CN113164523A - 呈现pd-l1的血小板逆转新发1型糖尿病 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含经修饰的血小板的治疗剂递送溶媒以及包含将其施用于受试者的治疗糖尿病、自身炎症性疾病和/或移植物抗宿主病的方法，所述修饰的血小板包含治疗剂货物和靶向部分。

Description

呈现PD-L1的血小板逆转新发1型糖尿病

本申请要求于2018年10月10日提交的美国临时申请号62/743,857的权益，该临时申请通过引用以其全部内容并入本文。

背景技术

1型糖尿病(T1D)是由遗传易感性、环境因素和病理生理学引起的免疫调节失调引起的。自身反应性淋巴细胞破坏胰岛素产生β-细胞，导致胰岛素产生不足，并导致血糖水平失控以及多种类型的继发性并发症。在T1D患者的胰腺中已检测到多种类型淋巴细胞的浸润。在这些渗透胰腺的淋巴细胞中，胰岛-抗原-反应性T细胞在疾病的发生和进展中起主要作用。这些T细胞可通过T细胞受体(TCR)介导的细胞毒性和细胞因子的产生(例如干扰素-γ(IFN-γ))破坏β-细胞。由于自身反应性淋巴细胞在T1D发病机理中的核心作用，免疫干预在治疗T1D中具有广阔的前景。用抗CD3单克隆抗体(替利珠单抗(teplizumab)和奥昔珠单抗(Otelixizumab))治疗T细胞耗竭有助于在新诊断出的患者中持续产生胰岛素。尽管抗CD3抗体可逆转新发T1D，但是这种抗原非特异性干预可能会引起不良反应和安全性问题。因此，需要胰岛抗原特异性T细胞的干预，其可提供增强的安全性，因而在治疗T1D时产生的副作用有限。

发明内容

本发明公开了涉及包含膜结合PD-L1的工程化血小板的方法和组合物。

本文公开了包含膜结合外源性PD-L1的工程化血小板。一方面，本文公开了任何前述方面的工程化血小板，其进一步包含膜结合CD40L和/或toll样受体。

本文还公开了任何前述方面的工程化血小板，其进一步包含靶向部分(例如肽、多肽、聚合物、小分子、核酸、抗体或糖)。应当理解并在本文中考虑到，靶向部分可经设计或经工程化以靶向骨髓、肝、脾、胰腺、前列腺、膀胱、心脏、肺、脑、皮肤、肾、卵巢、睾丸、淋巴结、小肠、大肠或胃。

一方面，本文公开了在受试者中治疗/减轻/预防/抑制糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和/或自身炎症性疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面的工程化血小板。

本文还公开了任何前述方面的治疗/减轻/预防/抑制糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和/或自身炎症性疾病或病症的方法，该方法进一步包括向受试者施用β-胰岛细胞。

附图说明

并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图阐明几个实施例，并且与说明一起阐明所公开的组合物和方法。

图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F、图1G、图1H、图1I、图1J、图1K和图1L示出呈现PD-L1的血小板的示意图和产生。图1A示出产生PD-L1血小板和抑制CD8⁺T细胞以保护β-细胞的示意图。(I)稳定表达小鼠PD-L1的L8057细胞系的建立和PD-L1血小板的产生。(II)PD-L1血小板经由PD-L1的PD-1阻断，保护β-细胞抵抗自身反应性T细胞。图1B示出稳定表达小鼠EGFP-PD-L1的L8057细胞系的共聚焦图像。WGA Alexa-Fluor 594染料用于对细胞膜染色(比例尺：10μm)。c，借由蛋白质印迹法(western blot)对PD-L1在L8057细胞系上的表达进行分析。L8是L8057细胞的缩写。图1D和图1E示出借由免疫荧光染色和流式细胞术检测EGFP-PD-L1 L8057细胞中的CD41a(比例尺：10μm)。图1F和图1G示出借由免疫荧光染色和流式细胞术检测用500nM PMA处理的EGFP-PD-L1 L8057细胞中的CD42a(比例尺：10μm)。图1H示出PD-L1 MK细胞经历成熟和分化的不同阶段(比例尺：10μm)。I：成熟EGFP-PD-L1 MK细胞；II：前血小板从MK细胞的出芽；III：前血小板从MK细胞的延伸；IV：前血小板从MK细胞的释放。图1I示出从L8057细胞延伸的PD-L1前血小板的形态(比例尺：10μm)。图1J示出纯化的PD-L1血小板的共聚焦图像(比例尺：2μm)。图1K示出代表性TEM图像，该图像显示PD-L1血小板的形态(比例尺：1μm)。图1L示出借由DLS测量的PD-L1血小板的大小分布。

图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G、图2H和图2I示出PD-L1血小板的体外和体内生物学特征。图2A示出PD-L1血小板、活化的PD-L1血小板和释放的血小板微粒(PMPs)的代表性TEM图像。图像I和图像II中的比例尺：1μm。图像III中的比例尺：100nm。图2B示出借由凝血酶活化后30分钟时PD-L1血小板和PMP的大小分布。图2C示出PD-L1血小板在胶原涂覆的孔中保留30min(比例尺：50μm)。图2D示出结合在T细胞上的EGFP-PD-L1血小板和游离血小板(比例尺：10μm)。图2E和2F示出借由流式细胞术(门控于CD8⁺T细胞上)分析的不同治疗组的胰腺分离的GzmB⁺CD8⁺T细胞的代表性图(2e)和定量(2f)(n＝5)。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行图基事后检验分析的双因素ANOVA来做所述分析。图2G示出游离血小板和PD-L1血小板的体内血液循环保留特性。在所示不同时间点测量荧光(n＝3)。误差条，±标准差。图2H示出胰腺和主要器官中游离血小板和PD-L1血小板的生物分布的体内荧光图像。给小鼠注射NHS-Cy5.5标记的游离血小板和EGFP-PD-L1血小板(200μL，约2×10⁸)，在注射后20h测量在器官中的分布。图2I示出所示胰腺和主要器官中每克组织的荧光强度(n＝8)。误差条，±标准差。

图3A和图3B示出hPD-L1血小板结合在人PD-1阳性T细胞上。结合在CD3/CD28Dynabeeds活化的PD-1阳性T细胞和未刺激的T细胞上的MEG-01衍生的EGFP-PD-L1血小板的代表性图像(3a)和定量(3b)(比例尺：10μm)。

