WO2019163802A1 - 胚様体の評価方法 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
Definitions
- the present invention relates to a method for evaluating the differentiation characteristics of embryoid bodies obtained by culturing and inducing differentiation of pluripotent stem cells, a method for screening embryoid bodies using the method, and a method for preparing specific differentiation-inducing cells, A cell population containing an embryoid body obtained by the above screening method and / or a differentiation-inducing cell obtained by inducing differentiation of the embryoid body, a pharmaceutical composition containing the embryoid body and / or cell population, and the medicament
- the present invention relates to a method for producing a composition.
- Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
- ES cells embryonic stem cells
- iPS cells induced pluripotent stem cells
- preparing differentiation-inducing cells from pluripotent stem cells for example when preparing cardiomyocytes, an embryoid body is first formed while giving the direction of differentiation from pluripotent stem cells to mesoderm.
- the cardiomyocytes are recovered by inducing differentiation into cardiomyocytes and dispersing them into single cells (for example, Patent Document 2).
- Non-Patent Document 4 describes that a fluorescence reporter protein gene configured to be issued according to the expression of a myocardial differentiation marker is introduced into stem cells to monitor the state of differentiation.
- Non-patent document 5 describes that the size of the embryoid body formed by changing the number of iPS cells to be seeded first was changed and the effect on cardiomyocyte differentiation was observed. .
- the present invention relates to a method for evaluating differentiation characteristics of embryoid bodies obtained by culturing pluripotent stem cells, a method for screening embryoid bodies obtained by culturing pluripotent stem cells, and cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
- a cell population comprising an embryoid body obtained by the screening method and / or differentiation-inducing cells obtained by inducing differentiation of the embryoid body, and a pharmaceutical composition comprising the embryoid body and / or cell population
- a method for producing the pharmaceutical composition is also known as embryoid body obtained by culturing pluripotent stem cells.
- pluripotent stem cells are actually differentiated into the desired differentiation-inducing cells, it cannot be determined whether or not the differentiation into the differentiation-inducing cells was appropriate.
- the present invention relates to the following: [1] A method for evaluating the differentiation characteristics of embryoid bodies obtained by culturing pluripotent stem cells, the method comprising measuring one or more morphological characteristics of embryoid bodies. [2] The method according to [1], wherein the differentiation characteristic is differentiation directivity. [3] The method according to [2], wherein the differentiation directivity is differentiation directivity into cardiomyocytes. [4] The method according to [1] to [3], wherein the measurement of morphological characteristics is performed at one or more time points including a time point when the embryoid body is determined to be formed. [5] The method of [1] to [4], wherein the measurement of morphological features is performed noninvasively.
- [6] The method of [1] to [5], wherein the step of measuring the morphological characteristics of the embryoid body includes imaging the embryoid body.
- the morphological features include embryoid body size and / or embryoid body color information.
- the method according to [8], wherein the target differentiation-inducing cell is a cardiomyocyte.
- the method of [8] or [9], wherein the morphological features include embryoid body size and / or embryoid body color information.
- A A step of culturing pluripotent stem cells to form embryoid bodies;
- B Non-invasively measuring the morphological characteristics of the embryoid body obtained in (A);
- C a step of screening an embryoid body based on the measurement result obtained in (B); and
- D a cell containing the desired differentiation-inducing cell by inducing differentiation of the embryoid body screened in (C)
- a method for preparing a differentiation-inducing cell of interest [12] The method according to [11], wherein the target differentiation-inducing cell is a cardiomyocyte.
- the method of [11] or [12], wherein the pluripotent stem cell is an iPS cell.
- step (b) includes imaging the embryoid body.
- step (b) includes imaging the embryoid body.
- the morphological features include embryoid body size and / or embryoid body color information.
- a pharmaceutical composition comprising a cell population comprising cardiomyocytes obtained by inducing differentiation of the embryoid body of [16].
- a method for producing a pharmaceutical composition comprising an embryoid body formed by culturing pluripotent stem cells and / or a cell population comprising differentiation-inducing cells obtained by inducing differentiation of the embryoid body, (A) measuring one or more morphological features of the embryoid body non-invasively; (B) The method comprising the step of comparing the measurement result obtained in step (a) with a reference; and (c) screening the embryoid body determined to have high differentiation-directivity.
- a method for screening for a pluripotent stem cell line having a high differentiation direction toward a target differentiation-inducing cell (1) culturing a target pluripotent stem cell to form an embryoid body; (2) a step of non-invasively measuring the morphological characteristics of the embryoid body obtained in (1); and (3) a step of comparing the morphological characteristics measured in (2) with a reference. Including said method.
- the present invention it becomes possible to select embryoid bodies having the ability to easily differentiate into desired differentiation-inducing cells, particularly cardiomyocytes, by a simple method from the initial stage of differentiation induction, and can be used for multipotency such as iPS cells.
- desired differentiation-inducing cells particularly cardiomyocytes
- multipotency such as iPS cells.
- the method of obtaining desired cells from sex stem cells by inducing differentiation differentiation-inducing cells can be efficiently prepared.
- the method of the present invention can inspect the target embryoid body non-invasively, it can be selected without affecting the cells contained in the embryoid body, and actual regenerative medicine can be performed. It can also be used when preparing a composition or the like used for the above.
- FIG. 1 is a graph showing the relationship between the area of the embryoid body and the final cTnT positive rate on the 1st, 4th, 6th, 8th and 12th days of culture for induction of differentiation into myocardium It is. Since the number of seeded cells was the same, no large variation was observed in the size of the aggregates on the first day of culture, but a variation in size was observed for each embryoid body after the fourth day of culture. A significant correlation was confirmed between the size of the embryoid body and the final cTnT positive rate at the 4th day of culture.
- FIG. 2 is a graph showing changes in morphological characteristics (vertical axis) of embryoid bodies on each culture day (horizontal axis) from day 1 to day 10 of differentiation induction culture into myocardium.
- A represents the change in the area ( ⁇ m 2 ) of each embryoid body
- B represents the change in the perimeter of each embryoid body ( ⁇ m).
- cells (*) that were beating at the 10th day of culture were confirmed in embryoid bodies that showed large numbers.
- FIG. 3A is a photomicrograph of embryoid bodies on the 12th day of differentiation induction culture into myocardium
- B is an immunostaining photograph of embryoid bodies on the 12th day of differentiation induction culture into myocardium.
- the cells stained in blue are dense in the immunostained image
- cTnT positive cells stained in green in the immunostained image are localized. It was confirmed that there was a cavity structure with no cells.
- FIG. 4 is a graph showing the relationship between the size change during the differentiation-inducing culture into the myocardium and the cTnT positive rate.
- A shows the relationship between the rate of change from the first day to the fourth day of culture, which is the initial stage of differentiation-inducing culture (until embryoid body formation), and the cTnT positive rate
- B shows the latter stage of differentiation-inducing culture (embryoid body).
- the relationship between the rate of change from the 8th day to the 12th day of the culture and the cTnT positive rate is shown.
- the rate of change at the initial stage showed a significant positive correlation with the cTnT positive rate.
- the cTnT positive rate tended to increase as the rate of change at the later stage decreased.
- FIG. 5 is a graph showing the relationship between the length of the major axis and the myocardial cell rate in the embryoid bodies on the fourth day of culture.
