KR102151210B1 - 규정된 조건하에서 인간 만능성 줄기 세포의 조혈내피세포 분화를 위한 방법 및 재료 - Google Patents

규정된 조건하에서 인간 만능성 줄기 세포의 조혈내피세포 분화를 위한 방법 및 재료 Download PDF

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Abstract

만능성 줄기 세포를 내피 및 조혈 계통의 세포로 분화시키는 방법 및 조성물이 기술되어 있다.

Description

규정된 조건하에서 인간 만능성 줄기 세포의 조혈내피세포 분화를 위한 방법 및 재료 {METHODS AND MATERIALS FOR HEMATOENDOTHELIAL DIFFERENTIATION OF HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS UNDER DEFINED CONDITIONS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2013년 3월 13일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/779,564의 이익을 청구한다.
연방정부 지원 연구/ 개발에 대한 언급
본 발명은 미국국립보건원에 제공된 승인 번호 HL099773 및 HL116221 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.
인간 만능성 줄기 세포 기법의 출현은 기능 연구 및 요법을 위해 시험관내에서 내피 및 조혈 세포를 생성할 기회를 제공하였다. 이전에 마우스 골수 기질 세포주인 OP9를 사용한 공동-배양 시스템을 이용하여 내피 및 혈액 계통으로의 인간 만능성 줄기 세포 (hPSC)의 효율적이고 확대가능한 분화가 확립되었다. 그러나, 마우스 공급자 세포 및 혈청 (즉, 이종 공급원)에 의존적인 공동-배양 시스템은 특이적 성장 인자에 대한 hPSC 반응 연구에 있어서 제한된 유용성을 갖는다. 게다가, 이러한 시스템은 임상 등급의 치료학적 혈액 세포의 제작에 있어서 고려되는 경우 추가의 한계를 갖는다.
종래 배양 시스템의 단점에 비추어 보면, 이종 오염의 도입 위험 없이 임상 현장에 사용하기에 적합한 내피 및 혈액 계통의 공급원을 제공하는 새로운 배양 시스템이 필요하다.
일 양태에서, 인간 만능성 줄기 세포를 분화시키는 방법으로서; (a) 인간 만능성 줄기 세포를 제공하는 단계; 및 (b) FGF2, BMP4, 액티빈　A, 및 LiCl을 포함하는 세포 배양 배지에서 저산소 조건하에서 약 2일의 기간 동안 인간 만능성 줄기 세포를 배양하여 중간엽혈관모세포 (mesenchymoangioblast) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포의 세포 군집을 형성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 본 방법은 또한 (c) 단계 (b)의 원시 중배엽 스테이지의 세포를 약 1-2일의 기간 동안 저산소 조건하에서 구성요소 FGF2 및 VEGF를 포함하는 혼합물에 노출시켜 OP9 세포에서 배양될 경우 혈관내피 (hematoendothelial) 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 혈관 (hematovascular) 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo /-) 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽을 포함하는 개체군을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 추가로 (d) 단계 (c)의 혈관 중배엽 스테이지의 세포를 약 1일 동안 구성요소 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, 및 IL3을 포함하는 혼합물에 노출시켜 CD144+CD73+CD235a/CD43- 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- 혈관형성 조혈 전구체 (AHP), 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포의 형성을 달성하는 단계를 포함한다. 추가의 구체예에서, 본 방법은 또한 (e) HEP 및 신생 조혈 전구체 세포를 약 3일 동안 정상 산소하에 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3의 혼합물에 계속 노출시켜 조혈 확장을 유도하여 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체 및 CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 (erythromegakaryocytic) 전구체로 구성된 CD43+ 조혈 전구체 군집을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법 중 임의의 방법에 사용될 방법은 언급된 구성요소로 본질적으로 구성된다. 일부 구체예에서, 사용될 혼합물은 이종항원을 비함유한다.
일부 구체예에서, 인간 만능성 줄기 세포는 테나신(Tenascin)-C로 처리된 기질 상에 제공된다.
추가의 양태에서, 하기 성분으로 보충된 IF9S 배지를 포함하는 인간 만능성 줄기 세포 분화용 이종항원-비함유 배양 배지가 본원에 제공된다: 약 50 내지 약 250 ng/ml BMP4; 약 10 내지 약 15 ng/ml 액티빈 A; 약 10 내지 약 50 ng/ml FGF2; 및 약 1 mM 내지 약 2 mM LiCl.
관련 양태에서, 하기 성분으로 보충된 IF9S 배지를 포함하는 인간 만능성 줄기 세포 분화용 이종항원-비함유 배양 배지가 본원에 제공된다: 약 10 내지 약 50 ng/ml FGF2; 및 약 20 내지 약 50 ng/ml VEGF. 일부 구체예에서, 배지가 FGF2 및 VEGF를 함유하는 경우, 배지는 또한 조혈 사이토킨을 포함한다. 일부 구체예에서, 조혈 사이토킨은 하기를 포함한다: 약 50 내지 약 100 ng/ml SCF; 약 50 내지 약 100 ng/ml TPO; 약 50 내지 약 100 ng/ml IL-6; 및 약 5 내지 약 15 ng/ml IL-3. 일부 구체예에서, 임의의 상기 배지는 IF9S 배지 및 보충된 구성 성분으로 본질적으로 구성된다. 일부 구체예에서, 임의의 상기 배지는 농축된 형태로 제공된다.
또 다른 양태에서, 인간 만능성 줄기 세포의 중배엽, 내피 및 조혈 전구체 세포로의 분화를 위한 이종항원-비함유 세포 배양 시스템으로서, 적어도 약 0.25 ㎍/cm2 내지 1 ㎍/cm2 농도로 테나신 C 층을 포함하는 기질 상에 단일 세포 현탁액으로서 시딩된 인간 만능성 줄기 세포; 및 약 50 내지 약 250 ng/ml BMP4; 약 10 내지 약 15 ng/ml 액티빈 A; 약 10 내지 약 50 ng/ml FGF2; 및 약 1 내지 약 2 mM LiCl로 보충된 IF9S 배지를 포함하는 이종항원-비함유 배양 배지를 포함하는 배양 시스템이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 만능성 줄기 세포를 분화시키는 방법으로서, (a) 인간 만능성 줄기 세포를 제공하는 단계; (b) 테나신 C로 처리된 기질 상에 단일 세포 현탁액으로서의 세포를 시딩하는 단계; 및 (c) 약 2일의 기간 동안 저산소 조건하에서 BMP4, 액티빈 A, FGF2, 및 LiCl로 보충된 IF9S 배지에서 시딩된 세포를 배양하여 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 약 30% EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포을 수득하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 약 1-2일 동안 저산소 조건하에 FGF2 및 VEGF로 보충된 IF9S 배지에서 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 스테이지의 세포를 배양하여, OP9 세포에서 배양시 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFR알파lo /- 혈관 중배엽 전구체 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 인간 만능성 줄기 세포를 분화시키는 상기 임의의 방법에 의해 발생한 정제된 세포 군집으로서, 세포는 비-인간 구성요소에 노출되지 않았던 세포인 군집이 본원에 제공된다.
관련 양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 정제된 세포 군집으로서, 세포가 중간엽혈관모세포 콜로니를 형성할 잠재성을 갖는 약 35% 초과의 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포인 세포 군집이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 정제된 세포 군집으로서, 세포는 OP9 세포에서 배양될 경우 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 30% 초과의 EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/- 혈관 중배엽 세포 및 약 35% 초과의 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽인, 정제된 세포 군집이 본원에 제공된다.
추가의 양태에서, CD144+CD73-CD235a/43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43+CD41a- 혈관형성 조혈 전구체, 및 CD144+CD73+CD235a/43- 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP)를 포함하는 CD144+ 세포를 약 40% 초과로 포함하는 정제된 세포 군집이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 전구체 및 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체로 구성된 CD43+ 조혈 전구체 세포를 약 30% 초과로 포함하는 세포 군집이 본원에 제공된다.
추가의 양태에서, 중간엽혈관모세포를 생성하는 방법으로서, (a) 인간 만능성 줄기 세포를 제공하는 단계; (b) 유효량의 콜라겐으로 처리된 기질 상으로 세포를 시딩하는 단계; 및 (c) 줄기 세포를 약 2일의 기간 동안 저산소 조건하에 FGF2, BMP4, 액티빈 A, 및 LiCl을 포함하는 혼합물에 노출시켜 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포의 군집을 형성시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 사용되는 콜라겐은 콜라겐 IV를 포함한다.
여전히 또 다른 양태에서, 하기 성분들을 포함하는, 인간 만능성 줄기 세포 분화용 세포 배양 배지가 본원에 제공된다: 64 mg/L L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염, 40 ㎕/L 모노티오글리세롤, 8.4 ㎍/L 부가적 소듐 셀레나이트, 10 mg/L 폴리비닐 알콜, 1x 글루타맥스 (GLUTAMAX), 1x 비필수 아미노산, 0.1x 화학적으로-규정된 리피드 농축물, 10.6　mg/L 홀로-트랜스페린 (Holo-Transferrin), 및 20 mg/L 인슐린.
추가의 양태에서, 인간 만능성 줄기 세포를 분화하는 방법으로서, (a) 인간 만능성 줄기 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 약 2일의 기간 동안 FGF2, BMP4, 액티빈　A, 및 LiCl를 포함하는 세포 배양 배지에서 저산소 조건하에 인간 만능성 줄기 세포를 배양하여 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파 + 원시 중배엽 세포의 세포 군집을 형성시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
일부 구체예에서, 인간 만능성 줄기 세포는 테나신 C 상에서 배양된다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 IF9S 세포 배양 배지를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지중 BMP4의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 250 mg/ml이며; 액티빈 A의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 15 ng/ml이며; FGF2의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml이며; LiCl의 농도는 약 1 mM 내지 약 2 mM이다.
일부 구체예에서, 본 방법은 (c) 약 1-2일의 기간 동안 FGF2 및 VEGF를 포함하는 세포 배양 배지에서 단계 (b)에서 수득된 세포 군집을 저산소 조건하에서 배양하여 OP9 세포에서 배양할 경우 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 혈관 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo /-) 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파 + 원시 중배엽을 포함하는 세포 군집을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지에서 FGF2의 농도는 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml이며; VEGF의 농도는 약 20 ng/ml 내지 약 50 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 본 방법은 (d) 약 1일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, 및 IL3을 포함하는 세포 배양 배지에서 단계 (c)의 혈관 중배엽 세포를 저산소 조건하에서 배양하여 CD144+CD73+CD235a/CD43- 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- 혈관형성 조혈 전구체 (AHP), 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포를 포함하는 세포 군집을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지 중의 FGF2의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 50　ng/ml이며; VEGF의 농도는 약 20 ng/ml 내지 약 50 ng/ml이며; SCF의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100　ng/ml이며; TPO의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml이며; IL-6의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100　ng/ml이고, IL-3의 농도는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 본 방법은 (e) 약 3일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3을 포함하는 배양 배지에서 HEP 및 조혈 전구체 세포를 정상 산소하에 배양시켜 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체 및 CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 전구체를 포함하는 CD43+ 조혈 전구체의 확장된 군집을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 DLL4를 과다발현하는 OP9 세포에서 약 3주의 기간 동안 CD34+CD43+ 조혈 전구체의 확장된 군집을 공동배양하여 CD4+CD8+ 이중 파지티브 T 세포를 포함하는 세포 군집을 수득하는 것을 추가로 포함하며, 단계 (b)의 인간 만능성 줄기 세포는 테나신 C 기질 상에서 배양된다.