图4示出在能生存的情况下分选CD8⁺T细胞以用于细胞培养和扩增。借由流式细胞术(门控于CD3⁺T细胞上)分析不同治疗组的CFSE⁺CD8⁺T细胞的代表性图。将CD3⁺T细胞用PD-L1血小板和游离血小板孵育72h，然后用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记10分钟，然后使用带有门控于CD3⁺T细胞上的FACS分析CD8⁺T细胞。

图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F示出PD-L1血小板逆转糖尿病NOD小鼠中的高血糖。图5A示出采用所示不同治疗的糖尿病NOD小鼠的血糖水平(n＝12)。图5B示出采用所示不同治疗的糖尿病NOD小鼠的平均血糖水平(n＝12)。深绿色线：无逆转的糖尿病NOD小鼠(n＝3)；浅绿色线：逆转的糖尿病NOD小鼠(n＝9)。数据表示为平均值±标准差。图5C和图5D示出胰腺切片中胰岛素⁺β-细胞的代表性共聚焦图像(5c)和定量(5d)(比例尺：100μm)。图5E示出采用所示不同治疗后的糖尿病NOD小鼠的胰岛素水平(n＝12)。(5C，5G，5I)。图5F示出NOD小鼠发展为糖尿病的发生率(n＝10)。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行图基事后检验分析的单因素ANOVA来做所述分析(5d和5e)或用对数秩(Mantel-Cox)检验(5f)。

图6A和图6B示出通过5次治疗，PD-L1血小板逆转糖尿病NOD小鼠中的高血糖。图6A示出治疗时间表。图6B示出采用所示不同治疗的糖尿病NOD小鼠的血糖水平(n＝12)。

图7A和图7B示出通过10次治疗，PD-L1血小板逆转糖尿病NOD小鼠中的高血糖。图7A示出治疗时间表。图7B示出采用所示不同治疗的糖尿病NOD小鼠的血糖水平(n＝12)。

图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图8F、图8G、图8H、图8I和图8J示出接受血小板治疗的糖尿病NOD小鼠的胰腺中T细胞状态的特征。图8A和图8B示出经免疫荧光染色的胰岛浸润的CD8⁺T细胞的代表性共聚焦图像(8a)和定量(8b)(比例尺：100μm)。图8C和图8D示出借由流式细胞术(门控于CD3⁺T细胞上)分析的不同治疗组的胰腺浸润的CD3⁺T细胞的代表性图(8c)和定量(8d)(n＝12)。图8E和图8F示出借由流式细胞术(门控于CD3⁺T细胞上)分析的不同治疗组的胰腺浸润的CD8⁺和CD4⁺T细胞的代表性图(8e)和定量(8f)(n＝12)。图8G和图8H示出借由流式细胞术(门控于CD8⁺T细胞上)分析的不同治疗组的胰腺浸润的GzmB⁺CD8⁺T细胞的代表性图(8g)和定量(8h)(n＝12)。图8I和图8J示出借由流式细胞术(门控于CD8⁺T细胞上)分析的不同治疗组的胰腺浸润的INF-γ⁺CD8⁺T细胞的代表性图(8g)和定量(8h)(n＝12)。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行图基事后检验分析的单因素ANOVA来做所述分析(8b、8d、8f、8h和8j)。

图9A和图9B示出借由流式细胞术(门控于CD8⁺T细胞上)分析的不同治疗组的胰腺的FoxP3⁺CD4⁺T细胞的代表性图(9a)和定量(9b)(n＝12)。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行图基事后检验分析的单因素ANOVA来做所述分析。

图10A和图10B示出在小鼠的不同治疗组中CD49b⁺CD4⁺Tr1细胞群体的百分比。借由流式细胞术(门控于CD3⁺T细胞上)分析的不同治疗组的胰腺的CD49b⁺CD4⁺Tr1细胞的代表性图(10a)和定量(10b)(n＝12)。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行图基事后检验分析的单因素ANOVA来做所述分析。

具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有规定，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有规定，否则它们不限于特定的试剂，因为它们当然会有所不同。另外应当了解，本文使用的术语只是为了描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。

A.定义

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”“一种”“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定不是这样。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两个或更多这样的载体的混合物等。

范围可在本文中被表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开了“小于或等于”值、“大于或等于”值以及时，也公开了如本领域技术人员适当理解的值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

在本说明书及随后的权利要求书中，将引用多个术语，将其定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。

向受试者“施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径施用，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉内、肌肉、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用(“simultaneousadministration”或“administered simultaneously”)”意指化合物在同一时间点施用或基本上紧接着施用。在后一种情况下，该两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点施用化合物时获得的结果不可区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部施用”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻施用点的一个或多个区域，并且在治疗上不系统地大量引入该药剂。例如，局部施用的药剂在施用点的局部附近是可容易检测到的，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。施用包括自我施用和他人施用。

“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对受试者无毒并且不对受试者造成显著的副作用。

“包含”意指组合物、方法等包括所提到的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应指包括所提到的元素，但不包括对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于施用本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每个所定义的实施例都在本发明的范围内。

“对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。

“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。

药剂的“有效量”是指药剂提供所需的效果的足够数量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天施用若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度如所示的按比例减少剂量。

“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，即该组分可掺入本发明的药物制剂中并施用如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人体的施用时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。

“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。

“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。

“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应，其中治疗效应例如治疗障碍或其他不希望的生理病症，预防效应例如预防疾病或其他不良生理症状(例如，非免疫原性癌症)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药学上可接受的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确所需的治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年施用多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。

在整个本专利申请中，参考各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本申请所涉及的技术现状。所公开的参考文献也单独并且具体地以引用方式并入本文，参考文献中包含的材料在参考文献所依据的句子中予以讨论。

B.组合物

本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当本发明公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每个在本文中均得到特别考虑和描述。例如，如果公开并且讨论了特定的PD-L1表达血小板并且讨论了可对包含PD-L1表达血小板的多个分子进行多种修改，除非指明是相反情况，否则具体考虑到PD-L1表达血小板的各种和每种组合和排列以及可能的修改。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子的实例，则公开了A-D，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了个体和集体考虑的含义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。

