JP2002534083A

JP2002534083A - 骨髄機能廃絶性ではない寛容原性の処置

Info

Publication number: JP2002534083A
Application number: JP2000592399A
Authority: JP
Inventors: シモンスラビン，; タチャナプリゴジーナ，
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1998-12-31
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2002-10-15
Also published as: WO2000040701A3; EP1498479A2; WO2000040701A2; EP1498136A2; CA2356434A1; IL143485A0; US6428782B1; EP1498136A8; EP1141246A2; WO2000040701A9

Abstract

(57)【要約】本発明は、宿主中でドナー特異的寛容性を誘導する方法を特徴とする。本発明の寛容原性の処置は、ドナーに由来する材料の移植の前に、宿主に投与され得る。この寛容原性の処置は、（１）宿主哺乳動物の機能的なＴリンパ球の集団を、排除することは必要ではないが、減少させるために十分である骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて、宿主哺乳動物に対して免疫抑制剤を投与する工程；（２）宿主哺乳動物に非同系ドナーに由来するドナー抗原を注入する工程；（３）リンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬の骨髄機能廃絶性ではない用量を使用して、注入したドナー抗原に対して応答性であるこれらの宿主のＴリンパ球を排除する工程；および（４）宿主哺乳動物に対してドナーの造血性細胞を投与する工程、を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９８年５月２２日に提出された国際出願番号ＵＳ９８／１０５
７５号、および１９９７年５月２３日に提出された国際出願番号０８／８６２，
５５０号の優先権を請求する。

【０００２】（発明の背景）器官、造血性細胞、および体細胞の移植は、種々の疾患を罹患している患者に
ついての重要な治療レジメンとなっている。移植のために必要な技術は極めてま
っすぐに進んでいるが、首尾良い移植を大きく妨げるブロックは、免疫システム
である。基本的な問題は、宿主免疫システムが、ドナー組織または細胞中に見出
される抗原の導入に対して反応する大きな力である。

【０００３】同種異系のドナー（すなわち、宿主患者に対して同じ種であるが遺伝的には同
一ではない）の移植片または異種のドナー（すなわち、宿主とは異なる種）の移
植片の移植は、特に大きな問題を起こしている。任意のドナーの移植片の持続的
な機能性は、移植が行われるドナー細胞の持続的な機能性に依存する。しかし、
ドナー移植片の細胞は、抑制されない場合には、宿主の一部に対して免疫応答を
誘発し得る。これは、移植片の崩壊を導き得る。

【０００４】移植片に対する宿主による反応を緩和する方法の１つは、宿主に対する免疫抑
制性の処置の投与である。残念なことに、新規でありそして非常に有効な免疫抑
制剤が有効であるにもかかわらず、急性の再発の症状の発現および慢性的な移植
片の拒絶が、共通して残っている。これはしばしば、移植片の機能の欠失を引き
起こす。さらに、移植の長期間の成功は、しばしば、薬物に関連する傷害性によ
って、および長期間の免疫抑制によって生じる合併症（例えば、感染症および二
次的な悪性腫瘍）によって制限される。さらに、骨髄細胞（ＢＭＣ）または小腸
（これらは、免疫応答性リンパ球に富む）の移植は、しばしば、移植片対宿主疾
患（ＧＶＨＤ）に起因する可能性のある生命を脅かす合併症に関連する。

【０００５】完全な造血性のキメラ（すなわち、自身のＢＭＣが別の個体（ドナー）に由来
する永久的に移植されたＢＭＣによって１００％置換されている患者）は、免疫
抑制性の治療を維持する必要なく、ドナーに由来する同種異系移植片を永久的に
受け容れ得ることが、示されている。しかし、完全な造血性のキメリズムの誘導
は、達成することが困難である。最初に、宿主の免疫造血性成分の実質的に完全
な崩壊（「致死的な」馴化）が、通常は、適合するＭＢＣ、および特に適合しな
いＢＭＣの移植のために必要とされる。宿主の致死的な馴化を用いて、ＧＶＨＤ
は、一貫して罹患率または致死率を生じる。このような場合には、移植片の造血
性の材料のＴ細胞の枯渇は、ＧＶＨＤの有効な予防のためのアプローチのみを示
す。続くＴ細胞の枯渇は、移植片の拒絶の増大した発症率に関連する。移植片の
拒絶の問題を克服するために、Ｔ細胞を枯渇された骨髄の同種異系移植片のレシ
ピエントは、特定の強力な馴化、あるいは極めて多数のＴ細胞を枯渇されたＢＭ
Ｃを必要とし得る。患者を、全身の照射（ＴＢＩ）のみで、または短期間の免疫
抑制剤と組み合わせたＴＢＩのような積極的な拒絶の予防プロトコールに供する
ことは、器官の同種異系移植を必要としている患者を処置する医師によっては、
あまり受け容れられない。

【０００６】完全なキメリズムを用いるよりもむしろ、混合したドナー／レシピエントの造
血性のキメリズムに関連する真の二極性の寛容性（すなわち、患者がレシピエン
ト（宿主）とドナーの両方の造血幹細胞を保有している条件）が、臨床的な器官
の移植において好ましいことが、提唱されている。いくつかの実験のプロトコー
ルは、混合したキメリズムを導く移植の寛容性を誘導するように設計されている
。馴化は、高用量のＴＢＩの使用、続くＴ細胞を枯渇されたドナーおよびレシピ
エントのＢＭＣの混合物での注入を必要とする（Ｓａｃｈｓら、Ａｎｎ．Ｔｈｏ
ｒａｃ．Ｓｕｒｇ．，５６：１２２１（１９９３）；Ｉｌｄｓｔａｄら，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３０７：１６８（１９８４））か、または低用量のＴＢＩの後でのドナ
ーＢＭＣでの接種、および全身性の汎血球減少症を誘導する、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、
ＣＤ８⁺Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対する抗体の混合物の注入を必要とした。Ｔ
ｏｍｉｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３：１０８７（１９９４）；Ｔｏｍ
ｉｔａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６１：４６９（１９９６）。別の
アプローチが、最近開発されている。これは、ＴＢＩの致死量以下での照射、お
よび非常に多数のＴ細胞を枯渇されたドナーに由来する造血性細胞での接種を含
む。Ｒｅｉｓｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１６：４３７（１９９５
）；Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、１２：
１２６８（１９８６）。ＴＢＩと組み合わせたシクロホスファミド（本明細書中
で以降は、「Ｃｙｔｏｘａｎ」または「Ｃｙ」といわれる）を使用する寛容原性
の処置もまた、記載されている。

【０００７】全リンパ系の照射（ＴＬＩ）は、混合した造血性のキメリズムおよび二極性の
移植寛容性を誘導するために、ドナーＢＭＣの注入の前に、単独の予備的なレジ
メンとして良好に使用されてる。ＳｌａｖｉｎＳ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄ
ａｙ、３：８８（１９８７）；Ｓｌａｖｉｎら、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．
，２２：２６４（１９８６）。ＴＬＩは、移植のレシピエントおよびホジキン病
に罹患している患者に移植するための、通院患者の基準に対して、骨髄機能廃絶
性ではなく、そして日常的には安全に与えられる。残念なことに、ＴＬＩを使用
するキメリズムの誘導は、一貫して、非常に高い累積的な用量の照射を必要とす
る（３，４００〜４，４００ｃＧｙ）。これは、再び、移植のレシピエントにつ
いては所望されない。ＴＬＩは、特に、臨床的な設定においてＴＢＩよりも十分
に有利である。ＴＬＩ（これは、イオン化放射線に対する全身の曝露を伴わない
、リンパ系の区画の選択的な照射を含む）が、十分に寛容化される。さらにＴＬ
Ｉ、は、宿主の免疫造血システムのインタクトな十分な部分を提示する。これは
、感染性の因子を含むリコール抗原に対して得られる維持された記憶を伴う。し
かし、ＴＬＩの長い経過は、時間がかかり得、そして日常的な臨床的な適用には
適切ではない場合がある、短期間および長期間の副作用に関連し得る。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、細胞、組織、および器官の同種異系移植片および異種移植片に対す
る移植寛容性を誘導するように、宿主哺乳動物を処置する新規の方法を提供する
。このような移植は、酵素または代謝性の障害についての置き換え治療、ならび
にヒトのガンおよび生命を脅かす感染について適合された免疫治療を提供し得る
。この方法はまた、同種異系および異種の細胞に対する寛容性の誘導のための新
規の動物モデルを提供するために使用され得る。本発明はまた、治療に使用され
る細胞の集団が、宿主への投与の前に、宿主抗原に対する応答性を実質的に除去
されている、非同系細胞治療の新規の方法を提供する。

【０００９】一般的には、本発明は、宿主哺乳動物を処置する方法を特徴とする。この方法
は、以下の工程を包含する：（ａ）宿主哺乳動物に対して非同系ドナーに由来す
るドナー抗原を投与する工程；（ｂ）ドナー抗原に対して応答する宿主哺乳動物
のリンパ球を選択的に排除するために、宿主哺乳動物に対してリンパ球細胞傷害
性試薬（例えば、シクロホスファミド）または寛容化試薬の骨髄機能廃絶性では
ない用量を投与する工程；および（ｃ）宿主哺乳動物に対して、非同系ドナーに
由来する造血幹細胞の調製物を投与する工程。

【００１０】工程（ａ）の前に、宿主哺乳動物は、宿主哺乳動物の機能的なＴリンパ球の集
団を減少させるために十分な骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて、免疫抑
制剤が投与され得る。免疫抑制剤は、１つ以上の、免疫抑制剤、アルカリ化剤、
イオン化放射線、または抗白血球もしくは抗白血球機能抗体を含み得る。免疫抑
制剤としてのＴＬＩの短い経過（ｓＴＬＩ）の使用（例えば、１〜１２回の用量
、しばしば、１〜６回の用量の２００ｃＧｙ／用量）が、特に有利である。

【００１１】宿主哺乳動物に投与されるドナー抗原は、非細胞性の抗原、細胞、組織、およ
び／または器官を含み得る。例えば、ドナー抗原としては、造血肝細胞、または
他の生存性の細胞が挙げられ得る。ドナー抗原が、造血幹細胞のような生存性の
細胞を含む場合は、上記に記載される免疫抑制性のレジメンは、ドナーの細胞の
少なくとも一時的な生存を可能にするレベルにまで、宿主のＴリンパ球の集団を
減少させるはずである。例えば、宿主のＴリンパ球の集団は、９０％、９５％、
または９９％まで減少させられ得る。

【００１２】宿主哺乳動物は、動物、またはヒト（例えば、ヒトのガン患者）であり得る。
ドナーは、宿主哺乳動物に対して同種異系または異種であり得る。方法の能力に
従って、宿主哺乳動物の血液は、２０％以上のドナー細胞を含み得る。宿主中の
このような細胞の得られる移植を伴う、ドナーの造血幹細胞の調製物の投与後、
宿主は、同種異系の細胞治療で処置され得る。この処置は、ドナーに由来する同
種異系のリンパ球を宿主哺乳動物中に注入することを含む。あるいは、宿主は、
ドナーに由来する移植された細胞、組織、または器官を受け得る。これによって
、移植片は、宿主哺乳動物中で誘導されるドナー特異的寛容性に起因して、宿主
中で移植される。

【００１３】別の局面においては、本発明は、ドナー特異的な、宿主に起源するリンパ球を
枯渇された組成物とともに、宿主に起源する造血性細胞およびドナーに起源する
造血性細胞を含有している、宿主に由来する造血性細胞組成物を特徴とする。造
血性細胞組成物は、上記に記載されるように宿主哺乳動物を処置すること、次い
で宿主哺乳動物から造血性細胞組成物を単離することによって、作成され得る。

【００１４】さらなる局面においては、本発明は、ヒト以外の哺乳動物／ヒトのキメラを作
成する方法を特徴とする。これは、ヒト以外の哺乳動物である宿主哺乳動物およ
びヒトであるドナーを用いて、上記の方法を実行することを含む。宿主哺乳動物
は、例えば、げっ歯類またはブタであり得る。結果としては、ヒトの造血幹細胞
を安定に移植された、げっ歯類、ブタ、または非ヒト哺乳動物である。このよう
に、非ヒト哺乳動物宿主は、造血性の混合されたキメラを構成する。

【００１５】本発明はまた、第１の個体の哺乳動物に由来する細胞の集団を含有する細胞の
組成物を包含する。細胞の集団は、リンパ球を含み、そして第１の個体の哺乳動
物と非同系（すなわち、同種異系または異種の）第２の個体の哺乳動物の抗原に
対する応答性を除去される。応答性の除去は、以下の連続する工程を含む方法に
よる：（ａ）第１の個体の哺乳動物に対して、第２の個体の哺乳動物によって発
現された抗原供給源を投与する工程；（ｂ）第１の個体の哺乳動物に対して、骨
髄機能廃絶性ではない用量のリンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬を投与す
る工程；（ｃ）第１の個体の哺乳動物に対して、第２の個体の哺乳動物に由来す
る造血性細胞の調製物を投与する工程；および（ｄ）第１の個体の哺乳動物から
細胞の集団を単離する工程。本発明の組成物においては、第１の個体の哺乳動物
に対して内因性である細胞は、集団の細胞の５０％から１００％である。使用さ
れる抗原は、ガン細胞であり得、そして第１の個体の哺乳動物および第２の固体
の哺乳動物は、両方ともヒトであり得る。あるいは、第１の個体の哺乳動物は、
ヒト以外の霊長類であり得、そして上記の第２の個体の哺乳動物は、ヒトであり
得る。または、第１の個体の哺乳動物はブタであり得、そして上記の第２の個体
の哺乳動物はヒトであり得る。

【００１６】本発明はまた、非同系細胞治療で哺乳動物を処置する方法を特徴とする。この
方法は、互いに非同系ドナー哺乳動物および宿主哺乳動物を用いて、宿主哺乳動
物中にドナー哺乳動物に由来する細胞の集団を注入する工程を包含する。細胞の
集団は、リンパ球を含み得、そして注入の前に、この細胞の集団は、宿主哺乳動
物によって発現される抗原に対する応答性を除去され得る。応答性の除去は、細
胞の集団からのＴ細胞の実質的な排除により得る。Ｔ細胞の排除工程は、骨髄機
能廃絶性ではないレジメンにおいて免疫抑制剤に対して細胞の集団を曝露するこ
とにより得るか、または細胞をマホスファミドと接触させることにより得る。こ
れらの排除工程は、インビトロまたはインビボで行われ得る。

【００１７】あるいは、細胞の集団の除去は、リンパ球の集団を上記の宿主哺乳動物によっ
て発現される抗原を含有している組成物と接触させること（そして、この接触は
インビボで行われ得る）によるか、または第１の個体の哺乳動物に対して抗原を
投与することによって、達成され得る。この方法は、さらに、抗原組成物との接
触工程の後に、リンパ球の集団に対して、骨髄機能廃絶性ではない用量のリンパ
球細胞傷害性試薬または寛容化試薬を送達する工程を包含し得る。この送達工程
は、インビトロであり得るか、またはドナー哺乳動物に対して骨髄機能廃絶性で
はない用量を投与することにより得る。この方法はまた、必要に応じて、以下の
工程を包含し得る：（ａ）送達工程の後に、ドナー哺乳動物に対して宿主哺乳動
物に由来する造血幹細胞の調製物を投与する工程；および／または（ｂ）抗原と
の接触工程の前に、リンパ球の集団中の機能的なＴリンパ球の数を減少させるた
めに十分な骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて、免疫抑制剤に対してリン
パ球の集団を曝露する工程。工程（ｂ）においては、曝露する工程は、インビト
ロであり得るか、またはドナー哺乳動物に免疫抑制剤を投与することにより得る
。抗原組成物は、１つ以上の抗原供給源、例えば、細胞、器官、組織および非細
胞性の抗原を含み得る。例えば、抗原としては、宿主哺乳動物の主要組織適合遺
伝子複合体を発現する、造血性細胞またはガン細胞が挙げられ得る。ガン細胞は
、例えば、宿主哺乳動物に由来し得る。

【００１８】パッケージング材料、およびパッケージング材料中の生物学的な細胞容器を含
む、製品もまた、本発明の範囲内にある。細胞容器は、造血幹細胞を含む組成物
を含み得、そしてパッケージング材料は、造血幹細胞が、宿主哺乳動物において
非同系ドナー特異的な寛容性を誘導する方法の工程（ａ）または工程（ｃ）にお
いて使用されることを示す、ラベルまたはパッケージ挿入物を含み得る。この方
法は、以下の工程を包含する：（ａ）非同系ドナーに由来するドナー抗原を宿主
哺乳に投与する工程；（ｂ）ドナー抗原に応答する宿主哺乳動物のリンパ球を選
択的に排除するために、リンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬の骨髄機能廃
絶性ではない用量を宿主哺乳動物に投与する工程；および（ｃ）非同系ドナーに
由来する造血幹細胞の調製物を宿主哺乳動物に投与する工程。

【００１９】本発明に含まれる別の製品は、パッケージング材料、このパッケージング材料
内の生物学的な細胞容器を含み、この細胞容器内には、上記の本発明の任意の細
胞組成物が含まれる。パッケージング材料は、この組成物が、この組成物を必要
としている第２の個々の哺乳動物に対してこの組成物を投与する工程を包含する
処置方法において使用されることを示す、ラベルまたはパッケージ挿入物を含む
。

【００２０】本発明はまた、非同系宿主哺乳動物に由来する移植片に対して、宿主哺乳動物
中で寛容性を誘導する方法を特徴とする。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）宿主哺乳動物に対して非同系ドナーに由来するドナー抗原を投与する工程
；（ｂ）宿主哺乳動物の機能的なＴリンパ球の集団を減少させるために十分な、
骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて、免疫抑制剤を宿主哺乳動物に投与す
る工程；（ｃ）ドナーに由来する細胞、組織、または器官を宿主動物中に移植す
る工程；（ｄ）ドナー抗原に応答する宿主哺乳動物のリンパ球を選択的に排除す
るために、リンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬の骨髄機能廃絶性ではない
用量を宿主哺乳動物に投与する工程；および（ｅ）非同系ドナーに由来する造血
幹細胞の調製物を宿主哺乳動物に投与する工程。この方法の工程（ａ）、（ｂ）
、および（ｃ）は、工程（ｄ）および（ｅ）と同じ日に、そしてそれらの前に行
われる。

【００２１】用語「骨髄機能廃絶性ではない」は、本明細書中で使用される場合は、宿主起
源の実質的に全ての造血性細胞を排除しない任意の治療を含む。「移植」は、本
明細書中で使用される場合は、細胞、組織、および器官を含む、ドナーに由来す
る任意の材料の移植をいう。細胞は、造血性であり得るか、または非造血性であ
り得る。「ドナー抗原」は、本明細書中で使用される場合は、非細胞性の抗原、
細胞、組織、または器官を含む、宿主の免疫応答を誘発する、ドナーに由来する
任意の材料をいう。幹細胞は、ドナー抗原として特に有用である。「リンパ球細
胞傷害性試薬」は、Ｔ細胞を殺傷するか、またはＴ細胞の機能を無効にする試薬
である。「寛容化試薬」は、正常なＴ細胞依存性の応答の発生を防ぐことによっ
てＴ細胞を活性化するか、または「差し止める」試薬である。用語「ガン」は、
本明細書中で使用される場合は、悪性細胞を含む全ての病理学的な状態を含む；
これは、固形の組織または器官において生じる「固形の」腫瘍、ならびに白血病
およびリンパ腫のような造血性の腫瘍を含み得る。用語「ドナー特異的寛容性」
は、本明細書中で使用される場合は、ドナーに由来する材料に対する宿主の寛容
性をいう。「非同系」は、本明細書中で使用される場合は、同種異系または異種
であり得る。特定の細胞の集団における「応答性の枯渇」は、本明細書中で使用
される場合は、応答性の細胞の数を減少させること、応答性の細胞の応答を減少
させること、またはそれらの両方のいずれかを意味する。本明細書中で、細胞が
、個々の哺乳動物に対して「内因性である」と言われる場合は、細胞自体または
それらの前駆体は、別の個々の哺乳動物に由来する細胞の任意の投与の前に、そ
の個の哺乳動物中に存在したと理解される。

【００２２】強力な主要組織適合性複合体ＭＨＣおよび主要ではない組織適合性遺伝子座（
ＭｉＨＬ）バリアにまたがるドナー特異的寛容性の誘導、ならびに種のバリアに
またがるドナー特異的寛容性（異種寛容性）の誘導は、本明細書中で記載される
寛容原処置を使用して哺乳動物宿主中で達成され得る。免疫抑制処置を維持する
必要を回避しながらの、ドナー特異的移植寛容性の誘導は、これは、臨床的な移
植において高度に所望される目的である。

【００２３】本明細書中で記載される骨髄機能廃絶性ではない寛容原処置は、広範な種々の
ドナー由来材料に対して長期間持続するドナー特異的寛容性の状態を誘導する。
このようなアプローチは、臨床的な状況における、細胞、組織、および器官の同
種異系移植および異種移植について魅力的である。なぜなら、このプロトコール
の全ての工程が、十分に寛容化されており、そして比較的安全であるからである
。手順の経過の間に宿主の免疫造血系の全てを根絶させることは必要ではないの
で、レシピエントは、免疫記憶を維持したままであり、そして一方では移植片対
宿主疾患に、他方では感染の合併症に抵抗する良好な状態にある。これは、臨床
的な実施において決定的に重要であり得る。ドナー特異的寛容性を誘導するため
のプロトコールは、少なくとも一部、通院患者での手順として、送達され得る。

【００２４】本明細書中で提供される非同系細胞治療の方法は、細胞、組織、または器官の
欠損または機能不全（ｍｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）が生じる条件下で特に有用であ
り得る。従って、これらは、例えば、代謝不全（遺伝的な代謝不全を含む）、自
己免疫疾患、およびガンにおいて有用であり得る。従って、この方法は、ある、
より感染性の因子に対する免疫を、ドナーから宿主に受動的に移すことにおいて
有用である。これらは、宿主の前処置を伴わずに、または本発明の寛容化方法の
１つによるドナー抗原に対する宿主の寛容化に続いて、使用され得る。

【００２５】他に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的
な用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと
同じ意味を有する。本明細書中に記載されているものと同様またはそれと等価な
方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方
法および材料が、以下に記載されている。本明細書中で記載されている、全ての
刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体において参考として
援用される。矛盾がある場合には、定義を含む本特許明細書が調節する。さらに
、材料、方法、および実施例は、例示のみであり、そして限定されることは意図
されない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の
範囲から明らかである。