- the rate of cardiomyocytes in the cell population induced to differentiate from all embryoid bodies tested was 88%. 36.8% of all embryoid bodies had a major axis of 100 ⁇ m or less, and the rate of cardiomyocytes induced to differentiate from such embryoid bodies was 93%. Further, 62% of embryoid bodies in all embryoid bodies had a major axis of 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 83%. Further, 1.2% of the embryoid bodies in all embryoid bodies had a major axis of 200 ⁇ m or more, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 83%.
- FIG. 6 is a graph showing the relationship between the length of the major axis and the myocardial cell rate in embryoid bodies on day 6 of culture.
- the rate of cardiomyocytes in the cell population induced to differentiate from all embryoid bodies tested was 90%.
- 36% of embryoid bodies had a major axis of 100 ⁇ m or less, and the rate of cardiomyocytes induced to differentiate from such embryoid bodies was 96%.
- 47% of all embryoid bodies had a major axis of 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 82%.
- 17% of all embryoid bodies had a major axis of 200 ⁇ m or more, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 89%.
- FIG. 7 is a graph showing the relationship between the length of the major axis and the myocardial cell rate in the embryoid bodies on day 18 of culture.
- A is a graph when EZSPHERE (R) is not used on day 0 of culture
- B is a graph when EZSPHERE (R) is used. If not used EZSPHERE (R), cardiomyocytes rate of cell populations differentiated derived from whole embryoid bodies tested was 70%. Of the embryoid bodies, 21% of the embryoid bodies had a major axis of 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, and the rate of cardiomyocytes induced to differentiate from such embryoid bodies was 63%.
- the embryoid bodies Of the embryoid bodies, 12% of the embryoid bodies had a major axis of 200 ⁇ m to 300 ⁇ m, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 58%. Of the embryoid bodies, 58% of the embryoid bodies had a major axis of 300 ⁇ m to 500 ⁇ m, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 82%. Further, 9% of all embryoid bodies had a major axis of 500 ⁇ m or more, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 83%.
- cardiomyocytes rate of cell populations differentiated derived from whole embryoid bodies tested was 84%.
- 11% of embryoid bodies had a major axis of 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, and the rate of cardiomyocytes induced to differentiate from such embryoid bodies was 80%.
- 12% of all embryoid bodies had a major axis of 200 ⁇ m to 300 ⁇ m, and the rate of cardiomyocytes in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 77%.
- the embryoid bodies Of the embryoid bodies, 53% of the embryoid bodies had a major axis of 300 ⁇ m to 500 ⁇ m, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 95%. Further, 24% of all embryoid bodies had a major axis of 500 ⁇ m or more, and the cardiomyocyte ratio in the cell population induced to differentiate from such embryoid bodies was 93%.
- FIG. 8 shows the myocardium when an embryoid body derived from an iPS cell line having a high differentiation direction (High group) and an embryoid body derived from an iPS cell line having a low differentiation direction (Low group) are induced to differentiate into cardiomyocytes, respectively. It is a graph showing a cell rate.
- FIG. 9 is a photograph of iPS cells in culture for each iPS cell line.
- FIG. 10 is a photograph of embryoid bodies derived from each iPS cell line on the 6th day of induction of differentiation.
- FIG. 11 is a graph showing the average of the area of the embryoid body (A) and the length of the major axis (B) on the sixth day of culture derived from the iPS cell line of each of the High group and the Low group.
- pluripotent stem cell is a well-known term in the art, and is capable of differentiating into all lineages of cells belonging to the three germ layers, ie, endoderm, mesoderm and ectoderm.
- Means a cell having Non-limiting examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), nuclear transfer embryonic stem cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
- ES cells embryonic stem cells
- ntES cells nuclear transfer embryonic stem cells
- iPS cells induced pluripotent stem cells
- pluripotent stem cells are first cultured in suspension to form aggregates of any of the three germ layers, and then form aggregates To induce differentiation into specific cells of interest.
- pluripotent stem cells are adherently cultured at high density to induce differentiation.
- embryoid body means an aggregate of such cells.
- an embryoid body having differentiation-directed property to an endoderm cell is referred to as an “endodermal embryoid body”
- an embryoid body having a differentiation-directed property to a mesodermal cell is referred to as “mesoderm embryo”.
- An embryoid body having a differentiation-directed property to ectoderm cells may be referred to as an “ectodermal embryoid body”.
- the “differentiation-inducing cell” means any cell that has been induced to differentiate from a pluripotent stem cell into a specific type of cell.
- Differentiation-inducing cells include adherent cells constituting tissues such as cardiomyocytes and skeletal myoblasts, and non-adherent cells such as blood cells.
- Non-limiting examples of differentiation-inducing cells include muscle cells such as cardiomyocytes and skeletal myoblasts, neuronal cells such as neuronal cells, oligodendrocytes, and dopaminergic cells, retinal cells such as retinal pigment epithelial cells, blood cells Cells, hematopoietic cells such as bone marrow cells, immune-related cells such as T cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells, B cells, cells constituting organs such as hepatocytes, pancreatic ⁇ cells, kidney cells, In addition to chondrocytes, germ cells, etc., precursor cells and somatic stem cells that differentiate into these cells are included.
- muscle cells such as cardiomyocytes and skeletal myoblasts
- neuronal cells such as neuronal cells, oligodendrocytes, and dopaminergic cells
- retinal cells such as retinal pigment epithelial cells
- blood cells Cells hematopoietic cells such as bone marrow cells
- progenitor cells and somatic stem cells include mesenchymal stem cells in cardiomyocytes, multipotent cardiac progenitor cells, unipotent cardiac progenitor cells, neural stem cells in nervous cells, hematopoietic cells and immune cells Examples include related hematopoietic stem cells and lymphoid stem cells.
- the differentiation induction of pluripotent stem cells can be performed using any known technique. For example, differentiation induction from pluripotent stem cells to cardiomyocytes can be performed by Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015 and WO2014 / 185358, Shugo Tohyama et al., Stem Cell Report, 9, 1-9, Nov 14, 2017.
- differentiation directivity means a property in which a pluripotent stem cell is easily differentiated into a specific differentiation-inducing cell.
- cardiomyocytes means cells having the characteristics of cardiomyocytes.
- the characteristics of cardiomyocytes include, but are not limited to, the expression of cardiomyocyte markers, the presence of autonomous pulsations, and the like.
- Non-limiting examples of cardiomyocyte markers include, for example, c-TNT (cardiac troponin T), CD172a (also known as SIRPA or SHPS-1), KDR (also known as CD309, FLK1 or VEGFR2), PDGFRA, EMILIN2, VCAM, etc.
- the pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes are c-TNT positive and / or CD172a positive.
- the evaluation method of the present invention includes a step of measuring one or more morphological features of an embryoid body to be evaluated.
- morphological features means features that can be visually confirmed. Examples of morphological features include, but are not limited to, embryoid body size, embryoid body shape, embryoid body color, and the like.
- the measurement result of the morphological feature can be obtained as numerical data, but may be obtained as image data, for example.
- Morphological features are obtained not only with data that can be measured with an optical microscope but also with non-visible light, such as Raman scattered light, infrared light, OCT, and second harmonics, obtained non-invasively. Information is also included. Data obtained by analyzing the data obtained as a measurement result is also included in the measurement result of the morphological feature of the present invention. Examples of such data include, but are not limited to, numerical data obtained by analyzing image data, change rates of numerical data at two or more points, and the like. The data obtained as a measurement result is accumulated as known data and can be fed back to the next inspection.