自身抗原捕获的DC通过扩增CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞在外周耐受性方面起关键作用。Treg细胞可直接抑制自身反应性T细胞和NK细胞的活性，以保护β-细胞免受攻击。为了使用Treg细胞保护β-细胞，已经开发了胰岛自身抗原(诸如胰岛素B链9-23)以诱导自身抗原特异性Treg细胞来治疗T1D。除Treg细胞外，正常组织还表达免疫抑制性配体，用于抑制淋巴细胞的活性以维持外周耐受性。程序性死亡配体1(PD-L1)是一种在正常组织细胞表面上呈现的关键免疫检查点配体，其防止CD8⁺细胞毒性T细胞的自身免疫攻击。PD-L1与程序性死亡1PD-1(PD-1)受体的相互作用导致T细胞耗竭。PD-1/PD-L1抑制轴的缺乏导致小鼠中的T1D。此外，接受PD-1/PD-L1阻断疗法的癌症患者有发生T1D的风险，这表明PD-L1在预防T1D的发病机理中起重要作用。本文中，将遗传上呈现PD-L1的血小板用作免疫抑制调节剂，以抑制NOD小鼠中的T细胞活性并逆转T1D糖尿病(图1a)。因此，一方面，本文公开了包含膜结合外源性PD-L1的工程化血小板。

除了止血和血栓形成外，血小板在调节炎症和免疫应答方面也发挥重要功能。例如，血小板含有有效的免疫调节分子，诸如Toll样受体(TLR)和CD40L，其可直接与先天免疫细胞(包括T细胞、DC细胞和嗜中性粒细胞)相互作用。因此，一方面，本文公开了表达膜结合PD-L1的工程化血小板，其进一步包含膜结合CD40L和/或toll样受体。

血小板还可结合并抑制T淋巴细胞的活性，并有助于类风湿性关节炎的抗炎症治疗。此外，血小板还含有多种抗炎症细胞因子，包括转化生长因子β(TGF-β)，其可抑制T细胞功能，衰减宿主的癌症免疫力。在这项研究中，已证明可利用工程化血小板的生理特性和结合的免疫阻断功能的组合来逆转NOD小鼠模型中的新发T1D。

应当理解并在本文中考虑到，公开的表达膜结合PD-L1的工程化血小板经设计可将PD-L1靶向至浸润特定组织或器官部位的T细胞。将血小板引导至所关注的特定组织或器官部位的一种方法是通过使用靶向部分。例如，靶向部分可经设计或经工程化以靶向骨髓、肝、脾、胰腺、前列腺、膀胱、心脏、肺、脑、皮肤、肾、卵巢、睾丸、淋巴结、小肠、大肠或胃。应当理解并在本文中考虑到，有多种方法可将本文所公开的工程化血小板靶向至靶组织或器官。因此，本文特别考虑的是工程化血小板，其包含可与修饰的血小板连接以靶向特定组织或器官的任何分子，包括但不限于肽、多肽、聚合物、核酸、抗体、糖或细胞。一方面，将血小板化学缀合至靶向部分。

应当理解并在本文中考虑到，工程化血小板可通过化学键或缀合连接至靶向部分。一方面，本文公开了表达膜结合PD-L1的工程化血小板，其中该血小板经由铜(I)催化的[3+2]叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)、应变促进的炔烃-硝酮环加成(SPANC)或二苯并环辛基(DBCO)无铜环加成(例如，二苯并环辛基(DBCO)-聚乙二醇(PEG)4NHS酯)化学缀合至靶向部分。为了促进缀合，也可修饰靶向部分以完成与血小板的连接。因此，本文公开了任何前述方面的治疗剂递送溶媒，其中靶向部分用活化的叠氮化物分子(例如四酰基化的N-叠氮乙酰基半乳糖胺(Ac4GalNAz))处理。

1.药物载体/药品的递送

一方面，应理解本文所公开的治疗剂递送溶媒旨在施用给受试者以治疗、预防、抑制或减轻糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和/或自身炎症性疾病或病症。因此，本文公开了包含本文所公开的任何工程化血小板的药物组合物。

一方面，本文公开了药物组合物，其包含任何表达本文所公开的膜结合PD-L1的工程化血小板以及靶向部分；其中该血小板已被修饰以包含治疗剂货物和化学键；其中化学键包含二苯并环辛基(DBCO)-聚乙二醇(PEG)4NHS酯；并且其中血小板化学缀合至靶向部分；其中一种或多种治疗性货物药剂包含小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-MT)、去甲哈尔满、迷迭香酸、艾卡哚司他、navooximod、阿霉素、他莫西芬、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)、siRNA、肽、聚合物、模拟肽和/或抗体(诸如例如以及抗PDL-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维单抗)。

如上所述，这些组合物也可以药学上可接受的载体施用到体内。“药学上可接受”意指非生物学上或其他方面不良的材料，即，该材料可与核酸或载体一起施用给受试者，不会造成任何不良生物效应或以有害方式与含其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知，该载体将自然地被选择，以最小化该活性成分的任何降解，并最小化该受试者中的任何不利副作用。

组合物可经口、经肠胃外(例如经静脉内)、借由肌内注射、借由腹膜内注射、经皮、经体外、经局部等施用，包括局部鼻内施用或借由吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指通过一个或两个鼻孔将该组合物递送至鼻腔和鼻腔通道，且可包括借由喷雾机制或液滴机制递送，或通过核酸或载体的喷雾化递送。借由吸入剂施用组合物是通过鼻腔或口腔、经由喷雾或液滴机制递送。也可经由插管直接递送到呼吸系统的任何区域(例如，肺)。所需组合物的确切数量因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄、体重和一般情况、所治疗过敏性障碍的严重程度、所使用的特定核酸或载体、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，可由本领域的普通技术人员通过仅使用本文给出教导的常规实验来确定适当的量。