【００２６】（詳細な説明）（Ａ．寛容性プロトコール）本発明者は、新規の、骨髄機能廃絶性ではない寛容原プロトコールを、非同系
移植片（すなわち、宿主に対して遺伝的に同一ではない、細胞、組織、または器
官の移植片）に対して安定でかつドナー特異的な寛容性を誘導するために使用し
た。寛容原処置のためのプロトコールは、以下のようにまとめられ得る：工程１：宿主哺乳動物の機能的なＴリンパ球の集団を減少させるが、排除しな
いために十分な骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて、宿主哺乳動物に対し
て免疫抑制剤を投与する。

【００２７】工程２：非同系ドナーに由来するドナー抗原（好ましくは、生存性の造血細胞
）を宿主哺乳動物に注入する。

【００２８】工程３：リンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬の骨髄機能廃絶性ではない
用量を使用して、注入されたドナー抗原に対して応答する宿主のＴリンパ球を排
除する。

【００２９】工程４：宿主哺乳動物に対して、ドナーの造血幹細胞の調製物を投与する。

【００３０】この骨髄機能廃絶性ではないドナー特異的な寛容原処置は、宿主の、高レベル
のドナーの造血細胞を有する造血混合されたキメラへの転換を生じる。代表的に
は、哺乳動物宿主は、ヒト患者であるが、寛容原処置のレシピエントは、任意の
哺乳動物であり得る。非同系移植は、器官、組織、または細胞の同種異系ならび
に異種の移植を含み得る。従って、工程２および工程４で使用される造血幹細胞
および他のドナー抗原は、同種異系または異種の供給源から誘導され得る。

【００３１】寛容原処置が適切であるヒト患者として、以下が挙げられるが、これらに限定
されない：糖尿病のような代謝機能の損失を含む、器官または組織の機能損失を
有する患者；ゴーシェ病、異染性の白質萎縮およびフルラー症候群のような先天
的な遺伝的疾患によって引き起こされる酵素の不全を有する患者；例えば、紅斑
性狼瘡および慢性関節リウマチのような自己免疫障害を有する患者；ならびにガ
ン患者。例えば、心臓、肝臓、または腎臓の不全を罹患している患者は、適切な
器官の移植前の寛容原処置での馴化についての優れた候補である。皮膚または骨
の移植片を必要としている患者もまた、移植の前に寛容原処置に供され得る。寛
容原処置を受けるガン患者として、任意の悪性疾患（乳ガンのような固形腫瘍、
または急性および慢性の白血病、リンパ腫、ならびに脊髄形成異常および脊髄増
殖性の障害を含む造血性の悪性疾患のいずれか）を罹患している患者が挙げられ
得る。

【００３２】本発明に従って、工程１の骨髄機能廃絶性ではないレジメンの後に、宿主哺乳
動物の機能的なＴリンパ球の集団の有意な数が、宿主中に残る。それにもかかわ
らず、ドナー細胞の接木は、以下に起因して生じ得る：（ａ）ドナー反応性の宿
主のＴリンパ球が工程３において排除されること、および（ｂ）続く注入（単回
または複数回）（工程４）において存在するドナーに由来するＴリンパ球および
／または幹細胞が、拒否効果を生じるように「拒否」細胞として作用し得る。本
明細書中で使用される場合は、拒否細胞は、Ｔリンパ球、特に、ＣＤ８⁺Ｔ細胞
を含む。これは、他のＴリンパ球を刺激するよりもむしろ、ダウンレギュレーシ
ョンを生じる。拒否効果は、免疫原性が乏しいが宿主Ｔ細胞を拒否し得る、Ｔ細
胞を枯渇させた幹細胞を含む、他の増殖している造血性細胞によって誘導され得
る。拒否効果においては、宿主起源のＴリンパ球は、幹細胞および／またはリン
パ球を含む、ドナーに由来する拒否細胞によってダウンレギュレートされる。他
の複製しているドナーに由来する細胞、またはさらに、非細胞性の抗原もまた、
繰り返し提供され、そして比較的高濃度で提供される場合には、宿主の同種異系
または異種反応性のＴ細胞を拒否し得る。同様に、ドナーの注入物中に存在する
免疫応答性Ｔ細胞は、宿主起源の拒否細胞によってダウンレギュレートされ得る
。従って、移植片対宿主および宿主対移植片の寛容性は、一方では、宿主の拒否
細胞とドナー起源との間で平衡化された平衡、および他方では移植片の免疫原性
および同種異系反応性の程度に起因して、同時に生じ得る。

【００３３】（ｉ）工程１工程１で有用な免疫抑制剤の例として、以下のような免疫抑制剤が挙げられる
が、これらに限定されない：メトトレキセートおよびフルダラビン（ＦＬＵ）；
アルキル化剤（例えば、Ｃｙ、メルファラン、チオテパ、およびブスルファン；
ポリクローナルおよびモノクローナルの抗−胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）およ
び抗−リンパ球グロブリン（ＡＬＧ））；ならびにイオン化放射線（例えば、Ｔ
ＬＩおよびＴＢＩ）。全ての宿主の造血性細胞のその非選択的な影響、およびそ
の重篤な即時型でかつ長期間の副作用に起因して、ＴＢＩは好ましくない。ＴＢ
Ｉが使用される場合は、重篤ではないか、または不可逆的な汎血球減少症を生じ
る用量レベルであるはずである。骨髄機能廃絶性ではないレジメンは、有利には
、短く、そしてＴＬＩの十分に寛容化された経過（ｓＴＬＩ）である。これは、
全てのリンパ系の器官において宿主Ｔリンパ球の数および／または機能において
際立った減少を生じ得る。以下に議論されるように、ｓＴＬＩが、比較的低い累
積的な照射用量でドナー抗原に対する非応答性を効果的に誘導し得ることが、発
見されている。

【００３４】ｓＴＬＩの免疫抑制性のレジメンは、例えば、宿主対移植片の可能性、および
工程４で投与される幹細胞の調製物中のＴリンパ球の含量に依存して、２００ｃ
Ｇｙ／各回の１から１２の毎日の画分を含み得る。Ｔリンパ球に富む幹細胞の調
製物は、１〜３のｓＴＬＩ画分のみを必要とし得るか、または全く免疫抑制を必
要としない（０のｓＴＬＩ画分）。しかし、Ｔ細胞を枯渇させた幹細胞の調製物
または低レベルのＴリンパ球を伴う幹細胞の調製物の接木は、４〜１２の画分の
使用を必要とし得る。ｓＴＬＩレジメンは、宿主のＴリンパ球の数において一時
的な減少のみを生じ、そしてこれは、通院患者に基づいて臨床的に実行可能であ
る。予想される重篤な副作用は存在しない。なぜなら、リンパ腫の患者について
臨床的に使用されるＴＬＩの日常的な累積的用量は、４，４００ｃＧｙからなる
からである。

【００３５】好ましくは、免疫抑制剤は、少なくとも約９０％、宿主の機能的なＴリンパ球
の集団を一時的に減少させる。より好ましくは、骨髄機能廃絶性ではないレジメ
ンは、宿主の機能的なＴリンパ球の集団を、少なくとも約９５％、そして最も好
ましくは、少なくとも約９９％まで、一時的に減少させる。９０％未満のリンパ
球の減少もまた、工程２において提供されるドナーの抗原の一時的な生存が可能
である限りにおいては、本発明の範囲内である。

【００３６】いくつかのドナー／レシピエントの組み合わせにおいては、ドナー抗原に対す
る寛容性は、工程１を実行する必要性を伴わずに誘導可能であり得る。この場合
においては、工程４において投与されるドナーの造血幹細胞の調製物は、工程３
の影響を回避する残余の宿主Ｔ細胞に対して防御的な拒否機能を提供するために
十分な数のＴ細胞を含まなければならない。

【００３７】（ｉｉ）工程２寛容原性の処置の工程２においては、非同系ドナーに由来する抗原は、宿主の
ドナー特異的Ｔリンパ球を刺激し、そしてその増殖を生じるために、宿主哺乳動
物に対して投与される。次いで、刺激されたドナー特異的宿主のＴリンパ球の亜
集団は、工程３において排除されるかまたは寛容化される。ドナー抗原は、骨髄
機能廃絶性ではない上記の免疫抑制性のレジメン（工程１）の後で、宿主に対し
て投与され得る（工程２）。あるいは、ドナー抗原は、免疫抑制されていない宿
主に対して投与され得る（上記の工程１が無視される）。

【００３８】工程２において投与されるドナー抗原として、以下が挙げられ得るが、これら
に限定されない：非細胞性の抗原、細胞、器官、組織、または組織抽出物、ある
いはなお、ドナー抗原を模倣する抗−イディオタイプ抗体。一般的には、宿主に
おいて免疫応答を誘発する任意のドナー抗原が、本発明の範囲内である。非同系
ドナーに由来するドナー抗原の任意の供給源が、使用され得る。そして非同系ド
ナーは、宿主に対して同種異系または異種であり得る。

【００３９】ドナー抗原の注入は、寛容性が所望されるドナーの抗原決定基を含むべきであ
る。例えば、クラスＩの組織適合性の抗原のみを保有している宿主ドナーに由来
する材料中に移植することが所望される場合は、工程３においてクラスＩ反応性
の宿主のＴリンパ球のみの排除が、必要であり得る。このことは、工程２におい
て、クラスＩの抗原決定基のみを保有しているドナー抗原を注入することによっ
て達成され得る。一方、さらなるドナーの抗原決定基が、工程２の注入物中に存
在し得るが、なお、これらのさらなる抗原決定基に対する宿主寛容性は必要では
ない場合がある。従って、クラスＩおよびクラスＩＩの抗原決定基を保有してい
るドナー抗原の注入によるクラスＩおよびクラスＩＩ反応性の宿主Ｔリンパ球の
排除は、後者の移植されたドナー材料がクラスＩ抗原決定基のみを保有している
場合にもなお、行われ得る。

【００４０】工程２において注入されたドナー抗原は、生存可能な非同系ドナーに由来する
造血幹細胞であり得る。ドナーの造血幹細胞は、一般的には、Ｔ細胞を枯渇させ
ていないが、工程２におけるＴ細胞を枯渇させたドナー造血肝細胞の使用もまた
、本発明の範囲内である。工程２および／または工程４における使用のためのド
ナーの造血幹細胞は、例えば、骨髄からの直接の抽出によってか、または骨髄か
らの動員後に抹消の循環から、得ることができる。後者は、顆粒球コロニー刺激
因子（Ｇ−ＣＳＦ）または骨髄からの抹消の循環中への幹細胞の動員を誘導する
他の適切な因子でのドナーの処置によって達成され得る。動員された幹細胞は、
任意の適切な細胞フェレーシス技術によって、例えば、ＦｅｎｗａｌＤｉｖｉ
ｓｉｏｎｏｆＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎによって販売されているＣＳ３０００Ｐｌｕｓ血球回収デバイスによって例
示されるような、市販によって入手可能な血液回収デバイスの使用を通じて、末
梢血から回収され得る。ＣＳ３０００Ｐｌｕｓ機器を用いてアフェレーシスを
行うための方法は、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓ
ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５：１２９−１３３（１９９０）およびＨｉｌｌｙｅｒ
ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ３３：３１６−３２１（１９９３）に記載されて
いる。幹細胞の別の供給源としては、新生児の幹細胞（例えば、臍帯血幹細胞）
および胎児の幹細胞（例えば、卵胞細胞の胎児の肝臓）が挙げられる。造血性の
サイトカインの混合物を用いてインビトロで増幅させられた幹細胞もまた、使用
され得る。他の有用な幹細胞の調製物としては、ドナー型ＭＨＣクラスＩまたは
クラスＩＩ分子をコードする遺伝子で形質導入されている幹細胞、ならびに、単
純ヘルペスチミジンキナーゼまたは、重篤なＧＶＨＤの症例においてガンシクロ
ビルまたは他の適切な薬物に対して成熟Ｔ細胞を敏感にする他の「自殺」遺伝子
で形質導入された幹細胞および／またはＴ細胞を含む幹細胞の調製物が、挙げら
れる。

【００４１】（ｉｉｉ）工程３工程３に関しては、増殖しているドナー特異的宿主Ｔリンパ球の「排除」は、
本明細書中で使用される場合は、宿主Ｔリンパ球の不活化または寛容化、および
宿主Ｔリンパ球の死滅を含む。工程３において有用なリンパ球細胞傷害性試薬の
例として、Ｃｙ、メルファラン、メトトレキセートが挙げられる。例えば、Ｃｙ
は、リンパ球（特に、抗原性の刺激に応答して増殖する細胞）を死滅させるその
能力について公知の短期間に作用する細胞傷害性の薬物である（ＢａｃｈＪＦ
、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ（１９７５）；Ａｉｓｅｎ
ｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２１３：４９８（１９６７）；ＰａｕｌＷＥ，Ｆ
ｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ
、（１９８４））。Ｃｙはまた、寛容化状態の維持に応答する抗原特異的Ｔ細胞
のサプレッサーの活性化を促進し得る。Ｃｈｅｒｎｙａｋｈｏｖｓｋａｙａら、
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，３８：２６７（１９８４）；Ｍａｅｄａら、
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５７：４６１（１９９４）。ドナーの抗原性
の刺激に応答して増殖するＴ細胞を排除することが公知の他の因子もまた、使用
され得る。これには、抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ６９、および抗−Ｉａ／ＤＲ抗体
のようなＴリンパ球の活性化マーカーに対するモノクローナル抗体を含む。同種
異系反応性宿主Ｔ細胞は、活性化と組み合わせて同時刺激をブロックする因子を
使用することによって、死滅させられるよりもむしろ寛容化され得る。なぜなら
、同時刺激によって提供される第２のシグナルを伴わない抗原とのＴ細胞の接木
は、寛容性を生じるからである。このような寛容化試薬として、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗−Ｂ７．１、または抗−Ｂ
７．２、抗−ＣＤ２８、ならびに、抗−ＬＦＡ１、抗−ＣＤ４４、および同様の
因子のような接着分子に対する抗体。寛容化試薬が使用される場合は、工程２お
よび工程３は、同時に行われ得る。

【００４２】（ｉｖ）工程４比較的多数の循環しているドナー細胞との安定な受容可能な状態の混合された
キメラ現象を確実にするために、ドナーの造血幹細胞が、工程３の実行後に宿主
に投与される。このドナー幹細胞の注入（工程４）は、同じドナーに由来するか
、または工程２の抗原を提供するものと遺伝的に同一のドナーに由来する。骨髄
に由来する、動員された末梢血の集団に由来する造血幹細胞、または上記のよう
な他の幹細胞の調製物（例えば、臍帯血幹細胞）が、使用され得る。工程４で投
与される幹細胞の数は、幹細胞の集団のＴ細胞含有量に依存して変化し得る。調
製物がＴ細胞を枯渇させていない場合は、比較的少数の幹細胞が、一般的には投
与される。幹細胞の調製物がＴ細胞を枯渇させている場合は、多数の幹細胞が投
与される。なぜなら、ＧＶＨＤの危険性がないからである。

【００４３】第２の注入物のドナーの造血幹細胞は、ドナーとレシピエントとの間での免疫
学的な不一致、工程１で与えられる免疫抑制の強度、および移植片の免疫原性に
関して所望されるキメラ現象の程度に依存して、Ｔ細胞を枯渇させてもよいし、
させなくてもよい場合がある。ｓＴＬＩのより多い画分（４〜１２）または同等
の免疫抑制を提供する免疫抑制剤が、工程１の免疫抑制性のレジメンにおいて使
用される場合は、ドナーの造血幹細胞を含有している第２の注入物は、代表的に
は、ＧＶＨＤについてのコントロールのためにＴ細胞を枯渇させる。工程１がわ
ずかな免疫抑制を含む場合（例えば、ｓＴＬＩの１〜３の画分）、または工程１
が全く排除される場合は、工程４におけるドナーの造血幹細胞の注入物は、代表
的には、Ｔ細胞を除去されない。Ｔ細胞が除去されていない場合は、ＧＶＤＨの
徴候についてモニターしながら、工程４で提供されるドナー幹細胞が、数週間ま
たは数ヶ月の期間にわたって段階的に増加させて注入され得る。

【００４４】以下に報告されるマウスの実験においては、マウスは、０〜６の画分の２００
ｃＧｙ／画分のｓＴＬＩを受容した（工程１）。宿主のドナー反応性Ｔ細胞は、
Ｔ細胞を枯渇させていないドナーＢＭＣ（３×１０⁷細胞）を注入することによ
って活性化された（工程２）。活性化された宿主Ｔ細胞は、骨髄機能廃絶性では
ない用量（２００ｍｇ／ｋｇまたは３用量の６０ｍｇ／ｋｇ）のＣｙによって実
質的に除去された（工程３）。血液中の低レベル（例えば、７％〜２０％）のド
ナー細胞と混合されたキメラは、Ｃｙ処置の後で、優性であった。高レベルの造
血性の混合されたキメラ現象（例えば、血液中で＞２０％のドナー細胞）の誘導
は、ドナーの造血幹細胞を含有している第２の注入物を投与すること（工程４）
によって達成され、これによってドナーの皮膚の同種異系移植片の長期間の生存
性を可能にした。

【００４５】６用量のＴＬＩで処置したマウスにおいては、工程４が、皮膚の厚み全体の同
種異系移植片の受容能を可能にする寛容性のレベルを達成するために必要とされ
た。皮膚の厚み全体は、ドナー特異的寛容性についての最もストリンジェントの
試験を示すことが周知である。皮膚の同種異系移植片の受容能は、安定なキメラ
においてのみ達成され得（Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：７５
３（１９９３））、そして皮膚の受け容れの成功は、宿主の血液中のドナー由来
の細胞のレベルに依存し得る。

【００４６】以下に報告されるさらなる実験においては、工程３に続く全ての宿主に由来す
るドナー反応性のＴリンパ球の枯渇によって、工程４において投与されたさらに
少数のドナー幹細胞（２〜３×１０⁶／マウス）の迅速な接木が可能となった。
これは、通常は、安定な混合されたキメラ現象の誘導のためには十分ではない。
これと同時に、工程３の後で誘導された完全な抗−ドナー非反応性もまた、致死
的なＧＶＨＤを導くドナーＴリンパ球に対する鋭い感受性を生じた。従って、ド
ナー反応性宿主Ｔ細胞が効率よく枯渇させた場合にはいつでも、工程４において
投与された造血幹細胞調製物からの免疫応答性Ｔリンパ球の排除、または寿命を
制限されたリンパ球（自殺遺伝子を保有している）の使用が、ＧＶＨＤを防ぐた
めに重要である。ドナー反応性の宿主リンパ球の選択的な枯渇に起因して、工程
３の後に投与された２〜３×１０⁶のＢＭＣ（Ｔ細胞を枯渇させた）がさらに接
木され、そして宿主マウスが血液中の比較的高レベル（２０％〜５０％）のドナ
ーに由来する造血性細胞との安定な混合されたキメラに転換される。

【００４７】ドナーの幹細胞の調製物のＴ細胞の枯渇は、移植の拒絶の危険性を増大させる
ことが知られている。従って、極端に多数のドナー幹細胞での接種は、Ｔ細胞が
枯渇したＢＭＣの、特に、以前の骨髄機能廃絶性ではないプロトコールを用いて
馴化されたレシピエントにおける接木について強制的である。Ｔｒｕｉｔｔら、
Ｂｌｏｏｄ７７、２５１５−２５２３（１９９１）；Ｒｅｉｓｎｅｒら、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１６、４３７−４４０（１９９５）；Ｂａｃｈａｒ−
Ｌｕｓｔｉｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２、１２６８−１２７３（１９９５）。少
数のドナーの造血幹細胞（Ｔリンパ球が枯渇した）を使用して接木を誘導する能
力は、本発明のプロトコールの有意な利点である。これは、そうでなければ、他
方でのより多い幹細胞の接種菌の使用による、ＧＶＨＤの低下した危険性と組み
合わせた一方でのドナーの造血幹細胞の改善された受容能に起因する。特に、ｓ
ＴＬＩおよびＣｙによって非特異的に免疫抑制される動物（Ｃｙの前にドナー抗
原の注入を伴わない）は、Ｔリンパ球が枯渇したＢＭＣを拒絶することが示され
た。従って、本発明のデータは、非特異的な免疫抑制アプローチと比較して、ド
ナー特異的寛容原性の馴化の利点を明らかに示し、一方、潜在的に有害な高用量
のＴＢＩを回避する。ＧＶＨＤはまた、工程３での使用についての上記の寛容原
性の試薬を使用して制御され得る。さらに、ＣＤ５２、ＣＤ４０、リガンド、Ｃ
Ｄ４０、ＩＬ−２レセプター（例えば、ＣＤ２５）に対する抗体が、ＧＶＨＤを
調節するために使用され得る。用語抗体は、ネイティブの抗体に、または抗体の
機能的なフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、またはＦｖフラグメ
ント）として、の両方で適用されると理解される。さらに、これらは、免疫毒素
（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ毒素もしくはジフテリア毒素、リシン、また
は放射性核種（例えば、¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉ）のような毒素に対して結合された）
として使用され得る。

【００４８】興味深いことに、ドナーに由来する皮膚移植片の厚み全体に対する寿命の長い
寛容性もまた、工程１に供されていないレシピエントおよび工程１がＴＬＩの単
一の画分（２００ｃＧｙ）のみを含んだレシピエントにおいて、達成された。従
って、宿主の馴化の強度と、ドナーに由来するＴ細胞の存在によって誘導される
ＧＶＨＤに対する宿主の感受性との間に平衡が存在する：ｓＴＬＩの単回の画分
のレシピエントは、Ｔ細胞が枯渇していないドナーＢＭＣの大量の接種によって
ＧＶＨＤの誘導を阻止し得るが、一方、ＧＶＨＤに対する宿主の感受性は、ｓＴ
ＬＩの６つの画分で馴化されたレシピエントにおいて増大した。従って、Ｔ細胞
が枯渇していないドナーＢＭＣを含有している第２の注入物（工程４）が、ｓＴ
ＬＩの１用量のレシピエントにおいて比較的安全に使用され得るが、一方、第２
の注入物のＴ細胞の枯渇は、ｓＴＬＩの６つの画分のレシピエントにおいて強制
的であった。ＧＶＨＤを発症することに対する６×ｓＴＬＩのレシピエントの感
受性は、おそらく、宿主のＴ細胞の全ての有効な枯渇に起因する、宿主反応性の
ドナー細胞を拒否することができないことに起因した。

