer vor einem IL-2-Entzug oder als ein Ersatz für IL-2-Entzug zu selektieren.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungen wird die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsreinigung bewirkt.
Beispielsweise kann ein Substrat, das einen Antikörper oder einen Liganden umfasst, der in der Lage ist, spezifisch ein Zelloberflächenmolekül zu binden, das nur von T-Lymphozyten, aber nicht von CTLs aufgewiesen wird, oder umgekehrt, verwendet werden, um effektiv T-Lymphozyten aus dem CTL-Präparat zu verarmen, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln.
Das Affinitätssubstrat gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Säulenmatrix sein, wie beispielsweise Agarose, Zellulose und dergleichen, oder Kügelchen, wie beispielsweise Magnetkügelchen, worauf ein Anti-T-Lymphozyt oder ein Anti-CTLs-Antikörper, wie vorangehend beschrieben, immobilisiert ist.
Somit kann gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, mittels Säulenchromatographie oder Magnetkügelchen-abscheidung bewirkt werden.
Der Zweck bei der Züchtung von Spender-T-Zellen, die gegen ein Antigen oder Antigene von dritter Seite sensibilisiert sind, ist die Erzielung eines an alloreaktiven Klonen, die gegen Wirtantigene gerichtet sind, verarmten T-Zellpräparats. Wie hierin beschrieben, umfasst die Prozedur zwei Hauptschritte. In dem ersten wird IL-2-Entzug angewendet, um eine teilweise Verarmung an Zellen, die nicht ihr eigenes IL-2 produzieren können, zu bewirken, in dem zweiten Hauptschritt werden Anti-Dritte-Klone kräftig mit optimalen Dosen von Il-2 expandiert, um verbleibende Anti-Wirt-Klone weiter zu verarmen. Im allgemeinen sind CD8-CTLs gegen im Kontext der HLA Klasse I präsentierte Antigene gerichtet, während CD4-Helfer-T-Zellen Antigene im Kontext von HLA-Klasse II erkennen. Den letztgenannten Zellen fehlt es an Vetoaktivität und daher führt die hierin beschriebene Prozedur zu einer minimalen Erzeugung solcher Zellen. Experimentell wurde jedoch festgestellt, dass selbst bei Verwendung von Stimulationsprotokollen, die die Erzeugung von CTLs gegen Antigene von dritter Seite begünstigten, es schwierig ist, am Ende der Kultur hohe Werte von CD8-CTLs zu erhalten, wenn nicht CD4-T-Zellen und CD56-natürliche Killer(NK)-Zellen 10–16 Tage nach der IL-2-Entzugsperiode (z.B. vor der Stimulation mit hohen Niveaus von IL-2) entfernt wurden. Somit wird in einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung CD8-Zellenreinigung entweder durch negative Selektion zur Entfernung von CD4- und CD56-Zellen oder durch positive Selektion zum Zurückhalten von CD8-Zellen bewirkt. Solche Selektion kann beispielsweise unter Verwendung von Affinitäts-Feststoffträgern einschließlich Anti-CD8-Antikörpern (zur positiven Selektion) oder Anti-CD4-Antikörpern und Anti-CD56-Antikörpern (zur positiven Selektion) bewerkstelligt werden. Der Feststoffträger kann eine Säule, Kügelchen oder Magnetkügelchen sein. Alternativ kann eine solche Selektion beispielsweise unter Verwendung von Affinitätsmarkierung, gefolgt von FACS-Abscheidung unter Einsatz fluoreszierend markierter Anti-CD8-Antikörper, Anti-CD4-Antikörper und/oder Anti-CD56-Antikörper bewerkstelligt werden.
Gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Transplantieren eines von einem Spender gewonnenen Transplantats in einen Empfänger verschafft. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist identisch zu dem hierin vorangehend beschriebenen, mit der Ausnahme, dass die verwendeten Vetozellen von nicht-T-Lymphozytursprung sind.
Ein Vetozellpräparat gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst von einem Spender gewonnene, genetisch modifizierte nicht-T-Zellen, die rekombinanten Fas-Liganden und rekombinantes CD8-Antigen ausdrücken.
Wie in Beispiel 2 des Abschnitts Beispiele beschrieben, wurde, während des Reduzierens der vorliegenden Erfindung auf die Praxis, entdeckt, dass CTLs nur dann effektiv ein Veto gegen CTL-Vorläufer durchführen können, wenn sowohl Fas-L als auch CD8 gemeinsam auf den früheren CTLs ausgedrückt werden.
Als solches können von einem Spender gewonnene nicht-T-Lymphozyt-zirkulatorische Zellen, wie beispielsweise Monozyten, Neutrophillen oder Basophillen, auch also effektive Vetozellen dienen, vorausgesetzt, dass diese Zellen CD8 und Fas-L ausdrücken und aufweisen.
Zum Ausdrücken dieser Proteine in solchen Zellen werden die Codierungssequenzen von Fas-L und CD8-Untereinheit o (Genbankzugang Nr. U11821 beziehungsweise M12825, beide werden hierin als Referenz aufgenommen) einschließlich geeigneter Führungssequenzen isoliert und jede wird in ein geeignetes Ausdruckskästchen eines Ausdrucksvektorkonstrukts ligiert.
Die Vektorkonstrukte können dann durch ein aus einer Vielzahl von in der Technik bekannten Verfahren gemeinsam in die Zelle eingebracht werden. Solche Verfahren finden sich generell beschrieben in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Springs Harbor Laboratory, New York, 1989, Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland, 1989, Chang et al., "Somatic Gene Therapy", CRC Press, Ann Arbor, MI, 1995, Vega et al., "Gene Targeting", CRC Press, Ann Arbor MI (995), "Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses", Butterworths, Boston MA, 1988, and Gilboa et al., Biotechniques 4 (6): 504–512, 1986, und beinhalten beispielsweise stabile oder vorübergehende Transfektion, Lipofektion, Elektroporation, biolistisches Bombardement und Infektion mit rekombinanten viralen Vektoren.
Jedes Nukleinsäurekonstrukt gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung enthält einen Promoter zum Regulieren des Ausdrucks von Fas-L oder CD8. Von solchen Promotern ist bekannt, dass sie cis-Sequenzelemente sind, die zur Transkription erforderlich sind, da sie dazu dienen, DNA-abhängige RNA-Polymerase zu binden, die stromabwärts davon vorhandene Sequenzen transkribiert.
Der Promoter der Wahl, der in Zusammenhang mit diesem Aspekt der Erfindung verwendet wird, kann jeder Promoter sein, der zum Ausdruck in Säugetierzellen geeignet ist. Vorzugsweise ist der angewendete Promotor ein starker, konstitutiver Promoter, der in der Lage ist, hohe Niveaus der Transkripte auszudrücken. Zusätzlich kann, um die Transkriptionsaktivität weiter zu erhöhen, das Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung auch ein Transkriptionserhöhungselement enthalten.
Das Vektorkonstrukt gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise einen geeigneten selektierbaren Marker. Es ist zu würdigen, dass, da hierin zwei unabhängige Konstrukte angewendet werden, jedes Konstrukt einen eindeutigen selektierbaren Marker umfasst, sodass nach einer mit beiden Konstrukten transformierten Zelle selektiert werden kann. Alternativ wird ein Einzelvektor eingesetzt, der beide Gene unterbringt, jedes mit seinen eigenen ausdrucksregulierenden Sequenzen.
Das Vektorkonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin vorzugsweise einen Replikationsursprung in Säugetierzellen und einen geeigneten selektierbaren Marker und Replikationsursprung zur Ausbreitung in E. Coli (d.h. Shuttlevektor). Das Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung kann zum vorübergehenden Ausdruck (d.h. keine genomische Integration) oder zur Integration in das Genom transformierter Zellen und den Ausdruck von dort aus angewendet werden. Das Konstrukt gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise ein Plasmid, ein Bacmid, ein Phagemid, ein Cosmid, ein Phage, ein Virus oder ein künstliches Chromosom sein.
Es ist zu würdigen, dass CD8 und Fas-L auch von einem Einzelvektorkonstrukt als ein einzelnes chimärisches Transkript ausgedrückt werden können, vorausgesetzt, dieses Transkript enthält eine IRES-Sequenz zum Lenken der Übersetzung eines von dem Transkript verschlüsselten zweiten Polypeptids.
Somit nutzt gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung das Verfahren zum Transplantieren eines Spendertransplantats ein Vetozellpräparat aus genetisch modifizierten nicht-T-Zellen, die rekombinanten Fas-Liganden und rekombinantes CD8-Antigen ausdrücken.
Es ist zu würdigen, dass ein solches Vetozellpräparat inhärent vorteilhaft zur Auslösung von Toleranz von Transplantaten ist, da ein solches Präparat keine Zellen T-lymphatischen Ursprungs enthält und solche Vetozellen daher inhärent keine Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion auslösen können.