该组合物的肠胃外施用(如果使用)通常以注射为特征。注射剂可制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适于在注射前在液体中溶解悬浮液的固体形式，或者是乳剂。最近改良的肠胃外施用方法包括使用缓释或缓释系统，以维持恒定剂量。参见，例如，美国专利号3,610,795，其通过引用并入本文。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)。它们可能通过抗体、受体或受体配体靶向至特定的细胞类型。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Senter等人，Bioconjugate Chem.,2:447-451,(1991)；Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer,60:275-281,(1989)；Bagshawe等人，Br.J.Cancer,58:700-703,(1988)；Senter等人，Bioconjugate Chem.,4:3-9,(1993)；Battelli等人，CancerImmunol.Immunother.,35:421-425,(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992)；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。“隐形”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的针对结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向等溶媒。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向至肿瘤组织的实例(Hughes等人，Cancer Research,49:6214-6220,(1989)；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta,1104:179-187,(1992))。一般来说，受体参与内吞作用的途径，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白所包被的小窝中，通过网格蛋白所包被的囊泡进入细胞，通过对受体进行分类的酸化的核内体，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，如营养吸收、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节等。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价态和配体浓度，许多受体遵循不止一个细胞内途径。受体介导的内吞作用的分子和细胞机制已有综述(Brown和Greene，DNA and CellBiology 10:6，399-409(1991))。

a)药学上可接受的载体

所述组合物包括抗体，可在治疗上与药学上可接受的载体结合使用。

合适的载体及其制剂在以下文献中有所描述：Remington:The Science andPractice of Pharmacy(第19版)，编辑A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA 1995。通常，在该制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使该制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该溶液的pH值优选为约5至约8，且更优选为约7至约7.5。进一步的载体包括缓释制剂，如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透膜基质，其基质为成型制品的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，某些载体可能更可取，例如取决于施用途径和施用组合物的浓度。

药物载体是本领域技术人员已知的。这些通常是给人类施用药物的标准载体，包括无菌水、生理盐水和生理pH下的缓冲液等溶液。这些组合物可经肌内或经皮下施用。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等以及所选择的分子。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，诸如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。

可根据是否需要局部或全身治疗以及要治疗的区域以多种方式施用药物组合物。施用可以是经局部(包括经眼、经阴道、经直肠、经鼻内)、经口、借由吸入或经肠胃外施用，例如借由静脉内滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。所公开的抗体可经静脉内、经腹膜内、经肌内、经皮下、经腔内或经皮施用。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

用于局部施用的制剂可包括软膏、乳液、面霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水、粉末或油性碱、增稠剂等可能是必要的或可取的。

口服施用组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、袋剂或片剂。增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是可取的。

一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸或碱加成盐施用，并通过无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和延胡索酸)反应形成，或无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(如一、二、三烷基和芳基胺及取代乙醇胺)反应形成。

b)治疗用途

可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。组合物的施用剂量范围应足够大，以产生所需的效果，从而影响障碍的症状。剂量不应太大以致引起不良副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病症、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以由本领域技术人员来确定。如果有任何禁忌症，也可以由个体医生来调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一剂量或多剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到针对适当剂量的指南。例如，在抗体治疗用途的文献中可以找到选择适当剂量抗体的指南，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编辑，NogesPublications，Park Ridge,N.J.，(1985)第22章和第303-357页；Smith等人，Antibodiesin Human Diagnosis and Therapy，Haber等人编辑，Raven Press，New York(1977)，第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量可能在每天约1μg/kg至100mg/kg体重或以上的范围内。

C.治疗1型糖尿病、移植物抗宿主病和/或自身炎症性疾病或病症的方法

如本文所述，所公开的工程化血小板和/或药物组合物可用于治疗、预防、抑制或减轻糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和/或自身炎症性疾病或病症。因此，本文公开了治疗、预防、抑制或减轻受试者的糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和/或自身炎症性疾病或病症的方法，该方法公开了表达膜结合PD-L1的工程化血小板和/或药物组合物。一方面，所公开的方法中使用的方法可以使血小板进一步表达膜结合CD40L和/或toll样受体。

应当理解并在本文中考虑到，可通过施用本文所公开的工程化血小板治疗、抑制、预防或减轻自身炎症性疾病或病症，该工程化血小板包括但不限于：失弛缓症、急性播散性脑脊髓炎、急性运动性轴索神经病、艾迪生氏病、痛性肥胖症、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺综合征、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病便(AMAN)、Baló病、白塞氏病、良性粘膜类天疱疮、Bickerstaff脑炎、大疱性类天疱疮、Castleman病(CD)、乳糜泻、Chagas病、慢性疲劳综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征(CSS)、嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、Cogan综合征、冷凝集素病、先天性心脏阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、1型糖尿病、盘状狼疮、德勒斯勒综合征、子宫内膜异位症、肌腱端炎、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合型冷球蛋白血症、伊文氏综合征、费尔蒂综合征、纤维肌痛症、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球性肾炎、古德巴斯捷氏综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、Guillain-Barre综合征、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、炎症性肠病(IBD)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、川崎病、Lambert-Eaton综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮肾炎、狼疮血管炎、慢性莱姆病、梅尼埃病、显微镜下型多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、Mooren溃疡、Mucha-Habermann病、多病灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、嗜中性白血球减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕里伯格综合征、帕尔斯平炎(周围性葡萄膜炎)、Parsonnage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、周围性脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺性综合征、风湿性多肌痛症、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕激素性皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、复发性多软骨炎、多动腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类风湿性血管炎、结节病、施密特氏综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、Sydenham舞蹈病、交感性眼炎(SO)、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、Takayasu动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹、荨麻疹性血管炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、Vogt-Koyanagi-Harada病和韦格纳氏肉芽肿病(或肉芽肿性多血管炎(GPA))。

一方面，本发明所公开的治疗/减轻/预防/抑制受试者的糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)(例如移植的β-胰岛细胞或肾的GvHD)和/或自身炎症性疾病的方法，其包括向受试者施用任何本文所公开的表达膜结合PD-L1的工程化血小板细胞，可包括以任何适于治疗、减轻、预防和/或抑制糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和/或自身炎症性疾病的频率施用该工程化血小板。例如，工程化血小板可至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用于患者。一方面，工程化血小板每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。

一方面，应当理解并在本文中考虑到，治疗/减轻/预防/抑制糖尿病、移植物抗宿主病(GvHD)和/或自身炎症性疾病或病症的方法可进一步包括向受试者施用β-胰岛细胞。β-胰岛细胞可在施用工程化血小板之前、同时或之后施用。一方面，工程化血小板是在施用β-胰岛细胞前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周施用。