관련 양태에서, 인간 만능성 줄기 세포를 분화시키는 방법으로서, (i) 약 2일의 기간 동안 FGF2, BMP4, 액티빈 A, 및 LiCl를 포함하는 세포 배양 배지에서 저산소 조건하에 인간 만능성 줄기 세포를 배양하여 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포의 세포 군집을 형성시키는 단계; (ii) 약 1-2일의 기간 동안 FGF2 및 VEGF를 포함하는 세포 배양 배지에서 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포를 저산소 조건하에 배양하여 OP9 세포에서 배양될 경우 혈관내피 클러스터를 형설할 잠재성을 갖는 세포에서 풍부한 혈관 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/-) 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽을 포함하는 세포 개체군을 수득하는 단계; (iii) 약 1일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, 및 IL3을 포함하는 세포 배양 배지에서 혈관 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo /-) 세포를 저산소 조건하에 배양하여 CD144+CD73+CD235a/CD43- 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- 혈관형성 조혈 전구체 (AHP), 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포의 형성을 달성하는 단계; (iv) 약 3일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3을 포함하는 배양 배지에서 헤모제닉 내피 전구체 (HEP) 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포를 저산소 하에 배양하여 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체 및 CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 전구체를 포함하는 CD43+ 조혈 전구체의 확장된 군집을 수득하는 단계; 및 (v) DLL4를 과다발현하는 OP9 세포 상에서 약 3주의 기간 동안 CD34+CD43+ 조혈 전구체를 공동배양하여 CD4+CD8+ T 세포를 포함하는 세포 군집을 수득하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 양태에서, 기본 배지, L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염, 모노티오글리세롤, 부가적 소듐 셀레나이트, 폴리비닐 알콜, 글루타맥스TM, 비필수 아미노산 (NEAA), 화학적으로 규정된 리피드 농축물, 홀로-트랜스페린, 및 인슐린을 포함하는 인간 만능성 줄기 세포의 혈관내피 분화에 적합한 세포 배양 배지가 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 BMP4, 액티빈 A, FGF2, 및 LiCl를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서, 배양 배지는 FGF2 및 VEGF를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서, 배양 배지는FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL-6, 및 IL-3를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 IF9S 배지를 포함한다. 일부 구체예에서, IF9S 세포 배양 배지는 표 2의 IF9S 세포 배양 배지 포뮬레이션을 갖는다.
관련된 양태에서, 9S 농축 배지 보충물이 본원에 제공되며, IMDM/F12 기본 배지에 9S 농축 배지 보충물을 희석하여 IF9S 세포 배양 배지를 생성한다. 일 구체예에서, 9S 농축 배지 보충물, 및 BMP4, 액티빈 A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, IL-3, 및 테나신 C 중 하나 이상을 포함하는 키트이다.
추가의 양태에서, 인간 만능성 줄기 세포 또는 혈관내피 계통을 따른 이들의 분화된 자손의 접착 성장을 위한 테나신 C 기질 및 IF9S 세포 배양 배지를 포함하는, 인간 만능성 줄기 세포의 혈관내피 분화를 위한 규정된 세포 배양 시스템이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, IF9S 세포 배양 배지는 저산소 조건하에 유지된다. 일부 구체예에서, 규정된 세포 배양 시스템은 테나신 C 기질 상에 성장한 인간 만능성 줄기 세포를 추가로 포함한다.
참조 통합
본 명세서에 언급된 모든 공개문, 특허 및 특허 출원은, 각 개별적인 공개문, 특허 및 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 통합되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 통합된다.
도 1은 조혈 발생 경로, 특이적 마커 및 각 발생 스테이지를 동정하는데 이용된 기능 검정, 및 화학적으로 규정된 배지에서 hPSC 분화에 이용된 조건을 보여주는 조혈 분화의 개략적 디아그램을 보여준다. OP9 공급자와의 공동배양 및 현재 화학적으로 규정된 배양을 이용한 분화 연구 전 관찰된 주요 세포 서브셋이 도시된다.
도 2. 과다성장한 OP9 기질 세포의 독특한 분자 시그내처의 동정. ( a) 과다성장 OP9 8일 대 신선한 컨플루언트 OP9 4일 및 MS5 및 S17에서의 상이하게 발현된 유전자 간의 중복을 보여주는 벤 디아그램. 회색 배경으로 표시된 21개 유전자는 모든 다른 평가된 세포주와 비교하여 OP9 세포 8일에서 독특하게 과다발현된다. (b) (a)에서 도시된 바와 같은 상이하게 발현된 중복 유전자의 히트 맵 (heat map). 테나신-C (Tnc)는 과다-컨플루언트 OP9 세포에서 최고로 상이하게 과다발현된 유전자 중 하나이다.
도 3. 화학적으로 규정된 조건하에 2, 3 및 4일 동안 ColIV vs TenC 상에서 분화된 hESC 배양에서 중배엽 발생. (a) 2 및 3일에서 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ (A+P+) 원시 중배엽 군집의 백분율을 비교한 유세포계수 플롯 및 그래프. (b) 4일에서 KDRhiCD31- (HVMP), CD31+, 및 KDRloCD31- 군집의 백분율을 비교한 유세포계수 플롯 및 그래프. (c) 2일, 3일 및 4일 배양의 MB/HB-콜로니 형성 잠재성의 비교. (d) 7일 동안 OP9와의 공동배양 후 화학적으로 규정된 조건하에 4일 분화된 세포로부터 분리된 KDRhiCD31- 및 KDRloCD31- 세포의 조혈 및 내피 잠재성. 상부 패널은 TRA-1-85+ 게이팅된 인간 세포의 유세포계수를 보여주며, 하부 패널은 KDRhiCD31- 및 KDRloCD31- 세포와의 OP9 공동배양으로부터 세포의 면역형광 염색을 보여준다. (a), (b) 및 (c) 막대는 3개 실험으로부터 평균 + SE이다 (*p<0.01).
도 4. 화학적으로 규정된 조건하에 5일 동안 ColIV 또는 TenC 상에서 분화된 배양물에서 내피 전구체의 발생. (a) 유세포계수 분석은 ColIV 및 TenC에서 화학적으로 규정된 조건하에 hESC 배양 5일 후 생성된 VE-카드헤린+ (VEC; CD144+) 전구체의 주요 서브셋을 입증한다. (b) ColIV 및 TenC 배양에서 생성된 VEC+ (CD144+) 세포 및 세브셋의 백분율. 오차 막대는 3개 실험으로부터의 평균 + SE이다 (*p<0.01). (c) FGF2 및 조혈 사이토킨을 갖는 무혈청 클론형성 배지에서 분리된 VEC+ (CD144+) 서브셋의 CFC 잠재성. (d) 5일 VEC+ (CD144+) 서브셋의 내피 및 조혈 잠재성. 후에 튜브 형성 검정되는 내피 조건에서 또는 7일 후에 면역형광 및 유세포계수 결과를 갖는 OP9 상에서 저장되고 배양된 전구체 서브셋. 기준 막대, 100 μm.
도 5. 화학적 규정된 조건하에 8일 동안 ColIV 상에서 분화된 배양물에서 조혈 전구체의 발생. (a) 유세포계수 분석은 ColIV 및 TenC 상의 배양물에서 생성된 CD43+ 세포의 주요 서브셋을 보여준다. (b) TenC 상의 배양물은 3개 실험에 걸쳐 현저하게 더 많은 CD43+ 세포를 생성한다 (*p<0.01). (c) 혈청-함유 배지에서 조혈-CFC 잠재성은 CD43+ 아군집으로 제한된다. (d) TenC 상에서 분화된 배양물은 ColIV 상에서 분화된 배양물보다 더 높은 CFC 잠재성을 가지며, 이는 3개 실험에 걸쳐 통계학적으로 유의하다 (*p<0.01).
도 6. 9일 동안 화학적으로 규정된 조건하에 ColIV 및 TenC 상에서 분화된 H1 hESC로부터 수집된 CD43+ 세포의 T 세포 잠재성. (a) 3주 동안 OP9DLL4 상에서의 배양 후 ColIV 및 TenC 조건으로부터 수집된 세포의 유세포계수 분석. (b) 게놈 PCR에 의한 T 세포 수용체 재배열을 위한 분석. H1 T-세포는 분화하는 H1으로부터 유래된 T-세포이며; PB 대조군은 말초 혈액 파지티브 대조군이며; H1 hESC는 비분화된 H1 hESC이다.
도 7. 화학적으로 규정된 조건하에 H1 hESC로부터 조혈 발생에 대한 TGFβ 억제제의 효과. 단지 2일 내지 4일의 TGFβ 억제제 SB-431542의 첨가 후 3, 4, 5 및 8일 분화의 유세포계수로부터 수집된 대표적인 도트 플롯. 3일째에, SB-431542는 PDGFR알파 발현을 감소시키나, 4일 및 5일까지 내피 전구체를 증가시킨다. 8일까지, CD43+ 조혈 전구체의 현저한 증가가 존재한다.
도 8. 다양한 기본 배지 및 매트릭스 단백질을 사용한 배양에서 KDR hi CD31 + 혈관내피 전구체의 생성. TeSR1 기저 배지는 사이토킨이 부재하는 TeSR1이다. DF4S는 하기 4개의 보충물이 보충된 DMEM/F12-기본 배지이다; 64 mg/L L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염, 8.4 ㎍/L 소듐 셀레나이트, 10.6 mg/L 홀로-트랜스페린, 및 20 mg/L 인슐린. I4S는 DMEM/F12-기재 배지 대신의 IMDM-기재 배지를 갖는 DF4S이나, 상기 4개의 언급된 보충물을 갖는다. IF4S는 DMEM/F12-기재 배지 대신의 IMDM/F12-기재 배지를 갖는 DF4S이나, 상기 4개의 언급된 보충물을 갖는다. VTN은 비트로넥틴 매트릭스이며; MTG는 Matrigel® 기질이며; ColIV는 콜라겐 IV 매트릭스이다. 유세포계수 플롯은 저산소 조건하에 50 ng/ml FGF2, BMP4 및 VEGF가 보충된 각 배지에서 분화된 4일 세포의 KDRhiCD31+ 내피 전구체의 퍼센트를 보여준다.
도 9. 화학적으로 규정된 조건하에 iPSC 및 H9 hESC의 조혈 분화. 상부 패널은, 세포를 TenC 또는 ColIV 상에 플레이팅할 경우 -1일부터 출발하여 9일까지의 분화 배양물에서 생성된 세포의 수를 나타낸다. CD31+ 및 CD43+ 세포의 수는 전체 세포 수 곱하기 유세포계수를 기반으로 하는 파지티브 세포의 백분율을 기반으로 계산된다. 하부 패널은 ColIV 또는 TenC 상의 8일 동안 분화된 19-9-7T 인간 섬유아 iPSC 주, BM19-9 인간 골수-유래된 iPSC 주, 및 H9 인간 ESC 주의 CD43+ 세포 및 이들의 서브셋의 백분율의 도트 플롯을 나타낸다.
도 10은 콜라겐 IV vs 테나신 C 상의 분화 효율을 비교하는 조혈 분화 시각표의 디아그램이다.
인간 만능성 줄기 세포 (hPSC) 기법은 HLA-매칭된 도너에 의존적이지 않은 환자-특이적 혈액 세포를 개발하고 시험관내에서의 인간 발달을 연구할 기회를 제공한다. 이전에 마우스 기질 세포주 OP9 상에서 공동배양 방법을 이용한 조혈 줄기/전구체 세포의 분화를 위한 효율적인 프로토콜이 개발되었다 (Vodyanik, et al., 2005; Vodyanik, et al., 2006). 이러한 시스템은 조혈의 원시 및 최종 웨이브를 재생하며, T 세포 및 B 세포를 포함하는 림프계 세포 및 HSC 표현형을 갖는 lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD117+CD43+CD45-/+ 다능성 최종 조혈 전구체를 수득하는데 사용될 수 있다 (Carpenter, et al., 2011; Kutlesa, et al., 2009; Schmitt and Zuniga-Pflucker, 2002; Vodyanik, et al., 2005).
OP9 세포와의 인간 만능성 줄기 세포 공동배양은 중내배엽 및 헤모제닉 내피 분화를 유도한다. OP9 세포 상으로의 hPSC 플레이팅시, hPSC는 중배엽 마커 아펠린 수용체 (APLNR), VEGFR2 (KDR), 및 PDGFR알파를 발현하기 시작하며, 중간엽혈관모세포 (MB) 및 혈관모세포 (HB) 잠재성 (2-3일 분화)을 획득한다. 발전적 성숙을 이용하여, KDR+APLNR+ 중배엽 세포는 KDR 발현을 상향조절하며, PDGFRα를 하향조절하는데, 이는 OP9 세포 상에서 배양될 경우 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 세포에서 풍부하다.
분화 2-3.5일에, KDR+APLNR+ 세포는 전형적인 내피 (Endothelial) (CD31, VE-카드헤린 (CD144)), 내피/중간엽 (Mesenchymal) (CD73, CD105) 및 조혈 (Hematopoietic) (CD43, CD45) 마커가 결여되어 있으며, 즉 EMHlin- 표현형을 갖는다. EMHlin- 세포는 내피 (CD31 및 CD144), 중간엽/내피 (CD73, CD105), 및 조혈 (CD43 및 CD45) 마커가 결여되어 있는 반면, lin- 세포는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, 및 CD20를 포함하는 분화된 조혈 세포의 마커가 결여되어 있다. 4일에 VE-카드헤린+ (CD144) 세포가 출현하였다. 신생 VE-카드헤린+ 세포는 이종 개체군을 나타내며, 이는 CD144+CD235a/43-CD73+ 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP), CD144+CD73-CD235a/43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP) 및 CD144+73-CD43+CD235a+CD41a-, 혈관형성 조혈 전구체를 포함한다. HEP는 다능성 lin-CD34+CD43+CD45+/- 조혈 전구체를 생기게 할 잠재성을 갖는다.
