CN115996735A

CN115996735A - 细胞组合物和治疗方法

Info

Publication number: CN115996735A
Application number: CN202180052054.0A
Authority: CN
Inventors: S·伊茨库; A·桑德拉萨格拉
Original assignee: Mesoblast International SARL
Current assignee: Mesoblast International SARL
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2021-08-10
Publication date: 2023-04-21
Also published as: US20230293590A1; JP2023537103A; CA3188492A1; AU2021324483A1; EP4192940A1; KR20230046298A; WO2022034506A1

Abstract

本公开涉及被修饰以引入溶瘤病毒的细胞组合物。此类组合物可以用于通过将溶瘤病毒递送至癌细胞来治疗癌症。

Description

细胞组合物和治疗方法

相关申请的交叉引用

本国际申请要求2020年8月10日提交的美国临时申请第63/063,657号的优先权权益，该申请通过引用以其整体并入本文。

技术领域

背景技术

癌症的治疗通常涉及手术切除、标准化疗和/或放射疗法，以去除或杀死肿瘤细胞。然而，由于肿瘤的侵袭性和/或对健康组织的附带损害，这些治疗的有效性通常是有限的。这种情况表明需要新的治疗策略，一种此类方法是使用病毒。

溶瘤病毒是能够在肿瘤细胞中特异性地复制并破坏肿瘤细胞的病毒，并且该性质是固有的或基因工程改造的。不幸的是，有希望的实验室结果尚未转化为改善的临床结果，并且这似乎是由肿瘤及其微环境、病毒和宿主免疫之间的复杂相互作用决定的。

因此，需要将溶瘤病毒递送至癌细胞的改进的方法。

发明内容

本发明的发明人已经确定间充质谱系前体细胞或干细胞能够将溶瘤病毒递送至癌细胞以减少癌细胞生长。本发明的发明人还发现，对于用溶瘤病毒感染靶细胞而言，间充质谱系前体细胞或干细胞是优于间充质干细胞的媒介物。

使用间充质谱系前体细胞或干细胞将溶瘤病毒递送至癌细胞的一个优点是间充质谱系前体细胞或干细胞归巢至癌细胞的能力。间充质谱系前体细胞或干细胞的迁移和粘附能力使它们特别适合于此目的。

使用间充质谱系前体细胞或干细胞将溶瘤病毒递送至癌细胞的另一个优点是其抑制炎性介质如TNF-α和/或IL-6的能力。表达高水平的ANG1和相对低水平的VEGF的间充质谱系前体细胞或干细胞可能特别适合于此目的。

因此，在第一个实例中，本公开涉及一种包括间充质谱系前体细胞或干细胞的组合物，其中所述细胞被修饰以引入溶瘤病毒。在一个实例中，间充质前体谱系或干细胞是STRO-1+。在一个实例中，间充质前体谱系或干细胞是STRO-3+。在一个实例中，间充质前体谱系或干细胞是TNAP+。在一个实例中，间充质前体谱系或干细胞表达选自由α1、α2、α3、α4和α5、αv、β1和β3组成的组的标志物中的一种或多种。在一个实例中，间充质谱系前体细胞尚未分化成间充质干细胞。

在另一实例中，本公开涉及一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括施用本公开的组合物。在一个实例中，所述方法包括施用包括STRO-1+间充质谱系前体细胞或干细胞的组合物，其中所述细胞被修饰以引入溶瘤病毒。在另一实例中，本公开涉及一种将溶瘤病毒递送至癌细胞中的方法，所述方法包括使癌细胞与已经被修饰以引入溶瘤病毒的间充质谱系前体细胞接触。在一个实例中，间充质前体谱系或干细胞表达STRO-1以及选自由α1、α2、α3、α4和α5、αv、β1和β3组成的组的标志物中的一种或多种。在一个实例中，接触发生在允许间充质谱系前体细胞或干细胞与癌细胞形成间隙连接的条件下，由此通过穿越间隙连接将溶瘤病毒递送至癌细胞。在一个实例中，间隙连接由Cx40或Cx43形成。在另一实例中，间隙连接由Cx43形成。在另一实例中，溶瘤病毒的递送是经由除了Cx43以外的机制进行的。在一个实例中，癌细胞是肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、骨肉瘤、乳腺癌或黑色素瘤细胞。在另一实例中，癌细胞是合胞体癌细胞。在另一实例中，溶瘤病毒被修饰以插入与由间充质谱系前体细胞或干细胞表达但不由癌细胞表达的寡核苷酸互补的核苷酸序列。在一个实例中，寡核苷酸是miRNA。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞基本上是STRO-1^bri。

在一个实例中，溶瘤病毒包括肿瘤特异性启动子和/或结合肿瘤特异性细胞表面分子的衣壳蛋白。例如，肿瘤特异性启动子可以是生存素启动子、COX-2启动子、PSA启动子、CXCR4启动子、STAT3启动子、hTERT启动子、AFP启动子、CCKAR启动子、CEA启动子、erbB2启动子、E2F1启动子、HE4启动子、LP启动子、MUC-1启动子、TRP1启动子、Tyr启动子。

在一个实例中，衣壳蛋白是纤维、五邻体或六邻体蛋白。

在另一实例中，溶瘤病毒包括用于转导地靶向肿瘤细胞的肿瘤特异性细胞表面分子。

在一个实例中，肿瘤特异性细胞表面分子选自由以下组成的组：整联蛋白、EGF受体家族成员、蛋白聚糖、二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside)、B7-H3、癌抗原125(CA-125)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、癌胚抗原(CEA)、肿瘤相关糖蛋白、分化簇19(CD19)、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD152、粘蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体a、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶(recepteur d'o gine nantais)(RON)受体和细胞毒性T淋巴细胞抗原4。

在一个实例中，溶瘤病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)、条件复制型腺病毒(CRAd)、腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒；慢病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、塞内加谷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或水泡性口炎病毒(VSV)和细小病毒。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达选自由Cx40、Cx43、Cx45、Cx32和Cx37组成的组的连接蛋白。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达选自由α2、α3和α5组成的组的整联蛋白。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞被修饰以引入杀死癌细胞但基本上不影响间充质谱系前体细胞或干细胞的存活力的溶瘤病毒。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞被修饰以在所述间充质谱系前体细胞或干细胞可以将所述溶瘤病毒递送至癌细胞之前引入不杀死所述间充质谱系前体细胞或干细胞的溶瘤病毒。

在另一实例中，溶瘤病毒表达病毒融合膜糖蛋白以介导间充质前体谱系或干细胞融合至肿瘤细胞的诱导。例如，病毒融合膜糖蛋白可以是长臂猿白血病病毒(GLAV)包膜糖蛋白、麻疹病毒蛋白F(MV-F)或麻疹病毒蛋白H(MV-H)。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.1μg/10⁶个细胞的量表达血管生成素-1(Ang1)。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.3μg/10⁶个细胞的量表达血管生成素-1(Ang1)。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.5μg/10⁶个细胞的量表达血管生成素-1(Ang1)。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.7μg/10⁶个细胞的量表达血管生成素-1(Ang1)。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少1.0μg/10⁶个细胞的量表达血管生成素-1(Ang1)。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以小于约0.05μg/10⁶个细胞的量表达血管内皮生长因子(VEGF)。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以小于约0.02μg/10⁶个细胞的量表达血管内皮生长因子(VEGF)。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约2:1的比率表达Ang1:VEGF。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约10:1的比率表达Ang1:VEGF。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约20:1的比率表达Ang1:VEGF。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约30:1的比率表达Ang1:VEGF。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约50:1的比率表达Ang1:VEGF。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞未被基因修饰以表达Ang1或VEGF。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞衍生自多能细胞。在一个实例中，多能细胞是诱导多能干(iPS)细胞。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1以及选自由α1、α2、α3、α4和α5、αv、β1和β3组成的组的标志物中的两种或更多种。

在另一实例中，本公开涉及一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括施用本文公开的组合物。在一个实例中，所述组合物包括表达STRO-1以及选自由α1、α2、α3、α4和α5、αv、β1和β3组成的组的标志物中的一种或多种的间充质谱系前体细胞或干细胞，其中所述细胞被修饰以引入溶瘤病毒。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达连接蛋白，所述连接蛋白也由包括受试者的癌症的癌细胞表达。例如，连接蛋白可以是Cx40或Cx43。

在一个实例中，癌细胞包括受试者的癌症的癌细胞表达Cx43。在一个实例中，癌症选自由肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤和黑色素瘤组成的组。

在另一实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞已经被处理以实现间充质谱系前体细胞或干细胞上的细胞表面聚糖的修饰。在一个实例中，处理涉及在导致间充质谱系前体细胞或干细胞上的细胞表面聚糖的修饰的条件下将间充质谱系前体细胞或干细胞暴露于糖基转移酶。在一个实例中，糖基转移酶是岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶或唾液酸转移酶。例如，岩藻糖基转移酶可以是岩藻糖基转移酶是α1,3岩藻糖基转移酶，如α1,3岩藻糖基转移酶III、α1,3岩藻糖基转移酶IV、α1,3岩藻糖基转移酶VI、α1,3岩藻糖基转移酶VII或α1,3岩藻糖基转移酶IX。

在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞暴露于外源性糖基转移酶，并且其中暴露于糖基转移酶导致细胞在体内炎症部位处的增强的保留。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞已经被修饰以引入编码糖基转移酶的核酸，并且其中糖基转移酶在细胞中的表达导致细胞在体内炎症部位处的增强的保留。

除非另有明确说明，否则本文中的任何实例应经必要修改后适用于任何其他实例。

本公开不限于本文描述的具体实例的范围，这些实例旨在仅用于举例说明的目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。

在整个说明书中，除非另有具体说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组应当视为涵盖一个和多个(即一个或多个)这些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组。

在下文中通过以下非限制性实例并参考附图来描述本公开。

附图说明

图1(A和B)：向MPC的病毒递送的总结。

图2(A和B)：GFP的慢病毒递送

图3(A和B)：GFP的腺病毒递送

图4(A和B)：GFP的rAAV-2递送

图5(A和B)：GFP的rAAV-DJ递送

图6(A和B)：HSVQ(亲代病毒)和HSV-P10(PTENα表达病毒)的病毒骨架。

图7(A和B)：间充质干细胞(MSC)的HSV-P10负载。

图8(A和B)：HSV-P10和HSVQ负载的间充质干细胞(MSC)的存活力。

图9(A和B)：HSV-P10负载的间充质干细胞(MSC)的PTENα的表达及其对PI3K/AKT信号传导通路的影响

图10：HSV-P10和HSVQ负载的间充质干细胞(MSC)向人乳腺癌细胞(MDA-468)的迁移。

图11(A和B)：HSV-P10负载的间充质干细胞(MSC)对人胶质瘤细胞的作用。

图12：与HSV-P10和HSVQ负载的间充质干细胞(MSC)共培养的DB7小鼠乳腺癌细胞的肿瘤细胞死亡的诱导。

图13(A和B)：溶瘤HSV在MSC和MPC中的复制。

图14：在感染溶瘤HSV后的MSC和MPC存活力。

图15：感染了RSV的A549。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图16：感染了RSV的H1299。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图17：感染了RSV的H1650。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图18：感染了RSV的LLC。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图19：感染了RSV的U2-OS。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图20：感染了RSV的SK-ES1。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图21：感染了RSV的4T1。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图22：MPC荧光显微术。

图23：感染了RSV的MPC。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图24：MSC荧光显微术。

图25：感染了RSV的MSC。LHS—荧光显微术；RHS–细胞存活力。

图26：在与来自RSV感染的MPC或MSC的上清液接触后，在A549细胞中的荧光显微术。表达红色荧光标志物mKate2的RSV。

图27：在与来自RSV感染的MPC或MSC的上清液接触后，在H1299细胞中的荧光显微术。表达红色荧光标志物mKate2的RSV。

图28：在与来自RSV感染的MPC或MSC的上清液接触后，在H1650细胞中的荧光显微术。表达红色荧光标志物mKate2的RSV。

图29：在与来自RSV感染的MPC或MSC的上清液接触后，在LLC细胞中的荧光显微术。表达红色荧光标志物mKate2的RSV。

图30：在与来自RSV感染的MPC或MSC的上清液接触后，在U2-OS细胞中的荧光显微术。表达红色荧光标志物mKate2的RSV。

图31：在与来自RSV感染的MPC或MSC的上清液接触后，在4T1细胞中的荧光显微术。表达红色荧光标志物mKate2的RSV。

具体实施方式

一般技术和选定的定义

除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语应当被视为具有与本领域(例如，分子生物学、细胞培养、干细胞分化、细胞疗法、基因修饰、病毒学、肿瘤学、生物化学、生理学和临床研究)的普通技术人员通常理解的相同含义。