Zusätzlich dienen solche Zellen, da sie von dem Spender gewonnen sind, als ausgezeichnete Fallen für CTL-Progenitoren, die von dem Empfänger als Reaktion auf das Transplantat erzeugt werden und als solche die Transplantat-/Graft-Abstoßung verhindern oder abmildern.
Somit beschreibt dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung alternative Herangehensweisen an das Generieren nicht-alloreaktiver Anti-Dritte-Vetozellen. Durch Ausdrücken von Fas-L und CD8, in einer Verschiedenheit von Zellen, können diese Zellen als Vetozellen für Antigene dienen, gegen die die Auslösung von Toleranz erwünscht ist.
Gleichartig den durch andere Aspekte der vorliegenden Erfindung beschriebenen Anti-Dritte-CTLs könnten diese 'künstlichen' Vetozellen helfen, den Bedarf an effektiven CD34-Megadosen bei fehlangepassten Leukämiepatienten zu verringern und könnte zu sicheren fehlangepassten hämatopoetischen Transplantaten bei Patienten führen, für die das Risiko supralethaler Strahlen-/Chemotherapie nicht gerechtfertigt ist, wie etwa Patienten mit Thalassämie, Sichelzellanämie und einigen Enzymunzulänglichkeiten.
Weiterhin kann gemäß der vorliegenden Erfindung das Auslösen von im Wesentlichen dauerhaftem Chimärentum verwendet werden, um Toleranz gegenüber Organ- oder Gewebetransplantaten auszulösen, oder als Einleitung für adaptive Zelltherapie bei Krebspatienten.
Zusätzliche Gegenstände, Vorteile und neue Merkmale der vorliegenden Erfindung werden einem Fachmann mit gewöhnlichem Fachwissen deutlich bei Überprüfung der nachfolgenden Beispiele, welche nicht einschränkend sein sollen. Zusätzlich findet jede der verschiedenen Ausführungen und jeder der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie hierin vorangehend umrissen und wie in dem Abschnitt Beispiele beansprucht, experimentelle Unterstützung in den nachfolgenden Beispielen.
BEISPIELE
Es wird nun auf die nachfolgenden Beispiele verwiesen, welche, zusammen mit den vorangehenden Beschreibungen, die Erfindung auf eine nicht einschränkende Weise illustrieren.
Im allgemeinen umfassen die hierin verwendete Nomenklatur und die in der vorliegenden Erfindung angewendeten Laborprozeduren molekulare, biochemische, mikrobiologische und rekombinate DNA-Techniken. Solche Techniken sind in der Literatur gründlich erläutert. Siehe beispielsweise: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I–III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New. York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis. A Laboratory Manual Series", Vols. 1–4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); Methodologien, wie in den US-Patenten mit den Nummern 4 666 828; 4 683 202; 4 801 531; 5 192 659 und 5 272 057 ausgeführt; A Laboratory Handbook", Volumes I–III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes 1-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Édition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); verfügbare Immunoassays sind ausführlich in der Patent- und wissenschaftlichen Literatur beschrieben, siehe beispielsweise die US-Patente mit den Nummern US-A 3 791 932; 3 839 153; 3 850 752; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 879 262 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; 4 098 876; 4 879 219; 5 011 771 et 5 281 521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986) "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) et "Methods in Enzymology" Vol. 1–317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization – A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) welche alle hierin als Referenz aufgenommen werden, als wären sie hierin vollständig ausgeführt. Andere allgemeine Referenzen werden in diesem Dokument vorgesehen. Die darin aufgeführten Prozeduren werden für wohlbekannt in der Technik gehalten und sind zur Bequemlichkeit des Leser vorgesehen. Die gesamte darin enthaltene Information wird hierin als Referenz aufgenommen.
BEISPIEL 1
Generierung von Spender-Anti-Dritte-Mäuse-CTLs: IL-2-Entzug verbessert Verarmung an Anti-Wirt-CTL-Vorläufern
Derzeit werden nicht-myeloablative Vorbehandlungsprotokolle bei älteren Leukämiepatienten erprobt, die HLA-identische Spender haben. Die Einpflanzung wird bei diesen Patienten durch die große Anzahl von T-Zellen vermittelt, die in den zur Transplantation verwendeten unabgeschiedenen Progenitorpräparaten aus peripherem Blut vorhanden sind. Diese Transplantate werden somit mit begrenzter Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion und mit Anti-Wirt-Reaktivität assoziiert, die zur Myeloablation von Wirthämatopoese führt. Für Patienten, die keinen vollständig passenden Spender haben, ist jedoch die T-Zellen-Toxizität ausgesprochener und relativ unakzeptabel. Das Entfernen alloreaktiver T-Zellen aus dem Transplantatimpfstoff wird wahrscheinlich die Einpflanzungspotenz schwächen und zu einer hohen Rate von Transplantatabstoßung führen. Als solches, und wie in diesem Beispiel beschrieben, wurden Anti-Dritte-CTL-Präparate, die frei von Zellen waren, die in der Lage sind, zu Anti-Wirt-CTLs heranzureifen, erstellt, um die Abstoßungsrate zu verringern und die Auslösung von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion zu verhindern.
Während die vorliegende Erfindung auf die Praxis reduziert wurde und wie hierin spezifisch gezeigt ist, haben die Erfinder entdeckt, dass CTL-Vetozellpräparate eines Spendertyps durch Stimulierung gegen Stimulatoren von dritter Seite durch anfänglichen Entzug von exogenem IL-2 effektiv an Alloreaktivität gegen Wirtszellen verarmt werden können. Diese Verarmung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass nur aktivierte CTL-Vorläufer (CTs) in der Lage sind, den IL-2-Entzug in der Primärkultur zu überleben. Offensichtlich könnte dieses an Alloreaktivität gegen den Wirt verarmte CTL-Präparat potentiell die Auslösung von Spendertypchimärentum ohne Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion in sublethal bestrahlten Empfängern erleichtern.
Zusätzlich untersucht diese Studie die Mechanismen, die für die von nicht-alloreaktiven Anti-Dritter-CTLs vermittelter Vetoaktivität verantwortlich sind.
Materialien und Verfahren:
Tiere:
Es wurden 6–12 Wochen alte weibliche Mäuse verwendet. C3H/HeJ, BALB/c, C57BL/6, gld/C3H/HeJ, lpr/C3H/HeJ wurden von Roscoe B. Jackson Memorial Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen. Ein Zuchtpaar transgener H-2^b-Mäuse, die das TCR-ab von dem CTL-Klon 2C mit Spezifität für L^d ausdrückten, wurde freundlicherweise von Janko Nikolic-Zugic (Sloan-Kettering, NY) zur Verfügung gestellt. Nachkommenschaft von diesen Tg-Mäusen und PO-Mäusen wurde im Tierzuchtzentrum des Weizmann-Instituts (Rehovot, Israel) gezüchtet. Alle Mäuse wurden in kleinen Käfigen gehalten (fünf Tiere in jedem Käfig) und mit sterilem Futter und saurem Wasser, das Cyprofloxacin (20 μg/ml) enthielt, gefüttert.
Herstellung nicht-alloreaktiever Spender Anti-Dritter CTLs:
Splenozyten von Balb/c-Mäusen (Spenderresponder) wurden geerntet und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt. Die Zellsuspensionen wurden mit Tris-gepuffertem Ammoniumchlorid behandelt, um rote Zellen zu entfernen, und die isolierten mononuklearen Zellen (2 × 10⁶/ml) wurden mit bestrahlten (20 Gy) C57BL/6- oder C3H/HeJ(Stimulatoren von dritter Seite)-Splenozyten (2 × 10⁶/ml) stimuliert und mit Tris-gepuffertem Ammoniumchlorid behandelt. Responder und Stimulatoren wurden in einem vollständigen Gewebekulturmedium (CTCM) auf 37°C in einem 5% CO₂/Luft-Heraeusinkubator inkubiert. 5 Tage nach dem Säen wurden 20 E/ml Human-rhIL-2 (Eurocetus, Mailand, Italien) der gemischten Lymphozytenreaktionskultur alle 24 Stunden zugesetzt, 2 Tage später wurde das Medium durch ein frisches Kulturmedium ersetzt. 10 Tage nach dem Säen wurden die MLR-Kulturen geerntet, fraktioniert auf Ficol-Paque plus (Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden), durch FACS auf ihren CD8-Gehalt analysiert und in unterschiedlichen Zellverhältnissen, wie hierin nachstehend im Abschnitt Ergebnisse beschrieben, den MLR-Kulturen zugesetzt.