【００４９】本明細書中に記載される寛容原性の処置によって生成された寛容性の混合され
た造血性のキメラは、第３部の移植片に対して免疫応答能力を有するままである
。以下に記載される実験においては、全ての寛容性のＢ６→ＢＡＬＢ／ｃキメラ
（これは、Ｂ６の皮膚の同種異系移植片を受容した）は、１６〜２０日以内に無
関係なＣＢＡの皮膚の移植片を拒絶した（ｎ＝１１）。従って、寛容性の誘導は
、混合されたキメラ中に保持された宿主免疫システムによっては正常な反応性は
、排除されず、そして損なわれない。このことは、この方法の重要な利点である
。なぜなら、レシピエントは、全ての宿主に由来する免疫細胞の一時的な欠失に
起因して、免疫和解されないからである。これは、そうでなければ、キメラがＴ
ＢＩ後に１００％のドナー細胞から構成される場合に、回避できない。記憶細胞
を伴う宿主に由来する免疫装置が残っている患者は、一次的および二次的な感染
に抵抗するための良好な状況にある。介入性の感染に対する抵抗を、特に、ウイ
ルス因子に感染している宿主の標的細胞に対して、維持されたこのことれは、極
めて有用である。このことは、ドナー造血性細胞がＭＨＣ異種であり得、従って
、ウイルスに感染した宿主組織に対する免疫防御を提供し得ないことに起因する
。

【００５０】上記の寛容原性の処置は、異種のバリアを通過して移植の寛容性を誘導するた
めに使用され得る。異種の皮膚の移植は、ドナー特異的寛容性についての最もス
トリンジェントな試験と考えられ得る。以下に記載されているように、本発明者
らは、マウスからラットへの皮膚移植片における永久的な寛容性を誘導すること
に成功した。本明細書中とともに示される同じドナー特異的寛容性の誘導プロト
コールが、ヒトにおける異種の移植に適用され得る。異種移植片（例えば、膵臓
の島）は、ヒト以外の哺乳動物から採取され得、そしてヒトに移植され得る。

【００５１】異種移植のための寛容原性の処置は、以下のように行われ得る。ｓＴＬＩ（工
程１）が行われ、続いて異種のドナー抗原（例えば、ＢＭＣ）の注入（工程２）
が行われる。続いて、少なくとも１つの骨髄機能廃絶性ではない用量のリンパ球
細胞傷害性試薬または寛容化試薬が投与される（工程３）。必要である場合は、
リンパ球細胞傷害性試薬は、数日間にわたって複数回で低用量で投与され得る。
リンパ球細胞傷害性試薬の投与の後には、Ｔ細胞が枯渇したドナーの造血幹細胞
を含有している調製物の注入が続く（工程４）。幹細胞は、成体のドナーの血液
または骨髄から得られ得る。あるいは、部分的に免疫応答性の臍帯血の細胞が使
用され得るか、またはなお、肝臓もしくは胚の卵胞から得られた胎児の幹細胞が
使用され得る。造血性のサイトカインの混合物を用いてインビトロで増殖させら
れた幹細胞もまた、使用され得る。工程４における幹細胞の投与は、異種のドナ
ーの幹細胞の接木を誘導し、そしてドナーに由来する器官に対する宿主の永久的
な移植の寛容性を導く。別の実施形態においては、異種移植は、骨髄機能廃絶性
ではないレジメンの投与を伴わずに（工程１が除外される）、そしてＴ細胞が枯
渇していないドナーの造血幹細胞を含有している第２回目の注入を用いて（工程
４）行われ得る。

【００５２】（ｖ）移植の寛容性の誘導のための短いプロトコール非同系器官、組織、または細胞の移植における本発明の寛容原性の方法の使用
に関しては、実施例１４に記載される実験の結果が非常に重要である。これらの
実験においては、同種異系の移植片（骨髄の間質または心臓）が、ＴＬＩの単回
の用量（工程１として）およびドナーの骨髄（工程２として）と同じ日（０日）
に、続いて、Ｃｙ（工程３として）によって１日目に、そして骨髄の２回目の用
量（工程４として）によって２日目に、有意な拒絶を伴わずに移植され得ること
が見出された。この方法は、これをいくつかの他の実験において使用されたより
長いプロトコールとは区別するために、「短いプロトコール」と命名された。従
って、このようなより長いプロトコールにおいては、例えば、心臓または皮膚の
移植片は、シクロホスファミド処置（工程３）の２０日後（実施例５）、および
第２回目の骨髄の注射（工程４）の１９日後（実施例２、３、４、６、７、およ
び９）に移植された。さらに、別の長いプロトコールにおいては、ｓＴＬＩは、
工程１として６日間の期間を超えて与えられた（例えば、実施例３）。短いプロ
トコールにおいては、移植された器官は、抗原として０日目に与えられた骨髄と
、互いに、そして可能である場合には相乗的に作用すると想定される。さらに、
０日目に与えられた骨髄は、必ずしも寛容性の確立には必要ではない可能性があ
る。しかし、本発明のこの方法は、作用の特定の機構によっては制限されない。

【００５３】短いプロトコールの成功は、ヒトの移植についての本発明の寛容原性のアプロ
ーチの適用可能性を広げる。例えば、死体の移植の場合におては、ドナーの骨髄
（または工程２に使用され得る任意の他の組織）は、関連する器官（例えば、腎
臓、心臓、肝臓、または肺）、組織（例えば、皮膚、骨、筋肉、または軟骨）、
または細胞（例えば、肝細胞または膵臓の島細胞）の利用可能性の進歩において
は、通常は有意に利用可能ではない。短いプロトコールを使用して、骨髄は、器
官と同じドナーから回収され得、そしてともに骨髄機能廃絶性ではない馴化（例
えば、ＴＬＩ）（０日）と同じ日にレシピエントに与えられ得る。同時に、骨髄
細胞は凍結され得、そして２日目および／または翌日のいずれかの、工程４での
使用のために保存され得る。死体の同種異系移植に対する本発明の寛容原性の方
法論の適用可能性を広げることに加えて、短いプロトコールもまた、同じ理由の
ために、生存している関連するドナーまたは異種のドナーの移植のロジスティッ
クを非常に単純にし得る。

【００５４】（ｖｉ）製品生物学的な細胞容器（例えば、細胞を培養するために使用され得る半透過性の
血液のバッグのような、血液のバッグ）を含有しているパッケージング材料（例
えば、厚紙の箱）を含む製品もまた、本発明に含まれる。生物学的な容器は、組
成物を含有し得る。この組成物は、造血幹細胞を含み、そしてパッケージング材
料は、組成物が、寛容原性のプロトコールの工程１において抗原として、そして
／または寛容原性のプロトコールの工程４のための造血幹細胞の供給源として使
用され得ることを示すパッケージの挿入物またはラベルを含み得る。

【００５５】（ｖｉｉ）キメラ別の実施形態においては、本発明は、ヒト以外の哺乳動物／ヒトの造血性のキ
メラを作成する方法に関する。この方法は、本明細書中に記載される骨髄機能廃
絶性ではない寛容原性の処置を使用して、ヒト以外の哺乳動物をヒトのドナーに
起源する抗原に対して寛容性にすることを含む。すなわち、ヒト以外の哺乳動物
が、上記のプロトコールにおいては「宿主哺乳動物」として機能し、そしてヒト
は「ドナー」である。例えば、げっ歯類は、ヒトの造血性細胞と永久的に接木さ
れた混合されたキメラげっ歯類を生じるように、開示される寛容原性のプロトコ
ールの工程１〜４を使用することによって、ヒトの細胞、組織、および器官に対
して寛容化され得る。このような造血性の移植が、異なる種間でもなお可能であ
ることが、公知である。例えば、ヒトの造血性細胞がマウス中に接木され得るこ
とが実証されている。例えば、Ｍａｒｃｕｓら、Ｂｌｏｏｄ８６：３９８−４
０６（１９９５）を参照のこと。ヒトの造血性細胞の生存性および機能性が、ヒ
ト以外の哺乳動物宿主中で最適よりも低い場合においては、ヒトの細胞の接木を
確実にするために、ヒトの造血性のサイトカイントともに宿主哺乳動物に提供す
ることが可能である。

【００５６】このようなキメラ動物の多数の用途が存在する。例えば、宿主哺乳動物がヒト
のドナーに対して寛容化されているので、ヒトの組織（例えば、腫瘍またはＨＩ
Ｖに感染した造血性細胞）については、ヒトの疾患のげっ歯類モデルを産生する
ためにこれらのげっ歯類中に移植され、そしてこれらにによって受け容れられる
ようにすることが、可能である。従って、これらのヒト以外の哺乳動物／ヒトキ
メラは、ヒトの疾患に関連する生物学的な表現型（新規の薬物の試験を含む）を
研究するために使用され得る。

【００５７】ヒト以外の哺乳動物／ヒトの造血性の混合されたキメラの産生は、ヒトの患者
への移植についての可能性のある、細胞、組織、および器官の供給源として、標
的化されたこれらのヒト以外の哺乳動物種についてなおより大きく有意である。
例えば、ブタが、ヒトへの移植についての可能性のある有用な、組織および器官
の供給源であることは、広範に認識されている。このようなブタの材料は、ヒト
の患者に移植された場合には、すぐに「超球性の」拒絶応答を受け、そしてヒト
の宿主によって長期間の免疫によって媒介される拒絶を受ける。ブタは、このよ
うなブタの組織および器官を、ヒトの患者に移植された場合に超急激に拒絶され
ることから守るために、遺伝的に操作されるか、またはそうでなければ処置され
る。これは、例えば、ヒトの補体調節タンパク質をコードするヒトの遺伝子をブ
タに提供することによって、または全てのヒトにおいて存在する予め形成された
異種抗体によって認識されるブタの抗原の産生を担う遺伝子を「ノックアウト」
することによって、達成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１５２５５およ
びＰＣＴ／ＩＢ９５／０００８８を参照のこと。

【００５８】本発明の寛容原性のプロトコールの「２通り」のバリエーションが、ヒトへの
異種のドナーの細胞、組織、および器官の容易な移植を可能にするために、この
ような遺伝子操作されたブタならびに他のドナー哺乳動物に適用され得る。例え
ば、予備的な寛容化手順において、ヒトの患者は、上記の４工程のプロトコール
において、「宿主」ブタに対して抗原および造血性の幹細胞を提供するための最
初の「ドナー」として機能し得る。結果として、ブタは、ブタ／ヒトの造血性の
混合されたキメラに形質転換され、これに伴って、ブタの造血性細胞はヒトの患
者の細胞、組織、および器官に対して寛容化される。この後、ヒトの患者および
ブタの役割が逆転する。そして、４工程のプロトコールにおいては、ブタはドナ
ーとなり、そしてヒトの患者は宿主となる。すなわち、ヒトの患者のＴ細胞寛容
性を有するブタの造血性細胞は、ヒト／ブタの造血性の混合されたキメラ中への
ヒトの患者の形質転換のための４工程のプロトコールにおいて使用され得る。上
記の理由のために、次いで、ヒトの患者は、ブタに由来する細胞、組織、および
器官を受け入れることができる。重要な利点は、この全てが、ブタのＴ細胞の免
疫応答能力によって生じる異種のＧＶＨＤの危険性を回避しながら達成され得る
ことである。なぜなら、ブタのＴ細胞は、予備的な寛容化手順において患者に対
して寛容化されたからである。従って、超急性の拒絶応答は、他の方法（例えば
、移植される材料を提供する動物の遺伝子操作）において克服し得ると仮定する
と、本発明は、長期間の免疫抑制の必要を伴わずに、ヒトへの異種の細胞、組織
、および器官の移植を可能にする。ヒトの患者の抗原に対してブタを寛容化する
ための別の方法として、ブタの細胞が単離され得、そして当該分野でよく知られ
ている標準的な組織培養技術を使用して、インビトロで寛容化が行われ得る。ヒ
トの抗原は、工程２におけるように、細胞性であり得るか、または非細胞性であ
り得る。それらは、例えば、本明細書中に記載される造血性細胞のいずれかであ
り得る。さらに、手順は、インビボまたはインビトロにはかかわらず、同種異系
の宿主／ドナー哺乳動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ブタ、ラット、マ
ウス、ウサギ、またはモルモット）の組み合わせ、ならびに異種の組み合わせを
使用して、行われ得る。

【００５９】さらに、ドナー細胞の寛容化が、抗原特異的である必要はない。これは、例え
ば、幹細胞および必要に応じて関連する疾患（例えば、ガン）を罹患している宿
主被験体に対して治療的な利点を有し得る他の機能的な細胞のサブセット（例え
ば、ＮＫ細胞）を保持している、工程４において使用される骨髄中の実質的に全
てのＴ細胞の枯渇を含み得る。造血細胞サンプルから非特異的にＴ細胞を枯渇す
るための方法として、寛容化プロトコールの工程１および工程３についての上記
の方法、または細胞治療に使用される細胞を枯渇するために使用されるプロトコ
ールの工程ＡおよびＣについて以下に記載される方法が挙げられる。このような
非特異的なインビトロでの枯渇プロトコールを使用する実験が、実施例１５に記
載される。

【００６０】（ｖｉｉｉ）細胞組成物本発明の別の局面は、上記のドナー特異的寛容原性の処置で処置された宿主に
由来する、造血細胞組成物である。この細胞組成物は、宿主に起源するリンパ球
、およびドナーに起源するリンパ球を含む。ドナーに起源するリンパ球の割合は
、変化し得る。好ましくは、ドナーに起源するリンパ球は、リンパ球の組成物の
約５％から約５０％を含む。より好ましくは、ドナーに起源するリンパ球は、リ
ンパ球の組成物の約２０％から約５０％を含む。造血細胞組成物は、ドナー特異
的な、宿主に起源するリンパ球を特異的に枯渇される。「枯渇される」は、この
文脈においては、宿主中での抗ドナー応答を排除するかまたは有意に減少させる
に十分に、Ｔリンパ球の数を減少させるかまたはＴリンパ球の機能を低下させる
こと、従って、この組成物がドナーに投与される場合に、ＧＶＨＤの危険性を低
下させることをいう。関連する局面においては、本発明は、上記の造血細胞組成
物を作製する方法に関する。この方法は、同種異系または異種のドナーを使用し
て、上記の寛容原性の処置に宿主哺乳動物を供する工程を包含する。寛容原性の
処置の後、この方法は、宿主から造血細胞の組成物を単離する工程を包含する。
この細胞組成物は、宿主およびドナーに起源する造血細胞を含むが、ドナー特異
的な宿主由来のＴリンパ球は枯渇される。

【００６１】（Ｂ．細胞治療プロトコール）寛容原性の処置のプロトコールを完了することにより、ガン患者および骨髄移
植を必要とする悪性疾患および非悪性疾患を有している他の患者へのドナーリン
パ球の注入を用いる、続く同種異系の細胞治療のための基盤（ｐｌａｔｆｏｒｍ
）が提供され得る。なぜなら、寛容宿主によって受容されるドナー細胞は、移植
片対白血病（ＧＶＬ）効果または移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を誘導し得るから
である。このような非悪性疾患として、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：再生不良性貧血、酵素の欠損を生じる遺伝的な疾患、および造血幹細胞の
十分に定義された生成物の欠損によって引き起こされる疾患（例えば、乳児期の
大理石骨病における破骨細胞の欠損）、ならびに先天的および後天的な免疫不全
症候群におけるＢ細胞およびＴ細胞における不全。同種異系の細胞治療における
使用のための細胞のドナーは、宿主と不適合性のＭＨＣ（例えば、ヒトにおいて
は、ＨＬＡ）であり得るか、または宿主と同一のＭＨＣであり得る。ＭＨＣ不適
合性の場合には、ドナーおよび宿主は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの対立
遺伝子を共有し得ない。あるいは、これらは、１つ以上の（例えば、２個、３個
、４個、または５個の）ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ対立遺伝子を
共有し得る。ドナーおよび宿主がＭＨＣ同一である場合は、これらは、ＭｉＨＬ
不適合性であり得る。従って、これらは、好ましくは、一卵性双生児ではない。
同種異系の細胞治療は、例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５／２４９１０号およ
び同第ＷＯ９６／３７２０８号に記載されている。

【００６２】同種異系の細胞治療においては、抗腫瘍、または他の抗宿主の造血細胞の効果
は、宿主に対して同種異系の末梢血リンパ球を、単独で、またはＴ細胞の活性化
因子と組み合わせてのいずれかで投与することによって、達成される。あるいは
、同種異系の末梢血リンパ球は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）のようなＴ
細胞の活性化因子によってインビトロで「予め活性化」され、次いで、単独で、
または同じかもしくは異なるＴ細胞の活性化因子と組み合わせてのいずれかで、
投与される。好ましくは、約１０⁵から約１０⁹個の細胞／ｋｇの同種異系の末梢
血リンパ球の１つ以上の注入物（十分に定義されたリンパ球のサブセットを含む
）が、投与される。本明細書中で記載される寛容原性の処置が先行する場合は、
これらの同種異系のリンパ球の注入は、宿主において移植される必要がある、抗
ガンエフェクター細胞の拒絶がはるかに減少した機会を伴って行われる。さらに
、ＧＶＨＤの危険性は、宿主の残存している造血細胞によって、そして必要であ
る場合には、比較的遅い時期のドナーリンパ球の注入によって、減少させられる
か、または排除される。

【００６３】本明細書中に記載される寛容原性の処置のプロトコールの後の同種異系の細胞
治療は、ガンおよび他の疾患の状況においてだけではなく、ドナーに由来する感
染性因子に対する免疫を宿主に養子移入することが所望される場合にもまた、有
用であり得る。従って、本明細書中に記載される寛容原性のプロトコールにおい
て使用されるドナーが、感染性因子（例えば、Ｂ型肝炎；Ｉｌａｎら、Ｈｅｐａ
ｔｏｌｏｇｙ１８：２４６−５２（１９９３）を参照のこと）に対する免疫で
ある場合には、この免疫は、寛容原性のプロトコールの完了後に、ドナーに由来
するリンパ球を宿主に注入することによって、宿主に移入され得る。あるいは、
寛容原性のプロトコールの工程４において注入される幹細胞の調製物は、それ自
体が、免疫の養子移入を提供し得る。なぜなら、幹細胞の調製物は、免疫応答性
リンパ球を含み得るからである。

【００６４】枯渇によって媒介される同種異系および異種の寛容性誘導に関する上述の記載
から、特に、寛容原性のプロトコールの工程４であるその使用前に、宿主特異的
活性の造血細胞（例えば、ブタの造血細胞）を枯渇するための方法の考察から、
細胞治療が、宿主（すなわち、細胞治療のレシピエント）に対して異種である個
体、同様に、同種異系である個体に由来する細胞を使用して行われ得ることが、
明らかである。異種の細胞治療においては、リンパ球の同じ組成物が、同種異系
の細胞治療について上記された、例えば以下のような１つ以上のＴ細胞活性化因
子とともに、またはそれを伴わずに、使用され得る：ＩＬ−２、インターフェロ
ン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）、またはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）。さらに、細胞は、宿主へ
の投与の前に、インビトロまたはインビボのいずれかで、予め活性化され得る。
細胞治療に使用される細胞は、血液、脾臓、リンパ節、もしくは任意の他のリン
パ系細胞の供給源から獲得され得るか、またはこれらは、造血細胞の供給源（例
えば、骨髄もしくは胎児の肝臓）から獲得され得る。

【００６５】（ｉ）細胞治療に使用される細胞の枯渇細胞治療は、選択されていないリンパ系細胞を投与することによって、与えら
れ得る。しかし、一般的には、投与の前に、リンパ系細胞は、レシピエントの抗
原に対して反応性のＴ細胞を枯渇されるか、または宿主の抗原に対するＴ細胞の
応答性を枯渇される。以下の記載においては、用語「枯渇する」または「枯渇」
）は、第２の個体の抗原に対する応答性を有するＴ細胞の数を減少させること、
および／またはこのようなＴ細胞の応答性を低下させることをいう。枯渇は、応
答性リンパ球の数、またはリンパ球の応答性を、２０％、３０％、４０％、５０
％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％さえも減少させ
ることにより得る。

【００６６】宿主特異的活性のドナーの造血細胞を枯渇することに関する上述の記載では、
宿主／ドナーの用語が逆転した。細胞治療のために使用されるリンパ系細胞を枯
渇する方法に関する以下の考察においては、「宿主」および「ドナー」に関する
混同を回避するために、細胞治療に使用される細胞の供給源である個体を「第１
の個体」といい、そして細胞治療を受ける個体（例えば、ヒトのガン患者）を「
第２の個体」という。さらに、句「非同系」は、同種異系および異種の両方を含
むように理解される。

【００６７】細胞治療のためのそれらの使用の前にリンパ系細胞を枯渇する方法は、基本的
に、ドナー抗原に対して宿主を寛容化するために、上記の工程１〜４の１つ以上
の使用を含む。しかし、移植前に宿主哺乳動物を寛容化するために使用される工
程と、細胞治療に使用されるリンパ系細胞を枯渇するために使用される工程とを
区別するために、細胞治療に使用されるリンパ系細胞の枯渇に使用される工程は
、「工程Ａ〜Ｄ」と命名される。

【００６８】工程Ａ：第１の個体の機能的なＴリンパ球を排除しないが、減少させるために
十分な骨髄機能廃絶性ではないレジメンに対して、この第１の個体のリンパ系細
胞を曝露する。

【００６９】工程Ｂ：この第１の個体のリンパ系細胞を、非同系第２の個体の抗原と接触さ
せる。

【００７０】工程Ｃ：リンパ系細胞に対して、骨髄機能廃絶性ではない用量のリンパ球傷害
性試薬または寛容化試薬を送達することによって、この第２の個体の抗原に応答
性であるこの第１の個体のＴリンパ球を実質的に排除する。

【００７１】工程Ｄ：この第２の個体から得た造血幹細胞の集団を、この第１の個体に投与
する。

【００７２】本質的には、上記の工程１〜４を行うための同じ方法は、これらの工程のいく
つかまたは全てが、当業者によく知られている組織培養方法を使用してインビト
ロで行われ得ることを除いて、工程Ａ〜Ｄを行うために使用され得る。当然、工
程Ｄは、常にインビボであり、そして全ての枯渇手順がインビボで行われる場合
にのみ含まれ得る。

【００７３】リンパ系細胞は、（ｉ）工程Ａのみ、（ｉｉ）工程Ｂのみ、（ｉｉｉ）工程Ａ
およびＢ、（ｉｖ）工程ＢおよびＣ、（ｖ）工程Ｂ、Ｃ、およびＤ、（ｖｉ）工
程Ａ、Ｂ、およびＣ、または（ｖｉｉ）工程Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ、のいずれか
を使用して枯渇され得る。