불행히도, OP9 시스템은 마우스 공급자 세포 및 혈청에 의존적이며, 이는 특이적 성장 인자에 대한 hPSC 반응 연구 및 임상 등급의 치료학적 혈액 세포의 제작에 있어서의 이의 유용성을 제한한다. 또한, OP9 공동배양 시스템은 혈청 질, 기질 세포 유지 및 분화에 사용된 PSC 콜로니의 크기 변화에 매우 민감하다.
다른 연구자들이 공급자-비함유 분화 프로토콜을 개발하였으나, 이러한 프로토콜은 조혈 분화를 위한 배양체 (EB) 형성에 의존적이다. EB 방법은 혈청에 종종 의존적이며, 또한 현저한 단점 예컨대, 비동시성 분화 및 높은 변동성을 갖는다. 무혈청 조건하에 조혈을 유도하기 위한 수개의 프로토콜이 최근 개발되었다 (Salvagiotto, et al., 2011; Wang, et al., 2012); 그러나, 이들은 이종 성분들, 혈청알부민 및/또는 전유 (proprietary) 보충물을 여전히 필요로 한다. 또한, 이들 프로토콜은 OP9에서 관찰된 것과 구별되는 조혈 웨이브를 재생하는지의 여부는 여전히 불분명하다.
또한, 대부분의 프로토콜은 MEF 또는 Matrigel®에서 성장한 hPSC를 분화시킨다. hPSC-유래 및 유지를 위한 신규하고 완전히 화학적으로-규정된 이종항원-비함유 배지 및 매트릭스가 기술되어 있기 때문에 (Chen, et al., 2011), hPSC로부터 조혈 전구체를 유도하기 위한 유사한 화학적으로-규정된 이종항원-비함유 유도 분화 프로토콜을 개발할 필요가 있다.
본 명세서에서 달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해분야의 통상의 기술을 갖는 당업자에 의해 그리고, 공개된 문헌을 참조로 하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
단수 형태는 하나 이상을 나타내는 것으로 주지되어야 하며, 예를 들어, "분자"는 하나 이상의 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 단수 형태, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 해당 수의 규모의 +/- 10%의 그 수에 대한 값의 범위를 고려한다. 예를 들어, "약 3 그램"은 2.7 내지 3.3 그램 등을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "규정된 조건" 또는 "규정된 배지"는 각 성분의 정체 및 양이 공지되어 있음을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "성분"은 구성요소로서, 이의 분자 정체 및 양이 공지되어 있는 구성요소를 나타낸다.
완전하게 규정된 이종항원-비함유 시스템에서 조기 중배엽, 혈관 중배엽 전구체, 및 헤모제닉 내피 스테이지를 통한 OP9 공동-배양 시스템에서 관찰된 조혈 발생을 개괄하는 효율적이고 재현가능한 방법 및 지지 조성물이 본원에 기재되어 있다.
표 1은 본원에 사용된 세포 유형, 관련된 세포 마커 표현형 및 상응하는 약어의 목록을 제공한다.
표 1 최근 적용에서 제시된 hPSC로부터 혈관형성 및 조혈 잠재성을 갖는 서브셋의 표현형 특징 및 정의
약어 표현형 설계/정의
PM
A+P+ 		EHMlin-APLNR+PDGFR알파 GFR 전형적인 원시 스트레이크 및 측판/배아외 중배엽 유전자를 발현하는 세포에서 풍분한 원시 후방 중배엽 (PM). 이들 세포는 FGF2에 반응하여 무혈청 배지에서 중간엽혈관모세포 (MB) 및 혈관모세포 (HB) 콜로니를 형성할 잠재성을 갖는다.
HVMP EHMlin-APLNR+KDRbrightPDGFR알파low /- 양기능성 혈관내피 클러스터 형성 세포에서 고도로 풍부하고 원시 스트레이크 유전자의 발현이 결여된 혈관 중배엽 전구체.
HEP CD144+CD235a/CD43-CD73- 주요 내피 특징, 결여된 조혈 CFC 잠재성 및 표면 마커를 가지나, 기질 세포와의 공동배양시 혈액 및 내피 세포를 발생시킬 수 있는 헤모제닉 내피 전구체.
비-HEP CD144+CD235a/CD43-CD73+ 내피 세포의 모든 기능적 및 분자 특징을 가지며, OP9 상의 내피 콜로니를 형성하는 비-헤모제닉 내피 전구체.
AHP CD144+CD235a/CD43+CD73-CD41a- 주요 조혈 특징 및 FGF2 및 조혈 사이토킨-의존적 콜로니-형성 잠재성을 가지나 내피 세포를 생성할 수 있는 혈관형성 혈액 전구체.
CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 전구체에서 풍부한 조혈 전구체.
lin-CD34+CD43+CD45+/- 골수림프 (myelolymphoid) 잠재성을 갖는 다능성 조혈 전구체
인간 만능성 줄기 세포 ( hPSC )의 혈관내피 분화 방법
규정된 조건하에 및 바람직하게는, 배양제 형성의 부재하에 인간 만능성 줄기 세포 (인간 배아 또는 인간 유도된 다능성 줄기 세포)의 분화 방법이 본원에 기술되어 있다. 이러한 분화의 적어도 하나의 요망되는 결과는 이들 계통의 기능 연구를 위한 공급원은 물론 임상 요법에 대한 공급원이 될 수 있는 내피 및 조혈 세포 군집의 공급이다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 분화 방법은 (a) 인간 만능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 또는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hiPSC))를 제공하는 단계 및 (b) 약 2일의 기간 동안 FGF2, BMP4, 액티빈 A, 및 LiCl를 포함하는 세포 배양 배지에서 저산소 조건하에 인간 만능성 줄기 세포를 배양하여 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포의 세포 군집을 형성시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 인간 만능성 줄기 세포는 배양체의 형성 없이 배양된다.
일부 구체예에서, 인간 만능성 줄기 세포는 약 5000 세포/cm2 내지 약 15,000 세포/cm2, 예를 들어, 6000 세포/cm2, 7000 세포/cm2, 8000 세포/cm2, 9000 세포/cm2의 초기 밀도, 또는 약 5000 세포/cm2 내지 약 15,000 세포/cm2의 또 다른 플레이팅 밀도로 플레이팅된다. 일부 구체예에서, 분화 방법은 (c) 약 1-2일의 기간 동안 FGF2 및 VEGF를 포함하는 세포 배양 배지에서 단계 (b)에서 수득된 세포 군집을 저산소 조건하에 배양하여 OP9 세포에서 배양될 경우 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 세포에서 풍부한 혈관 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/-) 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽을 포함하는 세포 군집을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 분화 방법은 (d) 약 1일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, 및 IL3를 포함하는 세포 배양 배지에서 저산소 조건하에 단계 (c)의 혈관 중배엽 세포를 배양하여 CD144+CD73+CD235a/CD43- 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- 혈관형성 조혈 전구체 (AHP), 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포의 형성을 달성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 분화 방법은 (e) 약 3일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3를 포함하는 배양 배지에서 정상 산소하에 HEP 및 조혈 전구체 세포를 배양하여 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체 및 CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 전구체를 포함하는 CD43+ 조혈 전구체의 확장된 군집을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 분화 방법은 (i) 약 2일의 기간 동안 FGF2, BMP4, 액티빈 A, 및 LiCl를 포함하는 세포 배양 배지에서 저산소 조건하에 배양체 형성 없이 인간 만능성 줄기 세포를 배양하여 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포의 세포 군집을 형성시키는 단계; (ii) 약 1-2일의 기간 동안 FGF2 및 VEGF를 포함하는 세포 배양 배지에서 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포를 저산소 조건하에 배양하여 OP9 세포에서 배양될 경우 혈관내피 클러스터를 형설할 잠재성을 갖는 세포에서 풍부한 혈관 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/-) 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽을 포함하는 세포 개체군을 수득하는 단계; (iii) 약 1일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, 및 IL3을 포함하는 세포 배양 배지에서 혈관 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/-) 세포를 저산소 조건하에 배양하여 CD144+CD73+CD235a/CD43- 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- 혈관형성 조혈 전구체 (AHP), 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포의 형성을 달성하는 단계; 및 (iv) 약 3일 동안 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3을 포함하는 배양 배지에서 헤모제닉 내피 전구체 (HEP) 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포를 저산소 하에 배양하여 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체 및 CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 전구체를 포함하는 CD43+ 조혈 전구체의 확장된 군집을 수득하는 단계중 적어도 하나의 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 저산소 조건은 약 3% O2 내지 약 10% O2의 주위 산소 (예를 들어, 세포 배양 인큐베이터 기체 혼합물) 수준을 나타낸다. 일부 구체예에서, 저산소 조건은 약 5% O2이다. 저산소 조건하에 세포 배양 배지의 평형이 허용되는 구체예에서, 세포 배양 배지는 정상 산소 조건 (예를 들어, 약 20% 산소를 함유하는 기체 혼합물) 하에 평형화된 세포 배양 배지와 비교하여 더 낮은 용해된 산소 수준으로 인해 저산소 세포 배양 배지가 된다.
일부 구체예에서, 상기 기술된 분화 방법 중 임의의 방법에 사용될 배양 배지는 본원에 기술된 IF9S 배지를 포함한다. 일 구체예에서, 사용될 IF9S 배지는 표 2에 제시된 포뮬레이션을 갖는 IF9S 배지이다.
일부 구체예에서, 임의의 상기-언급된 세포 (예를 들어, 인간 만능성 줄기 세포)는 테나신 C 상에서 배양된다. 일부 구체예에서, 임의의 언급된 세포는 기질에 10,000 세포/cm2를 접착시키기에 충분한 양의 테나신-C로 처리된 기질상에 시딩된다. 일부 구체예에서, 사용될 테나신-C는 인간 테나신 C이다. 일부 구체예에서, 기재는 적어도 약 0.25 ㎍/cm2 내지 1 ㎍/cm2, 예를 들어, 0.4 ㎍/cm2, 0.5 ㎍/cm2, 0.7 ㎍/cm2, 0.8 ㎍/cm2의 농도 또는 적어도 약 0.25 ㎍/cm2 내지 1 ㎍/cm2의 또 다른 농도의 테나신 C로 처리된다.
일부 구체예에서, 상기 기술된 분화 방법에 사용될 세포 배양 배지에서, BMP4의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 250　mg/ml이며; 액티빈 A의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 15 ng/ml이며; FGF2의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 50　ng/ml이며; LiCl의 농도는 약 1 mM 내지 약 2 mM이며; VEGF의 농도는 약 20 ng/ml 내지 약 50 ng/ml이며; SCF의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml이며; TPO의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml이며; IL-6의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml이고, IL-3의 농도는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 상기-언급된 임의의 세포는 이종항원-비함유 세포 배양 배지에서 배양된다. 임상 요법에서 가장 중요한 점은 유래된 세포 군집에서 이종 물질의 부재 즉, 비-인간 세포, 세포 단편, 혈청, 단백질 등의 부재이다. 바람직하게는, 본 발명은 플랫폼으로서 테나신 C 또는 콜라겐 IV의 사용에 의해 이종항원-비함유 분화된 세포에 도달하며, 이는 조기 분화 시스템에 사용된 OP9 세포와의 접촉을 근본적으로 대신한다. 또한, 본원에 기술된 배지는 화학적으로-규정된 것이며, 일부 구체예에서 이종항원-비함유로 제조되며, 동물-유래된 단백질 대신에 다른 인간 조직 또는 태반으로부터 유래되거나 재조합 기법을 이용하여 생성될 수 있는 인간 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 배지에 첨가되는 모든 단백질은 재조합 단백질이다.
분화 과정은 정연한 순차적인 사건이지만, 사건의 시기는 적어도 20% 만큼 변화될 수 있다. 예를 들어, 특정 단계가 1일 지속되는 것으로서 일 구체예에서 기술될 수 있으나, 사건은 대략 1일 동안 지속될 수 있다. 예를 들어, "1일"은 약 18 내지 약 30 시간의 기간을 포함할 수 있다. 수일 기간으로 기재된 기간은 다수의 "1일"일 수 있으며, 예컨대, 예를 들어, 2일은 약 36 내지 약 60시간 등의 기간으로 확대될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 시간 변동은 줄어들 수 있는데, 예를 들어, 2일은 d0부터 48 +/- 3 시간이며; 4일은 d0부터 96 +/- 3 시간이며, 5일은 d0부터 120 시간 +/- 3 시간이다.
