KR101882523B1 - Ｖｉｓｔａ 조절 ｔ 세포 매개 단백질, ｖｉｓｔａ 결합제 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 조절 T 세포 단백질에 관한 것이다. PD-L3 또는 VISTA로 명명되는 이 단백질은 PD-L1계 (family)의 멤버와 유사하고, 동정되었으며, 신규하고, 구조적으로 뚜렷한 Ig-대계 억제성 리간드 (Ig-superfamily inhibitory ligand)에 관한 것으로, 그 세포외 도메인은 B7계 리간드 PD-L1과 상동성을 가지고 있다. 이 분자는 PD-L3 또는 VISTA 또는 T 세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 억제자 (VISTA)라고 명명되었다. VISTA의 발현은 대개 조혈 구성요소내에 있으며, 골수성 APCs 및 T 세포에서 매우 조절된다. VISTA 억제적 경로의 치료적 중재는 다양한 암, 예를 들면 난소암, 방광암 및 흑색종의 치료를 위한 T-세포 매개 면역을 조절하는 새로운 접근을 나타낸다. 또한, VISTA 단백질, 특히 다합체 (multimeric) VISTA 단백질 및 항체는 자가면역 질환, 알러지, 감염 및 염증성 질병, 예를 들면 다발성 경화증 및 RA와 같은 관절염 질병에서 T 세포 면역을 억제하기 위해 사용될 수 있다.

Description

ＶＩＳＴＡ 조절 Ｔ 세포 매개 단백질, ＶＩＳＴＡ 결합제 및 그것의 용도{VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING AGENTS AND USE THEREOF}
본 출원은 2010년 3월 26일에 제출된 US Serial No. 12 732,371, 2010년 10월 6일에 제출된 US 가출원 No. 61/390,434, 2011년 1월 26일에 제출된 US 가출원 No. 61/436,379 및 2011년 3월 7일에 제출된 US 가출원 No. 61/449,882에 대해 우선권이 있다. 상기 모두는 참고문헌으로서 포함된다.
본 출원은 V-부위 면역글로불린-포함 T 세포 활성화의 억제 (V-region Immunoglobulin-containing Suppressor of T cell Activation; VISTA) 또는 PD-L3로 명명된 것으로, 발견되고 특징 되었으며 기능적으로 정의된, 신규하고 조혈-제한적 (hematopoieticaily-restricted)이며 구조적으로 뚜렷한 Ig-대계 억제성 리간드 (Ig-superfamily inhibitory ligand)에 관한 것이다. 세포외 도메인은 B7계 리간드 (B7 family ligand) PD-L1 상동성을 가지고 있고, PD-L1과 같이 VISTA는 면역에 있어서 많은 영향을 가진다. 하지만, PD-L1과 상이하게, VISTA의 발현은 조혈 구성요소 (hematopoietic compartment) 내에서만 보여진다. 발현은 CD4+ T 세포 및 Foxp3+ 조절 T 세포 (Foxp3+ regulatory T cells; Treg)의 부분집단에서도 유의적으로 흥미롭게 나타나지만, 대개 골수성 항체제시세포 (antigen presenting cells; APCs)에 우세하다. 용해성 VISTA-Igs 융합 단백질 또는 APCs에서의 VISTA 발현은 시험관내에서 강력하게 T 세포 증식, 사이토카인 (cytokine) 생산을 억제하고 T 세포 내에서 Foxp3의 발현을 유도한다. 반대로, 새롭게 발달된 항-VISTA 단일클론항체는 시험관내에서 VISTA+ APCs에 의한 T 세포의, VISTA-유도 면역억제를 방해한다. 또한, 생체내 항-VISTA는 T 세포 매개 자가면역 질환 실험적 알러지성 뇌척수염 (experimental allergic encephalomyelitis; EAE)의 발달을 촉진시키고, 차후의 종양 완화 (tumor remission)과 함께 보호적, 종양-특이적 면역반응의 발달을 촉진시켰다. VISTA-/- 생쥐의 초기 연구는 자발적 염증성 질환 (spontaneous inflammatory disease)의 초기 지표를 나타내고 있고, 그들의 병리적 운명이 결정될 것이다. 다른 모든 PD-리간드-관련 분자 (예를 들면, B7-H3, H4, H6)와 다르게, VISTA의 조혈 제한성과 그것의 많은 억제적 활성 및 고유한 구조적 특성은 VISTA가 신규하고, 기능적으로 필수적이며, 그것의 발현이 대개 골수-제한적 (myeloid-restricted)인, 면역의 중심적 음성조절자 (negative regulator)라는 것을 나타낸다.
면역반응의 유도는 T 세포의 팽창, 분화, 수축 및 T 기억세포 (T cell memory)의 생성을 필요로 한다. T 세포는 반드시 항원제시세포 (antigen presenting cell; APC)를 만나야 하고 T 세포 수용체/APC의 주조직적합성복합체 (major histocompatibility complex; MHC) 상호결합을 통해서 소통한다. TCR/MHC 상호결합이 생성되면, T 세포 및 APC 사이의 다른 수용체-리간드의 결합, 예를 들면 CD154/CD40 및 CD28/B7.1-B7.2를 통한 공동자극이 요구된다. 상기 접촉사이의 시너지 (synergy)는 생체내에서 병원균 및 종양을 제거할 수 있는 생산적인 면역반응 및 자가면역을 유도할 수 있는 상황을 야기시킨다.
조절하는 다른 수준, 즉 조절 T 세포 (regulatory T cell; Treg)가 동정되었다. 상기 T 세포의 특이적 부분집단 (subset)은 흉선에서 생성되어, 주변으로 이동하며, 시험관내 및 생체내에서 T 세포 반응 조절을 일정하게 유도할 수 있다 (Sakaguchi (2000) Cell 101(5):455-8; Shevach (2000). Annu. Rev. Immunol. 18:423-49; Bluestone and Abbas (2003) Nat. Rev. Immunol. 3(3):253-7). Treg는 CD4+CD25+ 표현형을 나타내며 또한 세포독성 T 세포 연관 항원-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4), OX-40, 4-1BB 및 글루코코티코이드 유도 TNF 수용체-연관 단백질 (glucocorticoid inducible TNF receptor-associated protein; GITR)을 높은 수준으로 발현한다 (McHugh, et al. (2002) Immunity 16(2):31 1-23; Shimizu, et al. (2002) Nat. Immun. 3(2): 135-42). 5일 신생 가슴절제 (5 day neonatal thymectomy) 또는 항-CD25 항체를 이용한 항체고갈 (antibody depletion)에 의한 Treg 세포의 제거는 자가면역 병원균의 유도와, 항-종양 반응을 포함한 외래 (foreign) 및 자가 (self)-항원에 대한 T 세포 반응의 악화를 야기한다 (Sakaguchi, et al. (1985) J. Exp. Med. 161(l):72-87; Sakaguchi, et al. (1995) J. Immunol. 155(3): 1151 -64; Jones, et al. (2002) Cancer Immun. 2: 1). 또한, Treg는 항-CD25 단일클론항체를 이용한 Treg의 고갈은 이식내성의 제거 및 급격한 이식거부를 야기시키기 때문에 (Jarvinen, et al. (2003) Transplantation 76: 1375-9), 이식내성 (transplantation tolerance)의 유도 및 유지와도 관련이 있다 (Hara, et al. (2001) J. Immunol. 166(6):3789-37%; Wood and Sakaguchi (2003) Nat. Rev. Immunol. 3: 199-210). Treg에 의해 발현되는 수용체 중에서, 시험관내 또는 생체내에서 작용제적 단일클론항체 (agonistic monoclonal antibody)를 이용한 Treg 표면에 있는 GITR의 연결 (ligation)이 급속한 Treg 활성의 종결을 야기시키고 (상기 McHugh, et al. (2002); 상기 Shimizu, et al. (2002)) 또한 자가면역 병원균 (autoimmune pathology) (상기 Shimizu, et al. (2002)) 및 이식내성의 제거를 야기시키기 때문에, GITR은 중요한 구성요소로 보인다.
공동자극 (costimulatory) 및 공동 억제 (co-inhibitory) 리간드 및 수용체는 T 세포 활성을 위한 2차 신호를 제공할 뿐만 아니라, 자기 (self)에 대한 면역을 제한하는 반면 감염 (infection)에 대한 면역반응을 최대화시키기 위한 양성 및 음성 신호의 네트워크를 균형잡는다. 가장 잘 특징화된 공동자극 리간드는 B7.1 및 B7.2이고, 이는 전문적 APCs (professional APCs)에 의해 발현되고 그들의 수용체는 CD28 및 CTLA-4이다(Greenwald, R. J., Freeman, G. J., and Sharpe, A. H. (2005). Annu Rev Immunol 23, 515-548; Sharpe, A. H., and Freeman, G. J. (2002) Nat Rev Immunol 2, 1 16- 126). CD28은 나이브(naive) 및 활성 T 세포에 의해 발현되고 최적화된 T 세포 활성화에 중요하다. 반면에, CTLA-4는 T 세포 활성화 후 유도되며 B7.1/B7.2에 결합함으로써 T 세포 활성화를 억제하고, 따라서 CD28-매개 공동자극을 손상시킨다. 또한, CTLA-4는 그 세포질 모티프 (cytoplasmic motif)를 통한 음성신호 (negative signaling)을 변환한다 (Teft, W. A., Kirchhof, M. G., and Madrenas, J. (2006). Annu Rev Immunol 24, 65-97; Teft, W. A., Kirchhof, M. G., and Madrenas, J. (2006). Annu Rev Immunol 24, 65-97). B7.1/B7.2 KO 생쥐는 손상된 적응면역반응 (adaptive immune response)을 보이는 반면 (Borriello, F., Sethna, M. P., Boyd, S. D., Schweitzer, A. N., Tivol, E. A., Jacoby, D., Strom, T. B., Simpson, E. M, Freeman, G. J., and Sharpe, A. H. (1997) Immunity 6, 303-313; Freeman, G. J., Borriello, F., Hodes, R. J., Reiser, H., Hathcock, K. S., Laszlo, G., McKnight, A. J., Kim, J., Du, L., Lombard, D. B., and et al. (1993). Science 262, 907-909), CTLA-4 KO 생쥐는 적절하게 염증을 조절할 수 없고 전신적 자가면역질환을 발달시킨다 (Chambers, C. A., Sullivan, T. J., and Allison, J. P. (1997) Immunity 7, 885-895; Tivol, E. A., Borriello, F., Schweitzer, A. N., Lynch, W. P., Bluestone, J. A., and Sharpe, A. H. (1995) Immunity 3, 541 -547; Waterhouse, P., Penninger, J. M., Timms, E., Wakeham, A., Shahinian, A., Lee, K. P., Thompson, C B., Griesser, H., and Mak, T. W. (1995). Science 270, 985-988).
B7 계 (family) 리간드는 공동자극 B7-H2 (ICOS 리간드) 및 B7-H3 뿐만 아니라 공동억제 B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H4 (B7S 1 또는 B7x), 및 B7-H6을 포함하는 것으로 확장되었다 (Brandt, C. S., Baratin, M., Yi, E. C, Kennedy, J., Gao, Z., Fox, B., Haldeman, B., Ostrander, C. D., Kaifu, T., Chabannon, C, et al. (2009) J Exp Med 206, 1495-1503; Greenwald, R. J., Freeman, G. J., and Sharpe, A. H. (2005) Annu Rev Immunol 23, 515-548).
유도성 공동자극 (ICOS) 분자는 활성화된 T 세포에서 발현되고 B7-H2에 결합한다 (Yoshinaga, S. K Whoriskey, J. S., Khare, S. D., Sarmiento, U., Guo, J., Horan, T., Shih, G., Zhang, M., Coccia, M. A., Kohno, T et al. (1999). Nature 402, 827-832). ICOS는 T 세포 활성화, 분화 및 기능에 중요할 뿐만 아니라, T-도움-세포 유도 B 세포 활성화 (T-helper-cell-induced B cell activation), Ig 종류전환 (Ig class swtiching) 및 배중심 (germinal center; GC) 형성에도 중요하다 (Dong, C, Juedes, A. E., Temann, U. A., Shresta, S., Allison, J. P., Ruddle, N. H., and Flavell, R. A. (2001) Nature 409, 97-101 ; Tafuri, A., Shahinian, A., Bladt, F., Yoshinaga, S. K., Jordana, M., Wakeham, A., Boucher, L. M., -Bouchard, D Chan, V. S., Duncan, G., et al. (2001) Nature 409, 105-109; Yoshinaga, S. K., Whoriskey, J. S., Khare, S. D., Sarmiento, U., Guo, J., Horan, T., Shih, G., Zhang, M., Coccia, M. A., Kohno, T., et al. (1999) Nature 402, 827-832). 반면, PD-1 (Programmed Death 1)는 T 세포 반응을 음성조절한다. PD-1 KO 생쥐는 루푸스-유사 자가면역질환 또는 유전적 바탕에 의존한 자가면역 확장형 심근병증 (autoimmune dilated cardiomyopathy)을 발달시킨다 (Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N., and Honjo, T. ( 1999) Immunity 1 1, 141 -151. Nishimura, H., Okazaki, T., Tanaka, Y., Nakatani, K., Hara, M., Matsumori, A., Sasayama, S., Mizoguchi, A., Hiai, H., Minato, N., and Honjo, T. (2001) Science 291 , 319-322). 자가면역은 대개 PD-Ll 및 PD-L2의 두가지 리간드에 의한 신호 결실에 의해 발생된다. 최근에 CD80이 T 세포에게 억제성 신호를 변환시키는 PD-L1에 대한 2차 수용체로 동정되었다 (Butte, M. J., Keir, M. E., Phamduy, T. B., Sharpe, A. H., and Freeman, G. J. (2007) Immunity 27, 1 1 1 -122). B7-H3 및 B7-H4에 대한 수용체는 아직 알려지지 않았다.
가장 잘 알려진 공동자극 리간드는 B7.1 및 B7.2이고, 이들은 B7 계 리간드 및 수용체와 같은, 다수의 중요한 면역조절자로 구성된 Ig 대계 (Ig superfamily)에 속한다. Ig 대계 구성원은 전문적 항원제시세포 (antigen-presenting cell; APC)에 발현되어 있고, 그들의 수용체는 CD28 및 CTLA-4이다. CD28은 나이브 및 활성 T 세포에 의해 발현되고 최적화된 T 세포 활성에 중요하다. 반면에, CTLA-4는 T 세포 활성화에 이어 유도되고 B7.1 및 B7.2를 억제함으로써 CD28-매개 공동자극을 손상시킴으로써 T 세포 활성화를 억제한다. B7.1 및 B7.2 녹아웃 (knockout; KO) 생쥐는 손상된 적응면역반응을 보이는 반면, CTLA-4 KO 생쥐는 염증을 적절하게 조절할 수 없고 전신적 자가면역질환을 발달시킨다. 시간이 흐르면서, B7 계 리간드는 B7-H2 (ICOS 리간드) 및 B7-H3과 같은 공동자극 및 B7-HI (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H4 (B7S1 or B7x), 및 B7-H6와 같은 공동억제 리간드를 포함시키는 것으로 확장되었다. 따라서, 추가적 CD28 계 수용체가 동정되었다. ICOS는 활성화된 T 세포에서 발현되며 B7-H2와 결합한다. ICOS는 양성 공동조절자이고 T 세포 활성화, 분화 및 기능에 중요하다. 반면에 PD-1 (programmed death 1)는 T 세포 반응을 음성적으로 조절한다. PD-1 KO 생쥐는 루푸스-유사 자가면역질환 또는 확장형 심근병증을 발달시킨다. VISTA (본 발명의 초점인 면역억제분자)와는 반대로, 두가지 억제성 B7 계 리간드인 PD-L1 및 PD-L2는 뚜렷이 구별되는 발현양상이 있다. PD-L2는 DCs 및 대식세포에서 유도적으로 발현되며, 반면에 PD-L1은 조혈세포 (hematopoietic cells) 및 비조혈세포 (nonhematopoietic cell) 종류 모두에서 일반적으로 발현된다. PD-1 수용체의 면역억제 역할과 일관성있게, PD-L1 -/- 및 PD-L2 -/- 생쥐를 이용한 연구는 두 가지 리간드 모두가 T 세포 증식 및 사이토카인 생성의 억제에 있어서 중복적인 역할을 한다는 것을 보였다. PD-L1 결핍은 자가면역 당뇨병의 NOD (non-obese diabetic) 모델 및 다발성 경화증의 생쥐모델 (실험적 자가면역 뇌척수염, experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE)에서 질환의 경과를 촉진시킨다. PD-L1-/- T 세포는 상기 두가지 질환모델에서 전염증적 사이토카인 (proinflammatory cytokines)의 상승된 수준을 생성한다. 게다가, NOD 생쥐에서의 연구는 PD-L1 (즉, 췌장내의)의 조직발현이 유일하게 염증을 국소적으로 조절하는 능력을 야기하였다. PD-L1은 또한 태반 융합세포영양막 (placental syncytiotrophoblasts)에 매우 높게 발현되며, 이것은 동종이계 태아 (allogeneic fetus)에 대한 모계 면역반응을 조절하는데 매우 중요하다.
면역을 조절하는 분자의 계 (family)에 대한 막대한 영향을 보면, 암의 생쥐 모델을 이용한 상당한 노력은 보호적 항암면역 (protective anti-tumor immunity)은 상기 분자의 계 (family)를 표적시킴으로써 유도할 수 있다는 것을 보여왔다. 항-CTLA-4와 관련된 연구는 생쥐모델 및 흑색종 (melanoma)의 임상시험에서 증진된 치료 이익을 증명하였다. B 16-GM-CSF (Gvax)로 백신화된 생쥐는 CTLA-4의 차단항체와 함께 병용되었을 때 B 16 흑색종의 거부반응이 증가되었다.
또한, PD-1 뿐만 아니라 PD-L1에 대한 항체는 넓은 범위의 종양 모델에서 증진된 항암면역 및 숙주 (host)의 생존을 증진시켰다. 마지막으로, 비록 CTLA-4 및 PD-1는 동일한 공동억제 분자의 계에 속하지만, 증거는 그들이 뚜렷이 상이한 T 세포 활성 억제 기작을 사용한다는 것을 보이며, 생쥐 흑색종에서 항-CTLA-4 및 항-PD-l/Ll가 병용될 때 숙주 생존을 증진시키는 능력에서 시너지 (synergy) 효과가 있다.
상기에 기초하여, 또 다른 신규한 B7 타입 계 (family) 멤버 및 리간드, 및 그것의 조절자의 명확한 면역, 특히 T 세포 면역을 조절하는 이러한 계 멤버의 중요한 역할에서 유용할 것이다.
본 발명은 특이적 조절 T 세포 단백질이 그 대응수용체 (countereceptor)에 특이적으로 결합하거나 또는 그 결합하는 것을 차단하는 것에 관한 것이다. PD-L3 또는 VISTA라고 명명되는 이 단백질은 신규하고, 구조적으로 구분되며, Ig-대계 (supefamily) 억제성 리간드이고, 그것의 세포외 도메인 (extracellular domain)은 B7 계 리간드 PD-L1 (B7 family ligand PD-L1)와 상동성을 가진다. 여기에서 이 분자는 상호교환적으로 PD-L3 또는 VISTA 라고 또는 T 세포 활성의 V-도메인 면역글로불린 억제 (V-domain Immunoglobulin Suppressor of T cell Activation; VISTA)라고 언급된다. VISTA는 주로 조혈 구성요소내에 발현되고 골수성 APCs (myeloid APCs) 및 T 세포에 높게 발현된다. VISTA 억제 경로의 치료적 조정은 매우 다양한 암의 치료를 위한 T 세포-매개 면역을 조절하는 신규한 접근을 나타낸다.
특히, 본 발명은 방광암 (bladder cancer), 난소암 (ovarian cancer), 및 흑색종(melanoma)를포함하는 특이적 암을 치료하기 위해 VISTA 또는 PD-L3에 특이적인 항체의 사용에 관한 것이다.
또한, 특히 본 발명은 pf PD-L3 또는 VISTA 단백질, 특히 다합체 VISTA (multimeric VISTA) 및 질환을 치료하기 위해 동일한 것을 발현하는 바이러스성 벡터 (viral vector) (예를 들면, 아데노바이러스성)에 관한 것이고, 여기서 면역억제는 치료적으로 바람직한 것으로, 예를 들면 알러지, 자가면역 및 염증성 질환이다.
아래 기술된 것과 같이, VISTA의 발현은 조혈 구성요소에 제한적인 것으로 나타나고, 이 단백질은 성숙 골수성 세포 (CD1 l bbrighl)에서 높게 발현되며 CD4+ T 세포, Treg 및 CD8+ T 세포에서는 보다 낮은 수준으로 발현된다. 예를 들면 용해성 VISTA-Ig 융합 단백질 (soluble VISTA-Ig fusion protein)과 같은 용해성 VISTA (soluble VISTA) 단백질, 또는 APC의 VISTA 발현은 시험관내에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 억제한다. 또한, 예를 들면 항-VISTA mAb (13F3)과 같은 항-VISTA 항체가 시험관 내에서 VISTA+ APCs에 의해 VISTA-유도 T 세포 반응의 억제를 차단하는 것을 관찰하였다. 또한, 항-VISTA mAb가 생체내에서 EAE를 악화시키고 뇌염유발성 Th17s (encephalitogenic Th17s)의 빈도를 증가시키는 것이 발견되었다. 더욱이, 아래 구체적인 내용에서 기술된 것과 같이, 항-VISTA mAb는 다수의 (4) 생쥐 종양 모델에서 종양 완화 (tumor remission)를 유도한 것을 발견하였다. 이러한 모델에서 골수 유래 억제 세포 (myeloid derived suppressor cells; MDSC)에서의 VISTA 발현은 매우 높고, 이것은 VISTA+ MDSC가 종양 특이적 면역을 억제한다는 것을 의미한다. 여기서 보여진 것과 같이, VISTA는 생쥐 및 인간 (시험관내)의 시험관내 및 생체내에서 T 세포의 면역억제 활성을 나타내고, 자가면역의 발달 및 암에 대한 면역반응을 조절하는 중요한 조절자이다. 특히, 상기 데이터는 하기를 나타낸다:
(1) VISTA는 Ig 대계 (Ig superfamily)의 새로운 멤버이고 PD-L1과 서열 유서성이 떨어진 (distant) Ig-V 도메인(domain)을 포함한다. 여기에서 Ig 융합 단백질로서 생산될 때 또는 인공적 APCs (artificial APCs)에서 과발현되었을 때, VISTA는 생쥐 및 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 억제한다는 것을 공개한다.
(2) 골수성 APCs의 VISTA 발현은 시험관내에서 T 세포에 대해 억제성을 나타낸다.
종양 미세환경 (tumor microenvironment)에서 MDSC의 VISTA 발현은 매우 높다. 이전의 많은 세포표면분자의 표현형 및 기능 분석은 T 세포의 MDSC-매개 억제와 관련되어 있다는 것을 제시한다: CD115, CD124, CD80, PD-Ll 및 PD-L2는 MDSC에 의해 발현되었지만, 양성세포에서의 발현이나 백분율 수준은 면역억제활성이 결여된 무종양 (tumor-free) 생쥐로부터의 MDSC 및 세포들 사이에서 상이성이 발견되지 않는다. 그러므로, VISTA가 MDSC에서 주요한 B7 음성 조절제일 것이라고 예측된다.
(4) 항체-매개 VISTA 차단은 자가종양 (autologous tumor)에 대한 보호적 면역 (protective immunity)을 유도한다.
상기를 기반하여, VISTA는 보호적 항-종양 면역의 발달을 개입하는, MDSC에서 우세한 음성면역조절 분자인 것으로 나타난다. 그러므로, 항-VISTA 항체를 사용하여 이 분자의 활성을 차단하는 것은 인간 및 다른 포유류에서 보호적 항-종양면역의 발달을 허용할 것이다.
그러므로, 본 발명은 면역 조절제로서 VISTA의 활성을 결합 또는 조율 (작용 또는 길항)하고, 상이한 암, 예를 들면 방광암, 난소암 및 림프종 (lymphoma), 및 자가면역질환, 알러지, 감염 및 염증성 질환 치료, 예를 들면 다발성 경화증 및 관절염을 위한, VISTA 세포외도메인 또는 그것의 단편의 다수 카피 (copy) 및 VISTA 결합제 (binding agent), 예를 들면 작은 분자 및 항체 또는 그것의 단편을 포함한, 용해성 VISTA 단백질, 예를 들면 융합 단백질, 다합체 VISTA 단백질을 사용하는 방법과 관련이 있다.
아래 구체적인 설명에서 기술되어 있는 것과 같이, 이 단백질은 세포외 Ig-V 도메인이 알려진 두가지 B7계 리간드와 상동성을 가지는, 신규한 억제성 리간드이다.
PD-L1 및 PD-L2 (Programmed Death Ligand 1 및 2)는 유일한 서열 특징을 나타내고 시험관내 및 생체내에서 APCs 및 T 세포의 부분집단에서 독특한 발현양상을 나타낸다 (이것은 다른 B7계 리간드로부터 PD-L3 또는 VISTA를 구별한다). 이 단백질은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 분화에 기능적 영향을 나타낸다 (CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 뿐만 아니라 사이토카인 생성을 억제). T 세포에서 그것의 발현 양상 및 억제적 영향을 기반으로 하여, T 세포 및 골수 유래 APCs 사이의 연계결합 (cognate interaction) 동안에 PD-L3 또는 VISTA는 T 세포 반응을 음성적으로 조절하는 조절 리간드 (regulatory ligand)로서 명백히 기능한다.
PD-L3 또는 VISTA가 B7계 리간드의 멤버인 것으로 보여지고, 다른 B7계 리간드와는 다르게, 이 분자는 Ig-C 도메인 없이 Ig-V 도메인만을 포함하였며 계통분류학적으로 B7계 수용체 PD- 1 (Programmed Death-1)와 보다 밀접하였다. 그에 대해, PD-L3 또는 VISTA, 및 그들에게 특이적인 작용제 (agonist) 또는 길항제 (antagonist)를 T 세포 활성 및 분화를 조절하기 위해, 보다 넓게는 면역반응을 조절하는 조절 네트워크 (regulatory network)를 조정하기 위해 사용할 수 있다. 특히, PD-L3 또는 VISTA 단백질 및 PD-L3 또는 VISTA 작용제 또는 길항제, 바람직하게는 PD-L3 또는 VISTA에 특이적인 항체가 자가면역, 염증반응 및 질병, 알러지, 암, 감염성 질병 및 이식 (transplantation)을 조절하는데 유용하다.
그러므로, 본 발명은 부분적으로 조성물, 예를 들면 약학적으로 이용가능, 진단 또는 면역조절 용도를 위하여 분리된 용해성 PD-L3 또는 VISTA 단백질, 또는 용해성 VISTA-Ig 융합 단백질이나 또는 다합체 VISTA 단백질과 같은 융합 단백질을 포함하는 조성물과 관련이 있고, 여기에서 바람직하게는 서열번호 2, 4 또는 5에서 개시된 인간 또는 생쥐의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 이종상동체 (ortholog)와 최소 70-90% 동일한 아미노산 서열, 또는 생체내에서 VISTA를 조절하는 서열 번호: 1 또는 3에 특이적으로 혼성화되는 유전자에 의해 암호화된 그것의 단편 및 약학적으로 이용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)를 포함한다. 어떤 실시예에서는, 용해성 또는 다합체 VISTA 단백질이 직접적으로 또는 간접적으로 이종단백질(heterologous, non-VISTA)와 연결될 수 있고 또는 바이러스성 벡터 또는 예를 들면 형질도입된, T 세포와 같은 면역세포를 포함하는 세포에 의해 발현될 수도 있다.
또한, 본 발명은 서열 번호: 2, 4 또는 5에서 개시된, 인간 또는 생쥐의 VISTA 아미노산 서열과 최소 70-90% 동일한 VISTA 단백질 또는 단편 또는 그것의 이종상동체를 암호화하는, 분리된 핵산을 포함한 발현벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하고, 상기 벡터는 선택적으로 Ig 폴리펩티드, 예를 들면 Fc 부위 또는 수용체 분자와 같은 다른 단백질을 암호화하는 서열과 융합된다.
또한, 본 발명은 특이적으로 분리된 결합제 (binding agent), 바람직하게는 서열 번호: 2, 4 또는 5에 개시된 아미노산 서열 또는 변이, 단편 또는 그것의 이종상동체를 포함한 PD-L3 또는 VISTA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기 결합제는 시험관내 또는 생체내에서 VISTA 활성을 조절 (작용 또는 길항)한다. 대부분의 바람직한 실시예에서, 상기 결합제는 작용적 (agonistic) 또는 길항적 (antagonistic) 항체이다.
본 발명은 나아가 면역세포의 반응을 조절하기 위해 1차 신호의 존재하에, 시험관내 또는 생체내에서, 상기 면역세포를 VISTA 단백질 또는 그것에 특이적으로 결합하는 결합제와 접촉시킴으로써 면역세포반응을 조절하기 위한 방법을 제공한다. (rVISTA EH는 그것의 조절자의 결합은 신호를 면역세포로 전달하고, 면역반응을 조절한다. PD-L3 또는 VISTA 단백질은 골수성 수지상세포 (dendritic cells; DCs) 및 대식세포 (macropghages)를 포함하는 골수성 항원제시세포 (myeloid antigen presenting cells)에 높은 수준으로 발현되어 있으며, CD4+ 및 CD8+ T 세포에는 보다 낮은 밀도로 발현되어 있다. 면역활성화 후, PD-L3 및 VISTA 발현은 골수성 APCs에서 상향조절되지만 CD4+ T 세포에서는 하향조절된다) 그러므로, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 핵산 및 폴리펩티드, 및 그것의 작용제 (agonist) 또는 길항제(antagonist)는 예를 들면 면역반응을 조절하는데 유용하다.
본 발명의 또 다른 측면은 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는, 분리된 핵산단편 분자, 바람직하게는 암호화된 용해성 융합 단백질 및 다합체 VISTA 단백질 뿐만 아니라 PD-L3 또는 VISTA-암호화 핵산의 탐지를 위한 프라이머 (primers) 또는 혼성화 탐침 (hybridization probes)와 같은 적절한 핵산 단편을 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자는 서열 번호: 1 또는 3의 PD-L3 또는 VISTA, 또는 그것의 상보서열을 암호화하는 뉴클레오티드 (nucleotide) 서열과 최소 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일하다.
또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자는 서열 번호: 2, 4 또는 5의 아미노산 서열과 특이적 퍼센트 동등성 (specific percent identity)을 지닌 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자는 서열 번호: 2, 4 또는 5의 아미노산 서열 전장(entire length)과 또는 그것의 세포외 도메인 (extracellular domain)과 최소 약 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 분리된 핵산 분자는 인간 또는 생쥐의 VISTA 또는 그 내부의 보존부위(conserved region) 또는 기능적 도메인(functional domain)의 아미노산 서열을 암호화한다. 또 다른 바람직한 실시예에서는, 핵산 분자는 서열 번호: 2, 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 핵산 분자의 길이는 최소 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 또 다른 바람직한 실시예에서는, 핵산 분자의 길이가 최소 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이고, 상기 핵산은 PD-L3 또는 VISTA 활성을 갖거나 또는 PD-L3 또는 VISTA 기능 (여기에서 기술되는) 을 조절하는 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 핵산 분자, 바람직하게는 PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자를 특징으로 하고, 이것은 특이적으로 비-PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자에 관하여 PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자를 탐지한다. 예를 들면, 어떤 실시예에서, 상기 핵산 분자의 길이는 최소 약 880, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이며, 상기 핵산분자는 특정 조건 (stringent condition)하에서 서열 번호: 2, 4 또는 5에서 보여진 폴리펩티드 또는 그것의 상보서열을 암호화하는 핵산 분자에 혼성화된다. 또 다른 실시예에서, 상기 핵산 분자의 길이는 최소 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이고, 상기 핵산 분자는 특정 조건 (stringent condition)하에서 PD-L3 또는 VISTA, 예를 들면 그 길이가 최소 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드인 것의 단편을 암호화하는 핵산 분자와 혼성화된다. 상기 핵산은 서열 번호: 2, 4 또는 5, 또는 그것의 상보서열의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 서열 번호: 1 및 3에서 공개된 핵산 서열의 15 개 (즉, 연속된 15 개)이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 특정 조건에서 서열 번호: 1, 또는 3에서 보여진 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 상보서열을 포함한 핵산 분자에 혼성화된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는 서열 번호: 2, 4 또는 5의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드의 자연적으로 발생한 대립유전자 변이 (allele variant)를 암호화하고, 여기에서 상기 핵산 분자는 특정 조건에서 서열 번호: 1, 3 또는 그것의 상보서열을 포함한 핵산 분자의 상보서열에 혼성화된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자에 대한 안티센스(antisense), 예를 들면 서열 번호: 1 또는 3에서 보여지는 PD-L3 또는 VISTA핵산 분자의 암호서열(coding strand)에 안티센스인, 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자를 포함한 벡터를 제공한다. 어떤 실시예에서, 상기 벡터는 재조합 발현벡터(recombinant expression vector)이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함한 숙주세포를 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위하여, 적절한 배지에 숙주세포, 예를 들면 비인간 포유류 세포 (non-human mammalian cell)와 같은, 재조합 발현벡터를 포함하는 본 발명의 포유류 숙주세포를 배양 (culture)함으로써 상기 폴리펩티드, 바람직하게는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 분리된 또는 재조합 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 (예를 들면, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 그것의 단편 (fragment)이나 부분 (portion))를 특징으로 한다. 하나의 실시예에서, 분리된 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질은 하나 또는 그 이상의 하기 도메인을 포함한다: 신호펩티드 도메인 (signal peptide domain), IgV 도메인, 세포외 도메인, 막관통 도메인 (transmembrane domain), 세포질 도메인 (cytoplasmic domain).
바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 하기의 하나 또는 그 이상의 도메인을 포함한다: 신호펩티드 도메인, IgV 도메인, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인. 그리고 서열 번호: 2 또는 4 또는 5의 아미노산 서열과 최소 약 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다. 또 다른 바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 하기의 하나 또는 그 이상의 도메인을 포함한다: 신호펩티드 도메인, IgV 도메인, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인. 그리고 VISTA 또는 PD-L3 활성 (여기서 기술된)을 가진다.
또 다른 실시예에서, PD-L3 폴리펩티드는 하기의 하나 또는 그 이상의 도메인을 포함한다: 신호펩티드 도메인, IgV 도메인, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인. 그리고 혼성화 특정 조건 하에서, 서열 번호: 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자의 상보서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자에 의해 암호화된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 서열 번호: 2 또는 4 또는 5의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 단편 (fragment) 또는 부분 (portion)을 특징으로 하고, 여기에서 상기 단편은 서열 번호: 2 또는 4의 아미노산 서열의 15 개의 아미노산 (즉, 연속적 아미노산)을 포함한다. 또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 서열 번호 2, 4 또는 5의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 구성된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 서열 번호: 1 또는 3, 또는 그것의 상보서열의 뉴클레오티드 서열과 최소 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동등한 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자에 의해 암호화된 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 특징으로 한다. 나아가, 본 발명은 혼성화 특정 조건에서, 서열 번호: 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 상보서열과 혼성화되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산 분자에 의해 암호화되는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 특징으로 한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 부분, 예를 들면 그것의 생물학적으로 활성부분은 조작되어 (operatively) 비-PD-L3 (non-PD-L3) 또는 VISTA 폴리펩티드 (예를 들면 이종기원 (heterologous)의 아미노산 서열)과 연결되어 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 나아가, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들면 단일클론항체 (monoclonal antibody) 또는 다클론항체 (polyclonal antibody)를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 바람직한 기능적 특성, 예를 들면 TCR 활성화에 있어서 본 발명 단백질의 억제적 효과, 항 CD-3에 대한 CD4+ T 세포 증식반응의 억제적 효과, 연계 CD4+ T 세포 (cognate CD4+ T 세포)의 항원 특이적 증식반응의 억제, IL-2 및 감마 인터페론 (gamma interferon)과 같은 특이적 사이토카인 (cytokine)의 발현에 있어서 PD-L3 또는 VISTA의 억제적 효과 등과 같이, 면역에 있어서 PD-L3 또는 VISTA의 특이적 효과를 조절하는 특성을 기반으로 상기 단백질 또는 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질에 대해 생산되는 단일클론항체의 집단으로부터 바람직한 기능적 특성을 가지는 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 선별하는 방법에 관한 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 치료적 용도로서, 항 PD-L3 또는 VISTA 항체는 시험관내 용해성 PD-L3 또는 VISTA- 단백질의 존재하에서, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질의 존재하에서, 면역 기능과 관련된 PD-L3 또는 VISTA에 있어서 PD-L3 또는 VISTA-Ig의 억제적 효과를 증진시키는 것이 선별될 것이다. 면역에 있어서, 다소 뜻밖에도 (하기에 보여짐) 상기 항체들은 생체내에서 시험관 내의 그들의 효과로부터 기대되는 것, 즉 상기 항- 또는 VISTA 단일클론항체는 면역억제성을 가지는 것과 반대로 작용하기 때문에, 이것은 바람직하다.
또한, 상기 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 (또는 그것의 생물학적 활성 부분) 또는 상기 PD-L3 또는 VISTA 분자의 조절자 (modulator), 즉 상기 방법을 사용하여 선별된 것과 같은 항체는 선택적으로 약학적 조성물에 포함될 수 있으며, 이는 약학적으로 이용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carreiers)을 포함한다.
또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 단백질은 면역세포 활성화를 감소시키기거나 또는 억제시키기 위한 억제성 신호로서 사용된다. 이러한 실시예에서, 상기 억제성 신호는 면역세포의 억제성 수용체 (inhibitory receptor) (예를 들면, CTLA-4 또는 PD-1)과 결합함으로써, 활성화 수용체(activating receptor) (예를 들면, TCR, CD3, BCR 또는 Fc 폴리펩티드를 통한)와 결합한 1차 신호에 대해 길항작용을 한다. 억제는 예를 들면 2차 전달자 형성의 억제; 증식의 억제; 면역세포의 작용기 (effector function)의 억제, 예를 들면 감소된 대식세포 작용 (phagocytosis), 감소된 항체 생산, 감소된 세포성 세포독성 (cellular cytotoxicity), 매개체 (mediator) (예를 들면, 사이토카인 (IL-2) 및/또는 알러지 반응의 매개체)를 생산하는 면역세포의 장애); 또는 아너지 상태 (anergy)의 발달을 포함한다.
어떤 실시예에서, 1차 신호는 TCR에 결합하고 1차 자극신호를 개시하는 리간드 (예를 들면, CD3 또는 항-CD3)이다. 상기 TCR 리간드 (ligand)는 상업적으로 쉽게 구할 수 있고 특이적 예로는 American Type Culture Collection에서 수득된 하이브리도마 세포 (hybridoma cell)로부터 준비된 항-CD3 항체 OK.T3 및 항-CD3 단일클론항체 G1-4를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 1차 신호는 단백질 키나아제 C (protein kinase C) 활성제, 예를 들면 포르볼에스테르 (phorbol ester) (예를 들면, 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (phorbol myristate acetate)), 및 칼슘 아이오노포르 (calcium ionophore) (예를 들면, 세포질의 칼슘 농도를 증가시키는 아이노마이신 (ionomycin)), 또는 그와 유사한 것을 포함하는 다른 기작을 통해서 T 세포에 전달된다. 상기 제제 (agent)의 사용은 TCR CD3 복합체를 우회하지만, T 세포에 자극 신호를 전달한다. 1차 신호로 작용하는 다른 제제는 자연적 (natural) 및 합성 리간드를 포함할 수 있다. 자연적 리간드는 펩티드가 제시되거나 되지 않은 MHC를 포함할 수 있다. 다른 리간드는 펩티드, 폴리펩티드, 성장인자, 사이토카인, 케모카인 (chemokine), 글리코펩티드 (glycopeptide), 용해성 수용체, 스테로이드, 호르몬, PHA와 같은 미토겐 (mitogen), 또는 다른 초항원 (superantigen), 펩티드-MHC 4분자체 (tetramer) (Altman, et al. (1996) Science 274(5284):94-6) 및 용해성 MHC 2분자체 (dimer) (Dal Porto, et al (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90: 6671-5)를 포함하지만, 이로 제한하지 않는다.
본 발명의 방법에 따라 활성화된 면역세포는 그 후에 생체외에서 (ex vivo) 팽창될 수 있고 다양한 질환의 치료 및 예방에서 사용될 수 있다: 예를 들면 인간 T 세포는 시험관 내에서 클론되고 팽창하여 조절 활성을 유지될 수 있다 (Groux, et al. (1997) Nature 389(6652):737-42). 팽창 이전에, T 세포의 근원 (source)은 인간, 개, 고양이, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 또는 그들의 유전자변종 개체로부터 수득되고, T 세포는 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선조직, 감염부위로부터 조직, 비장조직, 종양 또는 T 세포주 (T cell line)를 포함한, 다양한 근원에서 얻을 수 있다. T 세포는 당업자에게 잘 알려진 모든 기술, 예를 들면 피콜™ 분리 (ficoll™ seperation)를 사용하여 개체로부터 수득된 혈액으로부터 얻을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 시료에서, 상기 생물학적 시료를 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, 단백질 또는 폴리펩티드를 탐지할 수 있는 제제 (agent)와 접촉시킴으로써 PD-L3 또는 VISTA 핵산 분자, 단백질 또는 폴리펩티드의 존재를 탐지하기 위한 방법을 제공하여, 생물학적 시료에서 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, 단백질 또는 폴리펩티드의 존재를 탐지할 수 있다. 이러한 PD-L3 또는 VISTA 발현은 염증성 부위와 같은 특정 질환 부위를 탐지하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 시료에서, 상기 생물학적 시료를 PD-L3 또는 VISTA 활성의 지표 (indicator)를 탐지할 수 있는 제제와 접촉시킴으로써 PD-L3 또는 VISTA 활성의 존재를 탐지하기 위한 방법을 제공하여, 생물학적 시료에서 PD-L3 또는 VISTA 활성의 존재를 탐지할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하기 위한 방법을 제공하고, 이것은 PD-L3 또는 VISTA를 발현할 수 있는 세포를 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절할 수 있는 제제, 바람직하게는 항-PD-L3 또는 VISTA 항체와 접촉시키는 것을 포함하여, 세포 내의 PD-L3 또는 VISTA 활성이 조절될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 제제는 PD-L3 또는 VISTA 활성을 억제한다. 또 다른 실시예에서, 상기 제제는 PD-L3 또는 VISTA 활성을 자극시킨다. 나아가 다른 실시예에서는, 상기 제제가 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 및 그것의 자연적 결합 파트너 (natural binding partner) 사이의 결합을 증진시키거나 또는 방해한다. 하나의 실시예에서, 상기 제제는 특이적으로 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에 결합하는 항체이다. 또 다른 항체에서, 상기 제제는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에 결합하는 펩티드, 펩티드유사체 (peptidomimetic) 또는 다른 작은 분자이다.
또 다른 실시예에서, 상기 제제는 PD-L3 또는 VISTA 유전자의 전사, PD-L3 또는 VISTA mRNA의 번역, 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리페티드의 번역후 변형 (post-translational modification)을 조절함으로써 PD-L3 또는 VISTA의 발현을 조절한다. 또 다른 실시예에서, 상기 제제는 PD-L3 또는 VISTA mRNA 또는 PD-L3 또는 VISTA 유전자의 암호선 (coding strand)에 대해 안티센스인 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산분자이다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 방법은 비정상적이거나 (aberrant), 불충분하거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산 발현 또는 활성에 의해 특징화되는 장애 (disorder) 또는 질병 (condition)을 갖는 개체를 치료하기 위해, PD-L3 또는 VISTA 조절제 (modulator)를 상기 개체에 투여함으로써 사용된다. 어떤 바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 조절제는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 바람직하게는 하기에 기술되는 용해성 융합 단백질 또는 다합체 VISTA 단백질 또는 항-VISTA 항체이다. 또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 조절제는 예를 들면 아데노바이러스 벡터 (adenoviral vector) 내의 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 면역반응을 조절하는 추가적 제제 (additional agent)로 상기 개체를 치료하는 것을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 항원 및 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는 (증진시키거나 또는 억제시키는) 제제를 포함하는 백신 (vaccine)을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 백신은 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 억제한다.
또한, 본 발명은 하기 사항 하나 이상에 의해 특징화되는 유전적 변형 (alteration)의 존재 또는 부재를 동정하기 위한 진단 검사를 제공한다: (i) PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 비정상적인 변형 또는 돌연변이; (ii) 상기 유전자의 잘못된 조절 (misregulation); 및 (iii) PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 비정상적인 번역후 변형, 여기에서 상기 유전자의 야생형은 PD-L3 또는 VISTA 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 활성을 갖는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 포함하는 지표조성물 (indicator composition)을 제공하고, 검사 화합물을 상기 지표조성물에 접촉시키며, 및 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위해 지표화합물에서의 PD-L3 또는 VISTA 활성에 있어서 상기 검사 화합물의 효과를 결정함으로써, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에 결합하거나 또는 그 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 방법을 제공한다.
어떤 측면에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA와 면역세포에 있는 그것의 자연적 결합 파트너의 상호결합을 조절하기 위한 방법을 특징으로 하고, 이는 하기 형태의 군으로부터 선택된 제제와 PD-L3 또는 VISTA를 발현하는 항원제시세포를 접촉시키는 것을 포함한다: PD-L3 또는 VISTA, 또는 PD-L3 또는 VISTA 및 그의 자연적 결합 파트너와의 상호결합을 조절하는 제제의 형태로, 면역세포의 PD-L3 또는 VISTA와 자연적 결합 파트너의 상호결합이 조절될 수 있다. 바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호결합을 조절하는 제제는 PD-L3 또는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체이다. 하나의 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호결합은 상향조절된다. 또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호결합은 하향조절된다. 어떤 실시예에서는, 상기 방법은 면역세포 또는 항원제시세포를 면역반응을 조절하는 추가적 제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
어떤 실시예에서, 접촉시키는 상기 단계는 시험관내에서 수행된다. 어떤 실시예에서, 접촉시키는 상기 단계는 생체내에서 수행된다. 어떤 실시예에서, 상기 면역세포는 하기의 것으로 구성된 군으로부터 선택된다: T 세포, 단핵구 (monocyte), 대식세포 (macrophage), 수지상 세포 (dendritic cell), 및 골수성 세포 (myeloid cell).
또 다른 실시예에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA의 발현 또는 활성을 증가시키거나 억제하는 것을 포함하는 면역세포에서의 활성화를 억제하거나 또는 증가시키기 위한 방법에 관한 것이며, 면역세포의 활성을 억제되거나 또는 증가될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항원 및 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 억제하는 제제를 포함하는 백신에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항원 및 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 촉진하는 제제를 포함하는 백신에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역반응의 상향조절 (upregulation)로부터 이득이 될 수 있는 질병을 갖는 개체를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, PD-L3 또는 VISTA 및 개체의 면역세포에 있는 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 억제하는 제제를 투여하는 것을 포함하고, 이것으로 면역반응의 상향조절로부터 이득이 될 수 있는 질병이 치료될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 제제는 PD-L3 또는 VISTA에 결합하는 차단항체 (blocking antibody) 또는 작은 분자를 포함하고 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 억제한다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 면역반응을 상향조절시키는 2차 제제 (second agent)를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 면역반응의 하향조절로부터 이득이 될 수 있는 질병을 갖는 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로, PD-L3 또는 VISTA 및 개체의 세포에 있는 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 자극시키는 제제를 투여하는 것을 포함하고, 이것으로 면역반응의 하향조절로부터 이득이 될 수 있는 질병이 치료될 수 있다.
예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 단백질 또는 결합제로 치료되는 질환은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 종양, 병원균 감염 (pathogenic infection), 염증성 면역반응 또는 질병, 바람직하게는 덜 명확한 염증성 질병, 또는 면역억제성 질환 (immunosuppressive disease). 특이적 예시는 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 갑상선염 (thyroiditis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 당뇨병 타입 II 및 I, 및 전이성 암을 포함하는 진행성 및 초기의 두가지 형태의 암으로 예를 들면 방광암, 난소암, 흑색종, 폐암, 및 다른 암을 포함하고 여기에서 VISTA는 효과적인 항-종양 반응을 억제한다. 어떤 경우에, 각 개인은 항-VISTA 항체 또는 VISTA 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 발현하는 세포나 또는 바이러스 벡터가 투여될 수 있다.
어떤 실시예에서, 제제는 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 자극시키는 항체 또는 작은 분자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 방법은 PD-L!, PD-L2 또는 CTLA-4 융합 단백질 또는 그것에 특이적인 항체 와같은, 면역반응을 하향조절하는 2차 제제를 개체에 투여하는 것을 포함한다.
예를 들면, 본 발명에 따른 PD-L3 또는 VISTA 단백질, 결합제 또는 PD-L3 또는 VISTA 작용제 또는 길항제를 사용하여 치료될 수 있는 예시적 질병은 이식 (transplant), 알러지 (allergy), 감염성 질환 (infectious disease), 암 (cancer), 및 염증성 또는 자가면역 장애 (inflammatory or autoimmune disorders), 예를 들면, 염증성 면역 장애 (inflammatory immune disorder)를 포함한다. 상기의 특이적 예시는 종류 1 당뇨병 (type 1 diabetes), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 건성성 관절염 (psoriatic arthritis), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosis), 류마티즘성 질환 (rheumatic diseases), 알러지 장애 (allergic disorders), 천식 (asthma), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 피부 장애 (skin disorders), 크론 질환 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)과 같은 위장 장애 (gastrointestinal disorders), 이식거부 (transplant rejection), 연쇄구균감염 후 및 자가면역 신장부전증 (poststreptococcal and autoimmune renal failure), 패혈성 쇼크 (septic shock), 전신성 염증반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome; SIRS), 성인성 호흡곤란 증후군 (adult respiratory distress syndrome; ARDS) 및 동물성중독증 (envenomation); 자가염증성 질환 (autoinflammatory diseases) 뿐만 아니라 골관절염 (osteoarthritis), 크리스탈 관절염 (crystal arthritis) 및 피막염 (capsulitis) 및 다른 관절증 (arthropathies)을 포함한 퇴행성 뼈 및 관절 질환 (degenerative bone and joint diseases)를 포함한다. 나아가, 상기 방법 및 조성물은 건염 (tendonitis), 인대 및 외상 관절 부상 (ligamentitis and traumatic joint injury)을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA의 활성을 조절하는 화합물을 스크리닝하기 위한 세포-기반 검사 (cell-based assay)에 관한 것으로, 이는 PD-L3 또는 VISTA 표적 분자를 발현하는 세포를 검사 화합물과 접촉시키는 단계 및 PD-L3 또는 VISTA 표적 분자의 활성을 조절하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA와 표적 분자의 결합을 조절하는 화합물을 스크리닝하기 위한 세포-유리 검사 (cell-free assay)에 관한 것으로, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부분을 검사 화합물과 접촉시키는 단계 및 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부분과 결합하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 화합물, 예를 들면 1차 및 2 차 항원 농도에서 T 세포 활성화 및 사이토카인 생성에 대한 PD-L3 또는 VISTA의 효과를 조절하는 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 동정하는 방법에 관한 것으로, 이는 1차 항원농도에서 PD-L3 또는 VISTA 표적분자를 발현하는 T 세포와 검사 화합물을 접촉시키는 단계, 1차 항원농도에서 T 세포 증식 또는 사이토카인 생성을 조절하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계, 이는 2차 항원농도에서 PD-L3 또는 VISTA 표적분자를 발현하는 T 세포와 검사 화합물을 접촉시키는 단계, 2차 항원농도에서 T 세포 증식 또는 사이토카인 생성을 조절하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하며, 이로써 1차 및 2차 항원 농도에서 T 세포 활성화 또는 사이토카인 생성을 조절하는 화합물을 동정할 수 있다.
다른 특이적 실시예에서, 시험관내 또는 생체내에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 분화, 증식 및/또는 사이토카인 생성에서의 PD-L3 또는 VISTA 효과를 억제시키거나 또는 촉진시키는 것을 선택되기 위해 항-PD-L3 또는 VISTA 항체 및 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 집단이 스크리닝 될 수 있다.
바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 단백질, 핵산, 및 PD-L3 또는 VISTA에 특이적인 리간드, 바람직하게는 PD-L3 또는 VISTA 기능에 바람직한 효과를 가지는 항체 각각은 암, 자가면역 질환, 알러지, 염증성 장애 또는 감염 및 보다 구체적으로는 중증 복합형 면역 부전증 (severe combined immunodeficiency), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 전신적 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 종류 I 당뇨병 (type I diabetes mellitus), 림프증식성 증후군 (lymphoproliferative syndrome), 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 알러지, 천식 (asthma), 대숙주성이식편병 (graft-versus-host disease), 및 이식거부 (transplant rejection); 박테리아 및 바이러스과 같은 감염성 병원균에 대한 면역반응; 및 림프종 (lymphomas) 및 백혈병 (leukemia)과 같은 면역체계 암과 같은 면역체계 장애와 같은 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
도 1. 서열 분석. a. 생쥐 PD-L3 또는 VISTA의 아미노선 서열 전장 (full length). b. 생쥐 PD-L3 또는 VISTA 및 B7-H1 (PD-L1 ), B7-DC (PD-L2), B7-H3, 및 B7-H4를포함하는 선별된 B7계 리간드 사이의 세포외 Ig 도메인의 아미노산 서열 배열 (alignment). c. PD-L3 또는 VISTA Ig 도메인을 PD-1, CTLA-4, CD28, BTLA, 및 ICOS를 포함하는 B7계 수용체의 배열. Ig-v 도메인, "...."; Ig-c 도메인, " ". 배열은 MUSCLE 알고리즘 (Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation)를 사용하여 수행되었다. d. PD-L3 또는 VISTA 및 다른 B7계 리간드 및 수용체 사이의 Ig-V 도메인의 서열 유사성 (sequence identity) (%)은 ClustalW2 프로그램을 사용하여 산출되었다. e. 인간 및 생쥐의 PD-L3 또는 VISTA 사이의 서열 상동성 (sequence homology). 동일한 잔기는 검은색으로 음영되었다. 매우 보존된 및 반보존된 잔기는 어두운 색 및 밝은 회색으로 각각 음영되었다.
도 2. 생쥐 PD-L3 또는 VISTA와 다른 면역글로불린 대계(immunoglobulin (Ig) superfamily) 멤버의 계통분류학적 분석. 생쥐 PD-L3 또는 VISTA, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, PD-1. B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-1, B7-2, BTNL2, BTN3A3, BTN2A2, 및 BTNlAl을 포함하는 다른 Ig 대계 멤버의 서열 전장은 PhyML 알고리즘 (Phylogenetic Maximum Likelihood)을 사용하여 분석되었다. 가지 거리 (branch distance)는 나무 가지 접합부위 (tree branch joints)에 보여진다.
도 3. PD-L3 또는 VISTA의 조직 발현 및 조혈세포 (hematopoietic cell) 발현양상. a. 쥐 조직으로부터의 PD-L3 또는 VISTA 전장의 RT-PCR. 레인 (lane): (1) 근육 (2) 심장 (3) 눈 (4) 흉선 (5) 비장 (6) 소장 (7) 신장 (8) 간 (9) 뇌 (10) 포유류 분비선 (mammalian gland) (11) 폐 (12) 난소 (13) 골수. b. 정제된 조혈세포 종류로부터의 PD-L3 또는 VISTA 전장의 RT-PCR. 레인: (1) 복막 대식세포 (peritoneal macrophages) (2) 비장 CD11b+ 단핵구 (splenic CD1lb+ monocytes) (3) 비장 CD11c+ DCs (splenic CD1lc+ DCs) (4) 비장 CD4+ T 세포 (splenic CD4+ T cells) (5) 비장 CD8+ T 세포 (splenic CD8+ T cells) (6) 비장 B 세포 (splenic B cells). c-e. 흉선 및 비장으로부터의 비장의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 (c), CD11b+ 단핵구 (d), 비장 및 복강 (peritoneal cavity)로부터의 CD11c+ DC 부분집단 (e)에서의 PD-L3 또는 VISTA 발현의 세포유동분석 (flow cytometry analysis). f. 비장의 B 세포, NK 세포 및 과립성 백혈구 (granulocyte) 또한 분석되었다. g. 장막간의 림프절 (mesenteric LN), 말초 림프절 (peripheral LN), 비장, 혈액 및 복강으로부터의 조혈세포에서의 PD-L3 또는 VISTA의 상이한 발현. 최소 3번의 독립적 실험으로부터의 대표 데이터가 보여진다
도 4. GNF (Genomics Institute of Novartis Research Foundation) 유전자 어레이 데이터베이스 (gene array database) 뿐만 아니라 NCBI GEO (gene expression omnibus) 데이터베이스로부터 PD-L3 또는 VISTA의 유전자 어레이 데이터.
도 5. PD-L3 또는 VISTA 햄스터 단일클론항제의 특이성. PD-L1 또는 PD-L3 또는 VISTA를 과발현하는 생쥐 EL4 세포주를 하이브리도마 배양으로부터의 상층액을 사용하여 염색하고 세포유동분석에 의해 분석한다. 두 개의 대표 양성 클론이 보여진다.
도 6. 시험관내에서 배양된 비장세포에서의 PD-L3 또는 VISTA 발현을 다른 B7계 리간드와 비교. CD4+ T 세포, CD11bhi 단핵구 및 CD11c+ DCs를 포함한 조혈세포 종류에서의 PD-L3 또는 VISTA 및 다른 B7계 리간드 (즉, PD-L1, PD-L2, B7-H3, 및 B7-H4)의 발현을 비교하였다. 세포는 신선하게 분리되었거나, 또는 활성상태로 또는 비활성상태로 시험관내에서 24시간 동안 배양되었다. CD4+ T 세포는 플레이트-결합 □CD3 (5μg/ml)로 활성화되었고, CD11bhi 단핵구 및 CD11c+ DCs는 IFN알파 (20 ng/ml) 및 LPS (200 ng/mt)로 활성화되었다.
3번의 독립적인 실험으로부터 대표결과가 보여진다.
도 7. 면역화되는 (immunization) 동안에 PD-L3 또는 VISTA 및 다른 B7계 리간드의 생체내 발현양상. DO11.10 TCR 형질도입 생쥐 (transgenic mice)를 측면에서 완전 프로이트항원보강제 (complete Freund's adjuvant; CFA)에 유화된 닭 오브알부민 (ovalbumin; OVA)으로 면역화시켰다. 배수 (draining) 및 비-배수 (non-draining) 림프절 세포는 면역화된 24시간 후에 수득되었고, PD-L3 또는 VISTA, PD-L1 또는 PD-L2의 발현에 대해 세포유동분석에 의해 분석되었다. 최소 4번의 독립적인 실험으로부터 얻은 대표적 결과가 보여진다. a. 배수 림프절 (draining lymph node)에서, PD-L3 또는 VISTA를 높은 수준으로 발현하는 CD11b+ 세포 집단을 CFA/OVA로 면역화한 24시간 후에 유도되었으나, CFA 단독으로 처리된 집단에서는 유도되지 않았다. 이러한 세포들은 F4/80+ 대식세포 및 CD11c+ 수지상 세포의 혼합된 표현형을 가진다. b. CDllbhi 단핵구, CDllc+ DCs 및 CD4+ T 세포의, PD-L3 또는 VISTA PD-L1 및 PD-L2의 발현은 면역화된 24시간 후에 분석되었다.
도 8. 면역화에 대한 반응에서, 활성화된 CD4+ T 세포에서의 PD-L3 또는 VISTA의 결실. DO11.10 생쥐를 완전 프로이트항원보강제 (complete Freund's adjuvant; CFA)에 유화된 닭 오브알부민 (ovalbumin; OVA)으로 측면에서 면역화시켰다. 배수 및 비-배수 림프절 세포는 면역화된 48시간 후에 수득되었고, PD-L3 또는 VISTA의 발현에 대해 세포유동분석에 의해 분석되었다. 최소 2번의 독립적인 실험으로부터 얻은 대표적 결과가 보여진다.