除非另有说明，否则本公开中使用的分子和统计技术是本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在整个文献中以如下来源进行描述和解释：J.Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》,约翰·威利父子出版公司(John Wileyand Sons)(1984)，J.Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1989)，T.A.Brown(编辑)《基本分子生物学：实用方法(Essential Molecular Biology:APractical Approach)》,第1和2卷,IRL出版社(IRL Press)(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第1-4卷,IRL出版社(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人(编辑),《最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)》,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包含迄今为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编辑)《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室(Cold Spring HarbourLaboratory),(1988)，以及J.E.Coligan等人(编辑)《当前免疫学协议(Current Protocolsin Immunology)》,约翰·威利父子出版公司(包含迄今为止的所有更新)。

如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数和单数形式的术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”，例如，任选地包含复数指示物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“分析物”任选地包含一种或多种分析物。

如本文所用，除非有相反说明，否则术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选地+/-5％，更优选地+/-1％。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应该被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应该被视为对两种含义或对任一种含义提供了明确的支持。

在整个本说明书中，词语“包括(comprise)”或变体，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，应被理解为暗示包含所述要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

如本文所用的术语“连接蛋白”意指跨膜蛋白的大家族，其允许细胞间通讯以及离子及小信号传导分子的转移，并组装以形成间隙连接。连接蛋白是四通道跨膜蛋白，具有C和N细胞质末端、细胞质环(CL)和两个细胞外环(EL-I)和(EL-2)。连接蛋白以六个为一组被组装以形成半通道或连接蛋白，以及两个半通道(在每个细胞上一个)，然后结合以形成两个细胞之间的间隙连接。术语连接蛋白被缩写为Cx并且编码它的基因被缩写为Cx。

如本文所用的术语“间隙连接”意指细胞类型之间的特化细胞间连接。间隙连接直接连接两个细胞的细胞质，其允许如核酸、离子和电脉冲的各种分子直接通过细胞之间的调节门。

各种受试者可以施用根据本公开的细胞组合物。在一个实例中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是伴侣动物如犬或猫，或者家畜如马或牛。在另一实例中，受试者是人。术语如“受试者”、“患者”或“个体”在上下文中是可以在本公开中互换使用的术语。

如本文所用，术语“治疗”是指被设计成在临床病理学过程期间改变被治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗的期望的效果包含降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果与疾病相关联的一种或多种症状被缓解或消除，则个体被成功“治疗”。

“有效量”是指在必要的剂量和时间段内，达到期望的治疗或预防效果的至少有效量。可以在一次或多次施用中提供有效量。在本公开的一些实例中，术语“有效量”用于指对如上文所述的疾病或病状进行治疗所必需的量。有效量可以根据待治疗的疾病或病状以及根据体重、年龄、种族背景、性别、健康和/或身体状况以及与待治疗的哺乳动物相关的其他因素而变化。通常，有效量将落在相对较宽的范围内(例如“剂量”范围)，该范围可以由执业医师通过常规试验和实验来确定。有效量可以以单剂量施用，或者在治疗期间一次或几次重复给药。

“治疗有效量”至少是实现特定病症(例如癌症)的可测量改善所需的最小浓度。本文的治疗有效量可以根据如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及细胞组合物在个体中引发期望的响应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。在癌症的情况下，治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小原发肿瘤的大小；抑制(即，在一定程度上减慢，并且在一些实例中，停止)癌细胞向外周器官中的渗透；抑制(即，在一定程度上减慢，并且在一些实例中，停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制或延缓肿瘤生长或肿瘤进展；和/或在一定程度上缓解与病症相关联的症状中的一种或多种。就根据本公开的组合物可以防止生长和/或杀死现有的癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以例如通过评估存活的持续时间、疾病进展时间(TTP)、应答率(RR)、应答持续时间和/或生活质量来测量。

在一个实例中，在培养条件下确定特定标志物的水平。术语“培养条件”用于指在培养中生长的细胞。在一个实例中，培养条件是指活跃分裂的细胞的群体。在一个实例中，此类细胞可以处于指数生长期。例如，可以通过获取细胞培养基的样本并测量样本中标志物的水平来确定特定标志物的水平。在另一实例中，特定标志物的水平可以通过获取细胞的样本并测量细胞裂解物中标志物的水平来确定。本领域技术人员知道，分泌的标志物将通过对培养基进行取样来测量，而在细胞的表面上表达的标志物可以通过评估细胞裂解物的样本来测量。在一个实例中，当细胞处于指数生长期时获取样本。在一个实例中，样本在培养至少两天后获取。

培养来自冷冻保存的中间体的扩增细胞意指解冻经受低温冷冻的细胞，并在适合于细胞的生长的条件下进行体外培养。

间充质谱系前体(MPC)或干细胞

如本文所用，术语“间充质谱系前体细胞或干细胞”是指未分化的多能细胞，其具有在维持多能性的同时自我更新的能力和分化为多种间充质来源的细胞类型(例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和腱)或非中胚层来源的细胞类型(例如肝细胞、神经细胞和上皮细胞)的能力。

术语“间充质谱系前体细胞或干细胞”包含亲代细胞及其未分化的后代两者。该术语还包含间充质谱系前体细胞或干细胞(MPC)、多能基质细胞、间充质干细胞、血管周间充质谱系前体细胞或干细胞以及它们的未分化的后代。

间充质谱系前体细胞或干细胞可以是自体的、同种异体的、异种的、同基因的或等基因的。自体细胞是从将它们被重新移植的相同个体中分离出来的。同种异体细胞是从相同物种的供体中分离出来的。异种细胞是从另一物种的供体中分离出来的。同基因细胞或等基因细胞是从基因上相同的生物体(如双胞胎、克隆体或高度近亲繁殖的研究动物模型)中分离出来的。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞是同种异体的。在一个实例中，同种异体间充质谱系前体细胞或干细胞被培养扩增并冷冻保存。

间充质谱系前体细胞或干细胞主要存在于骨髓中，但也已经显示存在于多种宿主组织中，包含例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、小梁骨和牙髓。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1。在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞是从表达STRO-1+的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体中培养扩增的，然后被修饰以引入本文公开的溶瘤病毒。下文将进一步讨论培养物扩增及其方法。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和一种或多种整联蛋白。整联蛋白是一类细胞粘附受体，其介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质粘附事件两者。整联蛋白由异二聚体多肽组成，其中单个α链多肽与单个β链非共价缔合。现在存在约16种不同的α链多肽和至少约8种不同的β链多肽，它们组成了细胞粘附受体的整联蛋白家族。一般来说，不同的结合特异性和组织分布来源于α和β链多肽或整联蛋白亚基的独特组合。与特定整联蛋白缔合的家族通常以β亚基为特征。然而，整联蛋白的配体结合活性在很大程度上受α亚基的影响。

在一个实例中，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和具有β1(CD29)链多肽的整联蛋白。

在另一实例中，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和具有选自由α1(CD49a)、α2(CD49b)、α3(CD49c)、α4(CD49d)、α5(CD49e)和αv(CD51)组成的组的α链多肽的整联蛋白。因此，在一个实例中，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α1。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α2。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α3。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α4。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α5。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和αv。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1、α2和α3。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1、α2和α5。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1、α3和α5。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1、α2、α3和α5。

在另一实例中，本公开涵盖富集STRO-1和α1+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体。在本实例中，富集α1+细胞的群体可以包括至少约3％或4％或5％的α1+细胞。

在另一实例中，本公开涵盖富集STRO-1和α2+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体。在本实例中，富集α2+细胞的群体可以包括至少约30％或40％或50％的α2+细胞。

在另一实例中，本公开涵盖富集STRO-1和α3+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞群体。在本实例中，富集α3+细胞的群体包括至少约40％或45％或50％的α3+细胞。

在另一实例中，本公开涵盖富集STRO-1和α4+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体。在本实例中，富集α4+细胞的群体包括至少约5％或6％或7％的α4+细胞。

在另一实例中，本公开涵盖富集STRO-1和α5+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体。在本实例中，富集α5+细胞的群体包括至少约45％或50％或55％的α5+细胞。

在另一实例中，本发明涵盖富集STRO-1和αv+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体。在本实例中，富集αv+细胞的群体包括至少约5％或6％或7％的αv+细胞。

在另一实例中，本公开涵盖富集STRO-1、α1+、α3+、α4+和α5+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体。

在上述实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以具有β1链多肽。例如，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞可以表达选自由α1β1、α2β1、α3β1、α4β1和α5β1组成的组的整联蛋白。因此，在一个实例中，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α1β1。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α2β1。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α4β1。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和α5β1。

在另一实例中，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和具有β3(CD61)链多肽的整联蛋白。在一个实例中，本公开涵盖富集STRO-1和β3+细胞的间充质谱系前体细胞或干细胞的群体。在本实例中，富集β3+细胞的群体包括至少约8％或10％或15％的β3+细胞。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和αvβ3。在另一实例中，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和具有β5(ITGB5)链多肽的整联蛋白。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和αvβ5。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和αvβ6。

在另一实例中，根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞表达CD271。

可以使用本领域已知的各种方法来实现表达上述整联蛋白的间充质谱系前体细胞或干细胞的鉴定和/或富集。在一个实例中，可以使用商业上可获得的抗体(例如，Thermofisher；Pharmingen；Abcam)来利用荧光活化的细胞分选(FACS)来鉴定和选择表达期望的整联蛋白多肽链或其组合的细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1和柯萨奇病毒和腺病毒受体。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1、柯萨奇病毒和腺病毒受体以及上述整联蛋白中的一种或多种。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1、柯萨奇病毒和腺病毒受体、αvβ3和αvβ5。

在一个实例中，对间充质谱系前体细胞或干细胞进行基因修饰，以在其细胞表面上表达上述提及的整联蛋白或柯萨奇病毒和腺病毒受体中的一种或多种。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1，一种嵌合抗原受体(CAR)。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞表达STRO-1、CAR、αvβ3和αvβ5。

在一个实例中，表达CAR的间充质谱系前体细胞或干细胞可以引发T细胞介导的免疫应答。在另一实例中，CAR充当将间充质谱系前体细胞或干细胞附着于癌细胞的手段。在另一实例中，CAR充当触发间充质谱系前体细胞或干细胞与癌细胞的增强的粘附的手段。

在一个实例中，CAR由细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域组成。在一个实例中，抗原结合结构域对一种或多种肿瘤抗原具有亲和力。示例性的肿瘤抗原包含HER2、CLPP、707-AP、AFP、ART-4、BAGE、MAGE、GAGE、SAGE、b-连环蛋白/m、bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CEA、CASP-8、CDK/4、CDC-27、Cyp-B、DAM-8、DAM-10、ELV-M2、ETV6、G250、Gp100、HAGE、HER-2/neu、EPV-E6、LAGE、hTERT、生存素、iCE、MART-1、酪氨酸酶、MUC-1、MC1-R、TEL/AML和WT-1。

示例性的细胞内结构域包含CD3-ζ、CD28、4-IBB等，在一些情况下，CAR可以包括CD3-ζ、CD28、4-1BB、TLR-4的任何组合。

示例性的跨膜结构域可以衍生自T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、35CD 154的α、β或ζ链(即包括至少其跨膜区域)。在另一实例中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。

间充质谱系前体细胞或干细胞可以从宿主组织如上文提及的那些中分离并通过免疫选择富集。例如，来自受试者的骨髓抽吸物可以进一步用针对STRO-1或TNAP的抗体处理，以能够选择间充质谱系前体细胞或干细胞。在一个实例中，可以通过使用Simmons&Torok-Storb,1991中描述的STRO-1抗体来富集间充质谱系前体细胞或干细胞。

STRO-1+细胞是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞；并且能够分化成种系如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，STRO-1+细胞能够分化为大量细胞类型，包含但不限于脂肪、骨、软骨、弹性、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系承诺和分化途径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子的各种影响，如生长因子、细胞因子和/或由宿主组织建立的局部微环境条件。

如本文所用的术语“富集的”描述了细胞的群体，其中当与未处理的细胞的群体(例如在其天然环境中的细胞)相比时，一种特定细胞类型的比例或许多特定细胞类型的比例增加。在一个实例中，富集STRO-1+细胞的群体包括至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的STRO-1+细胞。在这方面，术语“富集STRO-1+细胞的细胞群体”将被理解为对术语“包括X％的STRO-1+细胞的细胞群体”提供明确的支持，其中X％是如本文所述的百分比。在一些实例中，STRO-1+细胞可以形成克隆形成集落，例如，CFU-F(成纤维细胞)或其亚群(例如，50％或60％或70％或70％或90％或95％)可以具有此活性。