본 발명에 의해 수득가능한 분화된 계통 및/또는 할당된 잠재성의 예로는 HB 및 MB CFC 잠재성을 갖는 KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포, OP9 세포에서 배양될 경우 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/- 혈관 중배엽 세포, VE-카드헤린+ (CD144+) 서브셋 세포, 예컨대, HEP (CD144+CD73-CD235a/43-, 비-HEPS (CD144+CD73+CD235a/43-, 및 AHP (CD144+CD73-CD235a/43+41a-), CD43+ 조혈 전구체 세포 예컨대, CD43+CD235a+41a+ 에리트로거대핵세포 조혈 전구체, 및 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 계통- ("lin-)은 아직 이의 임의의 유도성 혈액 세포 계통으로 할당되지 않은 조혈 전구체 또는 전구체 세포로서 지칭되는데, 이들 중 어느 것으로도 분화될 능력을 보유하기 때문이다. 이러한 특징은 임의의 유도성 계통으로의 분화를 나타내는 세포 표면 마커의 부재에 대한 관찰에 의해 모니터링된다. 본 발명의 추가의 유의한 이점은 테나신 C 플랫폼으로 인한 클론 세포 군집을 이용하여 분화된 군집을 생성할 능력에 있으며, 상기 플랫폼은 세포 클럼프 예컨대, 배양체에 공통적인 비규정되는 추계학적 사건에 대한 의존성을 제거한다. 게다가, 클론 세포 군집은 분화 과정 동안 더욱 큰 균일성을 나타내며, 이는 공급자 세포 시스템에서 이전에 관찰된 것보다 더 높은 수율의 동시발생된 세포를 제공한다. 따라서, 본 기재 내용은 또한 종래의 이용가능한 것보다 더욱 유효하고, 더욱 우수한 확장가능한 분화 시스템을 기술한다.
조성물
규정된 세포 배양 배지 및 농축된 배지 보충물
본원의 일부 구체예는 기본 배지, L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염, 모노티오글리세롤, 소듐 셀레나이트 (기본 배지에 임의의 존재하는 것 이외에), 폴리비닐 알콜, 글루타맥스™, 비필수 아미노산 (NEAA), 화학적으로 규정된 리피드 농축물, 홀로-트랜스페린, 및 인슐린을 포함하는 분화 배지를 기술한다. 본원에 기술된 분화 배지에 적합한 기본 배지는 비제한적으로, 이스코브 개질된 둘베코 배지 (Iscoves Modified Dulbecco's Medium)/F12 (IMDM/F12), mTeSR1™ 기본 배지인 TeSR1 기본 배지 (Stem Cell Technologies-see Ludwig and Thomson (2007), Curr Protoc Stem Cell Biol ., Chapter 1:Unit 1C.2 and U.S. Patent No. 7,449,334) (FGF2 및 TGF-베타 부재); Essential 8™ 배지인 DF4S 기본 배지 (Life Technologies; 또한, "E8" 배지로서 공지됨 - 문헌 [Chen and Thomson (2011), Nat Methods, 8(5):424-429] 및 미국 특허 출원 공개 번호 20120178166 참조)(FGF2 및 TGF-베타 부재), DMEM/F12 대신에 이스코브 개질된 둘베코 배지 (IMDM)를 갖는 DF4S 기본 배지인 I4S 기본 배지, 및 DMEM/F12 대신에 IMDM/F12을 갖는 DF4S 기본 배지인 IF4S 기본 배지를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 기본 배지는 알부민-비함유 배지이다. IMDM/F12는 첨가된 영양분 혼합물로 고밀도 세포 배양물을 신속하게 증식시키기에 적합한 고도로 풍부한 합성 배지이다.
일부 구체예에서, 본원에서 일반적으로 "IF9S" 배지로서 언급된 본원에 사용된 분화 배지는 IMDM/F12, L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염, 모노티오글리세롤, 소듐 셀레나이트 (기본 배지에 임의의 존재하는 것 이외에), 폴리비닐 알콜, 글루타맥스™, 비필수 아미노산 (NEAA), 화학적으로 규정된 리피드 농축물 (Life Technologies; Cat. No. 1905031), 홀로-트랜스페린, 및 인슐린을 포함한다.
일 구체예에서, IF9S 배지는 IMDM/F12 (1x), L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염 (64 mg/L), 모노티오글리세롤 (50 mg/L), 소듐 셀레나이트 (기본 배지에 존재하는 임의의 것 이외에; 8.4 ug/L), 폴리비닐 알콜 (10 mg/L), 글루타맥스™ (1x), NEAA (1x), 화학적으로 규정된 리피드 농축물 (0.1x), 홀로-트랜스페린 (10.6 mg/L), 및 인슐린 (20 mg/L)를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, hPSC의 혈관내피 분화의 다양한 시점/스테이지에서, 사용될 완전 분화 배지는 사이토킨, 성장 인자 및/또는 소분자의 다양한 조합물을 함유한다. 본원에 기술된 방법에 따라 혈관내피 분화의 스테이지에 따라, 적합한 완전 분화 배지는 본원에 기술된 완전 분화 배지에 대해 기술된 범위내의 농도를 갖는 사이토킨의 다양한 조합물로 보충될 것이다.
일부 구체예에서, 완전 분화 배지는 IF9S 배지, BMP4, 액티빈 A, FGF2, 및 LiCl를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 완전 분화 배지는 IF9S 배지, FGF2, 및 VEGF를 포함한다. 추가의 구체예에서, 완전 분화 배지는 IF9S 배지, FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL-6, 및 IL-3을 포함한다. 일부 구체예에서, 최종 완전 배지에서 BMP4의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 250　mg/ml이며; 액티빈 A의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 15 ng/ml이며; FGF2의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 50　ng/ml이며; LiCl의 농도는 약 1 mM 내지 약 2 mM이며; VEGF의 농도는 약 20 ng/ml 내지 약 50 ng/ml이며; SCF의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml이며; TPO의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml이며; IL-6의 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml이며, IL-3의 농도는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml이다. 일부 구체예에서, 완전 분화 배지에서 사용된 단백질 모두는 재조합 인간 단백질이다. 다른 구체예에서, 완전 분화 배지는 하나 이상의 비-인간 단백질 (예를 들어, 재조합 비-인간 단백질)을 포함한다.
일부 구체예에서, 완전 분화 배지는 IF9S 배지 및 지시된 농도의 표 3에 기록된 "사이토킨" 조합물 중 하나를 포함한다. 일부 구체예에서, 방금 언급된 완전 분화 배지에 사용된 IF9S 배지 포뮬레이션은 표 2에 기재된 IF9S 배지 포뮬레이션이다.
본원의 기술된 배지는 특정 모르포겐, 소분자 및 본원에 기술된 조혈 사이토킨을 포함할 수 있지만, 기재된 것을 이외에 또는 이들을 대신하여 당해 분야에 공지된 바와 같은 동일하거나, 등가이거나 유사한 특성을 갖는 추가적인 구성요소가 이용될 수 있음이 고려된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 배지는 이종 (즉, 비-인간, 생물학적 유래된) 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이종 물질은 이종 기원의 재조합 단백질일 수 있다. 본원에 기재된 배지는 또한, 사용 전에 희석되는 농축된 형태 예컨대, 2X, 10X, 100X, 또는 1000X 농축물로 제조될 수 있다.
게다가, 본 발명의 배지에서 특정 이종 물질의 대체는 단지 이종항원-비함유 배양 조건을 제시하는 것보다 더 크고 예상치 못한 이점을 제공하였다. 예를 들어, 폴리비닐 알콜로의 소 혈청알부민의 대체가 세포 생존에 예상치못하게 기여하는 "증점제" 배지로 이어지는 것으로 간주된다.
표 2. IF9S 배지의 예시적 구체예의 설명
Figure 112015098178665-pct00001
표 3. (IF9S 배지에서) hPSC의 혈관내피 분화 개시 후 다양한 날에서의 사이토킨보충 조합물 및 예시적 농도의 고찰
Figure 112015098178665-pct00002
농축 배지 보충물
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염, 모노티오글리세롤, 부가적 소듐 셀레나이트, 폴리비닐 알콜, 글루타맥스™ (또는 글루타민), 비필수 아미노산 (NEAA), 화학적으로 규정된 리피드 농축물, 홀로-트랜스페린, 및 인슐린을 포함하는 농축된 "9S" 배지 보충물이 본원에 또한 기재된다. 일부 구체예에서, 농축된 9S 배지 보충물은 기본 배지 중에 희석되는 경우의 최종 작업 농도의 10x 내지 1000x 농도로 각 구성요소를 포함한다. 일부 구체예에서, 농축된 보충물 중 9S 구성요소 모두의 농도는 표 3에 기록된 농도의 10x 내지 1000x이다. 일부 구체예에서, 보충물은 본원에 기술된 바와 같은 IF9S 배지를 수득하기 위해 IMDM/F12 배지에서 희석되어야 한다.
키트
hPSC의 혈관내피 분화에 유용한 키트가 또한 본원에 고려된다. 일부 구체예에서, 키트는 본원에 기술된 바와 같은 9S 농축 배지 보충물, BMP4, 액티빈 A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, 및 IL-3 중 하나 이상, 및 IF9S 배지 생성 및 본원에 기술된 바와 같은 hPSC의 혈관내피 분화 방법에 대한 설명서를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 IMDM/F12 배지를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 9S 농축 배지 보충물, 액티빈 A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, IL-3, 및 IF9S 배지 생성 및 본원에 기술된 바와 같은 hPSC의 혈관내피 분화 방법에 대한 설명서를 포함한다. 추가의 구체예에서, 상기 언급된 키트 중 임의의 키트는 또한, 테나신 C (예를 들어, 인간 테나신 C)를 포함하며, 이는 본원에 기술된 분화 방법에 따른 접착 성장을 위한 기질로서 사용된다.
hPSC의 혈관내피 분화를 위한 규정된 세포 배양 시스템
hPSC의 혈관내피 분화를 위한 규정된 세포 배양 시스템이 또한 본원에 기술되어 있다. 이러한 세포 배양 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 규정된 분화 배양 배지 예를 들어, IF9S 배지, hPSC 또는 이들의 혈관내피 계통을 따른 분화된 자손의 접착 성장을 위한 테나신 C 단백질 기질을 포함한다. 일부 구체예에서, 테나신 C는 적어도 0.25 ㎍/cm2 내지 약 1 ㎍/cm2로 사용되어 적합한 접착 기질을 생성한다.
일부 구체예에서, 세포 배양 시스템은 BMP4, 액티빈 A, FGF2, 및 LiCl로 보충된 IF9S 배지를 포함한다. 일부 구체예에서, IF9S 배지는 FGF2 및 VEGF로 보충된다. 일부 구체예에서, 세포 배양 시스템에서 사용된 IF9S 배지는 FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL6, 및 IL-3으로 보충된다. 일부 구체예에서, 세포 배양 시스템에 사용된 IF9S 배지는 표 2에 기술된 배지에 따라 포뮬레이션된다. 일부 구체예에서, 규정된 세포 배양 시스템은, 산소 수준 조절을 허용하는 세포 배양 인큐베이터를 사용하고 약 3% O2 내지 약 10% O2 (예를 들어, 5% O2)로 설정된 세포 배양 인큐베이터에서 세포 배양 배지를 평형화시킴으로써 용이하게 달성되는 저산소인 세포 배양 배지를 포함한다.
추가의 구체예에서, 규정된 세포 배양 시스템은 본원에 기술된 방법에 따라 IF9S 배지에서 테나신 C 기질 상에 배양된 부착성 인간 만능성 줄기 세포를 추가로 포함한다.
세포는 예를 들어, 테나신 C-코팅된 세포 배양 디쉬, 다중-웰 세포 배양 플레이트 또는 마이크로캐리어 비드 상에서 성장할 수 있다. 바람직하게는, 테나신 C 단백질은 인간 테나신 C (유전자뱅크 기탁 번호 CAA55309.1; 예를 들어, Millipore 카탈로그 번호 CC065로 시중에서 입수가능)이다.