MLR-Kulturen und Zytotoxizitätsassay:
Milzzellen von C3H/Hej-Mäusen (Responder) wurden geerntet und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt, wie oben beschrieben. Die Zellen (2 × 10⁶/ml) wurden dann mit bestrahlten (20 Gy) Balb/c-Splenozyten (2 × 10⁶/ml) oder mit 2 × 10⁶/ml bestrahlten (20 Gy) SJL-Splenozyten stimuliert. Vier-sechs Replikate pro Gruppe wurden in 96-Well-Platten mit U-Boden in 0,2 ml CTCM 6 Tage lang auf 37°C (5% CO₂-Atmosphäre) kultiviert. Aus SJL- oder Balb/c-Milzzellen (2 Tage in Gegenwart von 2 mg ConA/2 × 10⁶ Zellen/ml) generierte ConA-Blasten wurden mit ⁵¹Cr (NEN, Boston, MA.) markiert. Zellvermittelte Lyseassay wurde unter Verwendung variabler Anzahlen von MLR-Effektorzellen und 5000 Zielzellen in 96-Well-Platten mit V-Boden durchgeführt. Die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde nach einer Inkubation von 4 Stunden auf 37°C gemessen. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als eine spezifische Lyse, berechnet wie folgt: % spezifische Lyse = 100 × ((experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)). Die Standardabweichung (SD) von Replikatwerten betrug konsistent weniger als 10% des Mittelwerts.
Vetoaktivität nicht-alloreaktiver Spender-Anti-Dritter-CTLs:
Um zu ermitteln, ob Mäuse-nicht-alloreaktive-Spender-Anti-Dritte-CTLs Vetoaktivität besitzen, wurden Milzzellen von C3H/HeJ-Mäusen (2 × 10⁶/ml) 6 Tage lang mit bestrahlten (20 Gy) allogenen Milzzellen (2 × 10⁶/ml) von Balb/c(H-2-angepasst)- oder SJL(H-2-Fehlanpassung)-Mäusen inkubiert. Nicht-alloreaktive Spender-Anti-Dritte-Balb/c-CTLs wurden dem MLC mit einem Verhältnis von 1 : 100, 1 : 50 und 1 : 10 von Veto- zu Responderzellen zugesetzt. Die Abtötungsaktivität des Responder-CTL-p wurde durch ⁵¹Cr-Freisetzungsassay ermittelt.
Inhibierung des Vetoeffekts von CTLs durch Anti-CD8 mAb:
Veto-Anti-Dritte-CTLs von Balb/c-Ursprung wurden dem oben beschriebenen MLR auf einer Endkonzentration von 2% zugesetzt. Anti-CD8-monoklonale Antikörper (freundlicherweise von Uli Hamerling, Sloan-Kettering, NY zur Verfügung gestellt), die gegen Ly-2.2-Antigen gerichtet sind, das selektiv auf den -zellen und nicht auf den Effektorzellen ausgedrückt wird, wurde dem MLR mit unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt, wie in Ergebnisse beschrieben, und die Inhibierung des Vetoeffekts wurde überwacht.
Verarmung an Anti-H2^d-T-Zellen durch nicht-alloreaktive anti-Dritte-CTLs:
Milzzellen von 2C transgenen H-2^b-Mäusen, die die TRC-ab mit Spezifität für L^d-Mäuse (freundlicherweise von Janko Nikolic-Zugic, Sloan- Kettering, NY zur Verfügung gestellt) ausdrücken, wurden behandelt wie oben beschrieben. Die Zellen (2 × 10⁶/ml) wurden dann mit bestrahlten (20 Gy) Balb/c-Splenozyten (2 × 10⁶/ml) in Gegenwart von 2% oder 20% Veto-Anti-Dritte-CTLs stimuliert, die von Balb/c- oder von SJL(Hintergrundkontrolle)-Splenozyten stammten. Kulturen, die 20% oder 2% Veto-CTLs enthielten, wurden 48 Stunden beziehungsweise 5 Tage lang in 6-Well-Platten fortgesetzt. Die Verarmung von transgenen T-Zellen wurde durch Zytofluorometrie überwacht, welche den Gehalt an 2C-transgenen Zellen, die spezifisch durch den 1B2-Antikörper gefärbt waren, der gegen das klonotypische Anti-H-2L^dTCR gerichtet war, maß.
Zytoflowmetrie:
FACS-Analyse wurde unter Verwendung eines modifizierten Becton Dickinson FACScan durchgeführt. Fluoreszenzdaten wurden unter Verwendung von 3-Dekade-logarithmischer Amplifikation auf 25–50 × 10³ brauchbarer Zellen, bestimmt durch Vorwärtslichtstreuungsintensität, gesammelt. Die Zellen wurden mit einem CD8a (Ly-2)-FITC, CD3e-PE, CD95 (Fas)-FITC (Pharmingen) CD4-Qantum Red (sigma), 1B2 biotinierten (freundlicherweise von Janko Nikolic-Zugic, Sloan-Kettering, NY zur Verfügung gestellt) R-PE-Streptavidin (Jackson Immuno. Research Lab. Inc.) gefärbt.
Vektoren für den Gentransfer:
PLNGFR-Scheinvektor wurde konstruiert durch Subklonen von genverschlüsselungserhöhtem grünem Fluoreszenzprotein (EGFP, Clontech) von pEGFP-N1 (Clontech) zu EcoRI- und HpaI-Stellen von pLXSN, zur Verfügung gestellt von AD Miller, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee). PLNGFPFas-L war ebenfalls ein Derivat von pLXSN und wurde konstruiert durch Subklonen eines Fragments, das EGFR-Gen, innere Ribosomeintrittsstelle (IRES) und Mäuse-Fas-L cDNA in BamHI und XhoI-Stellen von pLXSN (LTR-EGFP-ISR-mFas-L-SV40p-NeoR) enthielt.
Verpacken retroviraler Vektoren und Virussupernant-Produktion:
Plasmides DNA wurde in ekotropische Mäuse-retrovirale Vektor-Verpackungszelllinie GP-E86 transfiziert und stabil transfizierte Zellen wurden mit G418 selektiert. Hoch-Titer-Verpackungszelllinien wurden durch Überprüfen individueller Kolonien isoliert. Retrovirus-Supernatant wurde gemäß Standardprozedur hergestellt.
Gentransfer in Splenozyten von Fas-L-mutierten C3H-gld-Mäusen:
50 E/ml Human-rhIL-2 wurden einer aus "gld"-Milzzellen generierten CTL-Kultur zugesetzt. Zwei Tage nach dem Zusatz wurden die stimulierten CTLs in RPMI-1640 resuspendiert, das 5 mg/ml Protaminsulfat und 50 E/ml rhIL-2 enthielt, und wurden mit viralem Supernatant inkubiert, das 3 Tage lang täglich zugesetzt wurde. Achtundvierzig Stunden nach dem letzten Zusetzen des viralen Supernatants wurden die infizierten Zellen in G418 (450 mg/ml) in Gegenwart von rhIL-2 (50 E/ml) eine Woche lang selektiert und dann auf ihre Vetoaktivität in MLR getestet, wie oben beschrieben.
Experimentelle Ergebnisse:
Vetoaktivität Anti-Dritter-CTLs:
Zur Evaluierung des Effekts von IL-2-Entzug auf die Anti-Wirt-Reaktivität nicht-alloreaktiver Anti-Dritter-CTLs wurden Balb/c(H-2^d)-Splenozyten stimuliert, in Gegenwart oder Abwesenheit von rekombinantem Human-IL-2 (rhIL-2), gegen bestrahlte (20 Gy) G57BL/6(H-2², von dritter Seite)-Splenozyten in MLR-Kultur für 4 Tage. Am zweiten Tag oder fünften Tag der Zellkultur wurde rhIL-2 zugesetzt und die Zellen wurden weitere sechs Tage behalten. Nach der Kultur wurden diese Zellen geerntet und auf ihre CTL-p-Häufigkeit gegen den beabsichtigten Wirt (C3H) oder die zur Stimulation verwendete dritte Seite (C57BL/6) getestet. Wie in 1 ersichtlich, konnte nachfolgend an IL2-Entzug für 4 Tage kein Anti-Wirt-CTLp erfasst werden, während eine signifikate Frequenz von Anti-Wirt-CTLp dokumentiert wurde, wenn IL2 der MLR-Kultur am zweiten Tag zugesetzt wurde.
Zur Evaluierung der Vetoaktivität solcher nicht-alloreaktiver C wurden Balb/c H-2^d-Splenozyten gegen bestrahlte (20 Gy) C57BL/6 H-2^b(von dritter Seite)-Splenozyten in MLR-Kultur 10 Tage lang stimuliert, wobei rhIL-2 nur am fünften Tag der Zellkultur zugesetzt wurde. Anschließend an die Kultivierung wurden diese Zellen geerntet und auf ihre Vetoaktivität in MLR-Kulturen von C3H/Hej H-2^k-Responderzellen (Wirttyp), die gegen bestrahlte Splenozyten vom Balb/c (Spendertyp) stimuliert waren, oder in einer SJL-Kultur (nicht-relevante Kontrolle, Typ H-2^s) getestet. Die von den Vetozellen auf die Responderzellen ausgeübte Inhibierung von Abtötungsaktivität wurde 6 Tage nach dem Kultivieren durch den ⁵¹Cr-Freisetzungsassay ermittelt.