도 9. 고정된 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 억제한다. a. CFSE 표지된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 플레이트-결합 □CD3에 의해 공동 흡수된 PD-L3 또는 VISTA-Ig (co-absorbed PD-L3 OR VISTA-Ig)와 함께 또는 없이 자극된다. CFSE-낮은 세포의 백분율 (percentage)은 b에서 정량화되고 보여진다. c. PD-1 KO 생쥐로부터의 CD4+ T 세포 또한 PD-L3 또는 VISTA-Ig에 의해 억제된다. d. PD-L3 또는 VISTA-Ig-매개 억제는 지속적이고 후에 작용할 수 있다. CD4+ T 세포는 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig의 존재하에서 72시간 (hr) 동안 (i), 또는 24시간 동안 (ii, iii 및 iv) 활성화된다. 24시간-전활성화 세포 (24hr-preactivated cells)을 수득하고 특이적 조건하에서 또 다른 48시간 동안 재자극시켰다. 세포 증식은 72시간 배양의 마지막에 분석되었다, (ii) PD-L3 또는 VISTA-Ig 로 전활성화 및 항CD3로 재자극; (iii) 항CD3로 재활성화 및 PD-L3 또는 VISTA-Ig로 재자극. (iv) PD-L3 또는 VISTA-Ig로 전활성화 및 PD-L3 또는 VISTA-Ig로 재자극. 이중처리된 웰 (duplicated wells)를 모든 조건에서 분석하였다. 최소 4번의 실험으로부터 얻어진 대표적 결과를 보인다.
도 10. CD4+ T 세포 증식에 있어서 PD-Ll-Ig 및 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질의 유사한 억제성 효과. 거대 정제된 CD4+ T 세포를 CFSE 표지화하고, PD-L1-Ig 또는 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질의 적절한 양과 함께 플레이트-결합 □CD3로 자극시켰다. CFSE 희석은 72시간에서 분석되었고 CFSE낮은 (CFSElow) 세포의 백분율이 정량화되었다. 이중처리된 웰은 모든 조건에서 분석되었다. 2번의 실험으로부터 얻어진 대표적 결과를 보인다.
도 11. 나이브 (naive) 및 기억 (memory) CD4+ T 세포의 증식에 있어서, PD-L3 또는 VISTA-Ig의 억제적 영향. A. 나이브 (CD25-CD441owCD62Lhi) 및 기억 (CD25-CD44hiCD62Llow) CD4+ T 세포 부분집단을 분류하고, CFSE 표지화한 후, 표시된 비율 (ratio)의 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig와 함께, 플레이트-결합 항-CD3 (2.5 g/ml)로 자극시켰다. 세포증식은 CFSE 분열 프로파일 (CFSE division profile)을 조사함으로써 72시간에서 분석되었다. CFSE낮은(CFSElow) 세포의 백분율에 의해 결정된, 증식된 세포의 백분율은 산출되었고, B에 보여진다. 이중처리된 웰은 모든 조건에서 분석되었다. 2번의 실험으로부터 얻어진 대표적 결과를 보인다.
도 12. PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질은 초기 TCR 활성화 및 세포증식을 억제하였지만, 직접적으로 세포자멸사 (apoptosis)를 유도하지 않았다. 거대 정제된 CD4+ T 세포를 CFSE 표지화하고, PD-L1-Ig 또는 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질의 1-2 비율 (각각 2.5 g ml 및 5 g/ml)과 함께 플레이트-결합 CD3로 자극시켰다. CFSE 희석은 24시간 및 48시간에서 CD69, CD62L, 및 CD44의 발현에 대해 세포유동분석 (flow cytometry)에 의해 분석되었다. 또한 세포를 초기 세포자멸사 마커 아넥신-V (annexin-V) 및 세포사멸 마커 7-아미노액티노마이신 (7-Aminoactinomycin D; 7-AAD)으로 염색하였다. 2번의 실험으로부터 얻어진 대표적 결과를 보인다.
도 13. PD-L3 또는 VISTA-Ig는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생성을 억제한다. A-B. 거대 정제된 CD4+ T 세포를 CFSE 표지화하고, 나타난 비율에서 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig, 및 플레이트-결합 항CD3로 자극시켰다. 배양 상층액은 24시간 및 48시간 후에 수거되었다. IL-2 및 IFN□의 수준이 ELISA에 의해서 분석되었다. C-D. CD4+ T 세포는 나이브 (CD25-CD441owCD62Lhi) 및 기억 (CD25-CD44hiCD62Llow) 세포집단으로 나뉘었다. 세포는 1:2의 비율로, 플레이트-결합 □CD3 및 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig로 자극되었다. 배양 상층액은 48시간 후에 수거하였고 IL-2 및 IFN□의 수준에 대해 ELISA로 분석하였다. E. 거대 정제된 CD8+ T 세포를 나타난 비율에서 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig, 및 플레이트-결합 □CD3로 자극시켰다. 배양 상층액에 있는 IFN□은 ELISA에 의해 분석되었다. 모든 조건에서, 6개의 이중처리된 웰의 상층액을 ELISA 분석을 위해 수거하였다. 최소 3번의 실험으로부터 얻어진 대표적 결과를 보인다.
도 14. PD-L3 또는 VISTA-Ig-매개 억제는 CD28에 의해 제공되는 공동자극의 중간수준을 극복할 수 있고 뿐만 아니라 외생적 IL-2에 의해 부분적으로 구제될 수 있지만, 공동자극의 높은 수준에 의해 완전하게 역전되지 않는다. a-b. CD4+ T 세포는 1-1 비율 및 1-2 비율에서 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig 중 하나와 함께 플레이트-결합 □CD3에 의해 활성화되었다. 사이토카인 구제에 대해서, 용해성 mIL-2, mEL7, mIL15 및 mIL-23 (모두 40ng/ml에서)를 세포 배지에 첨가하였다 (a). 공동자극의 효과를 조사하기 위해서, □CD28 (1μg/ml)을 □CD3 및 Ig 단백질과 함께 제시된 비율로 고정시켰다. (b). 세포증식을 CESE 세포분열 프로파일을 조사함으로써 72시간에 분석하였다. c-d. 공동자극의 낮은 수준의 존재하에서 PD-L3 또는 VISTA의 억제적 활성을 조사하기 위해서, □CD28의 적정된 (titrated) 양을 CD4+ T 세포의 증식을 자극하기 위해서 항-CD3 (2.5μg/ml) 및 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질 또는 대조군-Ig 융합 단백질 (10μg/ml)과 함께 코팅하였다. 세포증식은 72시간에 분석되었다. 증식된 CESElow 세포의 백분율은 정량화되었고 d에 나타내었다. 이중처리된 웰은 모든 조건에 대해 분석되었다. 최소 3번의 실험으로부터 얻어진 대표적 CFSE 프로파일의 결과를 보인다.
도 15. 항원제시세포에서 발현된 PD-L3 또는 VISTA는 CD4+ T 세포 증식을 억제한다. a-c. 안정적으로 MHCII 분자 I-Ad 및 공동자극분자 B7-2를 발현하는 CHO 세포주는 모세포주로서 사용되었다. PD-L3 또는 VISTA-RFP 또는 RFP 대조군 분자 중 하나를 발현하는 레트로바이러스는 세포에 도입되었다. 도입된 세포는 발현의 동일한 수준을 이루기 위해 분류되었다. 그들의 항원제시세포 능력을 검사하기 위해, CHO-PD-L3 또는 VISTA 또는 CHO-RFP세포는 미토마이신 C (mutimycin C)가 처리되었고, OVA 펩티드의 적정량의 존재하에서, OVA-특이적 형질도입 CD4+ T 세포 D011.10와 혼합되었다. CFSE 세포분열 프로파일 (a-b)에 의해서, 또는 트리튬 (tritium) 흡수에 의해서 (c), DO11의 증식은 72시간에 분석되었다. d. 10일 배양기간 동안에 RFP 또는 B7B-H5-RFP 레트로바이러스는 골수유래 수지상세포로 도입되었다. 도입된 CD11c+ RFP+ DCs 및 비도입된 CD11c+RFP- DCs는 분류되었고 OVA-특이적 형질도입 CD4+ T 세포를 자극시키기 위해 OVA 펩티드의 적정량의 존재하에서 사용되었다. 세포증식은 CFSE 세포분열을 조사함으로써 3일째 분석되었다. 모든 실험에 대해서, 이중처리된 웰은 모든 조건에서 분석되었고, 최소 3번의 실험으로부터 얻어진 대표적 결과를 보인다.
도 16. 레트로바이러스로 도입된 골수 유래 DCs에서의 PD-L3 또는 VISTA의 표면 발현수준. 골수유래 DCs (Bone marrow derived DCs; BMDC)를 GM-CSF (20ng mml)의 존재하에 배양시키고, 상기 실험방법에 기술된 것과 같이 RFP 또는 PD-L3 또는 VISTA-RFP 레트로바이러스를 도입시킨다. 10째 날, 배양된 BMDCs에서의 PD-L3 또는 VISTA의 표면 발현수준을 분석하고 신선하게 분리된 복강 대식세포 (freshly-isolated peritoneal macrophages)와 비교한다.
도 17은 항-PD-L3 mAb가 수동적 전달 EAE 모델 (passive transfer EAE model)에서 효능을 나타낸다는 것을 보인다. 이러한 입양 전달 EAE 모델 (adoptive transfer EAE model)에서, 공여자 SJL (donor SJL) 생쥐는 CFA 및 PLP 펩티드로 면역화되었다. 10째 날, 배수구 LN (림프절)로부터의 총 림프구를 분리하고, 시험관내에서 PLP 펩티드, IL-23 (20 ng/ml) 및 항-IFNg (10 g/ml)과 함께 4일 동안 배양하였다. 팽창된 CD4+ T 세포를 정제하고 비활성 수여자 생쥐 (naive recipient mice)로 입양이식시켰다. 질환 경과 (disease progression)은 모니터되고 하기의 점수를 가진다: 0, 질병이 없음; 0.5 꼬리 톤 (tail tone)의 상실; 1: 절룩되는 꼬리 (limp tail); 2: 절룩되는 꼬리 (limp tail) + 뒷다리 경도마비 (hind limb paresis); 2.5: 한개의 뒷다리 마비 (1 hind limb paralysis); 3: 두 개 모두의 뒷 다리 마비 (both hind limb paralysis); 3.5: 앞다리 약화 (forelimb weakness); 4: 뒷다리 마비 (hind limb paralysis) + 일방적 앞다리 마비 (unilateral forelimb paralysis). 생쥐는 점수 4에 도달할 때 희생시킨다. *은 생쥐가 희생된 것이다.
도 18은 항-PD-L3 또는 VISTA 항체가 콜라겐 (collagen)-유도 관절염 동물 모델에서 효능 (관절염의 증상을 감소함)을 나타내는 것을 보인다.
도 19는 항원제시세포에 발현된 VISTA가 CD4+ T 세포 증식을 억제하는 것을 보인다.
도 20은 항-VISTA 항체가 MB49 종양세포를 이식한 생쥐에서 종양 성장을 억제하는 것을 보인다.
도 21은 4개의 상이한 생쥐 항-종양 모델에서 VISTA mAb의 항종양 효과를 보인다.
도 22는 CD40/TLR 작용제 백신의 효능 (efficacy)에 있어서 VISTA mAb의 효과를 가능하게 하는 것을 보인다.
도 23은 CNS 세포에서의 VISTA 발현을 보인다.
도 24는 EAE 모델에서 T 세포의 운명 및 기능에 있어서 VISTA의 영향을 보인다.
본 발명을 보다 구체적으로 기술하기 이전에 하기의 정의를 제공한다.
여기서 사용되는, "면역세포"라는 용어는 조혈 유래 (hematopoietic origin)된 세포 및 면역반응 역할을 하는 세포를 포함한다. 면역세포는 B 세포 및 T 세포와 같은 림프구; 자연살해세포 (natural killer cells); 및 단핵구, 대식세포, 호산구 (eosinophils), 비만세포 (mast cells), 호염구 (basophils) 및 과립성 백혈구 (granulocytes)를 포함한 골수성 세포 (myeloid cells)를 포함한다.
여기서 사용되는, "T 세포"라는 용어는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 또한, 상기 용어 T 세포는 T도움 1종류 T 세포 (T helper 1 type T cells) 및 T도움 2종류 T 세포 (T helper 2 type T cells) 모두를 포함한다.
"항원제시세포"라는 용어는 전문적 항원제시세포 (예를 들면, B 림프구, 단핵구, 수지상 세포, 및 랑게르한스 세포) 뿐만 아니라 다른 항원제시세포 (예를 들면, 케라티노사이트 (keratinocytes), 내피세포 (endothelial cells), 성상세포 (astrocytes), 섬유아세포 (fibroblast) 및 희돌기교세포 (oligodendrocytes)를 포함한다.
여기서 "항원"이라는 용어는 그것에 대한 면역반응의 조절이 치료적으로 바람직할 수 있는 항원을 의미한다. 특정 표적항원에 대한 바람직한 증진된 면역반응의 경우에, 상기 항원은 예시로써, 보호적 면역반응이 유도될 수 있는 감염성 질환 항원을 포함하지만, 이로 제한하지 않는다. 예를 들면, 고려중인 HIV로부터의 항원은 단백질 gag, env, pol, tat, rev, nef, 역전사효소 및 다른 HIV 구성요소이다. 또한, 인간 파필로마 바이러스 (human papilloma virus)로부터의 E6 및 E7 단백질이 고려중이다. 또한, 단순헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus)로부터의 EBNA1 항원이 고려중이다. 고려중인 다른 바이러스 항원은 B 형 간염 바이러스의 S, M, 및 L 단백질, B형 간염바이러스의 전-S 항원 (pre-S antigen)와 같은 간염 바이러스 (hepatitis viral) 항원, 및 다른 간염, 예를 들면 A형, B형 및 C형, C형 간염바이러스 RNA와 같은 간염바이러스 구성요소; 헤마글루틴 (hemagglutinin), 뉴라미니다아제 (neuraminidase), 뉴클레오단백질 (nucleoprotein), M2, 및 다른 인플루엔자 바이러스 구성요소와 같은 인플루엔자바이러스 항원(influenza viral antigens); 홍역바이러스 융합 단백질 및 다른 홍역바이러스 항원 구성요소와 같은 홍역바이러스 항원 (meales viral antigens); 단백질 E1 및 E2, 및 다른 루벨라바이러스 항원 구성요소와 같은 루벨라바이러스 항원 (rubella viral antigens); VF7sc 및 다른 로타바이러스 항원 구성요소와 같은 로타바이러스 항원 (rotaviral antigens); 외피 당단백질 B 및 다른 거대세포바이러스 항원 구성요소와 같은 거대세포바이러스 항원 (cytomegaloviral antigens); RSV 융합 단백질, M2 단백질 및 다른 호흡장애바이러스 항원의 구성요소와 같은 호흡장애바이러스 항원 (respiratory syncytial viral antigens); 즉시 초기 단백질 (immediate early proteins), 당단백질 D, 및 다른 단순헤르페스 바이러스 항원 구성요소와 같은 단순 헤르페스 바이러스 항원 (herpes simplex viral antigens); gpl, gpll, 및 다른 대상포진 바이러스 항원 구성요소와 같은 대상포진바이러스 항원 (varicella zoster viral antigens); 단백질 E, M-E, M-E-NS1, NS 1, NS 1-NS2A, 80% E, 및 다른 일본뇌척수염 바이러스 항원 구성요소와 같은 일본뇌척수염 바이러스 항원 (Japanese encephalitis viral antigens); 광견병 당단백질 (rabies glycoprotein), 광견병 뉴클레오단백질 (rabies nucleoprotein) 및 다른 광견병 바이러스 항원 구성요소와 같은 광견병 바이러스 항원 (rabies viral antigens); 웨스트나일 바이러스 (West Nile virus) prM 및 E 단백질; 및 에볼라 외피 단백질 (Ebola envelope protein). 바이러스 항원의 추가적 예시를 위해 Fundamental Virology, Second Edition, eds. Knipe, D. M. and, Howley P. M. (Lippincott Williams & Wilkins, New York, 2001) for additional examples of viral antigens를 참고할 수 있다. 또한, 박테리아 항원을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 박테리아 항원은 하기를 포함하지만, 그것으로 제한하지 않는다: 백일해 독소, 사상 헤마글루티닌 (filamentous hemagglutinin), 펄탁틴 (pertactin), FI 2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라아제 (adenylate cyclase) 및 다른 백일해 박테리아 항원 구성요소와 같은 백일해 박테리아 항원 (pertussis bacterial antigens); 디프테리아 독소 (diptheria toxin) 또는 톡소이드 (toxoid) 및 다른 디프테리아 박테리아 항원 구성요소와 같은 디프테리아 박테리아 항원 (diptheria bacterial antigens); 파상풍 독소 또는 톡소이드 및 다른 파상풍 항원의 구성요소같은 파상풍 박테리아 항원 (tetanus bacterial antigens); M 단백질 및 다른 연쇄상구균 박테리아 항원 구성요소와 같은 연쇄상구균 박테리아 항원 (streptococcal bacterial antigens); IsdA, IsdB, SdrD, 및 SdrE와 같은 포도상구균 박테리아 항원 (Staphylococcal bacterial antigens); 지질다당류 (lipopolysaccharides), 플라젤린 (flagellin), 및 다른 그람-음성 박테리아 항원 구성요소와 같은 그람-음성 박테리아 항원 (gram-negative bacilli bacterial antigens); 미콜릭산 (mycolic acid), 열쇼크단백질 65 (HSP65), 30 kDa의 주요분비단백질 및 다른 결핵균 항원 구성요소와 같은 결핵균 항원 (Mycobacterium tuberculosis bacterial antigens); 헬리코박터 필로리 박테리아 항원 (Helicobacter pylori bacterial antigen) 구성요소; 뉴모리신 (pneumolysin), 페렴구균 캡슐 다당류 (pneumococcal capsular polysaccharides) 및 다른 폐렴구균 박테리아 항원 구성요소와 같은 폐렴구균 박테리아 항원 (pneumococcal bacterial antigens); 캡슐다당류 (capsular polysaccharides) 및 다른 헤모필루스 인플루엔자 바이러스 항원 구성요소와 같은 헤모필루스 인플루엔자 바이러스 항원 (haemophilus influenza bacterial antigens); 안트락스 보호항원 (anthrax protective antigen), 안트락스 레탈 인자 (anthrax lethal factor), 및 다른 안트락스 박테리아 항원 구성요소와 같은 안트락스 박테리아 항원 (anthrax bacterial antigens); 페스트균 (Yersinia pestis)으로부터의 F1 및 V 단백질; 롬스 (romps) 및 다른 리케티시애 박테리아 항원 구성요소와 같은 리케티시애 박테리아 항원(rickettsiae bacterial antigens). 또한, 여기에서 공개되는 상기 박테리아 항원과 함께 어떤 다른 박테리아, 미코박테리아 (mycobacterial), 미코플라스마 (mycoplasmal), 리케티시아 (rickettsial), 또는 클라미디아 (chlamydial) 항원을 포함한다. 원생동물 (protozoa) 및 다른 기생충 항원의 예는 하기를 포함하지만, 이로서 제한되지 않는다: 메로조이트 표면 항원 (merozoite surface antigens), 포자소체 표면 항원(sporozoite surface antigens), 주위포자소체 항원 (circumsporozoite antigens), 배우자모세포/생식세포 표면항원 (gametocyte/gamete surface antigens), 혈액단계 항원 (blood-stage antigen) pf 1 55 RESA 및 다른 말라리아 항원 구성요소와 같은 열대열말라리아원충 항원 (Plasmodium falciparum antigens); SAG- 1 , p30 및 다른 톡소플라스마 항원 구성요소와 같은 톡소플라스마 항원 (toxoplasma antigens); 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 (glutathione-S-transferase), 파라미오신 (paramyosin), 및 다른 주혈흡충항원 구성요소와 같은 주혈흡충 항원 (schistosomae antigens); 리슈마니아 주요 (leishmania major) 및 gp63과 같은 다른 리슈마니아 항원구성요소과 같은 리슈마니아 (leishmania) 및 75-77kDa 항원, 556kDa 항원 및 다른 트리파노좀 항원 구성요소와 같은 트로파토조마 크루지 항원 (trypanosoma cruzi antigens). 곰팡이 항원의 예는 칸디다 종류 (Candida species), 아스퍼길러스 종류 (Aspergillus species), 블라스토미스 종류 (Blastomyces species), 히스토플라스마 종류 (Histoplasma species), 코시디오도미오시스 종류 (Coccidiodomycosis species), 말라세지아 퍼르퍼르 (malassezia furfur) 및 다른 종류, 엑소필라 웨르네키 (Exophiala werneckii) 및 다른 종류, 리드라이아 호르타이 (Piedraia hortai) 및 다른 종류, 트리코스포룸 베이겔리 (Trichosporum beigelii) 및 다른 종류, 미코스포룸 종류 (Microsporum species), 트리코피톤 종류 (Trichophyton species), 에피더모피톤 종류 (Epidermophyton species), 스포로트릭스 첸키 (Sporothrix schenckii) 및 다른 종류, 폰세카애 페드로소이 (Fonsecaea pedrosoi) 및 다른 종류, 반길라 더마티티디스 (Wangiella dermatitidis) 및 다른 종류, 수달레체리아 보이디 (Pseudallescheria boydii) 및 다른 종류, 마두렐라 그리시아 (Madurella grisea) 및 다른 종류, 리조푸스 종류 (Rhizopus species), 압시디아 종류 (Absidia species), 및 무코르 종류 (Mucor species)를 포함하지만, 이로서 제한되지 않는다. 프리온 (prion) 질환 항원의 예는 PrP, 베타-아밀로이드 (beta-amyloid), 및 다른 프리온-관련 단백질을 포함한다.
상기 언급된 감염성 및 기생충성 제제 뿐만 아니라, 비감염성 제제에 대한 바람직한 증진된 면역원성의 또 다른 분야는 이상증식성 질환 (dysproliferative diseases)의 분야에 있고, 암을 포함하지만 이것으로 제한되지 않으며, 여기에서 암 항원을 발현하는 세포는 몸으로부터 제거된다. 조성물에서 사용 될 수 있는 종양 항원 (tumor antigen) 및 본 발명의 방법은 전립선 특이적 항원 (prostate specific antigen; PSA), 유방암, 방광암, 난소암, 고환암, 흑색종, 말단소체복원효소 (telomerase); P-당단백질 (P-glycoprotein)과 같은 다가약물내성단백질 (multidrug resistance proteins); MAGE- 1, 알파 페토단백질 (alpha fetoprotein), 배아종양항원 (carcinoembryonic antigen), 돌연변이 p53, 파필로마바이러스 항원 (papillomavirus antigens), 강글리오시드 (gangliosides) 또는 다른 흑색종 또는 다른 종양세포의 탄수화물-포함 구성요소 (carbohydrate-containing components)를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 종양의 어떠한 종류로부터의 항원이 여기에서 기술되는 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다는 것으 본 발명에 의해 고려된다. 상기 항원은 암 세포, 또는 막단백질과 같은 암세포에서 분리된 면역원성 물질일 수 있다. 서비빈 (survivin) 및 말단소체복원효소 일반 항원 및 고환암 항원의 MAGE계가 포함된다. 자가면역과 관련된 것으로 보이고 및 내성을 유도하는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 항원은 미엘린 기반 단백질 (myelin basic protein), 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질 (myelin oligodendrocyte glycoprotein) 및 다발성 경화증의 프로테오 단백질 (proteolipid protein) 및 류마티그 관절염의 CI1 콜라겐 단백질 (collagen protein)을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다.
상기 항원은 예를 들면 HZV-1, EBV, HBV, 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), SARS 바이러스, 폭스 바이러스 (poxviruses), 말라리아 (malaria), 또는 HSV와 같은 감염성 제제의 한 부분일 수 있고. 상기에 제한되지 않으며, 예를 들면, 강력한 T 세포 매개 면역 (수지상 세포를 통한)을 집결시키는 백신이 필요한 경우를 포함한다.
"종양"이라는 단어는 조직 신생 (tissue neoformation)의 형태에서, 대개 억제하는데 장애가 있는, 구체적으로 자발적이고 자주적이며 및 비가역적인, 내재적 조직 (endogenous tissue)의 초과 성장의 형태에서 최소 하나의 세포 또는 세포량을 의미하고, 이는 상기 초과 성장이 특이적 세포 및 조직 기능의 상실과 대개 자명하게 관련된 것이다. 이러한 세포 또는 세포량은 성장과 관련하여 스스로 또는 숙주 생물체의 조절기작에 의해 효과적으로 억제되지 않고, 그 예는 흑색종 또는 상피성암 (carcinoma)이다. 종양항원은 악성세포 자체 안에서 또는 그 세포에 나타난 항원을 포함할 뿐만 아니라, 내피세포 및 다른 혈관 구성요소를 포함하는 종양의 조직을 지지하는 기질 (stromal)에 나타난 항원도 포함한다.
여기서 사용하는 "면역반응"은 T 세포 공동자극의 조절에 의해 영향을 받는, T 세포-매개 및/또는 B-세포 매게 면역반응을 포함한다. 예시적 면역반응은 B 세포 반응 (예를 들면, 항체 생산), T 세포 반응 (예를 들면, 사이토카인 생산 및 세포성 세포독성) 및 예를 들면 대식세포와 같은 사이토카인 반응세포의 활성화를 포함한다. 여기서 사용되는, 면역반응에 대한 "하향조절"이라는 용어는 하나 또는 그 이상의 면역반응에서의 축소를 포함하는 반면, 면역반응에 대한 "상향조절"이라는 용어는 하나 또는 그 이상의 면역반응에서의 상승을 포함한다. 면역반응의 어느 한 종류의 상향조절은 면역반응의 또 다른 종류에서 그에 상응하는 하향조절을 초래할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 특정 사이토카인 (예를 들면, IL-10)의 생산의 상향조절은 세포성 면역반응의 하향조절을 초래할 수 있다.
여기서 사용되는 "공동자극 수용체"라는 용어는 면역세포에게 공동자극신호를 전달하는 수용체, 예를 들면 CD28 또는 ICOS를 포함한다. 여기서 사용되는 "억제성 수용체"라는 용어는 면역세포에게 음성신호를 전달하는 수용체를 포함한다.
여기서 사용되는, 활성화된 면역세포에 대해 "공동자극시킨다"라는 용어는 증식이나 또는 작용기 기능을 포함하는, 공동자극분자의 2차, 비-활성, 수용체-매개 신호 ("공동자극신호")를 제공하는 능력을 포함한다. 예를 들면, 공동자극신호는, 예를 들면 T 세포-수용체-매개 신호를 받은 T 세포에서, 사이토카인 분비를 초래할 수 있다. 세포 수용체-매개 신호를 받는 면역세포는, 예를 들면 활성화 수용체를 통해서, 여기에서 "활성화된 면역세포"라고 일컬어진다.
억제성 수용체에 의해 전달된 억제성 신호는 공동자극 수용체 (CD28 또는 ICOS)가 면역세포에 존재하지 않고 따라서 공동자극 분자의 결합에 있어서 억제성 수용체 및 공동자극 수용체 사이의 경쟁의 기능이 아닐 할 경우에도 발생할 수 있다 (Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205). 면역세포에 억제성 신호의 전달은 면역세포의 무반응, 아너지 (anergy) 또는 세포계획사멸 (programmed cell death)을 초래할 수 있다. 바람직하게, 억제성 신호의 전달은 세포자멸사 (apoptosis)와 관련되지 않은 기작을 통해서 작동한다.
여기서 사용되는 "세포자멸사 (apoptosis)"는 당업계에서 알려진 기술을 사용하여 특징화될 수 있는 세포계획사멸을 포함한다. 세포자멸사는, 예를 들면 세포 위축 (cell shirinkage), 막 블러빙 (mambrane blebbing) 및 세포 단편화 (cell fragmentation)에서의 최절정인 염색체 응축에 의해 특징화될 수 있다. 또한, 세포자멸사를 겪는 세포는 뉴클레오솜 사이 (internucleosome)의 DNA 절단 (DNA cleavage)의 특징적 양상을 나타낸다.
여기서 사용되는 "자가면역 질환"은 개인이 가지고 있는 조직을 공격하고그것으로부터 발생된 질환이나 장애, 또는 그들의 공동분리 (co-segregate) 또는 징후, 또는 그들로부터 야기되는 질병이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예시는 관절염 [급성 관절염, 만성 류머티스 관절염, 통풍성 (gouty) 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 (Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추성 관절염, 및 연소성 류마티스 관절염 (juvenile-onset rhematoid arthritis), 골관절염, 관절염 크로니카 프로그레디엔테(arthritis chronica progrediente), 변형성 (deformans) 관절염, 다발관절염 크로니카 프리마리아 (polyarthritis chronica primaria), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 및 강직성 척수염 (ankylosing spondylitis)과 같은 류머티스 관절염], 염증성 과증식 피부 질환, 플라크 건선 (plaque psoriasis), 구타테 건선 (gutatte psoriasis), 농포성 건선 (pustular psoriasis), 및 손톱의 건선 (psoriasis of the nails)과 같은 건선, 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알러지성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 포진성 피부염 (herpetiformis dermatitis), 및 아토피성 피부염 (atopic dermatitis)을 포함하는 피부염, X-연관 과 IgM 증후군, 만성 알러지성 두드러기 및, 만성 자가면역 두드러기를 포함하는, 만성 특발성 두드러기 (chronic idiopathic urticaria)와 같은 두드러기 (urticaria), 다발성근염/피부근염 (polymyositis/dermatomyositis), 연소성 피부근염 (juvenile dermatomyositis), 중독성 표피박리 (toxic epidermal necrolysis), 경피증 (scleroderma) (전신성 경피증을 포함), 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 스피노-옵티컬 MS (spino-optical MS), 원발성 진보성 MS (primary progressive MS; PPMS), 및 재발성 레밋 MS (relapsing remitting MS; RRMS)와 같은 다발성 경화증 (multiple sclerosis; MS), 진보성 전신 경화증 (progressive systemic sclerosis), 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis), 동맥경화증 (arteriosclerosis), 파종성 경화증 (sclerosis disseminata), 및 운동성 경화증 (ataxic sclerosis)을 포함하는 와 같은 경화증 (sclerosis), 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease; IBD) [예를 들면, 크론 질환, 자가면역-매개 위장질환, 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 궤양 대장염 (colitis ulcerosa), 미세 대장염 (microscopic colitis), 콜라겐성 대장염 (collagenous colitis), 폴리포사 대장염 (colitis polyposa), 신생아 괴사성 대장염 (necrotizing enterocolitis), 및 경벽 대장염 (transmural colitis)과 같은 대장염, 및 자가면역 염증성 장질환 (autoimmune inflammatory bowel disease)], 괴저성 농피증 (pyoderma gangrenosum), 결정성 홍반 (erythema nodosum), 원발성 경화 담관염 (primary sclerosing cholangitis, episcleritis)를 성인 또는 급성 호흡장애 증후군 (adult or acute respiratory distress syndrome; ARDS)을 포함하는 호흡 장애 증후군 (respiratory distress syndrome), 수막염 (meningitis), 포도막 (uvea)의 전체 또는 부분의 염증, 홍채염 (iritis), 맥락막염 (choroiditis), 자가면역혈액장애 (autoimmune hematological disorder), 류마티즘성 척추염 (rheumatoid spondylitis), 급성 청력 상실, 아나필락시스 (anaphylaxis) 및 알러지성 및 아토피성 비염과 같은 IgE-매개 질환, 라스무센 뇌염 (Rasmussen's encephalitis) 및 변연계 및/또는 뇌줄기 뇌염 (limbic and/or brainstem encephalitis)과 같은 뇌염 (encephalitis), 앞 포도막염 (anterior uveitis), 급성 앞 포도막염, 육아종 포도막염 (granulomatous uveitis), 비육아종 포도막염 (nongranulomatous uveitis), 파코항원성 포도막염 (phacoantigenic uveitis), 뒤 포도막염 (posterior uveitis), 또는 자가면역 포도막염 (autoimmune uveitis)과 같은 포도막염, 원발성 GN (primary GN)과 같은 만성 또는 급성 사구체신염과 같은 신증후군 (nephrotic syndrome)과 함께 또는 없이 사구체신염 (glomerulonephritis; GN), 면역-매개 GN, 막성신증 (membranous GN, membranous nephropathy), 특발성 막성신증 (idiopathic membranous nephropathy) 또는 특발성 막성신증 (idiopathic membranous GN), I형 및 II형를 포함한 레나브로- (rnembrano-) 또는 막 증식성 GN (membranous proliferative GN; MPGN), 및 급속한 진행성 GN, 알러지 질병, 알러지 반응, 알러지성 또는 아토피성 습진을 포함한 습진 (eczema), 소기관지 천식 (asthma bronchiale), 기관지 천식 (bronchial asthma) 및 자가면역 천식과 같은 천식, T 세포 침투 및 만성적 염증반응과 관련된 질병, 만성적 폐염증성 질환 (pulmonary inflammatory disease), 자가면역 심근염 (myocarditis), 백혈구부착결핍증 (leukocyte adhesion deficiency), 전신적홍반성루푸스 (systemic lupus erythematosus; SLE) 또는 피부 SLE와 같은 전신적홍반성루푸스, 아급성피부홍반성루프스 (subacute cutaneous lupus erythematosus), 신생아루푸스증후군 (neonatal lupus syndrome; NLE), 홍반성루푸스낭창 (lupus erythematosus disseminatus), 루푸스 [신장염 (nephritis), 뇌염 (cerebritis), 소아 (pediatric), 비신장 (non-renal), 신장외 (extra-renal), 반상 (discoid), 탈모 (alopecia)를 포함하는], 소아 인슐린-의존 당뇨병 (pediatric insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM)을 포함하는 유아개시 (I 형) 당뇨병 (juvenile onset (Type I) diabetes mellitus), 성인개시당뇨병 (II 형), 자가면역 당뇨병, 특발성 당뇨병요붕증 (idiopathic diabetes insipidus). T 림프구및 사이토카인에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역반응, 결핵, 사코이도시스 (sarcoidosis), 림프종모양육아종증 (lymphomatoid granulomatosis)를 포함하는 육아종증 (granulomatosis), 웨그너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 무과립구증 (agranulocytosis), 혈관염 (vasculitis) [거대혈관혈관염 (다발근육통 (polymyalgia rheumatica) 및 거대세포 (Takayasu's)동맥염)을 포함하는], 카와사키 질환, 결절성다발성동맥염 (polyarteritis nodosa)을 포함하는 중간혈관혈관염, 마이크로스코픽 다발성동맥염 (microscopic polyarteritis), CNS 관절염, 괴사성, 피부성, 또는 과민성 혈관염, 전신적괴사성혈관염 (systemic necrotizing vasculitis), 척-스트라우스 혈관염 (Churg-Strauss vasculitis) 또는 증후군 (CSS)와 같은 ANCA-관련 혈관염)을 포함하는 바스큘리티드 (vasculitides), 측두동맥염 (temporal arteritis), 재생불량성 빈혈 (aplastic anemia), 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스 (coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈 (Diamond Blackfan anemia), 용혈성 빈혈 (hemolytic anemia) 또는 자가면역용혈성빈혈 (autoimmune hemolytic anemia; AIHA)을 포함하는 면역 용혈성 빈혈, 악성빈혈 (pernicious anemia) (anemia perniciosa), 애디슨 질환 (Addison's disease), 순수적혈구빈혈무형성증 (pure red cell anemia aplasia; PRCA), 인자 VHI 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증 (autoimmune neutropenia), 범혈구감소증 (pancytopenia), 백혈구감소증 (leukopenia), 백혈구 누출증 (leukocyte diapedesis)과 관련된 질환, CNS 염증성 장애, 패혈증 (septicemia), 외상 (trauma), 출혈 (hemorrhage)에 대한 2차와 같은 다기관 손상, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알러지 신경염, 베체트 질환 (Bechet's 또는 Behcet's disease), 캐슬맨 증후군 (Castleman's syndrome), 굿패스쳐증후군 (Goodpasture's syndrom), 레이나우드 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 스티븐스-존슨 등후군 (Stevens- Johnson syndrome), 수포성 펩피고이드 (pemphigoid bullous) 및 피부 펨피고이드 (skin pemphigoid)와 같은 펩피고이드 (pemphigoid), 천포창 (pemphigus) [심상성천포창 (pemphigus vulgaris), 낙엽성천포창 (pemphigus foliaceus), 천포창 점막 핌피고이드 (pemphigus mucus-membrane pemphigoid), 및 홍반성천포창 (pemphigus erythematosus)을 포함], 자가면역 다발성내분비병증 (autoimmune polyendocrinopathies), 라이터 질환 (Reiter's disease) 또는 증후군, 면역복합체 신장염, 항체-매개 신장염, 시속척수염 (neuromyelitis optica), 다신경병증 (polyneuropathies), IgM 다신경병증 또는 IgM-매개 신경변증과 같은 만성적 신경병증 (chronic neuropathy), 혈전성 혈소판감소자반증 (thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP) 및 만성적 또는 급성 ITP를 포함하는 특발성혈소판감소증 (ITP)와 같은 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증을 포함하는 혈소판감소증 (thrombocytopenia) (예를 들면, 심근경색 환자에 의해 발달된), 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선기능저하증 (primary hypothyroidism), 자가면역 갑상선염과 같은 갑상선염을 포함하는 갑상선기능저하증, 자가면역내분비질환, 하시모토 질환 (Hashimoto's disease), 만성적 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis); 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선질환, 특발성 갑상성기능 저하증 (idiopathic hypothyroidism), 그레이브 질환 (Grave's disease), 자가면역 다분비선 증후군 [또는 다분비선 내분비증후군 (polyglandular endocrinopathy syndromes)]과 같은 다분비선 증후군 (polyglandular syndrome), 람베르트-이튼 증후군 (Lambert-Eaton myasthenic syndrome 또는 Eaton-Lambert syndrome)와 같은 신경부종양증후군을 포함하는 부종양 증후군 (paraneoplastic syndromes), 스티프-인간 증후군 (stiff-man or stiff-person syndrome), 알러지성 뇌척수염 (allergic encephalomyelitis 또는 encephalomyelitis allergica) 및 실험적 알러지성 뇌척수염 (experimental allergic encephalomyelitis; EAE)과 같은 뇌척수염 (encephalomyelitis), 흉선세포-관련 중증근무력증 (thymoma-associated myasthenia gravis)과 같은 중증근무력증 (myasthenia gravis), 소뇌변성 (cerebellar degeneration), 뉴로미오토니아 (neuromyotonia), 옵소클로노스 미오클로노르 증후군 (opsoclonus or opsoclonus myoclonus syndrome; OMS), 및 감각신경병증 (sensory neuropathy), 다초점운동신경병증 (multifocal motor neuropathy), 시한 증후군 (Sheehan's syndrome), 자가면역간염, 만성적 간염, 루포이드 간염 (lupoid hepatitis), 거대세포간염 (giant cell hepatitis), 만성활성간염 (chronic active hepatitis) 또는 자가면역 만성활성간염, 림프구성간질성 폐렴 (lymphoid interstitial pneumonitis), 세기관지기질화페례 (bronchiolitis obliteran, 비이식) 대 NSIP, 길린-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 베르게르 질환 (Berger's disease, IgA 신장병), 특발성 IgA 신장병, 선형 IgA 피부병, 원발성담즙성간경변 (primary biliary cirrhosis), 폐렴간경변 (pneumonocirrhosis), 자가면역 창자병 증후군 (autoimmune enteropathy syndrome), 셀리악 질환 (Celiac disease), 코엘리악 질환 (Coeliac disease), 셀리악 스프루 (celiac sprue, gluten enteropathy), 불응성 스프루 (refractory sprue), 특발성 스프루 (idiopathic sprue), 한랭글로불린혈증 (cryoglobulinemia), 근육위쪽가측경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; ALS; Lou Gehrig's disease), 관질환 (coronary artery disease), 자가면역속귀질환 (autoimmune inner ear disease; AGED)과 같은 자가면역 귀질환 (autoimmune ear disease), 자가면역청력상실, 옵소클로그 미오클루스 증후군 (opsoclonus myoclonus syndrome; OMS), 불응성 (refractory) 또는 재발성 다발연골염과 같은 다발연골염 (polychondritis), 폐포단백증 (pulmonary alveolar proteinosis), 아밀로이드증 (amyloidosis), 공막염 (scleritis), 비암성 림프구증 (non-cancerous lymphocytosis), 단일클론 B 세포 림프구증 [예를 들면, 양성 단일클론 감마병증 및 결정되지 않은 유의성의 단일클론 가르모병증 (monoclonal garnmopathy of undetermined significance; MGUS)]을 포함하는 원발성 림프구증 (primary lymphocytosis), 말초신경병증 (peripheral neuropathy), 부종양증후군 (paraneoplastic syndrome), 간질 (epilepsy), 편두통 (migraine), 부정맥 (arrhythmia), 근육성 장애, 난청 (deafness), 실명 (blindness), 주기성 근육마비 (periodic paralysis), 및 CNS의 채널병증과 같은 채널병증 (channelopathies), 자폐증 (autism), 염증성 근육병 (inflammatory myopathy), 국소분절사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 내분비 옵탈로모증 (endocrine opthalmopathy), 유베오레티니티스 (uveoretinitis), 맥락망막염 (chorioretinitis), 자가면역 간질환 (autoimmune hepatologicai disorder), 근육섬유통 (fibromyalgia), 다수내분비실패 (multiple endocrine failure), 시미디트 증후군 (Schmidt's syndrome), 부신염 (adrenalitis), 장무근력증 (gastric atrophy), 초로기치매 (presenile dementia), 자가면역 탈미엘 짝짓기 질환 (autoimmune demyel mating diseases)와 같은 탈미엘린화 질환 (demyelinating diseases), 당뇨병증 (diabetic nephropathy), 드레스러 증후군 (Dressler's syndrome), 알로페시카 그리타 (alopecia greata), CREST 증후군 (석회증(calcinosis), 레이나우드 증후군 (Raynaud's phenomenon), 식도 기능장애(esophageal dysmotility), 수지경화증(sclerodactyl), 및 모세혈관확장증 (telangiectasia)), 수컷 및 암컷 불임, 혼합된 연결조직 질환, 샤가스 질환 (Chagas' disease), 류마티스 열병 (rheumatic fever), 재발성 유산 (recurrent abortion), 농장폐 (farmer's lung), 다형홍반 (erythema multiforme), 심장절개후 증후군 (post-cardiotomy syndrome), 쿠싱 증후군 (Cushing's syndrome), 새-팬시어 폐 (bird-fancier's lung), 알러지성육아성혈관염 (allergic granulomatous angiitis), 양성림프구성혈관염 (benign lymphocytic angiitis), 알포트 증후군 (Alport's syndrome), 알러지성 치조골막염 및 섬유성 골막염과 같은 치조골막염 (alveolitis), 폐내부질환 (interstitial lung disease), 수혈질환, 나병 (leprosy), 말라리아 (malaria), 리슈만편모충증 (leishmaniasis), 키파노소미아시스 (kypanosomiasis), 주혈흡충증 (schistosomiasis), 회충증 (ascariasis), 아스파라거시스 (aspergillosis), 삼터 증후군 (Sampter's syndrome), 카플란 증후군 (Caplan's syndrome), 뎅기 (dengue), 심내막염 (endocarditis), 심내막염 섬유증 (endomyocardial fibrosis), 확산형 폐내섬유증 (diffuse interstitial pulmonary fibrosis), 폐내섬유증 (interstitial lung fibrosis), 특발성 폐섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis), 시스트 섬유증 (cystic fibrosis), 안구내염 (endophthalmitis), 지구성융기성 홍반 (erythema elevatum et diutinum), 태아적아구증 (erythroblastosis fetalis), 호산구성태아증 (eosinophilic faciitis), 슐만 증후군 (Shulman's syndrome), 펠티 증후군 (Felty's syndrome), 플라리라시스 (flariasis), 만성적 모양체염, 이종만성적 모양체염, 홍채모양채염 (iridocyclitis) 또는 푸치 모양체염 (Fuch's cyclitis)과 같은 모양체염 (cyclitis), 헤노흐-쉔라인 자반증 (Henoch-Schonlein purpura), 인간면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus; HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증 (cardiomyopathy), 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 파보바이러스 감염 (parvovirus infection), 루벨라바이러스 감염 (rubella virus infection), 백신후 증후군 (post-vaccination syndromes), 선천적 루볼라 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염 (Epstein-Barr virus infection), 이하선염 (mumps), 이반 증후군 (Evan's syndrome), 자가면역 성선부전증 (autoimmune gonadal failure), 시든햄 무도증 (Sydenham's chorea), 연쇄상구균후 신장염 (poststreptococcal nephritis), 혈전혈관염 (thromboangitis ubiterans), 갑상선중독증 (thyrotoxicosis), 척수매독 (tabes dorsalis), 맥락막염 (chorioiditis), 거대세포 다발근육통 (giant cell polymyalgia), 내분비 오프타모증 (endocrine ophthamopathy), 만성적과민성폐렴 (chronic hypersensitivity pneumonitis), 건성각결막염 (keratoconjunctivitis sicca), 유행성 각결막염, 특발성 신장염증후군 (idiopathic nephritic syndrome), 최소변화신장병증 (minimal change nephropathy), 양성 가족 (benign familial) 및 허혈성재관류 손상 (ischemia-reperfusion injury), 레티날 자가면역 (retinal autoimmunity), 관절염증 (joint inflammation), 기도염 (bronchitis), 만성적폐쇄성기도질환 (chronic obstructive airway disease), 규폐증 (silicosis), 아프다 (aphthae), 아프타성 궤양 (aphthous stomatitis), 동맥경화 질환 (arteriosclerotic disorders), 아스퍼미오진 (aspermiogenese), 자가면역 용혈증 (autoimmune hemolysis), 보에크 질환 (Boeck's disease), 한냉글로불린혈증 (cryoglobulinemia), 두푸이트렌 구축 (Dupuytren's contracture), 엔도프탈미아 파코아날피라티카 (endophthalmia phacoanaphylactica), 알러지성 장염 (enteritis allergica), 나병성 결절성 홍반 (erythema nodosum leprosum), 특발성 얼굴마비 (idiopathic facial paralysis), 만성피로증후군 (chronic fatigue syndrome), 루마티카열 (febris rheumatica), 하만-리치 질환 (Hamman-Rich's disease), 감각신경 청력상실 (sensoneural hearing loss), 해모글로비누리아 파록시마티카 (haemoglobinuria paroxysmatica), 성선기능저하증 (hypogonadism), 국한성회장염 (ileitis regionalis), 백혈구감소증 (leucopenia), 모노뉴클레오시스 감염 (mononucleosis infectiosa), 트래버스 척수염 (traverse myelitis), 원발성 특발성 점액수종 (primary idiopathic myxedema), 신장병 (nephrosis), 오프탈미아 심파티카 (ophthalmia symphatica), 오키티스 육아종 (orchitis granulomatosa), 췌장염 (pancreatitis), 급성다발신경근염 (polyradiculitis acuta), 괴저성 농피증 (pyoderma gangrenosum), 퀘르바인 갑상생염 (Quervain's thyreoiditis), 후천선 스페닉무근력증 (acquired spenic atrophy), 항정자성 항체에 의한 불임 (infertility due to antispermatozoan antobodies), 비악성 흉선종 (non-malignant thymoma), 비티리고 (vitiligo), SCID 및 엡스타인-바 바이러스-관련 질환 (Epstein-Barr virus-associated diseases), 후천성 면역결핍증 (acquired immune deficiency syndrome; AIDS), 리슈만편모충증 (Lesihmania)과 같은 기생충 질환, 독성-쇼크 증후군 (toxic-shock syndrome), 발독 (food poisoning), T 세포의 침투과 관련된 질병, 백혈구-부착 결핍, 사이토카인 및 T 세포에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역반응, 백혈구 누출과 관련된 질환, 다기관손상증후군 (multiple organ injury syndrome), 항원-항체 복합체-매개 질환, 안티글로머룰러 기저막 질환 (antiglomerular basement membrane disease), 알러지성 신경염 (allergic neuritis), 자가면역 다발성내분비병증 (autoimmune polyendocrinopathies), 난소염, 원발성 점액수종 (primary myxedema), 자가면역무근력증 장염 (autoimmune atrophic gastritis), 교감성안염 (sympathetic ophthalmia), 류마티스 질환 (rheumatic diseases), 혼합된 연결조직 질환, 신증후군 (nephrotic syndrome), 췌도염 (insulitis), 다발성내분지 부전 (polyendocrine failure), 말초신경병증 (peripheral neuropathy), 자가면역 다발생식선 증후군 I형 (aut oimmune polyglandular syndrome type I), 성인-개시 특발성 부갑상선기능이상저하증 (adult-onset idiopathic hypoparathyroidism; AOIH), 토탈리스 탈모증 (alopecia totalis), 확장성심근병증 (dilated cardiomyopathy), 에피더모리시스 불로사 에퀴시타 (epidermolisis bullosa acquisita; EBA), 혈색소증 (hemochromatosis), 심근염증 (myocarditis), 신증후군, 원발성 경화성 담관염 (primary sclerosing cholangitis), 화농성 또는 비화농성 부비동염 (sinusitis), 급성 또는 만성적 부비동염, 사골 (ethmoid), 앞 골 (frontal), 상악 (maxillary), 또는 접형골 (sphenoid) 부비동염, 호산구증가증과 같은 호산구-장애, 폐 침투 호산구증가등 (pulmonary infiltration eosinophilia), 호산구증가-미아글리아 증후군 (eosinophilia-myalgia syndrome), 로플러 증후군 (Loffler's syndrome), 만성적 호산구증가 폐렴 (chronic eosinophilic pneumonia), 국부성 폐 호산구증가증 (tropical pulmonary eosinophilia), 기도폐렴성 아스퍼길로시스 (bronchopneumonic aspergillosis), 아스퍼실로마 (aspergilloma), 또는 호산구를 포함하는 그라눌로마스 (granulomas), 아나필락시스 (anaphylaxis), 세로음성 스폰디로아트리티드 (seronegative spondyloarthritides), 다발내분지 질환 (polyendocrine autoimmune disease),경화성 담관염 (sclerosing cholangitis), 공막 (sclera), 상공막 (episclera), 만성적점막성칸디데이시스 (chronic mucocutaneous candidiasis), 브루톤 증후군 (Bruton's syndrome), 유아기의 일시적저감마글로불린증 (transient hypogammaglobulinemia of infancy), 위코트-알드리히 증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome), 모세혈관 확장성 운동실조증 (ataxia telangiectasia), 콜라겐 질환과 관련이 있는 자가면역 장애, 류마티스, 신경학적 질환, 허혈성재관류 장애, 혈압반응의 감소, 혈관탈기능, 안티기타시스 (antgiectasis), 조직손상, 심혈관 허혈 (cardiovascular ischemia), 통각과민 (hyperalgesia), 뇌동정맥 허혈 (cerebral ischemia), 및 혈관화 (vascularization)를 동반하는 질환, 알러지성 과민성 장애, 사구체신염 (glomerulonephritides), 재관류 손상 (reperfusion injury), 심근육 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성염증성 구성요소를 가지는 피부장애 (dermatoses), 급성 화농성 수막염 (acute purulent meningitis) 또는 다른 중추신경계 염증성 질환, 안구 (ocular and orbital) 염증성 질환, 과립구 수혈-관련 증후군 (granulocyte transfusion-associated syndromes), 사이토카인-유도 독성, 급성 중증 염증 (acute serious inflammation), 만성적 난치성염증 (chronic intractable inflammation), 신우염 (pyelitis), 폐렴간경변증 (pneumonocirrhosis), 당뇨망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨병성 거대-동맥 장애 (diabetic large-artery disorder), 동백내막과다형성증 (endarterial hyperplasia), 소화성궤양 (peptic ulcer), 판막염 (valvulitis) 및 자궁내막증 (endometriosis)을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다.
"암 (cancer)" 및 "암성 (cancerous)"은 를 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장에 의해 특징화되는 포유류의 물리적 질병을 일컫거나 또는 의미한다. 암의 예시는 상피성 암 (carcinoma), 림프종 (lymphoma), 아세포종 (blastoma), 육종 (sarcoma), 및 백혈병 (leukemia)를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예시는 편평세포암 (squamous cell cancer), 폐암 [소세포성 폐암 (small-cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (non-small cell lung cancer), 폐의 선암 (adenocarcinoma), 및 폐의 편평상피암(squamous carcinoma)], 복막암, 간세포암 (hepatocellular cancer), 장 또는 위암 (gastric or stomach cancer) (위장암 (gastrointestinal cancer)을 포함), 췌장암 (pancreatic cancer), 교아종 (glioblastoma), 자궁경부암 (cervical cancer), 난소암 (ovarian cancer), 간암 (liver cancer), 방광암 (bladder cancer), 간세포암 (hepatoma), 유방암 (breast cancer), 대장암 (colon cancer), 결장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암 (endometrial or uterine carcinoma), 침샘암 (salivary gland carcinoma), 신장암 (kidney or renal cancer), 간암 (liver cancer), 전립선암(prostate cancer), 음문암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간세포 상피성암 (hepatic carcinoma) 및 머리와 목암 (head and neck cancer)의 다양한 종류 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (B-cell lymphoma) [경도/소낭 비호차칸송 림프종 (low grade/follicular non-Hodgkin's lymphoma; NHL); 소림프구성 (small lymphocytic; SL) NHL; 중등도/소낭 (intermediate grade/follicular) NHL; 중등도 확산 (intermediate grade diffuse) NHL; 고도 면역아세포성 (high grade immunoblastic) NHL; 고도 림프아세포성 (high grade lymphoblastic) NHL; 고도 소비절단세포 (high grade small non-cleaved cell) NHL; 거대질환 (bulky disease NHL); 맨틀세포 림프종 (mantle cell lymphoma); AIDS-관련 림프종 (AIDS-related lymphoma); 및 발덴스트롬성 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's Macroglobulinemia)]; 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia; CLL); 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia; ALL); 모발세포 백혈병 (Hairy cell leukemia); 만성 골수아세포 백혈병 (chronic myeloblastic leukemia); 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 이식후 림프증식성 장애 (post-transplant lymphoproliferative disorder; PTLD)]를 포함한다.
"알러지성 질환"이라는 표현은 알러지 반응과 관련된 질환을 나타낸다. 보다 구체적으로, "알러지 질환"은 알러젠 (allergen)이 동정된 질환으로 정의되고, 여기에는 그 알러젠에 대한 노출과 병리학적 변화의 개시 사이에 밀접한 상관관계가 있고, 상기 병리학적 변화는 면역학적 기전을 가지는 것으로 증명된다. 여기에서, 면역학적 기작은 백혈구 (leukocytes)가 알러젠 자극에 대한 면역반응을 보이는 것을 의미한다. 알러젠의 예시는 진드기 알러젠 (mite allergen) 및 화분 알러젠 (pollen allergen)을 포함한다. 대표적인 알러지 질환은 기도천식 (bronchial asthma), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 및 화분 및 곤충 알러지를 포함한다. 알러지성 특이체질 (allergic diathesis)은 알러지가 있는 부모에서 자식으로부터의 유전될 수 있는 유전적 요소 (genetic factor)이다. 또한, 가족의 알러지성 질환은 아토피성 질환으로 불리고, 원인이되는 유전적으로 전달되는 요소는 아토피성 특이체질이다. "아토피 피부염"은 아포티 질환, 특히 피부염 증상을 동반하는 질환에 대한 일반적인 용어이다. 바람직한 예시는 습진 (eczema), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 건초열 (hay fever), 두드러기 (urticaria), 및 음식 알러지로 구성된 군으로부터 선별된 알러젠 질병을 포함한다. 알러젠 질병은 습진, 알러지성 비염 또는 코카타르 (coryza), 건초열, 기관지성 천식, 두드러기 (urticaria, hives) 및 음식 알러지, 및 다른 아토피성 질병을 포함한다.
"천식"은 염증, 기도가 좁아지는 것 및 흡입제(inhaled agent)에 대해 기도의 반응성 증가에 의해 특징화되는 호흡기체계의 장애를 의미한다. 천식은 종종 아토피 또는 알러지 증상과만 관려되지 않는다.
여기에서 "염증성 질병 또는 염증성 질환"의 표현은 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 질병 또는 질환을 포함하는, 만성 또는 습성 염증성 질환을 포함한다: 류머티즘 질환 (rheumatic diseases) (류머티즘 관절염, 골관절염, 건선 관절염을 포함하지만 이로 제한되지 않음), 척추관절병 (spondyloarthropathies) [강직 척추염 (ankylosing spondylitis), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 라이터 증후군 (Reiter's syndrome)을 포함하지만 이로 제한되지 않음], 결정성 관절병증 (crystal arthropathies) [통풍성 (gout), 가통풍성 (pseudogout), 칼슘 피로포스페이트 축적 질환 (calcium pyrophosphate deposition disease)를 포함하지만 이로 제한되지 않음], 라임 질환 (Lyme disease), 류마티스성 다발성 근육통 (polymyalgia rheumatica); 연결조직 질환 (connective tissue diseases) [전신성 홍반루푸스 (systemic lupus erythematosus), 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 다발근육염 (polymyositis), 피부근염 (dermatomyositis), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome)을 포함하지만 이로 제한되지 않음]; 혈관염 (vasculitides) [결절다발동맥염 (polyarteritis nodosa), 베게너육아종증 (Wegener's granulomatosis), 처르그-스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome)을 포함하지만 이로 제한되지 않음]; 외상 또는 허혈(ischaemia)의 결과를 포함한 염증성 질병; 사코이드증 (sarcoidosis); 죽상경화 혈관 질환 (atherosclerotic vascular disease), 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis) 및 혈관 차단성 질환 (vascular occlusive disease) [아테롬성 동맥경화증, 허혈성심장질환 (ischaemic heart disease), 심근경색 (myocardial infarction), 뇌졸중 (stroke), 말초혈관질환 (peripheral vascular disease)을 포함하지만 이로 제한되지 않음], 및 (vascular stent restenosis)을 포함하는 혈관성 질환; 포도막염 (uveitis), 각막질환 (corneal disease), 홍채염 (iritis), 홍채모양채염 (iridocyclitis), 및 백내장 (cataracts)을 포함하는 안구 질환 (ocular diseases).
본 발명에 의해 치료될 수 있는 암은 상피성 암 (carcinoma), 림프종 (lymphoma), 아세포종 (blastoma), 육종 (sarcoma), 및 백혈병 (leukemia) 또는 림프성 악성종양 (lymphoid malignancies)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예시는 방광암, 난소암, 흑색종, 편평세포암, 폐암 (소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평세포암을 포함), 복막암, 간세포암, 장 또는 위암 (위장암을 포함), 췌장암, 교아종, 대장암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양 (hepatoma), 유방암, 결장암, 대장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암(prostate cancer), 음문암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간세포 상피성암 (hepatic carcinoma) 및 머리와 목암 (head and neck cancer)의 다양한 종류 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (B-cell lymphoma) [경도/소낭 비호차칸송 림프종 (low grade/follicular non-Hodgkin's lymphoma; NHL); 소림프구성 (small lymphocytic; SL) NHL; 중등도/소낭 (intermediate grade/follicular) NHL; 중등도 확산 (intermediate grade diffuse) NHL; 고도 면역아세포성 (high grade immunoblastic) NHL; 고도 림프아세포성 (high grade lymphoblastic) NHL; 고도 소비절단세포 (high grade small non-cleaved cell) NHL; 거대질환 (bulky disease NHL); 맨틀세포 림프종 (mantle cell lymphoma); AIDS-관련 림프종 (AIDS-related lymphoma); 및 발덴스트롬성 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's Macroglobulinemia)]; 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia; CLL); 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia; ALL); 모발세포 백혈병 (Hairy cell leukemia); 만성 골수아세포 백혈병 (chronic myeloblastic leukemia); 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 이식후 림프증식성 장애 (post-transplant lymphoproliferative disorder; PTLD)], 뿐만 아니라 모반증 (phakomatoses), 부종 (edema) (뇌종양과 관련된 것과 같은), 및 메이그 증후군 (Meigs' syndrome)과 관련된 비정상적인 혈관증식을 포함한다. 바람직하게, 상기 암은 유방암, 대장암 (colorectal cancer), 직장암 (rectal cancer), 비소세포폐암, 비호치킨성 림프종 (NHL), 신세포암 (renal cell cancer), 전리선암, 간암, 췌장암, 연조직육종 (soft-tissue sarcoma), 카포시 육종 (kaposi's sarcoma), 암양종암 (carcinoid carcinoma), 머리 및 목 암, 흑색종, 난소암, 중피종 (mesothelioma) 및 다발성 골수종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예시적 실시예에서, 상기 암은 초기 진행성 (전이성 포함) 방광암, 난소암 또는 흑생종이다. 또 다른 실시예에서, 상기 암은 대장암 (colorectal cancer)이다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 상기 암 질병은 전이성 암 (metastatic cancer)을 포함하고, 여기에서 골수유래억제세포 (myeloid derived suppressor cellsl MDSCs)에 의한 VISTA 발현은 항종양 반응 및 항-침식성 (anti-invasive) 면역반응을 억제한다. 본 발명의 상기 방법은 특히 혈관성 종양의 치료에 적합하다.