- the measurement results of the morphological characteristics of the present invention include, but are not limited to, the circumference of the embryoid body, the diameter of the embryoid body (long diameter and / or short diameter), embryoid body Directly show the morphology of the embryoid body, such as the vertical projected area, the volume of the embryoid body, the roundness of the embryoid body, and the color information of the embryoid body (including brightness, saturation, brightness, brightness, etc.)
- examples include data that correlates with morphological characteristics such as the pH of the culture solution (color information of the culture solution), absorbance, etc. After obtaining as image data, it may be obtained by analyzing the image data.
- the measurement result includes the vertical projected area of the embryoid body. In another preferred embodiment, the measurement result includes embryoid body color information. In another preferred embodiment, the measurement result includes a rate of change of the vertical projection area from one time point to another time point. Color information of a medium to which a pH reactive reagent such as phenol red is added may be combined. Further, it may be a morphological feature obtained based on artificial intelligence such as machine learning or deep learning based on information obtained from a plurality of image data.
- any technique known in the art may be used as a technique for culturing pluripotent stem cells and inducing differentiation.
- various techniques for inducing differentiation of cardiomyocytes from pluripotent stem cells are known (for example, Burridge et al., Cell Stem Cell.
- mesoderm-inducing factor eg, activin A, BMP4, bFGF, VEGF, SCF, etc.
- cardiac specification factor eg, VEGF, DKK1, Wnt signal inhibitor (eg, IWR-1, IWP-2, IWP-3, IWP-4, etc.)
- BMP signal inhibitor eg, NOGGIN, etc.
- TGF ⁇ / activin / NODAL signal inhibitor eg, SB431542, etc.
- retinoic acid Signal inhibitors etc.
- cardiac differentiation factors eg, VEGF, bFGF, DKK1, etc.
- cardiomyocyte induction treatment from pluripotent stem cells is carried out by using (1) a combination of BMP4, bFGF and activin A on an embryoid body formed by the action of BMP4, (2) VEGF and IWP-3, And (3) sequentially applying a combination of VEGF and bFGF.
- the “differentiation characteristic” means the ability relating to differentiation of the embryoid body to be evaluated.
- the differentiation characteristics include, but are not limited to, differentiation directionality, the remaining undifferentiated cell rate after differentiation induction, the differentiation-induced cell content rate after differentiation induction, and the like.
- the differentiation characteristic is differentiation orientation.
- the differentiation characteristic is differentiation orientation toward cardiomyocytes.
- the morphological characteristics may be measured at any time point between the time when pluripotent stem cells are differentiated and the differentiation-inducing cells are obtained, and the number of measurements is not particularly limited. Thus, in certain embodiments, the measurement of morphological features is performed only once. In another embodiment, the measurement of morphological characteristics is performed twice. In yet another embodiment, the measurement of morphological characteristics is performed multiple times (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.).
- the morphological characteristics are measured at one or more time points after the time point when the embryoid body is determined to be formed. In a more preferred embodiment, the morphological characteristics are measured when it is determined that an embryoid body has been formed. In another preferred embodiment, the morphological characteristics are measured multiple times, including measurements at the time that it was determined that an embryoid body was formed.
- the culture period from the culturing of pluripotent stem cells to the formation of embryoid bodies varies depending on the culture conditions used and differentiation induction conditions.
- a person skilled in the art can immediately calculate the culture period until embryoid bodies are formed based on the culture conditions and differentiation induction conditions used. For example, in the case of the above-described embodiment that induces differentiation of cardiomyocytes, cell aggregates are formed on the first day of pluripotent stem cell culture, and embryoid bodies are formed from the second day to the fourth day of culture. . Therefore, in certain embodiments, it is determined that the embryoid body was formed on the fourth day of culture.
- the measurement of morphological characteristics may be performed invasively or noninvasively, but preferably noninvasively from the viewpoint that the measurement does not affect the subsequent differentiation of the embryoid body. Done.
- Non-invasive measurement methods for morphological features include, but are not limited to, for example, observation under a microscope, image data acquisition with an imaging device, etc. is there.
- the size of the embryoid body is used as the morphological feature.
- Numerical data representing the size of the embryoid body is not limited to this.
- the area occupied by the embryoid body in the visual field vertical projection area
- the length of the outer periphery of the embryoid body in the visual field Examples include embryoid body diameter and embryoid body volume.
- These numerical values may be obtained directly from the target embryoid body, for example, by measurement by observation under a microscope, or may be obtained by acquiring image data with an imaging device and analyzing the image data. These data may be numerical values measured accurately or approximate values calculated from simple measurements.
- the size of an embryoid body preferably includes measuring the size of the embryoid body when it is determined that the embryoid body has been formed. Accordingly, in one embodiment, when it is determined that an embryoid body has been formed, the size of the embryoid body is measured, and the differentiation characteristics of the embryoid body are evaluated. For example, in the above-described embodiment in which differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes is induced, the greater the size of the embryoid body after the sixth day of culture, the higher the differentiation direction to cardiomyocytes, that is, more cardiomyocytes It can be evaluated that the containing cell population can be obtained. In addition, in embryoid bodies on the fourth day of culture, it can be evaluated that the longer diameter is, for example, 100 ⁇ m or less, and that the size of the embryoid body is not too large has higher differentiation directivity to cardiomyocytes.
- the specific numerical range that can be evaluated as having high differentiation direction varies depending on the time of measurement, the target differentiation-inducing cell, the feature to be measured, etc.
- a suitable range can be selected as appropriate.
- it is preferably 100 ⁇ m or less for the fourth day of culture, preferably 100 ⁇ m or less or 200 ⁇ m or more for the sixth day of culture, and 12 days of culture. If it is after the first, it is preferably 300 ⁇ m or more, more preferably 300 to 500 ⁇ m.
- ⁇ 10 5 ⁇ m 2 to 7.0 ⁇ 10 5 ⁇ m 2 is preferable for the 6th day of culture, and 1.5 or more for the 12th day after the culture.
- ⁇ 10 6 ⁇ m 2 or more is preferable, and 2.0 ⁇ 10 6 is more preferable.
- the size of the embryoid body at a plurality of time points preferably including the time point at which the embryoid body was determined to be formed
- the rate of change between the two time points preferably including the time point at which the embryoid body was determined to be formed
- the greater the rate of change in size until embryoid bodies are formed the higher the differentiation directivity to cardiomyocytes, that is, the more myocardium It can be evaluated that a cell population containing cells can be obtained.
- the rate of change in size the higher the differentiation direction to cardiomyocytes, that is, it can be evaluated that a cell population containing more cardiomyocytes can be obtained.
- color information of the embryoid body may be measured as a morphological feature.
- the numerical data representing the color information of the embryoid body is not limited to this.
- the brightness, saturation, brightness, lightness, RGB value, light transmittance, and grayscale conversion level of the embryoid body examples include key values. These numerical values may be obtained directly from the target embryoid body, for example, by measurement by observation under a microscope, or may be obtained by acquiring image data with an imaging device and analyzing the image data. These data may be numerical values measured accurately or approximate values calculated from simple measurements.
- the color information of the embryoid body when it is determined that the embryoid body has been formed, it preferably includes measuring the color information of the embryoid body when it is determined that the embryoid body has been formed. Therefore, in one embodiment, when it is determined that an embryoid body has been formed, the color information of the embryoid body is measured to evaluate the differentiation characteristics of the embryoid body.
- the color of the embryoid body on the fourth day of culture is close to white ( It can be evaluated that the higher the gray scale average gradation value), the higher the differentiation direction to cardiomyocytes, that is, it is possible to obtain a cell population containing more cardiomyocytes.