테나신 C 및 저산소 조건의 사용은 콜라겐 IV 또는 OP9 세포 상에 시딩된 세포와 비교하여 더 높은 백분율 예컨대, 플랫폼 당 스테이지 당 비교할 경우 10% 초과, 또는 약 20% 초과, 약 50% 초과 또는 약 60% 초과의 내피 및 조혈 세포 풍부 군집의 발생을 가능하게 한다 (도 10 및 실시예 참조). 일 구체예에서, 본 발명에 의해 수득가능한 표적 군집의 백분율은 KDR+APLNR+PDGFR알파+ 중배엽 세포에 있어서 약 35% 초과이거나 약 20% 초과의 VE-카드헤린+CD43- 내피 세포 및 약 40% 초과의 CD34+CD43+ 조혈 전구체 세포일 수 있다. 추가로, 도 10에 있어서, 테나신 C 플랫폼 상에 수득된 세포의 백분율은 지시된 백분율 또는 그 초과이다. 또한, 도 10은 Col IV 또는 TenC 상에서 분화되는 경우 전체 배양물의 표적 군집 (예를 들어, 유세포계수에 따른 상응하는 표현형을 갖는 중배엽 전구체, 내피 전구체, 조혈 전구체)의 백분율을 나타낸다.
본 방법 및 재료는 세포 배양 시스템으로 조합되어 신규한 분화 플랫폼을 제공할 수 있다. 일 구체예에서, 기본 세포 배양 시스템은 테나신 C 상에 시딩된 만능성 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 시스템은 액티빈 A가 보충된 배지에서 콜라겐 IV 상에 시딩된 줄기 세포를 포함한다. 이들 시스템은 조혈 전구체 세포로 풍부해진 세포 군집을 생성할 능력을 갖는다.
본원에서 고려되는 세포 배양 시스템은 이들이 시스템으로부터 유래된 생성된 세포 군집을 변화시키는 추가적인 구성요소를 포함할 수 있다는 점에서 모듈식일 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 시스템은 특정 요망되는 결과를 위해 이종항원-비함유 배지를 포함할 수 있다. 그러나, 이들은 예를 들어, 임상 요법이 유래된 세포 군집에 대해 구상되지 않는다면, 이종-함유 배지를 포함할 수 있다. 추가로, 세포 배양 시스템은 당해 분야에 공지된 바와 같은 다양한 크기의 배양 용기를 기반으로 하여 요망되는 세포 군집 생성 규모에 도달할 수 있다.
일부 경우에, IF9S 배지의 구성요소의 일부를 치환할 수 있다. 예를 들어, 아스코르브산 및 모노티오글리세롤은 항산화제 특성을 갖는 화합물 및/또는 티올-함유 화합물의 선택적인 보충물로 대체될 수 있다. 글루타맥스™는 L-글루타민의 선택적 보충물로 대체될 수 있다. 인간 몸체가 다른 아미노산으로부터 생성할 수 있는 아미노산에 대한 일반적인 용어인 "비필수 아미노산 (NEAA)"은 아미노산의 선택적 보충물로 대체될 수 있다. Life Technologies에 의해 특정하게 배포된 용액인 "화학적으로 규정된 리피드 농축물"은 리피드의 선택적 보충물로 대체될 수 있다. 추가적인 셀레나이트, 인슐린, 및 홀로-트랜스페린은 임의의 ITS 보충물로 대체될 수 있다. ITS는 "인슐린-트랜스페린-셀레나이트"를 나타낸다. 일부 회사 (예를 들어, Life Technologies)는 다른 기본 배지 (예를 들어, DMEM)에서 보충물로서 사용될 ITS 용액을 판매한다. 그러나, 제조업체는 각 구성요소에 대한 농축물을 제공하지 않는다. 폴리비닐 알콜은 생물학적으로 불활성인 배지 증점 화합물의 선택적인 보충물로 대체될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 달성을 위한 바람직한 재료 및 방법을 제시한다. 그러나, 이들 실시예는 예시로서 제공된 것이며, 여기서 본 발명의 전반적인 범주에 대한 제한으로서 간주되지 않아야 함이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1 IMDM /F12 기재 배지는 혈관내피 계통으로의 hPSC의 분화 효율을 현저하게 증대시킨다.
이전에 본 실험실에서 마우스 기질 세포주, OP9에 대한 공동배양 방법을 이용한 조혈 hPSC 분화의 효율적인 분화를 위한 프로토콜을 개발하였다.9 , 13 OP9 시스템이 HE 및 다계통 조혈 전구체의 효율적인 생성을 지지하나 (도 1), 이러한 시스템이 혈청 질, 기질 세포 유지 및 분화에 사용된 hPSC 콜로니 및 클럼프의 크기 변동에 매우 민감하다.13 , 14 배양체 (EB) 형성은 hPSC로부터 HE 및 혈액 형성을 유도하기 위한 통상적으로 사용된 또 다른 접근 방법이다.7 ,15, 16 그러나, EB 방법은 종종 혈청 또는 비-규정된 배지에 따라 좌우되며, 또한 현저한 단점 예컨대, 비동시성 분화, 높은 변동성 및 초기 클럼프 크기에 대한 의존성을 갖는다. 추가적으로, hPSC 유지를 위해 사용된 알부민 배치의 변동으로 인한 hPSC의 질의 비일관성은 혈액 생성의 효율에서 변동을 초래할 수 있다.
이러한 한계를 극복하기 위해 본 발명자들은 비트로넥틴 (VTN) 상의 E8 완전하게 규정된 이종항원-비함유 배지에서 확장된 H1 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 단일 세포 현탁액으로부터 혈청 없이 혈관내피 분화를 지지할 수 있는 매트릭스 단백질 및 화학적으로 규정된 배지를 검정하기로 결정하였다17.
방법
인간 만능성 줄기 세포 유지
인간 만능성 줄기 세포 (H1 및 H9 hESC, 섬유아세포 유래된 iPSC 19-9-7T, 및 골수 단핵 세포로부터 유래된 BM119-9 iPSC)를 FGF2 및 TGFβ (Peprotech)로 보충된 자체 제작 E8 배지에서 비트로넥틴 또는 마트리겔 상에 유지시켰다. PBS 중 0.5 mM EDTA를 사용하여 80% 컨플루언시에 도달할 때 세포를 계대시켰다. 세포를 5% CO2를 갖는 정상 산조 조건하에서 유지시켰다.
인간 만능성 줄기 세포 분화
인간 만능성 줄기 세포를, 이들이 1x TrypLE (Life Technologies)를 사용하여 80% 컨플루언시에 도달할 때 비트로넥틴 또는 마트리겔로부터 분리시키고, 10 μM 로 키나제 (Rho Kinase) 억제제 (Tocris Y-27632)로 보충된 E8 배지에서 0.5 ㎍/cm2의 ColIV (Sigma-Aldrich) 또는 0.5 ㎍/cm2 테나신-C (Millipore)로 코팅된 6-웰 플레이트 상에 세포주에 따라 5000 세포/cm2 내지 15,000 세포/cm2 범위의 최적화된 밀도로 플레이팅시켰다. 24시간 (0일) 후, 배지를 50 ng/ml BMP4 (Peprotech), 15 ng/ml 액티빈 A (Peprotech), 50 ng/ml FGF2 (Miltenyi Biotech), 2mM LiCl (Sigma), 및 때때로, 세포 생존력을 증가시키기 위해 1 μM 로 키나제 억제제로 보충된 IF9S 배지로 교환하였다. 2일에, 배지를 50 ng/ml FGF2 및 50 ng/ml VEGF, 및 언급되는 경우 10 μM SB-431542 (Tocris)로 보충된 IF9S 배지로 교환하였다. 4일에, 배지를 50 ng/ml FGF2, VEGF, TPO, SCF, IL-6, 및 10 ng/ml IL-3로 보충된 IF9S 배지로 교환하였다. 6일에, 동일한 6개 인자로 보충된 추가적인 IF9S 배지를 오래된 배지를 흡입하지 않고 배양물에 첨가하였다(표 3). IF9S (9개 보충물을 갖는 IMDM/F12)를 하기와 함께 자체 제작하였다: 64 mg/L L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2+ 염 (Sigma-Aldrich), 40ul/L 모노티오글리세롤 (Sigma-Aldrich), 8.4 ㎍/L 부가적 소듐 셀레나이트 (Sigma-Aldrich), 10mg/L 폴리비닐 알콜 (Sigma-Alderich), 1x 글루타맥스 (Life Technologies), 1x 비필수 아미노산 (Life Technologies), 0.1x 화학적으로 규정된 리피드 농축물 (Life Technologies), 10.6 mg/L 홀로-트랜스페린 (Sigma-Aldrich), 및 20 mg/L 인슐린 (Sigma-Aldrich)으로 보충된 50% IMDM 50% F12 (Life Technologies) (표 2). 분화는 0일 내지 5일에 저산소 조건하에서 수행하고, 6일 내지 9일에 정상 산소 조건으로 이동시켰다 (도 1). 1x TrypLE를 사용하여 분석을 위한 세포를 분리하고 수집하였다.
중간엽 -(MB) 및 혈관모세포 ( HB ) 검정
MB 및 HB를 이전에 기술된 바와 같은 FGF2 보충된 무혈청 CFC 배지 검정을 이용하여 검출하였다11. 2일 또는 3일 배양물을 1x TrypLE (Life Technologies)를 사용하여 단일-세포 현탁액으로 분리 제조하고, 전체 배양물 중 5,000개 세포를 CFC 배지로 플레이팅시켰다. MB 및 HB 콜로니를 단일-세포 현탁액 플레이팅 후 12일째에 스코어링하였다.
조혈 CFC 검정
인간 재조합 SCF, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, 및 EPO (Stem Cell Technologies)로 보충된 혈청-함유 H4436 MethocultTM를 사용하여 조혈 CFC를 검출하였다. AHP의 조혈 잠재성을 이전에 기술된 바와 같은 FGF2 (20 ng/ml), SCF (20ng/mL), IL3 (10 ng/mL), IL6 (10 ng/mL), 및 EPO (2U/mL) (줄기 세포 Technologies) 첨가된 무혈청 SF H4236 Methocult를 사용하여 평가하였다6. 1000-10000개 분화된 세포를 CFC 배지에 플레이팅시키고, 콜로니를 배양 14일 후 스코어링하였다.
유세포계수 및 FACS
FACSCalibur 유동세포계수기 및 하기 항체를 이용하여 세포유동계수를 수행하였다: CD31-FITC (클론 WM59), CD34-FITC (8G12), CD41a-FITC/APC (클론 HIP8), CD43-FITC/PE/APC (클론 1G10), CD45-APC (클론 HI30), CD73-FITC/PE (클론 AD2), CD144-FITC/PE/AlexaFluor647 (클론 55-7H1), CD235a-FITC/PE/APC (클론 GA-R2), KDR-PE/AlexaFluor647 (클론 89106), PDGFRα-PE (클론 aR1) (BD Biosciences), TRA-1-85-FITC/PE (클론 TRA-1-85), 및 APLNR-APC (클론 72133) (R&D Systems). 이전에 기술된 바와 같이 FACS Aria 상에서 분류를 수행하였다 46. 분리된 군집의 순도는 92-95%이었다.
OP9 상으로의 분화된 hPSC의 이차 배양
OP9 세포를 이전에 기술된 바와 같이 20% FBS (Hyclone) 보충된 α-MEM (Gibco)에서 유지시켰다.10 분류된 4일 또는 5일 배양물을 100　μM MTG, 50 ㎍/ml 아스코르브산, 50 ng/ml SCF, TPO, IL-6, 및 10ng/ml IL-3로 보충된 10% FBS (Hyclone)로 보충된 α-MEM (Gibco)에서 OP9 세포의 컨플루언트 층 상에 이전에 기술된 바와 같은 6 웰 플레이트의 웰 당 5,000개 세포의 밀도로 플레이팅시켰다6. 부유 세포를 수집하고, 1x TrypLE를 사용하여 전체 배양물을 분리함으로써 4 내지 7일 후에 유동세포계수를 위해 배양물을 준비하였다.