또한, 본 발명은 화학요법 (chemotherapy) 또는 방사선요법 (radiotherapy) 또는 다른 생물학적 요법과 병행한 암 치료를 위해 및 그것의 활성을 증진시키기 위해, 즉 골수유래억제세포에 의한 VISTA 발현이 항종양 반응 및 화학요법 또는 방사선요법의 효능 또는 생물학적 효능을 억제하는 개인에서 적합하다. 어떤 항암 활성을 나타내는 화학요법제는 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 화학요법제는 알킬화제 (alkylating agents), 항대사체 (antimetabolites), 엽산 유사체 (folic acid analogs), 피리미딘 유사체 (pyrimidine analogs), 퓨린 유사체 (purine analogs) 및 관련된 억제제, 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloids), 에피포도필로독소 (epipodopyyllotoxins), 항생제 (antibiotics), L-아스파라기나아제 (L-Asparaginase), 토포이소머라아제 억제제 (topoisomerase inhibitor), 인터페론 (interferons), 백금 조합 복합체 (platinum coordination complexes), 안트라세네디온 대체 요소 (anthracenedione substituted urea), 메틸 하이드라진 유도체 (methyl hydrazine derivatives), 부신피질 억제제 (adrenocortical suppressant), 부신피질스테로이드 (adrenocorticosteroides), 프로게스틴 (progestins), 에스트로겐 (estrogens), 항에스트로겐 (antiestrogen), 안드로겐 (androgens), 항안드로겐 (antiandrogen), 및 성선자극호르몬-분비 호르몬 유사체 (gonadotropin-releasing hormone analog)로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 화학요법제는 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil; 5-FU), 루코보린 (Ieucovorin; LV), 이레노테칸 (irenotecan), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 카페시타빈 (capecitabine), 파클리탁셀 (paclitaxel) 및 독세탁셀 (doxetaxel)의 군으로부터 선택된다. 두 개 또는 그 이상의 화학요법제는 항-VEGF 항체의 투여와 함께 주입되는 칵테일에서 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 병용 화학요법은 플루오르우라실-기반이고, 이것은 5-FU 및 하나 또는 그 이상의 다른 화학요법제를 포함한다. 병용 화학요법의 적절한 치료용량은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들면 Saltz et al. (1999) Proc ASCO 18:233a and Douillard et al. (2000) Lancet 355: 1041-7에 기술되어 있다. 상기 생물학적 요법은 PD-Ll, PD-L2, CTLA-4 및 PD-L1, PD-L2, CTLA-4 융합 단백질 뿐만 아니라 사이토카인, 성장인자 길항제 및 작용제, 호르몬 및 항-사이토카인 항체와 같은 잠재적 면역 개시자 (immune potentiator) 일 수 있다.
수용체와 결합하는 PD-L3 또는 VISTA 분자의 형태에 따라, 신호는 전달될 수도 있고 [예를 들면, 상기 수용체의 교차연결 (crosslinking)을 야기시키는 PD-L3 또는 VISTA의 다가체(multivalent form)에 의해 또는 항원제시세포에 있는 Fc 수용체와 결합하는 PD-L3 또는 VISTA의 용해체 (soluble form)에 의해] 또는, 예를 들면 상기 수용체와 결합하기 위한 PD-L3 또는 VISTA 분자의 활성화 형태와 경쟁함으로써 억제될 수도 있다 [예를 들면, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 항원제시세포에 있는 Fc 수용체와 결합하지 않도록 변경한, PD-L3 또는 VISTA 분자의 용해성 단가체 (monovalent form) 또는 PD-L3 또는 VISTA의 용해체에 의해서]. 하지만, 용해성 분자가 자극적 (stimulatory) 일 수도 있는 예가 있다. 상기 다양한 조절제의 효과는 여기에서 기술되는, 일반적인 스크리닝 검사를 사용하여 쉽게 기술될 수 있다.
여기에서 사용되는 "활성화 수용체"라는 용어는 항원, 복합적 항원 (예를 들면, MHC 분자의 맥락에서), 또는 항체와 결합하는 면역세포 수용체를 포함한다. 상기 활성화 수용체는 T 세포 수용체 (TCRs), B 세포 수용체 (BCRs), 사이토카인 수용체, LPS 수용체, 보체 수용체 및 Fc 수용체를 포함한다.
예를 들면, T 세포 수용체는 T 세포에 존재하고 CD3 분자와 관련이 있다. T 세포 수용체는 MHC 분자의 맥락에서 항원에 의해 (뿐만 아니라 다클론 T 세포 활성제에 의해) 자극된다. TCR을 통한 T 세포 활성화는 많은 변화, 예를 들면 단백질 인산화 (phosphorylation), 막지질 변화 (membrane lipid changes), 이온 이동(flux), 고리형 뉴클레오티드 변형 (cyclic nuleotide alteration), RNA 전사 변화, 단백질 합성 변화, 및 세포 부피 변화를 야기시킨다.
여기에서 사용되는 "B 세포 수용체" (BCR)의 용어는 B 세포에서 발견되는 막 Ig (membrane Ig; mIg) 및 다른 막관통 폴리펩피드 (예를 들면, Ig 알파 및 Ig 베타)사이의 복합체를 포함한다. mIg의 신호전달기능은 올리고머 (oligomeric) 또는 다합체 (multimeric) 항원에 의한 수용체 분자의 교차연결에 의해 발생한다. 또한, B 세포는 항-면역글로불린 항체에 의해 활성화될 수 있다. BCR 활성화 후, 티로신 인산화 (tyeosine phosphorylation)를 포함한 많은 변화가 B 세포 내에서 발생한다.
"Fc 수용체" (FcRs)의 용어는 면역글로불린 분자 (Igs)의 Fc 부분에 대한 세포표면 수용체를 포함한다. Fc 수용체는 면역반응에 참여하는 많은 세포에서 발견된다. 지금까지 동정된 인간 FcRs는 IgG (Fc 감마. R로 명명) IgE (Fc 입실론 Rl), IgA (Fc 알파 R), 및 다합체 IgM/A (Fc.뮤. .알파. R)가 있다. FcRs는 하기 세포종류에서 발견된다: Fc 입실론 (epsilon) RI (비만세포), Fc 입실론. RII (많은 백혈구), Fc 알파. R (호중구), 및 Fc 뮤(mu) 알파. (alpha) R [선상상피 (glandular epithelium), 간세포 (hepatocytes)] (Hogg, N. (1988) Immunol. Today 9: 185-86). 널리 연구되는 Fc 감마(gamma) Rs는 세포성 면역 방어의 중심에 있고, 자가면역질환의 발병과 관련된 염증 및 가수분해효소의 매개체 분비를 자극하는 것을 담당한다 (Unkeless, J. C (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:251 -87). Fc 감마 Rs는 대식세포/단핵구, 다형핵 백혈구 및 자연살해세포 (natural killer; NK) Fc 감마 Rs가 Ig G에 의해 매개되는 특이적 인지 (specific recognition)의 구성요소를 제공하기 때문에, 작용기 세포 및 Ig를 분비하는 백혈구 사이에서 중요한 연결을 제공한다. 인간 백혈구는 Ig G에 대해 최소 3개의 상이한 수용체를 가진다: hFc 감마 RI (대식세포/단핵구에서 발견), hFc 감마 RII (단핵구, 호중구, 호산구, 혈소판, 가능하게는 B 세포, 및 K562 세포주에서), 및 Fc 감마 (NK 세포, 호중구, 호산구, 및 대식세포에서).
T 세포에 대하여, T 세포로 공동자극신호의 전달은 사이클로스포린 A (cyclosporin A)에 의해 억제되지 않는 신호경로와 관련이 있다. 또한, 공동자극신호는 T 세포에서 사이토카인 (예를 들면 IL-2 및/또는 IL-10) 분비를 유도할 수 있고 및/또는 항원에 대한 무반응의 유도, 아너지의 유도, 또는 T 세포 내의 세포사멸의 유도를 방지할 수 있다,
여기서 사용되는, "억제성 신호"의 용어는 면역세포에 있는 억제성 수용체 분자를 통해 전달되는 신호를 의미한다. 상기 신호는 활성화 수용체 (예를 들면, TCR, CD3 BCR, 또는 Fc 분자를 통한)를 통한 신호를 길항하고, 예를 들어, 하기를 초래할 수 있다: 2차 전달자 (second messenger) 형성; 증식; 또는, 예를 들면 감소된 대식작용, 항체 생산, 또는 세포성 세포독성과 같은 면역세포에서의 작용기 기능, 또는 매개체 [예를 들면, 사이토카인 (예를 들면 IL-2) 및/또는 알러지 반응의 매개체]를 생산하는 면역세포의 장애; 또는 아너지의 발달.
여기서 사용하는, "무반응(unresponsiveness)"는 자극, 예를 들면 활성화 수용체 또는 사이토카인을 통한 자극에 대한 면역세포의 무반응상태 (refractivity)를 포함한다. 무반응은, 예를 들면 면역억제제에 대한 노출 또는 항원의 고농도에 때문에 발생할 수 있다.
여기서 사용하는, "아너지 (anergy)" 또는 "내성 (tolerance)"라는 용어는 활성화 수용체-매개 자극에 대한 무반응 상태를 포함한다. 상기 무반응 상태는 일반적으로 항원-특이적이고 내성화 항원 (tolerizing antigen)에 대한 노출이 중지된 후에도 지속된다. 예를 들면, T 세포내에서 아너지 (무반응상태와 대조적인)는 사이토카인, 예를 들면 IL-2 형성의 결여에 의해 특징화된다. T 세포 아너지는 T 세포가 항원에 노출될 때 발생하고 2차 신호 (공동자극신호)의 부재하에서 1차 신호 (T 세포 수용체 또는 CD3 매개신호)를 받는다. 이러한 조건하에서, 동일한 항원에 대한 상기 세포의 재노출은 (비록 2차 신호는 공동자극 분자의 존재하에 발생하였다 하더라도) 사이토카인의 형성 실패를 야기하며, 따라서 증식에 실패한다. 하지만, 아너지 T 세포는 관련없는 항원에 대한 반응에는 도달할 수 있고 사이토카인 (예를 들면, IL-2)과 함께 배양되면 증식될 수 있다. 또한, 예를 들면, T 세포 아너지는 ELISA를 사용하여 측정하거나 또는 지표 세포주 (indicator cell line)을 사용한 증식검사 (proliferation assat)를 사용함으로써 T 림프구에 의한 IL-2 형성의 결여에 의해 관찰될 수 있다. 또는, 수용체 유전자 구조체 (construct)를 사용할 수 있다. 예를 들면, 아너지 T 세포는 5' IL-2 유전자의 조절하에, 이종기원의 프로모터에 의해 또는 인핸서 (enhancer) 내에서 발견될 수 있는 API 서열의 다중체 (multimer)에 의해 유도된 IL-2 유전자 전사를 개시하는데 실패한다 (Kang et al. (1992) Science 257:1 134).
공동자극신호의 조절은 면역세포의 작용기 기능의 조절을 초래한다. 따라서, "PD-L3 또는 VISTA 활성"의 용어는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 그 자연적 결합 파트너와 결합할 수 있는 능력, 면역세포 공동자극 또는 억제성 신호를 조절할 수 있는 능력, 및 면역반응을 조절할 수 있는 능력을 포함한다.
면역세포 내에서 억제성 신호의 조절은 증식 및/또는 면역세포에 의한 사이토카인 분비의 조절을 초래한다.
여기서 사용하는, "자연적으로-발생한" 핵산 분자는 자연에서 발생하는 뉴클레오티드 서열 (자연적 단백질을 암호화하는)을 가지는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다.
여기서 사용되는, "안티센스 (antisense)" 핵산분자는 단백질을 암호화하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들면 이중나성 cDNA 분자의 암호선 (coding strand)에 상보적인, mRNA 서열에 상보적인, 또는 유전자의 암호선에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산분자는 센스 핵산분자와 수소결합할 수 있다.
여기서 사용되는, "암호화 부위 (coding regions)"이라는 용어는 아미노산 잔기로 번역되는 코돈 (codon)을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 부위를 의미하고, 반면에 "비암호화 부위 (noncoding region)"는 아미노산으로 번역되지 않은 뉴클레오티드 서열의 부위 (예를 들면, 5' 및 3' 비번역 부위)를 의미한다.
여기서 사용되는, "벡터 (vector)"라는 용어는 또 다른 핵산분자를 연결된 곳으로 이동시킬 수 있는 핵산분자를 의미한다. 벡터의 한 종류는 "플라스미드 (plamid)"이고, 이것은 추가적 DNA 부분이 연결될 수 있는 원형 이중 나선 DNA 루프 (circular double stranded DNA loop)를 의미한다. 벡터의 또 다른 종류는 바이러스 벡터이고, 여기에서 추가적 DNA 부분은 바이러스 게놈 (genome)으로 연결될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주세포내에서 자체 복제할 수 있다 [예를 들면, 박테리아 복제원점 및 에피솜 포유류 벡터 (episomal mammalian vectors)를 가지고 있는 박테리아 벡터]. 다른 벡터 [예를 들면, 비에피솜 포유류 벡터 (non-episomal mammalian vector)]는 숙주세포에 도입된 후에 숙주세포의 게놈으로 통합됨으로써 숙주 게놈에 따라 복제된다. 또한, 특정 벡터는 유전자 발현을 조작적으로 연결시킬수 있다. 여기서 상기 벡터는 "재조합 발현벡터" 또는 단순하게 "발현벡터"를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서의 발현벡터의 유용성은 종종 플라스미드의 형태이다. 본 발명의 구체적인 내용에서, 플라스미드가 가장 이란적인 벡터형태이기 때문에 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명은 상기 발현벡터의 다른 형태, 예를 들면 바이러스 벡터 [예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스 (replication defective retroviruses), 아데노바이러스 (adenoviruses) 및 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated viruses)]도 포함하고, 이는 동일한 기능을 한다.
여기서 사용되는, "숙주세포"라는 용어는 본 발명의 핵산분자, 예를 들면 본 발명의 재조합 발현벡터가 도입되는 세포를 의미한다. "숙주세포" 및 "재조합 숙주세포"라는 용어는 여기에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특정 개체의 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 자손 (progeny) 또는 가능성이 있는 자손까지 의미한다는 것이 이해되어야만 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 연속되는 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 실제로 상기 자손은 모세포 (parent cell)과 동일하지 않을수도 있으나, 여기에서 사용되는 용어의 관점 내에 포함된다.
여기에서 사용되는, "형질도입 동물 (transgenic animal)"은 비인간 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 생쥐를 의미하고, 여기에서 상기 동물의 하나 또는 그 이상의 세포는 "도입유전자 (transgene)"를 포함한다. 상기 "도입 유전자"라는 용어는 형질도입 동물에서 발달한 세포의 게놈으로 통합되고 상기 성숙한 동물, 예를 들면 형질도입 동물의 하나 또는 그 이상의 세포 또는 조직에서 암호화된 유전자 생산물의 발현하는 동물의 게놈에 남아있는 외생적 (exogenous) DNA를 의미한다.
여기에서 사용되는, "상동 재조합 동물 (homologous recombinant animal)"은 형질도입 비인간 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 생쥐의 종류를 의미하고, 여기에서 내생적 유전자는 내생적 유전자 및 상기 동물의 세포, 예를 들면 상기 동물이 발달하기 이전에 상기 동물의 배아세포 (embryonic cell)로 도입된 외생적 DNA 분자 사이의 상동 재조합에 의해 변형된 것이다.
여기에서 사용된, "분리된 단백질 (isolated protein)"이라는 용어는 대개 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나 또는 세포로부터 분리되었을 때 다른 단백질, 세포물질 및 배지이 없거나, 또는 화학적으로 합성되었을 때 화학적 선구체 (chemical precursors) 또는 다른 화학물질이 대개 없는 단백질을 의미한다.
"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 그것의 생물학적 활성 부분은 대개 PD-L3 또는 VISTA 단백질이 유래된 세포 또는 조직으로부터의 세포물질 또는 다른 오염 단백질이 없거나, 또는 화학적으로 합성되었을 때 화학적 선구체 또는 다른 화학물질이 대개 없는 것이다. "세포물질이 대개 없다"라는 표현은 단백질이 분리되거나 또는 재조합적으로 생산된 세포의 세포구성물질로부터 분리된 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다. 어떤 실시예에서, "대개 세포물질이 없다"라는 표현은 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질 (또는 여기에서 "오염 단백질"이라고 표현됨)의 약 30% (건량에 의해) 이하, 보다 바람직하게는 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질의 약 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질의 약 10% 이하, 가장 바람직하게는 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질의 약 5% 이하를 가지는 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 단백질 또는 그것의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생산되었을 때, 또한 대개 배지가 없는 것이 바람직하다. 즉, 배지는 단백질 준비 부피의 약 20% 이하, 보다 바람직하게는 약 10%이하, 가장 바람직하게는 약 5% 이하를 나타낸다.
"대개 화학적 선구체 또는 다른 화학물질이 없다"라는 표현은 단백질의 합성과 관련된 화학적 선구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다. 어떤 실시예에서, "대개 화학적 선구체 또는 다른 화학물질이 없다"라는 표현은 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 30% (건량에 의해) 이하, 보다 바람직하게는 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 10% 이하, 가장 바람직하게는 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 5% 이하를 가지는 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다.
여기서 사용되는, "항체"라는 용어는 항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순히 "항원 부분") 뿐만 아니라 항원분자 전체를 포함한다. 여기서 사용되는, "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA)와 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 또는 그 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 항체 전장 (full-lenth)의 부분에 의해 수행되는 것이 보여졌다. 항체의 "항원-결합 부분" 내에서 포함되는 결합 단편의 예시는 (i) VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 구성된 1가 (monovalent) 단편인 Fab 단편; (ii) 경첩부위 (hinge region)에서의 이황화결합 (disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2다 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CHI 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔 (single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341 :544-546); 및 (vi) 분리된 상보성결정부위 (complementarity determining region; CDR)를 포함한다. 또한, 비록 Fv 단편의 도메인인 VL 및 VH가 분리된 유전자에 의해 암호화되어있어도, 그들은 재조합 방법을 사용하여 1가 분자를 형성하기 위해 VL 및 VH 부위가 쌍 (pair)으로 되어있는, 단일 단백질 쇄 (single protein chain)로 만들어지는 것을 가능하게 하는 합성 링커 (synthetic linker)에 의해 연결될 수 있다 (단일사슬 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들면, Bird et al. (1 88) Science 242:423- 426; and Huston et al. (1988) Proc Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Osbourn et al. 1998 Nat. Biotechnol. 16:778 참조). 또한, 상기 단일사슬 (single chain) 항체는 항체의 "항원-결합 부위"라는 용어 내에 포함된다. 특이적 scFv의 어떤 VH 및 VL 서열은 완전한 IgG 분자 또는 다른 아형 (isotype)을 암호화하는 발현벡터를 형성하기 위하여, 인간 면역글로불린 불변부위 cDNA 또는 유전체 서열과 연결될 수 있다. 또한, VH 및 VL은 단백질 화학(protein chemistry) 또는 재조합 DNA 기술 중 하나를 이용하여 Fab, Fc 또는 면역글로불린의 다른 단편의 형성에서 사용될 수 있다. 단일사슬 항체의 다른 형태, 예를 들면 디아바디 (diabodies)도 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬에 발현되었지만, 동일한 사슬에서 2개의 도메인 사이의 쌍만들기 (pairing)를 가능하게 하기에는 많이 짧은 링커 (linker)를 사용함으로써, 또 다른 사슬의 상보적 도메인에 쌍을 이룰 수 있도록 하여 상기 도메인이 두 개의 항원결합부위를 생성하도록 만든, 2가, 이중특이적 항체이다 (예를 들면, Holliger, P. et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J. et al. ( 1994) Structure 2:1 121-1 123 참조).
또한, 항체 또는 그것의 항원-결합 부위 부분은 상기 항체 또는 항체 부분을 하나 또는 그 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 공유결합 또는 비공유결합에 의해 형성된, 보다 큰 면역부착분자의 부분일 수 있다. 상기 면역부착분자 (immunoadhesion molecules)의 예시는 4분자체 (tetramer) scFv 분자를 만들기 위해 스트렙토아비딘 중심 부위의 사용 (Kipriyanov, S. M. et al. (1995) Hum. Antibodies Hybridomas 6:93-101), 및 2가 및 바이오틴화 (biotinylated) sc Fv 분자를 만들기 위해 시스테인 (cystein) 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그 (polyhistidine tag)의 사용 (Kipriyanov, S. M. et al. (1994) Mol Immunol. 31 : 1047-1058)을 포함한다. 항체부분, 예를 들면 전체 항체의 Fab 및 F(ab')2 단편은 보편적인 기술, 예를 들면 각각 파페인 (papain) 또는 펩신 절단 (pepsin digestion)을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체부분 및 면역부착분자는 여기에서 기술되는, 일반적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
항체는 다클론 또는 단일클론: 이종발생성 (xenogeneic), 동종이계성 (allogeneic), 또는 동종동계성(syngeneic); 또는 그것의 변형된 형태, 예를 들면 인간화, 키메라화 (chimeric) 등 일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 특이적으로 또는 매우 특이적으로 PD-L3 또는 VISTA 분자와 결합한다. 여기서 사용되는 "단일클로항체" 및 "단일클론항체 조성물"의 용어는 항원의 특정 에피토프 (epitope)에 면역반응을 할 수 있는, 오직 한 종 (species)의 항원결합부위를 포함하는 항체분자의 집단을 의미하는 반면, "다클론항체" 및 "다클론항체 조성물"이라는 용어는 항원의 특정 에피토프에 면역반응을 할 수 있는, 다수 종 (species)의 항원결합부위를 포함하는 항체분자의 집단을 의미한다. 단일클론항체 조성물은 일반적으로 면역반응을 하는 특정 항원에 대한 단일 결합 친화력 (affinity)를 나타낸다.
여기서 사용하는 "인간화된 항체"라는 용어는 인간세포에 의해 만들어질 수 있는 항체를 보다 가깝게 모방하도록 변형된 가변 (variable) 및 불변 (constant) 부위를 가지는, 비인간세포에 의해 만들어진 항체를 포함한다. 예를 들면, 비인간 항체 아미노산 서열을 인간 배선 면역글로불린 서열 (human germline immunoglobulin sequences)에서 발견되는 아미노산 서열로 변형시킨다. 본 발명의 인간화된 항체는, 예를 들면 CDRs에서 인간 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 [예를 들면, 시험관내에서 무작위 또는 위치-지향적 돌연변이형성 (random or site-specific mutagenesis) 또는 생체내에서 체세포 돌연변이 (somatic mutation)]를 포함할 수 있다. 또한, 여기서 사용되는 "인간화된 항체 (humanized antibody)"라는 용어는 또 다른 포유류, 예를 들면 생쥐 같은 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간구조서열 (human framework sequences)로 이식된 항체를 포함한다.
여기서 사용되는, "분리된 항체 (isolated antibody)"는 상이한 항원 특이성 을 가지는 다른 항체가 대개 없는 항체를 의미한다 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA와 결합하는, 분리된 항체는 대개 PD-L3 또는 VISTA가 아닌 다른항체와 특이적으로 결합하는 항체가 없다). 또한, 분리된 항체는 다른 세포물질 및/또는 화학물질이 대개 없다.
여기에서 "올리고머화 도메인 (oligomerization domai)"은 VISTA 세포외 도메인 또는 그것의 단편과 결합할 때 올리고마화를 촉진시키는 도메인을 의미한다. 상기 올리고머화 도메인은 추가적 이황화 결합에 의해 추가적으로 안정화 될 수 있는, 자기-관련 .알파. -헬릭스 (self-associating .alpha. -helics), 예를 들면 루신 지퍼 (leucine zipper)를 포함한다. 상기 도메인은 생체내에서 기능적 결합 단백질 (functional binding protein)로 폴리펩티드의 접힘을 촉진시키기 위한 것이라고 생각되는 과정인, 막을 넘어서 벡터성 접힘 (vectorial folding)과 공존할 수 있도록 디자인되었다. 그것의 예시는 당업계에 알려져 있고 하나의 예시로서 코일 (coiled) GCN4 및 COMP를 포함한다.
상기 .알파.-헬리칼 또꼬인 나선 (.alpha. -helical coiled coil)은 아마도 가장 널리 퍼진 단백질에서 발견되는 올리고머화 모티프 하위단위 (subunit)일 것이다. 따라서, 또꼬인 나선은 다양한, 상이한 기능을 만족시킨다. 예를 들면, 몇 계 (family)의 전사활성제 (transcriptional activators)에서, 짧은 루신 지퍼는 DNA-결합 부위를 DNA에 배치하는데 매우 중요한 역할을 한다 (Ellenberger et al., 1992, Cell 71 :1223-1237). 또한, 또꼬인 나선은 중간섬유 단백질 (intermediate filament protein)의 올리고머를 형성하기 위해 사용된다. 또한, 또꼬인 나선 단백질은 소낭 (vesicle) 및 바이러스 막융합 모두에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다 (Skehel and Wiley, 1998, Cell 95:871-874). 두가지 경우에, 융하될 막에 들어갈 소수성 서열은 막대-모양 복합체 (rod-shaped complex)의 동일한 말단에 위치한다. 이러한 분자배열은 상기 복합체가 막융합을 위해 조립되기 위해서 막 가까운 위치를 초래하기 위한 것으로 간주된다. 상기 또꼬인 나선은 종종 올리고머화를 조절하기 위해 사용된다. 이것은 그 중에서도 GCN4, 바이러스 융합 펩티드, SNARE 복합체 및 특정 tRNA 합성효소 (synthetase)를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는, 많은 종류의 단백질에서 발견된다. 트로포미오신 (tropomyosin), 중간 섬유 및 스핀들-폴-바디 구성요소 (spindle-pole-body component)와 같은 단백질에서 매우 긴 또꼬인 나선이 발견된다. 또꼬인 나선은 평행 또는 역평행 방향에서 관련있는 매우 정돈된 방법으로 서로 주위에 초나선 (supercoiled)된 많은 .알파.-헬릭스와 연관이 있다. 비록 이량체 (dimer) 및 삼량체 (trimer)가 가장 흔하지만, 상기 헬릭스는 동일하거나 또는 상이한 단백질로부터 있을 수 있다. 또꼬인 나선은 그들의 소수성 경계선 (hydrophobic seams)을 묻기 귀해 함께 따라오는 헬릭스 구성요소에 의해 형성될 수 있다. 상기 소수성 경계선은 각 헬릭스 (helix) 주위를 두르고 있고, 상기 헬릭스 또한 서로를 감기위해 두르고 있으며, 소수성 경계선을 묻어서, 초나선을 형성한다. 이것은 knobs-into-holes packing로 알려진, 또꼬인 나선의 구조로 정의되는, 이웃한 헬릭스 사이에서 측쇄 (side chain)의 특징적 지상돌기접착 (interdigitation)이다. 상기 헬릭스는, 비록 평행 형태 (conformation)가 보다 일반적이지만, 발생되는 이러한 종류의 상호결합을 위해 동일한 방향을 향할 필요가 없다. 삼량체 및 오량체 (pentamer)에서 역평행 형태는 매우 희귀하지만, 분자사이의 이량체에서는 보다 흔하고, 여기에서 두 헬릭스는 종종 짧은 루프 (loop)에 의해 연결된다. 세포외 공간에서, 상기 이종삼량체 또꼬인-나선 단백질 라미닌 (heterotrimeric coiled-coil protein laminin)은 기저막 (basement memebrane)의 형성에서 중요한 역할을 한다. 다른 예시는 트롬보스폰딘 (thrombospondins) 및 카트리지 올리고머 매트릭스 단백질 (cartilage oligomeric matrix protein; COMP)이고, 여기에서 세가지 (트로모스폰딘 1 및 2) 또는 다섯개 (트로모스폰딘 3, 4 및 COMP) 사슬이 연결된다. 상기 분자는 꽃 부케-유사 모양을 가지고 있고, 이러한 올리고머 구조의 원인은 아마도 세포 수용체와 상기 C-말단 도메인의 다가 상호결합 (multivalent interaction)일 것이다. 효모 전사 활성제 (yeast transcriptional activator) GCN4는 기저 부위 루신 지퍼 (basic region leucine zipper; bZIP) DNA-결합 모티프를 포함하는, 30개의 동정된 진핵세포 단백질의 하나이다 (Ellenberger et al., 1992, Cell 71 : 1223-1237). bZIP 이량체는 그들의 카복실-말단 34 잔기에서 평행적 또꼬인-나선을 형성하고 DNA 결합 부위의 깊은 홈 (major groove)을 통과하기 위해 그들의 아미노 말단을 향해 점차적으로 분기되는, 연속적인 알파 헬릭스의 쌍이다. 상기 또꼬인-나선 이합체화 접점은 거의 DNA 축에 대해 수직을 향하고, T 문자 모양의 복합체를 형성한다. bZIP은 평행한 알파-헬릭스 또꼬인-나선에서 함께 모으기 위해서 소수성 및 비극성 잔기의 4-3 7 반복을 포함한다 (Ellenberger et al., 1992, Cell 71 : 1223-1237). 이량체의 안정성은 7 반복의 a 및 d 위치에서 측면마다의 루신 및 비극성 잔기의 조밀성, 및 GCN4 루신 지퍼 펩티드 (leucine zipper peptide)의 결정구조에서 보여지듯이 (Ellenberger et al., 1992, Cell 71: 1223-1237), 헬릭스 내부 (inter-) 및 사이의 염다리 (salt bridges)의 제한된 개수에 의해 결정된다. 또 다른 예시는 Mr 52,000의 하위단위의 동삼량체 (homotrimer)로서, 소의 기관 카트리지 (bovine tracheal cartilage)로부터 분리된 CMP [매트릴린 (matrilin)-1]이고 (Paulsson and Heinegard, 1981 , Biochem J. 197:367-375), 여기에서 각각의 하위단위는 vWFAl 모듈 (module), 단일 EGF 도메인, vWFA2 모듈 및 5개의 7 반복 (heptads)에 걸친 또꼬인 나선 도메인으로 구성되어 있다 (Kiss et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:8126-8134; Hauser and Paulsson, 1994, J. Biol. Chem. 269:25747-25753). 정제된 CMP의 전자 현미경 (electron microscopy)는 부케-유사 삼량체 구조를 보이고, 여기에서 각각의 하위단위는 또꼬인 나선에 대응하는 일반적인 점으로부터 나타난 타원형을 형성한다(Hauser and Paulsson, 1994, J. Biol. Chem. 269:25747-25753). 메트릴린-1 내의 상기 또꼬인 나선 도메인은 광범위하게 연구되었다. 상기 삼합체 구조는 비변성 (non-denaturing) 조건하에서 사이사슬 (interchain) 이황화결합의 완전한 환원 후에 나타난다 (Hauser and Paulsson, 1994, J. Biol. Chem. 269:25747-25753). 또 다른 예시는 카트리지 올리고머 매트릭스 단백질 (Cartilage Oligomeric Matrix Protein; COMP)이다. 비-콜라겐성 당단백질 (non-collagenous glycoprotein)인 COMP는 카트리지에서 처음으로 동정되었다 (Hedbom et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:6132-6136). 상기 단백질은 4개의 상피성장인자 (epidermal growth factor; EGF)-유사 도메인 (EF), 7개의 칼슘-결하 도메인 (T3) 및 C-말단 구형 도메인 (TC)의 이후에 N-말단 7 반복 부위 (cc)로 구성된, 5개의 하부단위의, 524 kDa 동오량체 (homopentamer)이다. 이러한 도메인 구성에 따라서, COMP는 트로모스폰딘 계에 속한다. 바람직한 소수성 잔기 7 반복 (Heptad repeats, abcdefg)의 하위에는 a 및 d에서 헬릭스 또꼬인-나선 도메인을 형성한다 (Cohen and Parry, 1994, Science 263:488-489). 최근에, COMP의 재조합 5-선 또꼬인-나선 도메인 (recombinant five-stranded coiled-coil domain of COMP; COMPcc)는 결정화되었고 그것의 구조는 0.2 nm 해상도에서 보인다 (Malashkevich et al., 1996, Science 274:761-765).
"계 (family)"라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드 및 핵산분자를 의미할 때, 일반적인 구조 도메인 또는 모티프를 가지고 및 여기에서 정의되는 것으로서 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상동성이 충분히 있는, 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 또는 핵산분자가 의미하려는 의도를 가진다. 상기 계 멤버는 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생할 수 있고 및 동일하거나 또는 상이한 종의 하나로부터 있을 수 있다. 예를 들면, 계는 인간기원의 첫 폴리펩티드 및 다른, 뚜렷한 인간기원의 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 또는 비-인간 기원의 상동체 (homologues), 예를 들면 원숭이 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 계의 멤버는 일반적인 기능적 특징을 가질 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 PD-L3 및 VISTA 폴리펩티드의 계는 바람직하게는 최소 하나의 "신호펩티드 도메인"을 포함한다. 여기에서 사용되는 "신호서열" 또는 "신호펩티드"는 분비형 및 막결합 폴리펩티드의 N-말단에서 일어나고 및 소수성 아미노산 잔기를 많이 포함하는, 15 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함한다. 예를 들면, 신호서열은 최소 약 10-30개의 아미노산 잔기를 포함하고, 바람직하게는 약 15-25개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 18-20개의 아미노산 잔지, 보다 더 바람직하게는 약 19개의 아미노산 잔기를 가지며, 상기 신호서열은 소수성 아미노산 잔기 [예를 들면, 발린 (valine), 루신 (leucine), 이소루신 (isoleucine) 또는 페닐알라닌 (phenylalanine)]를 최소 약 35-65%, 바람직하게는 약 38-50%, 보다 바람직하게는 약 40-45%를 가진다. 상기 "신호서열"은 또한 당업계에서 "신호펩티드"로서 불러지고 지질이중막 (lipid bilayer)로 상기 서열을 포함한 폴리펩티드를 향하게 하는 기능을 하며, 분비형 및 막결합 폴리펩티드 형태로 절단된다. 하기 기술되는 것과 같이, 신호서열은 본 인간 PD-L3 또는 VISTA (native human PD-L3 또는 VISTA)의 아미노산 서열에서 동정되었고, 또한 본 생쥐 PD-L3 또는 VISTA (native mouse PD-L3 OR VISTA)의 아미노산 거열에서 동정되었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 "막관통 도메인 (transmembrane domain)"의 존재를 기본으로 동정되었다. 여기서 사용되는 "막관통 도메인"은 원형질막 (plasma membrane)을 통과하는, 길이가 약 15개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 막관통 도메인은 최소 약 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45 개의 아미노산 잔기를 포함하고 원형질막을 관통한다. 막관통 도메인은 소수성 잔기가 많고, 일반적으로 알파-헬릭스 구조는 가진다. 바람직한 실시예에서, 막관통 도메인의 아미노산은 최소 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상이 소수성, 예를 들면 루신, 이소루신, 티로신 (tyrosine) 또는 트립토판 (tryptophan)이다. 예를 들면, 막관통 도메인은 Zagotta, W. N. et al. ( 1996) Annu. Rev. Neurosci. 19:235-263에 기술되어 있고, 이것은 여기에서 참고문헌으로 포함된다. PD-L3의 상기 막관통 도메인은 여기에서 동정된다 (예를 들면 도 1을 참조).
또 다른 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 분자는 상기 폴리펩티드 또는 이에 상응하는 핵산분자에서 "IgC 도메인"의 부재 (absence) 및 "IgV 도메인"의 존재를 기초하여 동정되었다. 여기에서 사용되는 IgV 및 IgC 도메인은 당업계에서 Ig대계 (Ig superfamily)로서 인지되어있다. 이러한 도메인은 Ig 폴드 (Ig folds)라고 불리는 뚜렷한 접힙양상 (folding pattern)을 가지는 구조단위 (structural unit)와 일치한다. Ig 폴드는 두개의 베타 병풍구조 (beta sheet)의 샌드위치를 포함하고, 각각은 대개, 하지만 모두는 아닌 도메인에서 상기 두 병풍구조 사이에서의 보존된 이황화결합을 가지는 5-10개의 아미노산의 역평행 베타선 (beta strand)으로 구성되어 있다. Ig, TCR, 및 MHC 분자의 IgC 도메인은 동일한 종류의 서열양상을 공유하고, Ig 대계에서 C1 세트라고 불린다. 다른 IgC 도메인은 다른 세트로 분류된다. 또한, IgV 도메인도 서열양상을 공유하고 V 세트 도메인이라고 불린다. IgV 도메인은 C-도메인보다 길고 베타선의 추가적 쌍을 형성한다. IgV 도메인으로 구성된, 상기 본 인간 및 생쥐 PD-L3 또는 VISTA 폴리페티드의 아미노산 잔기는 도 1에 보여진다. IgV 도메인의 존재는 PD-L3 또는 VISTA 또는 그것의 자연적 결합 파트너 (natural binding partner)의 결합에 필수적인 것으로 보인다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 분자는 상기 폴리펩티드 또는 그에 상응하는 핵산분자에 있는 "세포외 도메인"의 존재를 기초로 동정되었다. 여기에서 사용되는 "세포외 도메인"의 용어는 세포 표면으로부터 꼬리로서 연장되어있는, N-말단 아미노산을 나타낸다. 본 발명의 세포외 도메인은 IgV 도메인을 포함하고 신호펩티드 도메인을 포함할 수 있다 (도 1 참조).
또 다른 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 분자는 상기 폴레핍티드 또는 그에 상응하는 핵산분자에 있는 "세포질 도메인 (cytoplasmic domain)"의 존재에 기초하여 동정되었다. 여기서 사용되는 "세포질 도메인"이라는 용어는 세포질 도메인을 구성한다고 예상되는, 세포의 세포질에서 꼬리로서 연장되어 있는 아미노산의 C-말단을 나타낸다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA는 최소 하나 또는 그 이상의 하기 도메인을 포함한다: 신호펩티드 도메인, IgV 도메인, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인.
본 발명의 분리된 폴리펩티드, 바람직하게는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 서열 번호: 2 or 4, 또는 5의 아미노산 서열과 충분하게 동일한 아미노산 서열을 가지고 또는 서열 번호: 1 또는 3 또는 그것의 단편 또는 상보적인 것과 충분하게 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 여기서 사용되는 "충분히 동일한"이라는 용어는 동일 (identical)하거나 또는 동등한 (equivalent) (예를 들면, 유사한 측쇄를 가지는 아미노산) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의, 충분한 또는 최소의 개수를 포함하는 첫 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열, 공통된 구조적 도메인 또는 모티프 및/또는 공통된 기능적 활성을 공유하는 첫번째 및 두번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예를 들면, 공통된 구조적 도메인을 공유하고, 상기 도메인의 아미노산 서열에서 최소 30%, 40% 또는 50% 상동성을 가지고, 바람직하게는 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%-80%, 보다 더 바람직하게는 90%-95%의 상동성을 갖고, 최소 하나 및 바람직하게는 두 개의 구조적 도메인 또는 모티프를 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 여기에서 충분히 동일하다고 정의된다. 또한, 최소 30%, 40% 또는 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70-80% 또는 90-95% 상동성을 공유하고 공통된 기능적 활성을 공유하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 여기에서 충분히 동일하다고 정의된다.
여기에서 상호교환적으로 사용되는 "PD-L3 또는 VISTA 활성", "PD-L3 또는 VISTA의 생물학적 활성" 또는 "PD-L3 또는 VISTA의 기능적 활성"은 PD-L3 또는 VISTA-반응 세포 또는 조직에서 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 결합 파트너에서, 생체내 또는 시험관내에서 일반적인 기술에 따라 결정되는 것에 따라서, PD-L3 또는 VISTA의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산분자에 의해 나타나는 활성을 의미한다. 이러한 활성은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식 및 사이토카인 생성을 조절하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 활성은 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 관련된 것과 같은 직접적 활성이다. 여기에서 사용되는, "표적 분자" 또는 "결합 파트너 (binding partner)"는 자연에서, 즉 T 세포에 발현된, PD-L3 또는 VISTA-대개 기능이 이루어질 수 있는, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드가 결합하거나 상호작용하는 분자이다. 또는, PD-L3 또는 VISTA 활성은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에 의해 매개되는 세포신호활성과 같은 간접적 활성이다. PD-L3 또는 VISTA의 생물학적 활성은 여기에서 기술된다, 예를 들면, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 및 PD-L3 또는 VISTA 작용제 또는 길항제는 하나 또는 그 이상의 하기 활성을 가질 수 있다: (1) CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 억제 또는 촉진한다, (2) 사이토카인 생성을 억제 또는 촉진시킨다, (3) T 세포 및 골수 유래 APCs 사이에서 연계 상호결합 (cognate interactions)하는 동안에 T 세포 반응을 음성적으로 조절하는 조절 리간드 (regulatory ligand)로서의 기능을 한다, (4) 세포자멸사 (apoptosis)에는 최소한의 영향을 미치면서 초기 TCR 활성화를 억제하고 세포분열을 중지시킴 (arresting)으로써 CD4+ T 세포를 음성적으로 조절한다, (5) APCs 및 T 세포 사이에서 연계 상호결합하는 동안에 항원-특이적 T 세포 활성화를 억제 또는 촉진시킨다 및/또는 (6) T 세포-매개 면역반응을 억제 또는 촉진시킨다; (7) 면역세포, 예를 들면 T 림프구의 활성화를 조절한다, 및 (8) 면역반응, 예를 들면 생물체 (organism), 예를 들면 생쥐 또는 인간 생물체의 염증성 면역반응을 조절한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시예는 하나 또는 그 이상의 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는, 분리된 PD-L3 또는 VISTA 단백질 및 폴리펩티드를 특징으로 한다. 이러한 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 하기 도메인을 갖는, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 포함할 것이다: 신호 펩티드 도메인, IgV 도메인, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인, 및 바람직하게는 PD-L3 또는 VISTA 활성.
추가적으로 바람직한 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 최소 하나의 세포외 도메인, 및 하나 또는 그 이상의 신호펩티드 도메인, IgV 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 가질 수 있고, 및 바람직하게는 특정 혼성화 조건하에서, 여기에서 서열 번호: 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열의 상보적인 것을 포함하는 핵산분자와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산분자에 의해 암호화될 수 있다. 예시적인, 분리된 인간 및 생쥐 PD-L3 또는 VISTA cDNA의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 및 인간 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열은 여기에서 나열된 서열에 포함된다.
인간 VISTA 또는 PD-L3 또는 VISTA는 T 세포 전사 프로파일 스크리닝에서 상향조절되는 것으로 동정되었다. 생쥐 CD4+ T-세포 cDNA 라이브러리로부터 수득된 동일한 930 bp 유전자 생산물의 특징화는 상기 크기와 서열을 확인하였다. 실리코-서열 (Silico-sequence) 및 구조적 분석은 성숙된 후 309 아미노산의 종류 I 막관통 단백질인 것을 나타낸다. 이것의 세포외 도메인은 136 아미노산의 단일 세포외 Ig-V 도메인을 포함하고, 이것은 23-아미노산 줄기부위 (stalk region), 21-잔기 막관통 부분, 및 97-아미노산 세포질 도메인과 연결된다. VISTA의 세포질 꼬리는 어떠한 신호도메인도 포함하지 않는다. VISTA Ig-V 도도메인을 사용한 BLAST 서열 검색은 경계선 주요 e-가치 점수 (borderline significant e-value score)와 함께 진화적으로 가장 가까운 관련된 단백질로서, B7의 PD-L1을 동정해내었다. B7계 멤버 PD-Ll , PD-L2, B7-H3 및 B7-H4와 함께 구조적 기본 서열 배열은 모든 Ig-V 도메인 단백질에서 체계적으로 보존된, 몇가지 아미노산을 강조하였다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 부분의 구체적인 내용에서 기술된다.
I. PD - L3 또는 VISTA 분리된 핵산분자
본 발명의 한 측면은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자, PD-L3 또는 VISTA-암호화 핵산 분자 (예를 들면 PD-L3 또는 VISTA mRNA)를 동정하기 위한 혼성화 탐침 (hybridization probes)으로서 및 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자의 증폭 또는 돌여년이를 위한 PCR 프라이머로서 사용하기 충분한 핵산 단편을 포함한다. 여기에서 사용하는, "핵산분자"라는 용어는 DNA 분자 [예를 들면, cDNA 또는 유전체 DNA (genomic DNA)] 및 RNA 분자 (예를 들면, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체응 사용하여 생산된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 상기 핵산분자는 단일나선 또는 이중나선일 수 있지만, 바람직하게는 이중나선 DNA이다.
"분리된 핵산 분자"라는 용어는 상기 핵산분자의 자연적 근원에서 존재하는 다른 핵산분자로부터 분리된 핵산분자를 포함한다. 예를 들면, 유전체 DNA에 대해서, "분리된"이라는 용어는 상기 유전체 DNA (genomic DNA)가 자연적으로 관련된 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게, "분리된" 핵산분자는 상기 핵산이 유래된 생명체의 유전체 DNA에서, 자연적으로 상기 핵산 옆에 있는 유리된 서열이다 (즉, 핵산분자의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열). 예를 들면, 다양한 실시예에서, 상기 분리된 PD-L3 또는 VISTA 핵사분자는 상기 핵산분자가 유래된 세포의 유전체 DNA에서 자연적으로 핵산분자 측면에 있는 뉴클레오티드 서열이 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 이하인 것을 포함할 수 있다. 또한, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산분자는 대개 재조합 기술에 의해 생산된, 유리된 다른 세포물질 또는 배지일 수 있고, 또는 대개 화학적으로 합성될 때 유리된 화학적 선구체 또는 다른 화학물질 일 수 있다.
본 발명의 핵산분자는, 예를 들면 서열 번호: 1, 3 또는 그것의 부분을 가지는 핵산분자는 일반적인 분자생물학 기술 및 여기에서 제공되는 서열정보를 사용하여 분리될 수 있다. 서열 번호: 1 또는 3의 핵산서열의 전체 또는 부분을 혼성화 탐침으로서 사용하여, PD-L3 또는 VISTA 핵산분자를 일반적인 혼성화 및 클로닝 기술 (예를 들어, S. mefaus, ambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989에 기술된 것에 따라)을 사용하여 분리할 수 있다.
또한, 서열 번호: 1, 3 또는 이종상동체 (ortholog) 또는 변이의 전체 또는 부분을 포함하는 핵산분자는 서열 번호: 1 ,2, 3, 4 또는 5의 서열에 기반하여 고안된, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 중합연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 핵산분자는 주형 (template)으로 cDNA, mRNA, 또는 유전체 DNA를, 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머 이용하여 일반적인 PCR 증폭기술에 따라서 증폭될 수 있다. 상기 매우 증폭된 핵산분자는 적절한 벡터로 클론될 수 있고, DNA 서열 분석에 의해 특징화될 수 있다. 또한, PD-L3 뉴클레오티드 서열을 따른 올리고뉴클레오티드는 일반적인 합성 기술에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성자 (automated DNA synthesizer)를 사용하여 준비될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 핵산분자를 암호화하는 분리된 PD-L3 또는 VISTA는 서열 번호: 1 또는 3, 또는 그것의 단편에서 보여진 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시예세어, 본 발명의 상기 핵산분자는 서열 번호 1 또는 3 또는 상기 뉴클레오티드의 어떤 부분에서 보여지는 뉴클레오티드의 상보적인 핵산분자를 포함한다. 서열 번호: 1 또는 3에서 보여지는 뉴클레오티드 서열의 상보적인 핵산분자는 서열 번호: 1 또는 3에서 보여지는 뉴클레오티드 서열과 충분히 상보적인 것으로, 서열 번호: 1 또는 3 각각에서 보여지는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있고, 이로서 안정적인 이중체 (duplex)를 형성한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 서열 번호: 1 또는 3, 또는 이러한 뉴클레오티드 서열의 어떤 부분에서 보여지는 뉴클레오티드의 전체 길이와 최소 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 핵산분자는 서열 번호: 1 또는 3의 핵산서열의 부분만을, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 부분, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 탐침 또는 프라이머 또는 단편으로서 사용될 수 있는 단편을 포함할 수 있다. 인간 PD-L2 유전자의 클로닝으로부터 결정된 뉴클레오티드 서열은 다른 PD-L2계 멤버 뿐만 아니라 다른 종으로부터 PD-L3 또는 VISTA 상동체를 동정하거나 및/또는 클로닝하는데 사용하기 위해 고안된 탐침 및 프라이머의 생성을 가능하게 한다. 상기 탐침/프라이머는 일반적으로 상당히 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 일반적으로, 특정 조건하에서 서열 번호: 1 또는 3의 센스 서열; 서열 번호: 1, 3의 안티센스 서열, 또는 서열 번호: 1 또는 3의 자연적으로 발생된 대립유전자 변이 또는 돌연변이의 최소 약 12 또는 15, 바람직하게는 약 20 또는 25, 보다 바람직하게는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 75 개의 연속된 뉴클레오티드와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열의 부위를 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 핵산분자는 약 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 길이이고, 특정 혼성화 조건에서, 서열 번호: 1 또는 3, 또는 그것의 상보적인 것의 핵산분자와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산분자는 약 880-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 길이이고, 특정 혼성화 조건에서, 서열 번호: 1 또는 3, 또는 그것의 상보적인 것의 핵산분자와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산분자는 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 길이이고, 특정 혼성화 조건에서, 서열 번호: 1 또는 3의 암호화부위, 또는 그것의 상보적인 것을 포함하는 핵산분자와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산분자는 약 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 850-900, 900-950개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 서열 번호: 1 또는 3의 암호화부위, 또는 그것의 상보적인 것을 포함하는, 최소 약 15 (즉, 15개의 연속된) 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 및 서열 번호: 1 또는 3, 또는 그것의 상보적인 것에서 보여지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자와 특정 조건에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열에 기초한 탐침은 동일한 것 또는 상동체 폴리펩티드를 암호화하는 전사체 또는 유전체 서열을 탐지하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 탐침은 그것에 결합한 표지군 (label group)을 포함하고, 예를 들yth 또는 효소 공동 면 표지군은 방사선 동위원소, 형광 화합물, 효소 공동인자 (cofactor)일 수 있다. 상기 탐침은, 예를 들면 개체로부터의 세포 시료에서 PD-L3 또는 VISTA-암호화 핵산의 수준을 측정함으로써, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA mRNA 수준을 탐지하거나 또는 유전체 PD-L3 또는 VISTA 유전자가 돌연변이 또는 결실되었는지 결정하는 것과 같이, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드가 잘못 발현된 세포나 조직을 탐지하는 진단검사키트의 부분으로서 사용될 수 있다.
"PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분"을 암호화하는 핵산은 PD-L3 또는 VISTA 생물학적 활성 (예를 들면, 그것의 자연적 결합 파트너와 결합하고 및/또는 면역세포 활성을 조절하는 능력)을 가지고 있는 폴리펩티드를 암호화하는 서열 번호: 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열의 부분을 분리함으로써, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 부분을 암호화하는 부분을 발현시킴으로써 (예를 들면, 시험관내에서 재조합 발현으로써), 및 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 부분을 암호화하는 부분의 활성을 평가함으로써 준비될 수 있다.
또한, 본 발명은 유전적 코돈 퇴화 (degeneracy of genetic code)에 의한 서열 번호: 1 또는 3에서 보여지는 뉴클레오티드 서열로부터 상이한 핵산분자를 포함하고 따라서 서열 번호: 1 또는 3에서 보여지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것으로서 동일한 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산분자는 서열 번호: 2, 4, 또는 5에서 보여지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진다.
서열 번호: 1 및 3에서 보여지는 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 당업자에 의해 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 변화를 초래하는 DNA 서열 다형성 (DNA sequence polymorphisms)은 집단 (예를 들면, 인간 집단) 내에 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다. PD-L3 또는 VISTA 유전자 내에서 상기 유전적 다형성은 자연적 대립유전자 변이 (natural allelic variation) 때문에 집단내의 개개인 사이에서 존재할 수 있다. 여기에서 사용되는, "유전자" 또는 "재조합 유전자"라는 용어는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 바람직하게는 포유류 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 오픈리딩프레임 (open reading frame)을 포함하고, 나아가 비암호화 조절 서열 (non-coding regulatory sequences) 및 인트론 (intron)을 포함할 수 있는 핵산분자를 의미한다.
인간 또는 생쥐 PD-L3 또는 VISTA의 대립유전자 변이 (allelic variant)는 기능적 및 비기능적 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 모두를 포함한다. 기능적 대립유전자 변이는 자연적 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 결합하고 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 생성 및 립프구 활성화를 조절하는 능력을 유지하는, 인간 또는 생쥐 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 자연적으로 발생한 아미노산 서열 변이이다. 기능적 대립유전자 변이는 일반적으로 서열 번호: 2, 4 또는 5의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 보존적 치환, 또는 상기 폴리펩티드의 중요하지 않은 부위에서의 중요하지 않은 잔기의 치환, 결실 또는 삽입만을 포함한다.
비기능적 대립유전자 변이는 자연적 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 결합하거나 및/또는 여기에서 기술된 PD-L3 또는 VISTA의 어떠한 활성도 조절하는 능력이 없는, 인간 또는 생쥐 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 자연적으로 발생하는 아미노산 서열 변이이다. 비기능적 대립유전자 변이는 일반적으로 서열 번호: 2, 4 또는 5의 아미노산 서열의 비보존적 치환, 결실 또는 삽입, 또는 전성숙 절단 (premature truncation), 또는 상기 폴리펩티드의 중요한 잔기 또는중요한 부위, 예를 들면 IgV 도메인에서의 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다.
또한 본 발명은 인간 또는 생쥐 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 비인간, 비생쥐 이종상동체 (ortholog)를 제공한다. 인간 또는 생쥐의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 이종상동체는 비인간, 비생쥐 생물체로부터 분리되고, 여기에서 기술된 인간 또는 생쥐 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 같이, 동일한 결합 친화성 (binding affinity), 및/또는 림프구 활성화-조절 활성과 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식 및 사이토카인 생성을 소유한 폴리펩티드이다. 인간 또는 생쥐 PD-L3 폴리펩티드의 이종 상동체는 서열 번호: 2, 4 또는 5와 대개 동일한 아미노산 서열을 포함하기 때문에 쉽게 동정될 수 있다.
또한, 다른 PD-L3 또는 VISTA 계 멤버를 암호화하는 핵산분자, 및 따라서 서열 번호 1 또는 3의 PD-L3 또는 VISTA 서열로부터 상이한 뉴클레오티드를 가진 핵산분자는 본 발명의 영역에 포함된다. 예를 들면, 또 다른 PD-L3 또는 VISTA cDNA는 생쥐 또는 인간 PD-L3 또는 VISTA의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 동정될 수 있다. 또한, 상이한 종으로부터의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 및 따라서 서열 번호: 1 또는 3의 PD-L3 또는 VISTA 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산분자는 본 발명의 영역에 포함된다. 예를 들면, 원숭이 PD-L3 또는 VISTA cDNA는 생쥐 또는 인간 PD-L3 또는 VISTA의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 동정될 수 있다.
본 발명의 PD-L3 또는 VISTA cDNA의 자연적 대립유전자 변이 및 상동체에 상응하는 핵산분자는 특정 혼성화 조건하에서 일반적인 혼성화 기술에 따른 혼성화 탐침으로서, 여기에서 공개된 상기 cDNA를 사용하여 여기에서 공개된 PD-L2 핵산, 또는 그 부분에 대한 그들의 상동성을 기초로 하여 동정될 수 있다. 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA cDNA의 자연적대립유전자 변이 및 상동체에 상응하는 핵산분자는 PD-L3 또는 VISTA 유전자로서 동일한 염색체 또는 위치 (locus)에 대한 지도작성(mapping)을 함으로써 분리될 수 있다.
따라서, 또 다른 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산분자는 최소 15, 20, 25, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 길이로 하고 하고 특정 조건에서 서열 번호: 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열의 암호화 부위를 포함하는 핵산분자와 혼성화된다. 또 다른 실시예에서, 상기 핵산 분자는 최소 700. 750, 800, 850, 880-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 길이로 한다.
여기서 사용되는, "특정 조건하에서 혼성화시킨다"는 용어는 서로에게 유의적으로 동일하거나 또는 상동적인 뉴클레오티드 서열이 서로에게 혼성화되어 유지되는, 혼성화 및 세척을 위한 조건을 기술하기 위함이다. 바람직하게, 상기 조건은 서로 최소 약 70%, 보다 바람직하게는 최소 약 80%, 보다 더 바람직하게는 최소 약 85% 또는 90% 동일한 서열이 서로에게 혼성화되어 유지되는 것이다. 상기 특정 조건은 당업자에게 알려져 있고 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc (1995), sections 2, 4 및 6.에 나타난다. 추가적인 특정 조건은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), chapters 7, 9 및 11에서 발견될 수 있다. 특정 혼성화 조건의 바람직한, 비제한적인 예시는 4배 또는 6배 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트 (sodium chloride/sodium citrate; SSC), 65-70 도 C (℃) (또는 4배 SSC와 50% 포름아미드 (formamide), 42-50도 C)에서의 혼성화, 바람직하게는 추가적으로 그 후 1 X SSC, 65-70 도 C에서의 세척을 포함하고, 특정 조건의 비제한적 예시는 6 배 SSC, 45 도 C에서의 혼성화, 그 후 0.2 배 SSC, 1@ SDS, 65 도 C에서의 한 번 또는 이상의 세척을 포함한다. 매우 엄격한 특정 혼성화 조건의 바람직한, 비제한적 예시는 1 배 SSC, 65-70 도 C 에서의 혼성화(또는 1배 SSC와 50% 포름아미드 (formamide), 42-50도 C에서의 혼성화), 그 후 0.3 배 SSC, 65-70 도 C에서 한 번 또는 그 이상의 세척을 포함한다. 덜 엄격한 특정 혼성화 조건의 바람직한, 비제한적 예시는 4배 또는 6배 SSC, 50-60 도 C에서의 혼성화 (또는 6배 SSC와 50% 포름아비드, 40-45 도 C에서의 혼성화), 그 후 2 배 SSC, 50-60 도 C에서 한 번 또는 그 이상의 세척을 포함한다. 상기 언급된 수치의 중간범위는, 예를 들면 65-70 도 C 또는 42-50 도 C는 본 발명에 의해 포함된다. 혼성화 및 세척 버퍼 (buffer)에서 SSPE (1 배 SSPE는 0.1 M NaCl, 10 mM NaH2P04, 및 1.25 mM EDTA, pH 7.4이다)는 SSC [1 배 SSC는 0.15M NaCl 및 15 mM 소듐 시트레이트 (sodium citrate)]를 치환할 수 있다; 혼성화가 완료된 후에 세척은 각각 15분 동안 수행된다. 길이가 50 염기쌍 (base pair) 이하로 예측되는 혼성체 (hybrid)를 위한 혼성화 온도는 혼성체의 융해온도 (melting temperature; Tm)보다 5-10도 C 이하이여야 하고, 여기에서 Tm은 하기의 방정식에 따라서 결정된다. 길이가 18 염기쌍 이하인 혼성체에 대하여, Tm( degrees C.)=2(A+T 염기의 수)+4(G+C 염기의 수)이다. 길이가 18 및 49 사이의 염기쌍인 혼성체에 대하여, Tm(degrees C.)=81.5+16.6(loglO[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)이고, 여기에서 N은 상기 혼성체에서의 염기의 수이고, [Na+1]는 혼성화 버퍼에서의 소듐 이온 (sodium ion)의 농도 (1 배 SSC에 대한 [Na.+] =0.165 M)이다. 또한, 당업자에 의해, 핵산분자가 막, 예를 들면 니트로셀룰로오즈 (nitrocellulose) 또는 나일론 막 (nylon membrane)으로의 비특이적 혼성화를 줄이기 위해서 추가적 시약이 혼성화 및/또는 세척 버퍼에 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이고, 이는 차단제 [예를 들면 BSA 또는 연어 또는 청어 정자 전달체 DNA(salmon or herring sperm carrier DNA)], 세제 (예를 들면, SDS), 킬레이팅제 (chelating agent) (예를 들면, EDTA), 피콜 (Ficoll), PVP 및 그와 유사한 것을 포함하지만 이로서 제한되지 않는다. 특히, 나일론 막을 사용할 때, 특정 혼성화 조건의 바람직한, 비제한적인 예시는 0.25-0.5M NaH2P04, 7% SDS, 약 65 도 C에서의 혼성화, 그 후 0.02M NaH2P04, 1 % SDS, 약 65 도 C에서의 한 번 또는 그이상 세척이다. 예를 들어, Church and Gilbert (1984) Proc. Nad. Acad. Sci. USA 81 : 1991-1995 (또는 0.2 배 SSC, 1 % SDS)를 참조할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 분리된 핵산분자는 서열 번호: 1 또는 3의 또는 그것의 상응하는 자연적으로 발생한 핵산분자에 서열과 특정 조건하에서 혼성화된다. 여기서 사용되는, "자연적으로 발생한" 핵산분자는 자연에서 발생하는 뉴클레오티드 서열을 가지는, RNA 또는 DNA 분자 (즉, 가연적 폴리펩티드를 암호화하는)를 의미한다.