在一个实例中，细胞的群体从包括可选择形式的STRO-1+细胞的细胞制剂中富集。在这方面，术语“可选择形式”将被理解为意指细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。标志物可以是STRO-1，但不必是STRO-1。例如，如本文所述和/或举例说明的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如MPC)也表达STRO-1(并且可以是STRO-1亮)。因此，细胞为STRO-1+的指示并不意味着细胞是通过STRO-1表达选择的。在一个实例中，至少基于STRO-3表达来选择细胞，例如，它们是STRO-3+(TNAP+)。

提及选择细胞或其群体不一定需要从特定的组织来源中选择。如本文所述，STRO-1+细胞可以选自或分离自或富集自多种来源。也就是说，在一些实例中，这些术语为从包括STRO-1+细胞的任何组织或血管化组织或包括周细胞的组织(例如，STRO-1+或3G5+周细胞)或本文所述的组织中的任何一种或多种进行选择提供了支持。

在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞单独地或共同地表达一种或多种标志物，该标志物选自由TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+组成的组。

术语“单独地”意指本公开单独地涵盖所列举的标志物或标志物的组，并且尽管单独的标志物或标志物的组在本文中可以不单独地列出，但是所附权利要求可以单独地并且可彼此分开地定义此类标志物或标志物的组。

“共同地”意指本公开涵盖所列举的标志物或标志物的组的任何数量或组合，并且尽管标志物或标志物的组的此类数量或组合在本文中可能没有具体列出，但是所附权利要求可以与标志物或标志物的组的任何其他组合分离地和分开地定义此类组合或子组合。

对于给定的标志物被称为“阳性”的细胞可以表达该标志物的低(lo或暗淡(dim)或晦暗(dull))、中间(中位)或高(亮，bri)水平，这取决于该标志物在细胞表面上存在的程度，其中这些术语涉及在细胞的分选过程或细胞的流式细胞术分析中使用的荧光或其他标志物的强度。低(lo或暗淡或晦暗)、中间(中位)或高(亮，bri)的区别将在待分类或分析的特定细胞群体上使用的标志物的上下文中理解。被称为对给定标志物“阴性”的细胞不一定完全不存在于该细胞中。该术语意指该标志物被该细胞以相对非常低的水平表达，并且当可检测地标记或在高于背景水平(例如，使用同种型对照抗体检测的水平)不可检测时，其产生非常低的信号。

如本文所用的术语“亮”或bri是指在细胞表面上的标志物，该标志物当被可检测地标记时产生相对高的信号。虽然不希望受到理论的限制，但提出“亮”细胞比样本中的其他细胞表达更多的靶标志物蛋白(例如，由STRO-1抗体识别的抗原)。例如，当用FITC缀合的STRO-1抗体标记时，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析所确定的，STRO-1bri细胞比非亮细胞(STRO-1lo/暗淡/晦暗/中间/中位)产生更大的荧光信号。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞从骨髓中分离，并通过选择STRO-1+细胞进行富集。在本实例中，“亮”细胞构成在起始样本中含有的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其他实例中，“亮”细胞构成在起始样本中含有的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个实例中，相对于“背景”，即作为STRO-1-的细胞，STRO-1亮细胞具有比STRO-1表面表达高2log量级的表达。相比之下，STRO-1lo/暗淡/晦暗和/或STRO-1中间/中位细胞具有比STRO-1表面表达高不到2log量级的表达，通常比“背景”高约1log或更低。

在一个实例中，STRO-1+细胞是STRO-1亮。在一个实例中，STRO-1亮细胞相对于STRO-1lo/暗淡/晦暗或STRO-1中间/中位细胞优先被富集。

在一个实例中，STRO-1亮细胞另外是TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+中的一种或多种。例如，针对前述标志物中的一种或多种选择细胞和/或显示细胞以表达前述标志物中的一种或多种。在这方面，显示表达标志物的细胞不需要被特异性地测试，而是先前富集的或分离的细胞可以被测试和随后使用，分离的或富集的细胞可以被合理地假定为也表达相同的标志物。

在一个实例中，STRO-1亮细胞是如WO 2004/85630中定义的血管周间充质谱系前体细胞或干细胞，其特征在于血管周标志物3G5的存在。

如本文所用，术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，该术语涵盖肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，TNAP是指可以结合由杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子，该杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约的规定于2005年12月19日保藏在ATCC，保藏号为PTA-7282。

此外，在一个实例中，STRO-1+细胞能够产生克隆形成CFU-F。

在一个实例中，相当大比例的STRO-1+细胞能够分化为至少两种不同的生殖系。细胞可以归属的谱系的非限制性实例包含骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其是胆管上皮细胞和肝细胞的多能细胞；神经限制性细胞，其可以产生进展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；进展为神经元的神经元前体；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖响应性胰岛素分泌胰腺β细胞系。其他谱系包含但不限于成牙本质细胞、产生牙本质的细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞如角质形成细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾小管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞是MSC。MSC可以是同质成分，或者可以是富集MSC的混合的细胞群体。可以通过培养贴壁的骨髓或骨膜细胞获得同质的MSC组合物，并且可以通过用独特的单克隆抗体鉴定的特异性细胞表面标志物来鉴定MSC。用于获得富集MSC的细胞群体的方法描述于例如美国专利5486359中。通过常规塑料贴壁分离制备的MSC依赖于CFU-F的非特异性塑料贴壁性质。在没有其他塑料贴壁骨髓群体的情况下，基于STRO-1通过免疫选择从骨髓中分离的间充质谱系前体细胞或干细胞特异性地从骨髓群体中分离克隆形成间充质前体。MSC的替代来源包含但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。在一个实例中，MSC是同种异体的。在一个实例中，对MSC进行冷冻保存。在一个实例中，对MSC进行培养扩增和冷冻保存。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞衍生自多能细胞，如诱导多能干细胞(iPS细胞)。在一个实施例中，多能细胞是人多能细胞。用于从多能细胞中产生间充质谱系前体细胞或干细胞的合适的工艺描述于，例如，US 7,615,374和US 2014273211，Barberi等人；《Plos医学(Plos medicine)》,第2卷(6):0554-0559(2005)，以及Vodyanik等人《细胞干细胞(Cell Stem cell)》,第7卷:718-728(2010)。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞是永生化的。用于产生永生化的间充质谱系前体细胞或干细胞的示例性工艺描述于，例如，Obinata M.,《细胞(Cell)》,第2卷:235-244(1997)，US 9,453,203，Akimov等人《干细胞(Stem Cells)》,第23卷:1423-1433，以及Kabara等人《实验室研究(Laboratory Investigation)》,第94卷:1340-1354(2014)。

在本公开的优选的实施例中，间充质谱系前体细胞或干细胞获自衍生自间充质谱系前体细胞或干细胞的主细胞库，该间充质谱系前体细胞或干细胞富集自健康志愿者的骨髓。使用来源于此类来源的间充质谱系前体细胞或干细胞对于没有合适的可用家庭成员可以作为间充质谱系前体细胞或干细胞供体的受试者，或需要立即治疗且在产生间充质谱系前体细胞或干细胞的时间期间处于高复发、疾病相关衰退或死亡风险的受试者尤其有利。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞表达Cx43。在另一实例中，间充质谱系前体细胞表达Cx40。在另一实例中，间充质谱系前体细胞表达Cx43和Cx40。在另一实例中，间充质谱系前体细胞表达Cx45、Cx32和/或Cx37。在一个实例中，间充质谱系前体细胞未被修饰以表达特定的连接蛋白。

分离的或富集的间充质谱系前体细胞可以通过培养进行体外扩增。分离的或富集的间充质谱系前体细胞可以被冷冻保存、解冻，并且随后通过培养进行体外扩增。

在一个实例中，将分离的或富集的间充质谱系前体细胞以50,000个活细胞/cm²接种在培养基(无血清或补充血清的)中，例如补充有5％胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺的α最小必需培养基(αMEM)，并且允许在37℃、20％ O²下粘附于培养容器过夜。随后根据需要更换和/或改变培养基，并将细胞在37℃、5％ O²下培养另外的68至72小时。

如本领域技术人员将理解的，培养的间充质谱系前体细胞与体内细胞在表型上不同。例如，在一个实施例中，它们表达以下标志物中的一种或多种：CD44、NG2、DC146和CD140b。培养的间充质谱系前体细胞在生物学上也不同于体内细胞，与体内大部分非循环(静止)细胞相比，具有更高的增殖速率。

在一个实例中，从单个供体或多个供体获得间充质谱系前体细胞或干细胞，其中供体样本或间充质谱系前体细胞或干细胞随后被混合，然后进行培养扩增。

由本公开涵盖的间充质谱系前体细胞或干细胞也可以在施用于受试者之前被冷冻保存。在一个实例中，在施用于受试者之前，对间充质谱系前体细胞或干细胞进行培养扩增和冷冻保存。

在一个实例中，本公开涵盖间充质谱系前体细胞或干细胞以及其后代、由其衍生的可溶性因子和/或从其分离的细胞外囊泡。在另一实例中，本公开涵盖间充质谱系前体细胞或干细胞以及从其分离的细胞外囊泡。例如，可以在适合于将细胞外囊泡分泌到细胞培养基中的条件下培养扩增本公开的间充质前体谱系或干细胞持续一段时间。随后可以从培养基中获得分泌的细胞外囊泡用于疗法。

如本文所用的术语“细胞外囊泡”是指从细胞中天然释放的脂质颗粒，并且其大小范围为约30nm到大至10微米，尽管通常它们的大小小于200nm。它们可以含有来自释放细胞(例如，间充质干细胞；STRO-1⁺细胞)的蛋白质、核酸、脂质、代谢物或细胞器。

如本文所用的术语“外来体”是指一类细胞外囊泡，其大小通常在约30nm至约150nm的范围内，并且来源于哺乳动物细胞的内体区室，它们从该区室被转运至细胞膜并被释放。它们可以含有核酸(例如，RNA；微小RNA)、蛋白质、脂质和代谢物，并且通过从一个细胞中分泌出来并被其他细胞摄取以递送其货物而在细胞间通讯中发挥作用。

细胞的培养扩增

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞被培养扩增。“培养扩增的”间充质谱系前体细胞或干细胞培养基与新鲜分离的细胞的区别在于它们已在细胞培养基中培养并传代(即亚培养)。在一个实例中，培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞被培养扩增持续约4-10代。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增持续至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10代。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5-10代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5-8代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5-7代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续超过10代。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续超过7代。在这些实例中，干细胞可以在被冷冻保存前进行培养扩增，以提供中间冷冻保存的MLPSC群体。在一个实例中，通过培养来自中间冷冻保存的MLPSC群体(或换句话说，冷冻保存的中间体)的细胞来产生本公开的组合物。

在一个实例中，本公开的组合物包括从冷冻保存的中间体中培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞。在一个实例中，从冷冻保存的中间体中扩增的细胞培养物被培养扩增持续至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10代。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5-10代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5-8代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续至少5-7代。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续超过10代。在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被培养扩增持续超过7代。

在一个实例中，从冷冻保存的中间体中培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞可以在不含动物蛋白的培养基中被培养扩增。在一个实例中，从冷冻保存的中间体中培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞可以在无异种培养基中被培养扩增。在一个实例中，从冷冻保存的中间体中培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞可以在不含胎牛血清的培养基中被培养扩增。

在一个实施例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以从单个供体或多个供体获得，其中供体样本或间充质谱系前体细胞或干细胞随后被混合，然后培养扩增。在一个实例中，培养扩增过程包括：

i.通过传代扩增来扩增活细胞的数目，以提供至少约10亿个活细胞的制剂，其中传代扩增包括建立分离的间充质谱系前体细胞或干细胞的原代培养物，然后连续建立来自先前培养物的分离的间充质谱系前体细胞或干细胞的第一非原代(P1)培养物；

ii.通过传代扩增将分离的间充质谱系前体细胞或干细胞的P1培养物扩增至间充质谱系前体细胞或干细胞的第二非原代(P2)培养物；以及，

iii.制备和冷冻保存从间充质谱系前体细胞或干细胞的P2培养物中获得的过程中的中间间充质谱系前体细胞或干细胞制剂；以及，

iv.解冻该冷冻保存的过程中的中间间充质谱系前体细胞或干细胞制剂，并通过传代扩增该过程中的中间间充质谱系前体细胞或干细胞制剂而扩增。

在一个实例中，扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞制剂具有抗原谱和活性谱，其包括：

i.小于约0.75％的CD45+细胞；

ii.至少约95％的CD105+细胞；

iii.至少约95％的CD166+细胞。

在一个实例中，相对于对照，扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞制剂能够抑制通过CD3/CD28活化的PBMC的IL2Rα表达至少约30％。

在一个实例中，培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞被培养扩增持续约4-10代，其中间充质谱系前体细胞或干细胞在被进一步培养扩增之前已经在至少2或3代之后被冷冻保存。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞被培养扩增持续至少1、至少2、至少3、至少4、至少5代，被冷冻保存，然后在根据本公开的方法被培养之前进一步培养扩增持续至少1、至少2、至少3、至少4、至少5代。