Wie in 2a (17 verschiedene Experimente) und in 3 (ein repräsentatives Experiment) ersichtlich, inhibiert ein Zusatz von Zellen, die in einer Balb/c-CTL-Linie generiert sind, die gegen Zellen von dritter Seite gerichtet und in Abwesenheit von IL-2 kultiviert ist, die Abtötungsaktivität der Responderzellen (C3H/Hej), die gegen Balb/c-Splenozyten stimuliert waren. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte der Zusatz von Zellen aus derselben CTL-Linie zu Responderzellen (C3H/Hej), die gegen SJL-Splenozyten stimuliert waren, die Abtötungsaktivität des Responders nicht. Die durch diese Ergebnisse enthüllte Spezifität suggeriert, dass die gegen Dritte gerichtete nicht-alloreaktiven CTLs tatsächlich Vetoaktivität besitzen.
Die in 2b gezeigte Dosis-Reaktionskurve suggeriert, dass die Anti-Dritte-CTLs eine sehr deutliche Vetoaktivität besitzen, wobei sie eine vollständige Inhibierung bei einem Verhältnis von Veto- zu Responderzellen von 1 : 50 erzielen. Der Zusatz von Vetozellen in 5-fach höheren Konzentrationen führt zur nicht-spezifischen Eliminierung von CTL-ps, die auf Ziele gerichtet sind, die nicht die Spendertyp-H-2-Determinanten teilen (Daten nicht dargestellt).
Eine optimale spezifische Inhibierung wird erreicht bei Zusatz von Anti-Dritte-CTLs (bei einem Verhältnis von Veto- zu Responderzellen von 1 : 50) zwischen Tag 0 und Tag 2. Danach ist der Vetoeffekt deutlich verringert (3). Somit, wie zuvor suggeriert, inhibieren oder beseitigen Vetozellen möglicherweise die Responderzellen auf dem Vorläuferniveau². Sobald diese CTL-Vorläufer sich zu differenzierten CTLs entwickeln, können die Vetozellen ihre Wirkung nicht mehr ausüben.
Zusätzlich bestätigten, durch Verwendung monoklonaler Antikörper, die gegen die CD8a Ly-2.2-Allele gerichtet sind, die auf den Anti-Dritte-CTLs, jedoch nicht auf den Responderzellen ausgedrückt werden, frühere Beobachtungen¹⁸, dass die CD8-Moleküle der Vetozellen sich an der Beseitigung der Responderzellen beteiligen (4).
Die Rolle von Fas-Fas-L-Apoptose:
Die Rolle von Apoptose bei der Responderzellenbeseitigung wurde durch zwei Herangehensweisen bestätigt. (i) der Zusatz des Apoptose-Inhibitors (BD-FmK) zu der MLR-Kultur führte zu einer vollständigen Inhibierung des Veto-Effekts (Daten nicht gezeigt); und (ii) der Zusatz von Anti-Dritte-CTLs von Balb/c (H-2^d)-Ursprung zu einer MLR-Kultur von TCR-transgenen C57B1/6-Respondern, die das gegen H-2^d gerichtete 2C TCR trugen, führte zu einer deutlichen und spezifischen Beseitigung der transgenen Responder bei Stimulierung gegen Balb/c-Stimulatoren (5a–c).
Unter Berücksichtigung dessen, dass zwei deutlich getrennte Hauptapoptosemechanismen, nämlich perforinvermittelte oder Fas-Fas-L-vermittelte Apoptose, zuvor beschrieben worden sind, wurden zwei unterschiedliche nicht-alloreaktive Anti-Dritte-CTL-Linien von Splenozyten von Fas-L-defizientem Stamm (C3H-gld, H-2^k) oder von Splenozyten von perforin-defizienten Mäusen (PO, H-2^bd) hergestellt. C3H-gld- oder PO-Splenozyten wurden gegen bestrahlte C57BL/6-H-2^b-beziehungsweise DBA/1H-2^q-Splenozyten stimuliert, wie für Wildtypsplenozyten beschrieben (Kultivierung für 10 Tage, ohne den Zusatz von exogenem rhIL-2 während der ersten 4 Tage) beschrieben. Die Verwendung von Vetozellen von gld-C3H/Hej(H-2^k-Ursprung) und von PO (H-2^bd-Ursprung) machte Veränderungen in der Gestaltung der verwendeten MLR-Responder und Stimulatoren erforderlich. Somit wurden die gld-mutierten Anti-Dritte-CTLs zu Masse-MLR-Kulturen zugesetzt, worin Balb/c-Responder gegen C3H/Hej-Splenozyten stimuliert wurden. Die PO-Knockout-Anti-Dritte-CTLs wurden zu Massen-MLR-Kulturen zugesetzt, worin C3H/Hej-Responder gegen PO- oder SJL-Splenozyten stimuliert wurden.
Wie in 6a ersichtlich ist, fehlte es den Anti-Dritte-CTLs, die von C3H-gld stammten, an Vetoaktivität, während die von perforin-defizienten Mäusen stammenden CTLs eine signifikante Vetoaktivität aufwiesen.
Zusätzliche Beweise für die Rolle von Fas-L bei dem Vetoeffekt wurden durch Gentransferexperimente erbracht, worin gld-Anti-Dritte-CTLs unter Verwendung eines retroviralen Vektors mit Fas-L transfiziert wurden. Wie in 6b ersichtlich, wiesen solche transfizierten CTLs im Vergleich zu scheininfizierten Anti-Dritte-CTLs eine deutliche Vetoaktivität auf.
Unter Anwendung einer gleichartigen Herangehensweise wurde die Rolle von Fas in der durch Anti-Dritte-CTLs ausgelösten Vetoaktivität untersucht. Wie in 7a ersichtlich, scheiterte, wenn Fas-defiziente C3H-lpr-Splenozyten gegen Balb/c in der primären MLR-Kultur stimuliert wurden, der Zusatz von Balb/c-Anti-Dritte-CTLs daran, die primären CTLs zu inhibieren. Im Gegensatz dazu wiesen diese Zellen Vetoaktivität auf, wenn sie zu primären MLR-Kulturen von Wildtyp-C3H-Respondern zugesetzt wurden. Gleichermaßen inhibierte ein Fas-Antagonist (Fas-Fusionsprotein) auch den Vetoeffekt von Anti-Dritte-CTLs (7b).
FACS-Analyse von Fas während einer typischen MLR von 2C-Splenozyten gegen Balb/c-Stimulatoren (8a–d) enthüllte, dass der Fas-Ausdruck an CD8⁺1B2⁺-T-Zellen bei 48 Std. deutlich erhöht ist (8b). Der Zusatz von Balb-Anti-C3H-(8c), jedoch nicht SJL-Anti-C3H-CTLs (8d) führte zu einer deutlichen Beseitung der Fas⁺-aktivierten CD8-T-Zellen, wodurch die kräftige Vetoaktivität und die bemerkenswerte Spezifität, mit der die Anti-Dritte-Veto-CTLs, die Fas-L²⁵, ²⁹ ausdrücken, in der Lage sind, Fas⁺-T-Zellen selektiv zu erkennen und abzutöten, die gegen ihre H-2-Antigene gerichtet sind, illustriert wird.
Insgesamt suggerieren diese Ergebnisse, dass der Vetoeffekt nicht-alloreaktiver Anti-Dritte-CTLs durch das simultane Ausdrücken von CD8 und Fas-L auf den Veto-CTLs und das Audrücken von Fas auf den Effektor-CTL-ps, die gegen die von den Vetozellen präsentierten Antigene gerichtet sind, vermittelt wird.
BEISPIEL 2
Generierung von Spender-Anti-Dritte-Human-CTLs, die an Anti-Wirt-CTL-Vorläufern verarmt sind
Nachfolgend an die oben beschriebene Demonstration, dass Anti-Dritte-CTLs an Anti-Wirt-CTLp verarmt werden können, ist ein Versuch unternommen worden, diese Herangehensweise auf Humanbedingungen anzuwenden. In dieser Hinsicht wird gewürdigt werden, und ist unter Wissenschaftlern in der Technik anerkannt, dass es keineswegs vorhersagbar ist, dass eine bei Mäusen effektive immungenetische Herangehensweise bei Menschen eine ähnliche Effektivität hätte.