【００７４】第２の個体に対して反応性の第１の個体のリンパ系細胞を枯渇する方法は、例
えば、第１の個体からリンパ系細胞を回収する工程、およびインビトロで工程Ａ
からＣを行う工程を包含し得る。あるいは、第１の個体において工程Ａを行った
後で、リンパ系細胞が第１の個体から単離され得、そして工程ＢおよびＣがイン
ビトロで行われ得る。別の実施形態においては、工程ＡおよびＢが、第１の個体
中で行われ得、リンパ系細胞が第１の個体から単離され得、そして工程Ｃがイン
ビトロで行われ得る。さらに、全ての工程が、必要に応じて工程Ｄを含んで、イ
ンビボで行われ得る。

【００７５】（ｉｉ）工程Ａ工程Ａは、治療に使用される細胞中のＴ細胞の総数を減少させ、そして必要に
応じて使用される。工程ＢおよびＣは、これらの細胞のみ、またはドナー抗原に
対して特異的なそのＴ細胞の反応性のみを枯渇するために使用される。以下の実
施例１０〜１３の実験によって示されるように、工程Ｃは、いくつかの場合（例
えば、ガン細胞が抗原として使用される場合）においては、排除され得る。なぜ
なら、工程Ｂは、十分に寛容原性であり得るからである。

【００７６】（ｉｉｉ）工程Ｂ工程２において使用されるのと同じ抗原供給源が、工程Ｂにおいて使用され得
、そしてこれらは、同じ方法によって獲得され得る。しかし、さらに、ガン細胞
が使用され得る。以下の実施例１０〜１３の実験によって示されるように、工程
Ｂのためのガン細胞を使用して枯渇されたリンパ系細胞は、ガンを有する哺乳動
物（例えば、ヒトのガン患者）の非同系細胞治療に特に有用であり得る。ＭＨＣ
および非主要組織適合性遺伝子座（ＭｉＨＬ）の両方、またはＭｉＨＬのみのい
ずれかで異なるマウスの系統を使用して行われた実験は、Ｙ系統のガン細胞に対
して曝されたＸ系統のマウスに由来するリンパ系細胞が、Ｙ系統の抗原に対する
移植片対宿主活性が実質的に枯渇されたにもかかわらず、Ｙ系統のマウスに対し
てガン細胞と共に移入された場合に、抗ガン治療効率を増強したことを示す。Ｙ
系統のガン細胞に対して曝されたＸ系統のリンパ系細胞の治療的な活性は、Ｙ系
統のリンパ系細胞に対して曝されたＸ系統のリンパ系細胞の活性よりも有意に高
かった。これは、少なくとも、ＭｉＨＬ不適合性のみの場合においては、正常な
曝露されていないＸ系統のリンパ系細胞の活性よりも有意に高かった。さらに、
Ｘ系統およびＹ系統がＭＨＣおよびＭｉＨＬの両方で異なるマウスの組み合わせ
において、正常な曝露されていないＸ系統のマウスに由来するリンパ系細胞は、
Ｙ系統の抗原を発現する宿主動物に移入された場合に、致死的なＧＶＨ活性を示
したが、Ｙ系統のガン細胞またはＹ系統のリンパ系細胞のいずれかに対して曝露
されたＸ系統の動物に由来するリンパ系細胞は、ＧＶＨ活性を実質的に枯渇され
た。一方、Ｘ系統およびＹ系統がＭｉＨＬのみで異なるマウスの組み合わせにお
いては、Ｙ系統のガン細胞へのＸ系統の動物の曝露によって、正常な曝露されて
いないＸ系統の動物に由来するリンパ系細胞と比較して、Ｙ系統特異的ＧＶＨ活
性のＸ系統のリンパ系細胞が枯渇されたが、Ｙ系統の動物に由来するリンパ系細
胞へのＸ系統の動物の曝露は、Ｘ系統のリンパ系細胞のＧＶＨ活性に対して影響
を有さなかった。

【００７７】（ｉｖ）工程Ｂについての腫瘍細胞の使用これらの実験は、哺乳動物（特にヒト）のガンの非同系細胞治療の新規の形態
を指摘し、この形態において、ＧＶＨＤ活性の治療に使用されるリンパ系細胞を
枯渇するために使用されるプロトコールはまた、リンパ系細胞における抗ガン治
療の増強された効率を生じる。別の組織不適合性の被験体のリンパ系細胞での細
胞治療を与えられた被験体は、他の被験体の抗原に対する非反応性（寛容）を確
立するために、上記の工程１〜４のうちのいずれかまたはすべてによって処置さ
れ得る。あるいは、この細胞治療は、これらの工程のいずれをも伴わずに、与え
られ得る。これは、例えば、無関係な原因（例えば、ＨＩＶＡＩＤＳ，遺伝的
な免疫不全、化学療法、または放射線治療）のために、有意に免疫学的に欠失し
ている（すなわち、８０％、９０％、９５％、または９９％を超えて機能的なＴ
細胞の集団が枯渇されている）患者に対して与えられ得る。この治療に使用され
るリンパ系細胞は、無関係なＭＨＣ適合性もしくは不適合性のヒト、関係するＭ
ＨＣ適合性もしくはＭＨＣ不適合性のヒト、または別の種（例えば、ブタ、もし
くは非ヒト霊長類）の個体に由来し得る。リンパ系細胞は、好ましくは、同系の
個体（例えば、一卵性双生児）には由来しない。

【００７８】工程Ｂに使用され得るガン細胞は、好ましくは、細胞治療を与えられる被験体
中に存在する型である（例えば、白血病、リンパ腫、乳ガン、肺ガン、胃腸のガ
ン、黒色腫、または尿生殖器のガン）。従って、このガン細胞は、同じ抗原また
は交差反応性の抗原を発現する。しかし、腫瘍細胞に対する曝露によって枯渇さ
れた非同系リンパ系細胞の抗ガン治療の増強された効率が、抗原特異的ではない
可能性は残されており、そして広範な種々の腫瘍に対する曝露によって枯渇され
た細胞が、所定の被験体によって保有される腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する可
能性が残されている。従って、工程Ｂはまた、被験体にものとは無関係な型の腫
瘍細胞を、枯渇因子として使用して行われ得る。

【００７９】工程Ｂに使用されるガン細胞は、好ましくは、患者のＭＨＣ分子（少なくとも
１つのＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子）を発現する。より好ま
しくは、これらは、その患者に由来する。ヒトの患者を含む全ての被験体に由来
する腫瘍細胞は、当業者に公知の標準的な方法によって得られる。非固形の血液
学的なガンの場合においては、この細胞は、被験体の血液、骨髄、脾臓、リンパ
節、または他のリンパ系組織から単離され得るかまたは富化され得る。固形の悪
性疾患の場合においては、腫瘍細胞の懸濁物は、原発性腫瘍または転移のいずれ
かの外科的な切除によって取り出された固形の腫瘍組織の破壊によって得られ得
る。患者の腫瘍細胞が入手可能ではないか、または十分な量を入手することがで
きない場合は、樹立された細胞細胞株を使用し得ることが可能である。このよう
な腫瘍細胞株は、患者のＭＨＣ分子を内因的に発現し得るか、またはこれらは、
このような分子をコードする遺伝子で安定にトランスフェクトされ得、そしてそ
れを発現し得る。必要である場合は、このようなトランスフェクトされた多数の
株は、各々、患者のＭＨＣ分子を、内因的に発現するかまたは安定なトランスフ
ェクションに起因して発現するかのいずれかである。任意の上記の腫瘍細胞の調
製物の細胞性画分（例えば、細胞溶解物または膜画分）もまた、工程Ｂの抗原と
して使用され得る。さらに、細胞性画分、または単離された腫瘍抗原が、抗原提
示細胞例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、またはＢリンパ球）と共同し
て、ドナーＴ細胞に対して提示され得る。これらは、新たに調製され得るかまた
は予め培養され得る。抗原提示細胞は、患者のＭＨＣ分子を発現し得、そして好
ましくは、その患者に由来する。このような抗原提示細胞は、工程Ｂでのそれら
の使用の前に、例えば、腫瘍細胞抽出物または腫瘍に関連するポリペプチド抗原
に由来するペプチドでパルスされ得る。あるいは、抗原提示細胞は、形質導入さ
れ得るか、または腫瘍に関連する全長ポリペプチド抗原もしくはこのような抗原
のサブ領域に対応するペプチドをコードする発現ベクターで安定にトランスフェ
クトされ得る。さらに、腫瘍細胞と抗原提示細胞との融合によって形成される細
胞のハイブリッドが、この方法の工程Ｂについて活性化抗原として使用され得る
。

【００８０】第２の個体（すなわち、細胞治療のレシピエント）がヒト患者であり、そして
工程Ｂがインビボで行われる場合には、第1の個体（すなわち、非同系細胞の供
給源）は、おそらく、患者の血族、または別の種の個体のいずれかであると想定
される。しかし、インビボ、インビトロ、血族、または別の種の個体である場合
には、抗原として使用される腫瘍細胞の増殖は、抗増殖因子（例えば、電離放射
線またはマイトマイシン−Ｃ）の十分な用量に対する腫瘍細胞の前曝露によって
実質的に排除され得る。あるいは、上記の細胞性画分が使用され得る。

【００８１】（ｖ）細胞の枯渇の抗原特異的ではない方法応答性Ｔ細胞を造血細胞から非特異的に枯渇するためのプロトコールは、工程
Ｂ〜Ｄのいずれをも伴わずない、工程Ａについての上記の任意の方法の使用を含
み得る。さらに、Ｔ細胞（またはＴ細胞以外の細胞）に結合する単一の抗体（モ
ノクローナルまたはポリクローナル）または抗体の組み合わせを使用する任意の
広範な種々の当該分野で公知の方法（例えば、磁気ビーズ、溶解性の補体、また
は蛍光活性化細胞分離）が、Ｔ細胞を枯渇するために使用され得る。このような
プロトコールは、１回または複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、
８回、１０回、または１２回）の処置を使用し得、そして１つ以上の方法が使用
され得る。さらに、これらは、インビボまたはインビトロのいずれかで行われ得
る。このようなプロトコールは、造血細胞集団中の実質的に全ての（例えば、８
０％を超え、好ましくは９０％を超え、より好ましくは９５％を超え、そして最
も好ましくは９９％を超える）Ｔ細胞の枯渇を生じる。上記のように、このよう
なプロトコールはまた、本発明の寛容化方法の工程４における使用の前に、宿主
に対して反応性のドナー細胞を枯渇するために使用され得ることが注意される。

【００８２】このようなプロトコールの一例が実施例１５に提供される。

【００８３】（ｖｉ）細胞組成物本発明はまた、第２の個体の抗原に対する反応性を枯渇されている、第１の個
体から得られたリンパ球を含有している、細胞組成物を含む。この枯渇は、好ま
しくは、工程Ａ〜Ｄの示される可能性のある組み合わせを含む上記の方法の１つ
によって行われている。このような方法として、工程Ｂおよび必要に応じて、工
程Ｄの使用（すなわち、第１の個体に対して第２の個体に由来する骨髄細胞を投
与する工程）のための、細胞性抗原および非細胞性抗原の両方の使用が挙げられ
る。従って、この組成物は、第１の個体に由来する（すなわち、第１の個体に対
して内因性の）細胞の２０％〜１００％、３０％〜１００％、５０％〜１００％
、７０％〜１００％、または９０％〜１００％を含み得る。この組成物の細胞は
、生理学的な溶液（例えば、生理食塩水溶液）中に懸濁され、そして適切な容器
（例えば血液バッグ、半透過性の血液バッグ、組織培養フラスコのような組織培
養容器、またはバイオリアクター）中に提供される。リンパ球の供給源（例えば
、血液、骨髄、脾臓、またはリンパ節）は、第１の個体から、枯渇の適切な段階
で得られ得、そして当業者によく知られている方法によって精製され得るかまた
は富化され得る。

【００８４】このような細胞組成物の「バッチ」が作製され得、そして適切なヒトまたは非
ヒト（例えば、豚、および非ヒト霊長類）ドナーに由来するリンパ球を使用して
供給者によって保存されることが想定される。リンパ球は、例えば、工程Ｂとし
て、全ての公知のＭＨＣ遺伝子の組み合わせで安定にトランスフェクトされ、そ
してそれらを発現する腫瘍細胞株の単一のものまたは組み合わせを使用して、枯
渇され得る。この方法においては、ＨＬＡ抗原の異なるセットに対してそれぞれ
寛容である、リンパ球のバッチが誘導される。これらの特注の予め寛容化された
リンパ球のバッチは、次いで、供給者に対して患者のＨＬＡハプロタイプの連絡
した後に、その患者が治療を必要としている医療従事者（例えば、腫瘍学者）に
供給され得る。

【００８５】非同系細胞治療の前に本発明の寛容原性の方法を実行することが提案される場
合は、医療従事者は、この寛容原性のプロトコールの工程２での使用のための抗
原性材料（例えば、造血細胞）の供給源を供給され得る。この抗原性材料は、細
胞治療に使用されるリンパ球が得られた個体に由来し得るか、または個体と同系
の個体に由来し得る。あるいは、適切なＨＡＬ遺伝子で安定にトランスフェクト
された細胞（例えば、非悪性造血細胞）、あるいは同様にトランスフェクトされ
た悪性腫瘍または非悪性腫瘍のいずれかの細胞の細胞抽出物が、使用され得る。

【００８６】（ｖｉｉ）細胞治療の方法被験体（好ましくは、ヒト患者）に対する上記の細胞組成物の投与を含む処置
方法もまた、本発明の範囲内である。上記に示されるように、このような被験体
は、必要に応じて、記載される寛容原性のレジメンの１つに供されている。処置
が与えれられ得る患者として、ガン患者（例えば、上記に列挙される腫瘍を有す
る患者）、ＨＩＶＡＩＤＳまたはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎のような感染性の
疾患に罹患している患者、タンパク質（例えば、ヘモグロビンもしくは酵素）の
欠損または異常に関連する遺伝的な疾患に罹患している患者、再生不良性貧血に
罹患している患者、先天的な免疫不全に罹患している患者、および自己免疫疾患
（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、全身性
エリテマトーデス、および筋無力症）に罹患している患者が挙げられる。

【００８７】（ｖｉｉｉ）製品上記に列挙されるような生物学的な細胞容器を含有しているパッケージング材
料（例えば、厚紙の箱）を含む製品もまた、本発明に含まれる。生物学的な容器
は、上記の任意の細胞組成物を含み、そしてパッケージング材料は、この組成物
が、その組成物を必要としている哺乳動物（例えば、上記に列挙される任意の疾
患を有する患者）に対してその組成物を投与する工程を包含する処置方法におい
て使用されることを示す、パッケージの挿入記事またはラベルを含み得る。

【００８８】本発明は、以下の例示的な実施態様を参照してさらに理解される。これらは、
単に例示であり、そして特許請求の範囲に記載されるような本発明の真の範囲を
制限するようには受け取られるべきではない。

【００８９】（実施例１）（材料および方法）（動物）近交系ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）（Ｈ−２^b）、ＤＢ
Ａ／２（Ｈ−２^d、ＣＢＡ（Ｈ−２^k）、Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ−２^d）、ＳＪＬ（Ｈ
−２^s）、および（ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ₁（Ｆ１）（Ｈ−２^b/d）
マウス、およびＬｅｗｉｓラットを、ＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨ
ａｄａｓｓａｈＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌＡｎｉｍａｌＦａｃｉｌｉ
ｔｙｉｎＪｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌから、Ｈａｒｌａｎ−Ｏｌａｃ
ｋ、Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、ＵＫに起源する交配させたつがいとともに、購入した。
２〜３匹の１ヶ月齢のマウスを、研究のために使用した。マウスを、自由に提供
される食餌および水を用いて、標準的な条件下で維持した。ほとんどの実験を、
Ｂ６→ＢＡＬＢ／ｃ株の組み合わせにおいて行った。

【００９０】（全リンパ系の照射（ＴＬＩ））マウスに麻酔し、次いで主要なリンパ節、甲状腺、および脾臓を電離放射線に
曝露するように設計された装置中に、以前に記載されているように、頭蓋、肋骨
、肺、四肢、および尾のほとんどを鉛で保護しながら、配置した。Ｓｌａｖｉｎ
ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４６：３４（１９７７）。放射線を、Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓのＸ線ユニット（２５０ｋｖ、２０ｍＡ）によって、Ｃｕ０．２ｍｍフ
ィルターを使用して７０ｃＧｙ／分の率で送達した。線源から皮膚の距離は、４
０ｃｍであった。

【００９１】（寛容原性処置）移植の前の馴化のための基本的なプロトコールは、１，２００ｃＧｙまでの総
線量までのｓＴＬＩ（２００ｃＧｙの１〜６回の毎日の曝露）、続いて、最後の
ＴＬＩ線量の後の日の３×１０⁷個のＢＭＣでの静脈内接種を含んだ。いくつか
のマウスには、ｓＴＬＩを全く投与しなかった（実施例９を参照のこと）。ＢＭ
Ｃの注入の１日後、実験マウスに、２００ｍｇ／ｋｇのＣｙ（Ｔａｒｏ、Ｉｓｒ
ａｅｌ）を静脈内注射した。Ｃｙを、注射の前に滅菌リン酸緩衝化生理食塩水中
に新しく溶解させた。異種移植片に対する寛容を誘導するためのＣｙプロトコー
ルの改変は、実施例８に記載する。ドナーのＢＭＣの第２回目の注入を、また、
Ｃｙの後に、いくつかのマウスに投与した。

【００９２】（骨髄および脾臓細胞の調製）ＢＭＣおよび脾臓細胞の単細胞の懸濁物を、１００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシンおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ、ＢｅｉｔＨａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）を補充したＰＢＳまたは
ＲＰＭＩ１６４０培地中に調製した。ＢＭＣを、総容量０．５ｍｌで、側方の尾
静脈中に注入した。

【００９３】（注入物のための血液細胞の調製）プールした新しい血液を、ヘパリンを含有しているチューブ（保存料を含まな
い）中に収集した。それぞれのレシピエントに、側方の尾静脈中に０．５ｍｌを
注入した。

【００９４】（モノクローナル抗体でのＢＭＣのＴ細胞の枯渇）モノクローナルラット抗−マウスＴｈｙ１抗体（ＹＴＳ１４８．３、ＩｇＭ
およびＹＴＳ１５４．７、ＩｇＧ２ｂ）を、Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ博士（Ｏｘ
ｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＫ）から得た。ＢＭＣ（１０⁷／ｍｌ）を
、１：２００の最終的な稀釈でＹＴＳ１４８．３抗体とともに４０分間インキ
ュベートし、洗浄し、そして１：１０の最終的な稀釈で、Ｌｏｗ−Ｔｏｘウサギ
補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｃａｎａｄａ）とともにさらに６０分間、３７℃に
てインキュベートし、洗浄し、そしてレシピエントに静脈内注射した。ＹＴＳ
１５４．７抗体を、インビボでのＢＭＣからのＴ細胞の除去のために使用した；
ＢＭＣ（３×１０⁶／ｍｌ）を、７５０μｇ、１５０μｇ、または３０μｇの抗
体とともに４℃にて６０分間インキュベートし、そして混合物をレシピエントに
静脈内注射した。

【００９５】（皮膚移植）皮膚移植を、寛容原性の処置の完了の２０日後に行った。１ｃｍ×１ｃｍの測
定した十分に厚い皮膚の移植片を、４Ｔｈｏｍａｓ外科手術用クランプによ
る移植片のベッド（ＴｈｏｍａｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に対して調
節した。肉様層を、移植片のベッド中で完全な状態で維持した。移植片は、ドナ
ーの色の毛が、軟らかくて可撓性である、下にある皮膚の上で成長した場合に受
け容れられたと考え、そしてドナーの上皮が失われた場合に拒絶されたと考えた
。

【００９６】（骨髄のプラグの移植）Ｂ６マウスの大腿骨を、筋肉を剥ぎ、そしてインビトロで４００ｃＧｙで照射
して、造血細胞の大部分を排除した。骨髄のプラグを、マンドリン線を有する大
腿骨の管の外側に機械的に押し出し、そして２つのプラグを、Ｃｈｅｒｔｋｏｖ
ら、Ｒａｄ．Ｒｅｓ．７９，１７７−１８６（１９７９）に記載されているよう
に、それぞれのレシピエントの左の腎臓のカプセルの下に移植した。

【００９７】（異所性の心臓移植）１〜２日齢のＢ６マウスの心臓を、Ｃｈｅｒｎｙａｋｈｏｖｓｋａｙａら、Ｔ
ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２９：４０９（１９８０）の方法に従って、寛
容原性の処置の２０日後に、耳の皮膚ポケットに移植した。ＥＣＧを、最初は移
植後２週間記録し、そしてその後１週間の間隔で記録した。

【００９８】（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））ＰＣＲを、以前に記載されているように、血液サンプルに由来する材料に対し
て行った。Ｐｕｇａｔｓｃｈら、ＬｅｕｋｅｍｉａＲｅｓ．１７、９９９−１
００２（１９９３）。簡潔には、血液サンプルを蒸留水中で溶解し、そして１２
，０００×ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、そして５０μｌの０．０５ＭのＮ
ａＯＨを細胞のペレットに添加した。サンプルを１０分間沸騰させ、次いで６μ
ｌの１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）を添加した。次いで、サンプルを、１２，０
００×ｇで遠心分離し、そして上清をアッセイのために使用した。増幅のために
選択した５’−および３’−オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにＰＣＲ反
応条件は、Ｐｕｇａｔｓｃｈらに記載されている。反応産物を、０．０５μｇ／
ｍｌのエチジウムブロマイドを含有している１．６％のアガロースゲル（Ｓｉｇ
ｍａ、ＵＳＡ）上で可視化した。

【００９９】（マウスのＢＣＬ１）ＢＣＬ１、ＢＡＬＢ／ｃ起源のＢ細胞白血病／リンパ腫（Ｓｌａｖｉｎ，Ｓ．
およびＳｔｒｏｂｅｒ，Ｓ．、Ｎａｔｕｒｅ、２７２：６２４（１９７８）；Ｓ
ｌａｖｉｎ，Ｓ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４１：４１６２（１９８１））
を、ＢＡＬＢ／ｓマウス中での連続的な接種によってインビボで維持した。ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス中への１０〜１００個のＢＣＬ１細胞の接種は、巨脾腫、極度の
末梢血リンパ球増加症（５００，０００リンパ球／ｍｌまで）、および１００％
のレシピエントの死亡によって特徴付けられる、代表的なＢ細胞白血病／リンパ
腫を生じる。ＢＣＬ１はまた、Ｆ１レシピエントにおいて白血病を引き起こすが
、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントにおけるよりも長く発症する（Ｓｌａｖｉｎら、（
１９８１）、前出）。