집단에서 나타날 수 있는 PD-L3 또는 VISTA 서열의 자연적으로 발생한 대립유전자 변이 뿐만 아니라, 당업자는 서열 번호: 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열로 돌연변이에 의해 변화가 도입될 수 있고, 따라서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 기능적 능력의 변화없이, 암호화된 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 아미노산 서열에 변화가 초래된다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, "비-필수적 (non-essential)" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 초래하는 뉴클레오티드의 치환은 서열 번호: 1 또는 3의 서열에서 만들어질 수 있다. "비-필수적" 아미노산 잔기는 PD-L3 또는 VISTA의 야생형 (예를 들면, 서열 번호: 2, 4 또는 5의 서열)으로부터 생물학적 활성의 변화없이 변형될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 필수적이다. 예를 들면, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 사이에서 보존된 아미노산 잔기, 예를 들면 세포외 도메인에 존재하는 것들은 특히 변형에 대해 수긍될 수 없는 것으로 예측된다. 또한, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 및 PD-L3 또는 VISTA 계의 다른 멤버 사이에서 보존된 추가적 아미노산 잔기도 변형에 대해 수긍될 수 없다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기에 있어서의 변화를 포함하는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함한다. 상기 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 4 또는 5로부터의 아미노산에 있어서 상이하지만, 생물학적 활성을 보유한다. 어떤 실시예에서, 상기 분리된 핵사눈자는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기세어, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 4 또는 5에 최소 71 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호: 2, 4 또는 5의 폴리펩티드와 동일한 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산분자는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 첨가 또는 결실이 서열 번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열에 도입됨으로써 생성될 수 있고, 이로써 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 상기 암호화된 폴리펩티드로 도입될 수 있다. 돌연변이, 예를 들면 위치-지향적 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이 (PCR-mediated mutagenesis)는 일반적인 기술에 의해 서열 번호: 1 또는 3으로 도입될 수 있다. 바람직하게, 보존된 아미노산 치환은 하나 또는 그 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 만들어질 수 있다. "보존된 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)"은 상기 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 계는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계는 염기성 측쇄 [예를 들면, 리신 (lysine), 아르기닌 (arginine), 히스티딘 (histidine)], 산성 측쇄 [예를 들면, 아스파르산 (aspartic acid), 글루타믹 산 (glutamic acid)], 비전하 극성 측쇄 (uncharged polar side chain) [예를 들면, 아스파라긴 (asparagine), 글루타민 (glutamine), 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 티로신 (tyrosine), 시스테인 (cysteine)], 비극성 측쇄 [예를 들면, 글리신 (glycine), 알라닌 (alanine), 발린 (valine), 루신 (leucine), 이소루신 (isoleucine), 프롤린 (proline), 페닐알라닌 (phenylalanine), 메티오닌 (methionine), 트립토판 (tryptophan)], 베타-가지 측쇄 (beta-branched side chain) [예를 들면, 트레오닌 (threonine), 발린 (valine), 이소루신 (isoleucine)], 및 아로마 측쇄 (aromatic side chain) [예를 들면, 티로신 (tyrosine), 페닐알라닌 (phenylalanine), 트립토판 (tryptophan), 히스티딘 (histidine)]을 포함한다. 따라서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에서 예측된 비필수적 아미노산 잔기는 바람딕하게는 동일한 측쇄계로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 또는, 또 다른 실시예에서, 돌연변이는 PD-L3 또는 VISTA 암호화 서열의 전부 또는 일부분이, 예를 들면 포화돌연변이 (saturation mutagenesis)에 의해 무작위로 도입될 수 있고, 상기 결과물 돌연변이는 PD-L3 또는 VISTA 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 동정을 위해 상기 활성으로 스크리닝 될 수 있다. 하기의 열 번호: 1 또는 3의 돌연변이 형성에서, 상기 암호화된 폴리펩티드는 재조합적으로 발현될 수 있고, 상기 폴리펩티드의 활성이 결정될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 돌연변이 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 자연적 PD-L3 또는 VISTA와 결합하거나 및/또는 상기 활성을 조절하고, 세포 사이 또는 세포내 신호전달을 조절하며, T 림프구의 활성화를 조절하고, 및/또는 생물체의 면역반응을 조절하는 능력을 검사할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 PD-L3 또는 VISTA, 또는 PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질을 암호화하는 분리된 핵산분자를 포함한다. 최소한 PD-L3 또는 VISTA 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 두번째 뉴클레오티드 서열과 조작적으로 연결된, PD-L3 또는 VISTA 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 첫번째 뉴클레오티드를 포함하는 상기 핵산분자는 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
상기 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자 뿐만 아니라, 본 발명의 또 다른 측면은 그것의 안티센스인, 분리된 핵산분자를 포함한다. "안티센스" 핵산분자는 폴리펩티드를 암호화하는 "센스" 핵산분자에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 이중나선 cDNA 분자의 암호선에 상보적인 것 또는 mRNA 서열에 상보적인 것을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소결합을 할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 PD-L3 또는 VISTA 암호화 선 전체 또는 그것의 오직 일부분에만 상보적일 수 있다. 어떤 실시예에서, 안티센스 핵산분자는 PD-L3 또는 VISTA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 선의 "암호화 부위"에 대해 안티센스이다. "암호화 부위"라는 용어는 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 부위를 의미한다. 또 다른 실시예에서, 안티센스 핵산분자는 PD-L을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 선의 "비암호화 부위"에 대해 안티센스이다. "비암호화 부위"라는 용어는 아미노산으로 번역되지 않는 암호화부위의 측면에 있는, 5' 및 3' 서열 (또한 5' 및 3' 비번역 부위라고도 한다)을 의미한다. 여기에서 공개되는 인간 또는 생쥐 PD-L3 또는 VISTA를 암호화하는 암호화 선 서열에서, 본 발명의 안티센스 핵산은 왓슨 및 크릭 (Watson and Crick )의 염기쌍 법칙에 따라 고안된다. 상기 안티센스 핵산 분자는 PD-L3 또는 VISTA mRNA의 전체 암호화 부위와 상보적일 수 있지만, 바람직하게는 PD-L3 OR VISTA mRNA의 암호화 또는 비암호화 부위의 일부분만에 대해 안티센스인 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들면, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PD-L3 OR VISTA mRNA의 번역 개시 부위를 둘러싼 부위에 대해 상보적일 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드를 길이로 한다. 본 발명의 안티센스 핵산분자는 당업계에 알려진 화학적 합성 및 효소적 연결 반응을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산분자 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있고, 또는 상기 분자의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해 또는 상기 안티센스 및 센스 핵산 사이에서 형성된 이중체 (duplex)의 물리학적 안정성을 증가시키기 위해, 다양하게 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면 포스포로티오에이트 유도체 (phosphorothioate derivatives) 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드 (acridine substituted nucleotides)를 사용할 수 있다. 안티센스 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있는, 변형된 뉴클레오티드의 예시는 5-플루오로우라실 (fluorouracil), 5-브로모우라실 (bromouracil), 5-크로로우라실 (chlorouracil), 5-아이오도우라실 (iodouracil), 하이폭산틴(hypoxanthine), 잔틴 (xantine), 4-아세틸시토신 (acetylcytosine), 5-(카복시하이그록실메틸) 우라실 [(carboxyhydroxylmethyl) uracil], 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘 (carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine), 5-카복시네티아미노메틸우라실 (carboxyrnethylaminomethyluracil), 디하이드로우라실 (dihydrouracil), 베타-D-갈락토실퀘오신 (beta-D-galactosylqueosine), 아이노신 (inosine), N6-이소펜테닐아데닌 (N6-isopentenyladenine), 1-메밀구아닌 (1-memylguanine), 1-메틸이노신 (1-methylinosine), 2,2-디메틸구아닌 (2,2-dimethylguanine), 2-메틸아데닌 (2-methyladenine), 2-메틸구아닌 (2-methylguanine), 3-메틸시토신 (3-methylcytosine), 5-메틸시토신 (5-methylcytosine), N6-아데닌 (N6-adenine), 7-메틸구아닌 (7-methylguanine), 5-메틸아미노메틸우라실 (5-methylaminomethyluraciI), 5-메톡시아미로메틸-2-티오우라실 (5-methoxyamiromethyl-2-thiouracil), 베타-D-만노실퀘오신 (beta-D-mannosylqueosine), 5'-메톡시카복시메틸우라실 (5'-methoxycarboxymethyluracil), 5-메톡시우라실 (5-methoxyuracil), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌 (2-methylthio-N6-isopentenyladenine), 우라실-5-옥시아세틱 산 (uracil-5-oxyacetic acid (v)), 비부톡소신 (wybutoxosine), 수도우라실 (pseudouracil), 퀘오신 (queosine), 2-티오시토신 (2-thiocytosine), 5-메틸-2-티오우라실 (5-methyl-2-thiouracil), 2-티오우라실 (2-thiouracil), 4-티오우라실 (4-thiouracil), 5-메틸우라실 (5-methyluracil), 우라실-5-옥시아세틱 산 메틸에스테르 (uracil-5-oxyacetic acid methylester), 우라실-5-옥시아세틱 산(uracil-5-oxyacetic acid (v)), 5-메틸-2-티오우라실 (5-methyl-2-thiouracil), 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실 [3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil], (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린 (2,6-diaminopurine)을 포함한다. 또는 상기 안티센스 핵산은 안티센스 발향으로 서브클로닝된 핵산이 있는 발현벡터를 사용함으로써 생물학적으로 생산될 수 있다 (즉, 상기 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA가 목표로 하는 표적 핵산에 대한 안티센스 방향일 것이고, 하기에 보다 자세히 기술될 것이다).
본 발명의 안티센스 핵산분자는 일반적으로 개체에 투여되거나 또는 인시추 (in situ)에서 생산되어, 그들은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 세포내 mRNA 및/또는 유전체 DNA와 혼성화됨으로써 상기 폴리펩티드의 발현을 억제, 예를 들면 전사 및/또는 번역의 억제한다. 상기 혼성화는 안정적인 이중체를 형성하기 위한, 보편적인 뉴클레오티드 상보성에 의해, 예를 들면 DNA 이중체와 결합하는 안티센스 핵산분자의 경우에, 이중 헬릭스 (double helix)의 깊은 홈 (major groove)에서의 특이적 상호결합을 통해서 형성될 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산분자의 투여경로의 예시는 조직부위에서 직접 주입 (direct injection)을 포함한다. 또는, 안티센스 핵산분자는 표적 선택된 세포로 주입된 후, 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 전신적 투여를 위해, 안티센스 분자는 변형되어, 선택된 세포의 표면에 발현된 수용체 또는 항원과 특이적으로 결합한다. 예를 들면 상기 안티센스 핵산분자를 세포 표면의 수용체 또는 항원과 결합하는 쳅티드 또는 항체와 연결함으로써 변형된다. 또한, 안티센스 핵산분자는 여기에서 기술된 벡터를 사용하여 세포로 운반될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위해서, 강력한 pol 또는 pol III 프로모터의 조절하에 상기 안티센스 분자가 위치한 벡터 구조물이 바람직하다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 .알파.-아노머릭 (anomeric) 핵산분자이다. .알파.-아노머릭 핵산분자는 상보적 RNA를 가진 특이적 이중나선 혼성체를 형성하고, 여기에서 일반적인 것과는 반대인 .베타.- 유닛 (.beta.-unit)인 선 (strand)은 서로에게 평행하게 있다 (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). 상기 안티센스 핵산은 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오티드 (2'-o-methylribonucleotide) (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (analogue) (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 안티센스 핵산분자는 리보자임 (ribozyme)이다. 리보자임은 상보적인 부위를 갖는, mRNA와 같은, 단일-나선 (single-stranded) 핵산을 절단할 수 있는, 리보뉴클라아제 (ribonuclease) 활성을 가지는 촉매적 RNA 분자 (catalytic RNA molecule)이다. 따라서, 리보자임 [예를 들면, 해머해드 (hammerhead) 리보자임 (Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591)에서 기술]은 PD-L3 또는 VISTA mRNA 전사체를 촉매적으로 절단하도록 사용될 수 있음으로써, PD-L3 또는 VISTA mRNA의 번역을 억제할 수 있다. PD-L3 또는 VISTA-암호화 핵산에 대해 특이성을 갖는 리보자임은 여기에서 공개된 PD-L3 또는 VISTA cDNA의 뉴클레오티드 서열 (즉, 서열 번호: 1 또는 3)을 기초로 하여 설계될 수 있다. 예를 들면, 테트라히메나 L-19 IVS RNA (Tetrahymena L-19 IVS RNA)의 유도체는 상기 활성부위의 뉴클레오티드 서열이 PD-L3 또는 VISTA-암호 mRNA에서 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 곳에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, Cech et al., U.S. Pat. No. 4,987,071 and Cech et al., U.S. Pat. No. 5, 116,742를 참고할 수 있다. 또는, PD-L3 또는 VISTA mRNA는 RNA 분자의 풀 (pool)로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선별하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, Bartel, D. and Szostak, J. W. (1993) Science 261 : 1411 -1418를 참조할 수 있다.
또는, PD-L3 또는 VISTA 유전자 발현은 표적 세포내에서 PD-L3 유전자의 전사를 방지하는 삼중 헬릭스 (triple helix)를 형성하기 위해, PD-L3 또는 VISTA의 조절 부위 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적시킴으로써 억제될 수 있다. 일반적으로, Helene, C (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L. J. (1992) Bioessays (12):807- 15를 참조할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자는, 예를 들면 상기 분자의 안정성, 혼성화 또는 용해성을 개선시키기 위해, 염기 모이어티 (base moiety), 당 모이어티 (sugar moiety) 또는 인산 백본 (phosphate backbone)에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산분자의 데옥시리보오즈 인산 백본 (deoxyribose phosphate backbone)은 펩티드 핵산을 생성하기 위해 변형될 수 있다 (Hyrup, B. and Nielsen, P. E. ( 1996) Bioorg. Med. Chem. 4( l):5-23을 참조). 여기서 사용되는, "펩티드 핵산" 또는 "PNAs"라는 용어는 핵산 모방체 (mimics), 예를 들면 DNA 모방체를 의미하고, 여기에서 상기 데옥시리보오즈 인산 백본은 수도펩티드 백본 (pseudopeptide backbone)에 의해 치환되고 오직 4개의 자연적 뉴클레오염기 (natural nucleobases)가 남는다. PNAs의 중성 백본은 낮은 이온 강도(low ionic strength)의 조건하에서 DNA 및 RNA에 특이적 혼성화를 허용하는 것이 보여졌다. PNA 올리고머의 합성은 상기 Hyrup and Nielsen (1996) 및 Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675에서 기술된, 일반적인 고체상 펩티드 합성 프로토콜 (standard solid phase peptide synthesis protocol)을 사용하여 수행될 수 있다.
PD-L3 또는 VISTA 핵산분자의 PNAs는 치료적 및 진단적 사용에 이용될 수 있다. 예를 들면, PNAS스캔은 유전자 발현의 서열-특이적 조절을 위해 안티센스 또는 안티유전자제로서, 예를 들면 전사 또는 번역중지를 유도하거나 또는 복제를 억제시킴으로써 사용될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 핵산분자의 PNAs는 또한 유전자에서의 단일 염기쌍 돌연변이 [예를 들면, PNA-지향적 PCR 클램핑 (clamping)에 의한]의 분석에서; 다른 효소와 병용하여 사용될 때 "인위적 제한효소 (artificial restriction enzymes)"로서 (예를 들면, S I nucleases (상기 Hyrup and Nielsen (1996)); 또는 DNA 서열분석 또는 혼성화를 위한 탐침 또는 프라이머로서 사용될 수 있다 (상기 Hyrup and Nielsen (1996); 상기 Perry-O'Keefe et al. (1996)).
또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA의 PNAs는 (예를 들면 그들의 안정성 또는 세포 흡수(uptake)를 증진시키기 위해서), PNA와 지질친화성 또는 다른 도움군 (helper group)을 결합시킴으로써, PNDa-DNA 키메라를 형성시킴으로써, 또는 리포좀 (liposome) 또는 당업계에 알려진, 다른 약물전달기술을 사용함으로써, 변형될 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 핵산분자의 PNA-DNA 키메라는 PNA 및 DNA의 장점을 융합하여 생성될 수 있다. 상기 키메라는 DNA 인지 효소 [예를 들면, RNAse H 및 DNA 중합효소 (polymerase)]를 DNA 부분과 상호작용하도록 허용하는 반면, PNA 부분은 높은 결합 친화력 및 특이성을 제공할 수 있다. PNA-DNA 키메라는 염기 스택킹 (stacking), 뉴클레오염기 사이의 결합의 수 및 방향의 측면에서 선별된, 적절한 길이의 링커(linker)를 사용하여 연결될 수 있다 (상기 Hyrup and Nielsen (1996)). PNA-DNA 키메라의 합성은 상기 Hyrup and Nielsen (1996) 및 Finn P. J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17):3357-63에서 기술된 것과 같이 수행될 수 있다. 예를 들면, DNA 사슬은 일반적인 포스포르아미디트 결합 화학기술 (standard phosphoramidite coupling chemistry) 및 변형된 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogs), 예를 들면 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포르아미디트 [5'-(4-methoxytrityl)amino-5'-deoxy-thymidine phosphoramidite]를 사용하여 고체 지지대에서 합성될 수 있고, PNA 및 DNA의 5' 사이의 다리로서 사용될 수 있다 (Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-88). 그 후, PNA 모노머 (monomer)는 단계적인 방법으로 결합되어 5' PNA 부분 및 3' DNA 부분과 함께 키메라 분자를 형성한다 (상기 Finn P. J. et al. (1996)). 또는, 키메라 분자는 5' DNA 부분 및 3' PNA 부분을 사용하여 합성될 수 있다 (Peterser, K. H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).
다른 실시예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 다른 첨가된 군, 예를 들면 펩티드 (예를 들면 생체내에서 숙주세포 수용체를 표적하기 위한 또는 세포막 (Letsinger et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT 출원 No. WO 88/09810를 참조) 또는 혈관-뇌 장벽 (blood-brain barrier) (PCT 출원 No. WO 89/10134 참조)을 넘는 수송을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 혼성화-야기 절단제(hybridization-triggered cleavage agents) (Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976 참조) 또는 끼어들기 약물 (intercalating agent) (Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549를 참조)를 사용하여 변형될 수 있다. 마지막으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 또 다른 분자 [예를 들면, 펩티드, 혼성화 야기-연결제 (hybridization triggered cross-linking agent), 수송제 (transport agent) 또는 혼성화-야기 절단제)와 결합될 수 있다.
또는, 세포주 또는 미생물 내의 내생적 PD-L3 또는 VISTA 유전자의 발현 특징은 이종 DNA 조절 요소를 안정적 세포주 (stable cell line) 또는 클론된 미생물의 유전체에 삽입함으로써 변형될 수 있고, 이로써 상기 삽인된 조절요소는 PD-L3 또는 VISTA 유전자와 조작되어 연결된 것이다. 예를 들면, 세포주 또는 미생물에서 정상적으로 "전사적으로 조용한 (transcriptionally silent)", 즉 PD-L3 또는 VISTA 유전자가 정상적으로 발현되지 않거나, 또는 매우 낮은 수준으로만 발현되는 내생적 PD-L3 또는 VISTA 유전자는 상기 세포주 또는 미생물에서 정상적으로 발현되는 유전자 생산물의 발현을 촉진시킬 수 있는 조절요소를 삽입함으로써 활성화될 수 있다. 또는, 전사적으로 조용한, 내생적 PD-L3 또는 VISTA 유전자는 여러 세포 종류를 거쳐 작동하는 호환조절요소 (promiscuous regulatory element)를 주입함으로써 활성화될 수 있다.
이종 조절요소(heterologous regulatory element)는 안정적 세포주 또는 클론된 미생물로 삽입될 수 있고, 이것은, 당업계에 잘 알려지고 Chappel, U.S. Pat. No. 5,272,071; 1991년 5월 16일에 출원된 PCT 출원 No. WO 91/06667에 기술된, 표적화된 상동성 재조합과 같은 기술을 사용함으로써 내생적 PD-L3 또는 VISTA 유전자와 조작적으로 연결될 수 있다.
II . 분리된 PD - L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 및 항- PD - L3 또는 VISTA 항체
본 발명의 한 측면은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 및 그것의 생물학적 활성 부분, 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 높이기 위한 면역원으로서 사용하기에 적절한 폴리펩티드 단편을 포함한다. 어떤 실시예에서, 본래의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 일반적인 단백질 정제기술을 사용한 적절한 정제 계획에 의해서 세포 또는 조직원으로부터 분리될 수 있다. 또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 재조합 발현에 대한 대안으로, PD-L3 또는 VISTA 단백질 또는 폴리펩티드는 일반적인 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
"분리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성부위는 대개 PD-L3 또는 VISTA 단백질이 유래된 세포 또는 조직으로부터의 세포물질 또는 다른 오염 단백질이 없거나, 또는 화학적으로 합성되었을 때 화학적 선구체 또는 다른 화학물질이 대개 없는 것이다. "세포물질이 대개 없다"라는 표현은 단백질이 분리되거나 또는 재조합적으로 생산된 세포의 세포구성물질로부터 분리된 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다. 어떤 실시예에서, "대개 세포물질이 없다"라는 표현은 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질 (또는 여기에서 "오염 단백질"이라고 표현됨)의 약 30% (건량에 의해) 이하, 보다 바람직하게는 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질의 약 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질의 약 10% 이하, 가장 바람직하게는 비-PD-L3 또는 VISTA 단백질의 약 5% 이하를 가지는 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 단백질 또는 그것의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생산되었을 때, 또한 대개 배지가 없는 것이 바람직하다. 즉, 배지는 단백질 준비 부피의 약 20% 이하, 보다 바람직하게는 약 10%이하, 가장 바람직하게는 5% 이하를 나타낸다.
"대개 화학적 선구체 또는 다른 화학물질이 없다"라는 표현은 단백질의 합성과 관련된 화학적 선구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다. 어떤 실시예에서, "대개 화학적 선구체 또는 다른 화학물질이 없다"라는 표현은 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 30% (건량에 의해) 이하, 보다 바람직하게는 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 10% 이하, 가장 바람직하게는 화학적 선구체 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 화학물질의 약 5% 이하를 가지는 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 준비를 포함한다.
여기에서 사용되는, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 "생물학적 활성부위"는 PD-L3 또는 VISTA 분자 및 비-PD-L3 또는 VISTA 분자, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA의 자연적 리간드 사이에서 상호결합에 참가하는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 단편을 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분은, 예를 들면 서열 번호: 2, 4 또는 5에서 보여지는 아미노산 서열과 같은, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 또는 상기 서열로부터 유래된 아미노산을 포함하고, 상기 서열은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 전장보다 적은 아미노산을 포함하고, 및 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 최소 하나의 활성을 나타낸다. 일반적으로, 생물학적 활성부위는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 최소 하나의 활성, 예를 들면 항-CD3에 대한 CD4+ T 세포의 증식반응을 조절(억제), 항원특이적 방법으로 연계 CD4+ T 세포의 증식반응의 억제, 특이적 사이토카인의 발현에서의 효과 등을 가지는 도메인 또는 모티프를 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생물학적 활성부위는, 예를 들면 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225개 또는 그 이상의 아미노산을 길이로 하는 폴리펩티드일 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생물학적 활성부위는 PD-L3 또는 VISTA-매개 활성, 예를 들면 면역세포 활성화를 조절하는 제제를 개발하는데 표적으로서 사용될 수 있다.
어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생물학적 활성부위는 최소한 세포외 도메인의 부분을 포함한다. 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 바람직한 생물학적 활성부위는 최소한 세포외 도메인의 부분 (예를 들면 IgV를 포함하는), 및 하나 또는 그 이상의 하기 도메인을 포함할 수 있다: 신호펩티드 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인. 또한, 상기 폴리펩티드의 다른 부위는 결실된, 다른 생물학적 활성부위는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고, 본래의 PD-L3 또는 VISTA 폴리페티드의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성을 평가할 수 있다.
바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 4, 또는 5에서 보여지는 아미노산 서열을 가진다. 또 다른 실시예에서, 상기 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 4, 또는 5와 상당히 동일하고 서열 번호: 2, 4, 또는 5의 폴리펩티드의 기능적 활성을 보유하지만, 상기 언급된 자연적 대립유전자 변이에 의해 아미노산 서열이 상이하다.
또한, 본 발명의 상기 핵산 및 폴리펩티드 서열은 공개된 데이터베이스에 대해, 예를 들면 다른 계 멤버 또는 관련된 서열을 동정하기 위한 검색하기 위한 "문의 서열 (query sequence)"로서 사용될 수 있다. 상기 검색은 Altschul et al. ( 1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(version 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자와 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해, BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 (score)=100, 단어길이 (wordlength)=12 내에서 수행될 수 있다. 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해, BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 (score)=100, 단어길이 (wordlength)=3 내에서 수행될 수 있다. 비교를 목적으로 배열의 차이를 알기 위해서, Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25( 17):3389-3402 기술된 것과 같이, Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램 (예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 변수 (default parameters)가 사용될 수 있다. National Center for Biotechnology Information에 대한 인터넷 웹사이트를 참고할 수 있다.
또한, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 여기서 사용되는, PD-L3 또는 VISTA "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비-PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 조작적으로 연결된, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 포함한다. "PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드"는 PD-L3 또는 VISTA 분자에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하는 반면, "비-PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드"는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 충분하게 상동성을 갖지 않는 폴리펩티드, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드로부터 상이한, 및 동일하거나 또는 상이한 생물체로부터 유래된 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열은 갖는 폴리펩티드를 의미한다. PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질 내에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 전체 또는 일부분과 일치할 수 있다. 바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질은 최소 하나의 생물학적 PD-L3 또는 VISTA 활성 부위 일부분을 포함한다. 또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 최소 두개의 도메인을 포함한다. 상기 융합 단백질 내에서, "조작적으로 연결된"이라는 용어는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 및 비-PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드가 서로 인-프레임 (in-frame)으로 융합된 것을 가리킨다. 비-PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단과 융합될 수 있고, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 용해성, 결합 친화력, 안정성 또는 결합가 (valency)를 변화시키는 모이어티와 나타낸다
예를 들면, 어떤 실시예에서, 상기 PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질은 GST-PD-L3 또는 VISTA 융합단백질이고, 여기에서 상기 PD-L3 또는 VISTA 서열은 GST 서열의 C-말단과 융합된다. 상기 융합 단백질은 재조합 PD-L3 또는 VISTA의 정제를 촉진시킬 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 융합 단백질은 N-말단에 이종 신호서열을 포함하는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드이다. 특정 숙주세포 (예를 들면, 포유류 숙주세포)에서, PD-L3 또는 VISTA의 발현 및/또는 분비는 이종 신호서열의 사용을 통해서 증가될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 융합 단백질은 Ig-PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질이고, 여기에서 PD-L3 또는 VISTA 서열은 Ig 분자의 부분과 융합된다. 상기 융합 단백질의 Ig 부분은 면역글로불린 불변 부위 (constant region), 예를 들면 인간 C 감마1 도메인 또는 C 감마4 도메인 [예를 들면 인간 IgC 감마1 또는 인간 IgC 감마4의 경첩부위, CH2, 및 CH3 부위 (여기에서 포함된 Capon et al., U.S. Pat. Nos. 5, 1 16,964; 5,580,756; 5,844,095 및 그와 유사한 것을 참조)]를 포함한다. 상기 결과로 생겨난 융합 단백질은 PD-L3 또는 VISTA 용해성, 결합 친화력, 안정성 및/또는 결합가 (즉, 분자당 결합부위의 개수)를 변화시킬 수 있고, 단백질 정제의 효율성을 높일 수 있다.
특히, 바람직한 PD-L3 또는 VISTA Ig 융합 단백질은 PD-L3 또는 VISTA의 면역글로불린 불변부분 (예를 들면 Fc 부위)과 결합된, 세포외 도메인 부위을 포함한다. 면역글로불린 불변부위는 상기 면역글로불린 구조에서 내재된 작용기 활성을 감소시키거나 제거하는 유전적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 세포외 부분을 암호화하는 DNA는 인간 IgG 감마1 및/또는 IgG 감마4의 경첩부위, CH2 및 CH3 부위를 암호화하는 DNA와, 위치-지향적 돌연변이, 예를 들면 WO 97/28267에 나타난 것에 의해 연결될 수 있다. 본 발명의 상기 PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질은 약학적 조성물에 포함될 수 있고, 생체내에서 개체에게 투여될 수 있다. 상기 PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질은 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너의 생물학적 이용성에 영향을 끼치는데 이용될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질의 사용은 면역반응의 조절로부터 이득이 있을 수 있는 질병 또는 장의 치료를 위해 치료적으로 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 PD-L3 또는 VISTA-융합 단백질은 대체에서 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 생산하기 위해, PD-L3 또는 VISTA-결합 단백질을 정제하기 위해, 및 스크리닝 검사하에서 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용을 억제하는 분자를 동정하기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 키메라 또는 융합 단백질은 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다.
또한, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 작용제 (모방체)로서 또는 PD-L3 또는 VISTA 길항제로서 기능을 하는, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 변이를 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 변이는 돌연변이형성, 예를 들면 분리된 점 돌연변이 (discrete point mutation), 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 절단 (truncation)에 의해 PD-L3 또는 VISTA 에 의해 생성될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 작용제는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 자연적으로 발생하는 형태의 생물학적 활성과 동일한 것 또는 부분집단을 상당히 가지고 있을 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 길항제는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 자연적으로 발생한 형태의 활성의 하나 또는 그 이상을, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 PD-L3 또는 VISTA-매개 활성을 경쟁적으로 조절함으로써 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이를 처리함으로써 유도될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 폴리펩티드의 자연적으로 발생한 형태의 생물학적 활성의 부분집단을 가지는 변이로 개체를 치료하는 것은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 자연적으로 발생한 형태로 개체를 치료하는 것에 비해 낮은 부작용을 가진다.
어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 작용제 (모방체)로서 또는 PD-L3 또는 VISTA 길항제로서 기능을 하는, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 변이를, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 작용제 또는 길항제 활성에 대한 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 돌연변이의, 예를 들면 절단 돌연변이(truncation mutant)의 조합 라이브러리 (combinatorial libraries)를 스크리닝 함으로써 동정할 수 있다. 어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 변이의 다양한 라이브러리는 핵산 수준에서의 조합 돌연변이형성에 의해 생성될 수 있고, 다양한 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. PD-L3 또는 VISTA 변이의 다양한 라이브러리는, 예를 들면 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열로 효소적으로 연결함으로써 생산될 수 있고, 이로써 잠재적인 PD-L3 또는 VISTA 서열의 퇴행성 세트 (degenerate set)는 개별적 폴리펩티드로서, 또는 여기에서의 PD-L3 또는 VISTA 서열의 세트를 포함하는, 보다 큰 융합 단백질의 세트 [예를 들면, 파지 표시 (phage display)]로서 발현가능하다. 퇴행성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 PD-L3 또는 VISTA 변이의 라이브러리를 생산할 수 있는 다양한 방법이 있다. 퇴행성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동적 DNA 합성제 (automatic DNA synthesizer)에서 수행될 수 있고, 상기 합성 유전자는 그 후 적절한 발현벡터와 연결된다. 유전자 세트의 퇴행성 (degenerate)의 사용은 하나의 혼합물에서 잠재적인 PD-L3 또는 VISTA 서열의 바람직한 세트를 암호화하는 서열의 모든 공급을 허용한다. 퇴행성 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계에 알려져 있다 (Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477를 참조)
또한, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 암호화 서열의 단편 라이브러리는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 변이를 스크리닝하고 그 결과 선별하기 위한, PD-L3 또는 VISTA 단편의 다양한 집단을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 암호화 서열 단편의 라이브러리는 조건하에서 PD-L3 또는 VISTA 암호화 서열의 이중 나선 PCR 단편에 뉴클레아제로 처리함으로써 생성될 수 있고, 여기에서 상기 조건은 절단 (nicking)은 약 분자당 한 번 발생하고, 이중나선 DNA를 변성(denaturation)시키며, 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중나선 DNA를 형성하기 위해서 상이한 절단된 생산물로부터 상기 DNA를 복원 (renaturation)시키고, SI 뉴클레아제로 처리함으로써 재생산된 이중체로부터 단일나선 부분이 제거되며, 및 발현벡터로 상기 결과적으로 생산된 단편을 연결시키는 것이다. 이러한 방법으로, 발현 라이브러리는 유도될 수 있고, 이것은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 다양한 크기의 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 암호화하한다.
점 돌연변이 또는 절단 (truncation)에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생산물을 스크리닝하기 위한, 및 선별된 특성을 가지는 유전자 생산물에 대해 cDNA 라이브러리를 스크리닝 하기 위한 몇가지 기술은 당업계에 알려져 있다. 상기 기술은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 조합 돌연변이형성에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 빠른 스크리닝을 위해 적응된 것이다. 큰 유전자 라이브러리 스크리닝을 위한 높은 처리 분석능력 (through-put analysis)을 가질 수 있는, 가장 널리 사용되는 기술은 복제가능한 발현벡터로의 유전자 라이브러리를 클로닝 하는 것, 상기 결과로 생긴 벡터 라이브러리를 적절한 세포에 도입시키는 것, 및 상기 조합 유전자를 조건에서 발현시키는 것을 포함하고, 여기에서 상기 조건은 바람직한 활성의 탐지가 그 생성물을 탐지하려는 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 촉진시키는 것이다. 상기 라이브러리에서 기능적 돌연변이의 빈도를 증진시킨, 회귀적 앙상블 돌연변이형성 (Recursive ensemble mutagenesis; REM)은 PD-L3 또는 VISTA 변이를 동정하기 위한 스크리닝 검사화 병용하여 사용될 수 있다 (Arkin and Youvan (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:781 1-7815; Delagrave et al. (1993) Protein Eng. 6(3):327-331).
자연적으로 발생한 아미노산만을 포함하는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 뿐만 아니라, PD-L3 또는 VISTA 펩티도모방체 (peptidomimetics) 또한 제공된다. 펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 것을 가지는 비-펩티드 약물로서, 일반적으로 제약산업에서 사용된다. 비-펩티드 화합물의 종류를 "펩티드 모방체 (peptide mimetics)" 또는 "펩티도모방체 (peptidomimetics)"라고 하고 (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger (1985) TINS p.392; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30: 1229가 여기에서 참고문헌으로 포함된다), 컴퓨터화 분자 모델링 (computerized molecular modeling)의 목적으로 때때로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동일한 치료적 또는 예방적 효과를 생산되는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약학적 활성을 가지는 폴리펩티드), 예를 들면 인간 또는 생쥐 PD-L3 또는 VISTA와 구조적으로 유사하지만, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 결합 (linkage)에 의해 선택적으로 대체된, 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합을 가지고: --CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, --CH.dbd.CH~ (cis and trans), --COCH2-, ~ CH(OH)CH2~, 및 -CH2SO-, 이는 당업계에 알려지고 하기 참고문헌에서 기술된 방법에 의해 이루어지며: Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. I, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications"; Morley, J. S. (1980) Trends. Pharm. Sci. pp.463-468; Hudson, D. et al. (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A. F. et al. (1986) Life. Sci. 38: 1243-1249 (-CH2-S); Hann, M. M. (1982) J. Chem. SoC Perkin. Trans. I 307-314 (-CH-CH--, cis and trans); Almquist, R. G. et al. ( 1980) J. Med. Chem. 23: 1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533 (--COCH2-); Szelke, M. et al., European Patent Application No. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (~CH(OH)CH2-); Holladay, M. W. et al. (1983) Tetrahedron. Lett. 24:4401-4404 (~C(OH)CH2); and Hruby, V. J. (1982) Life Sci. 31: 189-199 (--CH2 S); 각각은 여기에서 참고문헌으로 포함된다. 특별히 바람직한 비-펩티드 결합은 -CH2NH이다. 상기 펩티드 모방체는 본래의 폴리펩티드 보다 유의적으로 장점, 예를 들면 하기를 포함하는 장점을 가질 수 있다: 보다 경제적인 생산, 보다 높은 화학적 안정성, 증진된 약학적 특성 (예를 들면, 반감기, 흡수, 효능, 효과, 등), 변화된 특이성 (예를 들면, 생물학적 활성의 넓은 스펙트럼), 감소된 항원성 (antigenicity), 및 다른 것들. 펩티도모방체의 표지는 정량적 구조-활성 데이터 (quantitative structure-activity data) 및/또는 분자 모델링에 의해 예측된 펩티도모방체에서 비간섭위치 (on-interfering position)와, 직접적으로 또는 스페이서 (spacer) (예를 들면, 아미드 군)을 통해, 하나 또는 그 이상의 표지의 공유결합과 관련이 있다. 상기 비간섭위치는, 치료적 효과를 생산하기 위해, 일반적으로 상기 펩티도모방체가 결합하는 거대분자와 직접적 접촉을 형성하지 않는 위치이다. 펩티도모방체의 유도체화 (derivitization) (예를 들면 표지)는 상기 펩티도모방체의 바람직한 생물학적 또는 약학적 활성을 대개 방해하지 않아야 한다.
PD-L3 또는 VISTA 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 동일한 종류의 D-아미노산으로 (예를 들면, L-리신의 위치에 D-리신)의 전체적 치환 (systemic substitution)은 보다 안정적인 펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PD-L3 또는 VISTA 아미노산 서열 도는 대개 동일한 서열변이를 포함하는, 제한된 펩티드는 당업계에 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다 (여기서 참고문헌으로 포함된, Rizo and Gierasch (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387); 예를 들면, 상기 펩티드는 원형화하는 분자사이 이황화 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생산될 수 있다. 여기에서 동정된 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 아미노산 서열은 당업자가 PD-L3 또는 VISTA 펩티드 서열 및 그것의 서열변이와 일치하는 폴리펩티드를 생산하게 할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 PD-L3 또는 VISTA 펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 종종 보다 큰 폴리펩티드의 일부분으로서 발현시킴으로써 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 생산될 수 있다. 또는, 상기 펩티드는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 재조합 숙주에서, 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 방법, 폴리펩티드의 화학적 합성 및 시험관내 번역은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 변형, 및/또는 중심서열 (core sequence)로의 펩티드 연장은 물리적, 화학적, 생화학적 및 약학적 장점을 제공할 수 있고, 예를 들면: 증진된 안전성, 증가된 효능 및/또는 효과, 혈청 프로테아제 (serum protease)에 대한 저항성, 바람직한 약동학적 (pharmacokinetic) 특성, 및 다른 것이 있다. 펩티드는, 예를 들면 환자에게 공동자극을 변화시킴으로써 질환을 치료하는데 치료학적으로 사용될 수 있다.
분리된 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 또는 그것의 부분 또는 단편은 다클론 및 단일클론항체 제조를 위한 일반적인 기술을 사용하여, PD-L3 또는 VISTA와 결합하는 항체를 생산하기 위한 면역원 (immunogen)으로서 사용될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 전장의 폴리펩티드가 사용될 수 있고, 또는 본 발명은 면역원으로서 용도를 위한 PD-L3 또는 VISTA의 항원성 펩티드 부분을 제공한다. 어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA의 항원성 펩티드는 서열 번호: 2, 4 또는 5 에서 보여지는 아미노산 서열의 최소 8개의 아미노산 잔기를 포함하고, PD-L3 또는 VISTA의 에피토프를 포함하여, 상기 펩티드에 대해 생산된 항체는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 함께 특이적 면역복합체를 형성한다. 바람직하게, 상기 항원성 펩티드는 최소 10개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 최소 15개의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 최소 20개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 최소 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 항원성 펩티드에 의해 포함되는 바람직한 에피토프는 상기 폴리펩티드의 세포외 도메인, 예를 들면 친수성 부위에 위치한, PD-L3 또는 VISTA의 부위 뿐만 아니라 높은 항원성을 가지는 부위이다.
PD-L3 또는 VISTA 면역원은 상기 면역원을 사용하여 일반적으로 적절한 개체 (예를 들면, 토끼, 염소, 생쥐 또는 다른 포유류)를 면역화시킴으로써 항체를 제조하는데 사용된다. 예를 들면, 적절한 면역원성 제조는 재조합적으로 발현된 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 화학적으로 합성된 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제조는 보강제 (adjuvant), 예를 들면 완전 또는 불완전 프로이트항원보강제 (Freund's adjuvant), 또는 유사한 면역자극제를 포함할 수 있다. 면역원성 PD-L3 또는 VISTA 제조를 사용한 적절한 개체의 면역화는 다클론 항-PD-L3 또는 VISTA항체 반응을 유도한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 포함한다. 여기서 사용되는 "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성부위, 즉 PD-L3 또는 VISTA와 같은 항원과 특이적으로 결합하는 (면역반응을 하는) 항원결합부위를 포함하는 분자를 의미한다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성부위의 예는 펩신 (pepsin)과 같은 효소를 항체에 처리함으로써 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2를 포함한다. 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 분자와 결합하는 다클론 및 단일클론항체를 제공한다. 여기서 사용되는, "단일클론항체" 또는 "단일클론항체 조성물"이란 용어는 PD-L3 또는 VISTA의 특정 에피토프와 면역반응을 할 수 있는, 항원결합부위의 단 하나의 종 (species)을 포함하는 항체분자의 집단을 의미한다. 따라서, 단일클론항체 조성물은 일반적으로 그것이 면역반응을 하는 특정 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에 대한 단일 결합 친화력을 나타낸다.
다클론 항-PD-L3 또는 VISTA 항체는 상기 기술된 것과 같이, PD-L3 또는 VISTA 면역원, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질로 적절한 개체를 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 개체에서 상기 항-PD-L3 또는 VISTA 항체 타이터 (titer)는 일반적인 기술, 예를 들면 고정된 PD-L3 또는 VISTA를 사용한 효소결합면역흡수 검사 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)에 의해 시간에 따라 모니터될 수 있다. 바람직하다면, PD-L3 또는 VISTA에 대한 상기 항체분자는 포유류로부터 분리될 수 있고 (예를 들면, 혈액으로부터), 나아가 잘 알려진 기술, 예를 들면 단백질 A 크로마토그래피와 같은 기술에 의해 정제되어 IgG 분획 (fraction)을 얻을 수 있다. 면역화 후 적절한 시간에서, 예를 들면 항-PD-L3 또는 VISTA 항체 타이터가 가장 높을 때, 항체-생산 세포는 개체로부터 수득될 수 있고, 일반적인 기술, 예를 들면 Kohler and Milstein ( 1975) Nature 256:495-497 (see also Brown et al. (1981 ) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. ( 1976) Proc Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31 ; and Yeh et al. ( 1982) Int. J. Cancer 29:269-75)에 기술되어 있는 하이브리도마 (hybridoma) 기술, 보다 최근에는 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al. (183) Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 또는 트리오마 기술 (trioma techniques)에 의해 단일클론항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 단일클론항체 하이브리도마를 생산하기 위한 기술은 잘 알려져 있다 (일반적으로, Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Lemer, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al. ( 1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36을 참조). 간략하게, 불멸 세포주 (immortal cell line) (일반적으로 골수종)는, 상기 기술된 것과 같이, PD-L3 또는 VISTA 면역원으로 면역화된 포유류로부터의 림프구 (일반적으로 비장세포)와 융합되고, PD-L3 또는 VISTA와 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 동정하기 위해 그 결과로 생성된 하이브리도마 세포의 배지 상층액을 스크리닝한다. 융합림프구 및 불멸화된 세포주를 융합시키기 위해 사용되는, 잘 알려진 많은 프로토콜 중 어떤 것이라도 항-PD-L3 또는 VISTA 단일클론항체를 생산하는 목적으로 적용될 수 있다 (Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; 상기 Gefter et al. (1977); 상기 Lerner (1981); 및 상기 Kenneth (1980) 참조). 또한, 유용할 수 있는 다양한 많은 방법이 있다는 것을 당업자들은 이해할 것이다. 전형적으로, 상기 불멸 세포주 (예를 들면 골수종 세포주)는 상기 림프구와 동일한 포유류 종으로부터 유래된다. 예를 들면, 생쥐 하이브리도마는 불멸화된 생쥐 새포주와, 본 발명의 면역원성 제조를 사용하여 면역화된 생쥐로부터의 림프구를 융합시킴으로써 만들어질 수 있다. 바람직한 불멸 세포주는 하이포잔틴 (hypoxantine), 아미놉테린 (aminopterin) 및 티미딘 (thymidine)을 포함한 배지 ("HAT 배지")에 대해 민감한, 생쥐 골수종 세포주이다. 많은 골수종 세포주, 예를 들면 P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/0-Agl4 골수종의 어떠한 것도 일반적인 기술에 따른 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 상기 공수종 세포주는 ATCC로부터 이용이 가능하다. 일반적으로, HAT-민감 생쥐 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol; "PEG")을 사용하여 생쥐 비장세포와 융합된다. 그 후, 상기 융합으로부터 만들어진 하이브리도마 세포는 선별되고, 이것은 융합되지 않은 및 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 살해한다 (융합되지 않은 비장세포는 형질전환이 되지 않았기 때문에 몇 일 후 사망한다). 본 발명의 단일클로항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, PD-L3 또는 VISTA와 결합하는 항체를 위해 상기 하이브리도마 배양 상층액을 스크리닝함으로써, 예를 들면 일반적인 ELISA 검사를 사용함으로써 탐지된다.
PD-L3 또는 VISTA와 결합하는 항체를 생산하기 위한 특이적 방법은 실시예에 기술된 것과 당업계에 알려진 방법을 사용하여 작용될 수 있다. 단일클론항체-분비 하이브리도마를 제조하는 대안적 방법은, 단일클론 항-PD-L3 항체를 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리 [예를 들면, 항체 파지 표시 라이브러리 (antibody phage display library)]를 PD-L3 또는 VISTA를 사용하여 스크리닝함으로써 동정하고 분리할 수 있고, 이로써 PD-L3 또는 VISTA와 결합하는 면역글로불린 라이브러리 멤버를 분리할 수 있다. 파지 표시 라이브러리를 형성하고 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다.
PD-L3 또는 VISTA의 특이적 에피토프, 예를 들면 IgV 도메인 또는 다른 특이적 도메인과 결합하는 것을 동정하기 위한, 및/또는 PD-L3 또는 VISTA 단백질과 높은 친화력 (affinity) 및 와 결합력 (avidity)을 가지고 있는 항체를 선별하기 위해 상기 항체를 재스크리닝한다. 또한, 상기 항체를 시험관내 및 생체내에서, 면역 및 면역세포에 있어서 PD-L3 또는 VISTA의 특이적 기능 및 효과를 조절하는 것을 동정하기 위해 스크리닝한다. 예를 들면, 검사는, CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생성, CD28 공동자극, CD4+ T 세포 증식, 및 나이브 및 기억 CD4+ T 세포의 증식 등을 포함하는, PD-L3 또는 VISTA에 의해 음성적으로 조절되는, 면역기능에서의 항-PD-L3 또는 VISTA 항체의 조절효과를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 검사는, 시험관내에서 PD-L3 또는 VISTA-Ig의 존재가 PD-L3 또는 VISTA-Ig에 의한 억제를 증진시키킬 때, 즉 면역억제적인 잠재적 치료 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 동정하기 위해 수행될 수 있다. 본 발명은 136개의 아미노산 세포외 도메인, 예를 들면 1-50, 50-100, 100-136 아미노산과 결합하는 항-VISTA 항체, VISTA의 IgV와 특이적으로 결합하는 항체, VISTA의 줄기 부위 (stalk region)과 특이적으로 결합하는 항체, VISTA의 막관통 부위와 특이적으로 결합하는 항체 및 VISTA의 세포질 부위와 특이적으로 결합하는 항체, 및 그것의 사용을 포함한다. 상기 특이적 부위는 본 출원서에서 동정되었다.
또한, 일반적인 DNA 기술을 사용하여 만들어질 수 있는, 인간 및 비인간 부위를 포함하는, 재조합 항-PD-L3 또는 VISTA 항체, 예를 들면 키메라 및 인간화된 단일클론항체는 본 발명의 영역에 포함된다. 상기 키메라 및 인간화된 단일클론항체는 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들면 Robinson et al., 국제출원 No. PCT/US86/02269; Akira et al., 유럽특허출원서 184,187; Taniguchi, M., 유럽특허출원서 171,496; Morrison et al., 유럽특허출원서 173,494; Neuberger et al., PCT 국제출원 No. WO 86/01533; Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567; Cabilly et al., 유럽특허출원서 125,023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (19-87) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; Winter, U.S. Pat. No. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321 :552-525; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060에 기술된 방법을 사용함으로써 생산될 수 있다.
항-PD-L3 또는 VISTA 항체 (예를 들면, 단일클론항체)는 일반적인 기술, 예를 들면 친화력 크로마토그래피 또는 면역침전법 (immunoprecipitation)에 의해 PD-L3 또는 VISTA를 분리하기 위해서 사용될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 항체는 세포로부터의 자연적 PD-L3 또는 VISTA의 정제 및 숙주세포에서 발현된, 재조합적으로 생산된 PD-L3 또는 VISTA의 정제를 촉진시킬 수 있다. 또한, 항-PD-L3 또는 VISTA 항체는, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 존재 (abundace) 및 발현양상을 조사하기 위해서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 (예를 들면 세포용해물 또는 세포 상층액에서)를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 항-PD-L3 또는 VISTA 항체는 임상적 검사 과정의 부분으로서 조직에서 폴리펩티드 수준을 모니터하기 위해, 예를 들면 주어진 치료방법의 효과를 결정하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 탐지는 상기 항체를 탐지가능한 물질과 결합시킴으로써 촉진될 수 있다. 탐지될 수 있는 물질의 예시는 다양한 효소, 보결분자단 (prosthetic group), 형광물질, 발광물질, 생발광물질 (bioluminescent material), 및 방사선활성물질을 포함한다. 적절한 효소의 예시는 홀스라디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다아제 (beta-galactosidase), 또는 아세틸콜린에스터라아제 (acetylcholinesterase)를 포함하고; 적절한 보결분자단 복합체의 예시는 스트렙타비딘 바이오틴 (streptavidin biotin) 및 아비딘 바이오틴 (avidin biotin)을 포함하며; 형광물질의 예시는 엄벨리페론 (umbelliferone), 플루오레세인 (fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate), 로다민 (rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인 (dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드 (dansyl chloride) 또는 피코에리트린 (phycoerythrin)을 포함하고; 적절한 발광물질의 예시는 루미놀 (luminol)을 포함하며; 생발광물질의 예시는 루시퍼라아제 (luciferase), 루시페린 (luciferin), 및 애쿠오린 (aequorin)을 포함하고, 적절한 방사선활성물질은 1251, 1311, 35S 또는 3H를 포함한다.
III . 재조합 발현벡터 및 숙주세포
본 발명의 또 다른 측면은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 (또는 그것의 부분)를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현벡터를 포함한다. 여기에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 연결된 다른 핵산분자를 수송할 수 있는 핵산분자를 의미한다. 벡터의 한 종류는 "플라스미드 (plasmid)"이고, 이것은 추가적 DNA 부분이 연결될 수 있는, 원형 이중나선 DNA 루프 (loop)를 의미한다. 벡터의 또 다른 형태는 바이러스 벡터이고, 여기에서 추가적 DNA 부분은 바이러스 게놈 (genome)으로 연결될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주세포에서 자동적으로 복제할 수 있다 (예를 들면, 복제원점 및 에피솜 포유류 벡터를 가지는 박테리아 벡터). 다른 벡터 (예를 들면, 비에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포로 도입된 후 숙주세포의 게놈으로 통합되고, 따라서 숙주 게놈을 따라 복제된다. 또한, 특정벡터는 조작적으로 연결된 유전자를 발현할 수 있다. 상기 벡터는 여기에서 "발현벡터"라고 일컬어진다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 발현벡터의 유용성은 종종 플라스미드의 형태이다. 본 발명의 구체적인 설명에서, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명은 발현벡터의 다른 형태, 예를 들면 바이러스 벡터 (예를 들면, 결점있는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 복제)를 포함하고, 이것은 동일한 기능을 한다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 숙주세포에서 핵산의 발현을 위한 적절한 형태에서 본 발명의 핵산을 포함하고, 이것은 발현될 핵산서열과 조작적으로 연결된 상기 재조합 발현벡터가, 발현을 위한 숙주세포에 기초하여 선별된, 하나 또는 그 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현벡터 내에서, "조작적으로 연결된"은 표적 뉴클레오티드 서열이 상기 뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 방법으로 (예를 들면 시험관내에서 전사 번역 시스템에서 또는 상기 벡터가 숙주세포로 도입될 때 숙주세포에서), 조절서열과 연결된 것을 의미한다. "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소 [예를 들면 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signal)]를 포함하려는 의도이다. 상기 조절 서열은 예를 들면 Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7에 기술되어 있다. 조절 서열은 많은 종류의 숙주세포에서 항상 발현하는 뉴클레오티드의 서열 및 특정 숙주세포에서만 발현하는 (예를 들면 조직-특이적 조절 서열) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 발현벡터의 디자인은 형질전환된 숙주세포의 선택, 원하는 단백질의 발현수준 및 그와 유사한 것과 같은 요소에 의존할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명의 발현벡터는 숙주세포로 도입될 수 있고, 이로써 그들은 여기에서 기술된 핵산에 의해 암호화되는, 융합 단백질 또는 펩티드를 포함한, 단백질 또는 펩티드를 생산한다 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, PD-L3 또는 VISTA의 돌연변이 형태, 융합 단백질 또는 그와 유사한 것).
본 발명의 재조합 발현벡터는 원핵 또는 진핵세포에서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 발현을 위해 디자인 될 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 박테리아 세포, 예를 들면 E. coli, 곤충세포 [바큘로 발현 벡터 (baculovirus expression vector)를 사용한], 효모 세포, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주세포는 상기 Goeddel (1990)에서 더 기술된다. 또는, 상기 재조합 발현벡터는 시험관내에서, 예를 들면 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제 (T7 polymerase)를 사용하여, 전사되거나 또는 번역될 수 있다. 예를 들면, 정제된 융합단백질은 PD-L3 또는 VISTA 활성 검사에서 (예를 들면 하기 구체적인 내용에서 기술되는 직접적 검사 또는 경쟁적 검사), 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에 특이적인 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 발현벡터는 효모발현벡터 (yeast expression vector)이다. 효모 S. cerevisiae에서 발현을 위한 벡터의 예시는 pYepSecl (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 1 13-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함한다. 또는, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 바큘로바이러스 발현벡터 (baculovirus expression vector)를 사용한 곤충세포에서 발현될 수 있다. 곤충세포 (예를 들면, Sf9 세포)에서 배양된 폴리펩티드의 발현에 이용가능한 바큘로바이러스 벡터는 pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산은 포유류 발현벡터를 사용하여 포유류 세포에서 발현된다. 포유류 발현벡터의 예는 pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195)를 포함한다. 포유류 세포에서 발현될 때, 상기 발현벡터의 조절 기능은 종종 바이러스 조절요소에 의해 제공된다. 예를 들면, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마 (polyoma), 아데노바이러스 2 (Adenovirus 2), 거대세포바이러스 (cytomegalovirus) 및 시미안 바이러스 40 (Simian Virus 40)으로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포에 대한 다른 적절한 발현시스템에 대해 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning chapters 16 and 17: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989를 참조할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 재조합 포유류 발현벡터는 특정한 세포 종류 (예를 들면 조직-특이적 조절요소는 핵산을 발현시키는데 사용된다)에서 핵산의 발현을 바람직하도록 가능하게 할 수 있다. 조직-특이적 조절요소는 당업계에 알려져있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예는 알부민 프로모터 (간-특이적 (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1 :268-277), 림프구-특이적 프로모터 (lymphoid-specific promoter, Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), T 세포 수용체의 특정 프로모터 (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) 및 면역글로불린 (Banerji et al. ( 1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741 -748), 신경-특이적 프로모터 (neuron-specific promoters) [예를 들면, 신경미세섬유 프로모터 (neurofilament promoter); Byrne and Ruddle (1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], 췌장-특이적 프로모터 (pancreas-specific promoters) (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), 및 유선-특이적 프로모터 (mammary gland-specific promoters) [예를 들면, 밀크웨이 프로모터 (milk whey promoter); U.S. Pat. No. 4,873,316 및 유럽출원서 출원 No. 264, 166)를 포함한다. 예를 들면, 발달적-조절 프로모터 (developmentally-regulated promoter) 또한 포함되며, 그 예는 생쥐 혹스 프로모터 (murine hox promoters) (Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) 및 .알파.-페토단백질 프로모터 (.alpha, -fetoprotein promoter) (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)가 있다.
또한 본 발명은 안티센스 방향으로 재조합벡터로 클론된, 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 즉, 상기 DNA 분자는 PD-L3 또는 VISTA DNA와 안티센스인 DNA 분자의 발현 (DNA 분자의 전사에 의한)을 가능하게 하는 방법으로, 조작적으로 조절서열과 연결되었다. 안티센스방향으로 클로닝된 핵산분자와 조작적으로 연결된 조절 서열은 다양한 세포 종류에서 안티센스 RNA 분자를 지속적으로 발현시키는 것이 선택될 수 있다. 예를 들면 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서, 또는 조절서열은 안티센스 RNA의 발현을 항상 발현하거나, 조직 특이적 또는 세포종류 특이적으로 조절하는 것이 선택될 수 있다. 상기 안티센스 발현벡터는 벡터가 도입된 세포의 종류에 의해 결정된 높은 효율의 조절부위 및 활성하에서, 안티센스 핵산이 생산되는, 재조합 플라스미드, 파지미드(phagemid), 또는 약화된 바이러스 (attenuated virus)의 형태일 수 있다. 안티센스 유전자를 사용한 유전자 발현의 조절에 대한 고찰은 Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1 ) 1986을 참고할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, 예를 들면 재조합 발현벡터 내의 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자 또는 숙주세포의 게놈의 특이적 위치로의 상동성 재조합을 허용하는 서열을 포함한 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자가 도입된 숙주세포를 포함한다. "숙주세포" 및 "재조합 숙주세포"의 용어는 상호교환적으로 여기에서 사용된다. 상기 용어는 특정한 개체 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함한다. 왜냐하면 볼연변이 또는 환경적 영향에 의해 특정 변형이 연속되는 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 실제로 상기 자손은 모세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 여기에서 사용되는 용어의 영역내에 포함된다. 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 벡터 DNA는 일반적인 형질전환 (transformation) 또는 형질도입 (transfection) 기술을 통해 원핵 또는 진행 세포로 도입될 수 있다. 여기에서 사용되는 "형질전환" 및 "형질도입"은 외부 핵산 (예를 들면 DNA)를 숙주세포로 도입시키는, 당업계에 인지된 다양한 기술을 의미하고, 이는 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공동침전 (calcium phosphate or calcium chloride co-precipitation), DEAE-덱스트란-매개 형질도입 (DEAE-dextran-mediated transfection), 리포펙타민 (lipofection) 또는 전자침공 (electroporation)을 포함한다. 숙주세포의 형질도입 또는 형질전환을 위한 적절한 방법은 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 및 다른 실험적 매뉴얼에서 발견된다. 이러한 구성성분을 동정하고 선별하기 위해서, 선별마커 (예를 들면, 항생제 내성)를 일반적으로 표적 유전자와 함게 상기 숙주세포에 도입시킨다. 바람직한 선별마커는 약물, 예를 들면 G418, 하이지로마이신 (hygromycin) 및 메토트레세이트 (methotrexate)에 대해 내성을 제공하는 것을 포함한다. 본 발명의 숙주세포, 예를 들면 배지에서의 원핵 또는 진핵 숙주세포는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 생산 (즉, 발현)시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 나아가, 본 발명의 숙주세포를 사용함으로써 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 어떤 실시예에서, 상기 방법은 본 발명의 숙주세포 (PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 발현벡터가 도입된 숙주세포)를 적절한 배지에서 배양하는 것을 포함하여, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드가 생산될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 나아가 배지 또는 숙주세포로부터 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 분리하는 것으르 포함한다.