9일 배양물의 T-세포 분화
인간 델타-유사 리간드 4 (DLL4)를 항시적으로 발현하는 OP9 세포주 (OP9-DLL4)를 렌티바이러스를 사용하여 본 실험실에서 확립하고 OP9와 유사하게 유지시켰다. 9일 동안 인간 만능성 줄기 세포를 분화시킨 후, 부유 세포를 수집하고, 70 μm 세포 스트레이너 (BD Biosciences)를 통해 변형시키고 세척하였다. 이어서, 이들을 IL7 (5 ng/ml), Flt3L (5 ng/ml) 및 SCF (10ng/ml)로 보충된 20% FBS (Hyclone)로 보충된 α-MEM (Gibco)로 구성되는 T-세포 분화 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 이들을 OP9-DLL4 상에 플레이팅시키고, 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 4일 후, 세포를 콜라게나제 IV (Gibco) 용액 (DMEM/F12 중 1 mg/ml, Gibco) 및 1x TrypLE (Invitrogen)를 사용하여 수확하고, OP9-DLL4의 프레쉬 층 상으로 계대시켰다. 3일 후, 세포를 다시 계대시켰다. 매일 7일마다 4주까지 후속 계대를 수행하고, 그 후 부유 세포를 유동 분석 및 TCR 재배열 검정을 위한 게놈 DNA 추출을 위해 수집하였다.
TCR 재배열 검정
게놈 DNA를 신속-gDNA MiniPrep (Zymo Research)을 사용하여 분리하였다. TCRβ 및 TCRγ 클론성을 이전에 기술된 바와 같은 PCR 증폭 키트 (Invivoscribe) 및 AmpliTaq Gold® DNA 폴리머라제 (Applied Biosystems)를 사용하여 검출하였다33. PCR 생성물을 에티듐 브로마이드로 염색된 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 헤테로듀플렉스 분석을 이용하여 분석하였다.
마우스 기질 세포주의 마이크로어레이 분석
마우스 골수 기질 세포주 OP9를 닥터 토루 나카노 (Dr. Toru Nakano (Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University, Japan))로부터 수득하고, S17은 닥터 케네스 도르쉬킨드 (Dr. Kenneth Dorshkind (University of California, Los Angeles))로부터 수득하고, MS-5는 독일 조직 배양 콜렉션으로부터 수득하였다. 기질 세포주를 기술된 바와 같이 배양하였다9. DNA-비함유 RNA를 RiboPureTTM RNA를 사용하여 분리하고, DNA제는 TURBOTM DNA 비함유 시약 (Ambion)을 사용하여 분리하였다. 모든 샘플을 위스콘신 유니버시티 (Madison)의 생물공학 센터의 유전자 발현 센터에서 처리하였으며, NimbleGen Systems (Madison, WI)에 의해 제작된 A4543-00-01 MM8 60mer expr Mus musculus 1-Plex Array 표준 어레이를 사용하여 분석하였다. 유전자 발현 미처리 데이타를 NimbleScan 소프트웨어 v2.1을 사용하여 추출하였다. RNA 샘플의 시그널 분포가 gDNA 샘플의 것과 구별됨을 고려하여, 모든 8개 어레이에서 RNA 채널로부터 시그널 강도를 로버스트 멀티플-칩 어날리시스 (Robust Multiple-chip Analysis) (RMA) 알고리즘으로 표준화시켰다47. 별도로, 동일한 표준화 절차를 gDNA 샘플로부터의 시그널 강도에 대해 수행하였다. 이어서, 주어진 유전자에 있어서, RNA 채널로부터의 이의 표준화된 강도와 gDNA 채널로부터의 강도 사이의 중간-조절된 비를 하기와 같이 계산하였다: 비 = RNA 채널로부터의 강도/(gDNA 채널로부터의 강도 + gDNA 채널로부터의 모든 유전자의 중간 강도). 발현에서 3 초과 배수 차이를 갖는 유전자가 상이하게 발현되는 것으로 간주되었다. > 1 발현 수준을 갖는 유전자만이 분석을 위해 선택되었다.
결과
IMDM /F12 기재 배지는 혈관내피 계통으로의 hPSC의 분화 효율을 현저하게 증대시킨다.
본 발명자들은 단일 세포로서 hESC를 플레이팅하고 마트리겔 (MTG), VTN, 또는 콜라겐 IV (ColIV) 상의 10 μM 로 키나제 억제제가 보충된 E8 배지에서 24 시간에 걸쳐 부착되게 하였다. 이어서, 배지를 hPSC로부터 혈액 형성을 유도하는데 통상적으로 사용되는 인간 재조합 BMP4, FGF2, 및 VEGF 인자가 보충된, 동물 단백질 비함유 또는 성장 인자-비함유 TeSR1의 3개 기본 배지중 하나로 교환하였다18 , 19. 4일 분화 후, 세포 배양물을 혈관내피 전구체에서 고도로 풍부한 KDRhiCD31+ 세포의 존재에 대해 평가하였다6. 유동세포계수 분석은 L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 염, 8.4 ㎍/L 부가적 소듐 셀레나이트, 홀로-트랜스페린, 및 인슐린으로 보충된 IMDM/F12 배지에서 ColIV-코팅된 플레이트 상의 분화된 세포가 KDRhiCD31+ 혈관내피 전구체로 가장 효율적으로 분화됨을 보여주었다 (도 8). 후에, 본 발명자들은 폴리비닐알콜, NEAA, 글루타맥스, 화학적으로 규정된 리피드 농축물, 및 모노티오글리세롤의 첨가가 세포 생존력 및 분화 효율을 증가시켰음을 발견하였다 (데이타 미도시됨). 후속 기본 배지는 IF9S (IMDM/F12 플러스 9가지 보충물)로서 언급된다. 이들 결과는, 선택된 배지 및 보충물이 E8 배지에서 유지된 hPSC로부터 ColIV 매트릭스 상에서 화학적으로 규정된 이종항원-비함유 조건에서 혈관내피 세포를 수득가능하게 함을 입증하였다.
실시예 2. 조혈 전구체의 발달 및 유지를 증진시키는 세포외 매트릭스로서 테나신 C를 검정한 조혈-지지 기질 세포의 독특한 분자 시그내처의 분석.
이전에, 본 발명자들은 조혈 분화의 유도에서 OP9가 다른 기질 세포주 예컨대, S17, 및 MS5보다 탁월함을 보여주었다9. 또한, 8일에 과다성장한 OP9 배양물이 다능성 GEMM-CFC를 포함하는 조혈-CFC의 유도에서 4일의 새로운 컨플루언트 OP9보다 탁월함이 밝혀졌다9. 기질 세포의 컨플루언시가 분화 효율에 영향을 끼치기 때문에, 이는 본 발명자들이 혈관내피 분화에 영향을 끼치는 세포외 매트릭스가 존재하는 것으로 간주하게 한다. OP9의 조혈-지지 활성에 중대한 매트릭스 단백질(들)을 발견하기 위해, 본 발명자들은 낮은 조혈-유도 잠재성을 갖는 S17 및 MS5 기질 세포주 및 OP9 세포의 분자 프로파일링을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 과다성장한 OP9 (8일)를 새로운 컨플루언트 OP9 (4일) 단일층과 비교하였다. 전사체 분석은 모든 다른 기질 세포와 비교하여 8일의 과다성장한 OP9 세포에서 구별되게 발현된 21개 유전자를 드러냈다 (도 2a). 이들은 Ptn (플레이오트로핀 (pleiotrophin)), HSC 확장 및 재생의 분비된 조절인자,20 Rspo3 (R-스폰딘 3), Wnt 시그널링 및 혈관모세포 발달의 중요한 조절인자21, 및 B 림프구형성에 필요한 세포외 매트릭스 단백질 Postn (페리오스틴(periostin))22을 엔코딩하는 유전자를 포함한다. 흥미롭게도, 과다컨플루언트 OP9에서 가장 현저한 발현 변화를 보여준 하나의 유전자가 Tnc (테나신 C)이었다 (도 2b). TenC는 Aorta-Gonado-Mesonephros (AGM) 영역에서 조혈 클러스터에 근간이 되는 중간엽 세포에서 발현되며, 배아내 및 생후 조혈에 요구된다23 -25. 또한, 이는 골수 줄기 세포 니치 (niche)에서 발현된다25. 이러한 독특한 특성으로 인해, 본 발명자들은 TenC가 ColIV보다 더욱 효과적으로 조혈 분화를 지지하는 지의 여부를 평가하였다.
실시예 3. FGF2 , BMP4 , 액티빈 A, LiCl , 및 VEGF의 시간- 및 용량-의존적 처리는 발달의 중배엽, 내피 및 조혈 스테이지를 유도한다.
본 발명자들의 기존 연구는 OP9와의 공동배양에서 hPSC 분화 후 혈관내피 발달의 구별되는 스테이지를 확인하였다 (도 1)6 ,9-11, 26. OP9 기질 세포 상으로의 hPSC 플레이팅은 원시 스트레이크 및 중배엽 세포의 형성을 유도하며, 이는 아펠린 수용체 (APLNR) 및 KDR (VEGFR2) 11의 발현 및 발현 내피 (CD31, CD144(VE-카드헤린)), 내피/중간엽 (CD73, CD105) 및 조혈 (CD43, CD45) 마커 발현의 결여를 기반으로 하여 즉, EMHlin- 표현형에 의해 검출될 수 있다. 분화 2일에서 OP9 공동배양에서 나타나는 제 1의 KDR+ 중배엽 세포는 APLNR 및 PDGFR알파 (EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+, 이후 A+P+ 세포로서 언급됨)를 발현한다. 이들 세포는 중간엽혈관모세포 (MB) 잠재성 즉, 중간엽 줄기 세포 (MSC) 및 혈관 잠재성 둘 모두를 갖는 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 나타낸다. 분화 3일에 A+P+ 세포는 모세포 (BL)-CFC 또는 혈관모세포 (HB) 잠재성을 획득하였다11. MB 및 HB 잠재성 둘 모두는 FGF2가 보충된 무혈청 클론원성 배지에서 콜로니-형성 검정을 이용하여 검출될 수 있다11. 발전적 성숙으로, 중배엽 세포는 BL-CFC 활성을 손실하고, KDR 발현을 상향조절하고 PDGFR알파를 하향조절하며 즉, OP9 상의 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 세포에서 풍분한 KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/- 혈관 전구체 (HVMP) 표현형을 획득하였다 6. 발달의 내피 스테이지는 내피-특이적 마커 VE-카드헤린 (CD144)의 발현에 의해 규정된다. 제 1의 VE-카드헤린+ (CD144+) 세포가 분화 4일까지 KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/- 중배엽 세포로부터 출현하였다. 신생 VE-카드헤린+ (CD144+) 세포는 CD43-CD73+ (CD144+CD43-CD73+) 비-헤모제닉 내피 전구체 (비-HEP) 및 CD43-CD73- (CD144+CD43+CD73-) 헤모제닉 내피 전구체 (HEP)를 포함하는 이종 군집을 나타낸다 6. 조혈 CFC 잠재성이 결여된 HEP는 기질 세포와의 배양 후 이를 획득하였다. 발달의 조혈 스테이지는 조혈-특이적 마커 CD43의 발현에 의해 규정된다 6, 10. 제 1의 CD43+ 세포는 분화 4-5일에 VE-카드헤린+ (CD144+) 세포 내에서 출현하였다. 이들 세포는 낮은 수준의 CD43을 발현하고 CD235a를 공동발현하나, CD41a 발현은 결여되었으며, 즉, CD144+CD43/235a+41a- 표현형을 갖는다. 이들 세포가 FGF2 및 조혈 사이토킨의 존재하에 조혈 콜로니를 형성하는 것은 물론 피브로넥틴 상에서의 내피 세포를 성장시킬 능력을 갖기 때문에, 본 발명자들은 이들을 혈관형성 조혈 전구체 (AHP)로서 지명하였다. 제 1의 CD41a 세포는 CD235a 파지티브 세포 내에서 나타난다. CD235a+CD41a+ 세포는 고도로 풍부한 에리토-거대핵세포 전구체이며, 내피 잠재성이 결여되어 있다. 광범위한 골수림프 잠재성 및 lin-CD34+CD43+CD45+/- 표현형을 갖는 전구체는 CD235a+CD41a+ 세포의 출현 직 후 hPSC 배양물에서 검출될 수 있다. lin- 세포에 의한 CD45 발현의 획득은 진행성 골수성 구속 (commitment)과 관련된다.10
OP9 공동배양에서 관찰된 혈관내피 프로그램을 재생하기 위해, 본 발명자들은 중배엽 유도 및 혈관내피 특이성을 위한 모르포겐의 최적의 조합을 선택하고 ColIV 및 TenC 상에서 화학적으로-규정된 조건 하에 분화된 hPSC 배양 (도 1)에서 HE 및 혈액 세포로의 분화의 단계식 진행에 요구되는 특이적 성장 인자를 규정하기로 결정하였다. 배아 발달 동안, BMP4, Wnt, 및 TGFβ/Nodal/액티빈 A 시그널링은 원시 스트레이크 형성을 개시하고 후속 중배엽 발달에 중대한 것으로 밝혀졌다27 , 28. 이들 시그널링 경로의 활성화는 브라큐리 (brachyury) 및 KDR (Flk-1, VEGFR2)의 발현을 유도하고 마우스 및 인간 PSC의 중배엽 구속을 개시하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다 18,19,29- 32. 본 발명자들은 저농도의 액티빈　A (15 ng/ml) 및 LiCl (2 mM)의 보충물과 조합된 고농도의 BMP4 (50ng/ml)가 본 발명자가 상기 기술한 바와 같은 화학적으로-규정된 조건에서 ColIV 상의 hESC의 단일 세포 현탁액의 2일 배양 후 중배엽 표면 마커 APLNR, KDR, 및 PDGFR알파의 발현을 일관되게 유도하였음을 발견하였다. 그러나, 이들 조건은 세포 생존을 빈약하게 지지하며, 세포 생존력 및 중배엽 세포의 산출을 증대시키기 위해 FGF2의 첨가 및 저산소 조건 (5% O2, 5% CO2)이 요구된다. 이들 조건하에서 분화된 2일째의 KDR+ 중배엽 세포는 APLNR 및 PDGFR알파를 발현하였으며, 즉 APLNR+PDGFR알파+ 세포가 되며, OP9 공동배양에서 분화된 2일의 hPSC로부터 수득된 APLNR+PDGFR알파+ 중배엽 세포와 유사한 MB 콜로니-형성 잠재성을 나타내었다11 (도 3). 분화 2일 후, 본 발명자들은 분화 3일에 APLNR+PDGFR알파+ 중배엽이 HB 잠재성을 획득하게 하는데 단지 FGF2 및 VEGF만 요구되며, 분화 4일에 CD31- 중배엽 세포에서 APLNR+ 세포 (KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/- 표현형)의 PDGFR알파 발현 감소 및 KDR 발현 증가에 의해 나타내는 HVMP로의 중배엽 특이성을 진행시킴을 발견하였다. 발달 패턴은 ColIV 및 TenC 상에 배양된 세포에서와 유사하나, 후자는 APLNR+PDGFR알파+ 세포, MB 및 HB 콜로니를 현저하게 더 많이 생성하였다 (도 3a, 3c).