【０１００】（ドナーマウスの免疫化）ドナーＣ５７ＢＬ／６（Ｈ２−^b）マウスを、ＭＨＣおよび主要ではない組織
適合性遺伝子座（ＭｉＨＬ）の両方の同種異系抗原に対して、ＢＣＬ１を保有し
ているＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）マウスから得た脾臓細胞（１回の免疫について
１匹のマウスあたり３０×１０⁶個の細胞）、または正常なＢＡＬＢ／ｃマウス
から得た脾臓細胞（１匹のマウスあたり３０×１０⁶個）のいずれかでの注射に
よって、免疫化した。ドナーＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２^d）マウスを、Ｃ５７ＢＬ／
６マウスの免疫化に使用したものと同じ細胞の集団での注射によって、ＭｉＨＬ
同種異系抗原のみに対して免疫化した。免疫化を、屠殺の２０日前から１０日前
に、腹腔内注射によって行い、脾臓を回収し、そして単離された脾臓細胞をＦ１
またはＢＡＬＢ／ｃ宿主動物に導入した。

【０１０１】（全身の照射（ＴＢＩ））マウスを、１７０ｃＧｙ／分の線量率で、８０ｃｍの線源から皮膚までの距離
で、線形加速装置（ＶａｒｉａｎＣｌｉｍａｃ６Ｘ）によって送達される４
００ｃＧｙの単回の線量を用いて、ＴＢＩによって馴化した。

【０１０２】（ＢＣＬ１の免疫療法のための脾臓細胞の移植）上記に記載されるプロトコールを使用して免疫化したＣ５７ＢＬ／６またはＢ
１０．Ｄ２ドナーに由来する脾臓を、ナイロンメッシュを使用して、単細胞懸濁
物に細かく裂き、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ，ＢｅｉｔＨａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）中の１０％のウシ胎児血
清で２回洗浄し、そして静脈内注射した。

【０１０３】（ＢＣＬ１に対するＧＶＬの影響）ＧＶＬの誘導を評価するためのアッセイを、以下のように行った。ＭＨＣおよ
びＭｉＨＬ同種異系抗原の両方を含む不適合性にまたがるＧＶＬを試験するため
に、免疫化したか、またはコントロールの免疫化していないＣ５７ＢＬ／６ドナ
ーから得た１０⁴個の新しいＢＣＬ１細胞および３０×１０⁶個の脾臓細胞の全て
を、ＴＢＩの２４時間後に、Ｆ１レシピエント中に注入した。ＭｉＨＬ同種異系
抗原のみに関する不適合性にまたがるＧＶＬを試験するために、免疫化したか、
またはコントロールの免疫化していないＢ１０．Ｄ２ドナーから得た２×１０³
個のＢＣＬ１細胞および３０×１０⁶個の脾臓細胞の全てを、ＴＢＩの２４時間
後に、ＢＡＬＢ／ｃレシピエント中に注入した。既知の腫瘍細胞数の投与は、Ｇ
ＶＬの効果の定量的な測定を可能にした。

【０１０４】（キメリズムについてのアッセイ）Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞による、ＢＡＬＢ／ｃまたはＦ１レシピエントのキメ
ラ化を、特異的な同種異系抗血清およびウサギの補体を用いて、インビトロでの
補体依存的細胞傷害性アッセイを使用して、脾臓または血液サンプル中の宿主ま
たはドナー型細胞の割合を試験することによって測定した。Ｍｏｒｅｃｋｉら、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６５：１４６８（１９８７）。特異的な同種異系抗血
清（「ＢＡＬＢ／ｃ抗−Ｃ５７ＢＬ／６」および「Ｃ５７ＢＬ／６抗−ＢＡＬＢ
／ｃ」）を、十分に厚い皮膚の同種異系移植片での関連するマウスの交差免疫、
続く１〜２週間の間隔での３０×１０⁶個のドナーの脾臓細胞の６回の静脈内注
射によって調製した。マウスを放血させ、そして血清を−７０℃で保存した。

【０１０５】ＢＡＬＢ／ｃまたはＦ１レシピエントに由来する脾臓または末梢血細胞を、同
種異系抗血清およびウサギの補体の両方とともにインキュベートした。宿主ＢＡ
ＬＢ／ｃ細胞を、抗−Ｃ５７ＢＬ／６抗血清ではなく抗−ＢＡＬＢ／ｃで溶解し
、宿主Ｆ１細胞を、抗−ＢＡＬＢ／ｃおよび抗−Ｃ５７ＢＬ／６抗血清の両方で
溶解し、そしてＣ５７ＢＬ／６ドナーマウスに由来するＢＡＬＢ／ｃＦ１マウ
ス中の細胞を、抗−Ｃ５７ＢＬ／６抗血清のみによって溶解した。キメリズムを
、以下のように計算したドナー型（Ｃ５７ＢＬ／６）細胞の％として表現した：ドナー型（Ｃ５７ＢＬ／６）細胞の％＝抗Ｃ５７ＢＬ／６抗血清で溶解した細
胞の％−抗ＢＡＬＢ／ｃ抗血清で溶解した細胞の％−補体のみで溶解した細胞の
％。

【０１０６】（ＢＣＬ−１白血病の発症をモニターするための連続的なＰＢＬの計数）末梢血サンプル（２０μｌ）を、ヘパリン化したガラスキャピラリーを使用し
て毎週静脈穿刺することによって得た。末梢血白血球（ＰＢＬ）の数を、２％の
酢酸中での赤血球の溶解後に、血球計数器を使用して決定した。

【０１０７】（養子移入による残存しているＢＣＬ１細胞の検出）インビボでのアッセイを、処置した実験マウス中の残存しているＢＣＬ１細胞
の検出のために使用した。疾患の証拠を有さない処置したマウスに由来する脾臓
細胞のプールから得た１０⁵個のリンパ球のアリコートを、正常な２次のＢＡＬ
Ｂ／ｃレシピエント（１つの群あたり１０匹のマウス）に対して養子移入した。
白血病の発症を、毎週末梢血白血球（ＰＢＬ）の数を計数し、脾臓の肥大、およ
び生存性をモニターすることによって、決定した。

【０１０８】（ＧＶＨＤのモニタリング）レシピエントを、生存性、ならびに、ひだになった毛皮、下痢、および測定可
能な体重の減少のようなＧＶＨＤの臨床的な徴候についてモニターした。養子移
入の時点で、肝臓および肺の切片のサンプルを、ＧＶＨＤの組織学的な証拠につ
いて試験するために、それぞれのマウスから得た。組織学的な調製物を、２つの
盲目的な基準について独立した病理学者によって分析した。

【０１０９】（サイトカインアッセイ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、イ
ンターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、および
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を、宿主（レシピエント）動物への移植
のための収集の時点で、ドナー（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓細胞の上清中で測定し
た。レシピエント（Ｆ１）脾臓細胞の上清のサイトカインレベルを、ドナーＣ５
７ＢＬ／６脾臓細胞の移植後３週間で測定した。サイトカインを、当業者によく
知られている標準的な方法を使用する捕捉のために、マウスのサイトカイン特異
的モノクローナル抗体を使用して、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによって測定し
た。捕捉抗体を結合する決定基とは重複しないサイトカイン決定基に結合する抗
体、およびアルカリホスファターゼと結合体化した抗Ｉｇ抗体を、検出のために
使用した。標準曲線を、それぞれのサイトカインの標準的なサンプルを用いて作
成し、そして未知のサンプル中のサイトカインの濃度を標準曲線から決定した。

【０１１０】（インビトロでのＴ細胞増殖アッセイ）有糸分裂促進因子によって誘導されるＴ細胞の増殖応答を、Ｔ細胞の有糸分裂
促進因子であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、１０μｇ／ｍｌ）またはフィトヘ
マグルチニン（ＰＨＡ、１μｇ／ｍｌ）の存在下で３日間、脾臓細胞を培養する
ことによって測定した。［³Ｈ］−チミジンを、培養の最後の６時間に培養物に
添加し、そしてＴ細胞の増殖を、細胞の収集、および当業者に公知の放射活性技
術を使用して、細胞のＤＮＡ中に取りこまれた［³Ｈ］−チミジンの１分当たり
の計数（ｃｐｍ）によって測定した。

【０１１１】（インビトロでの細胞によって媒介される溶解アッセイ）ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびマウスの脾臓もしくは骨髄の集団を
、ＮＫ感受性の標的細胞（ヒトのＫ５６２細胞およびマウスのＹＡＣ−１細胞）
、およびＮＫ耐性の活性化されたＮＫ感受性の標的細胞（ヒトのＤａｕｄｉ細胞
およびマウスＰ８１５細胞）を溶解するそれらの能力について、標準的な⁵¹Ｃｒ
放出アッセイを使用して試験した。簡潔には、⁵¹Ｃｒで標識した標的細胞を、４
時間の間、エフェクター細胞に対する種々の標的細胞の比での、ＰＢＭＣエフェ
クター細胞とともに３７℃でインキュベートした。インキュベーションの終了時
に、細胞を、遠心分離によってペレット化し、そして上清の等量のアリコートを
、それぞれのアッセイ培養ウェルから取りだし、そして放射活性について計数し
た。溶解パーセントを、以下の式によって計算した：

【０１１２】

【数１】ここで：ｃｐｍ（ｅｘｐ．）は、標的細胞およびエフェクター細胞を含有してい
る実験培養ウェルに由来する上清中で検出されたｃｐｍである；ｃｐｍ（ｃｏｎｔ．）は、標的細胞を含有しているが、エフェクター細胞は含
まないコントロール培養ウェルに由来する上清中で検出されたｃｐｍの平均値で
ある；そしてｃｐｍ（ｍａｘ．）は、標的細胞、および界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸
ナトリウム）または酸（例えば、１ＮＨＣｌ）を含有している培養ウェルに由
来する上清中で検出されたｃｐｍの平均値であり、そして溶解によって標的細胞
から放出可能な放射活性の最大量を表す。

【０１１３】（統計学的分析）処置したマウスおよびコントロールマウスを比較する結果の統計学的な有意性
を、独立したｔ試験によって計算した。

【０１１４】（実施例２）（ｓＴＬＩ単独で、またはｓＴＬＩおよびＣｙで処置したマウスの非特異的免
疫抑制）実験の第１のセット（表１）においては、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００ｃＧ
ｙ／画分で、６、８、もしくは１２（実験群）または１７（コントロール群）個
のＴＬＩの画分を与えた。ＴＬＩの後、Ｂ６ドナーに由来する３×１０⁷のＢＭ
Ｃを、最後のＴＬＩの１日後に投与した。Ｂ６ドナーに由来する皮膚の同種異系
移植片を、ＢＭＣの移入の２０日後に、移植した。

【０１１５】実験の第２のセット（表２）においては、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントの５つの
群に、６個の画分の２００ｃＧｙ／日のｓＴＬＩを投与し、続いて１日後に、２
００ｍｇ／ｋｇのＣｙを静脈内で投与した。上記の馴化後、５つの群を、以下に
記載するように処置した。群１は、３×１０⁷個のＢＭＣを受けたが、群２は、
３×１０⁷個のＢＭＣおよび５×１０⁶個の脾臓細胞を受けた。群３は、０．３ｍ
ｌの全血を受けた。群４は、３×１０⁶個のＢＭＣを受けたが、群５は、３×１
０⁶個の、Ｔ細胞を枯渇したＢＭＣを受けた。Ｔ細胞の枯渇を、実施例１に記載
するように、モノクローナル抗体Ｔｈｙ１およびウサギの補体を用いて、インビ
トロで行った。上記の５つの群の全てについて、細胞および全血をＢ６ドナーか
ら得、そして静脈内で注入した。皮膚の同種異系移植片を、ＢＭＣまたは血液の
移入の２０日後に移植した。

【０１１６】（結果）ＴＬＩの長い経過（１７個の画分、それぞれ２００ｃＧｙ）とは対照的に、Ｔ
ＬＩの短い経過（ｓＴＬＩ）は、同種異系のＢＭＣまたは血液に由来する幹細胞
の受容能について不十分であった。表１は、Ｂ６ドナーに由来する３×１０⁷個
の完全に不適合なＢＭＣを受けているＢＡＬＢ／ｃマウスのいずれもが、６個の
画分のＴＬＩの後に造血性細胞キメラとはならなかったが、同種異系のＢＭＣの
一貫した受容能は、１７個の画分のＴＬＩの後で得られたことを示す。表１に示
すように、ｓＴＬＩおよび同種異系のＢＭＣまたは同種異系の血液細胞での処置
の後、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントは生存したままであり、いずれもＧＶＨＤを発
症せず、そして全てが、Ｂ６の皮膚の同種異系移植片を拒絶した。従って、ｓＴ
ＬＩ単独の後には、ドナーの同種異系移植片を拒絶するために十分な数の免疫応
答性細胞が、宿主中に残っている。

【０１１７】

【表１】

【０１１８】

【表２】鮮明な比較においては、ｓＴＬＩ（６個の画分、それぞれ２００ｃＧｙ）の最
後の画分の１日後に与えた単回のＣｙ（２００ｍｇ／ｋｇ）の注射は、非特異的
な免疫抑制を増大し、そして宿主がＢＭＣ、脾臓、および血液細胞を受け容れる
ことを可能にした。しかし、全てのレシピエントが、典型的な急性のＧＶＨＤを
発症し、これは、ほとんどの場合において致死的であった（表２）。ＧＶＨＤを
有するレシピエントの生存時間は、接種物中に存在する成熟した免疫応答性Ｔ細
胞の数の関数として現れた。３×１０⁷個のＢＭＣを接種したマウスの平均の生
存時間は、５×１０⁶個のＢ６脾臓細胞と混合した同数のＢＭＣのレシピエント
と比較して、４倍長かった（表２、群１および２）。より少ない数のＢＭＣ（３
×１０⁷個の代わりに３×１０⁶個）の移入は、有意には生存性を延長しなかった
（表２、群１および４）。

【０１１９】ｓＴＬＩおよびＣｙの後でＴ細胞を枯渇されたＢＭＣを受けた群５のマウス（
表２）においては、ＧＶＨＤを防ぐことに成功した。これらの実験マウスのいず
れもが、ＧＶＨＤを発症せず、そしてこれらの全てが生存したままであったが、
１匹を除く全てのマウスが、ドナーのＢＭＣを拒絶した。従って、延長された皮
膚の同種異系移植片の生存性が、７匹のレシピエントのうちの１匹だけにおいて
観察された。

【０１２０】（実施例３）（残存しているドナーの同種異系反応性の宿主の免疫応答性Ｔ細胞の抗原特異
的な排除）ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの３つの群に、２００ｃＧｙ／日の６個の画
分でｓＴＬＩを投与した。Ｂ６ドナーに由来するＴ細胞を枯渇していないＢＭＣ
（０日）を、全ての３つの群のＢＡＬＢ／ｃレシピエントに静脈内で移入した。
次の日に、全てのレシピエントに、２００ｍｇ／ｋｇのＣｙを投与した。１つの
群（表３、群１）は、２０日目にＢ６ドナーに由来する皮膚移植片を受けた。第
２の群（表３、群２）に、２日目に、Ｂ６ドナーに由来する３×１０⁷個のＴ細
胞を枯渇していないＢＭＣを受け、続いて２０日目に、皮膚移植片を受けた。第
３の群（表３、群３）は、２日目に、Ｂ６ドナーに由来する３×１０⁶個のＴ細
胞を枯渇していないＢＭＣを受け、続いて２０日目に皮膚移植片を受けた。

【０１２１】血液中のドナー細胞のレベルを、実施例１のプロトコールに従って、１００日
目に全ての生存しているマウスにおいてアッセイした。

【０１２２】

【表３】（結果）ほとんどのマウスが、血液中のドナーの造血性細胞の比較的小数（７％〜２０
％）との混合したキメラに転換した（表３、群１）。Ｃｙの１日後に移植された
ドナーのＴ細胞を枯渇されていないＢＭＣは、良好に植え付けられたが、ＧＶＨ
Ｄを誘導しなかった（表３、群２、３）。

【０１２３】（実施例４）（低用量のＴ細胞を枯渇されたドナーのＢＭＣの移入による、安定なＧＶＨＤ
を含まない混合されたキメラの確立）ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの２つの群を、Ｔ細胞を枯渇されていないＢ
ＭＣの代わりに、２日目にＴ細胞を枯渇したＢＭＣを投与したことを除いて、実
施例３に記載するように処置した。１つの群（表３、群４）に、Ｂ６ドナーに由
来する３×１０⁶個のインビトロでＴ細胞を枯渇したＢＭＣを投与した。１つの
さらなる実験において実証されるように、全部で２×１０⁶個のＴ細胞を枯渇さ
れたＢＭＣが十分であった（データは示さない）。他の群（表３、群５）には、
Ｂ６ドナーに由来する３×１０⁶個のインビボでＴ細胞を枯渇したＢＭＣを投与
した。Ｔ細胞の枯渇を、実施例１に記載するように行った。

【０１２４】（結果）同種異系のドナーＢＭＣに由来する免疫応答性Ｔ細胞の排除は、ＧＶＨＤの予
防に重要であった（図１）。穏やかに免疫抑制されたレシピエントにおいては、
ドナーのＢＭＣに由来するＴ細胞のインビトロでの枯渇の後、全ての処置された
マウスが、血液中のドナー細胞の２０％〜５０％を有する安定な混合されたキメ
ラに転換した。安定な混合されたキメラマウスが、全ての厚みのＢ６の皮膚の同
種異系移植片を受容し、そしてＧＶＨＤの臨床的な徴候を有することなく１５２
〜２９０日間生存した（表３、群４）。同様の結果を、ＢＡＬＢ／ｃの皮膚の同
種異系移植片の永久的な（＞１５０日）生存性を有するＢＡＬＢ／ｃ→Ｂ６キメ
ラについて同一のプロトコールを使用して得た（データは示さない）。

【０１２５】ドナーのＢＭＣからのインビボでのＴ細胞の枯渇は、インビトロでのＴ細胞の
枯渇よりも良好ではなかった（表３、群５）。インビボでＴ細胞を枯渇したＢＭ
Ｃを受けたマウスのうち、２分の１のみは、ＧＶＨＤを有さないままであり、そ
して２５０日以上生存した（表３、群５）。これらの動物を全て、安定な混合さ
れたキメラであること、そして全てがドナーの皮膚の同種異系移植片を受容した
ことを確認した。

【０１２６】（実施例５）（ドナーのＢＭ間質および新生児の心臓の同種異系移植片に対する寛容性）５つの群のＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスを、６個の画分の２００ｃＧｙ／
日の投与によってｓＴＬＩで馴化した。次いで、これらの群の全ては、Ｂ６ドナ
ーの３×１０⁷個のＴ細胞を枯渇していないＢＭＣを、最後のＴＬＩの画分の１
日後に静脈内で受けた。１用量のＣｙ（２００ｍｇ／ｋｇ）を、ＢＭＣの移入の
１日後ではあるが、同種異系移植片の移植の前に与えた。Ｃｙの２４時間後、群
１（表４）に、Ｔ細胞を枯渇していないＢＭＣを移植したが、一方、群２（表４
）に、インビトロでＴ細胞を枯渇したＢＭＣを移植した。群３（表４）に、Ｃｙ
の１日後に、ＢＭＣ間質を移植し、群４（表４）に、Ｃｙの２０日後に心臓を、
そして群５に、Ｃｙの２０日後に皮膚を移植した。全ての同種異系移植片は、Ｂ
６ドナーに由来した。

【０１２７】

【表４】（結果）未操作ドナーＢＭＣの２回目の注入を与えられたマウスは、移植片の受容能を
有したが、この２２匹のマウスのうちの２０匹が、細胞移入後３７〜４５日でＧ
ＶＨＤによって死亡した。この２回目の注入でＴ細胞枯渇ＢＭＣを移植されたマ
ウスは、移植片の受容能およびはるかに高い移植片の生存を有した。

【０１２８】Ｔ細胞枯渇ドナーＢＭＣの２回目の接種を受けないＣｙの１日後のＢＡＬＢ／
ｃレシピエントの腎臓嚢下での、Ｂ６ドナー由来の２つの大腿プラグの移植は、
十分に発達した異所性の骨の形成を生じ、これは、Ｘ線分析および引き続く剖検
によって確認された。この骨は、ドナー造血およびレシピエント造血の両方を支
持した（表４、群３）。異所性の骨形成−造血（ｏｓｔｅｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏ
ｉｅｔｉｃ）部位のフラグメントは、正常なマウスの腎臓嚢下に再移植された場
合、ドナー起源の第２のレシピエントにおいて骨および異所性の造血部位を形成
したが（Ｂ６レシピエントにおいて９／９の良好な同種異系移植片）、ＢＡＬＢ
／ｃマウスにおいては形成されなかった（０／９）。これらのデータは、これら
のマウス中の異所性の骨形成−造血部位が、ドナー起源であったことを示す。

【０１２９】同じ処置はまた、異所的に移植された、１〜２日齢のＢ６ドナーから得られた
新生児の心臓移植片の受容能についても十分であった。結果は、寛容原性の処置
の２０日後にＢＡＬＢ／ｃレシピエント耳の皮膚ポケット中に移植した心筋が、
８０日を超えてもＥＣＧ陽性であったことを示す（表４、群４）。ドナー由来の
新生児の心臓移植片を受容した全てのマウスにおいて、心筋の収縮もまた可視的
に検出され得た。ｓＴＬＩおよびＣｙのみを受けたマウスは、３０日以内にＢ６
ドナー由来の大腿プラグおよび新生児の心臓移植片の両方を拒絶した（データは
示さない）。

【０１３０】ｓＴＬＩ、ＢＭＣ、およびＣｙを受けたほとんどのレシピエントが、ドナーＢ
ＭＣ、ＢＭ間質前駆体細胞、および新生児の心臓の同種異系移植片を受容した。
しかし、この条件付けは、同じドナーから得られた皮膚同種異系移植片の生存を
確実にするためには十分ではなかった。

【０１３１】（実施例６）（マウスにおける安定なドナー皮膚同種異系移植片の受容能のために必要とさ
れる条件付け）１つの群のマウスに、ｓＴＬＩ、ＢＭＣ、およびＣｙを、実施例５に記載する
ように投与した。この群（表４、群６）はまた、Ｃｙの１日後であるが、皮膚同
種異系移植片の前に、３×１０⁶のＢ６インビトロＴ細胞枯渇Ｂ６ドナーＢＭＣ
の２回目の接種を受けた。