또한, 본 발명의 숙주세포는 비인간 형질도입 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 어떤 실시예에서, 본 발명의 숙주세포를 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드-암호화 서열이 도입된 난모세포 (oocyte) 또는 배아줄기세포에 수정시킨다. 그 후, 상기 숙주세포는 외생적 PD-L3 또는 VISTA 서열을 그들의 게놈으로 도입한, 비인간 형질도입 동물 또는 내생적 PD-L3 또는 VISTA 서열을 변형시킨 상동성 재조합 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 동물은 PD-L3 또는 VISTA의 활성 및/또는 기능을 연구하기 위해, 및 PD-L3 또는 VISTA 활성의 조절을 동정 및/또는 조사하기 위해 유용하다. 여기에서 사용되는, "형질도입 동물"은 하나 또는 그 이상의 상기 동물세포가 도입유전자 (transgene)을 포함한 비인간 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 쥐 (rat) 또는 생쥐 (mouse)와 같은 설치류 (rodent)이다. 형질도입 동물의 다른 예는 비인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 및 그와 같은 것을 포함한다. 도입유전자는 형질도입 동물이 발달하고 성숙한 상기 동물의 게놈에 남아있는 세포의 게놈으로 통합된, 외생적 DNA이고, 이로써 형질도입 동물의 하나 또는 그 이상의 세포종류 또는 조직에서의 암호화된 유전자 생산물을 발현한다. 여기서 사용되는, "상동성 재조합 동물 (homologous recombinant animal)"은 내생적 PD-L3 또는 VISTA 유전자가 상기 내생적 유전자 및 상기 동물의 세포로, 예를 들면 동물이 발달하기 이전에 상기 동물의 배아세포로 도입된, 외생적 DNA 분자 사이에서의 상동성 재조합에 의해 변형된, 비인간 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 생쥐이다. 본 발명의 형질도입 동물은 수정화된 난모세포의 수컷 전핵 (male pronuclei)에, 예를 들면 미세주입 (miicroinjection), 레트로바이러스 감염에 의해 PD-L3 또는 VISTA-암호화 핵산을 도입시키고, 상기 난모세포를 가임신한 대리모 동물 (pseudopregnant female foster animal)에서 발달하도록 함으로써 생산될 수 있다. 서열 번호: 1 또는 4의 PD-L3 또는 VISTA cDNA 서열을 비인간 동물의 게놈으로 도입 유전자로서 도입시킬 수 있다. 또는, 인간 PD-L3 또는 VISTA 유전자의 비인간 상동체, 예를 들면 원숭이 또는 쥐 PD-L3 또는 VISTA 유전자는 도입유전자로서 사용될 수 있다. 또는, PD-L3 또는 VISTA 유전자 상동체, 예를 들면 또 다른 PD-L3 또는 VISTA계 멤버는 서열 번호: 1 또는 3의 PD-L3 또는 VISTA cDNA 서열에 혼성화를 기초로 하여 분리될 수 있고(상기 하위 부분 I에 보다 기술됨), 도입유전자로서 사용될 수 있다. 인트론 서열 및 폴리아데닐화 신호 또한 도입 유전자의 발현 효과를 증가시키기 위해 포함될 수 있다. 조직-특이적 조절 서열은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 발현을 특정세포에서 일어나게 하기 위해 PD-L3 또는 VISTA 도입유전자와 조작적으로 연결될 수 있다. 배아조작 및 미세주입을 통한 형질도입 동물, 특히 쥐와 같은 동물을 생산하는 방법은, 당업계에 보편적이고, 예를 들면 U.S. Pat. Nos.4,736,866 and 4,870,009, both by Leder et al U.S. Pat. No. 4,873, 191 by Wagner et al. and in Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)에 기술되었다. 유사한 방법은 다른 형질도입 동물을 생산하기 위해 사용된다. 형질도입 수립 동물 (transgenic founder animal)은 상기 동물의 세포나 조직에서의 PD-L3 또는 VISTA mRNA의 발현, 또는 그것의 게놈에서의 PD-L3 또는 VISTA 도입유전자의 존재를 기초로 동정 될 수 있다. 그 후, 형질도입 수립 동물은 상기 도입유전자를 갖는 추가적 동물을 번식시키는데 사용될 수 있다. 또한, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 도입유전자를 갖는 형질도입 동물은 나아가 다른 도입유전자를 갖는, 다른 형질도입 동물로 번식될 수 있다.
상동성 재조합 동물을 생산하기 위해서, 결실, 첨가 또는 치환이 도입되는 PD-L3 또는 VISTA 유전자의 최소 부분을 포함하는 벡터가 제조됨으로써, PD-L3 또는 VISTA를 변형시키는, 예를 들면 기능적으로 파괴시킨다. 상기 PD-L3 또는 VISTA 유전자는 인간 또는 생쥐 유전자일 수 있다 (예를 들면 서열 번호: 1 또는 3의 cDNA).
또 다른 실시예에서, 상기 도입유전자의 발현을 조절하는 것을 허용하는 선별된 시스템을 포함하는 유전자 도입 비인간 동물이 생산될 수 있다. 상기 시스템의 한 예는 박테리아파지 PI (bacteriophage PI)의 cre/loxP 재조합효소 (recombinase) 시스템이다. cre/loxP 재조합효소 시스템의 기술에 대해, Lakso et al. (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236을 참고할 수 있다. 재조합효소 시스템의 또 다른 예는 S. cerevisiae의 FLP 재조합효소 시스템이다 (O'Gorman et al. (1991) Science 251 : 1351-1355). 만약 cre/loxP 재조합효소 시스템이 상기 도입유전자의 발현을 조절하는데 사용되었으면, Cre 재조합효소 및 선별된 폴리펩티드 모두를 암호화하는 도입유전자가 필수적이다. 상기 동물은 "이중" 형질도입 동물의 생성을 통해서, 예를 들면 두 개의 형질도입 동물, 선별된 폴리펩티드를 암호화하는 도입유전자를 포함하는 것 및 재조합효소를 암호화하는 도입유전자를 포함하는 다른 동물을 짝짓기 시킴으로써 제공될 수 있다.
또한, 여기서 기술되는 비인간 형질도입 동물의 클론은 Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813 및 PCT 국제출원 Nos. WO 97/07668 및 WO 97/07669에서 기술된 방법에 따라서 생산될 수 있다. 간략하게, 세포, 예를 들면 형질도입 동물로부터의 체세포는 분리될 수 있고, 성장사이클 (growth cycle)을 벗어나 G0 상 (phase)로 들어가기 위해 유도될 수 있다. 그 후, 상기 휴지기 세포 (quiescent cell)는, 예를 들면 전기적 자극 (electrical pulse)의 사용을 통해 상기 휴지기 세포가 분리된 동일한 종의 동물의 난모세포와 융합될 수 있다. 그 후 재건설된 난모세포는 배양되어, 상실배 (morula) 또는 미분화세포 (blastocyte) 단계로 발달된 후, 가임신 대리모 동물로 이식된다. 상기 대리모 동물의 자손은 상기 세포, 예를 들면 상기 체세포를 분리한 동물의 클론일 것이다.
IV . 약학적 조성물
PD-L3 또는 VISTA 분자, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 단편 및 항-PD-L3 또는 VISTA 항체 (또한 여기에서 "활성 화합물" 또는 "조절제 (modulating agents)"는 투여를 위한 적절한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으로 상기 핵산분자, 폴리펩티드 또는 항체 및 담체 (carrier), 예를 들면 약학적으로 이용가능한 담체를 포함한다. 여기서 사용하는, "약학적으로 이용가능한 담체"라는 용어는 약학적 투여를 할 수 있는 모든 용제 (solvent), 분산매 (dispersion media), 코팅 (coating), 항생 (antibacterial) 및 항균제 (antifungal agent), 등장 (isotonic) 및 흡수지연제 (absorption delaying agent), 및 그와 같은 것을 포함한다. 약학적 활성물질을 위한 상기 매질 (media) 및 제제 (agent)의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 어떠한 보편적 매질 또는 제제가 상기 활성물질과 공존할 수 없는 경우를 제외하고는, 상기 조성물에서 그것의 사용을 고려될 수 있다. 보조적 활성 조성물도 상기 조성물에 포함될 수 있다.
상기 조성물은 원하는 항원, 예를 들면 종양 항원, 또는 예를 들면 TLR 작용제 (Toll like receptor agonists), 알파 및 베타 인터페론과 같은 종류 1 인터페론 (type 1 interferon), 및 작용제적 CD40 항체 및 항체 단편과 같은 CD40 작용제와 같은 또 다른 면역조절 화합물, 바람직하게는 항-인간 CD40 작용제적 항체 및 항체 단편 또는 다른 면역증진제 또는 PD-L1 , PD-L2, CTLA4 융합 단백질 빛 그에 특이적인 항체와 같은 억제제를 포함한다.
어떤 바람직한 실시예에서, 상기 조성물 또는 PD-L3 또는 VISTA 기반 치료는 나아가 항원 또는 다른 면역작용제를 포함할 수 있다. 항원이 상기 조성물이나 치료에 존재할 때, 상기 항원은 그 항원에 대한 면역반응을 형성할 만큼 효과적인 양으로, 상기 조합의 다른 구성물질과 병용되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 항원은 약 100 μg/kg 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 항원은 약 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 항원은 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 하지만, 면역반응을 형성할만큼 효과적인 양으로 구성된 항원의 특정한 양은 어느정도 특정 요소, 예를 들면 투여되는 특정 항원; 투여되는 특정 작용제 및 그것의 양; 면역체계의 상태; 상기 작용제 및 상기 항원의 투여 방법 및 순서; 상기 제형이 투여되는 종 (species); 및 원하는 치료결과에 의존한다. 따라서, 상기 항원의 효과적인 양으로 구성되는, 일반적인 양을 개시하는 것은 현실적이지 않다. 하지만, 당업자들은 상기 요소들의 고려하에 적절한 양을 쉽게 결정할 수 있다.
상기 항원은 Th1 면역반응을 발생시킬 수 있는 어떠한 물질일 수 있고, 예를 들면 Th1 면역반응은 CD8+ T 세포 반응, NKT 세포 반응, .감마./.델타. T 세포 반응 (.gamma./.delta. T cell response), 또는 Thl 항체 반응의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 적절한 항원은 하기를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다; 펩티드; 폴리펩티드; 지질 (lipids); 당지질 (glycolipids); 다당류 (polysaccharides); 탄수화물 (carbohydrates); 폴리뉴클레오티드 (polynucleotides); 프리온 (prions); 살아있거나 또는 비활성화된 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 (live or inactivated bacteria, viruses or fungi); 및 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 원생동물 (protozoal), 종양-유래 또는 생물체-유래 (organism-derived) 항원, 독소 (toxin) 또는 변성독소 (toxoid).
또한, 특정 현재 실험적 항원 (currently experimental antigens), 특히 강한 면역반응을 발생시키지 않는 재조합 단백질, 당단백질, 및 펩티드는 본 발명의 보강제 조합 (adjuvant combinations)과 연결되어 사용될 수 있다. 예시적인 실험적 하위단위 항원 (experimental subunit antigen)은 바이러스 질환에 관련된 것, 예를 들면 아데노바이러스 (adenovirus), AIDS, 수두 (chicken pox), 거대세포바이러스 (cytomegalovirus), 뎅기 (dengue), 고양이 백혈병 (feline leukemia), 폴 플라그 (fowl plague), A형 간염 (hepatitis A), B형 간염 (hepatitis B), HSV-1 , HSV-2, 돼지 콜레라 (hog cholera), 인플루엔자 A (influenza A), 인플루엔자 B (influenza B), 일본뇌염 (Japanese encephalitis), 홍역 (measles), 파라인플루엔자 (parainfluenza), 광견병 (rabies), 호흡기세포융합바이러스 (respiratory syncytial virus), 로타바이러스 (rotavirus), 사마귀 (wart), 및 황열 (yellow fever)을 포함한다.
어떤 실시예에서, 상기 항원은 암 항원 또는 종양 항원일 수 있다. 암 항원 및 종양 항원의 용어는 상호교환적으로 사용되고 암세포에 의해 상이하게 발현되는 항원을 의미한다. 그러므로, 암 항원은 암세포에 대한 면역반응만을 상이하게 표적시키기 위해 적용될 수 있다. 따라서, 암 항원은 잠재적으로 종양-특이적 면역반응을 자극시킬 수 있다. 특정 암 항원은, 반드시 발현되지는 않지만, 정상세포에 의해 암호화된다. 상기 항원의 일부는 정상세포에서 정상적으로는 조용한 (즉, 발현되지 않은) 것, 분화의 특정 단계에서 발현하는 것, 및 일시적으로 발현하는 (예를 들면, 배아 및 태아 항원)것으로 특징화된다. 다른 암 항원은, 예를 들면 암유전자 (oncogene) (예를 들면, 활성화된 ras 암유전자), 억제유전자 (예를 들면, 돌연변이 p53), 또는 내부 결실 또는 염색체 전좌 (chromosomal translocation)로부터 생겨난 융합 단백질과 같은 돌연변이 세포 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 다른 암유전자도 RNA 및 DNA 종양 바이러스에 의해 운반되는 것과 같이 바이러스 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
종양 유전자의 예는 MAGE, MART-1 Melan- , gplOO, 디펩티딜 펩티다아제 IV (Dipeptidyl peptidase IV; DPPUV), 아데노신 데아미나아제-결합 단백질 (adenosine deaminase-binding protein; ADAbp), 사이클로필린 b (cyclophilin b), 대장관련항원 (Colorectal associated antigen; CRC)-C017-1 A/GA733, 발암배아성 항원 (carcinoembryonic Antigen; CEA) 및 그것의 항원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, am 11 , 전립선특이적항원 (Prostate Specific Antigen; PSA) 및 그것의 항원성 에피토프 PSA-2, and PSA-3, 전립선특이적막항원 (prostate-specific membrane antigen; PSMA), T-세포 수용체/CD3-.제타.사슬 (.zeta. chain), 종양항원의 MAGE-계 (예를 들면, MAGE-A1 , MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE- A 1 1 , MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), 종양항원의 GAGE-계 (예를 들면, GAGE-1 , GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM- 1 , CDK4, 티로시나아제 (tyrosinase), p53, MUC계, HER2/neu, p21ras, RCAS 1 , .알파.-페토단백질 (.alpha.-fetoprotein), .입실론.-캐드헤린 (.epsilon.-cadherin), .알파.-카테닌 (.alpha.-catenin), .베타.-카테닌 (.beta.-catenin), .감마.-카테닌 (.gamma.-catenin), pl20ctn, gplO.sup.Pmel l17, PRAME, NY-ESO-1 , cdc27, 아데노마토스 폴리포시스 코일 단백질 (adenomatous polyposis coli protein; APC), 포드린 (fodrin), 컨넥신 37 (Connexin 37), Id-이디오타입 (Ig-idiotype), pi 5, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드 (gangliosides), 인간파필로마바이러스 (human papilloma virus proteins)의 단백질과 같은 바이러스 생산물, 종양항원의 Smad계, Imp-1, PI A, EBV-암호화 핵항원 (encoded nuclear antigen; EBNA)-l, 뇌 글리코겐 포스포릴라아제 (brain glycogen phosphorylase), SSX-1 , SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2를 포함한다.
상기 종양과 관련된 (하지만 제한적이지 않음) 암 또는 종양 및 특이적 종양항원은 급성 림프아세포성 백혈병 [acute lymphoblastic leukemia (etv6, aml l , cyclophilin b)], B 세포 백혈병 [B cell lymphoma (Ig-idiotype)], 신경교종 [glioma (E-cadherin, .alpha. -catenin, .beta.-catenin, .gamma.-catenin, pl20ctn)], 방광암 [bladder cancer (p21ras)], 담도암 [biliary cancer (p21ras)], 유방암 [breast cancer (MUC family, HER2 neu, c-erbB-2)], 자궁경부암 [cervical carcinoma (p53, p21ras)], 대장암 [colon carcinoma (p21ras, HER2 neu, c-erbB-2, MUC family)], 결장암 [colorectal cancer (Colorectal associated antigen (CRC)-C017-1 A GA733, APC)], 융모암 [choriocarcinoma (CEA)], 상피세포암 [epithelial cell cancer (cyclophilin b)], 위장암 [gastric cancer (HER2 neu, c-erbB-2, ga733 glycoprotein)], 간세포암 [hepatocellular cancer (.alpha.-fetoprotein)], 호치킨 림프종 [Hodgkins lymphoma (Imp- l, EBNA-1)], 폐암 [lung cancer (CEA, MAGE-3, NY-ESO-1)], 림프구-유래 백혈병 [lymphoid cell-derived leukemia (cyclophilin b)], 흑색종 [melanoma (p5 protein, gp75, oncofetal antigen, GM2 and GD2 gangliosides, Melan- A/MART- 1 , cdc27, MAGE-3, p21ras, gpl00.sup.Pmel ! 17)], 골수종 [myeloma (MUC family, p21ras)], 비소세포성폐암 [non-small cell lung carcinoma (HER2/neu, c-erbB-2)], 비인두암 [nasopharyngeal cancer (Imp-1, EBNA-1)], 난소암 [ovarian cancer (MUC family, HER2/neu, c-erbB,-2)], 전립선암 [prostate cancer (Prostate Specific Antigen (PSA) 및 그의 항원성 에피토프 PSA-1 , PSA-2, 및 PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2, ga733 glycoprotein)], 신장암 [renal cancer (HER2 neu, c-erbB-2)], 자궁경부 및 식도의 편평상피세포암 [squamous cell cancers of the cervix and esophagus (human papilloma virus proteins와 같은 바이러스 생산물)], 고환함 [testicular cancer (NY-ESO-1)], 및 T 세포 백혈병 [T cell leukemia (HTLV-1 epitopes)]를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 그것의 투여경로가 가능하게 하기 위해 제형된다. 투여경로의 예는, 예를 들면 정맥내(intravenous), 피내 (intradermal), 피하 (subcutaneous)와 같은 비경구 (parenteral), 경구 (oral) [예를 들면, 흡입 (inhalation)], 경피 (transdermal) [국소성 (topical)], 경점막 (transmucosal), 및 직장투여 (rectal administration)를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하의 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액 (suspension)은 하기의 구성요소를 포함할 수 있다: 추입을 위한 물, 식염수 (saline solution), 고정유 (fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycols), 글리세린 (glycerine), 프로필렌 글리콜 (propylene glycol) 또는 다른 합성 용제 (synthetic solvents)과 같은 멸균 희석액 (sterile diluent); 벤질알코올 (benzyl alcohol) 또는 메틸파라벤 (methyl parabens)와 같은 항생제; 아스코르브산 (ascorbic acid) 또는 소듐바이설피트 (sodium bisulfite)와 같은 항산화제 (antioxidants); 에틸렌디아민테트라아세틸산 (ethylenediaminetetraacetic acid)과 같은 킬레이팅제(chelating agents); 아세테이트 (acetates), 시트레이트 (citrates) 또는 포스페이트 (phosphates)와 같은 버퍼, 및 소듐클로라이드 (sodium chloride) 또는 덱스트로오즈 (dextrose)와 같은 긴장성 (tonicity) 조절을 위한 제제. pH는 염산이나 또는 수산화나트륨과 같은, 산 또는 염기를 사용하여 조절될 수 있다. 상기 비경구 제조는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알에 동봉될 수 있다.
주입할 수 있는 용도에 적절한 약학적 조성물은 멸균된 수용액 (물이 녹는) 또는 현탁액, 및 멸균된 주입가능한 용액 또는 현탁액의 임시준비를 위한 멸균가루 (sterile powder)를 포함한다. 정맥투여를 위해, 적절한 담체는 생리식염수 (physiological saline), 정세균성 물 (bacteriostatic water), 크레모포어 (Cremophor) EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 버퍼 식염수 (phosphate buffered saline; PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 상기 조성물은 멸균되어야 하고, 쉽게 주사기이용성 (syringeability)이 존재하는 정도의 유동액이여야 한다. 제조 및 저장의 조건하에서 안정적이여야하며, 박테리아 및 곰팡이과 같은 미생물의 작용에 오염되는 것에 대해 보호되어야만 한다. 상기 담체는 용제 또는 현탁액 배지일 수 있고, 이것은 예를 들면 물, 에탄올 ,폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체성 폴리에틸렌 글리콜, 및 그와 같은 것) 및 그것의 적절한 혼합물이다. 상기 적절한 유동성은, 예를 들면 레시틴 (lecithin)과 같은 코팅을 사용함으로써, 현탁액의 경우에 요구되는 입자크기의 유지에 의해, 및 계면활성제 (surfactant)의 사용에 의해 유지되어야한다, 미생물작용의 방지는 다양한 항생제 및 항균제, 예를 들면 파라벤 (parabens), 클로로부탄올 (chlorobutanol), 페놀 (phenol), 아스코르브산 (ascorbic acid), 티머로살 (thimerosal) 및 그와 같은 것에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 상기 조성물에 등장제 (isotonic agents), 예를 들면 당 (sugar), 만니톨 (mannitol)과 같은 폴리알코올 (polyalcohol), 소르비톨 (sorbitol), 및 소듐클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주입가능한 조성물의 연장된 흡수 (prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스티아레이트 (aluminum monostearate) 및 젤라틴 (gelatin)을 상기 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
멸균된 주입가능한 용액은 활성화합물 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 단편, 항-PD-L3 또는 VISTA 항체, 또는 항-PD-L3 또는 VISTA 항체 및 항-PD-L1 항체의 조합과 같은 조절제)을 상기 열거된 구성물질의 하나 또는 조합과 함께 적절한 용제에 필요한 양을 포함시키고, 필요하다면 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 현탁액은 상기 활성 화합물을 염기성 현탁액 배지 및 상기 열거된 것으로부터 상기 요구되는 다른 구성요소를 포함하는, 멸균된 매개체 (vehicle)로 포함시킴으로써 제조된다. 멸균된 주입가능한 용액의 제조를 위한 멸균된 가루의 경우에는, 제조의 바람직한 방법은 그것의 미리 멸균된 여과용액으로부터 원하는 추가적 구성요소와 함께 상기 활성 구성요소의 가루를 제공하는, 진공 건조 및 동결건조이다.
일반적으로 구강 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용의 담체를 포함한다. 그들은 젤라틴 캡슐에 동봉될 수 있고 또는 타블렛으로 둘러쌓여질 수 있다. 경구 치료적 투여의 목적을 위해, 상기 활성 화합물은 첨가제와 함께 포함될 수 있고, 타블렛, 알약 (troche) 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 경구 조성물은 입세척을 위한 용도를 위해 유동담체 (fluid carrier)를사용하여 제조될 수 있고, 여기에서 상기 유동담체에 있는 상기 조성물은 경구적으로 적용되고 뱉어지거나 또는 삼켜질 수 있다. 약학적으로 양립가능한 결합제, 및/또는 보강물질은 상기 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 타블렛, 약 (pill), 캡슐, 알약 (trouche) 및 그와 같은 것은 하기의 구성요소, 또는 유사한 특성의 조성물의 어떤 것을 포함할 수 있다: 마이크로크리스탈린 셀룰로오즈 (microcrystalline cellulose)와 같은 바인더 (binder), 트래거캔스 고무 (gum tragacanth) 및 젤라틴; 전분 (starch) 또는 락토오즈 (lactose)와 같은 첨가제 (excipient), 알긴산 (alginic acid), 프리모겔 (Primogel), 또는 옥수수전분 (corn starch)과 같은 붕해제 (disintegrating agent); 스테아린산마그네슘 (magnesium stearate) 또는 스테로테스 (Sterotes)와 같은 윤활유 (lubricant); 콜로이달 실리콘 디옥시드 (colloidal silicon dioxide)와 같은 글리단트 (glidant); 수크로오즈 (sucrose) 또는 사카린 (saccharin)과 같은 감미제 (sweetening agent) ; 또는 페퍼민트 (peppermint), 메틸살리실레이트 (methyl salicylate), 또는 오렌지향신료 (orange flavoring)와 같은 착향료 (flavoring agent).
흡입에 의한 투여를 위해, 상기 화합물은 적절한 분사제 (propellant), 예를 들면 이산화탄소와 같은 기체를 포함한 압축된 용기 또는 기계 (dispenser)로부터 애로솔 스프레이(aerosol spray) 또는 분무기 (nebulizer)의 형태로 전달된다.
또한, 전신적 투여는 경점막 (transmucosal) 또는 경피 (transdermal)의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피투여에 대해, 스며드는 장벽에 대한 적절한 침투제 (penetrant)는 상기 제형에 사용될 수 있다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 예를 들면 경점막 투여를 위하여, 세제 (detergent), 담즙산염 (bile salt), 및 푸시딘산 유도체 (fusidic acid derivative)를 포함한다. 경점막 투여는 비강스프레이 (nasal spray)의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 경점막 투여를 위해, 상기 활성 화합물은, 당업계에 일반적으로 알려진 것과 같이 연고 (ointments), 유연고 (salves), 젤 (gels), 또는 크림 (creams)로 제형될 수 있다.
또한, 상기 화합물은 직장 (rectal)에 운반하기 위해 좌약 (suppositories)의 형태 (예를 들면, 코코아버터 및 다른 글리세리드와 같은 보편적인 좌약 기반제와 함께) 또는 보유관장제 (retention enemas)로 제조될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 활성화합물은 체내로부터 급속한 제거에 대해 상기 화합물을 보호하는 담체, 예를 들면 임플란트 (implant) 및 마이크로캡슐화 운반시스템 (microencapsulated delivery systems)을 포함하는 조절분비제형 (controllled release formulation)과 함께 제조된다. 생분해성 (biodegradable), 생체에 적합한 (biocompatible) 폴리머가 사용될 수 있고, 예를 들면 에틸렌 비닐 아세테이트 (ethylene vinyl acetate), 폴리안하이드리드 (polyanhydrides), 폴리글리콜릭산 (polyglycolic acid), 콜라겐 (collagen), 폴리오르소에스테르 (polyorthoesters), 및 폴리아세틱산 (polylactic acid)이 있다. 상기 제형의 제조 방법은 당업자에게 자명하다. 또한, 상기 물질 (바이러스 항원에 대한 단일클론항체로 담염된 세포를 표적화하는 리포좀을 포함)은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, InC Liposomal suspensions로부터 상업적으로 수득될 수 있고, 약학적으로 이용가능한 담체로서 사용될 수있다. 이것은 예를 들면 U.S. Pat. No. 4,522,81 1에 기술된 것과 같이, 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다.
용량단위 (dosage unit)를 경구 또는 비경구 조성물로 제형하는 것은 투여의 용이성 및 용량의 일관성에서 특히 이득이 있다. 여기에서 사용되는 용량단위형태는 치료될 개체를 위한 일원화된 용량으로서 적절한 물리적 구별단위를 의미한다; 각각의 단위는 필수적인 약학적 담체와 관련된 원하는 치료효과를 생산하기 위해 산출되는 활성 화합물의 예정양 (predetermined quantity)를 포함한다. 본 발명의 상기 용량단위 형태를 위한 구체적인 설명은 제시되었고, 성취되는 특정 치료효과 및 상기 활성화합물의 독특한 특징, 및 개개인을 치료하기 위한 상기 활성화합물을 구성하는 내재된 제한에 직접적으로 의존한다.
상기 화합물의 독성 및 치료적 효과는 세포배양 또는 실험동물에서 일반적인 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 상기 세포배양 검사 및 동물연구로부터 수득된 데이터는 인간에서의 사용을 위한 용량의 범위를 결정하는데 사용될 수 있다. 상기 화합물의 용량은 바람직하게 적은 ED50 또는 독성이 없는 것을 포함하는 농도 주위의 범위내에 놓여있다. 상기 용량은 적용된 용량형태에 따른 범위내에서 다양할 수 있고, 상기 투여경로가 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 화합물에 대해, 상기 치료적으로 효과있는 투여량 (dose)은 세포배양검사로부터 초기에 측정될 수 있다. 투여량은 세포배양에서 결정된 IC50 (즉, 증상의 최대 억제의 반을 성취하는 상기 검사화합물의 농도)을 포함하는 혈장농도범위 주위를 이루어내는 동물모델에서 제형될 수 있다. 상기 정보는 인간에서 유용한 투여량이 보다 정확하게 결정되기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 혈장에서의 수준은 고성능액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography)에 의해 측정될 수 있다.
여기에서 정의된 것과 같이, 단백질 또는 폴리펩티드의 치료적으로 효과적인 양 (즉, 효과적인 용량)은 약 0.001 내지 30 mg/kg 체중의 범위, 바람직하게는 약 0.01 내지 25 mg/kg 체중의 범위, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중의 범위, 및 보다 더욱 바람직하게는 약 1 내지 10 mg/kg, 2 내지 9 mg kg, 3 내지 8 mg/kg, 4 내지 7 mg/kg, 또는 5 내지 6 mg/kg 체중의 범위이다. 당업자는 특정 요소가 개체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 상기 용량에 영향을 미치고, 예를 들면 질환 또는 장애의 심각도, 이전의 치료, 상기 개체의 일반적인 건강 또는/및 나이, 존재하는 다른 질환이 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 단백질, 폴리펩티드 또는 항체의 치료적으로 효과적인 양으로 개체를 치료하는 것은 단일 치료 (single treatment)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 치료의 연속을 포함할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 개체는 약 1주 내지 10주, 바람직하게는 2주 내지 8주, 보다 바람직하게는 약 3주 내지 7주, 및 보다 더 바람직하게는 약 4주, 5주 또는 6주사이 동안에 주 1회의 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중 범위에서 항체, 단백질 또는 폴리펩티드로 치료될 수 있다. 치료를 위해 사용되는 항체, 단백질 또는 폴리펩티드의 효과적 용량은 특정 치료의 과정에 따라 증가되거나 또는 감소될 수 있다는 것 또한 이해될 것이다. 용량에서의 변화는 여기에서 기술되는 진단검사의 결과로부터 야기될 수 있고, 명확해 질 수 있다.
본 발명은 PD-L3 또는 VISTA의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함한다. 예를 들면 제제는 작은 분자일 수 있다. 예를 들면, 상기 작은 분자는 펩티드, 펩티도모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 몰 (mole) 당 약 10,000 그람 (gram) 이하의 분자량을 가지는 유기 또는 무기 화합물 (즉 이종생물체 또는 생물대사 화합물을 포함하는), 몰 당 약 5,000 그람 (gram) 이하의 분자량을 가지는 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 1,000 그람 (gram) 이하의 분자량을 가지는 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 500 그람 (gram) 이하의 분자량을 가지는 유기 또는 무기 화합물, 및 염, 에스테르 (esters), 및 상기 화합물의 다른 약학적 이용가능한 형태를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 작은 분자제제의 적절한 용량은 당업계의 의료관계자, 수의학자 또는 연구자의 지식의 영역에 포함되는 많은 요소에 의존한다는 것이 이해된다. 예를 들면, 상기 작은 분자의 용량은 동정 (identity), 크기, 및 치료될 개체 및 시료의 상태에 의존하고, 나아가 상기 조성물이 투여될 경로, 가능하다면 의료진이 본 발명의 상기 핵산 또는 폴리펩티드처럼 작은 분자가 가지기를 바라는 효과에 의존하여 다양할 것이다.
예시적 용량은 개체 또는 시료의 무게의 킬로그람 (kilogram) 당 작은 분자량의 밀리그람 (milligram) 또는 마이크로그람 (microgram)을 포함한다 (예를 들면, 킬로그람 당 약 1 마이크로그람 내지 킬로그람 당 약 500 밀리그람, 킬로그람 당 약 100 마이크로그람 내지 킬로그람 당 약 5 밀리그람, 또는 킬로그람 당 약 1 마이크로그람 내지 킬로그람 당 약 50 마이크로그람). 조절될 발현 또는 활성에 대해 작은 분자의 적절한 용량은 작은 분자의 효능에 의해 결정된다는 것이 이해된다. 상기 적절한 용량은 여기에서 기술된 검사를 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 상기 작은 분자의 하나 또는 그 이상은 동물로 (예를 들면, 인간) 투여될 때, 예를 들면 의료관계자, 수의학자, 또는 연구자가 처음에는 상대적으로 낮은 투여량을 처방하고, 그 후에 적절한 반응이 보일 때까지 상기 투여량을 증가시킨다. 또한, 어떤 특정 동물개체에 대한 특이적 용량수준은 적용되는 특이적 화합물의 활성, 개체의 나이, 체중, 일반적 건강, 성별 및 식이요법, 투여시간, 투여경로, 배설율 (rate of excretion), 어떤 병용약물, 및 조절되는 발현 또는 활성의 정도를 포함한 다양한 요소에 의존하는 것이 이해된다.
또한, 항체 (또는 그것의 단편)은 세포독성과 같은 치료적 모이어티 (therpeutic moiety), 약학적으로 이용가능 또는 방사선활성 금속이온과 결합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 치명적인 어떠한 제제를 포함한다. 예를 들면 탁솔 (taxol), 사이토칼라신 B (cytochalasin B), 그라미시딘 D (gramicidin D), 에티듐 브로마이드 (ethidium bromide), 에메타인 (emetine), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 테노포시드 (tenoposide), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 콜히친 (colchicin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 디하이드록시 안타라신 디온 (dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론 (mitoxantrone), 미트라마이신 (mithramycin), 액티노마이신 D (actinomycin D), 1-데하이드로테스토스테론 (1 -dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드 (glucocorticoids), 프로카인 (procaine), 테트라카인 (tetracaine), 리도카인 (lidocaine), 프로파놀올 (propranolol), 및 푸로마이신 (puromycin) 및 그것의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료적 제제는 항대사체 (antimetabolites) [예를 들면, 메토트레세이트 (methotrexate), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine), 6-티오구아닌 (6-thioguanine), 시타라바인 (cytarabine), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 데마르바진 (decarbazine)], 알킬화제 (alkylating agents) [예를 들면, 메클로레타민 (mechlorethamine), 티오에파 클로람부실 (thioepa chlorambucil), 멜팔란 (melphalan), 카르무스틴 (carmustine; BSNU) 및 로무스틴 (lomustine; CCNU), 사이클로토스파미드 (cyclothosphamide), 부술판 (busulfan), 디브로모만니톨 (dibromomannitol), 스트렙토조토신 (streptozotocin), 미토마이신 C (mitomycin C), 및 시스-디클로로디아민 플라티늄 (II) (cis-dichlorodiamine platinum (II); DDP) 시스플라틴 (cisplatin)], 안트라사이클린 (anthracyclines) [예를 들면, 다우노루비신 (daunorubicin (이전에는 다우노마이신 (daunomycin)) 및 독소루비신 (doxorubicin)], 항생제 (antibiotics) [예를 들면, 닥티노마이신 (dactinomycin) (이전에는 액티노마이신 (actinomycin)), 블레오마이신 (bleomycin), 미트라마이신 (mithramycin), 및 안트라마이신 (anthramycin; AMC)], 및 항-유사분열제 (anti-mitotic agents) [예를 들면, 빈크리스틴 (vincristine) 및 빈블라스틴 (vinblastine)]를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 결합체 (conjugate)는 주어진 생물학적 반응을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 상기 약물 모이어티는 일반적인 화학 치료제로 제한하여 제작하지 않는다. 예를 들면, 상기 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 아브린 (abrin), 리신 A (ricin A), 수도모나스 내독소 (pseudomonas exotoxin), 또는 디프테리아 독소 (diphtheria toxin)를 포함할 수 있고; 단백질은 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 알파-인터페론 (alpha-interferon), 베타-인터페론 (beta-interferon), 신경성장인자 (nerve growth factor), 혈소판유래성장인자 (platelet derived growth factor), 조직 플라스미노겐 활성제 (tissue plasminogen activator)를 포함할 수 있으며; 생물학적 반응 조절제는, 예를 들면 림포키안 (lymphokines), 인터루킨-1 (interleukin-1; "IL-1"), 인터루킨-2 (interleukin-2; "IL-2"), 인터루킨 (interleukin-6; "IL-6"), 과립구대식세포콜로니자극인자 (granulocyte macrophage colony stimulating factor; "GM-CSF"), 과립구콜로니자극인자 (granulocyte colony stimulating factor; "G-CSF"), 또는 다른 성장인자 (growth factors)를 포함할 수 있다. 항체에 대한 상기 치료적 모이어티 결합적 기술을 잘 알려져 있다.
본 발명의 핵산분자는 벡터로 삽입될 수 있고, 치료적 벡터 유전자로서 사용될 수 있다. 유전자치료 벡터는 예를 들면 정맥내 주입, 국소투여 (local administration) (U.S. Pat. No. 5,328,470 참조) 또는 입체공간적주입 (stereotactic injection) (예를 들면, Chen et al. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91 :3054-3057 참조)을 통해 개체에 운반될 수 있다. 상기 유전자치료 벡터의 약학적 제조는 이용가능한 희석제에 유전자치료 벡터를 포함할 수 있고, 또는 상기 유전자 전달수단이 끼워진 서방형 매트릭스 (slow release matrix)를 포함할 수 있다. 또는, 상기 완전한 유전자운반벡터, 예를 들면 레트로바이러스가 재조합세포로부터 완전하게 생산될 때, 상기 약학적 제조는 상기 유전자 운반시스템을 생산하는, 하나 또는 그 이상의 세포를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 투여용법과 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서 (dispenser)에 포함될 수 있다.
V. 본 발명의 용도 및 방법
PD-L3 또는 VISTA 분자, 예를 들면 여기서 기술되는 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, 폴리펩티드, 폴리펩티드 상동체, 및 항체 및 항체단편은 하기의 방법의 하나 또는 그 이상에서 사용될 수 있다: a) 스크리닝 검사 (screening assays); b) 예측 의학 (predictive medicine) [예를 들면, 진단검사, 예상검사 (prognostic assays), 임상시험의 모니터링 (monitoring clinical trials)]; 및 c) 치료방법 (예를 들면, 면역반응을 상향 또는 하향조절하는 치료적 및 예방적). 여기서 기술되는, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 하기의 활성 하나 또는 그 이상을 가진다: 1) 그것의 자연 결합 파트너와 결합하거나 및/또는 그 활성을 조절한다, 2) 세포사이 또는 세포내 신호를 조절한다, 3) T 림프구의 활성화를 조절한다, 4) 생물체의 면역반응을 조절한다, 예를 들면 생쥐 또는 인간과 같은 포유류 생물체. 예를 들면, 본 발명의 상기 분리된 핵산분자는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 (예를 들면 유전자치료 적용에서 숙주세포내의 재조합 발현벡터를 통해서)를 발현시키고, PD-L3 또는 VISTA mRNA (예를 들면 생물학적 시료내에서) 또는 PD-L3 또는 VISTA 유전자내에서 유전자 변형을 탐지하며, 및 하기에 더 기술될, PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하기 위해서 사용될 수 있다. 상기 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 PD-L3 또는 VISTA 억제제의 생산 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 불충분하거나 또는 과다한 생산에 의해 특징화될 수 있다. 또한, 상기 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너를 자연적으로 발생하는 것을 스크리닝하고, PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는 약물 또는 화합물을 스크리닝하며, 또한 불충분하거나 또는 과다한 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생산, 또는 PD-L3 또는 VISTA 야생형 폴리펩티드와 비교할 때 감소되거나, 이상하거나 또는 원치않는 활성을 가지는 PD-L3 또는 VISTA의 생산형태에 의해 특징지어지는 질병 또는 장애 [예를 들면, 면역체계 장애는 중증복합면역결핍증 (severe combined immunodeficiency), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 전신홍반성루푸스 (systemic lupus erythematosus), 종류 I 당뇨병 (type I diabetes mellitus), 림프증식성증후군 (lymphoproliferative syndrome), 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease), 알러지 (allergies), 천식 (asthma), 이식편대숙주병 (graft-versus-host disease), 및 이식거부 (transplant rejection); 박테리아 및 바이러스와 같은 감염성 병원균에 대한 면역반응; 및 림프종 및 백혈병과 같은 면역체계 암이 있다]를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-PD-L3 또는 VISTA는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 탐지하거나 분리하고, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하고, 및 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는데, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합을 조절함으로써 사용될 수 있다.
A. 스크리닝 검사:
본 발명은 조절자, 즉 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 결합하거나, PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 PD-L3 또는 VISTA 활성에서와 같은 자극적 또는 억제적 효과를 가거나 또는 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호작용에서 자극적 또는 억제적 효과를 가지는 후보자 또는 검사 화합물 또는 제제 (펩티드, 펩티도모방테, 작은 분자 또는 다른 약물)를 동정하기 위한 방법 (여기에서 "스크리닝 검사"라고도 일컬어짐)을 제공한다.
어떤 실시예에서, 상기 발명은 PD-L3 또는 VISTA 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부위와 결합하는 후보자 또는 검사 화합물, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 그것의 자연적 결합 파트너와 상호결합하는 능력을 조절하는 것을 스크리닝하기 위한 검사를 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성부위와 결합하거나 또는 그것의 활성을 조절하는 후보제 또는 검사화합물을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너 사이의 상호결합에서의 효과에 기초하거나 또는 여기에서 동정된 PD-L3 또는 VISTA에 의해 음성적으로 조절되는 면역기능에서의 자극적 또는 억제적 효과를 가지는 후보자 또는 검사 화합물을 스크리닝하기 위한 검사를 제공한다. 상기 PD-L3 또는 VISTA 관련 기능은 사이토카인 (예를 들면, U-2, T 세포에 의한 감마 인터페론) 생산을 억제, 중도 (moderate) CD28 공동자극을 억제, CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 억제, 나이브 및 기억 CD4+ T 세포의 증식 억제, 세포자멸사를 유도하지 않고 TCR 활성화 억제를 예로써 포함한다. 본 발명의 검사 화합물은 당업계에 알려진 조합 라이브러리 방법에 있는 많은 접근의 어떤 것이라도 사용함으로써 수득 될 수 있고, 이것은 생물학적 라이브러리 (biological libraries); 공간적 기술가능한 평행고체상 (spatially addressable parallel solid phase) 또는 용액상 라이브러리 (solution phase libraries); 데콘볼루션 (deconvolution)을 필수로 하는 합성 라이브러리 방법 (synthetic library methods); 1-비드-화합물 라이브러리 방법 (one-bead one-compound' library method); 및 친화성 크로마토그래피 선별 (affinity chromatography selection)을 사용한 합성 라이브러리 방법 (synthetic library methods)을 포함한다. 상기 생물학적 라이브러리 접근은 펩티드 라이브러리로 제한되는 반면, 상기 다른 4개의 접근은 펩티드, 화합물의 비펩티드 올리고머 또는 작은분자에 적용이 가능하다 (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).
어떤 실시예에서, 검사는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부위를 발현하는 세포가 검사 화합물과 접촉시키는 단계 및 상기 검사 화합물의 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는 능력을 결정하는 단계를 포함하는, 세포-기반 검사 (cell-based assay)이다. PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는 상기 검사화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA의 그 자연적 결합 파트너와 결합하고 및 면역세포 활성을 조절하는 능력을 모니터함으로써 이루어질 수 있다. 상기 면역세포는 예를 들면 T 세포, B 세포 또는 골수성 세포일 수 있다. 대응-수용체 (counter-receptor) (결정될)와 PD-L3 또는 VISTA 결합을 조절하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예를 들면 검사 화합물의 PD-L3 또는 VISTA 대응-수용체를 발현하는 T 세포와 PD-L3 또는 VISTA의 결합을 조절하기 위해 방사선동위원소 또는 효소적 표지와 PD-L3 또는 VISTA를 결합시킴으로써 이루어질 수 있다. PD-L3 또는 VISTA와 결합하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들면 상기 화합물을 방사선동위원소 또는 효소적 표지와 결합시킴으로써 이루어질 수 있고, 이로써 상기 화합물과 PD-L3 또는 VISTA의 결합은 복합체 내의 표지된 PD-L3 또는 VISTA 화합물을 탐지함으로써 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 영역내에 상호결합자의 어떠한 표지도 없이 PD-L3 또는 VISTA와의 상호결합을 하는 화합물의 능력을 결정하는 것이 있다. 예를 들면, 마이크로피지오미터 (microphysiometer)가, 상기 화합물 또는 마이크로피지오미터의 표지 없이, 화합물 상호작용을 탐지하는데 사용할 수 있다(McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906- 1912). 여기에서 사용되는, "마이크로피지오미터" (예를 들면, 세포센서 (cytosensor)는 세포가 빛-표시 포텐티오메트릭 센서 (light-addressable potentiometric sensor; LAPS)를 사용하여 그 환경을 산화시키는 비율을 측정하는 분석적 기계이다. 이러한 산성화의 변화는 화합물 및 PD-L3 또는 VISTA 사이의 상호결합의 지표로서 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 검사는 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너를 발현하는 T 세포를 검사 화합물에 접촉시키는 단계와 상기 검사 화합물의 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너의 활성을 조절 (예를 들면, 자극 또는 억제)하는 능력을 정하는 단계로 구성된 세포-기반 검사이다. 상기 검사 화합물의 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너의 활성을 조절하는 능력을 결정하는 것을, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 PD-L3 또는 VISTA 결합파트너와 결합하는 능력 또는 그것과 상호결합하는 능력을 결정함으로써 이루어질 수 있다.
PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 또는 그것의 생물학적 활성 단편의 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 결합하는 능력 또는 그것과 상호작용하는 능력을 결정하는 것은 직접적 결합을 결정하는 상기 기술된 방법 중 하나에 의해 이루어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA의 PD-L3 또는 VISTA 결합파트너와 결합하거나 또는 그것과 상호작용하는 능력을 결정하는 것은 상기 결합 파트너의 활성을 결정함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 결합 파트너의 활성은 세포 2차 전달자 (cellular second messenger) (예를 들면, 티로신 키나아제 또는 포스파타아제 활성)의 유도를 탐지하거나, 적절한 기질의 촉매적/효소적 활성을 탐지하거나, 수용체 유전자 (예를 들면 루시퍼라아제와 같은 탐지가능한 마커를 암호화하는 핵산과 조작적으로 연결된 표적-반응 조절인자를 포함하는)의 유도를 탐지하거나, 또는 표적-조절세포반응을 탐지함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 자연적 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 결합하거나 또는 상호작용하는 능력을 결정하는 것은 면역세포 공동자극을 조잘하는 화합물의 능력 및 증식검사에서 억제를 측정함으로써, 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 부분을 인지하는 항체와 결합하는 PD-L3 또는 VISTA의 능력을 방해함으로써 이루어질 수 있다. 어떤 실시예에서, T 세포 활성화를 조절하는 화합물은 T 세포의 증식 또는 사이토카인 생산을 조절하는 화합물의 능력을 조절함으로써 동정될 수 있다. 바람직한 실시예에서, T 세포 활성화를 조절하는 화합물은 T 세포의 증식 또는 사이토카인 생산을 조절하는 화합물의 능력을, 하나 이상의 항원 농도에서 결정함으로써 동정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 검사는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부위가 검사 화합물과 접촉되고, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성부위와 결합하는 검사 화합물의 능력이 결정되는, 세포-유리 검사이다. 본 발명의 검사에서 사용될 수 있는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 바람직한 생물학적 활성 부분은 비-PD-L3 또는 VISTA 분자와 상호결합에 참여하는 단편, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 결합파트너와 결합하는 세포외 도메인의 최소부분을 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 상기 검사 화합물의 결합은 상기 기술된 것과 같이 직접적으로나 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 검사는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부분을 검사 화합물과 접촉시키고, 및 상기 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부위의 활성을 조절 (예를 들면, 자극 또는 억제)하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정하는 세포-유리 검사 (cell-free assay)이다. 상기 검사 화합물의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 활성을 조절하는 능력을 결정하는 것은, 예를 들면 직접적 결합을 결정하는 상기 기술된 방법의 하나에 의해 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 결합하는 PD-L3 또는 VISTA의 능력을 결정함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 상기 세포-유리 검사는 폴리펩티드 (예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 그것의 생물학적 활성 부위, 또는 PD-L3 또는 VISTA 와 결합하는 결합 파트너)의 용해성 및/또는 막결합 형태 모두에서 사용에 가능하다. 막결합 폴리펩티드 형태가 사용되는 세포-유리 검사의 경우에 (예를 들면, 세포막 PD-L3 또는 VISTA), 상기 폴리펩티드의 막결합형태가 용액에 유지될 수 있도록 용해제 (solubilizing agent)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 용해제의 예는 n-옥틸글루코시드 (n-octylglucoside), n-도데실글루코시드 (n-dodecylglucoside), n-도데실말토시드 (n-dodecylmaltoside), 옥탄오일-N-메틸글루카미드 (octanoyl-N-methylglucamide), 데카노일-N-메틸글루카미드 (decanoyl-N-methylglucamide), 트리톤 RTM X-100(Triton RTM. X-100), 트리톤 RTM X-114 (Triton.RTM. X-l14), 테시트 (Thesit), 이소트리데시폴리(에틸글리콜에테르)n [Isotridecypoly(ethylene glycol ether)n], 3-[(3-클로라미도프로필)디메틸아미니오]-1-프로판술포네이트 (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]- l -propane sulfonate; CHAPS), 3-[(3-클로라미도프로필)디메틸아미니오]-2-하이드록시-1-프로판술포네이트 (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-2-hydroxy- l -propane sulfonate; CHAPSO), 또는 N-도데실,dbd.N,N-디메틸-3-아모니오-1-프로판술포네이트 (N-dodecyl.dbd.N,N-dimethyl-3-ammonio-l -propane sulfonate)와 같은 비이온성 세제 (non-ionic detergent)를 포함한다.
본 발명의 상기 검사방법의 하나이상의 실시예에서, 상기 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 비복합체 형태로부터 복합체의 분리를 촉진시키기 위해, 또한 상기 검사의 자동화 (automation)를 제공하기 위해 PD-L3 또는 VISTA 또는 그것의 결합 파트너를 고정시키는 것이 바람직할 수 있다. 후보자 화합물의 존재하에서 및 없을 때, PD-L3 또는 VISTA에 대한 감사 화합물의 결합, 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 그 결합 파트너와의 상호작용은 상기 반응제를 포함하는데 적절한 용기에서 이루어질 수 있다. 상기 용기의 예는 마이크로타이트레 플레이트 (microtitre plates), 검사 고무 (test rube), 및 마이크로-원심분리 튜브 (micro-centrifuge tube)를 포함한다. 어떤 실시예에서, 융합 단백질은 매트릭스에 결합된 상기 폴리펩티드의 하나 또는 둘을 허용하는 도메인이 첨가되어 제공될 수 있다. 예를 들면, 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 (glutathione-S-transferase) PD-L3 또는 VISTA 융합 단백질 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 결합 파트너 융합 단백질은 글루타치온 세파로오즈 비드 (glutathione sepharose beads) 또는 글루타치온 유래 마이크로타이트레 플레이트 (glutathione derivatized microtitre plates)로 흡수될 수 있고 (Sigma Chemical, St. Louis, Mo), 그 후 상기 검사 화합물, 또는 상기 검사화합물 및 비흡수 결합 파트너 폴리펩티드 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 혼합되고, 그리고 상기 혼합물은 복합체 형성을 유도하는 조건하에서 배양된다 (예를 들면, pH 및 염에 대한 생리학적 조건). 배양에 이어, 결합되지 않은 요소를 제거하기 위해, 상기 비드 또는 마이크로타이트레 플레이트웰을 세척하고, 비드의 경우에 상기 매트릭스를 고정시키며, 복합체 형성을 직접적 또는 간접적으로, 예를 들면 상기 기술된 것과 같이 결정한다. 또는, 상기 복합체는 상기 매트릭스로부터 분리될 수 있고, PD-L3 또는 VISTA 결합의 수준 또는 활성을 일반적인 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 매트릭스에 고정 폴리펩티드에 대한 다른 기술은 본 발명의 스크리닝 검사에서 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 검사 화합물의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 활성을 조절하는 능력을 결정하는 것은 PD-L3 또는 VISTA의 다운스트림 (downstream)에서 기능하는 분자의 활성을 조절하는 상기 검사 화합물의 능력을 결정함으로써, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너의 세포질 도메인과 상호작용을 함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 2차 전달자의 수준, 적절한 표적에서의 상기 상호작용하는 분자의 활성, 또는 적절한 표적에 대한 상호결합자의 결합은 상기 기술된 것과 같이 결정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 발현의 조절자는 세포가 후보 화합물과 접촉하고 및 세포내 PD-L3 또는 VISTA mRNA 또는 폴리펩티드의 발현이 결정되는 방법에서 동정될 수 있다. 상기 후보 화합물의 존재하에서 PD-L3 또는 VISTA mRNA 또는 폴리펩티드의 발현수준을 상기 후보 화합물이 부재하에서 PD-L3 또는 VISTA mRNA 또는 폴리펩티드의 발현수준을 비교한다. 그 후 상기 후보 화합물은 그 변화가 통계적으로 유의적일 때, 이 비교를 기초로 하여, PD-L3 또는 VISTA 발현의 조절자로서 동정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 PD-L3 또는 VISTA와 결합하거나 또는 상호작용하는 다른 폴리펩티드 ("PD-L3 또는 VISTA-결합 단백질", "PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너", 또는 PD-L3 또는 VISTA-bp") 및 PD-L3 또는 VISTA의 활성과 관련된 다른 폴리펩티드를 동정하기 위해서, 2-하이브리드 검사 (two-hybrid assay)에서 또는 3-하이브리드 검사에서 "미끼 단백질 (bait protein)"으로서 사용될 수 있다 (예를 들면, U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Battel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; 및 Brent WO94/10300 참조). 또한, 상기 PD-L3 또는 VISTA-결합 단백질은, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA-매개 신호전달경로의 다운스트림 요소로서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 PD-L3 또는 VISTA 표적에 의한 신호의 전파와 관련이 있을 수 있다. 또는, 상기 PD-L3 또는 VISTA-결합 폴리펩티드는 PD-L3 또는 VISTA 억제제일 수 이Te 상기 2-하이브리드 시스템은 대부분의 전사인자의 조절자적 특성에 기초하고, 이것은 분리될 수 있는 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성되어 있다. 간략하게, 상기 검사는 두개의 상이한 DNA 구조물 (construct)를 이용할 것이다. 하나의 구조물에서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 암호화하는 유전자는 알려진 전사인자 (예를 들면, GAL-4)의 DNA 결합 도메인을 암호화하는 유전자와 연결되었다. 또 다른 구조물에서는, DNA 서열의 라이브러리로부터의, 동정되지 않은 폴리펩티드 ["먹이 (prey)" 또는 "시료 (sample)"] DNA 서열을 암호화하는 DNA 서열은 상기 알려진 전사인자의 활성화 도메인을 암호화하는 유전자와 연결된다. 만약 상기 "미끼" 및 상기 "먹이" 폴리펩티드가 상호작용하여 생체내에서 PD-L3 또는 VISTA-의존 복합체를 형성할 수 있다면, 상기 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인은 가깝게 근접할 것이다. 이러한 근접성은 전사조절부위와 조작적으로 연결된 수용체 유전자 (예를 들면, LacZ)의 전사가 전사인자에 반응하도록 한다. 상기 수용체 유전자의 발현은 탐지될 수 있고, 상기 기능적 전사인자를 포함하는 세포 콜로니는 분리될 수 있으며, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 상호작용하는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 클론된 유전자를 수득하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 여기서 기술되는 상기 검사의 둘 또는 그 이상의 조합을 포함한다. 예를 들면, 조절제는 세포-기반 또는 세포-유리 검사를 사용하여 동정될 수 있고, 상기 제제의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 활성을 조절할 수 있는 능력은 생체내에서, 예를 들면 세포 형질전환 및/또는 종양형성 (tumorigenesis)을 위한 동물모델과 같은 동물에서 확인될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기-기술된 스크리닝 검사에 의해 동정되는 신규한 제제를 포함한다. 따라서, 여기서 기술되는 적절한 동물모델에서 동정되는 제제의 사용은 본 발명의 영역내에 있다. 예를 들면, 여기에서 기술되는 동정된 제제 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 조절제, 안티센스 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, PD-L3 또는 VISTA-특이적 항체, 또는 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너)는 상기 제제를 사용한 치료의 효과, 독성 또는 부작용을 결정하기 위해서, 동물모델에서 사용될 수 있다. 또는, 여기에서 기술된 것과 같이 동정된 제제는 상기 제제의 작용기전을 결정하기 위해서, 동물모델에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 여기에서 기술된 것과 같이 치료를 위해, 상기 기술된 스크리닝 검사에 의해 동정되는 새로운 제제의 사용을 포함한다.
B. 탐지 검사 (detection assay)
여기에서 동정된 cDNA 서열의 부위 또는 단편 [및 상기의 상응하는 완전 유전자 서열 (the corresponding complete gene sequences)]는 폴리뉴클레오티드 시약 (polynucleotide reagent)으로서 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 서열은 하기를 위해 사용될 수 있다: (i) 그들의 각 유전자를 염색체에 지도화하고, 및 따라서 유전적 질환과 관련된 유전자 부위를 위치화한다; (ii) 극미량의 생물학적 시료 [조직 타이핑 (tissue typing)]로부터의 개개인을 동정한다; 및 (iii) 생물학적 시료의 법의학적 동정 (forensic identification)을 돕는다. 상기 적용은 하기의 하위부분에서 기술된다.
1. 염색체 지도화
일단 유전자의 상기 서열 (또는 상기 서열의 부분)분리되면, 이 서열은 염색체에서 상기 유전자의 위치를 지도화하는데 사용될 수 있다. 이 과정은 염색체 지도화라고 불린다. 따라서, 여기에서 기술된 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열의 부위 또는 단편은 염색체에서 PD-L3 또는 VISTA 유전자의 위치를 지도화하도록 사용할 수 있다. 상기 염색체에 대한 PD-L3 또는 VISTA 서열의 지도화는 상기 서열이 질환과 관련된 유전자와 상관관계가 있는 점에서 중요한 첫 단계이다. 간략하게, PD-L3 또는 VISTA 유전자는 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열로부터 PCR 프라이머 (바람직하게는 15-25 bp의 길이)를 제조함으로써 염색체에 지도화될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 서열의 컴퓨터 분석은 유전체 DNA (genomic DNA)에 있는 하나 이상의 엑손 (exon)으로 놓이지않는 프라이머를 예측하는데 사용될 수 있고, 따라서 상기 증폭과정을 복잡하게 만든다. 그 후 상기 프라이머는 개개인의 인간 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드 (somatic cell hybrids)의 PCR 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 서열과 일치하는 인간 유전자를 포함하는 상기 하이브리드만 증폭된 단편을 생산한다. 체세포 하이브리드는 상이한 포유류로부터의 체세포 (예를 들면, 인간 및 생쥐 세포)를 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 인간 및 생쥐 세포의 하이브리드가 자라고 분열함에 따라, 그들은 점차적으로 무작위적 순서로 인간 염색체를 잃지만, 상기 생쥐 염색체는 보유한다. 특정 효소가 없기 때문에 생쥐세포가 자랄 수 없고 인간세포만 자랄 수 있는 배지를 사용함으로써, 상기 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 상기 인간세포 염색체가 보유될 것이다. 다양한 배지를 사용함으로써, 하이브리드 세포주의 패널이 수립될 수 있다. 패널에 있는 각 세포주는 단일 인간 염색체 또는 적은 수의 인간 염색체, 및 생쥐 염색체 전체의 세트를 포함하여, 각각의 유전자를 특이적 인간 염색체로 쉽게 지도화할 수 있게 한다 (D'Eustachio, P. et al. (1983) Science 220:919-924). 또한, 인간 염색체의 단편만을 포함한 체세포 하이브리드는 전좌 (translovation) 및 결실 (deletion)이 있는 인간 염색체를 사용함으로써 생산될 수 있다.
체세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정 서열을 특정 염색체에 할당하기 위한 빠른 과정이다. 3개 또는 그 이상의 서열은 단일 열 사이클러 (single thermal cycler)를 사용하여 하루동안 할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인한 PD-L3 또는 VISTA 뉴클리오티드 서열을 사용함으로써, 하위위치 (sublocalization)은 특이적 염색체로부터의 단편의 패널을 사용하여 이루어질 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 서열을 그 염색체에 지도화하는데 유사하게 사용될 수 있는, 다른 지도화 전략은 인시추 혼성화 (in situ hybridization) (Fan, Y. et al. (1990) Proc Natl. Acad. Sci. USA 87:6223-27에 기술), 표지된 유동-선별된 염색체 (labeled flow-sorted chromosomes)를 사용한 선-스크리닝 (pre-screening), 및 염색체 특이적 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화에 의한 선-선별 (pre-selection)을 포함한다.