间充质谱系前体细胞或干细胞分离和离体扩增的过程可以使用本领域中已知的任何设备和细胞处理方法来进行。本公开的各种培养扩增实施例采用需要操作细胞的步骤，例如接种、饲养、解离贴壁培养物或洗涤的步骤。操作细胞的任何步骤都有可能损伤细胞。尽管间充质谱系前体细胞或干细胞在制备期间通常可以承受一定量的损伤，但优选地通过处理程序和/或设备来操作细胞，该处理程序和/或设备充分地执行给定的步骤，同时使对细胞的损伤最小化。

在一个实例中，在包含细胞来源袋、洗涤溶液袋、再循环洗涤袋、具有入口和出口端口的旋转膜过滤器、滤液袋、混合区、用于洗涤的细胞的终产物袋和合适的管道的设备中洗涤间充质谱系前体细胞或干细胞，例如如在US 6,251,295(其据此通过引用并入)中所述。

在一个实例中，根据本公开培养的间充质谱系前体细胞或干细胞组合物在CD105阳性和CD166阳性以及CD45阴性方面是95％同质的。在一个实例中，这种同质性通过离体扩增而持续存在；即通过多次群体倍增而持续存在。

在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞在3D培养中培养扩增。例如，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞可以在生物反应器中被培养扩增。在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞最初在2D培养中被培养扩增，然后在3D培养中被进一步扩增。在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞是从主细胞库培养扩增的。在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞在3D培养中接种之前，在2D培养中从主细胞库进行培养扩增。在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞在生物反应器中的3D培养中接种之前，在2D培养中从主细胞库培养扩增持续至少3天。在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞在生物反应器中的3D培养中接种之前，在2D培养中从主细胞库培养扩增持续至少4天。在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞在生物反应器中的3D培养中接种之前，在2D培养中从主细胞库培养扩增持续3至5天。在这些实例中，2D培养可以在细胞工厂中进行。各种细胞工厂产品可商购获得(例如，Thermofisher，Sigma)。

Ang1和VEGF水平

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.1μg/10⁶个细胞的量表达Ang1。然而，在其他实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.2μg/10⁶个细胞、0.3μg/10⁶个细胞、0.4μg/10⁶个细胞、0.5μg/10⁶个细胞、0.6μg/10⁶个细胞、0.7μg/10⁶个细胞、0.8μg/10⁶个细胞、0.9μg/10⁶个细胞、1μg/10⁶个细胞、1.1μg/10⁶个细胞、1.2μg/10⁶个细胞、1.3μg/10⁶个细胞、1.4μg/10⁶个细胞、1.5μg/10⁶个细胞的量表达Ang1。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以小于约0.05μg/10⁶个细胞的量表达VEGF。然而，在其他实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以小于约0.05μg/10⁶个细胞、0.04μg/10⁶个细胞、0.03μg/10⁶个细胞、0.02μg/10⁶个细胞、0.01μg/10⁶个细胞、0.009μg/10⁶个细胞、0.008μg/10⁶个细胞、0.007μg/10⁶个细胞、0.006μg/10⁶个细胞、0.005μg/10⁶个细胞、0.004μg/10⁶个细胞、0.003μg/10⁶个细胞、0.002μg/10⁶个细胞、0.001μg/10⁶个细胞的量表达VEGF。

在间充质谱系前体细胞或干细胞的组合物或培养物中表达的细胞Ang1和/或VEGF的量可以通过本领域技术人员已知的方法确定。此类方法包含但不限于定量测定，例如如定量ELISA测定。在本实例中，将来自间充质谱系前体细胞或干细胞的培养物的细胞裂解物加入到ELISA板的孔中。孔可以涂覆有针对Ang1或VEGF的初级抗体(单克隆或多克隆抗体)。然后洗涤孔，然后与针对初级抗体的二级抗体(单克隆或多克隆抗体)接触。例如，二级抗体与适当的酶(如辣根过氧化物酶)缀合。然后可以温育孔，然后在温育期后洗涤。然后使孔和与二级抗体缀合的酶的合适底物(如一种或多种发色体)接触。可以使用的发色体包含但不限于过氧化氢和四甲基联苯胺。在添加底物后，将孔温育持续适当的时间段。在温育完成后，向孔中加入“终止”溶液，以便终止酶与底物的反应。然后测量样本的光密度(OD)。将样本的光密度与含有已知量的Ang1或VEGF的样本的光密度相关联，以便确定通过待测试的干细胞的培养物表达的Ang1或VEGF的量。

在另一方面，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约2:1的比率表达Ang1:VEGF。然而，在其他实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约10:1、15:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、50:1的比率表达Ang1:VEGF。

用于确定Ang1:VEGF表达比率的方法对本领域技术人员来说将是显而易见的。例如，可以经由如上所述的定量ELISA对Ang1和VEGF表达水平进行定量。在定量Ang1和VEGF的水平之后，基于定量的Ang1和VEGF水平的比率可以被表示为：(Ang1的水平/VEGF的水平)＝Ang1:VEGF比率。

在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞未被基因修饰以在上述例举的水平或比率表达Ang1和/或VEGF。未被基因修饰以表达Ang1和/或VEGF的细胞未通过用表达或编码Ang1和/或VEGF的核酸转染而被修饰。为了避免疑问，在本公开的上下文中，用编码Ang1和/或VEGF的核酸转染的间充质谱系前体细胞或干细胞将被认为是基因修饰的。在本公开的上下文中，未被基因修饰以表达Ang1和/或VEGF的细胞在某种程度上天然表达Ang1和/或VEGF，而无需用编码Ang1和/或VEGF1的核酸转染。

溶瘤病毒

术语“溶瘤病毒”在本公开的上下文中用于指能够感染肿瘤细胞并减少肿瘤细胞的生长的病毒。例如，溶瘤病毒可以抑制细胞增殖。在另一实例中，溶瘤病毒可以杀死肿瘤细胞。在一个实例中，与相应的正常细胞相比，溶瘤病毒优先感染并抑制肿瘤细胞的生长。在另一实例中，与相应的正常细胞相比，溶瘤病毒优先在肿瘤细胞中复制并抑制肿瘤细胞的生长。

在一个实例中，溶瘤病毒能够自然地感染肿瘤细胞并减少肿瘤细胞的生长。此类病毒的实例包含新城疫病毒、水泡性口炎、粘液瘤、呼肠孤病毒、辛德毕斯病毒、麻疹和柯萨奇病毒。能够自然地感染肿瘤细胞并减少肿瘤细胞的生长的溶瘤病毒通常通过利用在这些细胞中发生的细胞畸变来靶向肿瘤细胞。例如，溶瘤病毒可以利用表面粘附受体、活化的癌基因如Ras、Akt、p53和/或干扰素(IFN)途径缺陷。

在另一实例中，由本公开涵盖的溶瘤病毒被工程改造成感染肿瘤细胞并减少肿瘤细胞的生长。适合于此类工程改造的示例性病毒包含溶瘤DNA病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)和痘苗病毒；以及溶瘤RNA病毒如慢病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、塞内加谷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和细小病毒如啮齿动物原细小病毒H-1PV。

在一个实例中，溶瘤病毒的肿瘤特异性可以被工程改造成突变或缺失病毒在正常细胞中存活所需但在癌细胞中可消耗的基因。为了避免疑问，具有突变的或缺失的基因的溶瘤病毒能够在间充质谱系前体细胞或干细胞中存活足够长的持续时间，以允许转移至癌细胞。例如，溶瘤病毒可以通过突变或缺失编码胸苷激酶(一种核酸代谢所需的酶)的基因被工程改造。在本实例中，病毒依赖于细胞胸苷激酶的表达，这种表达在增殖的癌细胞中很高，但在正常细胞中受到抑制。在另一实例中，溶瘤病毒被工程改造成包括结合肿瘤特异性细胞表面分子的衣壳蛋白。在一个实例中，衣壳蛋白是纤维、五邻体或六邻体蛋白。在另一实例中，溶瘤病毒被工程改造成包括用于转导地靶向肿瘤细胞的肿瘤特异性细胞表面分子。示例性的肿瘤特异性细胞表面分子可以包含整联蛋白、EGF受体家族成员、蛋白聚糖、二唾液酸神经节苷脂、B7-H3、CA-125、EpCAM、ICAM-1、DAF、A21、整联蛋白-α2β1、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、CEA、肿瘤相关糖蛋白、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD152、CD155、MUC1、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体a、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、PSMA、RON受体和细胞毒性T淋巴细胞抗原4。

在另一实例中，溶瘤病毒被工程改造成增加受感染的间充质谱系前体细胞或干细胞向癌细胞递送病毒有效载荷的能力。例如，溶瘤病毒可以被工程改造成表达病毒融合膜糖蛋白以介导间充质前体谱系或干细胞融合至肿瘤细胞的诱导。病毒融合膜糖蛋白的实例包含长臂猿白血病病毒(GLAV)包膜糖蛋白、麻疹病毒蛋白F(MV-F)和麻疹病毒蛋白H(MV-H)。

在一个实例中，病毒融合膜糖蛋白受晚期启动子如腺病毒主要晚期启动子的控制。在一个实例中，病毒融合膜糖蛋白受严格的晚期启动子如UL38p(WO 2003/082200)控制，其仅在病毒DNA复制开始后才具有活性。在Fu等人(2003)《分子疗法(MolecularTherapy)》,7:748-54以及Guedan等人(2012)《基因疗法(Gene Therapy)》,19:1048-1057中公开了此类启动子和工程改造的病毒的实例。

在一个实例中，溶瘤病毒具有复制能力。在一个实例中，当与相应的正常细胞和/或间充质谱系前体细胞或干细胞相比时，溶瘤病毒在肿瘤细胞中选择性复制。在一个实例中，溶瘤病毒的肿瘤特异性可以被工程改造成通过其对在肿瘤细胞中组成型活化的转录活性的依赖性(即条件性复制)来限制病毒复制。在一个实例中，溶瘤病毒是条件复制型慢病毒。在另一实例中，溶瘤病毒是条件复制型腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹病毒、新城疫病毒或牛痘病毒。

在一个实例中，通过插入驱动关键基因的表达的肿瘤特异性启动子来实现条件性复制。此类启动子可以基于肿瘤、相应的周围组织和/或间充质谱系前体细胞或干细胞之间的基因表达的差异来鉴定。例如，鉴定合适的肿瘤特异性启动子的一种方法是比较肿瘤、相应的正常组织和间充质谱系前体细胞或干细胞之间的基因表达水平，以鉴定在肿瘤中以高水平表达而在相应的健康组织和/或间充质谱系前体细胞或干细胞中以低水平表达的那些基因。肿瘤特异性启动子可以是天然的或复合的。示例性的天然启动子包含AFP、CCKAR、CEA、erbB2、Cerb2、COX2、CXCR4、E2F1、HE4、LP、MUC1、PSA、生存素、TRP1、STAT3、hTERT和Tyr。示例性的复合启动子包含AFP/hAFP、SV40/AFP、CEA/CEA、PSA/PSA、SV40/Tyr和Tyr/Tyr。本领域技术人员将理解，在一些情况下，合适的肿瘤特异性启动子将由靶肿瘤决定。例如，cerb2启动子可能适用于乳腺癌和胰腺癌，而PSA启动子可能适用于前列腺癌。

在另一实例中，肿瘤特异性启动子可以基于肿瘤细胞中与相应的正常细胞和/或间充质谱系前体细胞或干细胞相比的启动子活性的差异来鉴定。例如，鉴定合适的肿瘤特异性启动子的一种方法是比较肿瘤细胞、相应的正常细胞和/或间充质谱系前体细胞或干细胞之间的启动子活性，以鉴定在肿瘤细胞中具有高活性而在相应的正常细胞和/或间充质谱系前体细胞或干细胞中具有低活性的那些启动子。在一个实例中，肿瘤特异性启动子可以是晚期或严格晚期病毒启动子。术语“晚期”和“严格-晚期”用于指其活性取决于病毒DNA复制起始的启动子。因此，晚期和严格晚期启动子适用于包含在可以在肿瘤细胞中复制但在非分裂正常细胞中具有有限的复制能力的溶瘤病毒中。示例性的晚期或严格晚期启动子包含主要晚期启动子(MLP)和UL38p。

在一个实例中，溶瘤病毒是包括晚期或严格晚期启动子的呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒或腺病毒。例如，溶瘤病毒是包括UL38p启动子的单纯疱疹病毒。在另一实例中，溶瘤病毒是包括MLP病毒的腺病毒。