【０１３２】（結果）混合造血細胞のキメリズムが、試験した全ての実験動物（ドナー型の皮膚同種
異系移植片を、受容した実験動物および拒絶した実験動物）について実証された
。しかし、キメリズムのレベルは、明らかに、Ｃｙの投与後に懸濁物中またはＢ
Ｍの大腿プラグ内のドナーＢＭＣを受けたマウス（２０〜５０％のドナー細胞）
において、ＢＭＣの２回目の注入を受けなかったマウス（２０％より少ないドナ
ー細胞）と比較して高かった。これらのデータは、皮膚同種異系移植片の受容能
（これは、強力な免疫原である）が、レシピエント中の造血細胞のキメリズムの
レベルに依存することを示す。

【０１３３】それらの血液中に２０％以上のドナー細胞を有する混合キメラは、任意のさら
なる処置を伴わずに、２７０日を超える間でドナーの皮膚同種異系移植片を受容
した（表４、群６）。ドナーＢＭＣの２回目の接種を受けなかったマウスのほと
んどは、血液中に２０％未満のドナー細胞を有し、そしてドナーの皮膚同種異系
移植片を拒絶した（表４、群５）。それにもかかわらず、この同じ群のマウスは
、他のドナーに由来の組織を受容した。これらのデータは、血液中の比較的少数
のドナー細胞（例えば、約２０％未満）が、骨髄由来間質細胞および心臓移植片
の首尾よい移植には十分であり得るが、強力なＭＨＣ障壁を横切る同じドナーに
由来する皮膚同種異系移植片の一貫した受容能が、より高いレベルの造血細胞の
キメリズムを必要とすることを実証する。

【０１３４】（実施例７）（寛容原性の処置によって誘導される移植寛容の特異性）インタクトなＢ６皮膚同種異系移植片を１５０日間有する寛容性ＢＡＬＢ／ｃ
レシピエントは、元のＢ６皮膚同種異系移植片をインタクトに維持しながら、第
３のパーティー（ＣＢＡ）ドナーから得られた第２の同種異系移植片を、１８〜
２０日以内に拒絶した。このことは、ドナー型特異的な移植の寛容性が、無関係
な移植抗原に対する同種異系反応性の完全な発現を伴う正常な免疫応答を生じ得
るレシピエント中で誘導され、そして維持されたことを示す。

【０１３５】ドナーの皮膚の同種異系移植片の受容能を、以下を含む、研究した全ての株の
組み合わせにおいて観察した：ＤＢＡ→ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝１０）、Ｂ６→ＣＢ
Ａ（ｎ＝３）、Ｂ６→ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝２１）、およびＢＡＬＢ／ｃ→Ｂ６（
ｎ＝９）。

【０１３６】（実施例８）（ラット→マウスの組み合わせにおける、皮膚異種移植片に対する移植寛容の
誘導のための寛容原性の処置の適用）２つの群のマウスに、２００ｃＧｙ／日の６画分のｓＴＬＩを投与した。ｓＴ
ＬＩでの条件付け後、両方の群に、３０×１０⁶の非Ｔ細胞枯渇Ｌｅｗｉｓラッ
トＢＭＣを静脈内投与した。第１の群には、翌日、単回用量の２００ｍｇ／ｋｇ
のＣｙを与えた。別の群には、翌日に、３×１０⁷の非Ｔ細胞枯渇ラットＢＭＣ
を投与した。この第２の群においては、第１の群に与えた単回の２００ｍｇ／ｋ
ｇの用量とは対照的に、６０ｍｇ／ｋｇのＣｙを３日間毎日与えた。第１用量の
Ｃｙを、１回目のラットＢＭＣ接種の１０時間後に与え、第２用量を、２４時間
後に与え、そして第３用量を４８時間後に与えた（下記を参照のこと）。３用量
の６０ｍｇ／ｋｇのＣｙの投与後、２回目の３×１０⁷の非Ｔ細胞枯渇ラットＢ
ＭＣの接種を、投与した。

【０１３７】（結果）上記のように処置した第１の群のマウス（表５、群１）は、Ｌｅｗｉｓラット
由来の３×１０⁷の非Ｔ細胞枯渇ＢＭＣの２回目の接種を受容した。しかし、ほ
とんどのレシピエントにおいては、致死的なＧＶＨＤが誘導された。このことは
、比較的穏やかで、かつ非骨髄機能廃絶性の免疫抑制性の条件付けであるにも関
わらず、ドナー細胞の迅速な移植（ｅｎｇｒａｆｍｅｎｔ）を示唆する（表５、
群１）。興味深いことに、ＧＶＨＤを発症したマウスは、ドナー細胞の受容能を
示し、この疾患に屈服する前に、ドナー由来の皮膚移植片をなお拒絶し得た。こ
れらの結果によって、宿主対移植片反応を媒介する、残存するドナー反応性宿主
Ｔ細胞が、免疫抑制性／寛容原性の処置を生存し得、そして高度に免疫原性であ
るドナー由来の皮膚異種移植片の拒絶を生じ得るという観察を確認する。

【０１３８】

【表５】結果は、この第２の群において、Ｃｙを６０ｍｇ／ｋｇの３回の等用量に分け
、そして１回目の非Ｔ細胞枯渇ラットＢＭＣの注入の１０時間後、２４時間後、
および４８時間後に注射した場合に改善された。これらの条件下では、２０匹の
Ｂ６レシピエントのうちの１５匹が、完全な厚みのＬｅｗｉｓラットの皮膚異種
移植片を受容した（表２、群２）。Ｃｙ投与プロトコールを改変することによっ
て、宿主の異種反応性細胞が、より効率的に制御され得る。正常なドナーの毛の
増殖を、全ての１５匹のレシピエントにおいて観察し、そしてそのうちの５匹が
、致死的なＧＶＨＤを発症した。これらの生存しているマウスは、ＧＶＨＤの臨
床的徴候を発症しなかったが、これらは、非Ｔ細胞枯渇異種ＢＭＣを移植されて
おり、このことは、残存する宿主型の造血細胞が、ドナー由来免疫応答性Ｔ細胞
を、拒否効果（ｖｅｔｏｅｆｆｅｃｔ）を通じてダウンレギュレートし得るこ
とを示唆する。

【０１３９】（実施例９）（ＧＶＤＨ非発症（ＧＶＨＤ−ｆｒｅｅ）およびドナー型皮膚同種異系移植片
の生存に対する、種々の用量のＴＬＩの効果）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０〜６用量のｓＴＬＩ（各用量は、２００ｃＧｙであ
る）処置した。ｓＴＬＩの投与後、１つの群のマウスに、Ｃｙ（２００ｍｇ／ｋ
ｇ）を受容させ、１日後に、Ｂ６ドナーから得た３×１０⁷または３×１０⁶のＢ
ＭＣ（非Ｔ細胞枯渇）を受容させた。第２の群のマウスには、ｓＴＬＩの１日後
に、Ｂ６ドナー由来の３×１０⁷のＢＭＣ（非Ｔ細胞枯渇）を受容させた。これ
らのマウスに、２４時間後、Ｃｙ（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与した。このＣｙの
１日後に、これらのマウスに、Ｂ６ドナーから得た３×１０⁷または３×１０⁶の
非Ｔ細胞枯渇ＢＭＣを再度受容させた。第３の群のマウスには、ｓＴＬＩの後に
、Ｂ６ドナー由来の０．３ｍｌの血液を受容させ、そして２４時間後に、Ｃｙ（
２００ｍｇ／ｋｇ）を受容させた。再度、Ｃｙの１日後に、Ｂ６ドナーから得た
３×１０⁷または３×１０⁶の非Ｔ細胞枯渇ＢＭＣをこれらのマウスに投与した。
２０日後、ドナーＢ６の皮膚を、全ての群の生存しているマウスに移植した。

【０１４０】別のセットの実験を行って、ドナー細胞のレベルと皮膚同種異系移植片の受容
能とを相関付けた。寛容原性の処置には、種々の数のｓＴＬＩ用量、１日後の３
×１０⁷のＢＭＣ、そして２４時間後のＣｙ（２００ｍｇ／ｋｇ）を含んだ。Ｃ
ｙ投与の１日後、３×１０⁷のＢＭＣの２回目の注入を投与した。ドナーの皮膚
を２０日後に移植した。宿主マウス中のドナー血液細胞の割合を、皮膚移植の１
００〜１３０日後に評価した。

【０１４１】別のセットの実験においては、ｓＴＬＩ処置ＢＡＬＢ／ｃマウスを表６に示さ
れるように寛容化し、その後２０日後に、ドナーの皮膚同種異系移植片を与えた
。１００日目または１２０日目のいずれかに、ドナー細胞のキメリズムをアッセ
イし、そして混合リンパ球反応（ＭＬＲ）試験を行った。次いで、赤血球を塩化
アンモニウムで溶解させ、続いてナイロンウールカラムに通し、そして１０％の
ＡＢヒト血清、０．０９ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム
、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００
Ｕ／ｍｌのペニシリン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉ
ｔＨａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）、および０．０５ｍＭの３−メルカプトエタ
ノール（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ培地中に再構成することによ
って、Ｔ細胞を富化させた。１０⁵の応答性のＴ細胞を、１０⁶の刺激性Ｔ細胞（
３０００ｃＧｙを照射した）と共に、平底マイクロプレート（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｕ
ＳＡ）中で３７℃、５％ＣＯ₂で３日間インキュベートした。これらの細胞を、
１μＣｉの［³Ｈ］チミジンで３日目にパルスし、そして４日目に回収した。

【０１４２】

【表６】（結果）ドナー特異的寛容化の非存在下では（図２Ａ、群Ａ）、０、１、または２用量
のｓＴＬＩは、３×１０⁷個のＢＭＣまたは３×１０⁶個のＢＭＣをＣｙ処置に続
いて投与した場合には、ＧＶＨＤを伴わずに生存可能である高い可能性に十分で
あるようであった。宿主に対するこれらの低用量のｓＴＬＩの投与は、比較的多
数の宿主の機能的なＴ細胞の保持を生じる。結果として、低いｓＴＬＩ用量での
比較的高い割合のＧＶＨＤを伴わない生存性は、宿主およびドナーに由来する拒
否細胞のレベルがバランスのとれた平衡状態にある、拒否効果に起因し得る。ド
ナーの皮膚の移植片の受容能は、０および１用量のｓＴＬＩでは低かったが、２
、３、および６用量のｓＴＬＩで増大した（４および５個のｓＴＬＩ画分につい
てはデータが得られなかった）。しかし、ＧＶＨＤを伴わない生存率は、これら
の用量のｓＴＬＩでは減少した（図２Ａ）。従って、ドナー特異的寛容化の非存
在下では、いずれのレジメンも、高い割合のＧＶＨＤを伴わない生存性および高
い割合のドナーの皮膚の移植片の受容能を導かなかった。

【０１４３】第２のマウスの群（図２Ａ、群Ｂ）におけるドナー特異的寛容化は、低用量の
ｓＴＬＩでの高いＧＶＨＤを伴わない生存性を生じ、そしてなお、ＴＬＩ処置を
伴わずに高いＧＶＨＤを伴わない生存性を生じた。ドナー特異的寛容化もまた、
ｓＴＬＩ用量の回数にかかわらず、ドナーの皮膚の同種異系移植片の受容能の高
い可能性を生じた。任意のｓＴＬＩ画分を伴わない場合には、第２用量の３×１
０⁷個のＢＭＣが必要であるようである。多数のｓＴＬＩ画分の使用は、高いＧ
ＶＨＤ罹患率を生じたが、皮膚の同種異系移植片の受容能は高いままであった。
ＧＶＨＤに関しては、多数のｓＴＬＩの画分は、より低い用量（３×１０⁶）の
ＢＭＣでより好結果であるようである。このことは、より少数の宿主の拒否細胞
が、より多数のｓＴＬＩ画分の投与に起因して、ＢＭＣのより低い用量とバラン
スのとれた平衡状態にあるという拒否効果に起因し得る。

【０１４４】第３のマウスの群（図２Ｃ、群Ｃ）における任意のＴＬＩを伴わない０．３ｍ
ｌの血液の注入は、ＧＶＨＤを伴わない生存性の高い可能性を生じたが、低いド
ナーの皮膚の同種異系移植片の受容能を生じた。この第３のマウスの群は、、０
、１、または２個のｓＴＬＩの画分が投与され、そしてマウスに多い用量（３×
１０⁷）のＢＭＣをＣｙ後に与えた場合に、高いＧＶＨＤを伴わない生存性を有
した。しかし、より多数のｓＴＬＩ画分が、Ｃｙ後に少ない用量（３×１０⁶）
のＢＭＣを用いて、より良好であった。この結果は、第２のマウスの群について
の上記のような、拒否効果に起因し得る。

【０１４５】レシピエント中のドナーの血液細胞の割合と、ドナーの皮膚の同種異系移植片
の受容能との間の相関関係を、図３に示す。これらの実験は、レシピエント中で
のドナーの血液細胞の割合が、皮膚の同種異系移植片の受容能について重要であ
ることを示した。２０〜２５％未満のドナーの血液細胞を有するレシピエントは
、ドナーの皮膚の同種異系移植片を受容しなかった（黒色の記号）。対照的に、
２０〜２５％より多いドナーの血液細胞を有するレシピエントは、ドナーの皮膚
の同種異系移植片を受容した（白色の記号）。さらに、レシピエントは、寛容原
性の処置において０、１、２、または３個のｓＴＬＩ画分で馴化した場合になお
、２０〜２５％より多いのドナーの血液細胞を得ることが可能であった。

【０１４６】ＭＬＲ反応性のデータ（表６）は、低いレベルのキメラ現象を有するマウス（
マウス４〜７）が、完全には寛容化されなかったことを示した。レスポンダー（
ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔリンパ球が、自己、ＢＡＬＢ／ｃおよびＢ６供給源に由
来する刺激因子の存在下で、増殖した。Ｂ６の刺激因子に対する応答は、特に高
かった。対照的に、高レベルのキメラ現象を有するマウス（マウス１〜３）は、
任意の供給源に由来する刺激因子に対して応答しなかった。

【０１４７】（実施例１０）（免疫化していない脾臓細胞よりも、免疫化したドナー脾臓細胞がＭＨＣバリ
アにまたがる強力なＧＶＬ効果を誘導する）ＭＨＣおよびＭｉＨＬ同種異系抗原の両方に関する不適合性にまたがるＧＶＬ
活性を測定するために、Ｆ１マウス（０日目にＴＢＩ（４００ｃＧＹ）で予め馴
化した）に、１日目に、１０⁴個のＢＣＬ１細胞および３０×１０⁶個の免疫化し
たまたは正常なＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を注射した。

【０１４８】４つの試験群のそれぞれが１０匹のマウスを有した：群１：Ｆ１レシピエントに、明らかに白血病性のＢＣＬ１を保有しているマウ
スに由来する脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するＢＣＬ１細
胞および脾臓細胞を与えた。

【０１４９】群２：Ｆ１レシピエントに、正常なＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞で免疫化したＣ５７
ＢＬ／６マウスに由来するＢＣＬ１細胞および脾臓細胞を与えた。

【０１５０】群３：Ｆ１レシピエントに、ＢＣＬ１細胞および正常なＣ５７ＢＬ／６の脾臓
細胞を与えた。

【０１５１】群４：ＢＣＬ１細胞のみを与えた未処置のＦ１レシピエント。それによってコ
ントロール群として提供する。

【０１５２】（結果）図４は、４個の同様の実験による累積的なデータを示す。第１群のマウスの７
５％および第２群のマウスの４８％が、白血病を発症せずに１２０日より後まで
生存した。以下の段落に記載しそして図５に示すデータは、１群のマウスの２５
％が１２０日以前に死亡し、白血病よりもむしろＧＶＨＤによって死亡したこと
を示す。対照的に、第３群のマウスの７９％が、７５日以内（中央値５６日）に
ＧＶＨＤで死亡した。第４群の全てのマウスが、３６日以内（中央値２４日）に
白血病で死亡した。ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／Ｃの脾臓
細胞を上回るＢＣＬ１で免疫したＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞治療的な利点、およ
び正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞を上回るＢＣＬ１で免疫化
した脾臓細胞の利点は、有意であった（それぞれ、ｐ＝０．００１および０．０
０２）。ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する
脾臓細胞を与えたＦ１マウスは、明らかに、正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ
／６の脾臓細胞で処置したＦ１マウスと比較して、より高い生存率を有した（図
４）が、利点は有意ではなかった（ｐ＝０．０８３）。

【０１５３】残存しているＢＣＬ１細胞を根絶させることにおける同種異系の細胞治療の効
率を測定するために、移植の３週間後に得た脾臓細胞を、それぞれの実験群から
プールし、そして１０⁵個の細胞を、２次ＢＡＬＢ／ｃレシピエント（１０匹の
マウス／群）に対して養子移入した（図５）。結果は、一次Ｆ１レシピエントマ
ウスにおいて得られた結果と一致した。ＢＣＬ１で免疫化した脾臓細胞のＧＶＬ
効果は、ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞（ｐ＝
０．００１）および正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞（ｐ＝０
．００４）の両方のものよりも強力であった。ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化
したＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞は、正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６の脾
臓細胞よりも大きくはない抗腫瘍活性を示した（ｐ＝０．５）。第１の実験群か
ら得た脾臓細胞を接種した全ての２次レシピエントが、１２０日を越えて白血病
を有さずに生存した。第２の実験群から得た脾臓細胞を接種した４０匹の２次Ｂ
ＡＬＢ／ｃレシピエントのうちの２５匹が、１２０日を越えて白血病を有さずに
生存した。そして、第３の実験群から得た脾臓細胞を接種した４０匹の２次ＢＡ
ＬＢ／ｃレシピエントのうちの２７匹が、１５０日を越えて白血病を有さずに生
存した。対照的に、コントロール群から得た脾臓細胞の２８匹の２次ＢＡＬＢ／
ｃレシピエントの全てが、３０日未満で白血病によって死亡した。Ｆ１レシピエ
ントから採取したＰＢＬは、４６〜５６％のドナー型細胞を示し、これによって
移植を確認する（表７）。

【０１５４】

【表７】ＧＶＨＤの程度の客観的な測定としてのそれぞれの群におけるマウスの体重の
研究を、図６に示す。全てのマウスが、移植後の最初の２週間以内に重篤なＧＤ
ＨＶを有し、そしてそれぞれの群の動物のある割合が生存できなかった。しかし
，第１群のマウスの７５％および第２群の４８％が、１２０日目には活性であり
、そしてＧＶＨＤの形跡を有さずに良好であった。第３群の動物の全てが、７５
日以内（中央値５６日）に、急性のＧＶＨＤの典型的な徴候を有して死亡した。
正常なＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞を与えたＦ１マウスは、持続的な体重の減少に
よって証明されるＧＶＨＤの典型的な臨床的な徴候を示したが、一方、わずかに
１週間の間で体重の一時的な減少が、ＢＣＬ１または正常なＢＡＬＢ／ｃの脾臓
細胞のいずれかに対して免疫化したドナーから得たＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を受
容しているＦ１マウスについて観察された。

【０１５５】（実施例１１）（免疫化していない脾臓細胞よりも、免疫化したドナーの脾臓細胞が、ＭｉＨ
Ｌバリアにまたがるより強力なＧＶＬ効果を誘導する）ＭｉＨＬ不適合性にまたがるＧＶＬ効果を決定するために、ＢＡＬＢ／ｃレシ
ピエント（ＴＢＩ（４００ｃＧｙ）で０日目に馴化した）に、１日目に２×１０ ³ 個のＢＣＬ１細胞、および３０×１０⁶個の、３つの方法の内の１つにおいて予
め処置したＢ１０．Ｄ２マウスに由来する脾臓細胞とともに、またはＢ１０．Ｄ
２の脾臓細胞を伴わずに、静脈内注射した。４つの実験群のそれぞれが、１０匹
のマウスを有した：群１：ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、ＢＡＬＢ／ｃから得たＢＣＬ１細胞で免
疫化したＢ１０．Ｄ２に由来するＢＣＬ１および脾臓細胞を与えた。

【０１５６】群２：ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、正常なＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化
したＢ１０．Ｄ２マウスに由来するＢＣＬ１細胞および脾臓細胞を与えた。

【０１５７】群３：ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、ＢＣＬ１細胞および正常なＢ１０．Ｄ２
の脾臓細胞を与えた。

【０１５８】群４：ＢＣＬ１細胞のみを与えた未処置のＢＡＬＢ／ｃレシピエント。そして
これによってコントロール群として提供する。

【０１５９】（結果）図７にまとめるように、第１群のマウスの８４％が、１２０日を越えて、ＧＶ
ＨＤの徴候、または白血病の徴候のいずれをも有さずに生存した。同様に、第２
群のマウスの４７％が、１２０日を越えて、ＧＶＨＤの臨床的な徴候、および白
血病の臨床的な徴候のいずれをも有さずに生存したが、一方、３０匹のマウスの
うちの１６匹が白血病で死亡した。第３群および第４群の全てのマウスが、白血
病で死亡した。ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２マウスの脾臓
細胞（ｐ＝０．０３）またはそのままの免疫化していないＢ１０．Ｄ２マウスに
由来する脾臓細胞（ｐ＜０．００２）のいずれかでの処置を超える、ＢＣＬ１で
免疫化したＢ１０．Ｄ２マウスに由来する脾臓細胞でのレシピエントのＢＡＬＢ
／ｃマウスの処置の有意な治療的な利点が存在した（図７）。そのままの免疫化
していないＢ１０．Ｄ２マウスに由来する脾臓細胞を投与することを超える、Ｂ
ＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２動物に由来する脾臓細胞を投与
することにおける有意な治療的な利点もまた，存在した（ｐ＝０．０００１）。
ＢＣＬ１で免疫化したＢ１０．Ｄ２マウスに由来する脾臓細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ
の脾臓細胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２マウスに由来するものよりも大きな、ＧＶ
Ｌによって媒介される治療効率を示した。