Materialien und Verfahren
Erstellung von Anti-Dritte-CTLs:
Anti-Dritte-CTLs wurden hergestellt durch Stimulieren normaler Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL), die von einem menschlichen Spender gewonnen waren, gegen eine Epstein-Barr-Virus(EBV)-transformierte Zelllinie von bekanntem HLA-Typ (hierin nachstehend Stimulator A). PBls wurden in Wachstumsvollmedium + 10% FCS (CM-RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamin + 100 E/ml Penicillin + 0,1 mg/ml Streptomycin + 2 mM HEPES + 1 mM Natriumpyruvat + 0,1 mM nichtessentielle Aminosäuren + 5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol) auf 2 × 10⁶ Zellen/ml kultiviert und wurden mit 5 × 10⁴ Zellen/ml bestrahlten (10.000 rad) Stimulatoren stimuliert.
Nach 10 Tagen gemeinsamer Kultur wurden die Zellen geerntet und lebende Zellen wurden auf Ficoll-Pacque-Gradienten isoliert und restimuliert, 5 × 10⁶ Zellen/ml mit 1,5 × 10⁵ Zellen/ml Stimulatoren. Vier Tage später wurden die Kulturen mit hrIL-2 auf 20 E/ml behandelt, zum ersten Mal.
Danach wurden die Kulturen dreimal pro Woche behandelt, jedesmal mit 20 E/ml rhIL-2. Die dritte Behandlung umfasste auch den Zusatz bestrahlter Stimulatoren mit einem Verhältnis von 4 : 1.
Die ursprünglich gegen Stimulator S stimulierte CTL-Linie wurde auf CTL-p-Responder gegen den ursprünglichen Stimulator S oder gegen Stimulator Nr. 38, der den beabsichtigten Wirt darstellt, getestet.
Die Zellen aus dieser Anti-Dritte-CTL-Linie wurden entweder mit Stimulator S oder mit Stimulator 38 auf 1 × 10⁶ Zellen/ml für 5 Tage kultiviert. Die Zellen wurden dann aus der Massenkultur geerntet und serielle Verdünnungen von CTL-Responderzellen (4 × 10⁴ bis 0,2 × 10³) per Well wurden mit den ursprünglichen bestrahlten Stimulatoren hergestellt. Jede Well enthält 10⁵ bestrahlten (30 Gy) Stimulator 38 oder 2 × 10⁴ (100 Gy) bestrahlten Stimulator S. Die Kulturen wurden für 7 Tage in Vollmedium + 1% + 20 E/ml rhIL-2 inkubiert.
Die Zytotoxizität wurde mit 5 × 10³ ⁵¹Cr-markierten Blasten (Zielzellen) von Spendern S, Nr. 38 und Nr. 40 (Kontrolle für nichtspezifische Abtötung) getestet.
Normale unabgeschiedene PBLs von dem ursprünglichen Spender der Zelllinie wurden parallel dazu getestet.
Experimentelle Ergebnisse:
Nicht-alloreaktive Human-CTL-Linien wurden in vitro durch Stimulieren von PBLs mit EBV-transformierter Zelllinie von bekanntem HLA-Typ erstellt. Während in unbehandeltem PBL von Spender A ein signifikanter Gehalt an Anti-Wirt-CTLp demonstriert wurde (9), wurde festgestellt, dass die aus PBL desselben Spenders A generierte Anti-Dritte-CTL-Linie deutlich an solchen Zellen verarmt war (10). Diese Ergebnisse deuten an, dass das CTL-Präparat dieses Beispiels an T-Zellen verarmt ist, die das Potential haben, zu Anti-Wirt-CTLs (alloreaktiven CTLs) heranzureifen, und ist daher vorteilhaft als Mittel zur Verbesserung von Transplantatakzeptanz bei Menschen.
Schlussfolgerungen:
Herangehensweisen des Standes der Technik, die von T-Zellen-Stimulation mit genau den Antigenen, gegen die eine Toleranz erwünscht ist, Gebrauch machen, könnten ein gewisses Risiko der Erzeugung geprägter CTLs beinhalten, falls eines der CTL-ps der Beseitung oder Anergieauslösung entkommt. Sobald solche Anti-Wirt-CTLs generiert sind, ist es sehr schwierig, ihre Alloreaktivität in vivo zu unterdrücken.
Eine rezentere Herangehensweise demonstrierte, dass eine "Megadosis" von Zellen angewendet werden kann, um Toleranz bei sublethal bestrahlten Mäusen auszulösen und als solches effektiv die deutliche Resistenz, die von der großen Anzahl von die sublethale Vorbehandlung überlebenden Lymphozyten präsentiert wird, zu überwinden. Jedoch könnte die Anzahl von Zellen, die erforderlich ist, um dieses wünschenswerte Ziel zu erreichen, von Humanspendern nicht leicht gesammelt werden.
Nicht-alloreaktive Anti-Dritte-CTLs, die zur Verbesserung von Transplantatakzeptanz bei Mäusen verwendet werden können, wurden ebenfalls dargestellt, es wurde jedoch bald erkannt, dass solche CTL-Präparate nicht an T-Zellen verarmt sind, die in der Lage sind, sich nach der Transplantation zu Anti-Wirt-CTLs zu entwickeln, die Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion auslösen.
Die vorliegende Forschung demonstriert, dass Spender-Anti-Dritte-CTLs an Anti-Wirt-Alloreaktivität verarmt werden können, wenn während der Anfangstage der Massenkultur mit den Stimulatorzellen kein exogenes IL-2 bereitgestellt wird. Solche nicht-alloreaktiven CTLs können die Einpflanzung, ohne Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion, beispielsweise von T-Zellen-verarmtem Knochenmark, das von demselben Spender stammt, verbessern.
Die vorliegende Studie enthüllt weiter den für die deutliche kräftige Vetoaktivität solcher Anti-Dritte-CTLs verantwortlichen Mechanismus.
Durch Nutzung von Anti-CD8-Antikörpern demonstriert die vorliegende Studie, dass das Ausdrücken von CD8 an den CTLs entscheidend ist für die CTL-p-Erkennung.
Durch Verwenden von Anti-Dritte-nicht-alloreaktiven CTLs, die aus Milzzellen verschiedener mutierter Mäuse generiert sind, demonstriert die vorliegende Studie, dass die Vetoaktivität dieser Zellen durch Apoptose mittels des Fas-Fas-L-Systems und nicht durch den Perforinmechanismus vermittelt wird.
Somit suggerieren die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass das simultane Ausdrücken von sowohl CD8 als auch Fas auf der CTL-Oberfläche und das Ausdrücken von Fas auf dem Effektor-CTL-p eine unerlässliche Bedingung für die Vetoaktivität ist.
BEISPIEL 3
Das Primatenmodell
Materialien und Verfahren
Affen:
Weibliche Cynomolgusaffen (im Alter von 1,5–2 Jahren), die 1,5–2,5 kg wiegen, werden als Knochenmarkempfänger verwendet und MLC-fehlangepasste männliche Cynomolgusaffen mit einem Gewicht von 6–9 kg werden als Spender verwendet.
Vorbehandlungsbedingungen:
Ein angewendetes sublethales, auf Bestrahlung basiertes Protokoll ist wie folgt: Fludarabin (FLU) 40 mg/m² von Tag –9 (vor der Transplantation) bis zu Tag –5 (Gesamtmenge 200 mg/m²); Kaninchen-Anti-Thymozytglobulin (ATG) 5 mg/kg von Tag –7 bis –3, und 6,5 oder 7 Gy TBI (Dosisrate 0, 15 Gy/min), abgegeben an Tag –1.
Sammeln mononuklearer Zellen aus peripherem Blut:
RhG-CSF (20 mg/kg/Tag) wird Spenderaffen über eine Zeitspanne von fünf Tagen in zwei täglichen subkutanen Injektionen verabreicht. Zwei Leukaphereseprozeduren werden zwischen den Tagen 4 und 5 durchgeführt.
Spender und Leukapherese:
Gesunde männliche Cynomologusspender werden einem doppelten oder dreifachen Satz von 100-Minuten-Leukophorese auf einem Cobe Spectra Zellseparator unterzogen, wie von Hillyer et al. [Referenz Nr. 27] beschrieben, mit den folgenden kleineren Abänderungen das Säure, Citrat, Dextrose(ACD)-zu-Blut-Verhältnis ist 12 14 und die Zentrifugengeschwindigkeit ist 1.600 UpM.