在另一实例中，溶瘤病毒的肿瘤特异性可以被工程改造成利用肿瘤特异性趋向性。在另一实例中，溶瘤病毒对在正常细胞和/或间充质谱系前体细胞或干细胞中表达的以低水平表达或在肿瘤细胞中不存在的寡核苷酸或结合蛋白敏感。例如，溶瘤病毒可以被工程改造成插入与由间充质谱系前体细胞或干细胞和/或正常细胞表达而未由癌细胞表达的寡核苷酸互补的核苷酸序列。例如，溶瘤病毒可能对抑制性寡核苷酸如miRNA敏感。在一些肿瘤细胞中以低水平表达并且在相应的正常细胞中以高水平表达的示例性的miRNA可以包含let-7a-5p、miR-122-5p、miR-125b-5p、miR-141-3p、miR-143-3p、miR-15a-5p、miR-16-5p、miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-192-5p、miR-195-5p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-211-5p、miR-215-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-29c-3p、miR-30a-5p、miR-30c-5p、miR-34a-5p、miR-34c-5p、miR-424-5p、miR-497-5p、miR-7-5p、miR-101-3p、miR-124-3p、miR-126-3p、miR-137、miR-138-5p、miR-140-5p、miR-152-3p、miR-185-5p、miR-214-3p、miR-25-3p、miR-26a-5p、miR-26b-5p、miR-372-3p、miR-517a-3p、miR-520c-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-200a-3p、miR-502-5p、let-7d-5p、let-7e-5p、let-7f-5p、miR-155-5p、miR-98-5p、let-7b-5p、miR-1、miR-100-5p、miR-125a-5p、miR-133a-3p、miR-133b、miR-146a-5p、miR-150-5p、miR-193a-3p、miR-193b-3p、miR-196b-5p、miR-206、miR-218-5p、miR-223-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-34b-3p、miR-449a、miR-542-5p、miR-99a-5p、let-7c-5p、let-7g-5p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-216b-5p、miR-622、miR-96-5p、miR-1291、miR-370-3p、miR-296-5p、miR-335-5p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-486-5p。

在另一实例中，溶瘤病毒可以被工程改造成在受感染的肿瘤细胞中表达基因。在一个实例中，基因的表达在间充质谱系前体细胞或干细胞中受到抑制。在一个实例中，基因增强针对受感染的肿瘤细胞的免疫应答。例如，基因可以是GM-CSF、FLT3L、CCL3、CCL5、IL2、IL4、IL6、IL12、IL15、IL 18、IFNA1、IFNB1、IFNG、CD80、4-1BBL、CD40L、热休克蛋白(HSP)或其组合。

各种病毒可以如上面提及的实例中所概述的那样被工程改造。在一个实例中，溶瘤病毒是修饰的呼吸道合胞病毒(RSV)、慢病毒、杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)或重组形式，如重组腺相关病毒(rAAV)及其衍生物，如自互补AAV病毒(scAAV)和非整合AV。例如，溶瘤病毒可以是修饰的慢病毒。在一个实例中，溶瘤病毒可以是修饰的RSV。

在其他实例中，溶瘤病毒可以是各种AV或AAV血清型中的一种。在一个实例中，溶瘤病毒是血清型1。在另一实例中，溶瘤病毒是血清型2。在其他实例中，溶瘤病毒是血清型3、4、7、8、9、10、11、12或13。在另一实例中，溶瘤病毒是血清型5。在另一实例中，溶瘤病毒是血清型6。

根据本公开可以被引入到间充质谱系前体细胞或干细胞的示例性的溶瘤病毒包含T-Vec(HSV-1；Amgen)、JX-594(疫苗；Sillajen)、JX-594(AdV；Cold Genesys)、呼肠孤病毒素(呼肠孤病毒；Oncolytics Biotech)。溶瘤病毒的其他实例公开在WO 2003/080083、WO2005/086922、WO 2007/088229、WO 2008/110579、WO 2010/108931、WO 2010/128182、WO2013/112942、WO 2013/116778、WO 2014/204814、WO 2015/077624and WO 2015/166082、WO2015/089280中。

在一个实例中，溶瘤病毒是复制缺陷型的。例如，可以用具有肿瘤特异性启动子的表达盒突变、缺失或替换复制基因。在一个实例中，E1/E3基因被突变、缺失或替换。在另一实例中，E1A/E1B基因被突变、缺失或替换。例如，在AV的情况下，E1/E3基因可以被突变、缺失或替换。在AAV的上下文中，E1A和E1B基因可以被突变、缺失或替换。上文讨论了合适的肿瘤特异性启动子的各种实例。

在其他实例中，溶瘤病毒可以包括突变的E1、E3、E1A或E1B基因。例如，E1A基因可以在编码成视网膜细胞瘤蛋白(RB)结合位点的区域中突变。在另一实例中，E3基因可以在编码内质网保留结构域的区域中突变。在另一实例中，溶瘤病毒可以包括γ-34.5基因和/或α-47基因中的突变。

在一个实例中，溶瘤病毒在间充质谱系前体细胞或干细胞中是复制缺陷型的，并且在肿瘤细胞中具有复制能力。在Nakashima等人(2014)《病毒学杂志(Journal ofVirology)》,第88卷:345-353中描述了将复制缺陷型病毒转变为具有复制能力病毒的实例。这种类型的其他示例性病毒包含RGD突变体，如在Shen等人(2016)PlosOne11:e0147173中描述的那些，在肿瘤细胞特异性启动子如α-趋化因子SDF-1受体(CXCR4)、生存素、环加氧酶-2(COX-2)和中期因子的控制下，在E1中包括δ24突变的病毒，其能够实现在pRb或p53失活的肿瘤细胞中的复制和/或E1的调节的表达。

修饰

本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞可以被修饰以引入上面提及的溶瘤病毒。当溶瘤病毒已经通过任何合适的人工操作手段被转移到细胞中时，或者在细胞是携带溶瘤病毒的原始改变的细胞的后代的情况下，间充质谱系前体细胞或干细胞被认为是“修饰的”。

可以使用本领域已知的各种方法修饰间充质谱系前体细胞或干细胞。在一个实例中，使间充质谱系前体细胞或干细胞与溶瘤病毒在体外接触。例如，可以将溶瘤病毒加入到间充质谱系前体细胞或干细胞培养基中。在另一实例中，用溶瘤病毒离心间充质谱系前体细胞或干细胞。

感染的效率很少是100％，并且通常需要富集已经被成功修饰的细胞的群体。在一个实例中，可以通过利用新基因型的功能特征来富集修饰的细胞。富集修饰的细胞的一种示例性方法是使用对药物(如新霉素)的抗性的阳性选择或基于lacZ的表达的比色选择。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞被修饰以引入与间充质谱系前体细胞或干细胞相比优先杀死癌细胞的溶瘤病毒。

在另一实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞被修饰以在该间充质谱系前体细胞或干细胞可以将溶瘤病毒递送至癌细胞之前引入不杀死间充质谱系前体细胞或干细胞的溶瘤病毒。

递送至癌细胞

本发明的发明人已经鉴定了间充质谱系前体细胞或干细胞可以将溶瘤病毒转移至癌细胞。因此，在一个实例中，本公开涵盖通过使癌细胞与已经被修饰以引入上面提及的溶瘤病毒的间充质谱系前体细胞或干细胞接触而将上面提及的溶瘤病毒递送至癌细胞的方法。为了避免疑问，被递送至癌细胞的溶瘤病毒是引入到间充质谱系前体细胞或干细胞的溶瘤病毒。

术语“接触”在本公开的上下文中用于指“直接”或“间接”接触。“直接接触”在本公开的上下文中用于指癌细胞和促进溶瘤病毒的转移的修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞之间的物理接触。例如，癌细胞和修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以经由共同的连接蛋白(即由癌细胞和修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞两者表达的连接蛋白)直接接触。在本实例中，共同的连接蛋白促进溶瘤病毒经由间隙连接从间充质谱系前体细胞或干细胞转移到癌细胞。因此，在一个实例中，接触发生在允许间充质谱系前体细胞或干细胞与癌细胞形成间隙连接的条件下，由此通过穿越间隙连接将溶瘤病毒递送至癌细胞。在一个实例中，间隙连接由Cx40形成。在另一实例中，间隙连接由Cx43形成。在另一实例中，间隙连接由Cx45、Cx32和/或Cx37形成。

“间接接触”在本公开的上下文中用于指在没有直接接触的情况下将溶瘤病毒从修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞递送至癌细胞。例如，与癌细胞非常接近的修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以与癌细胞间接接触。在一个实例中，与癌细胞间接接触的修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以经由外来体将溶瘤病毒递送至癌细胞。

在另一实例中，与癌细胞直接接触的修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以经由共同的连接蛋白和间接地经由外来体将溶瘤病毒递送至癌细胞。

接受来自修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞的溶瘤病毒的癌细胞没有特别限制，只要它们可以被修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞直接或间接接触以促进溶瘤病毒的转移。在一个实例中，癌细胞是胰腺癌细胞。在另一实例中，癌细胞是肺癌细胞。在另一实例中，癌细胞是宫颈癌细胞。在另一实例中，癌细胞是结肠直肠癌细胞。在另一实例中，癌细胞是肝癌细胞。在另一实例中，癌细胞是骨肉瘤细胞。在另一实例中，癌细胞是乳腺癌细胞。在另一实例中，癌细胞是前列腺癌细胞。在另一实例中，癌细胞是黑色素瘤细胞。

在另一实例中，癌细胞与修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞具有共同的连接蛋白。在一个实例中，癌细胞表达Cx40。在另一实例中，癌细胞表达Cx43。在另一实例中，癌细胞表达Cx45、Cx32和/或Cx37。

在另一实例中，癌细胞是合胞体癌细胞。术语“合胞体的”在本公开的上下文中用于指由通过具有间隙连接的专门膜互连的细胞组成的癌性组织或块，该细胞在动作电位中是电同步的。

可以在体外或体内促进溶瘤病毒从修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞向癌细胞的递送。在一个实例中，通过将修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞与癌细胞共培养，可以在体外促进溶瘤病毒从修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞向癌细胞的递送。在一个实例中，通过向受试者施用修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞，可以在体内促进溶瘤病毒从修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞向癌细胞的递送。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被全身性地施用，如例如通过静脉内、动脉内或腹膜内施用。在其他实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以通过鼻内或肌内施用被施用。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞施用至紧邻癌细胞的部位，如周围组织。在另一实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞直接施用于癌症。

改善的间充质谱系前体细胞或干细胞的保存和/或归巢

在一方面，处理本文定义的间充质谱系前体细胞或干细胞以修饰其细胞表面聚糖。细胞表面蛋白如CD44上的聚糖的修饰已经被证明产生E-选择素配体，该E-选择素配体可以与体内在炎症部位的微血管上表达的E-选择素分子结合。以这种方式，对间充质谱系前体细胞或干细胞上的细胞表面聚糖的修饰改善了间充质谱系前体细胞或干细胞在体内归巢至组织损伤的位点。

本发明的发明人还发现糖基转移酶介导的细胞表面聚糖的修饰改善了冷冻保存后的细胞存活力(即在冷冻-解冻循环后更多的细胞是有活力的)。因此，在一个实例中，本公开涵盖已经在修饰细胞上的细胞表面聚糖的条件下用糖基转移酶(E.C 2.4)处理的间充质谱系前体细胞或干细胞的冷冻保存的群体。在另一实例中，本公开涵盖冷冻保存间充质谱系前体细胞或干细胞的方法，该方法包括：在导致细胞上的细胞表面聚糖的修饰的条件下，用糖基转移酶处理间充质谱系前体细胞或干细胞的群体，以及在组合物中冷冻保存细胞。在另一实例中，本公开涵盖产生治疗性细胞的方法，该方法包括：在导致细胞上的细胞表面聚糖的修饰的条件下，用糖基转移酶处理间充质谱系前体细胞或干细胞的群体，以及在组合物中冷冻保存细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞“处理”包含在其中糖基转移酶具有酶活性的条件下使细胞与糖基转移酶接触。在本实例中，糖基转移酶修饰间充质谱系前体细胞或干细胞上的细胞表面聚糖。细胞表面聚糖修饰的实例是岩藻糖基化。在一个实例中，CD44被修饰。在另一实例中，CD14被修饰。在另一实例中，CD44、CD14、CD3和CD19中的一种或多种被修饰。

在一个实例中，使用流式细胞术鉴定表面聚糖修饰。在本实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞具有比未处理的间充质谱系前体细胞高1log量级的岩藻糖基化细胞表面聚糖的表达。在另一实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞具有比未处理的间充质谱系前体细胞高2log量级的岩藻糖基化细胞表面聚糖的表达。在另一实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞具有比未处理的间充质谱系前体细胞高3log量级的岩藻糖基化细胞表面聚糖的表达。例如，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以具有比未处理的间充质谱系前体细胞高1log量级的岩藻糖基化CD14的表达。在另一实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞具有比未处理的间充质谱系前体细胞高2log量级的岩藻糖基化CD14的表达。在另一实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞具有比未处理的间充质谱系前体细胞高3log量级的岩藻糖基化CD14的表达。