D.实例

提出以下实例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示范并且非旨在限制公开。已经努力确保数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，温度为℃或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

1.实例1

a)结果

(1)建立稳定表达PD-L1的巨核细胞(MK)细胞系。

血小板最初是从驻留在骨髓中的成熟MK释放到血液中的。为了在体外产生血小板，使用了鼠MK祖细胞系L8057。L8057细胞在用12-肉豆蔻酸酯13-乙酸佛波醇酯(PMA)刺激后经历了成熟、分化和血小板释放的过程。为了对稳定表达PD-L1的L8057细胞进行基因工程化，用编码鼠PD-L1的慢病毒感染L8057细胞。随后，用嘌呤霉素选择感染的细胞以获得稳定的细胞系。如细胞膜染料Alexa Fluor 594共轭麦胚凝集素(WGA594)所示，EGFP-PD-L1过表达并位于L8057细胞的细胞膜上(图1b)。借由蛋白质印迹法进一步检测了L8057细胞中EGFP-PD-L1的表达(图1c)。此外，在EGFP-PD-L1 L8057细胞上检测到MK细胞标志物CD41a(图1d和图1e)。CD42是指示MK成熟的标志物，其在PMA的刺激下在L8057细胞中大量表达(图1f和图1g)。另外，在成熟PD-L1 L8057细胞中也可检测到包括GPVI和P-选择蛋白的血小板标志物。

随着PMA的刺激，将PD-L1阳性囊泡积聚在成熟L8057细胞的血浆中(图1h和图1i)。随后，前血小板从细胞膜出芽并延伸(图1h和图1i)。最后，前血小板的碎裂释放出血小板(图1h)。收集呈现EGFP-PD-L1的血小板并从培养基中纯化(图1j)。分离出的PD-L1呈现血小板在透射电镜(TEM)下呈球形形态(图1k)。动态光散射(DLS)分析表明，PD-L1血小板的平均直径为约1.5μm，ζ电位为约-10mV(图1l)。用凝血酶刺激后，在活化的血小板上检测到P-选择蛋白的表达。磷脂酰丝氨酸也呈现于活化的血小板表面上，表明血小板在活化后经历死亡。

(2)PD-L1血小板的生物学特征。

血小板微粒(PMP)是从活化的血小板脱落的碎片，其在止血、血栓形成、炎症和组织再生促进剂中也起着血小板的作用。为了检查是否可以从活化的表达PD-1的血小板中产生PMP，将血小板在体外用凝血酶处理。用凝血酶刺激后，工程化血小板经活化并显示出无定形形式，并带有多个触角(图2a)。TEM图像还示出从平均直径为约100nm的活化血小板产生的PMP(图2a和图2b)。在一些血栓形成和炎症性疾患以及一些癌症中，血液循环的PMP数量增加。为了研究PD-L1血小板是否可以在NOD小鼠中释放PMP，观察到其在体内从血小板释放。大部分血小板是单个细胞，表明PD-L1血小板的血栓形成潜力低。与静息血小板相比，PMP具有明显较小的大小，从而增强了胰腺对PD-L1呈现颗粒的浸润并进一步增强了与T细胞的相互作用。血管破裂会导致胶原蛋白暴露，胶原蛋白可募集血小板进行止血。为了测试PD-L1血小板的胶原结合作用的功能，将PD-L1血小板用胶原涂覆的孔在体外孵育。值得注意的是，EGFP-PD-L1血小板可有效粘附至胶原涂覆的孔(图2c)。另一方面，血栓形成是止血应答的另一个关键事件。在被凝血酶活化后，PD-L1血小板彼此结合并形成聚集体。接下来，检测了PD-L1血小板与T细胞之间在体外的相互作用。从高血糖(血糖>500mg/dL)的NOD小鼠的16周胰腺中分离出的CD90.2⁺T细胞胰腺分别用PD-L1血小板和游离血小板孵育。PD-L1血小板和游离血小板均可与T细胞结合(图2d)。重要的是，用PD-L1孵育后，GzmB阳性CD8⁺T细胞的频率显著降低，表明PD-L1血小板可以消耗CD8⁺T细胞(图2e和图2f)。此外，游离血小板对CD8⁺T细胞活性的影响明显较低(图2e和图2f)。据报道这种有限的抑制作用是P-选择蛋白依赖性的。此外，血小板衍生的TGF-β也可衰减宿主的免疫应答。还检测到来自培养基和从血小板释放的TGF-β1，其有助于T1D的治疗。此外，人巨核细胞系MEG-01经基因工程化且稳定表达了人PD-L1(hPD-L1)，并经历了成熟和分化。同样，hPD-L1血小板能够与人PD-1阳性T细胞结合并抑制其活性，并且对活力和增殖的作用有限(图3A、图3B和图4)。

为了研究工程化血小板的全身循环，用Cy5.5标记了PD-L1血小板，然后通过尾静脉将其注入患有高血糖的NOD小鼠中。PD-L1血小板的血液滞留与游离血小板相似(图2g)，并且PD-L1血小板和游离血小板的半衰期(t 1/2)分别为约30.6h和23.9h。接下来，在患有高血糖的NOD小鼠中研究了PD-L1血小板的体内组织生物分布。值得注意的是，经促进的EGFP-PD-L1血小板和游离血小板能够在NOD小鼠的胰腺中积聚(图2h和图2i)，与用游离血小板治疗的NOD小鼠相比，可以观察到高葡萄糖水平(图2h和图2i)。此外，与健康小鼠相比，还显示出PD-L1血小板优先在糖尿病NOD小鼠的胰腺中积聚。同时，PD-L1血小板也大量积聚在肝中(图2h和图2i)。