Bearbeitung der mononuklearen Zellen aus peripherem Blut:
Peripherblut-Vorläuferzellen(PBPC)-Präparate werden unter Verwendung der E-Rosetting-Technik an T-Lymphozyten verarmt, wie zuvor beschrieben²⁶. Stammzellen werden dann durch positive Selektion gereinigt, unter Verwendung einer Avidin-Biotin-Immunadsorptionssäule (CEPRATE SC System, CellPro, Bothell, WA), gemäß den Angaben des Herstellers. Die Anzahl von CD34⁺-Zellen wird sowohl in Gesamtblut als auch in den Leukaphereseprodukt durch Flowzytometrie gemessen. Die T-Lymphozyten vor und nach der T-Zellenverarmung werden ebenfalls gemessen, unter Verwendung eines phycoerythringekoppelten Anti-CD2-monoklonalen Antikörpers. Aliquote werden für differentielle Zellzählungen, mAb-Einfärbung und GFU-GM-Assay in jeder Bearbeitungsstufe genommen.
Unterstützende Versorgung:
Die Affen werden in Schichtluftstromkäfigen versorgt, bis die Neutrophilenzählung sich auf 1 × 10⁹ erholte. Alle Affen erhalten Cyproxin und Amphotericin B als Darmpräparat, kombinierte Antibiotika als Prophylaxe gegen bakterielle Infektion seit dem Tag des Transplantats, und Fluconazol als Antifungusprophylaxe. Acyclovir wird zur Verhinderung viraler Infektion verabreicht. Ganzblut- oder Blutbestandteilprodukte werden gemäß Hämatokrit und Blutplättchenzählung des Affen als Transfusion verabreicht. Alle Blutprodukte werden vor der Transfusion mit 25–30 Gy bestrahlt und gefiltert.
Einpflanzung und Chimärentumbestimmung:
Die Zeit bis zur Einpflanzung wird getestet, indem der Tag nach der Transplantation ermittelt wird, an dem die Affen einen Gehalt von 0,5 Neutrophilen × 10⁹/L und 25 × 10⁹ Blutplättchen/L aufwiesen, unabhängig von der Transfusionsunterstützung. Chimärentum wird durch quantitative Polymerasekettenreaktion (PCR) getestet. Kurzfristig werden die PCR-Produkte 3% MetaPhor-Agarose(FMC)-Gel unterzogen. Die Dichte jedes Bandes für Y-spezifische DNA und Konkurrenz-DNA wird durch Verwendung computerisierter Dichtemesser gemessen und das Zielverhältnis (Y-spezifisch)/Konkurrenz-DNA (T/C) für jede Probe wird berechnet. An dem Punkt, an dem Y-spezifische und Konkurrenz-DNA im Gleichgewicht sind (d.h. Verhältnis = 1,0), ist die Anfangsmenge Y-spezifischer DNA vor PCR gleich der bekannten Anfangsmenge von Konkurrenz-DNA.
Generierung von Spender-Anti-Dritte-CTLs:
Eine etwas modifizierte Vorgehensweise wird zur Herstellung von Affen-Spender-Anti-Dritte-CTLs verwendet. Peripherblutzellen von Spender- und dritten Affen werden auf Ficoll-Paque plus fraktioniert und die isolierten mononuklearen Zellen, 1 × 10⁶/ml Responderzellen und 2 × 10⁶/ml bestrahlte (20 Gy) Stimulatoren von dritter Seite, werden 10 Tage in CTCM-Medium kultiviert. Vier Tage Stunden nach dem Aussäen wird Human-rhIL-2 (20 E/ml, Eurocetus, Mailand, Italien) alle 24 Stunden zugesetzt.
BEISPIEL 4
Präparat aus Human-CD8+-CTLs wird durch Entfernen von CD4+- und CD56+-Zellen verbessert
Es wurde beobachtet, dass der Gehalt von CD8+-Zellen in den im Wesentlichen wie oben beschrieben hergestellten CTL-Kulturen äußerst variabel ist. Daher findet die Selektion von CD8+-Zellen durch Entfernung (negative Selektion) von CD4+- und CD56+-Zellen statt, unter Verwendung von an Magnetkügelchen gekoppelten Antikörpern. Wie in den 11a–b ersichtlich ist, wiesen die durch diese Prozedur erhaltenen Zellen eine sehr starke Vetoaktivität mit einem Verhältnis von Veto- zu Effektorzelle von 1 : 25 und 1 : 50 auf.
Behandlung von Spenderzellen:
Anti-Dritte-CTLs wurden hergestellt durch Stimulieren von Spenderlymphozyten aus peripherem Blut gegen eine EBV-transformierte, vom Menschen gewonnene Zelllinie eines bekannten HLA-Typs (Stimulatoren) in 24-Well-Platten. Die Peripherblut-Lymphozyten wurden in Wachstumsvollmedium kultiviert, das mit 10% fötalem Kälberserum (CM-RPMI 1640, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin, 2 mM Hepes, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 5 × 10^–5 M β2-Mercaptoethanol) auf 1 × 10⁶ Zellen/ml angereichert war, und mit 2,5 × 10⁴ Zellen/ml bestrahlten (10.000 Rad) Stimulatoren stimuliert, in 250 ml-Kolben bei einem Volumen von 50 ml.
Nach 10 Tagen gemeinsamer Kultur wurden die Zellen geerntet und lebende Zellen wurden auf Ficollgradient isoliert und restimuliert, die Zellen wurden resuspendiert auf eine Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen/ml und wurden mit 1,5 × 10⁵ Stimulatorzellen/ml restimuliert.
Vier Tage später wurden die Zellen mit MACS-Kügelchen (Miltenyi Biotec) auf CD4+- und CD56+-Zellen negativ selektiert. Die ungebundenen Zellen wurden auf 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und mit 0,33 × 10⁶ Stimulatorzellen/ml restimuliert. Auf dieser Stufe (nach 2 Wochen in Kultur) wurden die Zellen mit Interleukin-2 (IL-2, Proleukin) auf 600 Einheiten/ml behandelt.
Danach wurden die Kulturen dreimal pro Woche behandelt, jedesmal mit 600 E/ml IL-2. Das dritte Mal umfasste auch den Zusatz bestrahlter Stimulatoren mit einem Verhältnis von 4 : 1. Es ist anzumerken, dass während der ersten zwei Kulturwochen kein IL-2 zu den Zellen zugesetzt wurde.
BEISPIEL 5
Experimente an Menschen – Fallbericht
Behandlung von Spenderzellen:
Anti-Dritte-CTLs wurden hergestellt durch Stimulieren von Spenderlymphozyten aus peripherem Blut gegen EBV-transformierte, von Menschen gewonnene Zelllinie eines bekannten HLA-Typs (Stimulatoren), wie in Beispiel 4 oben beschrieben. Die erhaltenen CTLs wurden einem Patienten infundiert, wie nachstehend beschrieben, um das Immunsystem des Patienten tolerant zu machen, um die Einpflanzung von Stammzellen darauf zu erleichtern.
Der Patient wurde im Mai 1998 mit Mantelzellenlymphom diagnostiziert. Der Patient wurde mit 4 Runden PROMACE behandelt, was zu einer Teilremission führte. Während des Monats Dezember 1998 wurde der Patient mit einer hohen Dosis Cytoxan (CTX) behandelt, und autologe Peripherblut-Stammzellen wurden geerntet und gefriergelagert.
Während des Monats März 1999 erhielt der Patient ein autologes Transplantat nach Vorbehandlung mit TBI und Thiotepa. Danach wurde eine vollständige Remission erzielt.
Während des Monats Oktober 1999 erlitt der Patient einen Rückfall mit lympho-plasmacytoider Infiltration des Knochenmarks. IgG/k-Serumgehalte wurden durch Plasmapherese und Dexametason bis Juli 2000 behandelt.
Während des Monats Oktober 2000 erhielt der Patient ein allogenes Megadosis-Stammzellentransplantat von einem nicht vollständig übereinstimmenden haploidentischen Kind. Der Patient wurde vorbehandelt mit Melphalan 80 mg/qm am Tag –12, Thiotepa 7 mg/kg Körpergewicht an Tag –11, Fludarabin 40 mg/qm von Tag –9 bis –6, Fresenius ATG 2,5 mg/kg Körpergewicht von Tag –9 bis Tag –6. Am Tag –1 wurden die Anti-Dritte-CTLs mit einer Zelldosis von 6,1 × 10⁶ CTL/kg Empfängerkörpergewicht infundiert. Am Tag 0 wurden die Spenderstammzellen mit einer Dosis von 9,7 × 10⁶ CD34+-Zellen pro kg Körpergewicht infundiert (bearbeitet durch CliniMACS, und 40.000 CD3T-Zellen/kg Körpergewicht umfassend). Sowohl Vorbehandlung als auch CTL-Infusion wurde gut vertragen, trotz der vor der Transplantation vorliegenden kardio-pulmonären Kompromittierung dieses alten Patienten.
Neutrophileinpflanzung (500/mm³) wurde zuerst am Tag +8 festgestellt, 980/mm³ am Tag +11, 2.760/mm³ am Tag +14, und 5.370/mm³ am Tag +21.