- the undifferentiated cell residual rate after differentiation induction and the differentiation-induced cell content rate as differentiation characteristics, it can be evaluated by drawing a calibration curve from a plurality of known data.
- measurement results of morphological characteristics such as the size of embryoid bodies obtained from induction of differentiation of a plurality of embryoid bodies, and after differentiation induction It has been found by the present inventors that the relationship between the residual rate of undifferentiated cells and / or the content of differentiation-inducing cells is linearly correlated.
- morphological features such as embryoid body size are obtained on the fourth day of culture, for example.
- the test method of the present invention can test a target embryoid body preferably non-invasively, and therefore, after testing the embryoid body using the test method of the present invention However, it is possible to continue to use the embryoid body for differentiation induction. That is, the differentiation property is examined by the examination method of the present invention, and an embryoid body (for example, an embryoid body having a high differentiation directivity to the target differentiation-inducing cell) obtained by obtaining a favorable result is selected and further differentiation induction is performed.
- an embryoid body for example, an embryoid body having a high differentiation directivity to the target differentiation-inducing cell
- an embryoid body screening method using the above-described ⁇ 1> testing method is included.
- screening not only classifies the target based on a predetermined standard and selects a target that satisfies the predetermined standard, but also monitors whether the target meets the predetermined standard. including.
- the differentiation directivity to a target differentiation-inducing cell such as a cardiomyocyte is examined by the above-described ⁇ 1> inspection method, and an embryoid body having a suitable differentiation directivity is screened. And therefore includes the following steps: (A) Non-invasively measuring one or more morphological features of the embryoid body.
- the non-invasive morphological feature measurement step (a) in this embodiment is as described in detail in ⁇ 1> above.
- the screening method of the present invention may optionally further include the following steps (b) and (c); (B) a step of comparing the measurement result obtained in step (a) with a reference; (C) A step of screening embryoid bodies determined to have high differentiation directivity.
- step (b) the measurement result obtained in (a) is compared with the reference.
- the standard means a morphological feature in an embryoid body known to have a suitable differentiation-directing property toward a target differentiation-inducing cell, and the target embryoid body is compared with the standard by comparing with the standard. If the data is equivalent to or more suitable, the target embryoid body is judged to have a high differentiation directivity to the target differentiation-inducing cell.
- criteria include, but are not limited to, for example, image data of embryoid bodies that have a high differentiation-directivity to target differentiation-inducing cells, and the content ratio of target differentiation-inducing cells after differentiation induction is predetermined.
- the reference may be data such as image data or numerical data obtained by measuring morphological features, but may be another reference. References other than data include, but are not limited to, filters and color samples having holes of a predetermined size.
- the step of measuring morphological characteristics, the step of comparing with a reference, and / or the step of screening those determined to be suitable may be the same step. For example, in an embodiment using a filter having a pore having a predetermined size as described above, an embryoid body to be measured for morphological characteristics is passed through the filter, and an embryoid body that cannot pass through is screened as a suitable one. Also good.
- the data obtained by the measurement is more suitable than the reference depends on the measured morphological characteristics and the target differentiation-inducing cell, but those skilled in the art will be able to determine the morphological characteristics and / or the desired differentiation induction. Judgment can be made immediately based on the cells. For example, in the case of differentiation induction into the above-mentioned cardiomyocytes, when the size of the embryoid body on the fourth day of culture is measured as a morphological feature, it is preferable that the measurement result is equal to or larger than the reference data Therefore, it can be determined that the embryoid body is an embryoid body having a high differentiation directivity to cardiomyocytes.
- the measurement result is obtained when the color information of the embryoid body on the fourth day of culture (for example, the grayscale image gradation value) is measured as the morphological feature Can be determined to be suitable data if it is equal to or larger than the reference data, and it can be determined that the embryoid body is an embryoid body having a high differentiation directivity to cardiomyocytes.
- the color information of the embryoid body on the fourth day of culture for example, the grayscale image gradation value
- the screening method of the present invention can be used for inducing differentiation of any differentiation-inducing cell that is induced to differentiate from a pluripotent stem cell.
- the differentiation-inducing cell is a cardiomyocyte.
- Arbitrary data can be measured as morphological characteristics, but preferably the size of embryoid bodies and / or color information of embryoid bodies.
- ⁇ 3> Method for Preparing Cardiomyocytes of the Present Invention a method for preparing differentiation-inducing cells, particularly cardiomyocytes, using the screening method of ⁇ 2> above is included.
- the preparation method of the present invention uses the screening method of ⁇ 2> above to screen embryoid bodies suitable for differentiation induction, particularly at an early stage of differentiation induction, so that target differentiation-inducing cells such as cardiomyocytes are obtained.
- the culture method used varies depending on the target differentiation-inducing cell, but any method known in the art can be used.
- the embryoid body formation method and differentiation induction method in the above-described cardiomyocyte differentiation induction method can be used.
- the pluripotent stem cell any of the above-described pluripotent stem cells can be used, and iPS cells, particularly human iPS cells are preferred.
- Examples of known methods for obtaining cardiomyocytes from human iPS cells include the following steps: (1) A step of maintaining and culturing human iPS cells in a culture solution not containing feeder cells (feeder-free method), (2) forming an embryoid body from the obtained iPS cells; (3) culturing the obtained embryoid body in a culture medium containing activin A, bone morphogenetic protein (BMP) 4 and basic fibroblast growth factor (bFGF), (4) culturing the obtained embryoid body in a culture solution containing a Wnt inhibitor, a BMP4 inhibitor and a TGF ⁇ inhibitor; and (5) the obtained embryoid body in a culture solution containing VEGF and bFGF. And culturing in a method.
- step (1) for example, as described in WO2017038562, StemFit AK03 (Ajinomoto) is used as a medium, and iPS cells are cultured and adapted on iMatrix511 (Nippi), and maintenance culture can be performed.
- iPS cells are introduced every 7 to 8 days as described in Nakagawa M., et al.A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.Sci Rep.2014; 4: 3594
- passage can be performed as a single cell using TrypLE (registered trademark) Select (Thermo Fisher Scientific).
- a step of purifying the obtained cardiomyocytes may be selectively performed.
- the purification of cardiomyocytes include a method of reducing non-cardiomyocytes using a glucose-free medium, and a method of reducing undifferentiated cells using heat treatment as described in WO2017 / 038562.
- the non-invasive morphological feature measurement step (b) in this aspect is as described in detail in ⁇ 1> above.
- the screening step (c) in this aspect is as described in detail in ⁇ 2> above.
- compositions containing cells derived from pluripotent stem cells, etc. the embryoid body screened by the screening method of ⁇ 2> above and / or derived from the embryoid body.
- Cell populations comprising differentiation-inducing cells, particularly cardiomyocytes, as well as pharmaceutical compositions containing them are included.
- the embryoid body screened using the screening method of the present invention has a high differentiation directivity and can be used for differentiation induction to obtain a cell population having a high content of target differentiation-inducing cells. It is.
- Such embryoid bodies and / or cell populations are suitably used as components of pharmaceutical compositions for treating diseases, particularly in fields such as regenerative medicine.
- the form of such a pharmaceutical composition may be any form capable of treating a disease, and may be, for example, a sheet-like cell culture (cell sheet), a cell suspension, a cell mass, a graft, or the like.
- the pharmaceutical composition of the present invention is for treating a disease.
- diseases include, but are not limited to, heart disease, lung disease, liver disease, pancreatic disease, kidney disease, colon disease, small intestine disease, spinal cord disease, central nervous system disease, bone disease, eye disease, or skin disease.