중기 염색체 분산에 대한 DNA 서열의 형광인시추혼성화 (Fluorescence in situ hybridization; FISH) 한 단계에서 염색체의 정확한 위치를 제공하는데 사용될 수 있다. 염색체 분산 (Chromosome spread)은 유사분열방추 (mitotic spindle)를 파괴하는 콜세미드 (colcemid)와 같은 화학물질에 의해 세포분열이 중기 (metaphas)에서 정지된 세포를 사용하여 만들어질 수 있다. 상기 염색체는 트립신 (trypsin)으로 짧게 처리된 후, 김자 (Giemsa)에 의해 염색된다. 각 염색체에서 밝은 및 어두운 밴드의 양상이 발달되어, 상기 염색체는 개별적으로 동정될 수 있다. 상기 FISH 기술은 500 또는 600 염기만큼 짧은 DNA 서열을 사용하여 이용될 수 있다. 하지만, 1,000 염기 이상의 클론은 단순한 감지를 위한, 충분한 신호 강도를 나타내는, 특별한 염색체 위치와 결합하는 높은 가능성을 가진다. 바람직하게 1,000 염기, 보다 바람직하게는 2,000 염기는 타당한 시간 동안에 좋은 결과를 얻기에 충분하다. 이 기술의 리뷰를 위해, Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of basic Techniques (Pergamon Press, New York 1988)를 참고할 수 있다. 염색체 지도화를 위한 시약은 상기 염색체에 단일 염색체 또는 단일 부위를 표시하기 위해 개별적으로 사용될 수 있고, 또는 시약의 패널이 다수 부위 및/또는 다수 염색체를 표시하기 위해 사용될 수 있다. 상기 유전자의 사실상 비암호화 부위와 상응하는 시약은 지도화 과정에서 바람직하다. 암호화 서열은 보다 유전자계내에 보존된 경우가 높으므로, 따라서 염색체 지도화 동안에 교차 혼성화 (cross hybridization)의 기회를 증가시킨다.
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 지도화가 되면, 염색체에서 상기 서열의 물리적 위치는 유전적 지도 데이터와 연관성이 있을 수 있다. 궁극적으로, 몇몇의 개인으로부터의 유전자의 완전한 서열분석은 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 및 다형성 (polymorphosm)으로부터의 돌연변이를 구별하기 위해 수행될 수 있다.
2. 조직 타이핑 (tissue typing)
또한, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 서열은 극미량의 생물학적 시료로부터 개인을 동정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 서열은 개개인 유전체의 선택된 부분에서의 실제 염기-당-염기 DNa 서열을 결정하는 대인적 기술을 제공하는데 사용될 수 있다. 따라서, 여기에서 기술된 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열은 상기 서열의 5' 및 3' 말단으로부터 2개의 PCR 프라이머를 제조하는데 사용될 수 있다. 그 후 이러한 프라이머는 개개인의 DNA를 증폭시키키고 그 후 그것의 배열순서를 밝히기 위해 사용될 수 있다.
이러한 방법으로 제조된, 개개인의 상응하는 DNA 서열의 패널은, 개개인은 대립유전자 상이성으로 인한 DNa 서열과 같은 특별한 (unique) 세트를 가지고 있기 때문에, 유일한 개개인의 동정 (individual identification)을 제공한다. 본 발명의 서열은 개개인 또는 조직으로부터의 서열 동정을 수득하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열은 특별하게 인간 유전체의 부분을 나타낸다. 대립유전자 변이는 상기 서열의 암호화부위에서 어느정도 발생하고, 비암호화 부위에서 보다 크게 발생한다. 개개인 인간 사이에서 대립유전자의 변이는 각 500개의 염기 당 약 한 번의 빈도로 일어나는 것으로 측정된다. 여기에서 기술된 서열의 각각은 개개인으로부터의 DNA를 동정의 목적을 위해 비교할 수 있는 것에 대한 일번적인 것으로써 어느정도 사용될 수 있다. 보다 많은 다형성은 비암호화부위에서 발생하기 때문에, 개개인을 구별하기 위해서는 보다 적은 서열이 필요하다. 서열 번호: 1 또는 4의 비암호화 서열은, 대략 10 내지 1,000 개의 프라이머의 패널을 사용하고 여기에서 각각은 100개의 염기의 비암호화된 서열을 제공하는, 양성 개개인 동정 (positive individual identification)을 쉽게 제공할 수 있다. 서열 번호: 3 또는 6에서의 서열과 같은 암호화 서열을 예측한다면, 양성 개개인 동정을 위한 프라이머의 보다 적절한 수는 500-2000일 것이다.
여기에서 기술된 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열로부터의 시약의 패널은 개개인을 위한 동정 데이터베이스 (identification database)를 생상하기 위해 사용될 때, 상기 동일한 시약은 상기 개개인으로부터의 조직을 동정하기 위해 그 후에 사용될 수 있다. 특별한 동정 데이터베이스를 이용하여, 살아있거나 또는 죽은, 개개인의 양성 동정은 극적으로 작은 조직시료로부터 만들어질 수 있다.
3. 법의학적 생물학 (Forensic Biology)에서의 PD-L3 또는 VISTA 서열의 용도
또한, DNA-기반 동정기술은 법의학적 생물학에서 사용될 수 있다. 본 발명의 서열은 인간 유전체에서 특이적 위치 (specific loci)에 표적화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면 PCR 프라이머를 제공하는데 사용될 수 있고, 이것은, 예를 들면 또 다른 "동정마커 (identification market)" (즉, 특정 개개인에 대해 특별한, 또 다른 DNA 서열)를 제공함으로써 DNA-기반 법의학적 동정의 신뢰성을 증가시킬 수 있다. 상기 언급된 것과 같이, 실제 염기서열 정보는 제한효소로 생성된 단편에 의해 형성된 양상에 대한 정확한 대안으로서 동정을 위해 사용될 수 있다. 서열 번호: 1 또는 3의 비암호화 부위를 표적으로 하는 서열은 다형성이 비암호화부위에서 보다 많이 발생하여, 상기 기술을 사용하여 개개인을 보다 쉽게 구별할 수 있게 하기 때문에, 특히 이러한 용도에 적절하다. 폴리뉴클레오티드 시약의 예는 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 부분, 예를 들면 최소 20개, 바람직하게는 최소 30개의 염기를 길이로 가지는, 서열 번호: 1 도는 3의 비암호화 부위로부터 유래된 단편을 포함한다. 여기에서 기술되는 PD-L3 또는 VISTA 뉴클레오티드 서열은 나아가 폴리뉴클레오티드 시약, 예를 들면 림프구와 같은 특이적 조직을 동정하기 위해 인시추 혼성화 기술에서 사용할 수 있는, 표지된 또는 표지가능항 탐침을 제공하는데 사용될 수 있다. 이것은 법의학적 병리학자들이 알려지지 않은 기원의 조직을 나타낼 경우에 매우 유용할 수 있다. 상기 PD-L3 또는 VISTA 탐침의 패널은 종에 의해 및/또는 기원 종류에 의해 조직을 동정하기 위해 유용할 수 있다. 유사한 방법에서, 상기 시약, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 프라이머 또는 탐침은 오염에 대한 조직배양을 스크리닝하기 위해 (즉, 배양에서 세포의 상이한 종류의 혼합물의 존재에 대한 스크리닝) 유용할 수 있다.
C. 예측적 의학 (Predictive Medicine)
또한, 본 발명은 진단검사, 예상검사 (prognostic assay) 및 임상시험을 모니터링을 예상 (예측)의 목적을 위해 사용함으로써 개인을 예방적으로 치료하려는 경우의 예측적 의학을 포함한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 생물학적 시료 (예를 들면, 혈액, 혈청, 세포 또는 조직)에서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 및/또는 핵산분자 뿐만 아니라 PD-L3 또는 VISTA 활성을 결정함으로써 개인이 비정상적이거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애가 있는지 또는 질환이 발달할 위험이 있는지 결정하기 위한 진단검사에 관한 것이다. 또한 본 발명은 개인이 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 핵산 발현 또는 활성과 관련된 질환을 발달시킬 위험이 있는지 결정하는 예상 (또는 예측) 검사를 제공한다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 유전자에서 돌연변이는 생물학적 시료에서 검사될 수 있다. 상기 검사는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, 핵산 발현 또는 활성와 관련되거나 또는 그것에 의해 특징지어지는 장애의 개시 이전에 개인을 예방적으로 치료할 수 있는 예방적 또는 예측적 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상시험에서 PD-L3 또는 VISTA의 발현 또는 활성에 있어서 제제 (예를 들면, 약물, 화합물)의 영향을 모니터하는 것을 포함한다. 상기 및 다른 제제는 하기 부분에서 보다 상세히 기술된다.
1. 진단검사
PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산의 존재 또는 부재를 탐지하기 위한 예시적 방법은 검사 개체로부터의 생물학적 시료를 수득하는 것, 및 상기 생물학적 시료를 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 PD-L3 또는 VISTA의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 (예를 들면, mRNA 또는 유전체 DNA)을 탐지할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시키는 것과 관련이 있어, 상기 생물학적 시료에서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산의 존재를 탐지할 수 있다. PD-L3 또는 VISTA mRNA 또는 유전체 DNA를 탐지하는 바람직한 제제는 PD-L3 또는 VISTA mRNA 또는 유전체 DNA와 혼성화 될 수 있는, 표지된 핵산 탐침이다. 예를 들면, 상기 핵산탐침은 서열 번호: 1 또는 3에서 개시된 PD-L3 또는 VISTA 핵산 또는 그것의 부분일 수 있고, 예를 들면 최소 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개의 뉴클레오티드를 길이로 하고, 특정조건하에서 PD-L3 또는 VISTA mRNA 또는 유전체 DNA와 특이적으로 혼성화되기에 충분한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 진단검사에서 사용하기 위한 다른 적절한 탐침은 여기에서 기술된다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 텀지하기위한 바람직한 제제는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 탐지가능한 표지가 있는 항체이다. 항체는 다클론, 또는 보다 바람직하게는 단일클론일 수 있다. 완전항체, 또는 그것의 단편 (예를 들면, Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 상기 탐침 또는 항체에 관하여 "표지된"이란 용어는 탐지가능한 물질을 상기 탐침 또는 항체와 결합시킴 (즉, 물리학적 연결)으로써 상기 탐침 또는 항체의 직접적 표지 뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 또 다른 시약을 사용한 반응성에 의해 상기 탐침 또는 항체의 간접적 표지를 포함한다. 간접적 표지의 예는 형광적으로 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체, 및 형광표지된 스트렙토아비딘 (streptoavidin)을 사용하여 탐지가능한 바이오틴을 이용한 DNA 말단-표지의 탐지는 포함한다. "생물학적 시료"의 용어는 개체로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 유동액, 뿐만 아니라 개체내에 존재하는 조직, 세포 및 유동액을 포함한다. 즉, 본 발명의 탐지방법은 생물학적 시료에서 PD-L3 또는 VISTA mRNA, 폴리펩티드 또는 유전체 DNA를, 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서, 탐지하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, PD-L2 mRNA의 탐지를 위한 시험관내 기술은 노던 혼성화 (Northern hybridizations) 및 인시추 혼성화 (in situ hybridization)를 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 탐지를 위한 시험관내 기술은 효소결합면역흡수 검사 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 웨스턴 블랏 (Western blots), 면역침전법 (immunoprecipitations) 및 면역형광법 (immunofluorescence)을 포함한다. PD-L3 또는 VISTA 유전체 DNA의 탐지를 위한 시험관내 기술은 서던 혼성화 (Southern hybridization)를 포함한다. 또한, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 탐지하기 위한 생체내 기술은 표지된 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 개체로 도입시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 개테내에서 그것으 존재 및 위치가 일반적인 이미지 기술에 의해 탐지될 수 있는, 방사선 표지 마커로 표지될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 생물학적 시료는 상기 검사개체로부터의 폴리펩티드 분자를 포함한다. 또는, 상기 생물학적 시료는 상기 검사개체 또는 mRNA 분자, 또는 상기 검사개체로부터의 유전체 DNA 분자를 포함할 수 있다. 바람직한 생물학적 시료는 개체로부터 보편적인 수단에 의해 분리된 혈청시료이다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 나아가 대조군 개체로부터의 대조군 생물학적 시료를 수득하는 것, 상기 대조군 시료를 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, mRNA, 또는 유전체 DNA의 존재는 상기 생물학적 시료에서 탐지될 수 있도록, mRNA 또는 유전체 DNA를 탐지할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시키는 것, 및 대조군 시료에서의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, mRNA, 또는 유전체 DNA의 존재를 상기 검사 시료에서의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, mRNA, 또는 유전체 DNA의 존재와 비교하는 것과 관련이 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에서 PD-L3 또는 VISTA의 존재를 탐지하기 위한 키트 (kit)를 포함한다. 예를 들면, 상기 키트는 생물학적 시료의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 mRNA를 탐지할 수 있는, 표지된 화합물 또는 제제; 상기 시료에서 PD-L3 또는 VISTA의 양을 결정하기 위한 수단; 상기 시료에서의 및 PD-L3 또는 VISTA의 양과 표준을 비교하기 위한 수단을 포함한다. 상기 화합물 및 제제는 적절한 용기에서 포장될 수 있다. 또한, 상기 키트는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산을 탐지하는 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
2. 예측검사
여기에서 기술된 진단 방법나아가 비정상적인 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 가지고 있거나 또는 발달할 위험이 있는 개체를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 여기에서 사용되는, "비정상적인" 용어는 야생형 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성으로부터 벗어난, PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성을 포함한다. 비정상적인 발현 또는 활성은 증가된 발현 또는 활성, 뿐만 아니라 야생형 발달의 발현양상 또는 발현의 하위 세포양상 (subcellular pattern of expression)을 따르지 않는 발현 또는 활성을 포함한다. 예를 들면, 비정상적인 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성은 적게 발현되거나 또는 과발현되는 PD-L3 또는 VISTA 유전자를 야기시키는 PD-L3 또는 VISTA에서의 돌연변이의 경우 및 상기 돌연변이가 비-기능적 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 야생형 방법을 기능하지 않는 폴리펩티드, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 상호작용을 하지 않는 폴리펩티드 또는 비-PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너와 상호작용을 하는 폴리펩티드를 야기하는 상황을 포함한다. 여기에서 사용되는, "원치않는"이라는 용어는 면역세포 활성화와 같은 생물학적 반응과 관련된, 원치않는 현상을 포함한다. 예를 들면, 상기 원치않는 이라는 용어는 개체에서 바람직하지 않은, PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성을 포함한다.
여기에서 기술되는 검사, 예를 들면 상기 진단검사 또는 하기 검사는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 활성 또는 핵산 발현의 잘못된 조절과 관련된 질환, 예를 들면 자가면역질환, 면역결핍질환, 자가면역과 같은 면역체계 질환, 알러지 또는 염증성 질관 또는 암이 발달하는 위험을 가진 개체를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 검사 시료는 개체로부터 수득되고, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산 (예를 들면, mRNA 또는 유전체 DNA)가 탐지되는, 비정상적이거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 동정하기 위한 방법을 제공하고, 여기에서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산의 존재는 비정상적이거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애가 발달하는 위험을 가지고 있는 개체를 위해 진단적이다. 여기에서 사용되는, "검사 시료"는 표적의 개체로부터 수득된 생물학적 시료를 의미한다. 예를 들면, 검사시료는 생물학적 유동액 (예를 들면, 뇌척수액 또는 혈청), 세포시료, 또는 조직일 수 있다.
또한, 여기에서 기술되는 상기 예상검사는 비정상적이거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 개체에 제제 (예를 들면, 작용제, 길항제, 펩티도모방체, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 작은분자, 또는 다른 약물 후보제)를 투여하는 것을 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 개체가 자가면역장애, 면역결핍장애, 면역체계암, 또는 알러지 또는 염증성 장애에 대해 제제를 효과적으로 치료될 수 있는지 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 비정상적이거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성과 관련된 장애를 위한 제제로 개체를 효과적으로 치료할 수 있을지 결정하기 위한 방법을 제공하고, 여기에서 검사 시료는 수득되고 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산 발현 또는 활성을 탐지된다 (예를 들면, 여기에서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산 발현 또는 활성의 존재는 비정상적이거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성와 관련된 장애를 치료하는 제제를 투여할 수 있는 개체를 위해 진단적이다). 또한, 본 발명의 방법은 PD-L3 또는 VISTA 유전자에서의 유전적 변형을 탐지하는데 사용될 수 있고, 따라서 변형된 유전자가 있는 개체가 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 활성 또는 핵산 발현에서의 잘못된 조절에 의해 특징되는 질환, 예를 들면 자가면역장애, 면역결핍장애, 면역체계암, 알러지장애, 또는 염증성 장애에 대한 위험이 있는지 결정할 수 있다. 여기에서 기술된 상기 방법은, 예를 들면 여기에서 기술된 최소한 하나의 탐침 핵산 또는 항체시약을 포함하는 미리포장된 진단키트를 사용함으로써 수행될 수 있고, 이것은 예를 들면 임상적 상황에서 PD-L3 또는 VISTA 유전자와 관련된 질병 또는 병의 가족력이나 증상을 보이는 환자를 진단하기 위해 편리하게 사용될 수 있다. 또한, PD-L3 또는 VISTA가 발현되는 어떤 세포종류 또는 조직은 여기에서 기술되는 예측검사에서 사용될 수 있다.
3. 임상시험 동안의 효과 모니터링
PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 발현 또는 활성에서 제제 (예를 들면, 약물)의 영향 (예를 들면 세포증식 및/또는 이동의 조절)을 모니터링은 기본약물스크리닝에 뿐만 아니라 임상시험에도 적용될 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 유전자 발현, 폴리펩티드 수준을 증가시키거나 또는 PD-L3 또는 VISTA 활성을 상향조절하는, 제제의 효과성은 감소된 PD-L3 또는 VISTA 유전자 발현, 폴리펩티드 수준, 또는 하향조절된 PD-L3 또는 VISTA 활성을 나타내는 개체의 임상시험에서 모니터될 수 있다. 또는, PD-L3 또는 VISTA 유전자 발현, 폴리펩티드 수준을 감소시키거나 또는 PD-L3 또는 VISTA 활성을 하향조절시키는 스크리닝 검사에 의해 결정되는 제제의 효과성은 증가죈 PD-L3 또는 VISTA 유전자 발현, 폴리펩티드 수준, 또는 PD-L3 또는 VISTA 활성을 나타내는 개체의 임상시험에서 모니터 될 수 있다. 기술된 것과 같이, PD-L3 또는 VISTA는 APCs (대식세포 및 골수성 수지상세포), 및 CD4+ T 세포를 포함하는, 많은 조형세포종류에서 발현되고, 보다 특이적으로 CD1lc+ DCs, CD4+ T 세포 (Foxp3- 작용기 T 세포 및 Foxp3+ nTregs 모두 포함), CD8+ T 세포, 및 Grl+ 과립성림프구 (granulocytes)에서 발현되며, B 세포 및 NK 세포에서 낮은 수준으로 발현된다. 상기 임상시험에서, 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 유전자의 발현 또는 활성, 및 보다 바람직하게는 다른유전자가 시사할 수 있는, PD-L3 또는 VISTA-관련 장애는 특정 세포의 표현형의 마커 또는 "판독 (read out)"으로서 사용될 수 있다.
예를 들면, 제한되지는 않지만, PD-L3 또는 VISTA 활성 (예를 들면, 여기에서 기술된스크리닝 검사에서 동정된)을 조절하는 제제 (예를 들면 화합물, 약물 또는 작은 분자)를 사용한 치료에 의한 세포에서 조절되는, PD-L3 또는 VISTA를 포함하는 유전자는 동정될 수 있다. 따라서, PD-L3 또는 VISTA-관련 장애에서의 제제의 효과를 연구하기 위해, 예를 들면 임상시험에서, 세포는 분리될 수 있고 다른 유전자의 발현수준에 대해 각각 PD-L3 또는 VISTA 및 RNA가 준비되며 분석될 수 있다. 유전자 발현수준 (예를 들면, 유전자 발현양상)은 여기에서 기술되는 노던 블랏 분석 또는 RT-PCR에 의해, 또는 생산된 폴리펩티드의 양을 측정함으로써, 여기에서 기술되는 방법중 하나로써, 또는 PD-L3 또는 VISTA 또는 다른 유전자의 활성 수준을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이러한 방법으로, 상기 유전자 발현양상은 상기 제제에 대한 세포의 생리학적 반응을 표지인, 마커로서의 기능을 한다. 따라서, 이러한 반응상태는 상기 제제를 개개인에게 처리하기 이전에, 및 처리하는 동안 다양한 시간대에서 결정될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 제제 (예를 들면, 여기에서 기술되는 스크리닝 검사에 의해 동정되는 작용제, 길항제, 펩티도모방체, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 작은분자, 또는 다른 약물 후보자)의 처리 효과성을 모니터링하기 위한 방법을 제공하고, (i) 상기 제제의 투여 이전에 개체로부터 전-투여 시료를 수득하고; (ii) 전투여 시료에서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, mRNA 또는 유전체 DNA의 발현수준을 탐지하며; (iii) 개체로부터 하나 또는 그 이상의 처리 후 시료를 수득하고; (iv) 처리후 시료에서 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, mRNA 또는 유전체 DNA를 발현 또는 활성의 수준을 탐지하며; (v) 전처리 시료에서의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, mRNA 또는 유전체 DNA 발현 또는 활성수준을 처리후 시료에서의 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드, mRNA 또는 유전체 DNA와 비교하고; 및 (vi) 따라서 상기 개체로부터 상기 제제의 투여를 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 제제의 증가된 투여는 탐지되는 것보다 높은 수준에 대해 PD-L3 또는 VISTA 발현 및 활성을 증가시키기 위해, 즉 상기 제제의 효과성을 증가시키기 위해 바람직하다. 또는, 상기 제제의 감소된 투여는 탐지되는 것보다 낮은 수준에 대해 PD-L3 또는 VISTA의 발현 또는 활성을 감소시키기 위해 바람직하다. 상기 실시예에 따르면, PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성은, 관찰가능한 표현형 반응의 부재속에서라도, 제제 효과성의 지표로서 사용될 수 있다.
D. 치료방법 (Methods of Treatment)
본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 단백질의 불출분하거나 또는 과다한 생산, 또는 PD-L3 또는 VISTA 야생형 단백질과 비교하여 감소되거나 또는 비정상적인 활성을 가지는 PD-L3 또는 VISTA 단백질 형태의 생산에 의해 특징화되는 장애에 위험이 있는 (또는 취약하거나) 개체를 치료하기 위한, 예방적 및 치료적 방법 모두를 제공한다. 또한, 본 발명의 상기-PD-L3 또는 VISTA 항체는, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 대응 수용체의 상호작용을 조절함으로써, PD-L3 또는 VISTA 단백질을 탐지하고 분리하고, PD-L3 또는 VISTA 단백질의 생물학적 이용성을 조절하고, 및 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는데 사용될 수 있다.
1. 예방적 방법 (Prophylactic Methods)
한 측면에서, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 최소 하나의 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절하는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 제제를 개체에 투여함으로써, 상기 개체에서 비정상적이거나 또는 원치 않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 예방하기 위한 방법을 제공한다. 비정상적이거나 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성에 의해 발생되거나 또는 만들어지는 질환 또는 장애에 대해 위험이 있는 개체는, 예를 들면 여기에서 기술되는 진단 또는 예상검사의 하나 또는 그 조합에 의해 동정될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 비이상의 특징적 증상의 발생 이전에, 질환이나 장애를 예방하는 또는, 진행을 지연시키는 예방적 제제가 투여될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 비이상의 종류에 의존하여, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 PD-L3 또는 VISTA 작용제 또는 PD-L3 또는 VISTA 길항제 (예를 들면, 항-PD-L3 또는 VISTA 항체) 제제는 상기 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 적절한 제제는 여기에서 기술되는 스크리닝 검사에 기초하여 결정될 수 있다.
2. 치료적 방법
본 발명의 중요한 측면은 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성, 또는 그것의 자연적 결합 파트너와 상호작용을 조절하는 방법을 포함한다. 치료와 관련하여, PD-L3 또는 VISTA는 CD28 공동자극을 억제하고, 면역세포의 TCR 활성을 억제하며, 활성화된 면역세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포)의 증식을 억제하고, T 세포에 의한 사이토카인 (IL-2, 감마 인터페론) 생산을 억제하며, 및 면역세포로 억제성 신호를 전달하는 것으로 나타났다. 따라서, PD-L3 또는 VISTA의 활성 및/또는 발현, 뿐만 아니라 PD-L3 또는 VISTA 및 T 세포에서의 그것의 결합 파트너 사이의 상호결합은 면역반응을 조절하기 위해 조절될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA는 억제성 수용체 (T 세포의)와 결합하기 때문에, PD-L3 또는 VISTA 활성의 상향조절은 면역반응의 하향조절을 초래해야 하는 반면, PD-L3 또는 VISTA 활성의 하향조절은 면역조절은 상향조절을 초래해야 한다. 바람직한 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA는 억제성 수용체와 결합한다. 이전에 기술된 것과 같이, 시험관내에서 (PD-L3 또는 VISTA-Ig의 존재하에서) PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질의 억제적 활성을 증진시키는 시도에 의해 생산된, 직관에 반대되는 PD-L3 또는 VISTA 특이적 항체는 생체내에서 기대될 작용의 반대로 작용을 한다. 즉, 상기 항테는 생체내에서 면역억제적으로 발견된다.
본 발명의 조적적 방법은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 세포와 관련된 PD-L3 또는 VISTA 활성의 하나 또는 그 이상을 조절하는 제제, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA의 발현 또는 활성을 조절하거나 및/또는 PD-L3 또는 VISTA 및 그것의 자연적 결합 파트너의 상호결합을 조절하는 제제를 상기 세포와 접촉시키는 것에 관련된다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 활성을 조절하는 제제는 여기에서 기술되는, 핵산 또는 폴리펩티드 또는 PD-L3 또는 VISTA의 자연적으로 발생한 결합 파트너, PD-L3 또는 VISTA 항체, PD-L3 또는 VISTA 작용제 또는 길항제, PD-L3 또는 VISTA 작용제 또는 길항제의 펩티도모방체, PD-L3 또는 VISTA 펩티도모방체, 또는 다른 작은분자와 같은 제제일 수 있다. 또한, PD-L3 또는 VISTA의 용해성 형태는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너 또는 리간드의 어떤 것과의 결합을 중재하는데 사용될 수 있다.
PD-L3 또는 VISTA 발현을 조절하는 제제는, 예를 들면 안티센스 핵산분자, 삼중체 올리고뉴클레오티드 (triplex oligonucleotide), 리보자임, 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 발현을 위한 재조합 벡터이다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 번역개시부위 주변 지역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 합성될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200mug/ml에서 세포배지로 첨가될 수 있고, 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 합성을 예방하기 위한 환자에게 주입될 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포에 흡수되며, 번역을 방지하기 위해 PD-L3 또는 VISTA mRNA와 혼성화된다. 또는, DNA 풀림 또는 전사를 방지하기 위한 삼중체구조를 형성하기 위해, 이중나선 DNA와 결합하는 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 어떠한 경우라도 그 결과로서, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 합성은 차단된다. PD-L3 또는 VISTA 발현이 조절될 때, 바람직하게 상기 조절은 PD-L3 또는 VISTA 유전자를 넉아웃 (knock out)시키는 것 보다는 다른 방법에 의해 발생한다.
세포내에서 그들이 PD-L3 또는 VISTA의 양을 조절하고 있다는 사실에 의해서, 그 발현을 조절하는 제제는 또한 세포내의 PD-L3 또는 VISTA 활성의 총량을 조절한다. 어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA를 조절하는 제제는 하나 또는 그 이상의 PD-L3 또는 VISTA 활성을 자극시킨다. 상기 자극적 제제의 예는 활성 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 및 세포로 도입된 PD-L3 또는 VISTA를 암호화하는 핵산분자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 제제는 하나 또는 그 이상의 PD-L3 또는 VISTA 활성을 억제한다. 상기 억제성 제제의 예는 안티센스 PD-L3 또는 VISTA 핵산분자, 항-PD-L3 또는 VISTA 항체, PD-L3 또는 VISTA 억제제 및 상기 개체 스크리닝 검사에서 동정된 화합물을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 억제성 제제는 항-PD-L3 또는 VISTA 항체 및 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 항체의 조합이다. 상기 조절적 방법은 시험관 내에서 (예를 들면, 상기 세포와 상기 제제를 접촉시킴으로써) 또는 생체내에서 세포와 제제를 접촉시킴으로써 (예를 들면, 상기 제제를 개체에 투여시킴으로써) 수행될 수 있다. 상기와 같이, 본 발명은 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 상향 또는 하향 조절로부터 이익을 얻을 수 있는 질병 또는 장애, 예를 들면 원치않는, 불충분한 또는 비정상적인 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산분자의 발현 또는 활성에 의해 특징화되는 질환을 가지는 개개인을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 실시예에서, 상기 방법은 제제 (예를 들면, 여기에서 기술되는 스크리닝 검사에 의해 동정되는 제제) 또는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성을 조절하는 제제의 조합을 투여하는 것과 관련한다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 감소된, 비정상적인 또는 원치않는 PD-L3 또는 VISTA 발현 또는 활성을 보상하기 위해, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 핵산분자를 치료제로서 투여하는 것과 관련이 있다.
개체의 PD-L3 또는 VISTA 결합제를 사용하여 치료될 수 있는 질환은 이전에 동정되었고, 다양한 염증성, 자가면역, 암, 알러지 및 감염성 질환을 포함한다. 특정 바람직한 지표는 다발성 경화증이다.
PD-L3 또는 VISTA 활성의 자극은 PD-L3 또는 VISTA가 비정상적으로 하향조절된 경우 및/또는 증가된 PD-L3 또는 VISTA 활성이 이득적 효과를 가질 경우에 바람직하다. 마찬가지로, PD-L3 또는 VISTA 활성의 억제는 PD-L3 또는 VISTA가 비정상적으로 상향조절되는 경우 및/또는 감소된 PD-L3 또는 VISTA 활성이 이득적 효과를 가질 경우에 바람직하다. PD-L3 또는 VISTA를 하향조절하기 위한 제제의 예시는 (즉, PD-L3 또는 VISTA 길항제), 예를 들면 안티센스 핵산분자, PD-L3 또는 VISTA를 인지하고 차단하는 항체, PD-L3 또는 VISTA를 인지하고 차단하는 항체들의 조합, 및 PD-L3 또는 VISTA 대응 수용체를 인지하고 차단하는 항체, 및 PD-L3 또는 VISTA과 면역세포에서 그것의 자연적으로 발생된 결합 파트너와의 상호작용을 차단하는 화합물 (예를 들면, 용해성, 단가 (monovalent) PD-L3 또는 VISTA 분자; 항원제시세포에 있는 Fc 수용체와 결합하지 않는 PD-L3 또는 VISTA의 용해성 형태, 및 상기 개체의 스크리닝 검사에서 동정된 화합물)를 포함한다. PD-L3 또는 VISTA를 상향조절하는 용도를 위한 예시적 제제는 (즉, PD-L3 또는 VISTA 작용제), 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, PD-L3 또는 VISTA 단가형태, PD-L3 또는 VISTA의 발현을 증가시키는 화합물, PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적으로 발생하는 결합 파트너 및 PD-L3 또는 VISTA를 발현하는 세포의 상호작용을 증진시키는 화합물을 포함한다.
3. 면역반응의 하향조절
PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 억제적 기능을 상향조절하여 면역반응을 하향조절하기 위해서 본 발명의 많은 실시예가 있다. 하향조절은 이미 진행된 면역반응을 억제하거나 또는 차단하는 형태일 수 있고, 또는 면역반응의 유도를 차단하는 것과 관련될 수도 있다. 활성화된 면역세포의 기능은 면역세포 반응을 하향조절함으로써 또는 면역세포의 특이적 아너지 (anergy)를 유도함으로써 또는 그 둘 모두에 의해 억제될 수 있다. 예를 들면, 어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA가 억제적 수용체와 결합하는 곳에서, 상기 억제적 수용체와 결합하는 PD-L3 또는 VISTA의 형태, 예를 들면 세포표면의 다가 (multivalent) PD-L3 또는 VISTA는 면역반응을 하향조절할 수 있다. 본 발명의 어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 활성을 자극시키는데 이용되는 활성화 항체는 이중특이적이다. 예를 들면 상기 항체는 PD-L3 또는 VISTA 결합부위, 및 면역세포, 예를 들면 T세포, B 세포 또는 골수성 세포에서의 세포표면 수용체를 표적으로 하는 또 다른 결합부위를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 항테는, PD-L3 또는 VISTA 결합부위를 포함하는 것 뿐만 아니라, 특이적 세포집단에 대한 분자를 표적화하기 위해 B 세포 항원 수용체, T 세포 항원 수용체 또는 FC 수용체와 결합하는 결합부위는 포함할 수 있다. 이중특이적 항체에 대한 2차 항체의 선별은 억제를 위해 표적화되려는 세포집단의 선별에서 유동성 (flexibility)를 제공한다. PD-L3 또는 VISTA 활성을 촉진시키고 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 활성화 항체 또는 PD-L3 또는 VISTA 활성화 작은부자)의 상호결합을 증진시키는 제제는 그들의 면역세포 증식을 억제 및/또는 작용기 기전을 억제하거나, 또는 시험관내 거사에서 첨가될 때 아너지를 유도하는 능력에 의해 동정될 수 있다. 예를 들면, 세포는 활성화 수용체를 통한 신호전달을 자극시키는 제제의 존재하에 배양될 수 있다. 세포 활성화의 많은 기술-인지적 판독(art-recognized readout)은 활성화제제의 존재하에서, 예를 들면 세포 증식 또는 작용기 기전 (예를 들면, 항체생산, 사이토카인 생산, 대식세포작용)을 측정하는데 적용될 수 있다. 이러한 활성화를 차단하는 검사제제의 능력은 측정될 증식 또는 작용기 기능을 감소시키는 효과를 나타내는 제제의 능력을 측정함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 어떤 실시예에서, 낮은 항원농도에서, PD-L3 또는 VISTA 면역세포 상호작용은 강력한 B7-CD28 신호를 억제한다. 또 다른 실시예에서, 높은 항원농도에서, PD-L3 또는 VISTA 면역세포 상호작용은 사이토카인의 생산을 감소시킬 수 있지만 T 세포 증식을 억제하지 않는다. 따라서, 검사 화합물의 활성화를 차단시키는 능력은 항원의 상이한 농도에서 사이토카인 생산 및/또는 증식을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 어떤 실시예에서, 내성은 PD-L3 또는 VISTA 작용제와 함께 항원을 공동투여함으로써 특이적 항원에 대해 유도될 수 있다. 예를 들면, 내성은 특이적 폴리펩티드에 대해 유도될 수 있다. 어떤 실시예에서, 면역반응이 바람직하지 않은 알러젠 또는 외부 폴리펩티드에 대한 면역반응은 억제될 수 있다. 예를 들면 인자 VIII를 받는 환자는 종종 이러한 혈액응고인자 (clotting factor)에 대한 항체를 생산한다. 재조합 인자 VIII와 함께, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 그것의 자연적 결합 파트너와의 상호작용을 자극시키는 제제의 공동투여 (또는 예를 들면 교차연결에 의해 물리적으로 PD-L3 또는 VISTA를 인자 VIII와 연결)는 면역반응의 하향조절을 초래할 수 있다.
어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA 작용제, 및 면역세포에 있는 공동자극 수용체의 활성을 차단할 수 있는 또 다른 제제는 면역반응을 하향조절하는데 사용될 수 있다. 예시적 분자는 하기를 포함한다: 다른 PD 리간드의 작용제 형태, CTLA-4의 용해성 형태, 항-B7-1 항체, 항-B7-2 항체, 또는 그것의 조합. 또는, 두 개의 분리된 펩티드 (예를 들면, B7-2 및/또는 B7-1 폴리펩티드의 차단적 형채를 가진 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드) 또는 항체의 조합 (항-B7-2 및/또는 항-B7.1 차단적 단일클론항체와 함께, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드에 대한 활성화 항체)는 개체에서 면역세포매개 면역반응을 하향조절하기 위해서, 단일 조성물로서 조합될 수 있고 또는 분리되어 투여될 수 있다 (동시에 또는 연속적으로). 또한, B7-1 및/또는 B7-2 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드와 함께, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 펩티드의 치료적 활성량은 면역반응에 영향을 주는 다른 하향조절시약과 함께 병용되어 사용될 수 있다. 다른 면역하향조절시약의 예는 공동자극 신호 (예를 들면, CD28 또는 ICOS에 대한), CTLA4를 통한 억제적 신호를 활성화시키는 항체 및/또는 다른 면역세포마커 (예를 들면, CD40, CD40리간드 또는 사이토카인)에 대한 항체, 융합 단백질 (예를 들면, CTLS4-Fc 또는 PD-2-Fc) 및 면역억제적 약물 [예를 들면, 라파마이신 (rapamycin), 사이클로스포린 A (cyclosporin A), 또는 FK506]을 포함한다. 또한, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티는 세포의 파괴에 의한 면역세포 기능을 차단하는 치료적 제제의 제작에서 유용할 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA의 부분은 그것이 결합하는 세포의 파괴를 야기할 수 있는 세포독성제제를 제작하기 위한 독소와 연결될 수 있다.
세포독성 제제에 대하여, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 알려진 기술을 이용하여 독소와 연결되어가 또는 조작적으로 결합될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체와 결합할 수 있는 다양한 독소가 알려져 있다. 예는 하기를 포함한다: 많은 유용한 식물-, 곰팡이-, 또는 박테리아-유래 독소, 그 예는 하기를 포함한다: 다양한 A 사슬 독소, 특히 리신 A 사슬 (ricin A chain); 사포린 (saporin) 또는 겔로닌 (gelonin)과 같은 리보솜 비활성화 단백질; 알파-사르신 (alpha-sarcin); 아스페르길린 (aspergillin); 레스트릭토신 (restictosin); 및 태반 뉴클레아제와 같은 리보뉴클라아제 (ribonuclease), 혈관생성 (angiogenic), 디프테리아 독소, 또는 수도모나스 내독소 (pseudomonas endotoxin). 본 발명과 병합하여 사용하기 위한 바람직한 독소 모이어티는 탄수화물 잔기가 변형되거나 또는 제거되도록 처리된 독소 A 사슬인 데글리코실레이티드 A 사슬 (deglycosylated A chain)이다 (U.S. Pat. No. 5,776,427).
상기 세포독성 제제의 하나 또는 조합의 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 리신 (단독 또는 PD-L1-리신과의 조합에서) 환자로 투여는 면역세포의 사멸, 특히 PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너를 높은 수준으로 발현하는, 활성화된 면역세포의 사멸을 야기할 수 있다. 예를 들면, PD-1은 활성화된 림프구의 표면에서 유도되기 때문에, Fc-R 의존적 기전에 의해 또는 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드와 세포독성 약물 [예를 들면 리신, 사포린 또는 칼리시미신 (calicheamicin)]을 결합의 제거에 의한 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드는 상기 특이적 세포의 고갈을 표적으로 하기위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 독소는 PD-L3 또는 VISTA-발현 항원제시세포의 사멸을 표적화하기 위해, 항-PD-L3 또는 VISTA 항체와 결합될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 PD-L3 또는 VISTA-항원-독소는 이중특이적 항체일 수 있다. 상기 이중특이적 항체는, 예를 들면 세포의 특정 종류, 예를 들면 B 림프구, 단핵구, 수지상 세포 또는 랑게르한스 세포 (Langerhans cells)에서만 특이적으로 발현하는 마커를 사용하여, 특이적 세포집단을 표적하기 위해 유용하다. PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA-면역세포 상호작용을 활성화시킴으로써 (및 따라서 PD-L3 또는 VISTA의 음성 신호기능을 자극하는) 면역반응을 하향조절하는 것은, 예를 들면 조직, 피부 및 기관이식 상황에서, 이식편대숙주병 (GVHD) 또는 알러지, 또는 전신적홍반성루푸스 및 다발성 경화증과 같은 자가면역질환에서 면역반응을 하향조절하기 위해 유용하다. 예를 들면, 면역세포 기능의 차단은 조직이식에서 감소된 조직파괴를 야기시킨다. 전형적으로, 조직이식에서, 상기 조직의 거부는 면역세포에 의해 외부것으로서 인식하고, 그 후 상기 이식을 파괴하는 면역반응에 의해 개시된다. PD-L3 또는 VISTA의 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 면역세포에서의 그것의 자연적 결합 파트너 (예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드의 용해성, 다합체 형태)의 상호작용을 촉진시키는 분자의, 이식 이전 또는 이식할 때, 단독 또는 다른 하향조절제제와 병행한 투여는 공동분자 신호의 형성을 억제할 수 있다. 또한, PD-L3 또는 VISTA 활성의 촉진은 면역세포를 아너지화하기 충분하고, 따라서 개체에서 내성을 야기할 수 있다.
개체에서 충분한 면역억제 또는 내성을 이루기 위해서, 다른 분자의 공동자극의 기능을 차단시키는 것을 바람직하다. 예를 들면, 이식 이전 또는 이식할 때, 상기 항원 각각의 활성을 가지는 펩티드 조합의 용해성 형태,또는 상기 항원들에 대한 차단항체를 투여함으로써 (분리적으로 또는 단일 조성물에서 함께), B7-1 및 B7-2의 기능을 차단시키는 것은 바람직하다. 또는, PD-L3 또는 VISTA의 억제적 활성을 촉진하고 및 B7-1 및/또는 B7-2의 공동자극적 활성을 억제하는 것은 바람직하다. 본 발명의 하향조절적 방법과 연결되어 사용될 수 있는 다른 하향조절적 제제는, 예를 들면 CTLA4를 통한 억제성 신호를 전달하는 제제, CTLA4의 용해성 형태, CTLA4를 통한 억제성 신호를 활성화시키는 항체, 다른 면역세포 마커에 대한 차단항체, 또는 다른 수용체 리간드 쌍의 용해성 형태 [예를 들면, CD30 및 CD40 리간드 사이의 상호작용을 파괴하는 제제 (예를 들면 항CD40리간드 항체)], 사이토카인에 대한 항체, 또는 면역억제적 약물을 포함한다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA를 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용을 활성화시키는 것은 자가면역 질환을 치료하기 위해 유용하다. 많은 자가면역 장애는 자기조직 (self tissue)에 대해 반응하고 사이토카인 생산을 촉진하는 면역세포의 적절하지 않은 활성화 및 상기 질환의 병리학과 관련된 자가 항체 (automated antibody)의 결과이다. 자기반응성 면역세포의 활성화를 차단하는 것은 질환 증상을 감소시키거나 제거할 수 있다. PD-L3 또는 VISTA의 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호결합을 촉진시키는 제제의 투여는 상기 질환으로부터의 장기간 해방을 초래할 수 있는, 자기반응성 면역세포의 항원-특이적 내성을 유도할 수 있다. 또한, 공동자극 수용체와 B7 분자의 수용체-리간드 상호작용을 파괴함으로서 면역세포의 공동자극을 차단하는 제제의 공동투여는 상기 질환 경과와 관련될 수 있는 자기반응항체 또는 사이토카인의 생산을 차단하기 위해 면역세포의 활성화를 억제하는데 유용할 수 있다. 자가면역 장애를 예방하거나 또는 경감시키는 시약의 효과는 인간 자가면역 질환의 잘 특징화된, 많은 동물모델을 사용하여 결정될 수 있다. 예는 실험적 자가면역 뇌척수염 (experimental autoimmune encephalitis), MRL/lpr/lpr 생쥐 또는 NZB 하이브리드 생쥐에서의 전신적홍반성루푸스, 생쥐 자가면역 콜라겐 관절염, NOD 생쥐 및 BB 쥐에서의 당뇨병, 및 생쥐 실험적 중증근무력증 (experimental gravis myasthenia)를 포함한다 (Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Newyo가, 1989, pp. 840-856을 참조).
면역세포 활성화의 억제는, 예를 들면 IgE 생산을 억제함으로써, 알러지 및 알러지 반응의 치료에 유용하다. PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너와의 상호작용을 촉진시키는 제제는 개체에서 면역세포-알러지반응을 억제하기 위해, 상기 알러지 개체로 투여될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 그것의 자연적 결합 파트너와의 상호작용의 자극은 적절한 MHC 분자와 연결된 알러젠에 노출되는 것과 동반될 수 있다. 알러지 반응은 비만세포 또는 호염구 (basophil)의 IgE 축적의 양상 및 알러젠의 투여입구에 따라, 자연에서 전신적이거나 또는 국소적일 수 있다. 따라서, 면역세포-매개 알러지 반응은 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA-면역세포 상호작용을 촉진시키는 제제를 전신적으로 또는 국소적으로 투여함으로써 억제될 수 있다.
PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너와의 상호작용을 통한 면역세포 활성화의 억제는 면역세포의 병리학적 감염에서 (예를 들면, 바이러스 또는 박테리아에 의한) 치료적으로 중요할 수 있다. 예를 들면, 후천성 면역결핍증후군 (acquired immunodeficiency syndrom; AIDS)에서, 바이러스 복제는 면역세포 활성화에 의해 자극될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 활성화의 자극은 바이러스 복제의 억제를 야기할 수 있고, 따라서 AIDS의 경과를 경감시킬 수 있다.
또한, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용의 자극을 통한 면역반응의 하향조절은 자기 조직의 자가면역공격을 치료하기 위해 유용할 수 있다. 따라서, 자가면역공격에 의해 발생되거나 악화되는 질병 (예를 들면, 심장질환, 심근경색증 또는 죽상동맥경화증)은 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 결합을 증가시킴으로써 경감되거나 또는 개선될 수 있다. 그러므로, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 대응 수용체의 상호작용을 자극시킴으로써, 자가면역공격, 예를 들면 자가면역장애 (뿐만 아니라 심장질환, 심근경색 또는 죽상동맥경화증)에 의해 악화되는 질병을 조절하는 것은 본 발명의 영역내에 있다.
4. 면역반응의 상향조절
면역반응을 상향조절하는 수단으로서, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용의 억제는 치료에서 유용하다. 면역반응의 상향조절은 존재하는 면역반응을 증진시키거나 또는 초기 면역반응을 유도하는 형태일 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 활성을 억제는 통한 면역반응의 증진은 미생물, 예를 들면 박테리아, 바이러스 또는 기생충 감염의 경우, 또는 면역억제의 경우에 유용하다. 예를 들면, 어떤 실시예에서, PD-L3 또는 VISTA활성을 억제하는 제제, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA에 대한 비-활성화 항체 (즉, 차단항체) 또는 PD-L3 또는 VISTA의 용해성 형태를 억제하는 제제는 바이러스, 박테리아, 또는 기생충의 보다 급속한 또는 전체 클리어런스 (cleaarnce)를 야기하는, 항체 및 세포-매개 반응의 상향조절이 이득이 되는 상황에서 치료적으로 유용하다. 이러한 질병은 바이러스 피부 질환, 예를 들면 헤르페스 (herpes) 또는 대상포진 (shingle)을 포함하고, 여기에서 상기 제제는 피부에 국소적으로 운반된다. 또한, 전신적 바이러스 질환, 예를 들면 인플루엔자, 일반적 감기 및 뇌척수염은 상기 제제를 전신적으로 투여함으로써 완화될 수 있다. 특정 경우에, 면역반응을 더 증강시키기 위해서 면역반응을 상향조절하는 다른 제제를, 예를 들면 공동자극 수용체를 통해 신호를 전달하는 B7계 멤버의 형태를 투여하는 것은 바람직하다.
또는, 환자로부터 면역세포를 제거하고, 시험관내에서 면역세포를 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너와의 상호작용을 억제하는 제제와 접촉시키며, 및 시험관내에서 자극된 면역세포를 환자에게 재도입시키는 것에 의해 감염된 환자내에서 면역반응이 증진될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 면역반응을 증진시키는 방법은 환자로부터 감염된 세포를, 예를 들면 바이러스에 감염된 세포를 분리하고, 세포가 그들의 표면에 PD-L3 또는 VISTA 분자 전체 또는 부분을 발현하도록, 그들의 자연적 결합 파트너와 결합할 수 없는 PD-L3 또는 VISTA의 형태를 암호화하는 핵산분자를 그들에게 형질도입시키며, 및 상기 환자에게 상기 형질도입된 세포를 재도입시키는 것과 관련이 있다. 상기 형질도입된 세포는 억제적 신호를 방지할 수 있을 수 있고, 따라서 생체내에서 면역 세포를 활성화시킬 수 있다.
PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용을 억제하는 제제는 다양한 폴리펩티드, 예를 들면 병원균으로부터 유래된 폴리펩티드에 대한 백신에서 예방적으로 사용될 수 있다. 병원균에, 예를 들면 바이러스에 대한 면역은 PD-L3 또는 VISTA의 활성을 억제하는 제제와 함께 바이러스 폴리펩티드로 백신화함으로써 유도될 수 있다. 또는, 병원성 항원 및 PD-L3 또는 VISTA와 면역세포의 상호작용을 차단하는 PD-L3 또는 VISTA의 형태 모두를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터는 백신화를 위해 사용될 수 있다. 핵산백신은 다양한 방법으로, 예를 들면 주입 [예를 들면, 근육내 (intramuscular), 피내 (intradermal) 또는 DNA-코팅 금 입자 (DNA-coated gold particle)를 경피로, 상기 입자를 상기 피부로 주입하기 위해 입자촉진제 또는 압축된 가스를 이용한 유전자총을 이용하여 주입하는 바이오리스틱 주입 (biolistic injection) (Haynes et al. (1996) J. Biotechnol. 44:37)]에 의해 투여될 수 있다. 또는, 핵산백신은 비침투성 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 순수한 또는 지질-제형화된 DNA는 호흡계 또는 DNA의 경구운반을 통해 표적된 장소, 예를 들면 페이어스 패치 (Peyers patches)에 운반될 수 있다 (Schubbert (1997) Proc Natl. Acad. Sci. USA 94:961). 완화된 미생물 (atteuated microorganism)은 점박 표면에 전달하기 위해 사용될 수 있다 (Sizemore et al. (1995) Science 270:29).
또 다른 실시예에서, 상기 백신의 상기 항원은 자기-항원이다. 상기 백신은 생물체에서 내성을 조절하는데 유용하다. 자기 항원 및 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용을 차단하는 제제를 사용한 면역화는 내성을 깰 수 있다 (즉, 자기 항원의 내성을 방해한다). 또한, 상기 백신은 알럼 (alum) 또는 사이토카인 (예를 들면, GM-SCF, IL-12, B7-1 또는 B7-2)과 같은 보강제를 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 감염으로부터의 면역을 제공하기 위하여, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용을 억제하는 제제는, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 또는 차단 항체, 및 T 세포의 활성화를 초래하기 위한 MHC 클래스 I .알파. 사슬 폴리펩티드 및 베타2 마이크로글로불린을 공동발현하기 위해 형질도입된 세포에 의해, MHC 클래스 I 폴리펩티드와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 백신에 사용되는 바이러스 병원균은 하기를 포함한다: B형 간염바이러스, C형 간염바이러스, 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus), 거대세포바이러스, HIV-1, HIV-2, 결핵 (tuberculosis), 말라리아 및 주혈흡충증 (schistosomiasis).
또 다른 측면에서, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용의 억제는 종양면역의 치료에서 유용하게 사용될 수 있다. 종양세포 (육종, 흑생종, 림프종, 백혈병, 신교세포종 또는 선암)은 PD-L3 또는 VISTA 활성을 억제하는 핵산분자로 형질도입될 수 있다. 이러한 분자는, 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA에 안티센스인 핵산분자일 수 있거나, 또는 비-활성 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 암호화할 수 있다. 또한, 상기 분자는 항-PD-L3 또는 VISTA 항체의 가변부위일 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양세포는 또한 공동자극 (예를 들면, B7-1 또는 B7-2)를 활성화시키는 다른 폴리펩티드가 도입될 수 있다. 상기 형질도입된 종양세포는 환자에게 다시 돌아가며, 이는 PD-L3 또는 VISTA 활성의 억제를 초래한다. 또는, 유전자 치료기술은 생체내에서 형질도입을 위해 종양세포를 표적으로 하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 종양세포에 대한 면역반응의 자극은 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용을 억제함으로써, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너를 억제하는 제제로 환자를 치료함으로써 이루어질 수 있다. 상기 제제의 바람직한 예는 안티센스 핵산분자, PD-L3 또는 VISTA를 인지하고 차단하는 항체, 및 면역세포에서 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적으로 발생한 결합 파트너의 상호작용을 차단하는 화합물을 포함한다 (예를 들면, 항원제시세포에서 Fc 수용체와 결합하지 않는 PD-L3 또는 VISTA 분자의 용해성 형태; PD-L3 또는 VISTA 결합 파트너의 용해성 형태; 및 상기 개체 스크리닝 검사에서 동정된 화합물). 또한, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자가 결여되거나 또는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자의 충분항 양을 발현하는데 실패한 종양세포는, MHC 클래스 I .알파. 사슬 폴리펩티드 및 베타2 마이크로 글로불린 폴리펩티드 또는 MHC 클래스 II .알파. 사슬 폴리펩티드 및 MHC 클래스 II .베타. 사슬 폴리펩티드의 전체 또는 부분 (예를 들면, 세포질-도메인 절단 부분)을 암호화하는 핵산으로 형질도입 될 수 있고, 따라서 세포표면에 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 폴리펩티드를 발현 할 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 억제 폴리펩티드 또는 안티센스 핵산과 함께 상기 적절한 MHC 클래스 I 또는 클래스 II의 발현은 형질도입된 종양세포에 대한 T 세포 매개 면역반응을 유도한다. 선택적으로, 종양 관련 항원의 제시를 촉진하고 종양 특이적 면역을 유도하기 위해서, MHC 클래스 II-관련 폴리펩티드, 예를 들면 불변사슬의 발현을 차단하는 안티센스 구조물을 암호화하는 유전자도 PD-L3 또는 VISTA 억제 폴리펩티드 또는 안티센스 핵산을 암호화하는 DNA와 함께 공동형질도입될 수 있다. B7-음성 생쥐 종양세포에 의해 B7-1의 발현이, 생쥐에서 종양 거부 및 종양이식에 대한 지연된 보호를 동반한 T 세포 매개 특이적 면역을 유도하는 것이 나타났다 (Chen, L. et al. (1992) Cell 71: 1093-1102; Townsend, S. E. and Allison, J. P. (1993) Science 259: 368-370; Naskar, S. et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. 90: 5687-5690). 따라서, 인간 개체에서 면역세포-매개 면역반응의 유도는 종양-특이적 내성을 개체에서 극복하기에 충분할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 면역반응은 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너와의 상호결합을 억제함으로써 자극될 수 있고, 따라서 먼저 존재하는 내성은 극복될 수 있다. 예를 들면, 개체가 유의적인 면역반응을 발달시키지 못하는 항원에 대한 면역반응, 예를 들면 종양-특이적 항원은 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA의 그 자연적 결합 파트너와 결합하는 능력을 억제시키는 제제를 투여함으로써 유도될 수 있고, 활성 면역화의 과정에서 외부 항원에 대한 반응을 증강시키기 위해 보강제로서 사용될 수 있다.
어떤 실시예에서, 면역세포는 상기 면역세포 집단을 팽창시키기 위해서, 개체로부터 수득되고, 생체외에서 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA과 그것의 자연적 결합 파트너와의 상호작용을 억제하는 제제의 존재하에서 배양된다. 또 다른 실시예에서, 상기 면역세포는 그 후 개체에게 주입된다. 면역세포는, 예를 들면 당업계에 알려진, 1차 활성화 신호 및 공동자극신호를 면역세포에 제공함으로써 시험관내에서 증식하도록 자극받을 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 폴리펩티드 및 PD-L3 또는 VISTA 활성을 억제하는 제제의 다양한 형채는 또한 면역세포의 증식을 공동자극하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 면역세포는 PCT 출원 No. WO94/29436에서 기술된 방법에 따라 생체외에서 배양된다. 상기 공동자극 분자는 용해성 (soluble)이거나, 세포막에 결합되었거나, 또는 고체표면, 예를 들면 비드와 결합되었다.
또 다른 실시예에서, 여기에서 기술된 상기 방법의 어떤 것을 수행하는데 있어서, 하나 또는 그 이상의 제제를 투여함으로써 면역반응을 상향조절하는 것은 본 발명의 영역 내에 있다. 예를 들면, 면역반응을 자극시키는 것으로 알려진 다른 제제, 예를 들면 사이토카인, 보강제, 또는 공동자극 분자의 자극적 형태 또는 그들의 리간드의 사용은 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용을 억제하는 제제와 함께 사용될 수 있다.
E. PD - L3 또는 VISTA 활성 또는 PD - L3 또는 VISTA 와 T 세포에 있는 그것의 대응 수용체의 상호작용의 조절에 의애 조절된 사이토카인의 동정
상기 기술된 PD-L3 또는 VISTA 분자는 생산된 사이토카인, 또는 PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 자연적 결합 파트너의 상호작용의 조절에 대해 면역세포에서 그 생산이 증진 또는 억제된 사이토카인을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 면역세포는 시험관내에서 차선택적으로 1차 활성화 신호로 자극될 수 있고, 예를 들면 T 세포는 포볼 에스테르 (pharbol ester), 항-CD3 항체, 또는 바람직하게 MHC 클래스 II 분자와 결합된 항원 및 주어진 공동자극 신호, 예를 들면 B7계 항원의 자극적 형태에 의해, 예를 들면 표면에 B7 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질도입되고 그 표면에 상기 펩티드를 발현함으로써, 또는 상기 펩티드의 용해성, 자극적 형태에 의해서 자극될 수 있다. 그 후, 상기 세포는 PD-L3 또는 VISTA (예를 들면 PD-L3 또는 VISTA에 대한 항체)를 발현하는 세포와 접촉될 수 있다. 배지로 분비되는, 알려진 사이토카인은 ELISA에 의해, 또는 면역세포의 증식 또는 상기 사이토카인에 의해 유도되는 다른 세포 종류의 증식을 억제하는 사이토카인을 차단하는 항체의 능력에 의해 동정될 수 있다. 예를 들면, IL-7 차단항체와 같이, IL-4 ELISA 키트는 Genzyme (Cambridge, Mass.)로부터 이용가능하다. IL-9 및 IL-12에 대한 차단항체는 Genetics Institute (Cambridge, Mass)로부터 이용가능하다. 상기 사이토카인 프로파일에서, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 그것의 결합 파트너의 상호작용을 자극시키거나 또는 차단하는 효과는 그 후 결정될수 있다. 상기 기술되고 실시예에서 보여진 것과 같이, PD-L3 또는 VISTA는 면역세포에 의해 IL-2 및 감마 인터페론의 발현을 명확하게 억제한다.
또한, 상기에 기술된 시험관 내 면역세포 공동자극 검사는 PD-L3 또는 VISTA 활성을 조절함으로써 조절될 수 있는 신규한 사이토카인을 동정하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, CD28/CTLA4 경로의 자극은 IL-2 분비를 증가시키는 것으로 보이는 곳에서, ICOS 경로의 자극은 IL-10의 분비를 증진시키는 것으로 보인다 (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263). 공동자극에 의해 유도된 특정 활성, 예를 들면 면역세포 증식은 알려진 사이토카인에 대한 차단항체를 첨가함으로써 억제될 수 없다면, 상기 활성은 알려지지 않은 사이토카인의 작용으로부터 초래된 경우일 것이다. 공동자극 후에, 이러한 사이토카인은 보편적인 방법에 의해 배지로부터 정제될 수 있고, 그것의 활성은 면역세포 증식을 유도하는 그것의 능력에 의해 측정될 수 있다.
내성의 유도에서 중요한 역할을 할 수 있는 사이토카인을 동정하기 위해서, 상기에서 기술된 시험관내 T 세포 공동자극 검사는 사용될 수 있다. 이러한 경우에, T 세포는 주어진 1차 활성화 신호일 수 있고, 선별된 사이토카인과 접촉되지만 주어진 공동자극신호가 아닐 수 있다. 만약 상기 면역세포가 반응 (예를 들면 증식 또는 사이토카인 생산)하지 않는다면, 그들은 내성화되어, 상기 사이토카인은 내성의 유도를 예방하지 못한다. 하지만, 상기 면역세포가 반응하면, 내성의 유도는 상기 사이토카인에 의해 방지된다. 내성을 유도할 수 있는 상기 사이토카인은 이식 수여자 또는 자가면역 질환을 가지는 개체 내에서 내성을 유도하기 위한 보다 효과적인 수단으로서, B 림프구 항원을 차단하는 시약과 함께. 생체내에서 표적될 수 있다. 예를 들면, PD-L3 또는 VISTA 활성 또는 PD-L3 또는 VISTA와 결합 파트너의 상호작용을 촉진시키는 제제와 함께 사이토카인 차단 항체를 개체로 주입할 수 있다.