【０１６０】残存しているＢＣＬ１細胞を根絶させることおけるＭｉＨＬ不適合性の脾臓細
胞の効率もまた、２次ＢＡＬＢ／ｃレシピエント（それぞれの群において１０匹
のマウス）中への、それぞれの実験群の動物から作成した脾臓細胞の別々のプー
ルに由来する１０⁵個の脾臓細胞の養子移入（移植の３週間後）によって、アッ
セイした（図８）。興味深いことに、第１群から得た脾臓細胞を接種した２次Ｂ
ＡＬＢ／ｃレシピエントの９５％が、１２０日を越えて白血病を有さないままで
あった。対照的に、第２群から得た脾臓細胞を接種した２次ＢＡＬＢ／ｃレシピ
エントの４１％だけが、１２０日を越えて生存し、そして白血病を有さなかった
。第３群および第４群から得た細胞の２次ＢＡＬＢ／ｃレシピエントの全てが、
４５日以内（中央値３８日）に白血病を発症した。ＢＣＬ１で免疫化したＢ１０
．Ｄ２の脾臓細胞で誘導した抗白血病効果は、正常な免疫化していないＢ１０．
Ｄ２の脾臓細胞およびＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２の脾臓
細胞の両方を超えて、有意であった（それぞれ、ｐ＜０．００１、およびｐ＝０
．０２７）。ＭＨＣおよびＭｉＨＬに関連する不適合性にまたがって誘導される
ＧＶＬ効果とは異なり、ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２の脾
臓細胞は、正常な免疫化していないＢ１０．Ｄ２の脾臓細胞と比較して、より強
いＧＶＬ効果を誘導した（ｐ＜０．０００１）。

【０１６１】図９は、移植後の最初の１週間で、一時的な体重の減少によって証明されるＧ
ＶＨＤの主要ではない発作の後で、ＭｉＨＬ−不適合性のＢＣＬ１で免疫化した
Ｂ１０．Ｄ２の脾臓細胞を接種したＢＡＬＢ／ｃマウスが、ＧＶＨＤに対して完
全に耐性であったことを示す。対照的に、ＭｉＨＬ不適合性の正常な免疫してい
ないＢ１０．Ｄ２マウスに由来する脾臓細胞、またはＭｉＨＬ不適合性のＢＡＬ
Ｂ／ｃの脾臓細胞で免疫化したマウスに由来する脾臓細胞のいずれかを接種した
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、致死的なＧＶＨＤを発症した。それにもかかわらず、Ｂ
ＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２の脾臓細胞を与えたレシピエン
トは、コントロール動物よりも長い間生存した。このことは、いくらかのＧＶＬ
効果が誘導されているが、ＧＶＨＤによってマスクされたことを示す。

【０１６２】（実施例１２）（誘導されたＧＶＨＤ／ＧＶＬを有するマウスにおける組織学的な知見）上記のように、免疫化したリンパ球で処置したマウスは、免疫化していない細
胞のレシピエントよりも効率的に白血病の発症に抵抗し、そしてなお、ＭＨＣお
よびＭｉＨＬ、ならびにＭｉＨＬのみのバリアにまたがるＧＶＨＤをより少なく
発症した。正常な免疫化していない脾臓細胞での治療を受容した３匹のマウスの
うち、２匹が、急性のＧＶＨＤと矛盾なく、適合性の肝臓において主要な組織学
的な異常を有した。同様の肝臓の病変が、宿主の脾臓細胞で免疫化したマウスに
由来するドナー細胞で処置した５匹のマウスのうちのわずか１匹において実証さ
れた。ＢＣＬ１で免疫化した動物に由来する脾臓細胞で処置した４匹のマウスの
全てが、肝臓においては任意の組織学的な異常を有さなかった。白血病性の浸潤
は、ＭＨＣおよびＭｉＨＬの両方に関連する不適合性に交差して処置されたマウ
スの全てにおいて実証されなかった。ＭｉＨＬバリアのみに交差してチャレンジ
したマウスにおいては、正常なＢ１０．Ｄ２細胞の注射は、ＢＡＬＢ／ｃレシピ
エント中でのＧＶＨＤと一致して、組織学的な変化を生じなかったが、一方、Ｂ
ＣＬ１で免疫化したかまたはＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２
マウスから得たＢ１０．Ｄ２の脾臓細胞を注射したマウスは、肺および肝臓に浸
潤を有した。しかし、上記のように、これらの浸潤は、増大したＧＶＨＤには関
連しなかった。白血病の細胞は、正常な免疫化していないドナーの脾臓細胞を注
射したＢＡＬＢ／ｃマウスの肺および肝臓中で、ならびにＢＡＬＢ／ｃの脾臓細
胞で免疫化したＢ１０．Ｄ２マウスに由来する脾臓細胞のＢＡＬＢ／ｃレシピエ
ント中で、見出された。対照的に、白血病の浸潤は、ＢＣＬで免疫化したマウス
から得た脾臓細胞で処置したマウスにおいては見出されなかった。

【０１６３】（実施例１３）（サイトカインの産生はＧＶＨＤおよびＧＶＬの可能性と相関する）（ａ）ＢＣＬ１細胞または正常なＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞のいずれかでの注射
によって、ＭＨＣおよびＭｉＨＬの同種異系抗原の両方に関連する不適合性に交
差して免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞、ならびに（ｂ）Ｂ
ＣＬ１細胞および（ａ）に記載されている脾臓細胞の集団を接種したＦ１マウス
に由来する脾臓細胞の、サイトカインプロフィールを決定した。

【０１６４】（結果）図１０に示すように、ＢＣＬ１で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞
の上清中のＩＦＮ−γのレベルは、ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したマウス
に由来する脾臓細胞のレベルよりも３倍高く、そして正常な免疫化していない脾
臓細胞中のレベルよりも６倍高かった。正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６
マウスの脾臓細胞の上清中のＩＬ−２のレベルは、ＢＣＬ１またはＢＡＬＢ／ｃ
の脾臓細胞のいずれかで免疫化したドナーから得た脾臓細胞の上清中のＩＬ−２
レベルよりも、４から５倍高かった（図１１）。ＢＣＬ１細胞で免疫化したＣ５
７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞の上清中のＩＬ−１０のレベルは、ＢＡＬ
Ｂ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞および
正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６細胞に由来する脾臓細胞の上清中のレベ
ルよりも２倍高かった（図１２）。ＴＮＦ−αの上清のレベルにおける差異は、
正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６マウス、ＢＣＬ１で免疫化したＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウス、およびＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウス
に由来する脾臓細胞においては、検出できなかった。

【０１６５】サイトカインレベルをもまた、上記のＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞のＦ１レシピ
エントから、細胞治療の３週間後に単離した脾臓細胞の培養物の上清中で測定し
た。正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞で処置したＦ１マウスに
由来する脾臓細胞の上清中でのＴＮＦ−αレベルは、ＢＣＬ１で免疫化したかま
たはＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したマウスＣ５７ＢＬ／６に由来する脾臓
細胞を与えたＦ１マウスに由来する脾臓細胞の上清中のレベルよりも４〜１０倍
高かった（図１３）。ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウ
スに由来する脾臓細胞を、または正常な免疫化していないＣ５７ＢＬ／６マウス
に由来する脾臓細胞を接種したＦ１マウスの脾臓細胞の上清中のＩＬ−２のレベ
ルは、ＢＣＬ１で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞を与えた
Ｆ１マウスに由来する脾臓細胞の上清中でのレベルよりも、３から４倍高かった
（図１４）。ＢＣＬ１で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞与
えたＦ１マウスに由来する脾臓細胞の上清中のＩＦＮ−γのレベルは、正常な免
疫化していないＣ５７ＢＬ／６細胞を受容させたＦ１マウスの脾臓細胞の上清中
でのレベルよりも、１０倍低かった（図１５）。３つの型のＣ５７ＢＬ／６細胞
を接種したＦ１マウスに由来する脾臓細胞中のＩＬ−１０の上清レベルにおいて
は、差異は検出されなかった。ＩＬ−４のレベルは、ＢＣＬ１で免疫化したＣ５
７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞のＦ１レシピエントの脾臓細胞の上清中で
は、ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスまたは正常な免
疫化していないＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれかに由来する脾臓細胞を接種した
Ｆ１マウスに由来する脾臓細胞の上清中のレベルよりも、約５倍高かった（図１
６）。

【０１６６】ＢＣＬ１腫瘍細胞の強力な同種異系特異的（ＭＨＣおよびＭｉＨＬ）寛容化活
性、および従って、それらでの免疫化のＧＶＨＤ抑制効果は、同時刺激分子の関
与を伴わない関連する同種異系抗原のそれらの提示（例えば、Ｂ７）、寛容性を
誘導することが既知の抗原提示の態様に起因し得る。さらに、上記の実験で観察
されたサイトカインプロフィールは、（ａ）増強された抗腫瘍効力および（ｂ）
宿主の造血性の（脾臓）細胞に対して予め曝露されたマウスに由来するリンパ系
細胞と比較して、宿主の腫瘍細胞に予め曝露されたドナーマウスに由来するリン
パ系細胞中での一貫して減少したＧＶＨ活性の、表面上は逆説的な知見について
の可能性のある根拠を示唆する。免疫化したドナー動物のリンパ系細胞中、およ
び免疫化したリンパ系細胞が導入される宿主動物のリンパ系細胞中の両方におけ
る、Ｔｈ１／Ｔｈ２の平衡が、ドナー動物に与えた免疫の型によって差次的に影
響を与えられる可能性がある。従って、例えば、ＩＬ−１０（原型のＴｈ２サイ
トカイン）の産生はアップレギュレートされたが、一方、ＩＬ−２（原型のＴｈ
１サイトカイン）の産生は、正常な脾臓細胞を除いて、同じＭＨＣバリアに交差
して免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞と比較して、腫瘍細
胞でＭＨＣバリアに交差して免疫化されたマウスから得られたＣ５７ＢＬ／６脾
臓細胞において減少した（図１１および１２）。さらに、ＩＬ−４（別の原型の
Ｔｈ２サイトカイン）の増大したレベル（図１６）が、ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞
で免疫化したＣ５７ＢＬ／６ドナーマウスに由来する脾臓細胞を注射したＦ１宿
主マウスに由来する脾臓細胞の上清中のレベルと比較して、ＢＣＬ−１で免疫化
したＣ５７ＢＬ／６の脾臓細胞を注射したＦ１宿主マウスに由来する脾臓細胞の
上清中の減少したＩＬ−２（図１４）、ＴＮＦ−α（図１３）、およびＩＦＮ−
γ（図１５）（全て、原型のＴｈ１サイトカイン）レベルによって達成された。
このことは、Ｔｈ２シフトしたＣ５７ＢＬ／６ドナー細胞が、Ｔｈ２の偏り（す
なわち、Ｔｈ１の影響と比較して、より高いレベルのＴｈ２の影響）をＦ１宿主
に移したことを示唆する。さらに、Ｔｈ１型のサイトカインは、一般的には、細
胞性の免疫または遅延型過敏症応答に関連するが、一方、Ｔｈ２サイトカインは
、一般的には液性（抗体）応答に関連することが公知であり、そしてＧＶＨＤは
、主に細胞に媒介される免疫学的影響に起因することが公知である。従って、ま
とめると、腫瘍細胞を有するドナーマウスの免疫化は、Ｔｈ２サイトカインの産
生に偏る傾向を生じ得、そして従って、ドナーマウスのＴ細胞中でのＧＶＨＤ疾
患の可能性を減少させ得る。

【０１６７】Ｔｈ１サイトカインのレベルを、ＧＶＨＤを最少にするために十分に減少させ
るが、一方で、有効な細胞性の抗腫瘍（ＧＶＬ）応答に十分なレベルであること
もまた、可能である。あるいは、抗腫瘍応答の機構は、ＧＶＨＤ応答に由来する
いくつかの局面において異なり得、そしてそれ自体、Ｔｈ１サイトカインよりも
むしろＴｈ２サイトカインによって促進され得る。さらに、Ｔｈ２サイトカイン
だけが、一般的には、細胞性の免疫応答についての「ヘルパー」サイトカインで
はないと考えられているわけではなく、これらは、細胞性の免疫応答を能動的に
抑制することが示されている。従って、ＢＣＬ１腫瘍によって免疫化されたドナ
ーマウスに由来する細胞によってＦ１宿主マウスに導入されたＴｈ２の偏りは、
実際に、ＧＶＨＤを能動的に抑制するように作用し得る。

【０１６８】正常な脾臓細胞に対して、腫瘍細胞で免疫化した動物に由来するドナー細胞中
でのＧＶＬおよびＧＶＨＤ活性における上記の不一致もまた、以下の影響の１つ
またはそれらの組み合わせに起因し得る：（ａ）同種異系抗原（ＭＨＣまたはＭｉＨＬ）特異的Ｔ細胞と比較して、寛容
性の誘導に対して比較的抵抗する、腫瘍抗原特異的エフェクターＴ細胞；（ｂ）腫瘍免疫化および／またはＴｈ２サイトカインによって寛容化されるよ
りもむしろ活性化される、Ｔ細胞以外の細胞（例えば、ＮＫ細胞）によって少な
くとも部分的に媒介される、抗腫瘍活性；（ｃ）同種異系特異的エフェクター細胞に対して比較的より敏感である、腫瘍
細胞；ならびに（ｄ）同種異系特異的および／または腫瘍特異的エフェクター細胞中でアポト
ーシスを誘導する、活性化の比較的貧弱なインデューサーである、腫瘍細胞。

【０１６９】上記の機構のいずれか１つまたはそれらの組み合わせが、ＧＶＬとＧＶＨＤ活
性との間の上記の解離を説明し得るが、本発明は、任意の特定の作用機構によっ
ては限定されない。

【０１７０】（実施例１４）（寛容化プロトコールの工程１〜３は移植と同日に行われ得る（「短いプロト
コール」））ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスに、０日目に、単回の用量のｓＴＬＩ（２０
０ｃＧｙ）を投与し、そしてＢ６ドナーに由来するＴ細胞を枯渇していないＢＭ
Ｃを注射した。この方法で処置した１つの群のＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｂ６Ｂ
Ｍの間質の移植片を受容させ、そして第２の群にＢ６の心臓の移植片を受容させ
た。全ての移植をもまた、０日目に行った。全てのマウスに、１日目にＣｙ（２
００ｍｇ／ｋｇ）の注射を受けさせ、そして２日目に第２回目のＢ６ＢＭＣの
注射を受けさせた。両方の群のマウスの１００％の生存性（図１７）に関して、
ＧＶＨＤを上記のプロトコールによって予防した。さらに、ＢＭの間質の移植片
の１００％および心臓の移植片の約８０％が生存した。

【０１７１】この実験は、本発明の寛容原性の方法の開始と同時に、被験体中に同種異系移
植片を良好に移植することが可能であることを示した。例えば、ＴＬＩ、ＢＭ、
および／またはＣｙの用量を単純に変更すること、ならびにこれらの試薬の続く
投与の頻度を単純に変更することによって、異種のレシピエント−ドナーの組み
合わせに対してもまたこのような「短い」プロトコールを適用することが可能で
あることが、予想される。

【０１７２】（実施例１５）（ＧＶＨＤ活性のインビトロでの非特異的な枯渇）薬物マホスファミド（ＡＳＴＡ−Ｚ）（これは、４−ヒドロキシペルオキシシ
クロホスファミド（４ＨＣ）と同一である）が、Ｔ細胞応答性のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの脾臓細胞を枯渇する能力を、ヒトおよび実験動物（例えば、マウス）に由
来する造血性細胞の処置後の造血幹細胞の活性の保存を生じることが公知のイン
ビトロの条件下で、試験した。ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞を、１００μｇ／ｍｌの
ＡＳＴＡ−Ｚを含有する組織培養培地中で３７℃で３０分間培養し、次いで、イ
ンビトロでＴ細胞応答について試験した。ＡＳＴＡ−Ｚへの曝露は、Ｔ細胞の有
糸分裂促進因子であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびフィトヘマグルチニ
ン（ＰＨＡ）に対するインビトロでの増殖性の応答の排除を生じた（表８）。さ
らに、ＩＬ−２（１，０００ＩＵ／ｍｌ）の脾臓細胞およびＡＴＳＡ−Ｚの培養
物への添加は、ＡＳＴＡ−Ｚによる有糸分裂促進因子に対する応答性の阻害を克
服しなかった。

【０１７３】

【表８】一方、ＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞（ＳＰ）または骨髄（ＢＭ）細胞のＡＳＴＡ−
Ｚ処理は、ＩＬ−２中でＳＰおよびＢＭ細胞を培養することによって、マウスの
ＹＡＣ−１およびＰ８１５腫瘍標的細胞を死滅させ得るキラー細胞の生成を減少
させなかった（図１８および１９）。上記のようなＡＳＴＡ−ＺでのＳＰ細胞ま
たはＢＭ細胞の処理後、過剰のＡＳＴＡ−Ｚを除去し、そして細胞を、ヒトのｒ
ＩＬ−２（６，０００ＩＵ／ｍｌ）とともに４日間培養した。次いで、これらを
回収し、そして標準的な⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて細胞溶解活性について試験
した。ＹＡＣ−１細胞は、ＮＫ細胞および活性化したＮＫ細胞の両方による溶解
に対して感受性であり、一方、Ｐ８１５細胞は、ＮＫ細胞による溶解に対しては
感受性ではないが、活性化されたＮＫ細胞に対しては感受性であった。従って、
このアッセイにおいて検出された細胞溶解活性は、少なくとも、活性化されたＮ
Ｋ細胞の作用に大きく起因するようである。さらに、ヒトのＰＢＭＣのＡＳＴＡ
−Ｚでの同じ処理は、上記と同じ条件下でヒトのｒＩＬ−２とともにＰＢＭＣを
培養することによって、ヒトのＤａｕｄｉ細胞およびＫ５６２腫瘍標的細胞を死
滅させ得るキラー細胞の産生を減少させなかった（表９）。Ｋ５６２細胞は、Ｎ
Ｋ細胞および活性化されたＮＫ細胞の両方による溶解に対して感受性であり、一
方、Ｄａｕｄｉ細胞は、ＮＫ細胞に対しては感受性ではないが、活性化されたＮ
Ｋ細胞に対しては感受性である。従って、上記のマウスの系においては、細胞傷
害性の活性は、おそらく、少なくとも、ＩＬ−２によって活性化されたＮＫ細胞
に大きく起因した。

【０１７４】

【表９】並行するマウスの実験において、致死的に照射した（１，１００ｃＧｙのＴＢ
Ｉ）ＳＪＬ／Ｊマウスへの注射（一匹のマウスあたり２５×１０⁶）の前のＢ６
骨髄のＡＳＴＡ−Ｚ（１００μｇ／ｍｌ）との３０分間の培養は、ＧＶＨＤを誘
導する骨髄細胞の能力を低下させた（図２０）。同様に、致死量以下で照射した
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６００ｃＧｙ）への注射（１匹のマウスあたり２５×１０ ⁶ ）の前の、ＡＳＴＡ−Ｚ（１００μｇ／ｍｌ）との３０分間のＢ６脾臓細胞の
培養は、ＧＶＨＤを誘導する脾臓細胞の能力を低下させた（図２１）。

【０１７５】従って、ＡＳＴＡ−Ｚは、いずれかの骨髄移植（例えば、本明細書中に記載す
る免疫寛容性プロトコールの工程４のため）に使用される造血性細胞を枯渇させ
るために使用され得る。これはまた、少なくとも一部、ＮＫ細胞の作用に起因し
得る、移植片対腫瘍（例えば、白血病）活性を保持しているかまたはなおそれに
ついて富化されながら、ＧＶＨＤを誘導する同種異系特異的（または異種特異的
）Ｔ細胞反応性の細胞治療に使用される細胞を枯渇させるために使用され得る。

【０１７６】（実施例１６）（ヒトの患者における骨髄機能廃絶性ではないドナー特異的寛容原性の処置）患者番号１：骨髄機能廃絶性ではない馴化、ドナー特異的寛容性の誘導、およ
び同種異系の骨髄の移植（ＡＢＭＴ）の前に、この男性の患者に、ホジキン病の
ステージＩＩＩＢの診断のほぼ３８ヶ月後に、自己の幹細胞の移植（ＡＳＣＴ）
を受けさせた。患者は、ＭＯＰＰ／ＡＢＶＤの別の処置（８サイクル）、放射線
治療、続くｖｅｌｂａｎ、アドリアマイシン、ブレオマイシン、およびＤＴＩＣ
での処置に失敗し、そして以下を含むさらなる化学療法のサイクルを繰り返され
た：診断の２年後の最初の顕性の再発の後の、ＭＯＰＰ（４サイクル）、および
ＶＰ１６、シスプラチン、イホスファミド、およびウロミテキサン（ｕｒｏｍｉ
ｔｅｘａｎ）（５サイクル）。再発に、ＡＳＣＴの２ヶ月後に再び気がつき、そ
してホジキン病の残存を示唆する明らかな感染性の病因を伴わない熱の臨床的な
状況に気づいた。

【０１７７】骨髄機能廃絶性ではない馴化、およびドナー特異的寛容化の後での、同種異系
骨髄の移植（ＡＢＭＴ）は、可能な処置方法として患者に与えられた。この処置
は、長期間続く形成不全を克服し得、そして移植片対ホジキン病の腫瘍細胞の応
答を誘導することによって、ホジキン病の持続をアンタゴナイズし得ると考えら
れた。

【０１７８】組織の分類データは、患者と利用可能なドナーである彼の父親との間での、Ｈ
ＬＡクラスＩ（血清学的な試験）における表現型の不適合を明らかにした：患者：Ａ２８Ａ１９Ｂ４１Ｂ５ドナー（父親）：Ａ２８Ａ３０Ｂ４１Ｂ５１ＨＬＡクラスＩＩの分類は以下のことを明らかにした：患者：ＤＲＢ１^*１１０４ＤＲＢ１^*０４０４ＤＱＢ１^*０３０１ＤＱＢ
１^*０４０２ドナー（父親）：ＤＲＢ１^*１１０１ＤＲＢ１^*０４０４ＤＱＢ１^*０３０
１ＤＱＢ１^*０４０２。

【０１７９】０日目に開始して、患者を、Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を
用いて３日間連続して、非骨髄機能廃絶性に馴化した。１日後に、患者に、ドナ
ー特異的抗原の供給源として、彼の父親から回収したＧ−ＣＳＦを動員した末梢
血細胞（「最初の同種異系移植片」）（２．９８×１０⁸個の有核細胞／ｋｇ）
の注入を受けさせ、その後、３日間毎日、ｃｙｔｏｘａｎ６０ｍｇ／ｋｇ（毎
日４，５００ｍｇ）の骨髄機能廃絶性ではない期間の用量を、ドナー特異的同種
異系反応性Ｔ細胞を枯渇させるために、与えた。選択していない父親の骨髄細胞
の注入（９．６×１０⁸個の有核細胞／ｋｇ）を、最後のｃｙｔｏｘａｎの用量
の終了の１日後に行った（「第２の同種異系移植片））。一方で幹細胞の移植の
機会を最大にし，そして他方でＧＶＴ効果を最大にするために、第２の同種異系
移植片について、さらなるＴ細胞の枯渇を伴わない改変していない骨髄細胞を使
用することを決定した。