Blutplättchenrekonstitution (35.000/mm³) wurde zuerst am Tag +18 erzielt.
CMV-Antigenämie wurde positiv (nur 4 Zellen) am Tag +40 (Patient war nicht unter prophylaktischer Behandlung).
Gammapathie bei Elektrophorese, typisch für Lymphompatienten, wurde auf normale Werte reduziert (vor der Transplantation – 33,8%, 21% am Tag +20 nach der Transplantation).
Der IgG-Wert war auf normale Werte reduziert (vor der Transplantation – 2330 mg/dl, 1500 mg/dl nach der Transplantation).
FISH-Analyse am Tag +20 nach der Transplantation enthüllte, dass alle Zellen im peripheren Blut und im Knochenmark von Spenderursprung waren.
Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit spezifischen Ausführungen davon beschrieben worden ist, ist evident, dass den Fachleuten in der Technik viele Alternativen, Modifikationen und Variationen deutlich sein werden. Dementsprechend ist beabsichtigt, all solche Alternativen, Modifikationen und Variationen mit einzubeziehen, die unter Inhalt und die breite Reichweite der beigefügten Ansprüche fallen. Alle hierin zitierten Veröffentlichungen werden in ihrer Gesamtheit als Referenzen aufgenommen.
REFERENZEN

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Claims

Eine Dosis, die nicht-alloreaktive, allogene anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) umfasst, die einem Empfänger verabreicht werden können, wenn ein von einem Spender gewonnenes Transplantat in den Empfänger transplantiert wird, wobei besagte nicht-alloreaktive anti-Dritte CTLs (i) aufgrund dessen, dass ihnen ein Faktor genommen ist, der zur CTL-Reifung erforderlich ist und der von heranreifenden CTLs abgesondert wird, im Wesentlichen verarmt sind an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, und (ii) in der Lage sind, die Abstoßung des Transplantats durch den Empfänger zu verhindern.
Eine Dosis, die nicht-alloreaktive, allogene anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) umfasst, die dem Empfänger verabreicht werden können, wenn ein von einem Spender gewonnenes Transplantat in einen Empfänger transplantiert wird, wobei besagte nicht-alloreaktive anti-Dritte CTLs erzeugt werden durch: (i) Lenken von T-Lymphozyten des Spenders gegen ein Antigen oder Antigene von dritter Seite; und (ii) Verarmen von T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, indem ihnen ein Faktor genommen wird, der für die CTL-Reifung erforderlich ist und der von heranreifenden CTLs abgesondert wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Verbesserung sowohl der Transplantatabstoßung durch den Empfänger als auch Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen verarmt ist.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch die Wegnahme eines Faktors bewerkstelligt wird, der (i) zur CTLs-Reifung erforderlich ist; und (ii) von heranreifenden CTLs abgesondert wird.
Die Dosis von Anspruch 6, wobei besagter Faktor ein Zytokin ist.
Die Dosis von Anspruch 7, wobei besagtes Zytokin IL2 ist.
Die Dosis von Anspruch 8, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Dosis von Anspruch 8, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen verarmt ist.
Die Dosis von Anspruch 8, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsmarkierung, gefolgt von markierungsbasierter Abscheidung, bewerkstelligt wird.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsreinigung bewerkstelligt wird.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei besagter Spender aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einem allogenen Spender, entweder HLA-identisch oder HLA-nicht-identisch, und einem xenogenen Spender.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei besagter Empfänger ein Mensch ist.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei besagtes Transplantat aus der aus Zellen, einem Gewebe und einem Organ bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Empfänger unter sublethalen, lethalen oder supralethalen Bedingungen vorbehandelt wird.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei Empfänger und Spender beide Menschen sind.
Die Dosis der Ansprüche 1 oder 2, wobei besagtes Antigen oder Antigene von dritter Seite aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Zellen von dritter Seite, einem Zellantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Proteinextrakt, einem gereinigten Protein und einem synthetischen Peptid, dargestellt durch autologe oder nicht-autologe darstellende Zellen.
Die Dosis von Anspruch 19, wobei besagtes virales Antigen ein EBV- oder ein CMV-Antigen ist.
Die Dosis von Anspruch 19, wobei besagtes gereinigtes Protein Ovalbumin ist.
Die Dosis von Anspruch 19, wobei besagte Zellen von dritter Seite allogene oder xenogene Zellen in Bezug auf den Empfänger sind.
Die Dosis von Anspruch 22, wobei besagte allogene Zellen HLA-Antigene aufweisen, die sich von denen des Spenders unterscheiden, die jedoch nicht kreuzreaktiv mit den Empfänger-HLA-Antigenen sind.
Die Dosis von Anspruch 22, wobei besagte allogene Zellen stimulatorische Zellen sind, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, die gereinigt sind aus peripheren Blutlymphozyten, Milz oder Lymphknoten, zytokinmobilisierten PBLs und in vitro expandierten antigendarstellenden dentritischen Zellen (APC).
Die Dosis von Anspruch 2, wobei die Schritte (i) und (ii) zur selben Zeit bewerkstelligt werden.
Die Dosis von Anspruch 2, wobei Schritt (i) vor oder nach Schritt (ii) bewerkstelligt wird.
Die Verwendung der Dosis von Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Empfängers, der an einer Erkrankung leidet, die die Transplantation unreifer hämatopoetischer Zellen erfordert, wobei die Behandlung folgendes umfasst: (a) Vorbehandeln des Empfängers unter sublethalen, lethalen oder supralethalen Bedingungen; (b) dem Empfänger Verabreichen einer ersten Dosis einschließlich unreifer hämatopoetischer Zellen einschließlich Stammzellen von einem allogenen oder xenogenen Spender; und vorausgesetzt, dass die Zellen nicht von menschlichen Embryos gewonnen sind, (c) dem Empfänger Verabreichen einer zweiten Dosis einschließlich nicht-alloreaktiver allogener anti-Dritter zytotoxischer T-Lymphozyte (CTLS), wobei besagte CTLs (i) im Wesentlichen, aufgrund Wegnahme eines Faktors, der zur CTL-Reifung erforderlich ist und der von heranreifenden CTLs abgesondert wird, an T-Lymphozyten verarmt sind, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln; und ii) in der Lage sind, Abstoßung besagter erster Dosis durch den Empfänger zu verhindern.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen verarmt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei beasgte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Wegnahme eines Faktors bewirkt wird, der (i) zur CTLs-Reifung erforderlich ist; und (ii) von heranreifenden CTLs abgesondert wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei besagter Faktor ein Zytokin ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 32, wobei besagtes Zytokin IL2 ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 33, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 33, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen verarmt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 33, wobei besagte Dosis im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen verarmt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsmarkierung, gefolgt von markierungsbasierter Abscheidung, bewerkstelligt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei die Verarmung an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsreinigung bewerkstelligt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei besagter Spender aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einem allogenen Spender, entweder HLA-identisch oder HLA-nicht-identisch, und einem xenogenen Spender.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Empfänger ein Mensch ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei sowohl Empfänger als auch Spender Menschen sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei besagtes Antigen oder Antigene von dritter Seite aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Zellen von dritter Seite, einem Zellantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Proteinextrakt und einem gereinigten Protein.
Die Verwendung gemäß Anspruch 42, wobei besagtes virales Antigen ein EBV- oder ein CMV-Antigen ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 42, wobei besagtes gereinigtes Protein Ovalbumin ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 42, wobei besagte Zellen von dritter Seite allogene oder xenogene Zellen in Bezug auf den Empfänger sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 45, wobei besagte allogene Zellen HLA-Antigene haben, die von denen des Spenders unterschiedlich sind, die jedoch nicht kreuzreaktiv mit den Empfänger-HLA-Antigenen sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 45, wobei besagte allogene Zellen stimulatorische Zellen sind, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, die gereinigt sind aus peripheren Blutlymphozyten, Milz oder Lymphknoten, zytokinmobilisierten PBLs und in vitro expandierten antigenvorlegenden dendritischen Zellen (APC).
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei besagte unreife hämatopoetische Zellen einschließlich Stammzellen aus dem Knochenmark, mobilisiertem peripherem Blut, fötaler Leber, Dottersack und/oder Nabelschnurblut des Spenders gewonnen sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 48, wobei besagte mobilisierte periphere Blutzellen durch Leukapherese peripheren Bluts des Spenders nach Stimulation mit einem geeigneten Zytokin erhalten werden.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei besagte unreife hämatopoetische Zellen T-Zellen-verarmte hämatopoetische Progenitorzellen sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 50, wobei besagte T-Zellen-verarmte hämatopoetische Zellen CD34+ – unreife Progenitor-hämatopoetische Zellen sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei ein Zellverhältnis zwischen besagten zytotoxischen T-Lymphozyten und besagten unreifen hämatopoetischen Zellen einschließlich Stammzellen zumindest 1 bis 100 beträgt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei die Schritte (b) und (c) zur selben Zeit bewerkstelligt werden.