따라서, 요약하면, 세포계획사 리간드 (Programmed Death Ligand; PDL) 계의 신규한 멤버가 동정되었고, 이는 Treg 세포에 발현한다. 상기 신규한 단백질은 PD-L3 또는 VISTA라고 명명되었다. 상기 PD-L 계의 수용체는 단일 IgV도메인을 포함하는 종류 I 막관통 단백질인 반면, 상기 리간드는 IgV 및 IgC 세포외 도메인을 발현하는 종류 I 막관통 단백질이다. PDL계의 다른 멤버와 마친가지로, PD-L3 또는 VISTA는 시험관내에서 T 세포의 αCD3 증식을 공동자극한다. 또한, PD-L3 또는 VISTA의 발현은 αCD3 활성화 Treg 세포를 증가시키고 αGITR의 존재하에서 감소된다.
둘째, TNF-유사, 단백질은 αCD3/αGITR 자극에 의해 상향조절되는 것으로 동정되었다. 상기 단백질은 Treg-sTNF라고 명명된다. 상기 단백질은 접촉-의존적 및 면역의 파라크라인 (paracrine) 억제와 관련될 수 있고, 그러므로 면역반응을 조절 (상향 또는 하향)하는 위해 및 Treg 신호전달과 관련된 질환 및 질병에서 유용하다. 예를 들면 PD-L3 또는 VISTA 단백질은 면역세포 활성화르를 자극시키거나 또는 증진시키기 위한 공동자극신호로서 사용될 수 있다. PD-L3 또는 VISTA 단백질 및 PD-L3 또는 VISTA 결합제 및 PD-L3 또는 VISTA 작용제 및 길항제는 특히 면역질병을 치료하는데 유용하고, 여기에서 T 세포 면역의 조절, 예를 들면 T 세포의 활성화, 분화 및 증식의 조절이 바람직하며, 및 특히 CD4+ T 및 CD8+ T 세포 증식, 사이토카인 생산, 및 T 세포 및 골수성 유래 APCs사이의 연계적 상호작용 동안의 T 세포의 조절이 바람직하다.
본 발명은 나아가 하기의 실시예에 의해 기술되고, 본 발명의 제한으로서 이해되지 않는다. 본 출원서 전체에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원서의 내용, 뿐만 아니라 도 및 서열목록은 참고문헌으로써 여기에서 포함된다.
실시예
하기의 재료 및 방법은 :재료 및 방법 (material and method)에 따른 실시예에서 사용되었다.
발현프로파일 ( expression profiling )
Treg 세포의 수립된 발현 프로파일을 비교를 촉진하기 위해서, 일반적인 성장 및 활성화 조건을 적용하였다 (상기 McHugh, et al. (2002)). 간략하게, 신선하게 분리된 Treg 세포 (∼96% 양성)은 항-GITR (DTA-1)와 함께 또는 없이, 항-CD3과 함께 선코팅된 24-웰 (well) 플레이트에서 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum) 및 100 유닛 (unit)의 IL-2를 가지고 있는 완전 RPMI 배지에서 106/ml의 농도로 배양되었다 (상기 Shimizu, et al. (2002)). 상기 세포는 37℃에서 0 및 12시간동안 배양되었고, RNA는 정제되었으며, 그 후 Affymetirx® 생쥐 게놈 A430 올리고뉴클레오티드 어레이 (array)를 사용하여 분석되었다.
휴지기 (resting) 또는 활성화된 CD4+CD25+ T 세포군으로부터의 상기 데이터를 비교함으로써, 유전자 발현양상은 당업계에서 수립된 것 (상기 Gavin, et al. (2002); 상기 McHugh, et al (2002))과 유사하다는 것이 발견되었다. GIRT 신호전달에 의해 조절되는 유전자를 동정하기 위해서, 항-GITR 처리를 한 또는 하지 않은 상이한 세포군 사이에서 유전자 발현 프로파일을 비교하였다. 이전에 특징되지 않은 PD-L3 또는 VISTA 및 Treg-sTNF를 포함하는, 알려진 뿐만 아니라 알려지지 않은 유전자의 목록을 만들었다.
생쥐
C57BL/6 생쥐, 및 OTII CD4 형질도입 생쥐를 Jackson Laboratory로부터 구입하였다. FoxP3-GFP 수용체 생쥐는 이전에 기술된 것과 같고 (Frontenor, J.D., Rasmussen, J.P. Williams, L.M., Dooley, J.L., Farr, A.G., and Rudensky, A.Y. (2005)). Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3, Immunity 22, 329-341), Alexander Rudensky University of Washington School of Medicine Seatle, WA에 의해 친절하게 제공되었다. PD-l KO 생쥐는 Dr. Tasuku Honjo (Kyoto University, Japan)에 의해 친절하게 제공되었다 (Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N., Honjo, T. (1999) Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity 11, 141-151; Nishimura, H., Okazaki, T.,Tanaka, Y., Nakatani, L., Hara, M., Matsumori, A., Sasayama, S., Mizoguchi, A., Hiai, H., Minato, N., and Honjo, T., (2001) Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice. Science 291, 319-322). 모든 동물은 다트머스 의과대학 (Dartmouth Medical School)의 병원균-유리 시설 (pathogen-fee facility)에서 사육되었다.
Abs , 세포주 및 시약:
항체 αCD3 (2C11), αCD28 (PV-1), αCD4 (GK1.5), αCD8 (53-6.7), αCD11b (M1/70), αF4/80 (BM8), αCD11c (N418), αNK1.1 (PK136), αGr1 (RB6-8C5), αPD-L1 (MIN5), αPD-L2 (TY25), αB7-H3 (M3.2D7), αB7-H4 (188)를 Ebioscience로부터 구입하였다. LPS (Sigma), 재조합 생쥐 IFN (Peprotech), 인간 IL-2 (Peprotech), 용해성 (soluble) PD-L1-Ig 융합 단백질 (R&D system)은 나타난 농도에서 사용되었다. 완전 프로이트항원보강제 (complete Freund's adjuvant; CFA) 및 닭 오브알부민 (ovalbuminl; OVA)은 Sigma로부터 구입되었다. MHC II 분자 I-Ad 및 공동자극분자 B7-2를 발현하는 상기 CHO 세포주는 Dr. Arlene Sharpe (Harvard Medical School)에 의해 친절하게 제공되었다.
PD - L3 또는 VISTA 의 분자 클로닝 , 레트로바이러스 생산 및 세포의 레트로바이러스 형질도입
PD-L3 또는 VISTA의 전장을 분리된 생쥐 CD4+ T 세포로부터 클론하였다. Qiagen RNA 미니키트를 사용하여, 총 RNA를 CD4+ T 세포로부터 분리하였다. Bio-Rad iScriptTM cDNA 합성키트를 사용하여, cDNA를 생산하였다. PD-L3 또는 VISTA의 전장을 증폭하였고 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) pMSCV-IRES-GFP의 EcorI-XhoI 부위로 클로닝하였고 (Zhang, X., 및 Ren, R. (1998). Bcr-Abl efficiently induces a myeloproliferative disease and production of excess interleukin-3 and granulcyte-macrophage colony-stimulating factor in mice: a novel model for chronic myelogenous leukemia. Bllod 92, 3928-3840), 여기에서 IRES-GFP 단편은 RFP로 대체되었고, 따라서 N-말단에 RFP가 융합된 PD-L3 또는 VISTA의 융합단백질이 만들어졌다. 도움이 없는 레트로바이러스 (helper free retrovirus)는 동종숙주 패키지 벡터 (ecotrophic package vector) pCL-Eco와 함께 (IMGENEX corp.), PD-L3 또는 VISTA-RFP 레트로바이러스 벡터의 일시적 형질도입에 의해, HEK293T에서 생산되었다. 생쥐 T 세포주 EL4 세포 또는 골수유래 DCs의 레트로바이러스 형질도입은 8μg/ml 폴리브렌 (polybrene) (Sigma)의 존재하에서 45분 동안 2000RT에서 회전감염 (spin infection)에 의해 수행되었다.
PD - L3 또는 VISTA - Ig 융합 단백질의 생산
PD-L3 또는 VISTA의 세포외 도메인 (아미노산 32-190)은 증폭되었고 모벡터 (parental vector) CDM7B의 SpeI-BamHI 부위로 클로닝되었다 (Hollenbaugh, D., Douthwright, J., McDanald, V., and Aruffo, A. (1995). J Immunol Methods 188, 1-7). 이러한 벡터는 인간 IgG1의 불변 (constant) 및 경첩부위 (hinge region)의 돌연변이 형태를 포함하고, 이것은 Fc 수용체와 훨씬 감소된 결합을 가진다. 상기 결과로 생긴 벡터 CDM7B-PD-L3 또는 VISTA은 DHFR 발현벡터 pSV-dhfr와 함께 상기 CHO (dhfr-) 세포주 (ATCC #CRL-9096)으로 공동형질도입된다 (McIvor, R.S., and Simonsen, C. C. (1990). Nucleic Acid Res 18, 7025-7032). PD-L3 또는 VISTA-Ig를 발현하는 안정적 CHO 세포주는 뉴클레오티드 없이 배지 MEM-알파 (Invitrogen)에서 선별된다. 나아가 0.5-1μ 메토트레세이트 (methotrexate) (Sigma M9929)를 사용한 증폭은 용해성 (soluble) PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질을 높은 수준으로 발현하는 클론을 제공한다. 나아가, 상기 융합 단백질은 일반적인 단백질-G 컬럼 친화성 크로마토그래피 (protein-G column affinity chromatography)를 사용하여 배지로부터 정제되었다.
PD - L3 또는 VISTA 단일클론항체의 생산
아르메니아 햄스터 (armenian hamster)는 PD-L3 또는 VISTA를 과다발현하는 EL4 세포로 매주 4번 면역화되었고, 그 후 CFA에 유화된 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합단백질로 증강 (boost)되었다. 상기 증간 4일 후에, 일반적인 하이브리도마 융합기술을 사용하여 햄스터 비장세포가 수득되었고 골수성 세포주 SP2/0-Ag14 (ATCC #CRL-1581)와 융합되었다 (Shulman, M., Wilde, C.D., and Kohler, G. (1978). A better cell for making hybridomas secreting specific antibodues. Nature 276, 269-270). PD-L3 또는 VISTA 특이적 항체를 분비하는 하이브리도마 클론 (hybridoma clone)은 제한된 희석 후 선별되었고, ELISA 및 세포유동검사 (flow cytometry) 모두에 의해 스크리닝 되었다.
RNA 및 RT - PCR
다양한 생쥐 조직 시료 또는 정제된 조혈세포 종류로부터의 총 RNA를 회사의 지시사항을 따라 Trizol TM (Invitrogen) 방법을 사용함으로써 수득하였다. cDNA는 iScript TM cDNA 합성키트 (Bio-rad)를 사용함으로써 준비되었다. PD-L3 또는 VISTA 전장을 증폭시키기 위해서, 조직 cDNA의 동일한 양 (10ng)을 RT-PCR 반응에 사용하였다. PCR 생산물은 1% 아가로오즈 겔 (agarose gel)을 통한 러닝 (running) 후에 관찰된다.
세포유동검사 ( Flow Cytometry )
CellQuest 소프트웨어 (BD Bioscience)를 사용하여 FACSCAN에서 세포유동검사는 수행하였다. 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어 (Treesta)를 사용하여 수행되었다.
세포준비
총 CD4+ T 세포를 나이브 (naive) 생쥐로부터 총 CD4+ T 세포 분리 키트 (Miltenyi)를 사용하여 분리하였다. 표시되었을 때, 풍족한 (enriched) CD4+ T 세포는 흐르면서 나이브 (CD44low CD25- CD62Lhi) 및 기억 (CD44hi CD25- CD62Llow) 집단으로 분류되었다. 시험관내 증식검사에서, CD4+ T 세포는 5μM CFSE (Molecular Probes)로 10분 동안 37℃에서 표지되었고, 자극되기 전에 두 번 세척하였다.
시험관내 플레이트-결합 T 세포 활성화 검사 ( In vitro plate - bound T cell activation assay )
정제된 CD4+ T 세포 (웰 당 100,000 세포)를 96x 평평한 바닥 웰 플레이트에서, 제시된 비율로 항-CD3 (2C11 클론) 및 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig의 존재하에서 배양되었다. 예를 들면, 적정의 전체 범위를 위해, 96-웰 플레이트를 PD-L3 또는 VISTA-Ig 또는 대조군-Ig 단백질 1.25μg/ml (2:1 비율), 5μg/ml (1:1 비율), 10μg/ml (1:2 비율) 또는 2.5μg/ml (1:4 비율)과 함께,αCD3의 2.5μg/ml로 4℃에서 하룻밤동안 PBS에서 코팅하였다. 웰은 CD4+ T 세포를 첨가하기 전에 3번 PBS로 세척하였다. 복제 배양 (replicate culture)는 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 10mM HEPES, 50μM β-ME, 페니실린/스트렙토바이신/L-글루카민 (penicillin/streptomycin/L-glutamine)이 첨가된 완전 RPMI1640 배지에서 수행되었다. 표시되었을 때, PD-L3 또는 VISTA-Ig의 억제적 효과를 구하기 위해, 100U/ml 인간 IL-2 (PeproTech) 또는 □CD28 (클론 PV-1, BioX cell)의 적정량을 □CD3과 함께 코팅되었다. CFSE 프로파일에서 3일째 또는 표시된 시간대에 따라, 배지를 분석하였다.
골수유래 DCs 의 배양, 레트로바이러스 형질도입, 및 형질도입 CD4 + T 세포의 자극
골수유래 DCs는 Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilivie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., and Schiuler, G. (1999) An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods 223, 77-92; Son, Y. I., Egawa, S., Tatsumi, T., Redlinger, R. E. Jr., Kalinski, P., and Kanto, T (2001) A nocel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. J Immunol Methods 262, 145-157 에서 기술된 것과 같이 약간의 변형을 하여 생산되었다. 간략하게, 0번 째 날, 골수 세포를 27G 바늘로 경골 (tibia)로부터 대퇴골 (femur)로부터 쏟아냄(flushing)으로써 분리하였다. 적혈구 용해 후에, 1-2 x 106 골수세포를 6x 웰 세포배양 플레이트 (Nunc, Inc.)에서, 20 ng/ml GM-CSF (Prpeotech Inc)를 포함한 완전 RPMI1640 1ml에 재현탁하였다. RFP 또는 PD-L3 또는 VISTA-RFP 레트로바이러스 중 하나를 포함한 2ml 상층액을 상기 골수세포로 첨가하였다. 또한, 폴리프렌 (polybrene) (Sigma)을 최종농도가 8μg/ml로 첨가하였다. RT에서 45분 동안 2000 rpm에서 상기 플레이트를 회전시킴으로써 감염을 수행하였다. 그 후 세포를 또 다른 2시간 동안 배양하한 후, 신선한 배지를 첨가하였다. 유사한 감염과정은 +1째 날, +3째 날, +5째 날, +7째 날에 반복되었다. 느슨하게 부착된 세포 (90%는 CD11c+)를 +10째 날에 수득하였고, CD11c+ RFP+ 이중 양성세포를 분류하여 형질도입 OT-II CD4+ T 세포을 자극시키기 위해 사용되었다. OT-II T 세포 증식검사에서, 합성된 OVA323-339 펩티드 (Anaspec) 적정량의 존재하에서, 30,000 분류된 RFP+ 또는 PD-L3 또는 VISTA-RFP+ BMDCs와 함께, 100,000 CFSE-표지 OT-II CD4+ T 세포를 96웰 둥근-바닥 플레이트에서 배양하였다. OT-II T 세포의 증식은 CFSE 프로파일을 조사함으로써 72시간에서 분석되었다.
면역화에 대한 PD - L3 또는 VISTA 의 발현 연구
형질도입 생쥐 (transgenic mice) DO11.10를 면역화하기 위해, 300μg OVA (Sigma)를 CFA (200μl)에 유화시키고, 생쥐의 측면에 피하주입하였다. 배수 림프절 (draining lymph nodes) 및 비-배수 림프절 (non-draining lymph nodes)은 제시된 시간데에서 수득되었다. 단일세포현탁액을 준비하여 PD-L3 또는 VISTA 및 다른 표면마커의 발현에 대해 세포유동분석로 분석하였다.
PD - L3 또는 VISTA 의 억제적 활성
시험관내에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포 항원수용체 형질도입 T 세포 및 항원자극과 함께 PD-L1의 억제적 활성을 PD-L1을 과발현하는 항원제시세포를 사용함으로써 나타내었다 (Carter, et al. (2002) Eur J. Immunol. 32:634-43). 유사하게, 여기에서 공개되는, PD-L3 또는 VISTA 전장을 발현하는 상기 렌티바이러스는 주조직적합성 복합체 (major histrocompatibility comlex) 클래스 II 및 MHC 클래스 I을 발현하는 세포주로 도입되었다. 공벡터 (empty vector)-형질도입된 또는 PD-L3 또는 VISTA-형질도입된 항원제시세포에 의해 제시된 항원에 대한, TEa Tg 또는 상기 2C 형질도입 T 세포의 반응은 수립된 방법에 따라서 결정되었다.
단백질 발현. 림프구, 단핵구 및 수지상세포 하위집단 뿐만 아니라 비 조혈조직에서의 발현양상은 일반적인 프로토콜을 사용하여, 여기에서 공개되는 αPD-L3 또는 VISTA 항체와 조합되어, RT-PCR 및 웨스턴 블랏 (Western blot) 분석에 의해 결정된다.
단일클론항체생산. PD-L3 또는 VISTA는 생쥐 B 세포주 A20에서 과발현되고, 상기 재조합세포는 아르메니아 햄스터를 면역화시키기 위해 사용된다. 5x 세포면역화 후에, 햄스터는 CFA에 유화된, 정제된 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질로 증강되었다. 4주 후에, 최종 증강은 용해성 PD-L3 또는 VISTA-Ig와 함께 제공되었다. 그 후, SP2/0와 햄스터 비장세포의 융합은 4일째 수행되었다. ELISA에 의해 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합단백질을 인지하고 PD-L3 또는 VISTA로 염색이 되지만, 생쥐 T 세포주 EL4에서 과발현되는 PD-L1은 염색되지 않는, 16개의 상이한 클론이 동정되었다. 11개의 상기 클론이 성공적으로 하위클론되었고, 그들의 세포의 내생적 PD-L3 또는 VISTA를 염색하고 PD-L3 또는 VISTA 기능을 차단하는 능력을 평가하기 위해 준비되었다.
증식검사
시험관내 CD4+ T 세포 증식검사는 PD-L3 또는 VISTA mAb 활성을 스크리닝하기 위해 고안되었다. 이 검사에서, T 세포는 마이크로플레이트 (microplate) 웰에서 고정된 항-CD3에 의해 자극되었고, 이는 T 세포 수용체와 교차연결한다. 인간 IgG의 Fc 부분과 융합된 PD-L3 또는 VISTA의 세포외 도메인을 포함하는, PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질을 사용하여, PD-L3 또는 VISTA mAb의 활성을 두 개의 상이한 형태에서 탐지하였다. 첫째는, mAb를 αCD3과 공동으로 고정하였을 때, 첨가된 용해성 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합단백질이 존재하에서만, 이것은 강력하게 T 세포 증식을 억제하였다. 이러한 활성은 PD-L3 또는 VISTA-Ig의 상기 웰에 고정화된 mAb와 결합하는 능력에 의해 결정된다. 상기 검사의 이러한 형태를 사용하여, 높거나, 중간이거나 또는 낮은 억제적 활성을 가지는 클론을 동정하였다. 두번째는, mAb를 상기 검사에 용해성 시약으로서 첨가하였을 때, 이것은 T 세포 증식에서, 상기 고정화된 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질과 시너지효과에 의해 강한 억제적 활성을 보인다. 이러한 형태의 검사에서, 다양한 억제적 활성을 가지는 클론을 동정하였다.
실시예 1: PD - L3 또는 VISTA 의 클로닝 및 서열분석
PD-L3 또는 VISTA 및 Treg-sTNF는 휴지기 Treg (resting Treg), αCD3로 활성화된 Treg, αCD3/αGITR로 활성된 Treg의 글로벌 전사 프로파일 (global transcription profil)에 의해 동정되었다. Treg에 있는 GITR을 야기하는 것은 그들의 접촉-의존적 억제적 활성을 소멸시키는 것으로 보이기 때문에, αGITR이 이러한 분석을 위해 선택되었다 (상기 Shimizu, et al. (2002)). PD-L3 또는 VISTA 및 Tref-sTNF는 그들의 특별한 발현 양상을 기본으로 하여 (표 1), AFFIMETRIX® DNA 어레이 (array)에서 동정되었다. PD-L3 또는 VISTA는 αCD3 활성화된 Treg에서 증가된 발현을 나타내고, αGITR의 존재하에서 감소된 발현을 나타낸다; 및 Treg-sTNF는 αCD3/αGITR-의존적인 발현 증가를 나타낸다.
실시간 PCR 분석을 위해, 정제된 CD4+CD25+ T 세포는 배지에서 하루밤동안, 아무것도 없이, αCD3, 또는 αCD3/αGITR, 및 분리된 RNA로 자극되었다. 나열된 발현은 액틴 (actin)에 상대적인 것이다.
Figure 112012087017459-pct00001
활성화 대(vs.) 휴지기 CD25+CD4+ nTreg의 Affrmetrix 분석은 Ig 대계에 대한 서열 상동성을 갖지만, 알려지지 않은 기능의 유전자 생산물 (RIKEN cDNA 4632428N05 또는 4632428N05Rik) 발현을 나타낸다.
보다 특이적으로, 930 bp 유전자 생산물은 CD4+ T 세포 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되었고, 이는 상기 예측된 크기 및 서열과 일치한다. 실리코-서열 (silico-sequence) 및 구조분석은 성숙 후 159개의 아미노산 세포외 도메인, 22개 아미노산의 막관통 도메인 및 95개 아미노산의 세포질 꼬리를 가진, 309 아미노산의 막관통 단백질이라고 예측하였다 (도 1). 아미노산 서열 배열은 PD-L1, PD-L2, B7-H3 및 B7-H4와 같은 B7계 리간드, 뿐만 아니라 B7계 수용체 (즉, PD-1, CTLA-4, CD28, BTLA, ICOS)와 상동성을 가지는 세포외 면역글로불린 (Ig)-V 유사 도메인임을 나타낸다 (도 1b-1c). 비록 B7계 리간드 및 수용체 사이에서 상기 Ig-V 도메인의 서열 동일성은 일반적으로 매우 높지 않고 (<40%), 4632428N05Rik의 Ig-V 도메인이 B7계 리간드 PD-L1 및 PD-L2롸 가장 높은 상동성을 가진다. 또한, 서열배열은 사슬사이 이황화결합 (intra-chain disulfide bond) 형성에 중요한, 몇몇의 매우 보존된 시스테인 (cystein)을 나타내고 (도 1b), 이는 상기 B7계 리간드의 특징이다 (Sica et al., (2003) Immunity 18, 849-861).
46322428N05Rik의 세포외 도메인은 Ig-V 도메인만을 포함하지만 Ig-C 도메인이 결핍되었다 (도 1b-1c). 이러한 독특한 특징은, Ig-V 및 Ig-C 도메인을 모두 포함하는 B7계 수용체의 특징이고, 이는 4632428N05Rik을 다른 모든 B7계 리간드와 구별하게 한다 (Freeman, G. J (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 10264-10276; Lazar-Molnar et al., (2008). Proc Natl Acad Sci USA 105, 10483-10488; Lin et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 3011-3016; Schwartz et al., (2001), Nature 410, 604-608; Stamper et al., (2001), Nature 410, 608-61). 일관적으로, PhyML 알고리즘을 이용한 계통분류학벅 검사 (Phylogenetic Maximum Likelihood)는 4632428N05Rik을 진화적으로 상기 B7계 리간드보다, B7계 수용체, 특히 PD-L1에 보다 가깝게 위치시킨다 (도 2) (Guindon, S., and Gascuel, O. (2003). A simple, fast, and accurate alorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol 52, 696-704). 하지만, PD-L3 또는 VISTA의 세포질 꼬리는 B7계 수용체의 표지 도메인인 신호전달 도메인 (signaling domain) (예를 들면 ITIM, ITAM 또는 ITSM)을 포함하지 않는다 (Sharpe, A. H., and Freeman, G. J. (2002) The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol 2, 116-126). 그러므로, 상기 억제적 수용체 PD-1과 근접한 진화적 관계에도 불구하고, 4632428N05Rik은 상기 B7 리간드예의 신규한 멤버임을 나타낸다. 이러한 구조적 및 계통분류학적 특성을 기초로, 이 분자는 PD-1- 발현 리간드 (PD-L3 또는 VISTA)로 명명된다. 또한, PD-L3 또는 VISTA는 생쥐 및 인간의 이종상동체 (ortholog) 사이에서 매우 보존되어 있고, 77%의 서열 상동성을 공유한다 (도 1d).
생쥐 PD-L3 또는 VISTA를 암호화하는 핵산서열은 서열 번호: 1에서 개시되고, 상기 생쥐 PD-L3 또는 VISTA 단백질 서열은 서열 번호: 2에서 개시된다. PD-L3 또는 VISTA의 인간 상동테는 염색체 10 (72.9 Mb)에 위치하고 6개의 핵손을 포함하여, 311 잔기 단백질을 암호화하는 길이의 4689 염기의 전사체를 생성한다. 인간 상동체 mRNA 암호화 서열은 GENBANK 어세션 번호 (accession number) NM_022153에서 제공되고, 단백질 서열은 NP_071436으로 주어진다. 인간 PD-L3 또는 VISTA를 암호화하는 핵산서열은 여기에서 서열 번호: 3에서 개시되고, 상기 인간 PD-L3 또는 VISTA 단백질 서열은 서열 번호: 4에서 개시된다. 생쥐 및 인간 유전자는 74%의 상동성 (homology)을 공유하고, 단백질 수준에서 68%의 동일성 (identity)을 가진다. 또한, 상동체는 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus)의 염색체 20 (27.7 Mb; GENEBANK 어세션 넘버 BC098723) 또는 푸구 루브리페스 (Fugu rubripes) 및 다니오 리리오 (Danio reerio)에서 동정된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 PD-L3 또는 VISTA 단백질은 서열 번호: 5에서 보여지는, 일반적인 아미노산 서열을 공유한다.
실시예 2: RT - PCR 분석 및 세포유동분석에 의한 PD - L3 또는 VISTA 의 발현연구
도 3의 실험에서 보여지는 것과 같이, RT-PCR 분석은 생쥐 조직에서 PD-L3 또는 VISTA의 mRNA 발현양상을 결정하는데 사용되었다 (도 3a). PD-L3 또는 VISTA는 거의 조혈조직 (비장, 흉선, 골수) 또는 백혈구가 충분히 침투되는 조직 (즉, 폐)에서 발현한다. 또한, 약한 발현은 비조혈조직 (즉, 심장, 신장, 뇌, 및 난소)에서도 탐지된다. 몇몇의 조혈세포 종류의 분석은 복강 대식세포 (peritoneal macrohage), 비장 CD11b+ 단핵구, CD11c+ DCs, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 PD-L3 또는 VISTA의 발현을 나타내지만, B 세포에서는 낮은 발현을 나타낸다 (도 3b). 또한 이러한 발현양상은 GNK (Genomics Institute of Novartis Research Foundation)의 유전자 어레이 데이터베이스 (Su et al., (2002) Proc Natil Acad Sci USA 99, 4465-4470), 뿐만 아니라 NCBI GEO (유전자발현 오니버스) 데이터베이스와 대개 일관적이다 (도 4a-4h).
상기 단백질 발현을 연구하기 위해서, PD-L3 또는 VISTA 특이적 햄스터 8D8 및 6E7 단일클론항체를 생산하였다. 상기 특이성은 PD-L3 또는 VISTA-과발현 생쥐 EL4 T 세포에서의 양성 염색, 그러나 PD-L1-과발현 EL4 세포에서는 음성 염색에 의해 증명되었다 (도 5).
다클론 및 단일클론항체 모두는 PD-L3 또는 VISTA에 대해 만들어졌다. 토끼 항-PD-L3 또는 VISTA 항체를 사용하여, PD-L3 또는 VISTA 단백질은 림프구 기관에 위치하였고 뇌조직에서도 현저히 발견되었다. 동정된 단일클론항체로는, αPD-L3 또는 VISTA 클론 D8D의 특이성이 나아가 조사되었다. 상기 검사에서 클론 8D8은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-1, B7-2, PD-L3 또는 VISTA 및 hIg를 포함하는 PD-L 유사-Ig 융합 단백질 분자의 패널에 대한 결합을 위해 검사되었다. 상기 검사의 결과는 8D8 αPDL-3가 PD-L3 또는 VISTA에 대해 매우 특이적이라는 것을 나타낸다.
특이적으로, 항-PD-L3 또는 VISTA mAb 클론 8D8을 사용하여, PD-L3 또는 VISTA 발현을 조혈세포에서 세포유동검사에 의해 분석하였다. Foxp3GFP 녹-인 리포터 생쥐 (knock-in reporter mice)는 CD4+ nTreg를 구별하기 위해 사용되었다 (34). 말초 림프기관 (비장 및 림프절)에서, 모든 CD4+ T 세포 하위집단 (모든 CD4+ T 세포 또는 Foxp3-나이브 T 세포 및 Foxp3+ nTreg 세포 및 기억 CD4+ T 세포)에서 유의적인 발현이 관찰된 반면, CD8+ T 세포는 현저하게 낮은 표면 PD-L3 또는 VISTA 발현을 나타낸다 (도 3c). 흉선에서, PD-L3 또는 VISTA 발현은 CD4+CD8+ 이중양성 흉선세포에서 음성적이고, CD4 단일 양성세포에서 낮은 발현을 보이며, CD8 단일 양성세포에서는 탐지가능한 발현을 보인다. 그 다음으로, 높은 PD-L3 또는 VISTA 발현과 CD11b 마커의 강한 연관성은 F4/80 대식세포 및 골수성 CD11c+ Dcs를 포함한, 비장 및 복강세포 모두에서 보인다 (도 3d-3e). 다른 한편, B 세포 및 NK 세포는 대개 PD-L3 또는 VISTA 발현에 대해 음성적이다. Gr-1+ 과립구의 적은 비율은 또한 PD-L3 또는 VISTA를 발현한다 (도 3f).
상이한 발현양상은 상이한 림프기관으로부터의 동일한 세포계보 (cell lineageg)에서 보여진다 (도 3g). CD4+ T 세포 및 CD11b 중간 단핵구에 대해, 상기 발현수준은 장간막 림프절 (mesenteric lymph node) > 말포 림프절 및 비장 > 복강 및 혈액의 양상을 따른다. 이러한 양상은 CD11bhi 세포에서는 덜 명확하다. 이러한 데이터는 특정 세포 종류에서의 PD-L3 또는 VISTA 발현이 세포 성숙 및/또는 조직미세환경에 의해 조절될 수 있다를 것을 제시한다.
신선하게 분리된 세포 뿐만 아니라, PD-L3 또는 VISTA 발현은 시험관내 배지에서 활성화된 및 활성화없이, 비장 CD4+ T 세포, CD11bhi 단핵구 및 CD11c+ DCs에서도 분석되었다 (도 6). 비장세포는 배지와 배양되었거나, 또는 항-CD3 (T 세포 활성화를 위한)와 함께, 또는 IFN□ 및 LPS (단백구 및 DCs의 활성화를 위한)와 함께 24시간동안 배양된 후, PD-L3 또는 VISTA 및 다른 B7계 리간드 (예를 들면, PD-L1, PD-L2, B7-H3 및 B7-H4)의 발현에 대해 분석되었다. 이러한 비교는 상기 분자사이에서 구별된 발현양상을 나타내었다. 활성화 상태와 무관하게, 시험관내 배지에 있어서 모든 세포에서 PD-L3 또는 VISTA 발현은 빠르게 결실되었다. 반대로, PD-L1 발현은 자극 후에, CD4+ T 세포 또는 CD11bhi 단핵구, 및 배지 단독에서 배양되는 CD11c+ DCs에서 상향조절되었고, 나아가 자극될 때 증진되었다. PD-L2, B7-H3 및 B7-H4의 발현은 사용된 배양조건에서 현저하지 않았다. 시험관 내에서 상기 PD-L3 또는 VISTA 발현의 결실은 다른 B7계 리간드와 비교할 때 특별하지만, 조직 미세환경을 모방하는 것을 실패한 최적화되지 않은 배양조건을 반영하는 것일 수도 있다.
생체내에서 어떻게 PD-L3 또는 VISTA의 발현이 조절되는지 알아보기 위해서, CD4 TCR 형질도입 생쥐 DO11.10을 완전 프로이트항원보강제 (complete Freund's adjuvant; CFA)에 유화된 연계항원 닭 오브알부민 (OVA)로 면역화하였다. 면역화 24시간 후에, 배수 림프절로부터의 세포를 PD-L3 또는 VISTA 발현에 대해 조사하였다 (도 7a). 보강제 없이 항원 (CFA/OVA) 만을 사용한 면역화는 CD11b+ PD-L3 또는 VISTA+ 골수성 세포집단을 극적으로 증가시켰고, 이것은 F4/80 대식세포 및 CD11c+ DCs의 혼합된 집단을 포함하였다. 나아가, PD-L1 및 PD-L2와의 비교는 PD-L1이 가장 높은, 항상 발현하는 수준을 가지고 있어도, 상기 염증면역반응 동안에는 PD-L3 또는 VISTA가 가장 높게 상향조절되었다 (도 7b). 결론적으로, 이러한 데이터는 골수성 APCs에서의 PD-L3 또는 VISTA 발현은 면역체계에 의해 매우 조절된다는 것을 강력하게 제시하고, 면역반응을 조절하고 T 세포 면역을 조절하는데 그것의 역할에 공헌한다.
APCs에서 그것의 증가된 발현과 대조적으로, PD-L3 또는 VISTA 발현은 면역화된 나중의 시간대에서 (즉, 24시간이 아닌 48시간에서) 활성화된 DO11.10 CD4+ T 세포에서 감소된다. 이러한 결과는 생체내에서 CD4 T 세포에서의 PD-L3 또는 VISTA 발현이 그것의 활성화 상태 및 활성 면역반응 동안의 사이토카인 미세환경에 의해 조절된다는 것을 제시한다.
실시예 3: CD4 + 및 CD8 + T 세포반응에서의 PD - L3 또는 VISTA 신호전달의 기능적 영향
PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질은 CD4+ T 세포 반응에서 PD-L3 또는 VISTA의 조절적 역할을 조사하기 위해 생산되었다. 상기 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질은 인간 IgG1 Fc 부위와 융합된 PD-L3 또는 VISTA의 세포외 도메인을 포함한다. 마이크로플레이트에 고정화되었을 때, 정지된 세포분열에 의해 결정된 것과 같이, 대조군 Ig는 아닌, PD-L3 또는 VISTA-Ig는 플레이트 결합된 항-CD3 자극에 대한 거대 정제된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 억제한다 (도 9a-9b). 상기 PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질은 ELISA에 의해 결정된 것과 같이 (데이터는 보여지지 않음), 상기 플라스틱 웰로 항-CD3 항체의 흡수에 영향을 주지 않고, 따라서 비특이적 억제적 효과의 가능성을 배제한다. PD-1 KO CD4+ T 세포 또한 억제되었고 (도 9c), 이는 PD-1은 PD-L3 또는 VISTA에 대한 수용체가 아니라는 것을 나타낸다. PD-L1-Ig 및 PD-L3 또는 VISTA-Ig의 억제적 효과 또한 직접적으로 비교되었다 (도 10). CD4+ T 세포를 자극하기 위해, □CD3과 함께 Ig 융합 단백질의 적정량이 상기 마이크로플레이트로 흡수되었을 때, PD-L3 또는 VISTA-Ig는 PD-L1-Ig 융합 단백질과 유사한 억제적 효과를 보인다.
거대 정제된 CD4+ T 세포가 다양한 하위집단을 가지고 있기 때문에, 분류된 나이브 (CD25-CD44lowCD62Lhi) 및 기억 (CD25-CD44hiCD62Llow) CD4+ T 세포 하위 집단에서의 PD-L3 또는 VISTA-Ig의 영향이 조사되었다 (도 11). 이것은 기억세포에서 보다 덜 효과적이지만, PD-L3 또는 VISTA가 두 하위 집단 모두의 증식을 억제할 수 있다는 것을 보인다.
PD-L3 또는 VISTA-매개 억제의 기전을 더 이해하기 위해서, 초기 TCR 활성화 및 세포자멸사 (apoptosis)마커의 발현을, PD-L3 또는 VISTA-Ig의 존재 또는 부재하에서 T 세포의 활성화 후 측정하였다. 세포증식에서의 음성적 효과와 일관적으로 초기 활성화 마커, CD69, CD44 및 CD62L (보조적 도 12a)의 발현에서 글로벌 억제가 있었다. 반면에, PD-L3 또는 VISTA-Ig 융합 단백질은 세포자멸사를 유도하지 않았다. 반대로, TCR 활성화의 초기 (24시간) 및 후단계 (48시간) 모두에서, 대조군-Ig보다 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig의 존재하에서 적은 세포자멸사 (아넥신 V+ 7AAD- 세포의 백분율에 의해 결정된)는 보여졌다 (도 12b). 예를 들면, 24시간대에서, 총 "게이트되지 않은 (ungated)" 집단에서 ~27% 세포는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig의 존재하에서 세포자멸사였으나, 대조군 세포는 ~39%가 세포자멸사였다. 살아있는 세포 R1 게이트내에서 상기 세포를 조사할 때, PD-L3 또는 VISTA 및 VISTA-Ig를 처리하였을 때 약 72.6% 대조군 세포가 세포자멸사인 반면, 43.5% 세포만이 세포자멸사였기 때문에 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig는 강력하게 활성화-유도-세포사멸 (ACID)를 억제한 것이 명확하다. 유사하나 결과가 48시간대에서도 보여졌다. 그러므로, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA가 초기 TCR 활성화를 억제하고 세포분열을 정지시킴으로써, 그러나 세포자멸사에는 최소한의 직접적 효과와 함께 음성적으로 CD4+ T 세포 반응을 조절한다는 것이 나타났다. 억제의 상기 기작은 B7-H4의 것과 유사하다 (Sica, G.L., Choi, I.H., Zhu, G., Tamada, K., Wang, S.D., Tamura, H., Chapoval, A.I., Files, D.B., Bajorath, J., and Chen, L. (2003). B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity. Immunity 18, 849-861).
2-단계 검사는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig가 전활성화 CD4+ T 세포를 억제할 수 있는지 결정하기 위해, 및 어떻게 그것의 억제적 효과가 지속되는지 결정하기 위해 개발되었다. PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig 융합 단백질의 억제적 효과는 활성화 24시간 후에 그것의 제거 후까지 지속된다는 것을 보였다 (도 9d). 또한, 나이브 및 전활성화 CD4+ T 세포 모두는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig에 의해 억제될 수 있다 (도 9d의 i, 도 9d의 iii 및 도 9d의 iv).
다음으로, CD4+ T 세포의 사이토카인 생산에 있어서, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig의 효과를 분석하였다. PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig는 거대 정제된CD4+ T 세포의 배양으로부터 Th1 사이토카인 IL-2 및 IFN알파의 생산을 억제하였다 (도 13A-13B). PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig의 영향은 나아가 분리된 나이브 (CD25-CD44lowCD62Lhi) 및 기억 (CD25-CD44hiCD62Llow) CD4+ T 세포집단에서 검사되었다. 기억 CD4+ T 세포는 CD4+ T 세포 부분내에서 사이토카인의 생산을 위한 주요한 원천이고, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA는 이러한 생산을 억제할 수 있다 (도 13C-13D). CD8+ T 세포로부터의 IFN알파의 생산에 있어서, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 유사한 억제적 효과 또한 보였다 (도 13E). CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생산에서의 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 억제적 효과는, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA가 면역반응을 하향조절하는 억제적 리간드라는 가설과 일관성이 있다.
다음으로, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 억제적 효과를 극복할 수 있는 요소를 결정하기 위한 연구가 고안되었다. PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA는 IL-2 생산을 억제하고 IL-2는 T 세포 생존 및 증식에 중요한 것을 생각할 때, IL-2는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 억제적 활성을 우회할 수 있다는 가정을 세울 수 있다. 도 14a에서 보여진 것과 같이, IL-15, IL-7 또는 IL-23과는 다르게, 외생적 IL-2는 세포증식에서 부분적으로 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig의 억제적 효과를 역전시킨다. IL-2의 높은 수준에의한 불완전한 극복은 PD-L3 또는 VISTA의 신호전달이 단순하게 IL-2 생산 보다 넓은 T 세포 활성화 경로를 표적화한다. 반면에, 항-CD28 작용제적 항체에 의해 제공된 강력한 공동자극 신호는 완벽하게 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig 매개 억제를 역전시키는 반면 (도 14b), 공동자극의 중간수준은 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 신호전달에 의해 억제된다 (도 14c). 이러한 결과는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-매개 면역억제는 낮은 염증성 질병하에 보다 효과적일 수 있지만, 불가피하게 강력한 양성 공동자극에 의해 압도될 것임을 제시한다. 여기에서, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA는 PD-L1 및 B7-H4와 같은 다른 억제적 B7계 리간드와 이러한 특징을 공유한다 (Sica et al., (2003) Immunity 18, 849-861.; Carter et al., (2002), Eur J Immunol 32, 634-643).
PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-Ig 융합 단백질 뿐만 아니라, APCs에 발현되는 APCs 및 T 세포 사이에서의 연계적 상호작용 동안에 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA가 항원-특이적 T 세포 활성화를 억제할 수 있는지 확인하는 것은 필요하다. 이러한 목적을 위해, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-RFP 또는 RFP 대조군 단백질을 MHCII 및 B7-2 분자를 안정적으로 발현하는, 인공적인 항원제시세포주 (CHO-APC)에 레트로바이러스 형질도입을 통해서 과발현시켰다 (Latchman et al., (2001), Natu Immunol 2, 261-268). CHO에서 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA를 발현하는데 한가지 문제점은 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 대다수가 세포표면에 위치하는 것을 실패한다는 것이고, 이는 아마도 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 표면 위치화를 지지하는 것이 결여된 외부 환경때문일 것이다 (데이터는 보여지지 않음). 비록 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 세포질 꼬리에 존재하는, 조절의 작용을 나타낼만한 뚜렷한 모티프는 없지만, 상기 꼬리가 그것의 세포내 위치화에서 중요한 역할을 할 것이라고 생가한다. 결과적으로 꼬리가 없는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 돌연변이가 고안되었고, CHO 세포표면에 성공적으로 위치화하는 것이 발견되었다.
T 세포 반응을 자극하기 위해서, CHO-PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 또는 CHO-RFP 세포를 항원성 OVA 펩티드의 존재하에서 DO11.10 CD4+ T 세포와 함께 배양하였다. 도 15a-15c에서 보여진 것과 같이, CHO-PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA는 CHO-RFP 세포보다 낮은 DO11.10의 증식을 유도하였다. 보다 강한 자극성 신호가 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 억제적 영향을 극복할 수 있는 사실과 일관성있게, 이러한 억제적 효과는 낮은 펩티드 농도에서 보다 명확하였다.
또한, 자연적 APCs에서의 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 전장 (full-length)의 억제적 효과를 확인하였다. 시험관내 배양된 골수유래 수지상세포 (BMDC)는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 높은 수준을 발현하지 않는다 (도 16). 10일 배양기간 동안에, 레트로바이러스 형질도입에 의해 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA-RFP 또는 RFP는 BMDCs에서 발현되었다. 형질도입된 세포는 RFP 발현에 기초한 동종성 (homogenecity)에 대해 분류되었다. 형질도입된 DCs에서 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 발현수준은 항-PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA mAb를 사용하여 염색함으로써 측정되었고, 생리학적 발현 범위내에서 신선하게 분리된 복강 대식세포에서의 수준과 유사하게 발견되었다 (도 16). 그 후, 분류된 BMDCs는 OVA 펩티드의 존재하에서 OVA-특이적 형질도입 CD4+ T 세포 (OTII)를 자극시키기 위해 사용되었다 (도 15d). 거기에서, BMDCs에서의 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 발현은 연계 CD4+ T 세포 증식적 반응을 억제하는 것이 보여졌다. 상기 결과는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA -Ig 융합 단백질 및 CHO-APC 세포를 사용한 이전의 데이터와 일관성이 있고, 이것은 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA가 T 세포-매개 면역반응을 억제할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 4: 다발성 경화증 동물모델 ( EAE )에서의 항- PD - L3 또는 VISTA 또는 VISTA 항체의 평가
생체내에서 □PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA mAbs는 T 세포 반응을 억제하는 것으로 보이기 때문에, 이것이 T 세포-매개 자가면역을 억제할 수 있는지 평가하기 위해서 □PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA가 검사되었다. 실험적 알러지 뇌척수염 (experimental allergic encephalomyelitis; EAE) 모델을 사용하여, 염증성 질환에서의 PDL-L3 mAbs의 기능적 영향을 결정하였다. EAE는 보강제에서 미엘린 항원 (myelin antigen)를 사용한 면역화 또는 미엘린-특이적 T 세포의 입양전달 (adoptive transfer)에 의해 유도될 수 있고, 이것은 다양한 작용적 T 세포 및 B 세포, 및 대식세포의 염증성 침입 및 중추신경계의 탈미엘린화(demyelination)을 초래한다.
외부항원으로서 mAb의 많은 양을 주입때문에 일어나는 아나필락시스 (anaphylaxis)를 피하기 위하여, αPDL-L3 mAb는 상기 수동적 EAE 모델에서 검사되었다. 이러한 입양전달 EAE 모델에서, 공여자 SJL 생쥐는 CFA 및 PLP 펩티드로 면역화되었다. 10번째 날, 배수 림프절으로부터의 총 림프구는 분리되었고, PLP 펩티드, IL-23 (20ng/ml) 및 항-IFNg (10μg/ml)와 함께 시험관내에서 4일 동안 배양되었다. 팽창된 CD4+ T 세포는 그 후 정제되었고 나이브 수여자 생쥐 (naive recipient mice)로 입양전달되었다. 이러한 분석은 αPDL-L3 mAb가 질환의 개시를 지연시켰을 뿐만 아니라, 질병의 심각도를 감소시킴으로써 질병의 경과 곡선을 유의적으로 이동시켰다는 것을 의미한다 (도 17). 또한, 그것은 상기 생쥐의 높은 비율에서 심각도를 감소시켰고, 약 22%에서 75%이상으로 생존률을 크게 증가시켰다. EAE에서 αPDL-L3 mAb의 활성은 상기 시험관내 데이터와 일관성이 있다는 것을 나타내고, 다양한 염증성 질환에서 신규한 염증조절시약으로서 상기 시약의 용도를 나타내었다.
실시예 5: CNS 에서의 VISTA 의 발현
CNS에서 VISTA의 발현 또한 효과가 있었다. 상기 검사는 질환을 가진 생쥐에서 VISTA 발현이 CD11b+ 세포를 현저히 감소시켰다는 (76% ⇒ 33%) 것을 보이며 (도 23), 이것은 VISTA의 결실은 증가된 염증을 나타낼 것이라는 가설과 일관성이 있다. 이것은 흥미롭고, 및 VISTA를 매우 높은 수준으로 발현하는 종양에서의 MDSC와 함게 염증성 골수성 세포와 대조하였을 때, 기능적으로 중요하다. EAE 생쥐는 비장에서, T 세포 활성화를 강력하게 억제하는, 골수성 유래 억세성 세포 (CD11b+Ly-6Chigh MDSC)의 증가된 수를 가지고 있고 질환32를 완화시킬수 있다는 것이 보고되었다. 데이터는 VISTA가 EAE에서의 골수성-매개 억제에서 기능을 할 수 있다는 것을 강력하게 지지한다.
실시예 6: EAE 에서의 T 세포의 운명 및 기능에 대한 VISTA 의 영향
또한, EAE에서 T 세포의 운명과 기능에 대한 VISTA의 효과를 검사하는 실험을 수행하였다. VISTA가 병원성, 뇌척수염성 T 세포의 발달, 클론 T 세포의 팽창, T 세포의 극성 (polarity), 수명 및 Teff ⇒ Treg의 전환을 변화시키는지 측정하였다. EAE에서의 T 세포 운명에 대한 VISTA의 차단 효과를 연구하였다. 보다 높은 질환 점수와 일관성 있게, 질환 과정 말기에서의 CNS 분석은 13F3 (VISTA) 처리군에서 유의적으로 보다 많은 IL-17A-생산 CD4+ T 세포 침투 (0.66 ⇒ 11%)를 확인하였다 (도 24).
실시예 7: PD - L3 또는 VISTA 또는 VISTA 형질도입 ( transgenic ) 및 녹아웃 (knock-out) 생쥐
배아의 렌티바이러스 감염을 사용하여, 항상 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 를 발현하는 4개의 형질도입 생쥐가 생산되었다. 상기 생쥐는 인간연장인자 1 (human elongation factor 1) 프로모터의 조절하에서 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA의 전장을 발현한다. 상기 생쥐는 렌티바이러스 pWPT 벡터를 사용하여 생산되었다. 다른 PD-L1계 멤버와 유사하게 (Appay, et al. (2002) J. Immunol. 168:5954-8), PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA는 시험관내에서 αCD3 T 세포 증식을 공동자극 시키는 기능을 하는 반면, 생체내에서 음성 조절자로서 역할을 할 것이라고 고려된다. 이러한 점에서, 상기 생쥐는 자발적으로 자가면역을 발달시키는 것으로 기대되고, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 형질도입 생쥐에서 생체내 면역반응 [즉, 체액성 면역반응, T 세포 프라이밍 (priming)]은 전신적 자가면역 질환발달을 평가하기 위해 조사되었다.
녹아웃 생쥐에 대해서, 자발적으로 자가면역 및는 상동성 재조합에 의해 비활성화된다. PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 전장 서열을 포함한 BAC 클론은 INVITROGENTM (Carlsbad, CA)로부터 구입되었다. PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 표적 벡터는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 유전자의 두번째 엑손의 5' 쪽에 위치한 1.6 kb 단편을 네오마이신 (neomycin) 유전자 위에, PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 유전자의 세번째 엑손의 3' 쪽에 위치한 5kb를 상기 네오마이신 유전자 아래에 삽임함으로써 생산되었다. B6-유래 배아줄기 (ES)세포는 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 표적벡터를 사용하여 전자침공되었고, 재조합 클론이 선별되었다. 그 후, 선별된 클론은 C5BL/6 미분화세포 (blastocyte)로 주입되었고, 상기 결과적인 키메라 수컷 자손은 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP-제거자(deleter) 생쥐와 짝지어졌다. 상기 자손의 표적화된 대립유전자의 전달은 유전체 DNA로부터의 PCR에 의해 결정되었다. 상기 두번째 및 세번째 엑손은 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 도메인을 포함하고 있고, 따라서 상기 결과의 생쥐는 오직 PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 분자의 비활성화된 형태를 가진다.
PD-L3 또는 VISTA 또는 VISTA 결여된 생쥐의 전체적인 면역능력은 항원에 대한 T 세포 반응의 측정, 체액성 면역반응, 외적 자가면역 (예를 들면, 전신성 홍반성루푸스, 염증성 장질환) 및 자가면역질환 (실험적 자가면역 뇌척수염)에 대한 증가된 민감성 (susceptibility)을 포함하여, 다른 PD-L-/- 생쥐와 함께 결정된다 (상기 Chen (2004)).
실시예 8: 콜라겐-유도 관절염 동물모델에서 검사된 PD - L3 또는 VISTA 또는 VISTA 특이적 항체
도 18에서의 실험에서 보여진 것과 같이, 수컷 DBA/1J 생쥐는 CFA에서 100μg 닭 종류-II 콜라겐 (C-II) (결핵균 3.5mg/ml)을 포함하는 유화액의 100μl로 그들의 꼬리의 하단 (base)에서 면역화되었고, 100μg 수용성 C-II로 면역화 후 21일째 IP 증강하였다. 각 처리군 (n=6)의 생쥐는 제시된 것과 같이, 처리되지 않았거나 (NT-검정색 원), 단일클론항체 "7c9"의 300μg (붉은색 삼각형) 또는 300μg 햄스터 IgG (Ham Ig-검정색 사각형) EH는 "13F3" (녹색 삼각형) 중 하나로 처리되었다. 주입은 2일마다 주어졌다. 관절의 붓기 (swelling)는 제시된 날에서 각 생쥐의 각각의 발에 대해 0-4의 크기로 점수가 매겨졌다. 상기 보여진 관절염 점수는 상기 군의 생쥐의 수에 의해 나누어진 각 처리군 생쥐의 모든 발의 점수이다.
실시예 9: VISTA 단일클론항체에 의한 VISTA 차단은 시험관에서 T 세포 반응을 증진시킨다.
VISTA-특이적 mAb (13F3)은 VISTA-매개억제를 중화시키는 것으로 동정되었다 (도 19). 13F3의 존재 또는 부재하에서 OT-II 형질도입 CD4+ T 세포를 자극시키기 위해, CD11bhi 골수성 APCs는 나이브 생쥐로부터 정제되었다. 그것의 중화효과와 일관성있게, 13F3은 VISTA가 높은 수준으로 발현하는 것으로 보여진, CD11bhi 골수성세포에 의해 자극받은 T 세포 증식을 증진시켰다.
실시예 10: 항- VISTA 는 항-종양 면역을 증진시킨다.
항-VISTA의 T 세포 활성화를 증진시키는 능력 때문에, 항-VISTA가 면역원성 종양에 대해 보호적 면역반응을 증진시키는지 조사하였다. 가지고 있는 좋은 경험의 모델은 방광암 (bladder carcinoma), MB49이다. MB49는 수컷 항원을 발현하고, 따라서 중간의 면역원성이 암컷에서 있어서 면역적 중재가 없으면 그것은 자라서 암컷을 죽인다. □VISTA 치료의 효과성을 검사하기 위해, 암컷 생쥐에 MB49 종양세포를 피하로 주입시켰고 (sq), □VISTA로 처리하였다. 상기 생쥐가 안락사되어야할 때까지, 매일 상기 종양의 크기를 특정하였다. 도 20에서 쉽게 볼 수 있는 것과 같이, 항-VISTA 치료는 종양성장을 매우 손상시킨다. 이것이 항-VISTA의 세포-매개 면역 (CMI) 반응을 강화시키는 능력 때문이라고 믿는다.
실시예 11: 4 생쥐 종양모델에서의 종양완화 ( tumor regression )에 대한 VISTA의 효과
면역원성 방광암 MB49의 실험에서, mAb 13F3을 사용한 VISTA의 중화가 숙주를 종양의 성장으로부터 보호한다는 것을 보았다. 상기 데이터는 종양의 미세환경에서 VISTA가, MDSC에서 그것의 매우 높은 발현때문에 상당한 음성 면역조절 역할을 한다는 것을 가리킨다. 면역원성 (MB49) 및 매우 비-면역원성인 (B16) 종양모델에서 항-생쥐 VISTA의 효과를 조사한 연구는 나아가 αVISTA 치료의 효과가 작용기전을 밝히고 최적의 용량 및 시간대의 선택에 대한 기초를 제공하는 것을 확인하였다. 각각의 종양모델에 대한 근거는 하기와 같다.
암컷 생쥐에서의 MB49: 이미 이러한 생쥐모델에서 효과성을 보였다. 이 모델에서 MDSC 또한 상승된 수준의 VISTA를 발현한다 (데이터는 보여지지 않음). 이 모델에서, H-Y 항원의 존재 때문에, 상기 MB49 종양은 중간적으로 면역원성을 가진다. 항-VISTA 치료가 효과적인 것을 알기 때문에, 항-VISTA 치료의 용량 (1-100 μg/생쥐); 및 시간대 (종양 투여의 날, 또는 종양의 4, 7, 10번째 날, 치료적 중재)]를 결정하기 위해 이 모델을 "양성" 대조군으로 사용할 것이다.
Figure 112012087017459-pct00002
수컷 생쥐에서의 MB49: 암컷 생쥐에서 효과적인 용량 및 시간대를 사용하여, 수컷 생쥐에서의 (종양이 덜 면역성인) 항-VISTA의 효과성을 결정하였다.
B16 흑색종: 항-CTLA-4 mAb는 이 모델에서 매우 효과적인 것으로 보였고, 상기생쥐모델이 인간에서 성공을 예측하는데 가치있는 곳에서 비면역원성 종양을 나타냈다. 용량 용법 및 시간대는 MB49 모델에서 효과적인 것으로 보여진 것과 유사할 것이다.
ID8 난소암: 이 모델에서, VISTA 발현은 극적으로 MDSCs에서 높은 것으로 보여졌다. ID8 종양을 가지고 있는 생쥐를 종양 주입의 시간에서, 또는 주입후 5, 15, 25째 날에 αVISTA로 처리하였다.
방법. B6 WT 생쥐를 상기된 모든 생쥐종양모델의 완화를 위해 항-VISTA 처리의 최적 용량 및 시간대를 결정하기 위해 사용하였다. 사용된 상기 모델은 상기 표에 열거되어 있다.
이러한 용량 및 시간대 검사에 대한 해독틀 (readout)은 종양성장 동역학 (kinetics)이다. MB49 및B16 연구에 대해서, 모든 종양 연구는 피내 (intradermal; i.d.) 주입을 통해 수행되었고 그러므로 종양크기는 쉽게 측정될 수 있다. 종양측정은 캘리퍼 (caliper)를 사용하여 매 2-3일마다 수거되었다. 상기 모델의 각각에서, 항-VISTA 또는 대조군 항체의 영향은 종양성장을 천천히 하거나 또는 종양완화를 촉진하는 그것의 능력에 대해 검사될 것이다. ID8의 성장은 루시퍼라아제 (luciferase) 형질도입된 ID8을 사용하여 따르고, IVIS Workstation을 사용하여 몸 전체를 이미지화 할 것이다. 또한, 숙주의 생존도 결정될 것이다.
종양성장에서의 데이터는 평균 종양 부피 ± SEM로서 표시되고, 군 사이에서의 상이성은 2중-꼬리 AVONA (two-tailed ANOVA)에 의해 분석될 것이다. 0.05이하의 가능성 (p) 수치는 통계적으로 유의하다. 생존 데이터는 군 사이에서의 생존의 상이성의 유의성을 확인하는데 사용되는 웰콕손 (Wilcoxon) 랭크 및 로그 (log)-랭크와 함께 Kaplan-Meier를 사용하여 분석되었다. B16 모델에서, 백반 (vitiligo)를 발달시키는 생쥐의 빈도가 결정된다.
상기 방법을 사용하여, 생쥐에서의 늦어진 종양성장 및/또는 종양완화는 몇몇의 비면역원성 종양 모델에서 대조군 Ab를 처리한 생쥐와 비교하여 수득되었다. 항-VISTA 처리는 면역원성 종양 모델에서 종양의 성장을 지연시킨다는 것은 이미 보여졌다. 상기 종양모델 각각은 그들 자신만의 특이적 성장 동역학을 가지고 있고, 종양성장을 제공하고 면역을 억제하기 위해 VISTA에 대한 의존성을 예측하기 때문에, 생쥐에 종양 투여의 시간에 또는 그 후 시간에, mAb를 투여할 것이다. 또한, VISTA mAb의 최소 3개의 상이한 농도를 치료적 이익을 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 검사할 것이다.