- the target cell is a myocardial cell, cardiac disease with myocardial infarction (including chronic heart failure associated with myocardial infarction), dilated cardiomyopathy, ischemic cardiomyopathy, systolic dysfunction (eg, left ventricular systolic dysfunction) (For example, heart failure, especially chronic heart failure).
- a target cell and / or a sheet-like cell culture (cell sheet) of the target cell may be useful for the treatment.
- the embryoid body formed by culturing pluripotent stem cells and / or obtained by inducing differentiation of the embryoid body comprising the screening method of ⁇ 2> above as one step.
- a method for producing a pharmaceutical composition comprising a cell population comprising differentiation-inducing cells is included.
- an embryoid body having a suitable differentiation directing property to a desired differentiation-inducing cell such as a cardiomyocyte is selected by the screening method of ⁇ 2> above, and the embryoid body is selected.
- Steps (a) to (c) in this embodiment are as described in detail in ⁇ 2> above.
- the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention may optionally further comprise the following steps (d) and (e).
- (D) A step of inducing differentiation of the embryoid body screened in (c) to obtain a cell population containing differentiation-inducing cells (for example, cardiomyocytes);
- (E) A step of preparing the cell population obtained in (d) into a desired form (for example, a sheet-like cell culture).
- the differentiation induction step (d) is as described in detail for the step ⁇ 3> (D).
- a method for preparing a cell population containing the obtained differentiation-inducing cells into a desired form is known in the art.
- the method for producing a sheet-shaped cell culture typically includes seeding cells on a culture substrate, forming the seeded cells into a sheet, and isolating the formed sheet-shaped cell culture from the culture substrate. Including, but not limited to. Before the step of seeding the cells on the culture substrate, a step of freezing the cells and a step of thawing the cells may be performed. Further, a step of washing the cells may be performed after the step of thawing the cells.
- the sheet-shaped cell culture is a laminated sheet-shaped cell culture obtained by laminating a plurality of sheet-shaped cell cultures
- a step of laminating (stacking) a plurality of sheet-like cell cultures may be included. Each of these steps can be performed by any known method suitable for the production of a sheet-like cell culture.
- cells having tumorigenic potential are removed from the cell population.
- Removal of cells having tumorigenicity can be performed using any known technique.
- Non-limiting examples of such techniques include various separation methods using markers specific to cells having tumorigenicity (eg, cell surface markers), such as magnetic cell separation (MACS), flow cytometry Culturing in a medium excluding nutrient sources (methionine, etc.) necessary for the survival of cells with tumor-forming ability, affinity separation methods, methods of expressing selectable markers (eg, antibiotic resistance genes) using specific promoters, etc.
- a method for destroying undifferentiated cells a method for treating with a surface antigen of a cell having tumorigenic ability, a method for removing known undifferentiated cells, methods described in WO2014 / 126146 and WO2012 / 056997 Method, method described in WO2012 / 147922, method described in WO2012 / 133694, WO20 2/012803 (special table 2013-535194), method described in WO2012 / 0781153 (special table 2014-501518), JP2013-143968 and Tohyama S.
- Brentuximab vedotin is an antibody drug complex in which an antibody that targets the CD30 antigen and a small molecule drug (monomethyl auristatin E: MMAE) that inhibits microtubules is combined, and is sold under the brand name ADCETRIS Has been. It is a therapeutic agent for relapsed / refractory CD30 positive Hodgkin lymphoma and the like and can selectively act on cells expressing CD30 antigen. Since CD30 antigen is highly expressed in undifferentiated cells, undifferentiated cells can be removed by brentuximab vedotin (WO2016 / 072519). As a specific operation, brentuximab vedotin is added to the culture medium and incubated.
- a multiplicity of high differentiation direction to target differentiation-inducing cells based on the morphological characteristics of embryoid bodies. Included are methods for screening for potent stem cell lines. The present inventors have found that pluripotent stem cells may have different differentiation directivity toward differentiation-inducing cells for each cell line. The inventors of the present invention seemed to differentiate a cell line having a high differentiation-inducing property into a target differentiation-inducing cell (for example, a cardiomyocyte) into a target differentiation-inducing cell (for example, a cardiomyocyte) as compared with a low cell line. It was found that when differentiation was induced, the same morphological features as those of the embryoid body considered to have high differentiation direction in the evaluation method ⁇ 1> above were found.
- a target differentiation-inducing cell for example, a cardiomyocyte
- a target differentiation-inducing cell for example, a cardiomyocyte
- the screening method of this aspect includes the following steps: (1) culturing a target pluripotent stem cell to form an embryoid body; (2) a step of non-invasively measuring the morphological characteristics of the embryoid body obtained in (1); and (3) a step of comparing the morphological characteristics measured in (2) with a reference.
- the embryoid body forming step (1) is as described in detail in the step (A) of ⁇ 3> above.
- the measurement step (2) is as described in detail in ⁇ 1> above.
- the comparison step (3) is as described in detail in the step (b) of the above ⁇ 2>.
- Example 1 Correlation analysis between morphological characteristics of embryoid body and cardiomyocyte differentiation induction (1) Induction of cardiomyocyte differentiation Nunclon Sphera 96 well plate (Thermo Fisher Scientific) was seeded with human iPS cells at a rate of 10,000 cells / well, Differentiation induction was performed under the condition that the following additives were added to StemPro34 (Life Technologies) medium: Day 0-1: BMP4 10 ng / ml, FGF-2 5 ng / ml, Activin A 6 ng / ml, Y-27632 10 mM Day 1-4: BMP4 10 ng / ml, FGF-2 5 ng / ml, Activin A 6 ng / ml Day 4-6: IWR-1 4 ⁇ M, IWP-2 10 ⁇ M Day 6-12: VEGF 5 ng / ml, FGF-2 10 ng / ml.
- the obtained embryoid body was diluted with TrypLE (registered trademark) Select) Enzyme (10X), no phenol red (ThermorFisher Scientific) to a concentration of 3x with 1 mM EDTA.
- the cells were dispersed into single cells by incubating at 37 ° C. for 10 minutes.
- the dispersed cells were fixed and permeabilized using BD Cytofix / Cytoperm (registered trademark) Fixation / Permeabilization Solution Kit (BD Bioscience), then anti-human troponin antibody (Thermo Fisher Scientific), Alexa488-labeled goat-derived anti-mouse IgG (A -11001) (Thermo
- a phase-contrast microscope image of the embryoid body was taken on days 1 to 10 of the culture, and the area and perimeter of the embryoid body in the image were analyzed. On day 10 of culture, the presence or absence of pulsation of the embryoid body after differentiation induction into cardiomyocytes was observed. The results are shown in FIG. Embryoid bodies in which pulsation was observed tended to show large values in both area and perimeter at the 5th and 7th day of culture.
- Example 2 Observation of embryoid body Example 1 above.
- human iPS cells were induced to differentiate to form embryoid bodies.
- a phase-contrast microscope image of the embryoid body was taken on the 12th day of culture. After imaging, sections were prepared from the imaged embryoid bodies, stained with mouse-derived anti-cTnT antibody (ab10223), Alexa488-labeled goat-derived anti-mouse IgG (A-11001), and hoechst33342 (dojindo) and observed.
- the embryoid bodies are generally light in color.
- the cell nucleus stained blue was densely present (that is, the cells were densely present) in the dark (dark) portion in the microscopic image.