(3)PD-L1血小板逆转NOD小鼠中的新发T1D。

PD-L1在维持外周免疫耐受性中起至关重要的作用，有助于控制T细胞的活性。因此，认为PD-L1呈现血小板起免疫抑制细胞的作用，以保护β-细胞免受胰岛特异性自身反应性T细胞的攻击。为了研究PD-L1血小板是否可以逆转新发T1D，将NOD小鼠分为三组，并在10周龄时每两天检测一次血糖。健康维持正常血糖量，血糖为80mg/dL至130mg/dL。一旦NOD小鼠的血糖水平超过250mg/dL，就认为这些小鼠表现出新发糖尿病。然后，每两天分别向糖尿病NOD小鼠静脉内注射游离血小板或PD-L1血小板，直至终点(40天)。如图5a所示，在NOD小鼠中的新发T1D(血糖>250mg/dL)未经治疗的情况下，血糖逐渐升高，最终达到高血糖(血糖>600mg/dL)。相反，对于接受PD-L1血小板治疗的新发T1D小鼠，新发T1D的进展在75％的小鼠中被显著抑制，高血糖被逆转为正常血糖(共12只小鼠中的9只)(图5a和图5b)。但是，用游离血小板治疗新发T1D小鼠对进展性T1D的抑制作用有限，并且不能逆转高血糖(图5a和图5b)。为了进一步检查胰岛素产生β-细胞，收集了来自不同治疗组的NOD小鼠的胰腺，并借由免疫荧光进行了分析。如图5c所示，在具有正常血糖(血糖＜130mg/dL)的NOD小鼠中，胰岛素产生β-细胞是完整的。相反，在患有高血糖(血糖>500mg/dL)的NOD小鼠中，大多数β-细胞丢失(图5c和图5d)。值得注意的是，用PD-L1血小板治疗的NOD小鼠可阻止胰岛素产生β-细胞的损伤和丢失(图5c和图5d)。相反，用游离血小板治疗的NOD小鼠不能阻止β-细胞的丢失(图5c和图5d)。此外，还检测了NOD小鼠的血液胰岛素水平。与未经治疗的NOD小鼠相比，用PD-L1血小板治疗后，胰岛素水平提高了3倍(图5e)。为了检查PD-L1血小板的短期治疗效果，将糖尿病NOD小鼠分别用对照血小板和PD-L1血小板治疗5次(10天)和10次(20天)。观察到接受5次治疗的糖尿病NOD小鼠在治疗期间维持正常血糖，但是只有41％的小鼠在第20天仍维持正常血糖(图6A和图6B)。与接受20次治疗的小鼠相比，接受10次PD-L1血小板治疗(20天)的糖尿病NOD小鼠获得了相似的益处(图5a)。大多数小鼠(75％)在第30天维持正常血糖(图7A和图7B)。为了研究小鼠在PD-L1血小板治疗后是否可以获得长期利益，测量了接受10次PD-L1血小板治疗的小鼠在第20天后的血糖水平。在接下来的8周内，经PD-L1血小板治疗的小鼠中的58％逆转为正常血糖(共12只小鼠中的7只)。该数据表明，在PD-L1血小板治疗后，小鼠可以实现长期益处。为了研究PD-L1对预防NOD小鼠的糖尿病的作用，在10周龄时对NOD小鼠进行了正常血糖治疗。令人惊讶的是，与用游离血小板治疗的NOD小鼠相比，PD-L1血小板治疗使糖尿病NOD小鼠模型中的糖尿病发生率显著降低(P<0.01，Kaplan-Meier估计)(图5f)。

(4)PD-L1血小板消耗渗透胰腺的T细胞。

浸润胰腺的自身反应性T细胞攻击β-细胞而导致T1D。为了检测胰腺浸润的T细胞的状态，收集了来自不同治疗组的NOD小鼠的胰腺，并借由免疫荧光进行了分析。如图8a所示，正常血糖的NOD小鼠中几乎没有CD3⁺或CD8⁺T细胞渗透胰腺，而高血糖的NOD小鼠中有大量T细胞渗透胰腺边缘和胰岛(图8a和图8b)。通过PD-L1血小板治疗，渗透胰腺的CD8⁺T细胞显著减少(图8a和图8b)。相反，游离血小板在防止T细胞渗透方面作用有限(图8a和图8b)。借由流式细胞仪进一步分析渗透胰腺的T细胞。与正常血糖相关的NOD小鼠相比，高血糖NOD小鼠的CD3⁺T细胞频率显著增加(图8c和图8b)。令人惊讶的是，与用游离血小板治疗的小鼠相比，PD-L1血小板的治疗强烈抑制了胰腺T细胞渗透(图8c和图8d)。此外，与未经治疗的高血糖NOD小鼠相比，用PD-L1血小板治疗的NOD小鼠的胰腺中的CD8⁺T细胞的频率显著降低(图8e和图8f)；而使用游离血小板治疗的糖尿病NOD小鼠对CD8⁺T细胞渗透的频率影响有限(图8e和图8f)。活化的CD8⁺毒性T细胞分泌免疫细胞因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、颗粒酶B和穿孔素，以攻击β-细胞。如图8g、图8h、图8i和图8j所示，在这些未经治疗的高血糖NOD小鼠中，渗透胰腺的CD8⁺T细胞为GzmB和IFN-γ阳性，表明T细胞可引起β-细胞的损伤。值得注意的是，与接受游离血小板治疗的NOD小鼠相比，PD-L1血小板抑制CD8⁺T细胞的活性(图8g、图8h、图8i和图8j)。

CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞可起抑制性T细胞的作用，维持对自身抗原的耐受性并预防包括T1D的自身免疫性疾病。流式细胞仪结果表明，未经治疗的高血糖NOD小鼠中Tregs的频率显著降低(图9a)。在PD-L1血小板的治疗下，也防止了Tregs丢失，这可能有助于保护β-细胞(图9b)。另一类调节T细胞，CD49b⁺CD4⁺调节T(Tr1)细胞，在自身免疫性疾病的免疫抑制中也起关键作用。涂覆有主要组织相容性复合物II类(pMHCII)分子的纳米粒子呈现自身抗原以触发Tr1扩增，有助于治疗包括T1D的自身免疫性疾病。在此还观察到接受PD-L1血小板治疗的小鼠的胰腺中的Tr1细胞得以恢复(图10A和图10B)。总的来说，这证明了PD-L1血小板可以有效抑制渗透胰腺的CD8⁺T细胞的活性并增加Tregs的百分比，这有助于在NOD糖尿病小鼠中逆转新发T1D。