在一个实例中，“处理”包含在核苷酸糖供体底物的存在下使间充质谱系前体细胞或干细胞与糖基转移酶接触。合适的供体底物包含岩藻糖、半乳糖、唾液酸或N-乙酰基葡萄糖胺。例如，底物可以是GDP-岩藻糖。

例如，治疗可以涉及使间充质谱系前体细胞或干细胞的群体与外源性糖基转移酶如岩藻糖基转移酶接触。在本实例中，可以将糖基转移酶添加到包括间充质谱系前体细胞或干细胞的细胞培养基或其他生理学上可接受的溶液中。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞可以在包括糖基转移酶的培养基中培养。在另一实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞悬浮在包括糖基转移酶的培养基中。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞可以从培养物中解离并重新悬浮在包括糖基转移酶的合适培养基中。在一个实例中，可以使用乙二胺四乙酸(EDTA)解离细胞。在另一实例中，可以使用单独的蛋白酶如胰蛋白酶或与EDTA联合解离细胞。

在一个实例中，细胞培养基包括至少1.8μg的糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括至少2.0μg的糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括至少2.5μg的糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括2μg至15μg的糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括2μg至10μg的糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括2μg至5μg的糖基转移酶。在一个实例中，细胞培养基包括至少1.8μg的岩藻糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括至少2.0μg的岩藻糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括至少2.5μg的岩藻糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括2μg至15μg的岩藻糖基转移酶。在另一实例中，细胞培养基包括2μg至10μg的岩藻糖基转移酶。在另一实例中，向细胞培养基中加入2μg至5μg的岩藻糖基转移酶。在这些实例中，糖基转移酶可以以30μl的反应体积提供给约5×10⁵个间充质谱系前体细胞或干细胞。

例如，可以在被称为外岩藻糖基化的过程中用外源性糖基转移酶处理间充质谱系前体细胞或干细胞。在本实施例中，糖基转移酶可以在具有低水平的二价金属辅因子的生理学上可接受的溶液中提供。在各种实施例中，生理学上可接受的溶液被缓冲。生理学上可接受的溶液可以是，例如，Hank的平衡盐溶液，Dulbecco的改良Eagle培养基，Good的缓冲液(参见N.E.Good,G.D.Winget,W.Winter,T N.Conolly,S.Izawa和R.M.M.Singh(Good,G.D.Winget,W.Winter,T N.Conolly,S.Izawa and R.M.M.Singh),《生物化学(Biochemistry)》5,467(1966)；N.E.Good,S.Izawa,《酶学方法(Methods Enzymol.)》24,62(1972)，如HEPES缓冲液、2-吗啉代乙烷磺酸(MES)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

在一个实例中，生理学上可接受的溶液基本上不含甘油。

在另一实例中，通过修饰细胞以表达糖基转移酶，用糖基转移酶处理间充质谱系前体细胞或干细胞。例如，糖基转移酶可以由间充质谱系前体细胞或干细胞在细胞内产生。在本实施例中，将编码糖基转移酶的核酸分子引入到间充质谱系前体细胞或干细胞中。然后，糖基转移酶由间充质谱系前体细胞或干细胞表达，以实现其表面聚糖的修饰。

当编码糖基转移酶的核酸已经通过任何合适的人工操作手段转移到细胞中时，或者在细胞是携带编码糖基转移酶的核酸的最初改变的细胞的后代的情况下，间充质谱系前体细胞或干细胞被认为是“基因修饰以表达糖基转移酶”。细胞可以被稳定地或瞬时地修饰以表达糖基转移酶。

在一个实例中，糖基转移酶在基因修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞中的表达导致细胞在体内炎症部位处的增强的保留。例如，基因修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以保留在肿瘤或其转移处。在另一实例中，基因修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以保留在器官移植排斥的部位。在另一实例中，基因修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞可以保留在损伤的部位，如梗塞的心脏。各种方法可用于确定基因修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞是否保留在体内炎症的部位。在一个实例中，使用放射性示踪剂或其他合适的标记对细胞进行体内成像。

间充质谱系前体细胞或干细胞可以使用本领域已知的各种方法进行基因修饰。在一个实例中，在体外用病毒载体处理间充质谱系前体细胞或干细胞。基因修饰的病毒已经被广泛应用于核酸向细胞中的递送。用于本文所述的细胞的基因修饰的示例性病毒载体包含逆转录病毒载体，如γ逆转录病毒载体、慢病毒、鼠白血病病毒(MLV或MuLV)和腺病毒。例如，可以将病毒加入到间充质谱系前体细胞或干细胞培养基中。也可以采用非病毒方法。实例包含质粒转移和通过使用整合酶或转座酶技术、脂质体或蛋白质转导结构域介导的递送和物理方法如电穿孔来应用靶向的基因整合。

基因修饰的效率很少是100％，并且通常需要富集已经被成功地修饰的细胞的群体。在一个实例中，可以通过利用新基因型的功能特征来富集修饰的细胞。富集修饰的细胞的一种示例性方法是使用对药物(如新霉素)的抗性的阳性选择或基于lacZ的表达的比色选择。

在各种实施例中，使间充质谱系前体细胞或干细胞与多于一种的糖基转移酶及其合适的供体底物(例如糖)接触。例如，使细胞同时或依次与两种糖基转移酶接触，每一种糖基转移酶都以适当的连接向(延伸的)核心聚糖结构中添加不同的单糖。在另一实例中，基因修饰的细胞表达两种糖基转移酶。

在一个实施例中，经处理的间充质谱系前体细胞或干细胞表达CD44，例如，α(2,3)唾液酸化的CD44。在另一个实施例中，间充质谱系前体细胞或干细胞不表达CD34或PSGL-1。在一个实例中，经处理的间充质谱系前体细胞或干细胞结合E-选择素和/或L-选择素。在一个实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞不结合P-选择素。

在另一实例中，CD14在经处理的间充质谱系前体细胞或干细胞上被岩藻糖基化。在另一实例中，CD14和CD3在经处理的间充质谱系前体细胞或干细胞上被岩藻糖基化。

在一个实施例中，糖基转移酶能够在37℃下在pH 6.5下每分钟转移1.0毫摩尔的糖。

在一个实例中，糖基转移酶是岩藻糖基转移酶(催化L-岩藻糖的转移)。在另一实例中，糖基转移酶是α1,3岩藻糖基转移酶，例如α1,3岩藻糖基转移酶III、α1,3岩藻糖基转移酶IV、α1,3岩藻糖基转移酶VI、α1,3岩藻糖基转移酶VII、α1,3岩藻糖基转移酶IX、α1,3岩藻糖基转移酶X、α1,3岩藻糖基转移酶XI)。例如，可以用α1,3岩藻糖基转移酶VII处理细胞。在另一实例中，可以用α1,3岩藻糖基转移酶VI处理细胞。在这些实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞的岩藻糖基化可以通过检测经处理的细胞结合至选择素如E-选择素的能力的增加和/或经处理的细胞与本领域中已知的结合至sLeX的抗体(包含但不限于HECA-452)的反应性的增加来鉴定。

在另一实例中，糖基转移酶是半乳糖基转移酶(催化半乳糖的转移)。在另一实例中，糖基转移酶是唾液酸转移酶(催化唾液酸的转移)。

治疗方法

在一个实例中，可以施用根据本公开的组合物以用于治疗癌症。术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以未调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包含但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤以及白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包含但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包含小细胞肺癌)、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包含胃肠癌和胃肠间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、雀斑样恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包含低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小物非切割的细胞NHL；大块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与血小板增多症、水肿(如与脑瘤相关的水肿)、梅格斯综合征(Meigs'syndrome)、脑癌、以及头颈癌和相关转移瘤相关联的异常血管增生。

在一个实例中，癌症为胰腺癌。在另一实例中，癌症是肺癌。在另一实例中，癌症是宫颈癌。在另一实例中，癌症是结肠直肠癌。在另一实例中，癌症是肝癌。在另一实例中，癌症是骨肉瘤。在另一实例中，癌症是前列腺癌。在另一实例中，癌症是黑色素瘤。

在另一实例中，根据本公开治疗的癌症包括与根据本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞共享共同的连接蛋白的细胞。在本实例中，共同的连接蛋白促进核酸从间充质谱系前体细胞或干细胞转移到癌细胞。

在一个实例中，癌症包括表达Cx40的细胞。在另一实例中，癌症包括表达Cx43的细胞。在另一实例中，癌症包括表达Cx40和Cx43的细胞。

细胞组合物

在实施本公开的方法时，间充质谱系前体细胞或干细胞可以以组合物的形式施用。

根据本公开的示例性组合物可以包括已经被修饰以引入溶瘤病毒的间充质谱系前体细胞或干细胞。示例性的溶瘤病毒如上所述。在一个实例中，根据本公开的组合物可以包括已经被修饰以引入上面提及的溶瘤病毒的间充质谱系前体细胞或干细胞或其组合。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞可以被修饰以引入溶瘤病毒，其被表征为条件复制型腺病毒(CRAd)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒、疫苗病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、辛德毕斯病毒、RSV、麻疹和细小病毒如啮齿动物原细小病毒H-1PV。在一个实例中，可以修饰间充质谱系前体细胞或干细胞以引入条件复制型慢病毒。

在另一实例中，根据本公开的组合物可以包括经修饰以引入溶瘤病毒的间充质谱系前体细胞或干细胞，溶瘤病毒基本上不影响间充质谱系前体细胞或干细胞的存活力。

在另一实例中，根据本公开的组合物可以包括经修饰以引入溶瘤病毒的间充质谱系前体细胞或干细胞，溶瘤病毒在间充质谱系前体细胞或干细胞可以将溶瘤病毒递送至癌细胞之前不杀死间充质谱系前体细胞或干细胞。

在一个实例中，此类组合物包括药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

术语“载剂”和“赋形剂”是指本领域中常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质组合物(参见，例如，雷明顿制药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)，第16版，麦克出版公司(Mac Publishing Company)(1980)。载剂也可以减少活性化合物的任何不期望的副作用。合适的载剂例如是稳定的，例如不能与载剂中的其他成分反应。在一个实例中，在用于治疗的剂量和浓度下，载剂在接受者中不产生显著的局部或全身不良作用。

用于本公开的合适的载剂包含常规使用的那些，例如水、盐水、水性右旋糖、乳糖、林格氏溶液、缓冲溶液、透明质烷和二醇是示例性的液体载剂，特别是(当等渗时)用于溶液的液体载剂。合适的药物载剂和赋形剂包含淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一实例中，载剂是培养基组合物，例如细胞在该培养基组合物中生长或悬浮。这种培养基组合物在施用其的受试者中不产生任何不良作用。

示例性的载剂和赋形剂不会不利地影响细胞的存活力和/或细胞治疗或预防疾病的能力。

在一个实例中，载剂或赋形剂提供缓冲活性以将细胞和/或可溶性因子维持在合适的pH，从而发挥生物学活性，例如，载剂或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载剂或赋形剂，因为它与细胞和因子最低限度地相互作用并且允许细胞和因子的快速释放，所以在这种情况下，本公开的组合物可以制成液体，用于直接施加到血流或施加到组织或组织周围或邻近组织的区域，例如通过注射。

本文所述的细胞组合物可以单独施用或作为与其他细胞的混合物施用。不同类型的细胞可以在施用前立即或不久与本公开的组合物混合，或者它们可以在施用前共培养一段时间。

在一个实例中，组合物包括有效量或治疗有效量的细胞。例如，组合物包括约1×10⁵个细胞至约1×10⁹个细胞或约1.25×10³个细胞至约1.25×10⁷个细胞。待施用的细胞的确切数量取决于多种因素，包含受试者的年龄、体重和性别，以及所治疗的病症的程度和严重程度。

示例性的剂量包含至少约1.2×10⁸至约8×10¹⁰个细胞，如约1.3×10⁸至约8×10⁹个细胞、约1.4×10⁸至约8×10⁸个细胞、约1.5×10⁸至约7.2×10⁸个细胞、约1.6×10⁸至约6.4×10⁸个细胞、约1.7×10⁸至约5.6×10⁸个细胞、约1.8×10⁸至约4.8×10⁸个细胞、约1.9×10⁸至约4.0×10⁸个细胞、约2.0×10⁸至约3.2×10⁸个细胞、约2.1×10⁸至约2.4×10⁸个细胞。例如，剂量可以包含至少约1.5×10⁸个细胞。例如，剂量可以包含至少约2.0×10⁸个细胞。