- the cells stained with green are concentrated in the light-colored (whitish) area in the microscopic image, and the area between the cells is wide in that area, and there are also areas where no cells exist.
- a cavity structure is formed inside the embryoid body as the embryoid body differentiates.
- the body itself becomes larger, the color of the part where the cavity structure is formed is observed to be faint, the cells surrounding the cavity structure differentiate into cardiomyocytes, and the cardiomyocytes are compared to non-cardiomyocytes It is estimated that the cell size or the distance between cells is large.
- Example 3 Correlation between size change of embryoid body and cTnT positive rate
- Example 1 The area data obtained in the above were further analyzed to examine the correlation between the size change of the embryoid body and the cTnT positive rate.
- the size change rate from the first day to the fourth day of the culture and the size change rate from the eighth day to the 12th day of the culture The relationship with the positive rate of cTnT in the embryoid bodies thus obtained was analyzed.
- the size change rate and the cTnT positive rate from the first day to the fourth day of culture were remarkably positively linearly correlated. This indicates that embryoid bodies whose size changes greatly from the first day to the fourth day of culture have a high directionality of differentiation into cardiomyocytes and a high content of cardiomyocytes in the final embryoid body. ing. Conversely, the size change rate and the cTnT positive rate from the 8th day to the 12th day of the culture were negatively linearly correlated. This is because the embryoid bodies that do not change much in size from the 8th day to the 12th day of culture have higher differentiation direction to cardiomyocytes, and the cardiomyocyte content in the final embryoid body is also higher. It is high.
- Example 4 Correlation between embryoid body size and cTnT positive rate at each time point The relationship between the embryoid body size at each culture time point and the finally obtained cTnT positive rate (cardiomyocyte rate) was examined. Except that the spheroid-forming culture vessel EZSPHERE (R) was used for culturing some iPS cells on the 0th day of culture, and that the 6th to 18th day was cultured under the 6th to 12th day culture conditions. Example 1 above. In the same manner as (1), human iPS cells were induced to differentiate. On the 4th, 6th and 18th days of culture, the length of the major axis of the embryoid body was measured and sorted according to length. After culturing up to day 18, Example 1 above. The cTnT positive rate was measured as in (1).
- FIGS. 5 to 7 show the relationship between the length of the major axis on day 4, 6 and 18 of culture and the cardiomyocyte rate, respectively.
- the cardiomyocyte ratio (purity) finally obtained tended to improve. From this, it was shown that the purity of cardiomyocytes can be predicted and screened by classifying embryoid bodies based on morphological characteristics even on the fourth day of culture.
- the cardiomyocyte ratio (purity) finally obtained when 100 ⁇ m or less or 200 ⁇ m or more tended to improve.
- cardiomyocyte rate (purity) was higher as the major axis of the finally obtained cardiomyocytes was longer, and the cardiomyocyte rate was significantly increased particularly at 300 ⁇ m or more.
- cultivation EZSPHERE (R) was used on the culture
- Example 5 Correlation between difference in differentiation direction for each cell line and size of embryoid body The following 6 cells obtained from RIKEN BioResource Center were used as the iPS cell line: 201B7, 253G1, 409B2, HiPS-RIKEN-1A HiPS-RIKEN-2A and HiPS-RIKEN-12A. These iPS cell lines are obtained by referring to the methods described in Matsuura, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327, Miki K. Cell Stem Cell (2015), WO2014 / 185358A1 and WO2017 / 038562. In Example 1. Differentiation was induced to cardiomyocytes by the same method as (1).
- undifferentiated human iPS cells were used on feeder cells of mitomycin C-treated MEF (ReproCell) using 5 ng / mL bFGF added to Prime ES medium (ReproCell). Cultured and passaged once every 3-4 days.
- human iPS cells were dissociated with Dissociation solution (ReproCell) and Accumax (Innovation Cell Technologies), and StemPro34 (Life Technologies) supplemented with 0.5 ng / mL BMP-4 and 10 ⁇ M Y27632 (Rock inhibitor)
- the suspension was suspended and then cultured with EZSPHERE (IWAKI) for 1 day to form agglomerates.
- the resulting embryoid body was cultured until 4 days in a culture solution containing activin A, bone morphogenetic protein (BMP) 4 and basic fibroblast growth factor (bFGF), and then Wnt inhibitor (IWR1) was added.
- BMP bone morphogenetic protein
- bFGF basic fibroblast growth factor
- the cells were cultured in a culture medium containing up to day 6, and then cultured in a culture medium containing VEGF and bFGF to induce differentiation into cardiomyocytes.
- the rate of troponin positive after induction of differentiation into cardiomyocytes was measured in the same manner as in (1), and the above six cell lines were higher in the differentiation induction efficiency into cardiomyocytes (High group: 201B7, 253G1, 409B2) and lower (Low group: HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A).
- the troponin positive rate is determined by dispersing embryoid bodies using TrypLE Select, fixing the dispersed cells using BD Cytofix / Cytoperm (R) Fixation / Permeabilization Solution Kit (BD Bioscience), and permeabilizing the anti-human troponin. After sequentially reacting an antibody (Thermo Fisher Scientific) and Alexa488-labeled goat-derived anti-mouse IgG (A-11001) (Thermo Fisher Scientific), measurement was performed with a flow cytometer and calculated.
- BZ-X700 analysis application ver1.3.1.
- FIG. 9 is a photograph of iPS cells in culture
- FIG. 10 is a photograph of embryoid bodies on day 6 of differentiation induction.
- the differentiation-inducing cell when a differentiation-inducing cell is obtained by inducing differentiation of a pluripotent stem cell, the differentiation-inducing cell can be estimated nondestructively at an early stage of differentiation induction. In particular, it is very useful in the manufacture of products such as regenerative medicine.