b)讨论

总之，输注PD-L1血小板可以抑制NOD小鼠中的进展并逆转新发1型糖尿病。PD-L1呈现血小板，并且其释放的PMP积聚在发炎的胰腺中并执行免疫抑制功能。渗透胰腺的效应T细胞的活性已被强烈抑制，胰岛素产生β-细胞得以拯救，使得高血糖逆转为正常血糖。此外，PD-L1血小板治疗还增加了胰腺中Tregs的百分比并增强了胰腺免疫耐受性，这也有助于NOD小鼠中新发T1D的逆转。这种免疫检查点阻断介导的细胞治疗策略可进一步扩展，以治疗具有靶向能力和有限副作用的其他自身免疫性疾病。

c)方法

(1)化学品和试剂。

凝血酶和抗小鼠PD-L1抗体购自Sigma-Aldrich。用于免疫荧光染色的抗小鼠CD4、CD8、CD41a和CD42a抗体购自Abcam。小鼠GPVI抗体购自R&D Systems(MAB6758)。P-选择蛋白(sc-8419)抗体购自Santa Cruz biotechnology。用于荧光活化细胞分选(FACS)的抗体(抗CD41a、CD42d、CD3、CD4、CD8、Foxp3、GrzmB和IFN-γ)购自Biolegend Inc。麦胚凝集素(WGA)Alexa 594染料购自Thermo Scientific。

(2)细胞培养。

L8057细胞在补充有20％胎牛血清(FBS)的罗斯威尔公园纪念研究所(RoswellPark Memorial Institute，RPMI)(RPMI)1640培养基中培养。HEK293T细胞在补充有10％FBS的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)中培养。

(3)建立稳定的细胞系。

编码具有C端单体GFP标签(pLenti-C-mGFP-PD-L1-puro)的鼠PD-L1和人PD-L1的慢病毒载体并且包装质粒购自Origene Technology。根据制造商的说明，用PD-L1质粒和包装质粒瞬时转染HEK293T细胞。转染48小时后，慢病毒被渗析并从培养基中纯化。然后，用慢病毒感染L8057细胞，并用6μg/ml的聚凝胺孵育。感染96小时后，将L8057细胞用1μg/mL嘌呤霉素孵育，以筛选稳定表达小鼠PD-L1的细胞系。将既定的表达EGFP-PD-L1的L8057细胞维持在辅以0.5-1μg/ml嘌呤霉素的20％FBS中。

(4)产生血小板。

在补充有500nM PMA的1640培养基中培养稳定表达EGFP-PD-L1的L8057细胞3天。之后，将成熟L8057细胞再培养6天以进行分化。分化后将血小板释放到培养基中。收集培养基以分离血小板。首先将培养基以1000rpm离心20min以除去L8057细胞。随后，将上清液以12,000rpm离心30min。最后将血小板沉淀物小心地重悬于含有1μM PGE1或Tyrode缓冲液(134mM NaCl、12mM NaHCO₃、2.9mM KCl、0.34mM Na₂HPO₄、1mM MgCl₂、10mM HEPES、pH 7.4)的PBS中。

(5)免疫荧光测定。

将L8057细胞用4％多聚甲醛固定10min。然后，将细胞用PBS洗涤三次。然后，将固定的细胞用3％BSA和0.2％Triton X-100孵育以用于封闭和透化。然后，将L8057细胞分别用如所示的一级抗体在4℃孵育过夜。在第二天，将细胞用PBS洗涤三次以除去未结合的抗体。随后，将细胞用与罗丹明缀合的二级抗体(1.5％BSA)避光孵育1小时。然后用DAPI将细胞核染色20min。最后，将细胞用PBS洗涤三次。借由共聚焦显微镜(Zeiss)使用40倍物镜观察细胞。

(6)蛋白质印迹测定。

如所述执行蛋白质印迹法。简而言之，用上样缓冲液裂解EGFP-PD-L1 L8057细胞。样品在沸水浴中浸泡15分钟。随后，对样品进行12％SDS-PAGE。将蛋白质转移到PVDF膜上，并使用PD-L1和β-肌动蛋白一级抗体进行分析。

(7)体外T细胞结合和活性测定。

使用T细胞分离试剂盒(Thermo Fisher)从NOD小鼠的胰腺中分离出Pan T细胞(CD90.2+T细胞)。将EGFP-PD-L1血小板(约1×10⁸)或Cy5.5标记的游离血小板(约1×10⁸)用T细胞孵育过夜。之后，将核用Hoechst染色10min。借由共聚焦显微镜(Zeiss)使用40倍物镜观察血小板与T细胞的结合。对于T细胞活性测定，借由流式细胞术确定颗粒酶B⁺CD8⁺T细胞的百分比。

(8)血小板胶原结合测定。

I/III型小鼠胶原蛋白购自Bio-Rad。将胶原溶液(2.0mg ml在0.25％的乙酸中)涂覆在共聚焦孔上在4℃过夜。之后，在结合测定之前，用2％BSA封闭孔。将EGFP-PD-L1血小板(约1×10⁸)加入胶原涂覆的孔中30秒钟，然后将孔洗涤三次以除去未结合的血小板。利用共聚焦显微镜(Zeiss)使用40倍物镜观察结合血小板。

(9)血小板聚集测定。

通过共聚焦成像评估血小板的聚集。血小板用WGA Alexa Fluor 594标记。然后将血小板上样到共聚焦孔中，并用0.5IU^-1凝血酶刺激30min。在共聚焦显微镜(Zeiss)上以顺序扫描模式用63倍物镜进行共聚焦显微镜检查。

(10)体内循环分析。

分离的血小板用NHS-Cy5.5标记。之后，用PBS洗涤血小板以除去游离NHS-Cy5.5。然后，通过尾静脉向NOD小鼠注射NHS-Cy5.5标记的血小板(200μL，约2×10⁸)。在血小板注射后的不同时间点(分别在2min、30min、1h、2h、4h、8h、24h和48h)收集NOD小鼠的血液。借由以1500rpm离心5min来纯化血清，并使用TeCan Infinite M200读数器测量血小板的荧光。

(11)体内生物分布分析。

分离的血小板在PBS缓冲液中用NHS-Cy5.5标记。孵育20小时后，用PBS洗涤NHS-Cy5.5标记的血小板三次，以除去游离NHS-Cy5.5。通过尾静脉向NOD小鼠注射Cy5.5标记的血小板(200μL，约2×10⁸)。然后，对NOD小鼠实施安乐死，并收集包括胰腺、肺、心脏、肾、脾和肝的主要器官。最后，借由Xenogen IVIS Spectrum成像系统记录主要器官的强度。