4일 분화된 hESC는 HB 콜로니를 형성할 능력을 손실하였으나 (도 3c), 이들 세포는 10% FBS, SCF, TPO, IL6, 및 IL3으로 보충된 αMEM에서 OP9 상에 분류되고 플레이팅될 때 혈관내피 클러스터를 형성할 수 있다. 혈관내피 클러스터 잠재성은 KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo /-CD31- HVMP로 제한되었다 (도 3d). KDRloCD31- 세포는 단지 조혈 활성을 거의 갖지 않는 내피 클러스터를 형성하는 반면 (도 3d), KDR- 세포는 내피 및 혈액 세포 둘 모두를 성장시키지 못하였다 (미도시됨). 이는 또한 OP9 공동배양에서의 분화와 일치한다6. KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/- HVMP 세포의 백분율은 TenC 배양에서 일관되게 더 높았다 (도 3a).
hPSC/OP9 공동배양에서 HVMP의 형성이 HE 및 혈액 전구체의 발달 이후 바로 이어지기 때문에, 본 발명자들은 분화 4일로부터 시작하여 VEGF 및 FGF2 이외에 SCF, TPO, IL-6, 및 IL-3 조혈 사이토킨으로 본 배양물을 보충하였다. 본 발명자들은 배양물의 FGF2 및 VEGF로의 연속 처리가 내피 전구체 및 조혈 특이성을 유도하는데 충분하였음을 주지하였으나, 조혈 사이토킨의 첨가가 화학적으로 규정된 배양에서 이들 세포의 산출을 증가시키는데 필수적이었다. 이들 조건에서 분화 5일에, 이전에 확인된 CD144+ 군집6의 3개의 주요 서브셋이 출현하였다: CD144+CD43-CD73+, CD144+CD43-CD73- 및 CD144+CD43/CD235a+CD41a- (도 4). 이들 서브셋이 내피 조건으로 분류되고 플레이팅되는 경우, 이들 모두는 OP9 공동배양과 일관되게, 튜브 형성 검정에서 AcLDL를 흡수하여 혈관 튜브를 형성할 능력을 갖는 세포를 발현하는 VE-카드헤린의 단일층을 형성하였다 (도 4d). 그러나, 조혈 CFC 잠재성은 CD144+CD43/CD235a+CD41a- 세포로 대부분 제한되었다 (도 4c). 중요하게는, OP9와의 공동배양에서 발생한 5일의 CD144+ 서브셋을 이용한 발견과 유사하게, CD144+CD43/CD235a+CD41a- 세포의 조혈 CFC 잠재성이 조혈 사이토킨 이외에 FGF2의 존재하에 단지 무혈청 배지에서 검출되었으며, 이는 이들 세포가 hPSC/OP9 공동배양에서 확인된 AHP와 실질적으로 유사함을 나타낸다6. 본 발명자들은 이전에 조혈 CFC 잠재성이 결여된 CD144+CD43-CD73- 세포로서 HEP를 규정하였으나, OP9 상에서의 배양 후 이러한 잠재성을 획득할 수 있다. CD144+CD43-CD73-가 OP9-유도된 HEP와 유사한 완전하게 규정된 조건하에서 생성되는 지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 5일 CD144+ 서브셋을 분류하고 이전에 기술된 바와 같이 OP9와 배양하였다6. 이들 경우, HEP는 큰 수의 HE-클러스터를 갖는 내피 및 조혈 세포 둘 모두를 형성한 반면, AHP는 수개의 내피 세포 및 혈관내피 클러스터를 갖는 조혈 세포를 우세하게 형성하였다. CD144+CD43-CD73+ 세포는 단지 비-HEP 표현형과 일관되게 내피 클러스터를 형성하였다 (도 4d). Tenc 상에 분화된 클러스터는 전체 CD144+ 세포의 더 큰 군집을 가지며, 이에 따라 ColIV 상에 분화된 배양물과 비교하여 HEP, 비-HEP, 및 AHP의 군집을 증가시켰다 (도 4a, b).
6일에 많은 부유하는 둥근 조혈 세포가 배양물에서 가시화될 때, 저산소 조건은 조혈 발달을 지속하는데 반드시 필요한 것은 아니다. 따라서, 분화 6일 부터, 배양물을 정산 산소 인큐베이터 (20% O2, 5% CO2)로 세포 이동시켰다. 분화 8일까지, 배양물은 CD34 (도 5)를 발현하고 다른 계통 마커가 결여된 (미도시됨) lin-CD43+CD45-/+ 세포 및 에리트로-거대핵세포 전구체에 풍부한 CD235a+CD41a+ 세포로 구성된 다수의 CD43+ 조혈 세포의 발달을 보여주었다. OP9 상에서 분화된 세포와 일관되게, 조혈 콜로니 형성 잠재성은 CD43+ 아군집에 제한되었다 (도 5c). CD43+ 조혈 전구체는 ColIV와 비교하여 TenC 상에서 현저하게 더 많이 확장되었다 (도 5b). 또한, TenC 상의 배양물의 GEMM-CFC 잠재성은 ColIV 상의 배양물보다 현저하게 더 컸다 (도 5d).
분화 프로토콜이 H1 hESC를 사용하여 초기에 발달되었으나, 본 발명자들은 본원에 기술된 화학적으로 규정된 조건이 또한 섬유아세포 또는 골수 단일핵 세포로부터 생성된 기타 hESC (H9) 및 hiPSC로부터 HE 및 혈액의 형성을 지지함을 발견하였다 (도 9). 이전에는, 본 발명자들은, 제대혈 단일핵 세포 (CB hiPSC)의 재프로그래밍을 통해 수득된 hiPSC가 섬유아세포-유래된 (FB) hiPSC와 비교하여 OP9 공급자 상의 혈액 세포로 덜 효율적으로 분화됨을 발견하였다33. 이들 발견은 본 발명자들이 ColIV 상에서 CB 및 FB iPSC를 분화시키는 경우 재현되었다. 그러나, TenC 상에서의 분화는 hESC 및 FB hiPSC으로 관찰된 수준으로 CB hiPSC의 조혈 분화 잠재성을 복구시켰으며 (도 9), 이렇게 하여 TenC가 hPSC로부터의 조혈 분화를 촉진하는데 있어서 ColIV 보다 탁월함을 확인하였다.
실시예 4. 테나신 C는 hPSC로부터 T 림프구 전구체의 특이성을 독특하게 지지한다.
본 배양 시스템이 hPSC로부터 최종적 조혈 프로그램의 성립을 지지하는 지의 여부를 밝혀내기 위해, 본 발명자들은 본 시스템에서 발생한 혈액 세포의 T 세포 잠재성을 최종 조혈의 지표로서 분석하였다7. 본 발명자들은 9일에 분화된 배양물로부터 CD43+ 부유 세포를 수집하고, 20% FBS, Flt3L, IL-7, 및 SCF가 보충된 α-MEM에서 DLL-4를 발현하는 OP9 세포 상에 이들을 재플레이팅시킬 경우, CD7+CD5+ 림프구 전구체는 이차 공동배양의 2주 까지 출현하기 시작하였다. 3주 까지, CD4+CD8+ 이중 파지티브 T-세포가 발생하였다 (도 6a).
흥미롭게도, ColIV 및 TenC 매트릭스 둘 모두에서 발생된 CD43+ 세포는 CD5+CD7+ 림프구 전구체를 생성시킬 능력을 갖는다. 그러나, CD4+CD8+ T 림프구 세포로의 진행은 TenC 상에서 발생한 CD43+ 세포로부터만 관찰되었으며, ColIV 상에서는 관찰되지 않았다. T 세포 발달을 확인하기 위해, 본 발명자들은 TCR 재배열의 존재에 대한 이들 배양물로부터의 게놈 DNA를 분석하였다. 이러한 분석은 폴리클로날 T 계통 레퍼토리의 지표인 γ-로커스에서의 다중 V-J 및 재배열 및 γ-로커스에서의 무작위 V-J 및 D-J 재배열의 다중 PCR 생성물의 존재를 입증하였다 (도 6b 및 6c). 전반적으로, 이러한 발견은 세포외 매트릭스 테나신 C가 완전하게 화학적으로 규정된 조건에서 최종적 조혈을 지지하는데 필수적임을 의미한다.
실시예 5. TGF -β의 억제는 화학적으로 규정된 조건하에서 혈관내피 특이성을 증진시킨다.
최근의 연구는 중배엽 특이성 후 그러나 내피 발달 전에 TGF-β 억제제 첨가는 최종적인 조혈 분화를 증가시킴을 보여주었다. 본 발명자들은 10 μM의 SB-431542, 즉, 강력하나 비-특이적인 TGFβ 억제제가 2일 내지 4일에 첨가되는 경우, 3일까지 PDGFR알파-파지티브 중배엽 세포의 발달을 현저하게 감소시키고 4일까지 CD31+ 분화를 증가시킴을 발견하였다. 4일 후, SB-431542는 더 이상 첨가하지 않았으나, 2일 처리의 효과는 9일까지 CD43+ 군집을 계속해서 증가시켰다 (도 7).