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Abstract
【課題】本発明は、多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法、多能性幹細胞を培養して得られる胚様体をスクリーニングする方法、多能性幹細胞から心筋細胞を調整する方法、上記スクリーニング方法により得られた胚様体および/または該胚様体を分化誘導して得られる分化誘導細胞を含む細胞集団、該胚様体および/または細胞集団を含む医薬組成物、ならびに該医薬組成物の製造方法などを提供することを目的とする。多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む、前記方法などにより、上記課題が解決された。
Description
本発明は、多能性幹細胞を培養および分化誘導して得られる胚様体の分化特性を評価する方法、該方法を利用した胚様体のスクリーニング方法および特定の分化誘導細胞を調製する方法、上記スクリーニング方法により得られた胚様体および/または該胚様体を分化誘導して得られる分化誘導細胞を含む細胞集団、該胚様体および/または細胞集団を含む医薬組成物、ならびに該医薬組成物の製造方法などに関する。
成体の心筋細胞は自己複製能に乏しく、心筋組織が損傷を受けた場合、その修復は極めて困難である。近年、損傷した心筋組織の修復のために、細胞工学的手法により作製した心筋細胞を含む移植片を患部に移植する試みが行われている(特許文献1、非特許文献1)。かかる移植片の作製に用いる心筋細胞として最近注目されているのが、胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)などの多能性幹細胞から誘導した心筋細胞であり、このような多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の作製や動物での治療実験が試みられている(非特許文献2~3)。しかしながら、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の開発は始まったばかりであり、その機能的特性や、それに影響する因子などについては依然不明な部分が多い。
多能性幹細胞から分化誘導細胞を調製する場合、例えば心筋細胞を調製する場合であれば、まず多能性幹細胞から中胚葉への分化の方向性を与えつつ胚様体を形成し、かかる胚様体を心筋細胞に分化誘導し、これを単一の細胞に分散させることにより心筋細胞を回収する(例えば特許文献2など)。
近年ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞に関する研究が進んでおり、多能性幹細胞の細胞株や個々の多能性幹細胞間で、特定の分化誘導細胞への分化傾向に差異があることがわかってきている(例えば非特許文献4)。そこで最近では、分化の過程をモニタリングしたり、分化に影響する因子を見出そうという試みが為されている。例えば特許文献3には、幹細胞に心筋分化マーカーの発現に応じて発行するように構成された蛍光レポータータンパク質遺伝子を導入して、分化の様子をモニタリングすることが記載されている。また非特許文献5には、最初に播種するiPS細胞の数を変えることにより形成される胚様体の大きさを変化させ、それによる心筋細胞分化への影響を観察したことが記載されている。
Shimizu et al., Circ Res. 2002 Feb 22;90(3):e40-e48
Matsuura et al., Biomaterials. 2011 Oct;32(30):7355-62
Kawamura et al., Circulation. 2012 Sep 11;126(11 Suppl 1):S29-37
Kojima et al., Cell Stem Cell 14, 107-120 (2014)
大貫善継 他、THE CHEMICAL TIMES、関東化学株式会社、2016年7月、Vol. 241、pp. 12-16
本発明は、多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法、多能性幹細胞を培養して得られる胚様体をスクリーニングする方法、多能性幹細胞から心筋細胞を調製する方法、上記スクリーニング方法により得られた胚様体および/または該胚様体を分化誘導して得られる分化誘導細胞を含む細胞集団、該胚様体および/または細胞集団を含む医薬組成物、ならびに該医薬組成物の製造方法などを提供することを目的とする。
上記の試みにも拘らず、多能性幹細胞の分化傾向に関与する因子については未だに特定されておらず、分化前または分化途中で分化の傾向を判別する方法についてもまた解明されておらず、多能性幹細胞を完全に目的とする分化誘導細胞に実際に分化させてみなければ、該分化誘導細胞への分化に適性があったのか判断することができないのが現状である。しかしながら、多能性幹細胞を体細胞まで完全に分化させるのにはある程度の期間が必要であることや、一度完全に分化してしまった場合、再び分化多能性を与えるのは容易ではないことから、完全に分化させる前に分化傾向を判断する方法が望まれている。
本発明者らは多能性幹細胞から心筋細胞を調製する方法について研究する中で、規格化された方法、すなわち同一の個数の多能性幹細胞を播種し、同一の条件で培養および分化誘導して得られる胚様体であっても、それぞれ大きさが異なることを見出した。そこで、かかる胚様体の大きさと分化傾向との関係についてさらに研究を続けたところ、胚様体が大きいものほど心筋細胞への分化指向性が高い、すなわち心筋細胞に分化しやすい性質を有していることを新たに見出し、かかる知見に基づいて鋭意研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する:
[1]多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む、前記方法。
[2]分化特性が、分化指向性である、[1]の方法。
[3]分化指向性が、心筋細胞への分化指向性である、[2]の方法。
[4]形態学的特徴の測定が、胚様体が形成されたと判断された時点を含む、1または2以上の時点において実施される、[1]~[3]の方法。
[5]形態学的特徴の測定が、非侵襲的に行われる、[1]~[4]の方法。
[1]多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む、前記方法。
[2]分化特性が、分化指向性である、[1]の方法。
[3]分化指向性が、心筋細胞への分化指向性である、[2]の方法。
[4]形態学的特徴の測定が、胚様体が形成されたと判断された時点を含む、1または2以上の時点において実施される、[1]~[3]の方法。
[5]形態学的特徴の測定が、非侵襲的に行われる、[1]~[4]の方法。
[6]胚様体の形態学的特徴を測定する工程が、胚様体を撮像することを含む、[1]~[5]の方法。
[7]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[1]~[6]の方法。
[8]多能性幹細胞を培養して得られる胚様体をスクリーニングする方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程を含み、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い胚様体がスクリーニングされる、前記方法。
[9]目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、[8]に記載の方法。
[10]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[8]または[9]の方法。
[7]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[1]~[6]の方法。
[8]多能性幹細胞を培養して得られる胚様体をスクリーニングする方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程を含み、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い胚様体がスクリーニングされる、前記方法。
[9]目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、[8]に記載の方法。
[10]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[8]または[9]の方法。
[11](A)多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して目的の分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;
を含む、目的の分化誘導細胞の調製方法。
[12]目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、[11]の方法。
[13]多能性幹細胞が、iPS細胞である、[11]または[12]の方法。
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して目的の分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;
を含む、目的の分化誘導細胞の調製方法。
[12]目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、[11]の方法。
[13]多能性幹細胞が、iPS細胞である、[11]または[12]の方法。
[14]工程(b)が、胚様体を撮像することを含む、[11]~[13]の方法。
[15]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[11]~[14]の方法。
[16][8]~[10]のスクリーニング方法によりスクリーニングされた胚様体。
[17][16]の胚様体を分化誘導して得られる心筋細胞を含む細胞集団を含む、医薬組成物。
[15]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[11]~[14]の方法。
[16][8]~[10]のスクリーニング方法によりスクリーニングされた胚様体。
[17][16]の胚様体を分化誘導して得られる心筋細胞を含む細胞集団を含む、医薬組成物。
[18]多能性幹細胞を培養して形成された胚様体および/または該胚様体を分化誘導して得られる分化誘導細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物の製造方法であって、
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程
を含む、前記方法。
[19]さらに
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;および
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態に調製する工程;
を含む、[18]の方法。
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程
を含む、前記方法。
[19]さらに
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;および