换句话说，示例性的剂量包含至少约1.5×10⁶个细胞/kg(80kg受试者)。在一个实例中，剂量可以包含至少约2.5×10⁶个细胞/kg。在其他实例中，剂量可以包括约1.5×10⁶至约1×10⁹个细胞/kg、约1.6×10⁶至约1×10⁸个细胞/kg、约1.8×10⁶至约1×10⁷个细胞/kg、约1.9×10⁶至约9×10⁶个细胞/kg、约2.0×10⁶至约8×10⁶个细胞/kg、约2.1×10⁶至约7×10⁶个细胞/kg、约2.3×10⁶至约6×10⁶个细胞/kg、约2.4×10⁶至约5×10⁶个细胞/kg、约2.5×10⁶至约4×10⁶个细胞/kg、约2.6×10⁶至约3×10⁶个细胞/kg。

在一个实例中，修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞占组合物的细胞群体的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％。

可以冷冻保存本公开的组合物。间充质谱系前体细胞或干细胞的冷冻保存可以使用本领域已知的慢速冷却方法或“快速”冷冻方案进行。优选地，冷冻保存的方法与未冷冻的细胞相比保持了相似的表型、细胞表面标志物和冷冻保存的细胞的生长率。

冷冻保存的组合物可以包括冷冻保存溶液。冷冻保存溶液的pH通常为6.5至8，优选地为7.4。

冷冻保存的溶液可以包括无菌的、无热原的等渗溶液，如例如PlasmaLyte A^TM。100mL的PlasmaLyte A^TM含有526mg的氯化钠，USP(NaCl)；502mg的葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)；368mg的三水乙酸钠，USP(C2H3NaO2·3H2O)；37mg的氯化钾，USP(KCl)；和30mg的氯化镁，USP(MgCl2·6H2O)。它不含抗微生物药剂。用氢氧化钠调节pH。pH为7.4(6.5至8.0)。

冷冻保存溶液中可以包括Profreeze^TM。冷冻保存溶液可以另外地或替代地包括培养基，例如αMEM。

为了便于冷冻，通常向冷冻保存溶液中加入冷冻保护剂，如例如二甲基亚砜(DMSO)。理想地，冷冻保护剂应当为对细胞和患者无毒、非抗原、化学惰性，在解冻后提供高的存活率并允许移植而无需洗涤。然而，最常用的冷冻保护剂DMSO显示出一定的细胞毒性。羟乙基淀粉(HES)可以用作替代品或与DMSO结合使用，以降低冷冻保存溶液的细胞毒性。

冷冻保存溶液可以包括DMSO、羟乙基淀粉、人血清组分和其他蛋白质填充剂中的一种或多种。在一个实例中，冷冻保存溶液包括约5％的人血清白蛋白(HSA)和约10％的DMSO。冷冻保存溶液可以进一步包括甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和海藻糖中的一种或多种。

在一个实施例中，将细胞悬浮在42.5％的Profreeze^TM/50％αMEM/7.5％ DMSO中，并在受控速率的冷冻机中冷却。

冷冻保存的组合物可以解冻并且直接施用于受试者或加入到另一种溶液中，例如，包括透明质酸的溶液。可替代地，可以在施用前将冷冻保存的组合物解冻，并且将间充质谱系前体细胞或干细胞重悬浮在替代的载剂中。

在一个实例中，本文所述的细胞组合物可以单剂量施用。在另一实例中，细胞组合物以多剂量施用。例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个剂量。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以在施用前培养扩增。间充质谱系前体细胞或干细胞培养的各种方法是本领域中已知的。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞在施用前在无血清培养基中培养扩增。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞在施用前可以被传代至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、10次或更多次。

间充质谱系前体细胞或干细胞可以被全身性地施用，如例如通过静脉内、动脉内或腹膜内施用。间充质谱系前体细胞或干细胞也可以通过鼻内、肌内或心内施用被施用。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞直接施用于受试者的肿瘤中。

实例

实例1-评估间充质谱系前体细胞的病毒递送系统

在人间充质前体细胞(MPC)中评估了三种不同病毒递送系统的有效性。从冷冻的贮备液中取出两个批次的MPC，并且以5,000、10,000和15,000个细胞/cm²直接接种到96孔板中。在加入病毒颗粒之前，允许细胞在37℃下在5％ CO₂的情况下粘附过夜。测试了三种病毒递送系统：慢病毒、腺病毒和rAAV，每一种都在CMV启动子的控制下编码GFP。

将每种病毒递送系统以三种MOI添加到每种细胞密度中：

a.以10、50和100的MOI添加慢病毒颗粒。

b.以50、100和200的MOI添加腺病毒颗粒。

c.在1,000、10,000和100,000的MOI下测试了两种rAAV血清型。

将病毒颗粒与细胞在37℃下在5％ CO₂的情况下温育过夜。第二天取出慢病毒和腺病毒颗粒，并用新鲜的培养基替换。在测定的持续时间内，rAAV颗粒留在细胞上。在感染后24、48和72小时，使用Incucyte ZOOM^TM活细胞成像仪(Essen)来确定GFP荧光和细胞汇合。基于对比的算法用于确定细胞汇合和表达GFP的细胞。通过将GFP汇合除以相汇合，计算每个孔的GFP/相汇合。

MOI为100时的慢病毒递送是最有效的，其中几乎所有的细胞在感染后72小时都表达GFP(图1和2)。对于每个批次的MPC，递送效率大致相当。在用腺病毒或rAAV感染后表达GFP的细胞的比例远低于用慢病毒的感染，使用这些方法只有少数细胞表达GFP(图3至5)。

实例2-间充质干细胞(MSC)的HSV-P10负载

使用经修饰的PTENα基因序列产生表达PTENα的单纯疱疹病毒(HSV-P10)(一种溶瘤病毒)，其中PTENαCUG起始密码子被突变为AUG，以增强全长N末端延伸的蛋白质的翻译，并且内部规范PTEN AUG起始密码子被突变为AUA，以从构建体中消除规范PTEN表达。PTENα被并入到溶瘤性HSV1主链中，该溶瘤性HSV1主链在病毒的ICP6基因基因座内缺失了γ34.5的两个拷贝。图6描绘了在研究中使用的对照(HSVQ)和HSV-P10病毒的ICP6基因座内工程改造的基因操作的结构。

在感染复数(MOI)为0.025、0.05、0.1、0.2和0.5时，用HSVQ或HSV-P10加载间充质干细胞，并且通过随时间检测细胞中的GFP来确定感染(图7A和2E)。使用Cytation 5细胞成像多模式读取器结合BioSpa 8自动培养箱(Biotek Instruments，INC.)随时间监测GFP。GFP对象计数被量化并被绘制为每个治疗组±SEM的平均4个孔。细胞内的复制率与用于感染间充质干细胞的HSVQ或HSV-P10的MOI相关。

为了确定在间充质干细胞中HSV-P10和HSVQ病毒复制的动力学，对HSV-P10和HSVQ加载的间充质干细胞进行了比较(图7A)。将3×10⁶个细胞处的间充质干细胞置于6孔板中并培养24小时。将铺板的间充质干细胞用1MOI的HSVQ或HSV-P10感染1小时。在温育后，取出培养基并用新鲜的DMEM替换，并且培养另外的24小时。收获HSVQ或HSV-P10加载的间充质干细胞和条件培养基，并对vero细胞进行滴定研究。

与HSVQ相比，HSV-P10似乎具有更好的病毒复制动力学(图7A)。然而，HSV-P10加载的间充质干细胞的病毒载量与HSVQ加载的间充质干细胞的病毒载量相当(图7B)。即使在体外5次传代后，仍在加载的间充质干细胞中观察到HSV-P10和HSVQ的病毒复制。

为了确定病毒负载量对间充质干细胞的存活力的影响，在通过流式细胞术评估的加载的间充质干细胞中确定了细胞溶质活性(水活/死染料)和GFP表达，并对其进行了量化并以直方图表示(图8)。数据表明，HSV-10和HSVQ加载的间充质干细胞在感染后24小时是有活力的(图8A)。流式细胞术象限在图8B中示出。

实例3-评估由HSV-P10加载的间充质干细胞(MSC)表达的功能性PTENα

为了评估由HSV-P10表达的PTENα的功能，研究了HSV-P10对HSV-P10加载的间充质干细胞的PI3K/AKT信号传导途径的影响。蛋白质印迹分析显示，HSVQ加载的间充质干细胞中AKT增加，而表达PTENα的HSV-P10加载的间充质干细胞与对照病毒加载量相比减少了磷酸化的AKT(图9A)。在HSV-P10加载的间充质干细胞的条件培养基中检测到PTENα，表明通过HSV-P10加载的间充质干细胞分泌PTENα(图9B)。

实例4-HSV-P10加载的间充质干细胞对肿瘤细胞的影响

为了确定HSV-P10加载的间充质干细胞向癌细胞递送HSV-P10的能力，使用Cytation 5细胞成像多模式读取器结合BioSpa 8自动培养箱(Biotek Instruments，INC.)，通过监测病毒GFP随时间的变化进行Boyden室分析和迁移。然而，对HSVQ和HSV-P10加载的间充质干细胞迁移的分析意外地显示，与HSVQ加载的间充质干细胞相比，HSV-P10加载的间充质干细胞向人乳腺癌细胞(MDA-468)的动力学增加(图10)。

实例5-HSV-P10加载的间充质干细胞对原代人胶质瘤细胞的影响

将HSVQ和HSV-P10加载的间充质干细胞与表达RPF的GMB12原代人胶质瘤细胞共培养(图11A)。确定了由HSV-P10加载的间充质干细胞表达的PTENα在PI3K/AKT信号传导通路上的功能。蛋白质印迹分析显示，在与MSC共培养后，胶质瘤细胞中PTENα增加并且磷酸化的AKT减少(图11B)。

实例6-HSV-P10加载的间充质干细胞对乳腺癌细胞的影响

HSV-P10加载的间充质干细胞与DB7鼠乳腺癌细胞的共培养导致HSV-P10转移至癌细胞，并且在这些癌细胞中诱导细胞死亡，如通过胞质活性(水活/死染料)和GFP表达确定的。与未加载的间充质干细胞(对照)相比，在与HSV-Q加载的间充质干细胞共培养后，观察到死亡的DB7鼠乳腺癌细胞的总量的增加(图12)。与未加载的间充质干细胞(对照)和HSV-Q加载的细胞相比，在与HSV-P10加载的间充质干细胞共培养后，观察到死亡DB7鼠乳腺癌细胞的总量的进一步增加(图12)。

实例7-溶瘤HSV对MSC和MPC的影响

间充质干细胞(MSC)和间充质前体细胞(MPC)加载有溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，感染多样性(MOI)逐渐增加0.1–5。通过检测细胞随时间的荧光来确定感染。

病毒复制是通过在感染后24、48和72小时从细胞中收获病毒来确定的，并通过对Vero细胞进行菌斑测定来滴定。令人惊讶的是，与MSC相比，在所有时间点并且在两种测试的MOI(图13A；MOI 0.1；图13B；MOI 1)观察到MPC中HSV复制增加。

感染72小时后，经由MTT测定来确定MSC和MPC中的HSV细胞毒性。同样令人惊讶的是，与MSC相比，在MPC中观察到增加的细胞存活率，尤其是当MOI增加到高于0.1时(图14)。

这些发现支持了将MPC用作溶瘤病毒有效载荷的载剂以及将其用于如癌症疗法等应用的一般概念。

实例8-MPC和MSC中的溶瘤病毒

方法

几种癌细胞系感染有呼吸道合胞病毒(RSV)，包含肺癌细胞系A549(第15代)、H1299(第13代)、H1650(第8代)和LLC(第12代)；肉瘤细胞系U2-OS(第9代)和SK-ES1(第9代)；以及乳腺癌细胞系MCF-7(第13代)和4T1(第9代)。将癌细胞系置于96孔板中，并用RSV在1、5和10的多重感染(MOI)下用Opti-Mem培养基感染持续90分钟。在90分钟后，用每个细胞系的完整培养基替换培养基。在感染后48小时和72小时，使用Cell Titer Glo测定进行细胞存活力测定。

人间充质前体细胞(MPC)和间充质干细胞(MSC)也感染了MOI为1、5和10的RSV。在感染后48和72小时还评估了细胞存活力。

在感染后72小时，从各种MOI(1、5和10)的孔中收集来自感染的MSC和MPC的上清液并且用于癌细胞系的感染。用相应的MOI的上清液感染过夜后，在替换感染上清液后加入完整培养基。在72小时后测量细胞存活力。使用vero细胞，经由斑块测定来确定从感染的MPC和MSC获得的上清液的滴度。提及结果中的MOI 0表示模拟感染，即来自无感染的对照孔的上清液。