(12)糖尿病NOD小鼠的治疗。

NOD/ShiLtJ雌性小鼠购自Jackson Lab(USA)。所有的小鼠研究都是在北卡罗来纳州立大学机构动物护理和使用委员会以及北卡罗来纳大学教堂山分校批准的动物方案的背景下进行的。明显的糖尿病定义为连续2天血糖水平高于250mg/dL。借由尾部采血进行测量。从10周龄开始监测NOD小鼠的血糖。一旦小鼠高血糖(>250mg/dL)持续两天，就不对高血糖小鼠进行治疗(对照组)或经由尾静脉每2天注射一次游离血小板(约2×10⁸)或PD-L1血小板(约2×10⁸)。每两天测量一次NOD小鼠的血糖，直至特定终点(40天)，然后处死小鼠进行进一步分析。

(13)组织免疫荧光测定。

收集NOD小鼠的胰腺并冷冻在最佳切割培养基(O.C.T.)中。使用冷冻切片机切割胰腺样品，并将其安放在载玻片上。首先将冷冻的胰腺切片用PBS洗涤5min以除去O.C.T.。然后，使用含有3％BSA和0.2％Triton-X100的缓冲液封闭试样。然后，如所示的将试样用胰岛素、胰高血糖素和CD8一级抗体(在1.5％BSA中为1:100)孵育过夜。试样用PBS洗涤三次，每次5min。随后，将试样用FITC和TRITC标记的二级抗体(在1.5％BSA中稀释)孵育1h。最后，样品的核用DAPI染色20分钟，并用PBS洗涤三次。通过共聚焦显微镜(Zeiss)使用40倍物镜观察样品。

(14)胰腺T细胞分析。

为了评估胰腺浸润的T细胞的状态，用所示的不同处理方法从NOD小鼠中收集胰腺。胰腺被解离以产生单细胞。样品通过70微米过滤器。随后，将细胞用所示的APC抗小鼠CD3抗体、FITC缀合的抗CD4、PE缀合的抗CD8、PE缀合的抗FoxP3、FITC缀合的抗颗粒酶B和FITC缀合的抗IFN-γ染色。借由流式细胞术测定CD3⁺CD8⁺T细胞、CD3CD4 T细胞、颗粒酶B⁺CD8⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞以及FoxP3⁺CD4⁺Treg细胞的百分比。

(15)统计分析。

所有数据均显示为平均值±标准差。除非另有说明，否则在所有实验中均进行生物学重复。使用单因素或双因素方差分析(ANOVA)和图基事后检验对样品进行多次比较。使用对数秩检验分析存活数据。所有统计分析都是使用IBM SPSS统计数据进行的。p*<0.05被认为具有统计学意义。

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Claims (14)

1.一种包含膜结合外源性PD-L1的工程化血小板。

2.根据权利要求1所述的工程化血小板，其进一步包含膜结合CD40L和/或toll样受体。

3.根据权利要求1所述的工程化血小板，其为靶向部分。

4.根据权利要求3所述的工程化血小板，其中所述靶向部分为肽、多肽、聚合物、小分子、核酸、抗体或糖。

5.根据权利要求3所述的工程化血小板，其中所述靶向部分靶向骨髓、肝、脾、胰腺、前列腺、膀胱、心脏、肺、脑、皮肤、肾、卵巢、睾丸、淋巴结、小肠、大肠或胃。

6.一种治疗/减轻受试者的糖尿病的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的工程化血小板。

7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用β-胰岛细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述工程化血小板是在施用所述β-胰岛细胞前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周施用。

9.一种治疗/减轻/预防/抑制受试者的移植物抗宿主病(GvHD)的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的工程化血小板。

10.一种治疗/减轻/预防/抑制自身炎症性病症的方法。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述自身炎症性病症选自由以下项组成的组：失弛缓症、急性播散性脑脊髓炎、急性运动性轴索神经病、艾迪生氏病、痛性肥胖症、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺综合征、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病变(AMAN)、Baló病、白塞氏病、良性粘膜类天疱疮、Bickerstaff脑炎、大疱性类天疱疮、Castleman病(CD)、乳糜泻、Chagas病、慢性疲劳综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征(CSS)、嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、Cogan综合征、冷凝集素病、先天性心脏阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、1型糖尿病、盘状狼疮、德勒斯勒综合征、子宫内膜异位症、肌腱端炎、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合型冷球蛋白血症、伊文氏综合征、费尔蒂综合征、纤维肌痛症、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球性肾炎、古德巴斯捷氏综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、Guillain-Barre综合征、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、炎症性肠病(IBD)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、川崎病、Lambert-Eaton综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮肾炎、狼疮血管炎、慢性莱姆病、梅尼埃病、显微镜下型多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、Mooren溃疡、Mucha-Habermann病、多病灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、嗜中性白血球减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕里伯格综合征、帕尔斯平炎(周围性葡萄膜炎)、Parsonnage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎(Perivenousencephalomyelitis)、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺性综合征、风湿性多肌痛症、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕激素性皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、复发性多软骨炎、多动腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类风湿性血管炎、结节病、施密特氏综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、Sydenham舞蹈病、交感性眼炎(SO)、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、Takayasu动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹、荨麻疹性血管炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、Vogt-Koyanagi-Harada病和韦格纳氏肉芽肿病(或肉芽肿性多血管炎(GPA))。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述自身炎症性病症为类风湿性关节炎。

13.根据权利要求6-8中任一项所述的治疗糖尿病的方法、根据权利要求6所述的治疗/减轻/预防/抑制移植物抗宿主病(GvHD)的方法、或根据权利要求10-12所述的治疗/减轻/预防/抑制自身炎症性病症的方法，其中所述工程化血小板至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用于患者。

14.根据权利要求6-8中任一项所述的治疗糖尿病的方法、根据权利要求6所述的治疗/减轻/预防/抑制移植物抗宿主病(GvHD)的方法、或根据权利要求10-12所述的治疗/减轻/预防/抑制自身炎症性病症的方法，其中所述工程化血小板每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。

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