도 21a-21e에서 보여진 것과 같이, VISTA mAb 처리는 상기 4개의 종양모델에서 종양성장을 감소시키고, 여기에서 생쥐는 a. MB49, b. MCA105, 또는 c. EG7 종양세포로 피하(sq)로, 또는 d. ID-8-루시퍼라아제 종양세포를 복강내(ip)로 주입되었고, +1 째 날에 시작하여 격일로 (300μg) VISTA mAb 13F3 으로 처리되었다. 피하 종양성장이 모니터되었다. ID8-루시퍼라아제 종양에 대해, 생쥐는 Xenogen IVIS를 사용하여 30번 째 날 이미지화 되었다. e. 종양을 가지는 생쥐의 골수성 백혈구에서의 VISTA 발현 또한 결정되었다. 배수 림프절 (LN) 및 종양 조직 (복수)는 VISTA 발현을 위해서 분석되었다. 상기 발견은 보호적 항-종양 면역의 발달을 방해하는 MDSC에서 발현한 VISTA가 주요 억제적 분자임을 나타내고, VISTA는 이러한 억제적 활성을 완화하여 면역중재를 허용하고 종양의 성장을 천천히 한다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 발견은 자가면역질환에서 골수성 세포에서의 VISTA는 염증의 정도를 조절하는 필수적 기능을 한다는 결론을 지지한다.
실시예 12: 자가면역질환의 치료에 대한 올리고머 VISTA 및 VISTA 융합 단백질의 합성
시험관내 용해성 VISTA-Ig는 억제적이지도 않고, 쉽게 탐지되는 세포와 결합할 수도 없다. 대조적으로, 플라스틱에 결합된 상기 분자는 매우 억제적이다. 또한, 생체내 VISTA-Ig를 사용한 연구는 명백한 활성을 나타내지 않는다 (데이터는 보여지지않음). 이러한 연구에 대하여, 만들어진 VISTA-Ig는 FcR 결합을 방해하는 CH2-CH3 도메인에 돌연변이를 가지고, 그러므로 생체내에서 세포질친화성이 없다. 최근 연구는 PD-1과 4합체 PD-L1 결합이 단량체 PD-L126보다 100배 높다는 것(Kd 6x10-8 M) 및 세포와의 결합이 쉽게 탐지가능하다는 것을 보였다. 4합체 PD-L1은 생체내에서 검사될 수 있지만, 시험관내에서 본래의 (native) PD-L1에 의한 기능적 억제를 차단하는 것으로 보여진다. 유사한 방법을 사용하여, VISTA 경로를 표적으로 하고 시험관내 및 생체내에서 강력한 면역억제성 활성을 유도하는 올리고머 (oligomer)가 만들어진다.
상기 올리고머는 VISTA 또는 그것의 단편, 예를 들면 최소 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200 아미노산의 길이의 단량체 세포외 도메인을 사용하여 제작되었고, 그 세포외 도메인 또는 그것의 부분은 올리고머의 빌딩블록 (building block)으로서 사용된다. 이러한 방법에서, 본 발명은 잘-수립된 MHC 4합체 기술의 이점을 가진다. 이러한 방법에서, 상기 VISTA 엑토도메인(ectodomain) 구조 또는 단편은 4가 내지 7가를 포함하는 수가 (valency)를 가지는 VISTA 복합체의 시리즈를 생상하기 위하여, 다양한 도메인 올리고머화 (상기 동정된)의 N-말단과 연결된다.
그러므로, 비공유 올리고머의 시리즈는 2합체, 3합체, 4합체, 5합체 및 7합체 모임의 안정적 형성을 돕는, 매우 높은 친화성 또꼬인-코일 (coiled-coil) 도메인에 기초하여 만들어질 수 있다. 상기 올리고머 구조는 숙주세포, 예를 들면 E.coli에서 발현된다. 발현이 E.coli에서 효과적일 때, 상기 발현된 올리고머는 재접힘이 있고, 일반적인 실헙실 프로토콜을 사용하여 봉입체 (inclusion body)로부터 정제된다. 상기 접근은 생물학적 및 구조적 분석을 위해, MHC-펩티드 복팜체 및 4합체 GITL66을 포함하여, 일반적으로 높은 질의 물질을 생산해왔다. 그 후, 상기 분리된 올리고머 단백질은 SDS-PAGE, 분석적 겔 여과 (gel filtration), 분석적 초원심분리 (ultracentrifugation) 및 질량분석기 (mass spectrometry)에 의해 검사되었다. 상기 질 조절 측정은 시험관내 및 실험관 연구에 대한 동종성의 잘-특징화된 물질의 이용가능성을 확실히 한다. 상기 구조물의 평행적인 구조는, 각각의 VISTA 복합체가 세포표면에 결합된 VISTA 수용체와 생산적으로 상호결합을 하게 되기 때문에, 그 수가가 올리고머 상태와 동일한 분자를 야기한다. 상기 구조물은 올리고머 상태에서 매우 안정하고 균일하다. (비공유 또꼬인 코일 올리고머화 도에인은 녹는검이 95℃를 나타내는 7합체 서열을 제외하고, 일반적으로 100℃를 초과하는 녹는점을 나타낸다.
2합체 뿐만 아니라, VISTA-Ig는 세포질친화 또는 세포질비친화인 4합체가 된다. IgG1 Fc (야생형 IgG1 및 기존의 비Fc결합 IgG1 모두)를 가지는 인프레임 (inframe)의 VISTA의 Fc 융합 구조물은 효소적 바이오틴화 (biotinylation)을 위한 N-말단 BirA 부위에서 변형하였고, pIRES2-EGFP 벡터로 클론하였다. 효소적 바이오틴화는 특이적, 단일 잔기 변형 및 아비딘 (avidin)의 다합체화에 대한 방향을 허용한다. 이러한 접근은 B7-1, PD-L1, PD-L2 및 TIM-3을 포함하는 다양한 Ig-융합 단백질을 생산하기 위해 사용되어왔다. 그 후 상기 발현된 단백질은 시험관내에서 효소적으로 바이오틴화되었고, 크기배제 (size exclusion) HPLC에 의해 정제되고, PE-아비딘을 이용하여 4합체화된다. 세포질친화적거나 또는 아닌, 상기 결과의 4합체는 생체내에서 측정된다.
이러한 조작된 다합체 VISTA 단백질은 자가면역 및 다른 질병을 치료하는데 유용하고, 여기에서 VISTA 경로에서의 중재 및 면역억제는 치료적으로 보장된다.
실시예 13: 면역억제를 유도하기 위한 VISTA 아데노바이러스 벡터 (adenoviral vector )
재조합 아데노-연관 바이러스 (adeno-associated virus; AAV)를 사용한 유전자 이식은 유전자치료에서의 큰 기술적 발달을 보여왔다. PD-L1 유전자, 또는 CTLA4-Ig 및CD30-Ig의 AAV-매개 유전자 전달은 루푸스 및 심장이식의 자가면역질환 모델에서 치료적 효과성을 성취하였다. 상기 방법은 VISTA의 전장, 또는 VISTA 엑토도메인의 올리고머 중 하나를 전달하는데 사용되고, 그들의 치료적 효과는 EAE 모델에서 측정된다. VISTA의 전장, 또는 VISTA 엑토도메인의올리고머 중 하나를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 제조사의 지시에 따른 Adeno-XTM 발현 시스템 (Clontech)을 사용하여 만들어졌다. 간략하게, VISTA는 인간 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터하에서, E1 및 E3-결실, pAdDEST-기초 발현 벡터로 클론되었다. 그 후, VISTA 및 대조군 lacZ 발현 아데노바이러스는 세포 용해물로부터 정제되었다. 면역화를 통한 질병의 유도 전에 또는 직후에, 또는 질병의 개시 이후에, VISTA의 전신적 과발현을 위해 아데노바이러스를 꼬리 정맥내 주입에 의해 생쥐로 투여되었다 [1x109 플라크-형서 유닛 (pfu)]. 상기 대조군 생쥐는 100μl PBS를 받았다. 질환발달 및 변화는 SJL 생쥐 및 C57BL/6 생쥐에서 모니터되었고, 이것은 상이한 질병진행양상을 나타내며, 인간 MS환자의 임상적 징후의 두가지 상이한 형태를 나타낸다.
실시예 14: 조작된 단백질 및 아데노바이러스 벡터를 이용한 기능적 연구
또한, 생쥐는 조작된 VISTA 및/또는 아데노바이러스 벡터로 투여되었다 (5-100 μg 단백질/생쥐 x 3주). 투여후, T 세포 팽창, 분화 뿐만 아니라 EAE 발달이 결정되었다.
실시예 15: VISTA 의 구조적 연구 및 VISTA 기능의 분자결정요소의 결정
친화성, 특이성, 올리고머 상태 및 구조화된 신호복합체의 형성 및 위치는 면역기능에 중요한 공헌을 한다. 상기 수용체-리간드 엑토도메인 (ectodomain)의 구조는 직접적으로 비공유적 결합 세포질 신호 및 스캐폴딩 분자 (scaffolding molecule)의 이동, 조직화 및 기능을 조절하기 때문에, 상기 특징의 모든 것은 신호전달 및 면역조절에 영향이 있다. VISTA의 상기 높은 해상 크리스탈 구조 (high resolution crystal structure) 뿐만 아니라 높은-처리량 크리스탈화 (high-throughput crystalization) 및 구조결정 접근은 박테리아, 곤충 및 포유류 발현시스템을 포함한 기술을 사용하여 결정된다. 크리스탈그래픽적으로 관찰한 이황화결합 양상을 타당화하기 위해, TIM-3 및 인간 DcR359의 공개한 연구를 성공적으로 지지해주었던 접근을 사용하여, 높은 해상도 질량분석기를 적용하였다. 상기 구조적 결과를 기초로, 변화된 올리고머의 특성을 가지는 돌연변이 시리즈 및 VISTA IgV 도메인의 교란된 (perturbed) 어떤 부위의 부근에서 돌연변이가 고안되었다. 상기 돌연변이 단백질은 VISTA 기능에 대한 추가적인 직접적 기작 통찰력을 제공할 것이고, 치료에 있어서 유용할 것이며, 여기에서 면역억제는 여기에서 동정된 자가면역, 알러지 및 염증성 질환과 같은 곳에서 바람직하다. 질환결과, 질환완화에서의 면역억제적 효과를 평가하기 위해, 이러한 돌연변이, 특히 올리고머는 시험관내에서 검사되었고, 동물의 자가면역 및 염증성 질환모델에서 또는 상기 자가면역 또는 염증성 질병을 발달시키는 것으로부터 동물을 보호하는 데에서 측정되었다.
상기 올리고머 VISTA 단백질은 자가면역에서 면역 중재의 표적으로서 VISTA 경로 및 기능을 활성화시킨다. 상기 중재는 면역을 억제하고, 자가면역을 억제하는 것이 바람직한 자가면역질환 또는 다른 질병에서 치료적 효과를 나타낸다. 이것은 EAE 및 콜라겐-유도 관절염 동물 모델과 같은, 상이한 자가면역 및 염증성 모델에서 올리고머화된 VISTA 단백질을 투여함으로써 이루어진다. 또한, 상기 기술된 것과 같이, VISTA 전장 또는 VISTA의 올리고머를 과발현하는 아데노바이러스 벡터는 만들어지고, 생체내에서 검사된다. 이러한 연구는 VISTA 올리고머의 면역억제적 효과를 확인할 것이다.
실시예 16: 조건적 VISTA 과발현 형질도입 생쥐주 ( mouse strain )를 이용한 실험 ( VISTA 형질도입 생쥐주 : R26StopFLVISTA ( VISTA ))
loxp-측면 STOP 카세트에 의해 선행된, VISTA의 전장 cDNA를 포함하는 표적화 구조물은 항상 발현하는 ROS26 위치로 표적화되었다. 다수의 올바르게 표적화된 R26StopFL/-VISTA 새끼는 태어났고, CMV-Cre 제거자 주 60에서 사육하였다. VISTA x CMV-cre에서의 선데이터로 GFP 및 강조된 VISTA 발현을 확인하였다. 상기 생쥐의 면역상태에 대한 연구는 (항원에 대한 T 세포 반응, 항체 타이터 등) 억제된 표현형을 확인할 것이다. VISTA 발현의 위치가 억제에 영향을 미치는지 결정하기 위해 상기 VISTA 계통은 CD4-cre, CD11c-cre 및 Lys-cre와 함께 이종교배될 것이다. 또한, T 세포의 표현형 및 기능이 결정될 것이고, VISTA의 과발현이 aTreg의 생산을 초래할 것인지 결정될 것이다. 상기 연구에서, 과발현된 VISTA의 존재하에 항원 면역화가 항원-특이적 Treg를 유도하는지 알아보기 위해, OVA-면역 cre x VISTA 계통은 WT 숙주로 입양전달 (adoptive transfer)된다. 이것은 VISTA가 Treg 분화에 영향을 주는 것을 확인한다.
또한, 연구는 EAE 모델에서 효과가 있었고, 이로써 질병발달에 대해서 상이한 계통에서의 VISTA 단백질의 영향은 (CD4-, CD11c-, Lys-cre와 이종교배됨으로써) 평가될 것이다. 질환이 계통 제한적 VISTA 과발현에 의해 또는 CMV x VISTA 돌연변이에서 억제될 수 있다는 것을 가정할 때, 질환 발달의 상기 일시적 조절은 Cre-ERT 2x VISTA를 사용한다. 타목시펜 (tamoxifen)의 투여를 통해서, 질병개시 이전에, 또는 개시에서 또는 질병 피크 (peak)에서 VISTA가 면역의 유도 및/또는 작용 단계에 대해 영향을 주는지 결정하기 위해서, VISTA의 과발현을 유도할 수 있다. BM 키메라 생쥐를 사용하여, 일시적으로 제한된 VISTA 과발현은 조혈집단에서 제한될 수 있다. VISTA가 과발현되는 시간창을 조절하는 것에 대한 이해에 대해, VISTA는 일반적으로 일어나고, 그 후 혈청학적으로 항-VISTA mAb의 투여와 함께 꺼진다. 상기 연구는 어디에서 및 언제 VISTA가 자가면역질환의 잘달 및 경과를 조절하는 역할을 가지는지 결정할 것이다.
실시예 17: 항- VISTA 항체 CD40 / TLR 작용제 백신의 효과
도 22에서 보여지는 것과 같이, 백신의 효과성에 있어서 항-VISTA 항체의 효과를 검사하는 실험이 수행되었다. 상기 결과는 항-VISTA가 CD40/TLR 백신의 치료적 효과를 증진시킨다는 것을 보였다. C57BL/6 생쥐는 1x105 전이성 B16.F10 흑색종 세포를 s.q.로 자극하였다. 4일 후에, 생쥐는 항-VISTA (200μg x 3/주)와 함께 또는 없이, 100μg 종양 관련 항원 △V, 100μg αCD40 FGK45 (CD40 작용제적 항체) 및 100μg S-27609 (TLR7 작용제)로 백신화되었다. 종양의 성장은 캘리퍼 (caliper) 측정에 의해 모니터되었다.
본 발명에서 기술된 것과 같이, 하기의 청구항에 제공된다. 이러한 청구항은 여기에서 기술된 모든 일반적 및 특이적 특징, 및 언어적 문제로서, 그 사이에 있을 수 있는 상기 영역의 모든 진술을 포함하기 위함이다.
SEQUENCE LISTING <110> Trustees of Dartmouth College Noelle, Randolph J. Lu, Li-Fan Sergio, Quezada David, Gondek <120> REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEINS AND USES THEREOF <130> 76799.000106 <140> PCT/US2011/030087 <141> 2011-03-25 <150> 60/674,567 <151> 2005-04-25 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4795 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gagcattcac tctagcgagc gagcggcgtg tacagccggc tccctgggct cctggagtcc 60 cgcttgctcc aagcgcactc cagcagtctc tttctgctct tgcccggctc gacggcgaca 120 tgggtgtccc cgcggtccca gaggccagca gcccgcgctg gggaaccctg ctccttgcta 180 ttttcctggc tgcatccaga ggtctggtag cagccttcaa ggtcaccact ccatattctc 240 tctatgtgtg tcccgaggga cagaatgcca ccctcacctg caggattctg ggccccgtgt 300 ccaaagggca cgatgtgacc atctacaaga cgtggtacct cagctcacga ggcgaggtcc 360 agatgtgcaa agaacaccgg cccatacgca acttcacatt gcagcacctt cagcaccacg 420 gaagccacct gaaagccaac gccagccatg accagcccca gaagcatggg ctagagctag 480 cttctgacca ccacggtaac ttctctatca ccctgcgcaa tgtgacccca agggacagcg 540 gcctctactg ctgtctagtg atagaattaa aaaaccacca cccagaacaa cggttctacg 600 ggtccatgga gctacaggta caggcaggca aaggctcggg gtccacatgc atggcgtcta 660 atgagcagga cagtgacagc atcacggctg cggccctggc caccggcgcc tgcatcgtgg 720 gaatcctctg cctccccctt atcctgctgc tggtctataa gcagagacag gtggcctctc 780 accgccgtgc ccaggagttg gtgaggatgg acagcagcaa cacccaagga atcgaaaacc 840 caggcttcga gaccactcca cccttccagg ggatgcctga ggccaagacc aggccgccac 900 tgtcctatgt ggcccagcgg caaccttcgg agtcaggacg gtacctgctc tctgacccca 960 gcacacctct gtcgcctcca ggccctgggg acgtcttttt cccatcccta gatccagtcc 1020 ctgactcccc taactctgaa gccatctaaa ccagctgggg aaccatgaac catggtacct 1080 gggtcaggga tatgtgcact tgatctatgg ctggcccttg gacagtcttt taggcactga 1140 ctccagcttc cttgctcctg ctctgagcct agactctgct tttacaagat gcacagaccc 1200 tcccctatct ctttcagacg ctacttgggg ggcagggaga agatgttgga ttgctcatgg 1260 ctgttctcaa gatcttggga tgctgagttc tccctagaga cttgacttcg acagccacag 1320 atgtcagatg acctgcatcc tatgaacgtc cggcttggca agagcctttc ttcatggaaa 1380 ccagtagccc ggaggggatg aggtaggcac cttgccaccc tcccgggaga gagacacaag 1440 atgtgagaga ctcctgctca ctgtgggggt gtggctggcc tgcttgtttg cctgaggatg 1500 ctcctctgtt ggactgactc tatccccctg gattctggag cttggctggc ctatgtccca 1560 ccagaggagc atctcagcag ccttccacca gcaacctgag ggcctgccag cttcgtggct 1620 ctgggctctc attacctgta tggccgtcca cagagctcag tggccagagg ctttgaaaca 1680 ggaagtacat gtcaggttca ggaaccactg tgagctcatt agtgtcttga gcaatgtgag 1740 gcctggacca gtggacacgg agggagggtg gcgagaggat gatggggatg atgaggggaa 1800 cacgctccct tcctgtcctt gtcatccacc actaccacta ttcagtgtgg agcagtggca 1860 aaggtgaccg acctccacaa tgtcctagtg atgctggacc atttctaagt gtgaaagaga 1920 tgctattaaa aacagtatgt ggcaatggct gccaacagct gagtggactg gaggcactgg 1980 ctttaaggcc ctggaggtgc agggcccggt atggggatag ggatgggagt ttcagtgagg 2040 gcctagggat cactccgctt ctgaccactc ttcttctgag cctcacctca gggtgacctt 2100 caggcacaca gaagagcttg cccctggtcc gatactactc ttggctctca tctccagggt 2160 ttggcatgac ctgggcacac agggggagtc ttcagaaagg attttaaagc atgaaaagaa 2220 agggtagttc ttgtgaggta gggatgggca gctgatgttt gagagtgagg agggatacgg 2280 ctgggcagat cactctccag 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ccttgctgct gctgtagaga cagctgcagg atcttagggt 3180 ggaaaatgga ggtgccctga ggtgctagcc cttggggcaa aagatggggt ggcaatgaga 3240 cacagtgggg aactgagttc cccaagagga gggaggagcc ctgtagcctc aagggccata 3300 ttgggttcct ggtaccagca aaagcctaga gagcgaagtc tgtattttga ggaggtaatt 3360 gatccttacg gaatccatca gaaatttgga gcgggtgctt tatctatctc tggagggtct 3420 ctacctatct ccgatgaagc tctccctggg cctgggatgg gagaaaccag gaggaaaggt 3480 gtctgataaa gcaggggctt cttgacaagc caaagggcca ctggtagctg ttgtggaccg 3540 agctgaccct gctgaagtat tgtagtgtgc cttggaccaa cttctcaaaa gagcaacccc 3600 ggggctaccc tacttctgcc aggaagaggc ggagaagggg ctgagaggcc tggaaggggc 3660 tagctccttc tttgagaact gctccccgga ggacttggag gaggcggcta ggctacgggc 3720 tgctgagggc cctttgtctt tcctaacctg ggcactgtta ggatgctccc tcctggaaaa 3780 ggctttcctg ggtgtgagct agagcagtgt ccatgccagc gctgaacctg ccatggtggg 3840 agctgaacta aaaatttctc agggaactaa aataggcaaa agaggaactg ggggaggagg 3900 gtgccaggca ggatgggggg aagggagggc agtgcaaaag tctcttgaaa cacagacagc 3960 ccagctgagt gccagtccca gatcacagag aatacggctc atctggctca tgttctgcat 4020 gcttgctgct ttaccctggc actttccttc tccaccatga gtgcgagtcc tgggagtcct 4080 gggagggtga ggattaatgc cagcctgggg agcagatagc tgacagagtc cttgggtaac 4140 tggcttgaac caggacctca ggattccact ctggggatct agctttgtct gggccagtga 4200 agatctctat aatggcatta ttgccagggg ataaacattt cactgggttc tgatctgttg 4260 ggtgtggctt cctggaaaat atggtgagag gaattctgct aaggatacag ttgataagaa 4320 agttctgaga ttgattagta atgcctgcct tggactcagg aagggaagtg gcagtatgaa 4380 tgccatgtct taatcatttt ggttaaaata tgcttcccaa aagatttcca cgtgtgttct 4440 tgtttatttg acatctgtct ccatatcagt cttgaaagcc tttctgtgtg tatatatatg 4500 atgtttgcgt gtatatatgt ttttgtgtgt gcatatggaa gtcagaaatc actgggtgtc 4560 ttcctccatt cctttgcaat gtatgttttt ttttttttta cgatttattt actatatgaa 4620 tgttttgcct gaatacatgc ataggtgtca cgtacatgcc tgctggaacg cttggaactg 4680 gagttacagg tggctatgag ctacagtgtg agcactggga atcaaacctg ggtcttctgc 4740 aagagcaaca aattaaaagt cagctcttaa ctacttgagc tatttttcca actcc 4795 <210> 2 <211> 309 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Gly Val Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ser Pro Arg Trp Gly Thr 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Leu Val Ala Ala 20 25 30 Phe Lys Val Thr Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 35 40 45 Asn Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Val Ser Lys Gly His 50 55 60 Asp Val Thr Ile Tyr Lys Thr Trp Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Glu Val 65 70 75 80 Gln Met Cys Lys Glu His Arg Pro Ile Arg Asn Phe Thr Leu Gln His 85 90 95 Leu Gln His His Gly Ser His Leu Lys Ala Asn Ala Ser His Asp Gln 100 105 110 Pro Gln Lys His Gly Leu Glu Leu Ala Ser Asp His His Gly Asn Phe 115 120 125 Ser Ile Thr Leu Arg Asn Val Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Cys 130 135 140 Cys Leu Val Ile Glu Leu Lys Asn His His Pro Glu Gln Arg Phe Tyr 145 150 155 160 Gly Ser Met Glu Leu Gln Val Gln Ala Gly Lys Gly Ser Gly Ser Ths 165 170 175 Cys Met Ala Ser Asn Glu Gln Asp Ser Asp Ser Ile Thr Ala Ala Ala 180 185 190 Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro Leu Ile 195 200 205 Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Val Ala Ser His Arg Arg Ala 210 215 220 Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Ser Asn Thr Gln Gly Ile Glu Asn 225 230 235 240 Pro Gly Phe Glu Thr Thr Pro Pro Phe Gln Gly Met Pro Glu Ala Lys 245 250 255 Thr Arg Pro Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser Glu Ser 260 265 270 Gly Arg Tyr Leu Leu Ser Asp Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly 275 280 285 Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp Ser Pro 290 295 300 Asn Ser Glu Ala Ile 305 <210> 3 <211> 4774 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gggggcgggt gcctggagca cggcgctggg gccgcccgca gcgctcactc gctcgcactc 60 agtcgcggga ggcttccccg cgccggccgc gtcccgcccg ctccccggca ccagaagttc 120 ctctgcgcgt ccgacggcga catgggcgtc cccacggccc tggaggccgg cagctggcgc 180 tggggatccc tgctcttcgc tctcttcctg gctgcgtccc taggtccggt ggcagccttc 240 aaggtcgcca cgccgtattc cctgtatgtc tgtcccgagg ggcagaacgt caccctcacc 300 tgcaggctct tgggccctgt ggacaaaggg cacgatgtga ccttctacaa gacgtggtac 360 cgcagctcga ggggcgaggt gcagacctgc tcagagcgcc ggcccatccg caacctcacg 420 ttccaggacc ttcacctgca ccatggaggc caccaggctg ccaacaccag ccacgacctg 480 gctcagcgcc acgggctgga gtcggcctcc gaccaccatg gcaacttctc catcaccatg 540 cgcaacctga ccctgctgga tagcggcctc tactgctgcc tggtggtgga gatcaggcac 600 caccactcgg agcacagggt ccatggtgcc atgagctgtca ggtgcagac aggcaaagat 660 gcaccatcca actgtgtggt gtacccatcc tcctcccagg atagtgaaaa catcacggct 720 gcagccctgg ctacgggtgc ctgcatcgta ggaatcctct gcctccccct catcctgctc 780 ctggtctaca agcaaaggca ggcagcctcc aaccgccgtg cccaggagct ggtgcggatg 840 gacagcaaca ttcaagggat tgaaaacccc ggctttgaag cctcaccacc tgcccagggg 900 atacccgagg ccaaagtcag gcaccccctg tcctatgtgg cccagcggca gccttctgag 960 tctgggcggc atctgctttc ggagcccagc acccccctgt ctcctccagg ccccggagac 1020 gtcttcttcc catccctgga ccctgtccct gactctccaa actttgaggt catctagccc 1080 agctggggga cagtgggctg ttgtggctgg gtctggggca ggtgcatttg agccagggct 1140 ggctctgtga gtggcctcct tggcctcggc cctggttccc tccctcctgc tctgggctca 1200 gatactgtga catcccagaa gcccagcccc tcaacccctc tggatgctac atggggatgc 1260 tggacggctc agcccctgtt ccaaggattt tggggtgctg agattctccc ctagagacct 1320 gaaattcacc agctacagat gccaaatgac ttacatctta agaagtctca gaacgtccag 1380 cccttcagca gctctcgttc tgagacatga gccttgggat gtggcagcat cagtgggaca 1440 agatggacac tgggccaccc tcccaggcac cagacacagg gcacggtgga gagacttctc 1500 ccccgtggcc gccttggctc ccccgttttg cccgaggctg ctcttctgtc agacttcctc 1560 tttgtaccac agtggctctg gggccaggcc tgcctgccca ctggccatcg ccaccttccc 1620 cagctgcctc ctaccagcag tttctctgaa gatctgtcaa caggttaagt caatctgggg 1680 cttccactgc ctgcattcca gtccccagag cttggtggtc ccgaaacggg aagtacatat 1740 tggggcatgg tggcctccgt gagcaaatgg tgtcttgggc aatctgaggc caggacagat 1800 gttgccccac ccactggaga tggtgctgag ggaggtgggt ggggccttct gggaaggtga 1860 gtggagaggg gcacctgccc cccgccctcc ccatccccta ctcccactgc tcagcgcggg 1920 ccattgcaag ggtgccacac aatgtcttgt ccaccctggg acacttctga gtatgaagcg 1980 ggatgctatt aaaaactaca tggggaaaca ggtgcaaacc ctggagatgg attgtaagag 2040 ccagtttaaa tctgcactct gctgctcctc ccccaccccc accttccact ccatacaatc 2100 tgggcctggt ggagtcttcg cttcagagcc attcggccag gtgcgggtga tgttcccatc 2160 tcctgcttgt gggcatgccc tggctttgtt tttatacaca taggcaaggt gagtcctctg 2220 tggaattgtg attgaaggat tttaaagcag gggaggagag tagggggcat ctctgtacac 2280 tctgggggta aaacagggaa ggcagtgcct gagcatgggg acaggtgagg tggggctggg 2340 cagaccccct gtagcgttta gcaggatggg ggccccaggt actgtggaga gcatagtcca 2400 gcctgggcat ttgtctccta gcagcctaca ctggctctgc tgagctgggc ctgggtgctg 2460 aaagccagga tttggggcta ggcgggaaga tgttcgccca attgcttggg gggttggggg 2520 gatggaaaag gggagcacct ctaggctgcc tggcagcagt gagccctggg cctgtggcta 2580 cagccaggga accccacctg gacacatggc cctgcttcta agccccccag ttaggcccaa 2640 aggaatggtc cactgagggc ctcctgctct gcctgggctg ggccaggggc tttgaggaga 2700 gggtaaacat aggcccggag atggggctga cacctcgagt ggccagaata tgcccaaacc 2760 ccggcttctc ccttgtccct aggcagaggg gggtcccttc ttttgttccc tctggtcacc 2820 acaatgcttg atgccagctg ccataggaag agggtgctgg ctggccatgg tggcacacac 2880 ctgtcctccc agcactttgc agggctgagg tggaaggacc 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ctcccaggga gaggctgaag 3840 gaatggaatt gaaagcacca tttggagggt tttgctgaca cagcggggac tgctcagcac 3900 tccctaaaaa cacaccatgg aggccactgg tgactgctgg tgggcaggct ggccctgcct 3960 gggggagtcc gtggcgatgg gcgctggggt ggaggtgcag gagccccagg acctgctttt 4020 caaaagactt ctgcctgacc agagctccca ctacatgcag tggcccaggg cagaggggct 4080 gatacatggc ctttttcagg gggtgctcct cgcggggtgg acttgggagt gtgcagtggg 4140 acagggggct gcaggggtcc tgccaccacc gagcaccaac ttggcccctg gggtcctgcc 4200 tcatgaatga ggccttcccc agggctggcc tgactgtgct gggggctggg ttaacgtttt 4260 ctcagggaac cacaatgcac gaaagaggaa ctggggttgc taaccaggat gctgggaaca 4320 aaggcctctt gaagcccagc cacagcccag ctgagcatga ggcccagccc atagacggca 4380 caggccacct ggcccattcc ctgggcattc cctgctttgc attgctgctt ctcttcaccc 4440 catggaggct atgtcaccct aactatcctg gaatgtgttg agagggattc tgaatgatca 4500 atatagcttg gtgagacagt gccgagatag atagccatgt ctgccttggg cacgggagag 4560 ggaagtggca gcatgcatgc tgtttcttgg ccttttctgt tagaatactt ggtgctttcc 4620 aacacacttt cacatgtgtt gtaacttgtt tgatccaccc ccttccctga aaatcctggg 4680 aggttttatt gctgccattt aacacagagg gcaatagagg ttctgaaagg tctgtgtctt 4740 gtcaaaacaa gtaaacggtg gaactacgac taaa 4774 <210> 4 <211> 311 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser 1 5 10 15 Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala 20 25 33 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 35 40 45 Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His 50 55 60 Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val 65 70 75 80 Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp 85 90 95 Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp 100 105 110 Leu A1a Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn 115 120 125 Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr 130 135 140 Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val 145 150 155 160 His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp 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gtctctgcca tcttccagtt 900 ttctgccagc ctgcacgtgg accacagtga actgcagggc agaggccggt tgcgtacccg 960 ggatatggtc cgtgttctca tctgtattga gtccttgtgt catcgtcata cgtccctgga 1020 ggctgtatca ggtctggaga gcaacagcag ggtcttcaca gtgcaggttc aggggctgct 1080 gcatctacag tctggacagt atgtctctgt gttcgtggac aacagttctg gggcagtcct 1140 caccatccag aacacttcca gcttctcggg aatgcttttg ggtacctagc ggagctgaag 1200 aaacgattgt ggattgagga accaacacct tgcttcttag aggagctgaa aaggactact 1260 cactcccctt ttaatagttt tcatagcaat aaagaactcc aaacttcttc atcgct 1316 <210> 7 <211> 308 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Trp Ala Trp Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Trp Leu Gln Thr 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gly Ala Arg Gln Glu Leu Lys Lys Ser Arg Gln Leu Phe 20 25 30 Ala Arg Val Asp Ser Pro Asn Ile Thr Thr Ser Asn Arg Glu Gly Phe 35 40 45 Pro Gly Ser Val Lys Pro Pro Glu Ala Ser Gly Pro Glu Leu Ser Asp 50 55 60 Ala His Met Thr Trp Leu Asn Phe Val Arg Arg Pro Asp Asp Gly Ser 65 70 75 80 Ser Arg Lys Arg Cys Arg Gly Arg Asp Lys Lys Ser Arg Gly Leu Ser 85 90 95 Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 100 105 110 Ser Pro Gly Val Gly Val Thr Pro Glu Ala Leu Leu Gln Glu Phe Gln 115 120 125 Glu Ile Leu Lys Glu Ala Thr Glu Leu Arg Phe Ser Gly Leu Pro Asp 130 135 140 Thr Leu Leu Pro Gln Glu Pro Ser Gln Arg Leu Val Val Glu Ala Phe 145 150 155 160 Tyr Cys Arg Leu Lys Gly Pro Val Leu Val Asp Lys Lys Thr Leu Val 165 170 175 Glu Leu Gln Gly Phe Gln Ala Pro Thr Thr Gln Gly Ala Phe Leu Arg 180 185 190 Gly Ser Gly Leu Ser Leu Ser Leu Gly Arg Phe Thr Ala Pro Val Ser 195 200 205 Ala Ile Phe Gln Phe Ser Ala Ser Leu His Val Asp His Ser Glu Leu 210 215 220 Gln Gly Arg Gly Arg Leu Arg Thr Arg Asp Met Val Arg Val Leu Ile 225 230 235 240 Cys Ile Glu Ser Leu Cys His Arg His Thr Ser Leu Glu Ala Val Ser 245 250 255 Gly Leu Glu Ser Asn Ser Arg Val Phe Thr Val Gln Val Gln Gly Leu 260 265 270 Leu His Leu Gln Ser Gly Gln Tyr Val Ser Val Phe Val Asp Asn Ser 275 280 285 Ser Gly Ala Val Leu Thr Ile Gln Asn Thr Ser Ser Phe Ser Gly Met 290 295 300 Leu Leu Gly Thr 305 <210> 8 <211> 1055 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ctcgccgcgc tgagccgcct cgggacggag ccatgcggcg ctgggcctgg gccgcggtcg 60 tggtccccct cgggccgcag ctcgtgctcc tcgggggcgt cggggcccgg cgggaggcac 120 agaggacgca gcagcctggc cagcgcgcag atccccccaa cgccaccgcc agcgcgtcct 180 cccgcgaggg gctgcccgag gcccccaagc catcccaggc ctcaggacct gagttctccg 240 acgcccacat gacatggctg aactttgtcc ggcggccgga cgacggcgcc ttaaggaagc 300 ggtgcggaag cagggacaag aagccgcggg atctcttcgg tcccccagga cctccaggtg 360 cagaagtgac cgcggagact ctgcttcacg agtttcagga gctgctgaaa gaggccacgg 420 agcgccggtt ctcagggctt ctggacccgc tgctgcccca gggggcgggc ctgcggctgg 480 tgggcgaggc ctttcactgc cggctgcagg gtccccgccg ggtggacaag cggacgctgg 540 tggagctgca tggtttccag gctcctgctg cccaaggtgc cttcctgcga ggctccggtc 600 tgagcctggc ctcgggtcgg ttcacggccc ccgtgtccgg catcttccag ttctctgcca 660 gtctgcacgt ggaccacagt gagctgcagg gcaaggcccg gctgcgggcc cgggacgtgg 720 tgtgtgttct catctgtatt gagtccctgt gccagcgcca cacgtgcctg gaggccgtct 780 caggcctgga gagcaacagc agggtcttca cgctacaggt gcaggggctg ctgcagctgc 840 aggctggaca gtacgcttct gtgtttgtgg acaatggctc cggggccgtc ctcaccatcc 900 aggcgggctc cagcttctcc gggctgctcc tgggcacgtg agggcgccca ggggggctgg 960 cgaggagctg ccgccggatc ccggggaccc tcctactgat gcccgtggtc accacaataa 1020 agagccctcc accctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1055 <210> 9 <211> 302 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Arg Trp Ala Trp Ala Ala Val Val Val Leu Leu Gly Pro Gln 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Gly Val Gly Ala Arg Arg Glu Ala Gln Arg Thr 20 25 30 Gln Gln Pro Gly Gln Arg Ala Asp Pro Pro Asn Ala Thr Ala Ser Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Glu Gly Leu Pro Glu Ala Pro Lys Pro Ser Gln Ala Ser 50 55 60 Gly Pro Glu Phe Ser Asp Ala His Met Thr Trp Leu Asn Phe Val Arg 65 70 75 80 Arg Pro Asp Asp Gly Ala Leu Arg Lys Arg Cys Gly Ser Arg Asp Lys 85 90 95 Lys Pro Arg Asp Leu Phe Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Glu Val 100 105 110 Thr Ala Glu Thr Leu Leu His Glu Phe Gln Glu Leu Leu Lys Glu Ala 115 120 125 Thr Glu Arg Arg Phe Ser Gly Leu Leu Asp Pro Leu Leu Pro Gln Gly 130 135 140 Ala Gly Leu Arg Leu Val Gly Glu Ala Phe His Cys Arg Leu Gln Gly 145 150 155 160 Pro Arg Arg Val Asp Lys Arg Thr Leu Val Glu Leu His Gly Phe Gln 165 170 175 Ala Pro Ala Ala Gln Gly Ala Phe Leu Arg Gly Ser Gly Leu Ser Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Arg Phe Thr Ala Pro Val Ser Gly Ile Phe Gln Phe Ser 195 200 205 Ala Ser Leu His Val Asp His Ser Glu Leu Gln Gly Lys Ala Arg Leu 210 215 220 Arg Ala Arg Asp Val Val Cys Val Leu Ile Cys Ile Glu Ser Leu Cys 225 230 235 240 Gln Arg His Thr Cys Leu Glu Ala Val Ser Gly Leu Glu Ser Asn Ser 245 250 255 Arg Val Phe Thr Leu Gln Val Gln Gly Leu Leu Gln Leu Gln Ala Gly 260 265 270 Gln Tyr Ala Ser Val Phe Val Asp Asn Gly Ser Gly Ala Val Leu Thr 275 280 285 Ile Gln Ala Gly Ser Ser Phe Ser Gly Leu Leu Leu Gly Thr 290 295 300 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Treg-sTNF <400> 10 Ile Phe Gln Phe Ser Ala Ser Leu His Val Asp His Ser Glu Leu Gln 1 5 10 15 Gly

Claims (54)

  1. 분리된 또는 재조합 면역억제 다합체(multimeric) VISTA 단백질을 포함하는, 면역억제 또는 치료가 필요한 개체에서 면역억제를 유도하거나, 또는 알레르기성, 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 다합체 VISTA 단백질은
    서열 번호: 2 또는 4에서의 인간 또는 생쥐(murine) VISTA 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성되는 폴리펩티드의 2개 내지 6개의 카피(copies)를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외 도메인 중 최소 하나가 올리고머화 도메인의 N-말단에 부착되는 것인 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 올리고머화 도메인이 GCN4, COMP, SNARE, CMP, MAT, LLR 포함 1 NLRC, NOD2 뉴클레오티드-결합 NLRC2, LRR 포함 1 NLRC NOD2 뉴클레오티드-결합 NLRC2, 및 PSORAS1로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인 중 최소 하나가 Ig 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 것인 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4 및 ICOS 단백질로부터 선택되는 최소 하나의 다른 면역억제제 및 상기 최소 하나의 다른 면역억제제 중 어느 하나에 특이적인 항체를 포함하는 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기성, 염증성 또는 자가면역 질환은 건선(psoriasis), 피부염(dermatitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis); 전신성 강피증(systemic scleroderma), 경화증(sclerosis); 크론 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis); 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome), 성인 호흡 곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome; ARDS); 피부염; 수막염(meningitis); 뇌염(encephalitis); 포도막염(uveitis); 대장염(colitis); 사구체신염(glomerulonephritis); 습진(eczema), 천식(asthma), 죽상동맥경화증(atherosclerosis); 백혈구 부착 결핍증(leukocyte adhesion deficiency); 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis); 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus; SLE); 당뇨병(diabetes mellitus); 다발성 경화증(multiple sclerosis); 레이나우드 증후군(Reynaud's syndrome); 자가면역 갑상선염(autoimmune thyroiditis); 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis); 쇼그렌 증후군(Sjorgen's syndrome); 연소성 당뇨병(juvenile onset diabetes); 결핵(tuberculosis), 사르코이도시스(sarcoidosis), 다발성근염(polymyositis), 육아종증(granulomatosis), 혈관염(vasculitis); 악성빈혈(pernicious anemia)(애디슨병(Addison's disease)); 중추신경계(CNS) 염증성 장애, 다장기 손상 증후군(multiple organ injury syndrome); 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 한랭글로불린혈증(cryoglobinemia) 또는 쿰스(Coombs) 양성 빈혈; 중증근무력증(myasthenia gravis); 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환(anti-glomerular basement membrane disease); 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome); 알레르기성 신경염(allergic neuritis); 그레브스 질환(Graves' disease); 람베르트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 수포성 펨피고이드(pemphigoid bullous); 천포창(pemphigus); 자가면역 다발성내분비병증(autoimmune polyendocrinopathies); 라이터 질환(Reiter's disease); 스티프-맨 증후군(stiff-man syndrome); 베체트 질환(Behcet disease); 거대세포 동맥염(giant cell arteritis); 면역복합체 신염(immune complex nephritis); IgA 신장병(nephropathy); IgM 말초신경병증(polyneuropathies); 면역 혈소판감소성자반병(immune thrombocytopenic purpura; ITP), 자가면역 혈소판감소증(autoimmune thrombocytopenia), 관절염, 류마티스 관절염, 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍성(gouty) 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 연소성 류마티스 관절염(juvenile-onset rheumatoid arthritis), 골관절염, 만성 진행성 관절염(arthritis chronica progrediente), 변형성 관절염(arthritis deformans), 원발성 만성 다발관절염(polyarthritis chronica primaria), 반응성 관절염(reactive arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 염증성 과증식 피부 질환, 건선, 플라크 건선(plaque psoriasis), 구타테 건선(gutatte psoriasis), 농포성 건선(pustular psoriasis), 손톱의 건선(psoriasis of the nails), 피부염, 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), X-연관 과IgM 증후군, 두드러기(urticaria), 만성 알레르기성 두드러기, 만성 특발성 두드러기, 만성 자가면역 두드러기, 다발성근염/피부근염(polymyositis/dermatomyositis), 연소성 피부근염(juvenile dermatomyositis), 중독성 표피박리(toxic epidermal necrolysis), 경피증(scleroderma), 전신성 경피증, 경화증, 전신성 경화증(systemic sclerosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS), 스피노-옵티컬 MS(spino-optical MS), 원발성 진행성 MS(primary progressive MS; PPMS), 재발완화형 MS(relapsing remitting MS; RRMS), 진행성 전신 경화증(progressive systemic sclerosis), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 동맥경화증(arteriosclerosis), 파종성 경화증(sclerosis disseminata), 실조성 경화증(ataxic sclerosis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 크론 질환, 대장염, 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 궤양 대장염(colitis ulcerosa), 미세 대장염(microscopic colitis), 콜라겐성 대장염(collagenous colitis), 용종성 대장염(colitis polyposa), 신생아 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis), 경벽 대장염(transmural colitis), 자가면역 염증성 장질환(autoimmune inflammatory bowel disease), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 결절성 홍반(erythema nodosum), 원발성 경화 담관염(primary sclerosing cholangitis), 상공막염(episcleritis), 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome), 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군(adult or acute respiratory distress syndrome; ARDS), 수막염(meningitis), 포도막(uvea)의 전체 또는 부분의 염증, 홍채염(iritis), 맥락막염(choroiditis), 자가면역 혈액장애(autoimmune hematological disorder), 류마티스 척추염(rheumatoid spondylitis), 돌발성 청력 상실, IgE-매개 질환, 아나필락시스(anaphylaxis), 알레르기성 비염, 아토피성 비염, 뇌염(encephalitis), 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 변연계 뇌염(limbic encephalitis), 뇌줄기 뇌염(brainstem encephalitis), 포도막염, 앞포도막염(anterior uveitis), 급성 앞포도막염, 육아종 포도막염(granulomatous uveitis), 비육아종 포도막염(nongranulomatous uveitis), 파코항원성 포도막염(phacoantigenic uveitis), 뒤포도막염(posterior uveitis), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 사구체신염(glomerulonephritis; GN), 특발성 막성 GN(idiopathic membranous GN) 또는 특발성 막성 신증(idiopathic membranous nephropathy), 막성-(membrano-) 또는 막 증식성 GN(membranous proliferative GN; MPGN), 급속 진행성 GN, 알레르기성 병태, 자가면역 심근염(myocarditis), 백혈구 부착 결핍증(leukocyte adhesion deficiency), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus; SLE), 전신성 홍반성 낭창, 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스(subacute cutaneous lupus erythematosus), 신생아 루푸스 증후군(neonatal lupus syndrome; NLE), 파종성 홍반성 낭창(lupus erythematosus disseminatus), 루푸스, 신장염(nephritis), 뇌염(cerebritis), 소아 루프스(pediatric lupus), 비신장 루프스(non-renal lupus), 신장외 루프스(extra-renal lupus), 원판상 루프스(discoid lupus), 탈모(alopecia), 연소성 (I형) 당뇨병(juvenile onset (Type I) diabetes mellitus), 소아 인슐린-의존 당뇨병(pediatric insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM), 성인형 당뇨병 (II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 당뇨병 요붕증(idiopathic diabetes insipidus), 사이토카인 및 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역반응, 결핵, 사르코이도시스(sarcoidosis), 육아종증(granulomatosis), 림프종모양 육아종증(lymphomatoid granulomatosis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 무과립구증(agranulocytosis), 맥관염(vasculitides), 혈관염(vasculitis), 거대혈관 혈관염(large vessel vasculitis), 류마티스성 다발근육통(polymyalgia rheumatica), 거대세포(타카야슈(Takayasu)) 동맥염, 중간혈관 혈관염(medium vessel vasculitis), 가와사키 질환(Kawasaki's disease), 결절성 다발성동맥염(polyarteritis nodosa), 미세 다발성동맥염(microscopic polyarteritis), CNS 혈관염, 괴사성, 피부성, 또는 과민성 혈관염, 전신성 괴사성 혈관염(systemic necrotizing vasculitis), ANCA-관련 혈관염, 척-스트라우스 혈관염(Churg-Strauss vasculitis) 또는 증후군(CSS), 측두동맥염(temporal arteritis), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스(Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈(Diamond Blackfan anemia), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia) 또는 면역 용혈성 빈혈(immune hemolytic anemia), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia; AIHA), 악성빈혈(pernicious anemia)(anemia perniciosa), 애디슨병, 순수적혈구빈혈 또는 무형성증(pure red cell anemia or aplasia; PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증(autoimmune neutropenia), 범혈구감소증(pancytopenia), 백혈구감소증(leukopenia), 백혈구 누출(leukocyte diapedesis)을 수반하는 질환, CNS 염증성 장애, 다장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트 질환(Bechet's 또는 Behcet's disease), 캐슬맨 증후군(Castleman's syndrome), 굿패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 레이나우드 증후군(Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 펨피고이드(pemphigoid), 수포성 펨피고이드(pemphigoid bullous), 피부 펨피고이드(skin pemphigoid), 천포창(pemphigus), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽성 천포창(pemphigus foliaceus), 천포창 점막 펨피고이드(pemphigus mucus-membrane pemphigoid), 홍반성 천포창(pemphigus erythematosus), 자가면역 다발성내분비병증(autoimmune polyendocrinopathies), 라이터 질환(Reiter's disease) 또는 증후군, 면역복합체 신장염, 항체-매개 신장염, 시속척수염(neuromyelitis optica), 다신경병증(polyneuropathies), 만성 신경병증(chronic neuropathy), IgM 다신경병증, IgM-매개 신경변증, 혈소판감소증(thrombocytopenia), 혈전성 혈소판감소자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP), 특발성 혈소판감소자반증(ITP), 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선기능저하증(primary hypothyroidism), 부갑상선기능저하증, 자가면역 갑상선염, 하시모토 질환(Hashimoto's disease), 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)); 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상성기능저하증(idiopathic hypothyroidism), 그레브스 질환(Grave's disease), 다분비선 증후군(polyglandular syndrome), 자가면역 다분비선 증후군, 다분비선 내분비병 증후군(polyglandular endocrinopathy syndromes), 부종양 증후군(paraneoplastic syndromes), 신경부종양 증후군(neurologic paraneoplastic syndromes), 람베르트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome) 또는 이튼-람베르트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 스티프-맨(stiff-man) 또는 강직 인간(stiff-person) 증후군, 뇌척수염(encephalomyelitis), 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 실험적 알레르기성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis; EAE), 중증근무력증(myasthenia gravis), 흉선종-관련 중증근무력증(thymoma-associated myasthenia gravis), 소뇌변성(cerebellar degeneration), 신경근긴장증(neuromyotonia), 안구간대경련(opsoclonus) 또는 안구간대경련 근간대경련 증후군(opsoclonus myoclonus syndrome; OMS), 감각 신경병증(sensory neuropathy), 다초점 운동 신경병증(multifocal motor neuropathy), 시한 증후군(Sheehan's syndrome), 자가면역 간염, 만성 간염, 루포이드 간염(lupoid hepatitis), 거대세포 간염(giant cell hepatitis), 만성 활동성 간염(chronic active hepatitis) 또는 자가면역 만성 활동성 간염, 림프구성 간질성 폐렴(lymphoid interstitial pneumonitis), 폐쇄성 세기관지염(bronchiolitis obliteran, 비이식) 대 NSIP, 길린-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 베르게르 질환(Berger's disease, IgA 신장병), 특발성 IgA 신장병, 선형 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 폐경변(pneumonocirrhosis), 자가면역 창자병 증후군(autoimmune enteropathy syndrome), 셀리악 질환(Celiac disease), 만성소화장애(Coeliac disease), 셀리악 스프루(celiac sprue)(글루텐 장병증(gluten enteropathy)), 불응성 스프루(refractory sprue), 특발성 스프루(idiopathic sprue), 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS; 루게릭병(Lou Gehrig's disease)), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 자가면역 귀질환(autoimmune ear disease), 자가면역속귀질환(autoimmune inner ear disease; AGED), 자가면역청력상실, 안구간대경련 근간대경련 증후군(opsoclonus myoclonus syndrome; OMS), 다발연골염(polychondritis), 불응성(refractory) 또는 재발성 다발연골염, 폐포단백증(pulmonary alveolar proteinosis), 아밀로이드증(amyloidosis), 공막염(scleritis), 비암성 림프구증가증(non-cancerous lymphocytosis), 원발성 림프구증가증(primary lymphocytosis), 단일클론 B 세포 림프구증가증, 말초신경병증(peripheral neuropathy), 부종양증후군(paraneoplastic syndrome), 채널병증(channelopathies), 간질(epilepsy), 편두통(migraine), 부정맥(arrhythmia), 근육 장애, 난청(deafness), 실명(blindness), 주기성 근육마비(periodic paralysis), CNS의 채널병증, 자폐증(autism), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 국소 분절 사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 내분비 안병증(endocrine opthalmopathy), 포도막망막염(uveoretinitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 자가면역 간질환(autoimmune hepatological disorder), 근육섬유통(fibromyalgia), 다수 내분비 부전(multiple endocrine failure), 시미디트 증후군(Schmidt's syndrome), 부신염(adrenalitis), 위 위축증(gastric atrophy), 초로기 치매(presenile dementia), 탈수초성 질환(demyelinating diseases), 자가면역 탈수초성 질환, 당뇨병성 신장병(diabetic nephropathy), 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 원형 탈모증, CREST 증후군, 석회증(calcinosis), 레이나우드 현상(Raynaud's phenomenon), 식도 운동장애(esophageal dysmotility), 수지경화증(sclerodactyl), 모세혈관확장증(telangiectasia), 수컷 및 암컷 자가면역 불임, 혼합된 결합조직 질환, 샤가스 질환(Chagas' disease), 류마티스 열(rheumatic fever), 재발성 유산(recurrent abortion), 농부폐(farmer's lung), 다형홍반(erythema multiforme), 심장절개후 증후군(post-cardiotomy syndrome), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 조류 애호가의 폐(bird-fancier's lung), 알레르기성 육아성 혈관염(allergic granulomatous angiitis), 양성 림프구성 혈관염(benign lymphocytic angiitis), 알포트 증후군(Alport's syndrome), 폐포염(alveolitis), 알레르기성 폐포염, 섬유화 폐포염, 간질성 폐질환(interstitial lung disease), 수혈 반응, 나병(leprosy), 말라리아(malaria), 리슈만편모충증(leishmaniasis), 키파노소마증(kypanosomiasis), 주혈흡충증(schistosomiasis), 회충증(ascariasis), 아스페르길루스증(aspergillosis), 삼터 증후군(Sampter's syndrome), 카플란 증후군(Caplan's syndrome), 뎅기열(dengue), 심내막염(endocarditis), 심내막 섬유증(endomyocardial fibrosis), 미만성 간질성 폐섬유증(diffuse interstitial pulmonary fibrosis), 간질성 폐섬유증(interstitial lung fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 안구내염(endophthalmitis), 지구성 융기성 홍반(erythema elevatum et diutinum), 태아적아구증(erythroblastosis fetalis), 호산구성 태아증(eosinophilic faciitis), 슐만 증후군(Shulman's syndrome), 펠티 증후군(Felty's syndrome), 플라리아증(flariasis), 모양체염(cyclitis), 만성 모양체염, 이색성 모양체염, 홍채모양체염(iridocyclitis) 또는 푹스 모양체염(Fuch's cyclitis), 헤노흐-쉔라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증(cardiomyopathy), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파보바이러스 감염(parvovirus infection), 풍진 바이러스 감염(rubella virus infection), 백신접종후 증후군(post-vaccination syndromes), 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염(Epstein-Barr virus infection), 이하선염(mumps), 이반 증후군(Evan's syndrome), 자가면역 성선부전(autoimmune gonadal failure), 시든햄 무도증(Sydenham's chorea), 연쇄상구균감염후 신장염(poststreptococcal nephritis), 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증(thyrotoxicosis), 척수매독(tabes dorsalis), 맥락막염(chorioiditis), 거대세포 다발근육통(giant cell polymyalgia), 내분비 안구병증(endocrine ophthamopathy), 만성 과민성 폐렴(chronic hypersensitivity pneumonitis), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 유행성 각결막염, 특발성 신장염 증후군(idiopathic nephritic syndrome), 최소변화신장병증(minimal change nephropathy), 양성 가족성(benign familial) 및 허혈성-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 망막 자가면역(retinal autoimmunity), 관절 염증(joint inflammation), 기관지염(bronchitis), 만성 폐쇄성 기도질환(chronic obstructive airway disease), 규폐증(silicosis), 아구창(aphthae), 아프타성 구내염(aphthous stomatitis), 동맥경화 질환(arteriosclerotic disorders), 무정자증(aspermiogenese), 자가면역 용혈(autoimmune hemolysis), 보에크 질환(Boeck's disease), 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 듀프트렌 구축증(Dupuytren's contracture), 수정체 과민성 안내염(endophthalmia phacoanaphylactica), 알레르기성 장염(enteritis allergica), 나병성 결절성 홍반(erythema nodosum leprosum), 특발성 안면마비(idiopathic facial paralysis), 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 류마티스성 열(febris rheumatica), 함만-리치 질환(Hamman-Rich's disease), 감각신경 청력상실(sensoneural hearing loss), 발작성 혈액소뇨증(haemoglobinuria paroxysmatica), 성선기능저하증(hypogonadism), 국한성 회장염(ileitis regionalis), 백혈구감소증(leucopenia), 전염성 단핵구증(mononucleosis infectiosa), 횡단성 척수염(traverse myelitis), 원발성 특발성 점액수종(primary idiopathic myxedema), 신장증(nephrosis), 교감신경성 안염(ophthalmia symphatica), 육아성 고환염(orchitis granulomatosa), 췌장염(pancreatitis), 급성다발신경근염(polyradiculitis acuta), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 퀘르바인 갑상샘염(Quervain's thyreoiditis), 후천성 비장 위축증, 항정자성 항체로 인한 불임, 비악성 흉선종(non-malignant thymoma), 백반증(vitiligo), SCID 및 엡스타인-바 바이러스-관련 질환(Epstein-Barr virus-associated diseases), 후천성 면역 결핍 증후군(acquired immune deficiency syndrome; AIDS), 기생충 질환, 리슈마니아(Lesihmania), 독성-쇼크 증후군(toxic-shock syndrome), 식중독(food poisoning), T 세포의 침윤과 관련된 병태, 백혈구-부착 결핍증, 사이토카인 및 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역반응, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 다장기 손상 증후군(multiple organ injury syndrome), 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환(antiglomerular basement membrane disease), 알레르기성 신경염(allergic neuritis), 자가면역 다발성내분비병증(autoimmune polyendocrinopathies), 난소염, 원발성 점액수종(primary myxedema), 자가면역 위축성 위염(autoimmune atrophic gastritis), 교감성 안염(sympathetic ophthalmia), 류마티스 질환(rheumatic diseases), 혼합된 결합조직 질환, 신증후군(nephrotic syndrome), 췌도염(insulitis), 다발성내분비 부전(polyendocrine failure), 말초신경병증(peripheral neuropathy), 자가면역 다분비선 증후군 I형(autoimmune polyglandular syndrome type I), 성인형 특발성 부갑상선기능저하증(adult-onset idiopathic hypoparathyroidism; AOIH), 완전 탈모(alopecia totalis), 확장성 심근병증(dilated cardiomyopathy), 후천성 표피 수포증(epidermolisis bullosa acquisita; EBA), 혈색소증(hemochromatosis), 심근염(myocarditis), 신증후군, 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 화농성 또는 비화농성 부비동염(sinusitis), 급성 또는 만성 부비동염, 사골(ethmoid), 전두(frontal), 상악(maxillary), 또는 접형골(sphenoid) 부비동염, 호산구 관련 장애, 호산구증가증, 폐 침투 호산구증가증(pulmonary infiltration eosinophilia), 호산구증가증-근육통 증후군(eosinophilia-myalgia syndrome), 로플러 증후군(Loffler's syndrome), 만성 호산구성 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 국부성 폐 호산구증가증(tropical pulmonary eosinophilia), 기도폐렴성 아스페르길루스증(bronchopneumonic aspergillosis), 아스페르길루스종(aspergilloma), 또는 호산구 함유 육아종(granulomas containing eosinophils), 아나필락시스(anaphylaxis), 혈청음성 척추관절염(seronegative spondyloarthritides), 다발성내분비 자가면역 질환(polyendocrine autoimmune disease), 경화성 담관염(sclerosing cholangitis), 공막(sclera), 상공막(episclera), 만성 점막피부 칸디다증(chronic mucocutaneous candidiasis), 브루톤 증후군(Bruton's syndrome), 유아기의 일시적 저감마글로불린혈증(transient hypogammaglobulinemia of infancy), 비스코트-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 모세혈관 확장성 운동실조증(ataxia telangiectasia), 콜라겐 질환과 관련된 자가면역 장애, 류마티스, 신경 질환, 허혈성 재관류 장애, 혈압반응의 감소, 혈관기능장애, 혈관확장, 조직손상, 심혈관 허혈(cardiovascular ischemia), 통각과민(hyperalgesia), 뇌허혈(cerebral ischemia), 혈관화(vascularization)를 동반하는 질환, 알레르기성 과민성 장애, 사구체신염(glomerulonephritides), 재관류 손상(reperfusion injury), 심근육 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증 성분을 갖는 피부병(dermatoses), 급성 화농성 수막염(acute purulent meningitis) 또는 다른 중추신경계 염증성 질환, 안구 및 안와 염증성 질환, 과립구 수혈-관련 증후군(granulocyte transfusion-associated syndromes), 사이토카인-유도 독성, 급성 중증 염증(acute serious inflammation), 만성 난치성 염증(chronic intractable inflammation), 신우염(pyelitis), 폐경변(pneumonocirrhosis), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 거대-동맥 장애(diabetic large-artery disorder), 동백내막 과다형성증(endarterial hyperplasia), 소화성 궤양(peptic ulcer), 판막염(valvulitis) 및 자궁내막증(endometriosis)으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 알레르기성, 염증성 또는 자가면역 질환은 다발성 경화증 또는 류마티스 관절염인 약학적 조성물.
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