Die Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei Schritt (b) vor oder nach Schritt (c) bewerkstelligt wird.
Ein Verfahren zur Herstellung nicht-alloreaktiver anti-Dritter zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs), die im Wesentlichen verarmt sind an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) in vitro Stimulieren einer Zellpopulation, die allogene T-Lymphozyten umfasst, mit einem Antigen oder Antigenen von dritter Seite; und (b) Wegnahme von besagter Zellpopulation, die anti-Dritte-CTLs umfasst, eines Faktors, der zur CTL-Reifung erforderlich ist und der von heranreifenden CTLs abgesondert wird, wodurch nicht-alloreaktive anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) produziert werden, die im Wesentlichen verarmt sind an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln.
Das Verfahren von Anspruch 55, das weiterhin den Schritt des im Wesentlichen Verarmens an CD4-T-Zellen von besagten T-Lymphozyten umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 55, das weiterhin den Schritt des im Wesentlichen Verarmens an CD56-natürlichen Killerzellen von besagten T-Lymphozyten umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 55, das weiterhin den Schritt des im Wesentlichen Verarmens an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen von besagten T-Lymphozyten umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 55, wobei die Verarmung von T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, bewerkstelligt wird durch Wegnahme eines Faktors, der (i) zur CTLs-Reifung erforderlich ist; und (ii) von heranreifenden CTLs abgesondert wird.
Das Verfahren von Anspruch 59, wobei besagter Faktor ein Zytokin ist.
Das Verfahren von Anspruch 60, wobei besagtes Zytokin IL2 ist.
Das Verfahren von Anspruch 61, das weiterhin den Schritt des im Wesentlichen Verarmens an CD4-T-Zellen von besagten T-Lymphozyten umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 61, das weiterhin den Schritt des im Wesentlichen Verarmens an CD56-natürlichen Killerzellen von besagten T-Lymphozyten umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 61, das weiterhin den Schritt des im Wesentlichen Verarmens an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen von besagten T-Lymphozyten umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 55, wobei die Verarmung von T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsmarkierung, gefolgt von markierungsbasierter Abscheidung, bewerkstelligt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 55, wobei die Verarmung von T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, durch Affinitätsreinigung bewerkstelligt wird.
Das Verfahren von Anspruch 55, wobei besagtes Antigen oder Antigene von dritter Seite aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Zellen von dritter Seite, einem Zellantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Proteinextrakt und einem gereinigten Protein.
Das Verfahren von Anspruch 67, wobei besagtes virales Antigen ein EBV- oder ein CMV-Antigen ist.
Das Verfahren von Anspruch 67, wobei besagtes gereinigtes Protein Ovalbumin ist.
Das Verfahren von Anspruch 67, wobei besagte Zellen von dritter Seite allogene oder xenogene Zellen in Bezug auf den Empfänger sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 70, wobei besagte allogene Zellen HLA-Antigene haben, die von denen des Spenders unterschiedlich sind, die jedoch nicht kreuzreaktiv mit den Empfänger-HLA-Antigenen sind.
Das Verfahren von Anspruch 70, wobei besagte allogene Zellen stimulatorische Zellen sind, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, gereinigt aus peripheren Blutlymphozyten, Milz oder Lymphknoten, zytokinmobilisierten PbLs und in vitro expandierten antigendarstellenden dendritischen Zellen (APC).
Ein Zellpräparat zur Transplantation auf einen Empfänger, wobei das Zellpräparat nicht-alloreaktive, allogene anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) umfasst, die gegen ein Antigen oder Antigene von dritter Seite gerichtet sind, wobei das Zellpräparat im Wesentlichen verarmt ist durch (a) in vitro Stimulieren einer Zellpopulation, die allogene T-Lymphozyten umfasst, mit einem Antigen oder Antigenen von dritter Seite; und (b) Wegnahme von besagter Zellpopulation, die anti-Dritte-CTLs umfasst, eines Faktors, der zur CTL- Reifung erforderlich ist und der von heranreifenden CTLs abgesondert wird, wodurch nicht-alloreaktive anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) produziert werden, die im Wesentlichen verarmt sind an T-Lymphozyten, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln.
Das Zellpräparat von Anspruch 73, das im Wesentlichen an CD4-T-Zellen verarmt ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 73, das im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen verarmt ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 73, das im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen verarmt ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 73, wobei besagtes Antigen oder Antigene von dritter Seite aus der Gruppe gewählt ist bzw. sind, bestehend aus Zellen von dritter Seite, einem Zellantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Proteinextrakt und einem gereinigten Protein.
Das Zellpräparat von Anspruch 77, wobei besagtes virales Antigen ein EBV- oder ein CMV-Antigen ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 77, wobei besagtes gereinigtes Protein Ovalbumin ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 73, wobei besagte Zellen von dritter Seite allogene oder xenogene Zellen in Bezug auf den Empfänger sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 80, wobei besagte allogene Zellen HLA-Antigene haben, die von denen des Spenders unterschiedlich sind, die jedoch nicht kreuzreaktiv mit den Empfänger-HLA-Antigenen sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 80, wobei besagte allogene Zellen stimulatorische Zellen sind, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, die gereinigt sind aus peripheren Blutlymphozyten, Milz oder Lymphknoten, zytokinmobilisierten PBLs und in vitro expandierten antigendarstellenden dendritischen Zellen (APC).
Ein Zellpräparat zur Transplantation auf einen Empfänger, wobei besagtes Zellpräparat folgendes umfasst: (a) spendergewonnene unreife hämatopoetische Zellen einschließlich Stammzellen; und (b) nicht-alloreaktive, allogene anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die gegen ein Antigen oder Antigene von dritter Seite gerichtet sind, wobei das Zellpräparat im Wesentlichen verarmt ist durch (a) in vitro Stimulieren einer Zellpopulation, die allogene T-Lymphozyten umfasst, mit einem Antigen oder Antigenen von dritter Seite; und (b) Wegnahme von besagter Zellpopulation, die anti-Dritte-CTLs umfasst, eines Faktors, der zur CTL-Reifung erforderlich ist und der von heranreifenden CTLs abgesondert wird, wodurch nicht-alloreaktive anti-Dritte zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) produziert werden, die im Wesentlichen verarmt sind an T-Lymphozyte, die in der Lage sind, sich zu alloreaktiven CTLs zu entwickeln, vorausgesetzt, dass die Zellen nicht aus menschlichen Embryos gewonnen sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 83, das im Wesentlichen an CD4-T-Zellen verarmt ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 83, das im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen verarmt ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 83, das im Wesentlichen an CD56-natürlichen Killerzellen und CD4-T-Zellen verarmt ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 83, wobei besagtes Antigen oder Antigene von dritter Seite aus der Gruppe gewählt ist bzw. sind, bestehend aus Zellen von dritter Seite, einem Zellantigen, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Proteinextrakt und einem gereinigten Protein.
Das Zellpräparat von Anspruch 87, wobei besagtes virales Antigen ein EBV- oder ein CMV-Antigen ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 87, wobei besagtes gereinigtes Protein Ovalbumin ist.
Das Zellpräparat von Anspruch 87, wobei besagte Zellen von dritter Seite allogene oder xenogene Zellen in Bezug auf den Empfänger sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 90, wobei besagte allogene Zellen HLA-Antigene haben, die von denen des Empfängers unterschiedlich sind, die jedoch nicht kreuzreaktiv mit den Empfänger-HLA-Antigenen sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 90, wobei besagte allogene Zellen stimulatorische Zellen sind, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, die gereinigt sind aus peripheren Blutlymphozyten, Milz oder Lymphknoten, zytokinmobilisierten PBLs und in vitro expandierten antigendarstellenden dendritischen Zellen (APC).
Das Zellpräparat von Anspruch 83, wobei besagte unreife hämatopoetische Zellen einschließlich Stammzellen aus dem Knochenmark, mobilisiertem peripherem Blut, fötaler Leber, Dottersack und/oder Nabelschnurblut des Spenders gewonnen sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 93, wobei besagte mobilisierte periphere Blutzellen durch Leukapherese peripheren Bluts des Spenders nach Stimulation mit einem geeigneten Zytokin erhalten sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 83, wobei besagte unreife hämatopoetische Zellen T-Zellen-verarmte hämatopoetische Progenitorzellen sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 95, wobei besagte T-Zellen-verarmte hämatopoetische Zellen CD34+ unreife Progenitor-hämatopoetische Zellen sind.
Das Zellpräparat von Anspruch 83, wobei ein Zellverhältnis zwischen besagten zytotoxischen T-Lymphozyten und besagten unreifen hämatopoetischen Zellen einschließlich Stammzellen zumindest 1 bis 100 beträgt.