【０１８０】ほぼ４０℃までの熱が、第２の同種異系移植片の最初の週に発生し、そして患
者は、出血を防ぐために頻繁に単一のドナーの血小板の注入を必要とした。患者
にはまた、アミカシン、タゾシンでの抗生物質治療、ジフルカン（ｄｉｆｌｕｃ
ａｎ）で真菌の感染に対する予防的な治療、およびサイトメガロウイルスの感染
に対するアシクロビル治療を受けさせた。熱は、抗生物質治療に完全には応答し
なかったので、アンホテリシンＢ（１ｍｇ／ｋｇ）を、１日おきに与えた。入院
期間を通じて熱が継続した。患者の白血球数（ＷＢＣ）は、＋１４日目には１．
０×１０⁹／Ｌに増大し、そして絶対好中球数（ＡＮＣ）は、＋１４日目に０．
５×１０⁹／Ｌ以上に、そして＋２８日目には１．０×１０⁹／Ｌ以上に達した。
ＷＢＣは段階的に、７５％の顆粒球をともなって５．１×１０⁹／Ｌの最大レベ
ルまで増大した。しかし、血小板減少症は持続した。移植を、計数の増大によっ
て、そして当業者に公知の技術である、タンデム反復の変動数−ポリメラーゼ連
鎖反応（ＶａｒｉａｂｌｅＮｕｍｂｅｒｏｆＴａｎｄｅｍＲｅｐｅａｔ
ｓ−ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）（ＶＮＴＲ−ＰＣ
Ｒ）によるドナーＤＮＡの検出によって確認した。

【０１８１】＋１０日目に、患者は、バリウムの注入に対して応答して大発作を起こした。
局所性の神経学的な知見が、Ｂａｂｉｎｓｋｉの徴候が相互にポジティブであっ
たことを除いて見出されなかった。シクロスポリンＡを、ＧＶＨＤについての予
防的な処置として投与した。ＧＶＨＤの代表的な顕性の皮膚の発疹が、＋１２日
目に現れた。肝臓の症状発現が続いて生じた。抗生物質および抗菌剤治療との組
み合わせでの、ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ（２ｋｇ／ｋｇ）（毎日）およびシクロス
ポリンでの組合せ治療にもかかわらず、患者の状態は、段階的に悪化し、１６日
目に発症して１２倍までの下痢を伴い、ＧＶＨＤのステージＩＶの指標である徴
候を伴った。ＧＶＨＤおよび可能性のある感染の強力な処置にもかかわらず、熱
のスパイクが、呼吸困難を伴って継続し、これによって、＋２８日目に、肺出血
および肺における両側性間質性浸潤を同時に発症した。患者に＋２９日目に挿管
した。大量の分泌物を、チューブを通じて吸引した。分泌物は血液を含んだが、
洗浄によっては任意の感染性の因子は明らかではなかった。ドーパミンドリップ
および注意深い肺系の維持を含む強力な治療にもかかわらず、血圧は、段階的に
低下し、そして患者は２９日目に死亡した。

【０１８２】結果として、第２の同種異系移植片に使用した彼の父親の骨髄による患者の良
好な移植は、ＨＬＡ不適合の幹細胞が、ドナーの同種異系抗原性組織を拒絶する
能力を有する宿主細胞の選択的な枯渇後に、そして骨髄機能廃絶性馴化を伴わず
に受容され得ることを示した。患者における発症は、ＡＳＴＣおよび高レベルの
防御的な混合されたキメリズムの確立に失敗した後の汎球血減少症に起因して、
彼が、ＧＶＨＤにより敏感であり得ることを示唆する。Ｔ細胞を枯渇していない
骨髄は、第２の同種異系移植片に使用され、そしてこれは残念なことにＧＨＶＤ
を生じた。それにもかかわらず、上記の知見は、ＨＬＡ不適合の細胞が、記載さ
れる免疫寛容性プロトコルを使用して、骨髄機能廃絶性の馴化を伴わずに受容さ
れ得、そして移植され得ることを実証した。

【０１８３】マウスの実験に鑑みて考慮されるこれらのデータは、第２の同種異系移植に使
用されるドナーの骨髄が、（ａ）注入の前にＴ細胞を枯渇されたか、または（ｂ
）非枯渇において使用されるが、レシピエント中での混合されたキメリズムの一
時的な段階が達成されるか、のいずれかである場合に、ＧＶＨＤを伴わないヒト
患者において移植を得ることが可能であることを示す。さらに、この臨床的な研
究とマウスの実験とを組み合わせた知見は、ヒトの患者において、レシピエント
がドナー特異的Ｔ細胞を同種異系移植片の前に枯渇されている場合には、同種異
系移植片の拒絶を防ぐことが可能であることを示す。

【０１８４】（実施例１７）（患者の同種異系抗原に対して予め曝露した同種異系リンペ球での、ヒトの慢
性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の効果的な処置）患者の同種異系抗原に対して予め曝露したドナーのリンパ球を使用する同種異
系の細胞治療を、フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）のＣＭＬを有する女性
の患者に与えた。この患者は、同種異系の骨髄移植の９ヶ月後に再発した。移植
に使用した骨髄細胞は、生後６ヶ月の兄弟（「ドナー」）と同一のＨＬＡ−Ａ、
ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲに由来した。患者は、ドナーのＰＢ
ＭＣ（これは、いくつかの処置においては、ＩＬ−２で活性化した）を使用する
数回の同種異系の細胞治療（骨髄移植に続いて与えた）に対して応答できなかっ
た。患者の骨髄は、以下の連続する手順からなるこの同種異系の細胞治療の前に
は、約９５％のＰｈ＋細胞を含んだ。

【０１８５】（ａ）１ｋｇあたり１０⁷個のドナーＰＢＭＣを、低用量のＣｙ（５００ｍｇ
／ｍ²）の２４時間後に静脈内投与した。寛解傾向は得られなかった。

【０１８６】（ｂ）１ｋｇあたり１０⁷個のドナーのＰＢＭＣ（ＩＬ−２でインビトロで活
性化した）を、静脈内投与した。細胞の注入の日に開始して、ｒＩＬ−２（６×
１０⁶のＩＵ／ｍ²／日）を３日間皮下投与した。全ての手順を、およそ１ヶ月の
間をあけて２回行った。そして、患者の骨髄中のＰｈ＋細胞の割合を約６７％ま
で一時的に減少させた。

【０１８７】（ｃ）６×１０⁶個の父性ＰＢＭＣ（ＩＬ−２でインビトロで活性化した）を
、静脈内投与し、これによって、患者の骨髄中のＰｈ＋細胞の割合を約６０％に
一時的に減少させた。この減少は、続いて、９４％のＰｈ＋骨髄細胞にまで段階
的に増大した。

【０１８８】この時点で、患者を、患者の同種異系抗原に対してインビトロで活性化したド
ナーのＰＢＭＣを用いて処置することを決定した。患者に、患者（およびドナー
）の両親に由来する照射した（３，０００ｃＧｙ）ＰＢＭＣに対して１日に２回
インビトロで曝露したドナーのＰＢＭＣを注入した。従って、ドナーのＰＢＭＣ
を、患者によっては発現されない親のＭＨＣ抗原、および患者によって発現され
るがドナーによっては発現されないＭｉＨＬ抗原に対して活性化した（この患者
およびドナーは、この親のＨＬＡが同一の子供である）。次いで、患者に、ｒＩ
Ｌ−２（６×１０⁶のＩＵ／ｍ²／日）を細胞の注入の日に開始して３日間与えた
。全ての手順を、約一ヶ月の間をあけて２回行った。インターフェロン−α（１
．５×１０⁶）を、４年間にわたって１週間に３回投与した。患者は、５年以上
寛解傾向にある。彼女は、検出可能な白血病細胞（核型の分析、およびフィラデ
ルフィアｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）染色体の転座によって生じるｂｃｒ
／ａｂｌハイブリッドＤＮＡ配列に由来するｍＲＮＡ転写物を検出するためのＲ
Ｔ−ＰＣＲの両方によって）を有さず、彼女の血液および彼女の骨髄細胞の１０
０％が、ドナー由来であり、そして彼女は、ＧＶＨＤの臨床的な徴候を有さない
。

【０１８９】この研究は、ヒトのガンの同種異系の細胞治療の効率が、患者によって発現さ
れる同種異系抗原に対する治療に使用されるドナー細胞の予備的な曝露によって
増強され得ることを示す。上記のマウスの実験に関しては、このような予め曝露
したドナー細胞はまた、おそらく、曝露していない細胞と比較して、減少したＧ
ＶＨ活性を提示するようである。

【０１９０】（他の実施形態）本発明は、その詳細な記載と組み合わせて記載されているが、上記の記載が、
本発明の範囲を説明するように意図され、そして制限するようには意図されない
ことが、理解される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され
る。他の局面、利点、および改変が、上記の特許請求の範囲内にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】寛容性のマウスの生存率に対する、第２回目のＢＭＣ注入によるＴ細胞の枯渇
の効果。

【図２】種々の回数の毎日のＴＬＩ画分で照射したＢＡＬＢ／ｃマウスの、ＧＶＨＤを
含まない生存率（上段のパネル）およびドナー型の皮膚の同種異系移植片の生存
率（下段のパネル）。

【図３】ｓＴＬＩ、ドナーＢＭＣ、およびＣｙの使用に基づく、骨髄機能廃絶性ではな
い寛容原性プロトコール後の、Ｂ６マウスのレシピエントにおけるルイスラット
の皮膚の異種移植片の生存率。

【図４】ＢＣＬ１腫瘍細胞、ならびにＭＨＣおよびＭｉＨＬの両方で宿主マウスと適合
性ではない、免疫化したかまたは免疫化していないかのいずれかのＢ６ドナーマ
ウスに由来するリンパ系細胞の注射後の、宿主Ｆ１マウスの生存率。

【図５】ＢＣＬ１腫瘍細胞、ならびにＭＨＣおよびＭｉＨＬの両方で宿主マウスと適合
性ではない、免疫化したかまたは免疫化していないかのいずれかのＢ６ドナーマ
ウスに由来するリンパ系細胞を注射した初代Ｆ１宿主マウスに由来する脾臓細胞
の移入後の、２次ＢＡＬＢ／ｃ宿主マウスの生存率。

【図６】ＢＣＬ１腫瘍細胞、ならびにＭＨＣおよびＭｉＨＬの両方で宿主マウスと適合
性ではない、免疫化したかまたは免疫化していないかのいずれかのＢ６ドナーマ
ウスに由来するリンパ系細胞の注射後の、Ｆ１宿主マウスの体重の変化。

【図７】ＢＣＬ１腫瘍細胞、ならびにＭｉＨＬのみで宿主マウスと適合性ではない、免
疫化したかまたは免疫化していないかのいずれかのＢ１０．Ｄ２ドナーマウスに
由来するリンパ系細胞の注射後の、宿主ＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率。

【図８】ＢＣＬ１腫瘍細胞、ならびにＭｉＨＬのみで初代ＢＡＬＢ／ｃ宿主マウスと適
合性ではない、免疫化したかまたは免疫化していないかのいずれかのＢ１０．Ｄ
２ドナーマウスに由来するリンパ系細胞を注射した初代ＢＡＬＢ／ｃ宿主マウス
に由来する脾臓細胞の導入後の、２次ＢＡＬＢ／ｃ宿主マウスの生存率。

【図９】ＢＣＬ１腫瘍細胞、ならびにＭｉＨＬのみで宿主マウスと適合性ではない、免
疫化したかまたは免疫化していないかのいずれかのＢ１０．Ｄ２ドナーマウスに
由来するリンパ系細胞の注射後の、ＢＡＬＢ／ｃ宿主マウスの体重の変化。

【図１０】ＢＣＬ１腫瘍細胞またはＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞のいずれかで免疫化したＣ５７
ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞による、および免疫化していないＣ５７ＢＬ
／６マウスに由来する脾臓細胞による、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の
産生。

【図１１】ＢＣＬ１腫瘍細胞またはＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞のいずれかで免疫化したＣ５７
ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞による、および免疫化していないＣ５７ＢＬ
／６マウスに由来する脾臓細胞による、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の産
生。

【図１２】ＢＣＬ１腫瘍細胞またはＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞のいずれかで免疫化したＣ５７
ＢＬ／６マウスに由来する脾臓細胞による、および免疫化していないＣ５７ＢＬ
／６マウスに由来する脾臓細胞による、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）
の産生。

【図１３】図１０〜１２に示す３つの脾臓細胞集団を注射したＦ１マウスに由来する脾臓
細胞による、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の産生。

【図１４】図１０〜１２に示す３つの脾臓細胞集団を注射したＦ１マウスに由来する脾臓
細胞による、ＩＬ−２の産生。

【図１５】図１０〜１２に示す３つの脾臓細胞集団を注射したＦ１マウスに由来する脾臓
細胞による、ＩＦＮ−γの産生。

【図１６】図１０〜１２に示す３つの脾臓細胞集団を注射したＦ１マウスに由来する脾臓
細胞による、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生。

【図１７】ｓＴＬＩ、第１のＢ６の骨髄の注入、および同種異系移植片の移植を全て０日
目に行うプロトコールを使用する寛容化および移植の後での、ＢＡＬＢ／ｃレシ
ピエントマウスおよびＢ６マウスに由来する同種異系移植片（骨髄間質または心
臓）の生存率。

【図１８】ＡＳＴＡ−Ｚ処理なしまたはＡＳＴＡ−Ｚでの処理のいずれかに続いてＩＬ−
２で培養した後の、ＢＡＬＢ／ｃの骨髄（ＢＭ）または脾臓（ＳＰ）細胞のＩＬ
−２でのインビトロでの活性化によって生成されたキラー細胞による、マウスの
ＹＡＣ−１腫瘍標的の溶解。

【図１９】ＡＳＴＡ−Ｚ処理なしまたはＡＳＴＡ−Ｚでの処理のいずれかに続いてＩＬ−
２で培養した後の、ＢＡＬＢ／ｃの骨髄（ＢＭ）または脾臓（ＳＰ）細胞のＩＬ
−２でのインビトロでの活性化によって生成されたキラー細胞による、マウスの
Ｐ８１５腫瘍標的細胞の溶解。

【図２０】Ｂ６マウスに由来する、処理していないか、またはＡＳＴＡ−Ｚで処理したか
のいずれかの骨髄細胞の注入後の、致死的に照射したＳＪＬ／Ｊマウスの生存率
。コントロールの、致死的に照射した、再構成していないＳＪＬ／Ｊマウスを用
いて得た生存率のデータもまた示す。

【図２１】Ｂ６マウスに由来する、処理していないかまたはＡＳＴＡ−Ｚで処理したかの
いずれかの骨髄細胞の注入後の、致死量未満で照射したＢＡＬＢ／ｃマウスの生
存率。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (71)出願人バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢＡＸＴＥＲＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤアメリカ合衆国 60015 イリノイ，ディアフィールド、ワンバクスターパークウェイ．２−２イー (72)発明者スラビン，シモンイスラエル国エルサレム，エインカレム，ハオーレンストリート 21 (72)発明者プリゴジーナ，タチャナイスラエル国レホボット，レボブハージル 203，アパートメント 11 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA94X AC20 BA24 BD25 BD42 CA44 4C085 AA03 BB01 CC03 CC04 CC05 CC26 DD88 EE01 4C087 AA01 AA02 BB63 NA14 ZB08 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１の個体の哺乳動物に対して内因性である細胞の集団を含
有する、細胞の組成物であって、該細胞の集団がリンパ球を含有し、該集団は、
第２の個体の哺乳動物の抗原に対する応答性を枯渇されており、該第２の個体の
哺乳動物が、該第１の個体の哺乳動物と同系ではなく、ここで、該第１の個体の
哺乳動物に対して内因性である該細胞の集団が、該組成物の細胞の５０％から１
００％である、組成物。
【請求項２】前記応答性の枯渇が、前記リンパ球を前記第２の個体の哺乳
動物の前記抗原の供給源と接触させる工程を包含する、請求項１に記載の組成物
。
【請求項３】前記抗原の供給源がガン細胞を含む、請求項２に記載の組成
物。
【請求項４】前記第１の個体の哺乳動物および前記第２の個体の哺乳動物
がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】前記第１の個体の哺乳動物がヒト以外の霊長類であり、そし
て前記第２の個体の哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】前記第１の個体の哺乳動物がブタであり、そして前記第２の
個体の哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】非同系細胞治療を用いて宿主哺乳動物を処置する方法であっ
て、該方法は、該宿主哺乳動物中にドナー哺乳動物に由来する細胞の集団を注入
する工程を包含し、該細胞の集団がリンパ球を含有し、該ドナー哺乳動物および
該宿主哺乳動物が互いに同系ではなく、ここで、該注入工程の前に、該集団が該
宿主哺乳動物の抗原に対する応答性を枯渇される、方法。
【請求項８】前記枯渇工程が、前記集団を前記宿主哺乳動物によって発現
される抗原を含有している組成物と接触させる工程を包含する、請求項７に記載
の方法。
【請求項９】前記接触工程がインビトロである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記接触工程が、前記第１の個体の哺乳動物に対して前記
抗原を投与する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】前記接触工程の後に、前記リンパ球の集団に対してリンパ
球細胞傷害性試薬または寛容化試薬の骨髄機能廃絶性ではない用量を送達する工
程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】前記送達工程がインビトロである、請求項１１に記載の方
法。
【請求項１３】前記接触工程が、前記ドナー哺乳動物に対して前記抗原を
投与する工程を包含し、そして前記送達工程が、ドナー哺乳動物に対して前記骨
髄機能廃絶性ではない用量を投与する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】前記送達工程の後に、前記ドナー哺乳動物に対して、前記
宿主哺乳動物に由来する造血幹細胞の調製物を投与する工程をさらに包含する、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】前記接触工程の前に、さらに、前記リンパ球の集団中の機
能的なＴリンパ球の数を減少させるために十分な、骨髄機能廃絶性ではないレジ
メンで、免疫抑制剤に対して該集団を曝露する工程を包含する、請求項８に記載
の方法。
【請求項１６】前記曝露工程がインビトロである、請求項１５に記載の方
法。
【請求項１７】前記曝露工程が、前記ドナー哺乳動物に対して前記免疫抑
制剤を投与する工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】前記組成物が、細胞、器官、組織、および非細胞性の抗原
からなる群より選択される１つ以上の抗原の供給源を含む、請求項８に記載の方
法。
【請求項１９】前記抗原が造血性細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】前記抗原が、前記宿主哺乳動物の主要な組織適合性複合体
分子を発現するガン細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】前記ガン細胞が前記宿主哺乳動物に由来する、請求項２０
に記載の方法。
【請求項２２】前記注入工程の前に、前記宿主哺乳動物における前記ドナ
ー哺乳動物の抗原に対する寛容性を誘導する工程をさらに包含する方法であって
、ここで、該寛容性の誘導が以下の工程：（ａ）該宿主哺乳動物に対してドナー抗原を投与する工程；（ｂ）該ドナー抗原に応答する該宿主哺乳動物のリンパ球を選択的に排除する
ために、該宿主哺乳動物に対してリンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬の骨
髄機能廃絶性ではない用量を投与する工程；および（ｃ）該宿主哺乳動物に対して、前記非同系ドナーに由来する造血幹細胞の調
製物を投与する工程、を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項２３】工程（ａ）の前に、前記宿主哺乳動物の機能的なＴリンパ
球の集団を減少させるために十分な骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて、
該宿主哺乳動物に対して免疫抑制剤を投与する工程をさらに包含する、請求項２
２に記載の方法。
【請求項２４】前記応答性の枯渇が、前記集団からＴ細胞の実質的な排除
による、請求項７に記載の方法。
【請求項２５】前記排除が、骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて免
疫抑制剤に対して前記集団を曝露することによる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】前記排除が、前記集団をマホスファミドと接触させること
による、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】前記排除がインビトロである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】パッケージング材料、および該パッケージング材料中の生
物学的な細胞容器を含む、製品であって、該細胞容器は、その中に造血幹細胞を
含有している組成物を有し、ここで該パッケージング材料は、該造血幹細胞が宿
主哺乳動物において非同系ドナー特異的寛容性を誘導する、以下の工程：（ａ）該宿主哺乳動物に対して非同系ドナーに由来するドナー抗原を投与する
工程；（ｂ）該ドナー抗原に応答する該宿主哺乳動物のリンパ球を選択的に排除する
ために、該宿主哺乳動物に対してリンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬の骨
髄機能廃絶性ではない用量を投与する工程；および（ｃ）該宿主哺乳動物に対して、該非同系ドナーに由来する造血幹細胞の調製
物を投与する工程、を包含する方法の、工程（ａ）または工程（ｃ）において使用されることを示す
ラベルまたはパッケージ挿入物を含む、製品。
【請求項２９】パッケージング材料、および該パッケージング材料中の生
物学的な細胞容器を含む、製品であって、該細胞容器は、その中に請求項１から
５のいずれかに記載の細胞の組成物を有し、ここで該パッケージング材料は、該
組成物が、前記第２の個体の哺乳動物に対して該組成物を投与する工程を包含す
る処置方法において使用されることを示すラベルまたはパッケージ挿入物を含み
、ここで、該第２の個体の哺乳動物は、該組成物を必要としている、製品。
【請求項３０】哺乳動物において、非同系宿主哺乳動物に由来する移植片
に対して寛容性を誘導する方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）該宿主哺乳動物に対して非同系ドナーに由来するドナー抗原を投与する
工程；（ｂ）該宿主哺乳動物の機能的なＴリンパ球の集団を減少させるために十分な
骨髄機能廃絶性ではないレジメンにおいて、該宿主哺乳動物に対して免疫抑制剤
を投与する工程；（ｃ）該宿主動物中に、該ドナーに由来する細胞、組織、または器官を移植す
る工程；（ｄ）該ドナー抗原に応答性である該宿主哺乳動物のリンパ球を選択的に排除
するために、該宿主哺乳動物に対してリンパ球細胞傷害性試薬または寛容化試薬
の骨髄機能廃絶性ではない用量を投与する工程；および（ｅ）該宿主哺乳動物に対して該非同系ドナーに由来する造血幹細胞の調製物
を投与する工程、を包含する方法であって、ここで、工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、工程（ｄ）および（ｅ）と同
じ日に、そしてそれらの前に行われる、方法。