최근 십년 동안, hPSC로부터의 조혈 분화에서 유의한 진척이 이루어졌다. 조혈 분화를 위한 많은 프로토콜이 개발되었으며, 실험을 위한 혈액 세포를 일상적으로 생성시키는 것을 가능하게 하였다. 그러나, hPSC로부터 장기간 재구성 잠재성을 갖는 혈액 세포 HSC의 발생은 여전히 유의한 도전으로 남아있다. 배아에서, 조혈 세포 및 HSC는 내피 (HE)의 특이적 서브셋으로부터 발생하며1 -5, 따라서 완전하게 화학적으로 규정된 환경에서 혈액 세포로의 HE 특이성 및 전이를 유도하는 시그널링 경로를 조사하는 능력은 처음부터 HSC 생성을 위한 조건의 궁극적인 발달 및 HSC 특이성에 요구되는 인자의 확인에 필수적이다. 조혈 분화를 위한 원래의 프로토콜은 이종 공급자 및/또는 혈청을 사용되었으나, 조혈 분화를 위한 수개의 무혈청 및 무공급자 시스템이 최근에 기술되었다18 ,34, 35. 그러나, 이러한 프로토콜은 여전히 혈청 구성요소 (알부민)를 요구하며, 이들 프로토콜이 원래의 분화 시스템에서 관찰된 최종적 림프골수 (lymphomyeloid) 잠재성을 갖는 HE의 발생을 포함하여 조혈의 구별되는 웨이브를 재현하는 지의 여부는 여전히 불분명하다. 더욱 최근에는, 케네디 등7 은 hPSC의 EB-기반 조혈 분화를 위한 공급자- 및 기질-비함유 조건을 개발하였으며, 이들 조건이 조혈의 원시적 및 최종적 웨이브를 재생시키며, T 림프구 잠재성을 갖는 HE를 발생함을 보여주었다. 그러나, 이러한 프로토콜은 밝히지 않은 화학물질 및 인간 단백질 함유물을 갖는 전유 배지에서 EB-기반 조혈 분화를 위한 MEF 상에서 성장하는 hPSC를 이용한다. 여기에서, 본 발명자들은 화학적으로 규정된 E8 배지에서 유지된 hPSC의 단일 세포 현탁액으로부터 무혈청 및 이종 단백질 비함유의 완전하게 화학적으로 규정된 조건에서 혈액 세포의 효율적인 생성을 가능하게 하는 프로토콜을 처음으로 개발하였다12. 이러한 프로토콜은 EB 시스템에서 관찰된 동물- 또는 인간-공급원의 알부민, 이종 매트릭스, 클럼프 크기 및 비동시성 분화와 관련된 변동성을 제거하며, OP9에서 분화된 hPSC에서 관찰된 HE 및 최종적 조혈 전구체의 형성을 포함하는 조혈의 전형적인 웨이브를 재생한다. 중요하게는, 다양한 조혈-유도 활성을 갖는 기질 세포주 및 OP9의 분자 프로파일링을 기반으로 하여, 본 발명자들은 로버스트 헤마토-유도 잠재성을 갖는 OP9에서 독특하게 발현된 TenC 매트릭스 단백질이 hPSC로부터의 혈관내피 및 T 림프구 발달을 강하게 증진시킴을 발견하였다. TenC는 디설피드-연결된 헥사머릭 글리코단백질이며, 이는 배아 발달 동안 주로 발현된다. TenC는 성인 유기체에서는 대부분 사라지지만, 이의 발현은 상처 회복, 혈관신생 및 신생물 동안 상향조절된다.36 흥미롭게도, TenC는 골내 영역에서 주로 발현되며37 ,38 후속 골수상해 (myeloablation)를 상향조절하는25 성인 골수에서 발견되었다. TenC는 골수 조혈 세포39의 증식 및 적혈구형성40을 지지하였다. TenC-결핍 마우스는 더 낮은 골수 CFC 잠재성을 가지며24, 골수 제거 후 조혈 재구성에 실패하였으며, 야생형 HSC의 생착을 지지하는 능력이 감소됨을 나타냈다 25. 높은 수준의 TenC 발현은 또한 인간 및 닭 아오르타-고나드-메소네프로스 (aorta-gonad-mesonephros) (AGM) 영역23 ,41, 제 1의 HSC가 출현한 부위 및 태아 간의 조혈 부위에서 검출되었다42. TenC 발현이 조혈 클러스터의 오른쪽 아래 대동맥하 간엽에서 매우 풍부하기 때문에, 이는 TenC가 배아발생 동안 HSC 발달에서 중심이 되는 역할을 수행하는 것임을 시사한다23. TenC는 또한 혈관신생 및 심장 내피 전구체의 조절과 관련된다43. 본 발명자들의 연구는 hPSC로부터의 조혈 촉진에서 TenC의 탁월한 특성을 입증하였다. TenC의 긍정적인 영향은 분화의 모든 스테이지에서 명백하였으며, 헤모제닉 중배엽, HE 및 CD43+ 조혈 전구체 생성의 향상을 포함하였다. 중요하게는, TenC는 T 림프구 잠재성을 갖는 최종적인 조혈 세포의 발달을 지지할 수 있으며, 반면 본 발명자들은 ColIV 상의 배양에서 이러한 세포를 획득할 수 없었다. TenC 분자는 아미노-말단 올리고머화 영역에 이어서 헵타드 반복부, EGF-유사 및 피브로넥틴 유형 III 반복부 및 피브리노겐 글로브로 구성된다36. 이들 도메인의 기능은 부족하게 이해되었다. TenC와 세포의 효과 및 상호작용은 다중 도메인의 통합 작용을 필요로 하는 것으로 간주되는데44, 그러나 조혈 세포의 증식을 유도할 수 있는 수개의 독특한 미토겐 도메인이 이러한 분자내에 확인되었다39. 피브로넥틴-활성화된 중점 부착 키나제- 및 Rho-매개된 시그널링의 억제 및 Wnt 시그널링의 자극을 포함하는 TenC와의 세포 상호작용에서 관련된 수개의 시그널링 메카니즘이 확인되었다 (45에서 고찰됨). hPSC 및 이들의 조혈 유도체에 대한 TenC 작용의 메카니즘을 확인하고자 하는 추가의 연구는 조혈 발달에서 이러한 매트릭스 단백질의 역할을 이해하는데 도움이 될 것이다.
요약하면, 본원에 제공된 발견은 hPSC로부터의 최종적 혈액 세포 및 HE의 확장가능한 생성을 지지할 수 있는 동물 단백질 및 혈청/혈청 구성요소 비함유의 완전하게 화학적으로 규정된 조건 및 TenC 매트릭스 단백질을 확인하였다. 이러한 분화 시스템은 조혈 분화에 연관된 시그널링 분자의 정확한 질문을 허용하며, 임상 적용을 위한 혈액 세포의 cGMP 등급의 생성을 위한 플랫폼을 제공한다.
참고 문헌
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Claims (40)

  1. EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포로의 인간 만능성 줄기 세포 (human pluripotent stem cell)를 분화시키는 방법으로서,
    (a) 인간 만능성 줄기 세포를 2일의 기간 동안 저산소 조건하에서 10 내지 50 ng/ml의 FGF2, 50 내지 250 ng/ml의 BMP4, 10 내지 15 ng/ml의 액티빈　A, 및 1 내지 2 mM의 LiCl을 포함하는 이종항원-비함유 및 혈청알부민-비함유 배양 배지와 접촉시켜, 중간엽혈관모세포 (mesenchymoangioblast) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포의 군집을 배양체의 형성 또는 기질 세포와의 공동배양 없이 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    (b) 단계 (a)의 원시 중배엽 스테이지의 세포를 1-2일의 기간 동안 저산소 조건하에서 구성요소 FGF2 및 VEGF를 포함하는 이종항원-비함유 및 혈청알부민-비함유 배양 배지와 접촉시켜 OP9 세포에서 배양시 혈관내피 (hematoendothelial) 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 세포에서 풍부한 혈관 (hematovascular) 중배엽 세포 (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/-) 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽을 포함하는 군집을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    (c) 단계 (b)의 혈관 중배엽 스테이지의 세포를 1일 동안 구성요소 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, 및 IL3을 포함하는 이종항원-비함유 및 혈청알부민-비함유 배양 배지와 접촉시켜 CD144+CD73+CD235a/CD43- 비-헤모제닉 내피 전구체 (non-hemogenic endothelial progenitor) (비-HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43- 헤모제닉 내피 전구체 (HEP), CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- 혈관형성 조혈 전구체 (angiogenic hematopoietic progenitor) (AHP), 및 CD43+CD41a+ 조혈 전구체 세포의 형성을 달성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    (d) HEP 및 신생 조혈 전구체 세포를 3일 동안 정상 산소하에 구성요소 FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, 및 IL3을 포함하는 배양 배지와 계속 접촉시켜 조혈 확장을 유도하여 CD43+CD235a+CD41a+ 에리트로거대핵세포 (erythromegakaryocytic) 전구체 및 lin-CD34+CD43+CD45+/- 다능성 조혈 전구체로 구성된 CD43+ 조혈 전구체 군집을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 배양 배지가 상기 구성요소로 필수적으로 이루어지는 것인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 세포가 테나신-C (Tenascin-C)로 처리된 기질 상으로 시딩되는 방법.
  7. 인간 만능성 줄기 세포를 분화시키기 위한 이종항원-비함유 배양 배지로서,
    50 내지 250 ng/ml의 BMP4;
    10 내지 15 ng/ml의 액티빈 A;
    10 내지 50 ng/ml의 FGF2; 및
    1 내지 2 mM의 LiCl로 보충된 배지를 포함하는 이종항원-비함유 배양 배지.
  8. EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포로의 인간 만능성 줄기 세포 분화를 위한 이종항원-비함유 세포 배양 장치로서,
    테나신 C 층을 포함하는 기질 상에 단일 세포 현탁액으로서 적어도 0.25 ㎍/cm2 내지 1 ㎍/cm2의 농도로 시딩되는 인간 만능성 줄기 세포; 및
    50 내지 250 ng/ml의 BMP4;
    10 내지 15 ng/ml의 액티빈 A;
    10 내지 50 ng/ml의 FGF2; 및
    1 내지 2 mM의 LiCl로 보충된 배지를 포함하는 이종항원-비함유 배양 배지를 포함하는, 이종항원-비함유 세포 배양 장치.
  9. EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포로의 인간 만능성 줄기 세포를 분화시키는 방법으로서,
    (a) 테나신 C로 처리된 기질 상에 단일 세포 현탁액으로서 인간 만능성 줄기 세포를 시딩하는 단계; 및
    (b) 2일의 기간 동안 저산소 조건하에서 50 내지 250 ng/ml의 BMP4, 10 내지 15 ng/ml의 액티빈 A, 10 내지 50 ng/ml의 FGF2, 및 1 내지 2 mM의 LiCl로 보충된 배양 배지에서 시딩된 세포를 배양하여 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 30% EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포를 배양체의 형성 또는 기질 세포와의 공동배양 없이 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 1-2일 동안 저산소 조건하에 FGF2 및 VEGF로 보충된 배양 배지에서 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 스테이지의 세포를 배양하여, OP9 세포에서 배양시 혈관내피 클러스터를 형성할 잠재성을 갖는 EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFR알파lo/- 혈관 중배엽 전구체 및 혈관모세포 (HB-CFC) 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포를 생성하는 방법으로서,
    (a) 유효량의 콜라겐으로 처리된 기질 상으로 인간 만능성 줄기 세포를 시딩하는 단계; 및
    (b) 줄기 세포를 2일의 기간 동안 저산소 조건하에 10 내지 50 ng/ml의 FGF2, 50 내지 250 ng/ml의 BMP4, 10 내지 15 ng/ml의 액티빈 A, 및 1 내지 2 mM의 LiCl을 포함하는 배양 배지에 접촉시켜, 중간엽혈관모세포 잠재성을 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFR알파+ 원시 중배엽 세포의 군집을 배양체의 형성 또는 기질 세포와의 공동배양 없이 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 콜라겐이 콜라겐 IV를 포함하는 방법.
  13. 제 2항에 있어서, 단계 (b)에서 이종항원-비함유 및 혈청알부민-비함유 배양 배지가 10 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF2; 및 20 ng/ml 내지 50 ng/ml의 VEGF을 포함하는 방법.
  14. 제 3항에 있어서, 단계 (c)의 이종항원-비함유 및 혈청알부민-비함유 배양 배지가 10 ng/ml 내지 50　ng/ml의 FGF2, 20 ng/ml 내지 50 ng/ml의 VEGF, 50 ng/ml 내지 100　ng/ml의 SCF, 50 ng/ml 내지 100 ng/ml의 TPO, 50 ng/ml 내지 100　ng/ml의 IL-6, 및 5 ng/ml 내지 15 ng/ml의 IL-3을 포함하는 방법.
  15. 제 4항에 있어서, 이종항원-비함유 및 혈청알부민-비함유 배양 배지가 50 내지 100　ng/ml의 SCF, 50 내지 100 ng/ml의 TPO, 50 내지 100　ng/ml의 IL-6, 및 5 내지 15 ng/ml의 IL-3을 포함하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 인간 만능성 줄기 세포가 적어도 0.25 ㎍/cm2 내지 1 ㎍/cm2 농도로 테나신 C 층을 포함하는 기질 상에 단일 세포 현탁액으로서 시딩되는 방법.
  17. 제 6항에 있어서, 테나신 C 층이 적어도 0.25 ㎍/cm2 내지 1 ㎍/cm2 농도인 방법.
  18. 제 6항에 있어서, 테나신 C 층이 0.5 ㎍/cm2 농도인 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 저산소 조건이 3% 내지 10% O2의 주위 산소 수준을 포함하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 줄기 세포가 콜라겐 IV를 포함하는 기질 상으로 시딩되는 방법.
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