结果

用RSV溶瘤病毒感染各种癌细胞系导致显著的癌细胞死亡。通常在感染后72小时和在较高的MOI下观察到较高的细胞死亡。

肺癌细胞系：

-A549细胞：在72小时时，在所有MOI下观察到明显的细胞死亡。在RSV MOI1的情况下，存在几乎40％的细胞死亡。对于MOI 5和10，分别存在50％和60％的细胞死亡(图15)。

-H1299细胞：在72小时时，在MOI 5和10下观察到明显的细胞死亡。在RSV MOI 10的情况下，存在几乎40％的细胞死亡(图16)。

-H1650细胞：在感染后48小时和72小时，在RSV MOI 5的情况下观察到几乎40％的细胞死亡，并且在MOI 10的情况下观察到65％的细胞死亡(图17)。

-LLC细胞：在48小时时，在RSV MOI 10的情况下观察到35％的细胞死亡。在72小时时，在MOI 1的情况下观察到几乎25％的细胞死亡，在MOI 5的情况下观察到65％的细胞死亡，并且在MOI 10的情况下观察75％的细胞死亡(图18)。

肉瘤细胞系：

-U2-OS细胞：在48小时时，在MOI 10的情况下观察到明显的细胞死亡。在72小时时，在所有MOI下观察到明显的细胞死亡，其中在该时间点在MOI 10下观察到几乎60％的细胞死亡(图19)。

-SK-ES1细胞：在感染后48小时观察到在RSV MOI 5和10的情况下的显著细胞死亡。在72小时时，在MOI 5和10的情况下观察到几乎90％的细胞死亡(图20)。

乳腺癌细胞系：

-4T1细胞：在72小时时，在MOI 5和10下观察到明显的细胞死亡。在用RSV MOI 10感染后72小时观察到25％的细胞死亡(图21)。

这些数据表明，溶瘤病毒RSV能够感染并杀死多种不同谱系的癌细胞系。

干细胞：

-MPC和MSC细胞：在RSV感染后72小时，在MOI 5下观察到40％的细胞死亡，并且在MOI 10的情况下观察到50％的细胞死亡(图22和图23)。在72小时时，对于MSC观察到类似的结果(图24和图25)。

数据显示，RSV溶瘤病毒同时感染MPC和MSC，并且MPC和MSC在感染后至少72小时仍保持存活。与以上实例7中讨论的HSV感染结果一致，在用RSV感染后48小时，特别是在MOI 5和10下，与MSC相比更多的MPC存活，这表明MPC对病毒感染更具耐药性，特别是在48小时时。

RSV感染的MPC和MSC两者均产生新的RSV，该新的RSV存在于培养的细胞的上清液中，并且新的RSV能够感染癌细胞系(图26至31)。然而，数据令人惊讶地表明，与MSC相比，MPC向其周围环境中释放更多的病毒，导致癌细胞的更大感染。鉴于与来自MSC的上清液相比，通过来自MPC的上清液感染的癌细胞数量增加，这一发现尤其明显(特别参见图26至28、30和31所示的A549、H1299和H1650肺癌细胞、U2-OS肉瘤细胞和4T1乳腺癌细胞在MOI 5的结果)。换言之，与用溶瘤病毒感染的MSC相比，用来自用溶瘤病毒感染的MPC的培养基(v/v)观察到更高的癌细胞感染性。

这些结果进一步支持了上面提及的发现，并进一步支持了将MPC用作溶瘤病毒的载剂的一般概念。因此，本发明的发明人的发现代表了本领域的显著进步，特别是考虑到这些发现对于将溶瘤病毒递送至癌细胞中的潜在应用。

实例9-抗癌疗法

间充质谱系前体细胞在被施用于诊断为癌症的受试者之前负载有溶瘤病毒，如RSV或腺病毒。向受试者施用约2亿个负载的间充质谱系前体细胞。

在约2-6周内，评价经治疗的受试者的安全性和疗法的功效。根据需要施用另外剂量的负载的间充质谱系前体细胞。

实例10-胰腺癌疗法

在被施用于诊断为胰腺癌的受试者之前，间充质谱系前体细胞负载有条件复制型溶瘤腺病毒(CRAd)。通过向间充质谱系前体细胞培养基中添加溶瘤CRAd，间充质谱系前体细胞负载有约10–50个感染单位(i.u.)/MPC。向受试者施用约2亿个负载的间充质谱系前体细胞。

本领域技术人员将理解，在不脱离如所广泛描述的本公开的精神或范围的情况下，可以对如在特定实施例中所示的本公开进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

以上讨论的所有出版物以其整体并入本文。

本申请要求2020年8月10日提交的63/063,657的优先权，该申请的公开以其整体并入本文。

包含在本说明书中的对文件、行为、材料、装置、制品等的任何讨论仅仅是为了提供本公开的上下文的目的。不应当认为是承认这些事项中的任何或全部形成现有技术基础的一部分或者是与本公开相关的领域中的公知常识，因为它在本申请的每个权利要求的优先权日之前已经存在。

参考文献

●Ausubel等人(编辑)(1988，包含到目前为止的所有更新)《最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology),Greene Pub.Associates andWiley-Interscience。

●Bader等人(2011)《基因疗法(Gene Ther)》.18:1121-6。

●Brown TA(编辑)(1991)《基本分子生物学：实用方法(Essential MolecularBiology:A Practical Approach)》,第1和2卷,IRL出版社(IRL Press)。

●Coligan等人(编辑)(包含到目前为止的所有更新)《当前免疫学协议(CurrentProtocols in Immunology)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)。

●Glover和Hames(编辑)(1995&1996)《DNA克隆：实用方法(DNACloning:APractical Approach)》,第1-4卷,IRL出版社。

●Griffiths-Jones,S.2004《核酸研究(Nucl Acids Res)》,32,D109-D111。

●Harlow和Lane(编辑)(1988)《抗体：实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual)》,冷泉港实验室(Cold Spring Harbour Laboratory)。

●Kozomara等人2013；《核酸研究》,42,D68-D73。

●Lennox和Behlke(2011)《基因疗法》18”1111-20。

●Perbal J(1984)《分子克隆实用指南(A Practical Guide to MolecularCloning)》,约翰·威利父子出版公司。

●Sambrook等人,(1989)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)。

●Simmons&Torok-Storb(1991)《血液(Blood)》.78:55-62。

Claims

1.一种包括STRO-1+间充质谱系前体细胞或干细胞的组合物，其中所述细胞被修饰以引入溶瘤病毒。

2.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括施用包括STRO-1+间充质谱系前体细胞或干细胞的组合物，其中所述细胞被修饰以引入溶瘤病毒。

3.一种将溶瘤病毒递送至癌细胞中的方法，所述方法包括使癌细胞与已经被修饰以引入溶瘤病毒的STRO-1+间充质谱系前体细胞或干细胞接触。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞表达选自由α1、α2、α3、α4和α5、αv、β1和β3组成的组的标志物中的一种或多种。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法或组合物，其中所述溶瘤病毒包括肿瘤特异性启动子和/或结合肿瘤特异性细胞表面分子的衣壳蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法或组合物，其中所述肿瘤特异性启动子是生存素启动子、COX-2启动子、PSA启动子、CXCR4启动子、STAT3启动子、hTERT启动子、AFP启动子、CCKAR启动子、CEA启动子、erbB2启动子、E2F1启动子、HE4启动子、LP启动子、MUC-1启动子、TRP1启动子、Tyr启动子。

7.根据权利要求5或6所述的方法或组合物，其中所述衣壳蛋白是纤维、五邻体或六邻体蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或组合物，其中所述溶瘤病毒包括用于转导地靶向肿瘤细胞的肿瘤特异性细胞表面分子。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法或组合物，其中所述肿瘤特异性细胞表面分子选自由以下组成的组：整联蛋白、EGF受体家族成员、蛋白聚糖、二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside)、B7-H3、癌抗原125(CA-125)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、癌胚抗原(CEA)、肿瘤相关糖蛋白、分化簇19(CD19)、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD152、粘蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体a、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶(recepteur d'o gine nantais)(RON)受体和细胞毒性T淋巴细胞抗原4。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法或组合物，其中所述溶瘤病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)、条件复制型腺病毒(CRAd)、腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒；慢病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、塞内加谷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或水泡性口炎病毒(VSV)和细小病毒。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞表达：

选自由Cx40、Cx43、Cx45、Cx32和Cx37组成的组的连接蛋白；和/或，

选自由α2、α3和α5组成的组的整联蛋白。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞被修饰以引入杀死所述癌细胞但基本上不影响所述间充质谱系前体细胞或干细胞的存活力的溶瘤病毒。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞被修饰以在所述间充质谱系前体细胞或干细胞可以将所述溶瘤病毒递送至癌细胞之前引入不杀死所述间充质谱系前体细胞或干细胞的溶瘤病毒。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法或组合物，其中所述溶瘤病毒表达病毒融合膜糖蛋白以介导间充质前体谱系或干细胞融合至肿瘤细胞的诱导。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病毒融合膜糖蛋白是长臂猿白血病病毒(GLAV)包膜糖蛋白、麻疹病毒蛋白F(MV-F)和麻疹病毒蛋白H(MV-H)。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞基本上是STRO-1^bri。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.1μg/10⁶个细胞的量表达血管生成素-1(Ang1)。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以至少0.5μg/10⁶个细胞的量表达Ang1。

19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以至少1.0μg/10⁶个细胞的量表达Ang1。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以小于约0.05μg/10⁶个细胞的量表达血管内皮生长因子(VEGF)。

21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以小于约0.02μg/10⁶个细胞的量表达VEGF。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约2:1的比率表达Ang1:VEGF。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约10:1的比率表达Ang1:VEGF。

24.根据权利要求1至21中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体以至少约20:1的比率表达Ang1:VEGF。

25.根据权利要求1至21中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞以至少约30:1的比率表达Ang1:VEGF。

26.根据权利要求1至21中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体以至少约50:1的比率表达Ang1:VEGF。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体未被基因修饰以表达Ang1或VEGF。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞衍生自多能细胞。

29.根据权利要求28所述的方法或组合物，其中所述多能细胞是诱导多能干(iPS)细胞。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法或组合物，其中所述方法或组合物包括表达STRO-1以及选自由α1、α2、α3、α4和α5、αv、β1和β3组成的组的标志物中的一种或两种或更多种的间充质谱系前体细胞或干细胞。

31.根据权利要求3所述的方法，其中所述接触发生在允许所述间充质谱系前体细胞或干细胞与所述癌细胞形成间隙连接的条件下，由此通过穿越所述间隙连接将所述溶瘤病毒递送至所述癌细胞。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述间隙连接由Cx40或Cx43形成。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述间隙连接由Cx43形成。

34.根据权利要求2或4至32中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒的递送是经由除Cx43之外的机制进行的。

35.根据权利要求3至34中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、骨肉瘤、乳腺癌或黑色素瘤细胞。

36.根据权利要求3至34中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是合胞体癌细胞。

37.根据权利要求3至36中任一项所述的方法或组合物，其中所述溶瘤病毒被修饰以插入与由所述间充质谱系前体细胞或干细胞表达而不由所述癌细胞表达的寡核苷酸互补的核苷酸序列。

38.根据权利要求37所述的方法或组合物，其中所述寡核苷酸是miRNA。

39.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括施用根据权利要求1或4至30中任一项所述的组合物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞表达连接蛋白，所述连接蛋白也由包括所述受试者的癌症的癌细胞表达。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述连接蛋白是Cx40或Cx43。

42.根据权利要求41所述的方法，其中癌细胞包括所述受试者的癌症的癌细胞表达Cx43。

43.根据权利要求2、4至30或39至42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤和黑色素瘤组成的组。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法或组合物，其中所述修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞已经被处理以实现对所述间充质谱系前体细胞或干细胞上的细胞表面聚糖的修饰。

45.根据权利要求44所述的方法或组合物，其中所述处理涉及在导致所述间充质谱系前体细胞或干细胞上的细胞表面聚糖的修饰的条件下将所述间充质谱系前体细胞或干细胞暴露于糖基转移酶。

46.根据权利要求45所述的方法或组合物，其中所述糖基转移酶是岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶或唾液酸转移酶。

47.根据权利要求46所述的方法或组合物，其中所述岩藻糖基转移酶是α1,3岩藻糖基转移酶，如α1,3岩藻糖基转移酶III、α1,3岩藻糖基转移酶IV、α1,3岩藻糖基转移酶VI、α1,3岩藻糖基转移酶VII或α1,3岩藻糖基转移酶IX。

48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法或组合物，其中将所述间充质谱系前体细胞或干细胞暴露于外源性糖基转移酶，并且其中暴露于所述糖基转移酶导致所述细胞在体内炎症部位处的增强的保留。

49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法或组合物，其中所述间充质谱系前体细胞或干细胞已经被修饰以引入编码糖基转移酶的核酸，并且其中所述糖基转移酶在所述细胞中的表达导致所述细胞在体内炎症部位处的增强的保留。