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態に調製する工程;
を含む、[18]の方法。
[20]目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株をスクリーニングする方法であって、
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程
を含む、前記方法。
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程
を含む、前記方法。
本発明によれば、所望の分化誘導細胞、特に心筋細胞に分化しやすい能力を有する胚様体を、分化誘導の初期段階から簡便な方法で選別することが可能となり、iPS細胞などの多能性幹細胞から所望の細胞を分化誘導して得る方法において、効率的に分化誘導細胞を調製することが可能となる。また本発明の方法は、対象の胚様体を非侵襲的に検査することが可能であるため、胚様体に含まれる細胞に何ら影響を与えることなく選別することができ、実際の再生医療等に用いる組成物等を作製する際にも用いることが可能である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
本発明において、「多能性幹細胞」という語は、当該技術分野で周知の用語であり、三胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉に属する全ての系列の細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、核移植胚性幹細胞(ntES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)などが挙げられる。通常多能性幹細胞を特定の細胞に分化誘導する際には、まず多能性幹細胞を浮遊培養して、上記三胚葉のいずれかの細胞の凝集体を形成し、その後凝集体を形成する細胞を目的とする特定の細胞に分化誘導させる。または、多能性幹細胞を高密度で接着培養して、分化誘導させる。本発明において「胚様体」とは、かかる細胞の凝集体を意味する。本発明においては特に、内胚葉系の細胞に分化指向性を有する胚様体を「内胚葉性胚様体」、中胚葉系の細胞に分化指向性を有する胚様体を「中胚葉性胚様体」、外胚葉系の細胞に分化指向性を有する胚様体を「外胚葉性胚様体」と称する場合がある。
本発明において、「分化誘導細胞」は、多能性幹細胞から特定の種類の細胞に分化するように分化誘導処理された任意の細胞を意味する。分化誘導細胞は、心筋細胞や骨格筋芽細胞などの組織を構成する接着性の細胞および、血球細胞などの非接着性の細胞が含まれる。分化誘導細胞の非限定例は、心筋細胞、骨格筋芽細胞などの筋肉系の細胞、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、ドーパミン産生細胞などの神経系の細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血球細胞、骨髄細胞などの造血系の細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、樹状細胞、B細胞などの免疫関連の細胞、肝細胞、膵β細胞、腎細胞などの臓器を構成する細胞、軟骨細胞、生殖細胞などの他、これらの細胞に分化する前駆細胞や体性幹細胞などを含む。かかる前駆細胞や体性幹細胞の典型例としては、例えば心筋細胞における間葉系幹細胞、多分化性心臓前駆細胞、単能性心臓前駆細胞、神経系の細胞における神経幹細胞、造血系の細胞や免疫関連の細胞における造血幹細胞およびリンパ系幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞の分化誘導は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導は、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やWO2014/185358、Shugo Tohyama et al., Stem Cell Report, 9, 1-9, Nov 14, 2017に記載の手法に基づいて行うことができる。
本発明において、「分化指向性」は、多能性幹細胞が特定の分化誘導細胞に分化しやすい性質を意味し、特定の分化誘導細胞への分化指向性が高いほど、当該分化誘導細胞になりやすいことを意味する。したがって特定の細胞への分化指向性が高い多能性幹細胞は、分化指向性が高くない多能性幹細胞と比較して、当該特定の細胞への分化誘導方法により分化誘導を行った場合、同一の分化誘導方法であってもより多くの分化誘導細胞を得られることが期待される。
本発明において、「心筋細胞」とは、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味する。心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、c-TNT(cardiac troponin T)、CD172a(別名SIRPAまたはSHPS-1)、KDR(別名CD309、FLK1またはVEGFR2)、PDGFRA、EMILIN2、VCAMなどが挙げられる。一態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞は、c-TNT陽性かつ/またはCD172a陽性である。
<1>本発明の評価方法
本発明の一側面は、多能性幹細胞を培養・分化誘導して得られる胚様体の分化特性を評価する方法に関する。本発明の評価方法は、評価対象である胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む。
本発明において「形態学的特徴」は、視覚的に確認できる特徴を意味する。形態学的特徴の例としては、これに限定するものではないが例えば、胚様体の大きさ、胚様体の形状、胚様体の色などが挙げられる。形態学的特徴の測定結果は数値データとして得られ得るが、例えば画像データなどで得てもよい。形態学的特徴には光学顕微鏡で測定可能なデータだけでなく、光学顕微鏡以外により得られる可視光域以外の光、例えばラマン散乱光、赤外線、OCT、第二高調波などで非侵襲的に得られる情報も含まれる。また、測定結果として得られたデータを解析して得られたデータもまた本発明の形態学的特徴の測定結果に包含される。かかるデータの例としては、これに限定するものではないが、例えば画像データを解析して得られた数値データ、2以上の時点の数値データの変化率などが挙げられる。また、測定結果として得られたデータは、既知データとして蓄積され、次の検査にフィードバックすることができる。
本発明の一側面は、多能性幹細胞を培養・分化誘導して得られる胚様体の分化特性を評価する方法に関する。本発明の評価方法は、評価対象である胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む。
本発明において「形態学的特徴」は、視覚的に確認できる特徴を意味する。形態学的特徴の例としては、これに限定するものではないが例えば、胚様体の大きさ、胚様体の形状、胚様体の色などが挙げられる。形態学的特徴の測定結果は数値データとして得られ得るが、例えば画像データなどで得てもよい。形態学的特徴には光学顕微鏡で測定可能なデータだけでなく、光学顕微鏡以外により得られる可視光域以外の光、例えばラマン散乱光、赤外線、OCT、第二高調波などで非侵襲的に得られる情報も含まれる。また、測定結果として得られたデータを解析して得られたデータもまた本発明の形態学的特徴の測定結果に包含される。かかるデータの例としては、これに限定するものではないが、例えば画像データを解析して得られた数値データ、2以上の時点の数値データの変化率などが挙げられる。また、測定結果として得られたデータは、既知データとして蓄積され、次の検査にフィードバックすることができる。
本発明の形態学的特徴の測定結果の具体例としては、これに限定するものではないが、例えば胚様体の周長、胚様体の径(長径および/または短径)、胚様体の垂直投影面積、胚様体の体積、胚様体の真円度、胚様体の色情報(輝度、彩度、明度、光度などを含む)などの胚様体の形態を直接的に示すデータのほか、培養液のpH(培養液の色情報)、吸光度など形態学的特徴に相関するデータなどが挙げられ、これらの値は直接数値として測定したものであっても、一旦撮像して画像データとして得た後で、該画像データを解析して得たものであってもよい。好ましい一態様において、測定結果は、胚様体の垂直投影面積が含まれる。別の好ましい一態様において、測定結果は、胚様体の色情報が含まれる。別の好ましい一態様において、測定結果は、ある時点から別の時点までの間の垂直投影面積の変化率が含まれる。フェノールレッドなどのpH反応性の試薬を加えた培地の色情報なども組み合わせてよい。また、複数の画像データから得られた情報をもとに、機械学習やディープラーニングなどの人工知能に基づいて得られた形態学的特徴であっても良い。
本発明において、多能性幹細胞の培養および分化誘導の手法は当該技術分野において知られたいかなる手法を用いてもよい。例えば心筋細胞に分化誘導する場合、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する手法としては、様々なものが知られている(例えば、Burridge et al., Cell Stem Cell. 2012 Jan 6;10(1):16-28)が、いずれの方法においても、中胚葉誘導因子(例えば、アクチビンA、BMP4、bFGF、VEGF、SCFなど)、心臓特異化(cardiac specification)因子(例えば、VEGF、DKK1、Wntシグナルインヒビター(例えば、IWR-1、IWP-2、IWP-3、IWP-4等)、BMPシグナルインヒビター(例えば、NOGGIN等)、TGFβ/アクチビン/NODALシグナルインヒビター(例えば、SB431542等)、レチノイン酸シグナルインヒビターなど)および心臓分化因子(例えば、VEGF、bFGF、DKK1など)を、順次作用させることにより誘導効率を高めることができる。一態様において、多能性幹細胞からの心筋細胞誘導処理は、BMP4を作用させて形成した胚様体に、(1)BMP4とbFGFとアクチビンAとの組み合わせ、(2)VEGFとIWP-3、および、(3)VEGFとbFGFとの組み合わせを順次作用させることを含む。
本発明において「分化特性」とは、評価対象の胚様体が有する分化に関する能力を意味する。分化特性の例としては、これに限定するものではないが、例えば分化指向性、分化誘導後の残存未分化細胞率、分化誘導後の分化誘導細胞含有率などが挙げられる。好ましい一態様において、分化特性は、分化指向性である。さらに好ましい一態様においては、分化特性が、心筋細胞への分化指向性である。
形態学的特徴は、多能性幹細胞を分化誘導して分化誘導細胞を得るまでの間の任意の時点で測定してよく、測定回数も特に限定されない。したがってある態様において、形態学的特徴の測定は、1回だけ行われる。別の態様において、形態学的特徴の測定は、2回行われる。さらに別の態様において、形態学的特徴の測定は、複数回(例えば2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回など)行われる。
好ましい一態様において、形態学的特徴は、胚様体が形成されたと判断された時点より後の1または複数の時点で測定される。より好ましい一態様において、形態学的特徴は、胚様体が形成されたと判断された時点で測定される。別の好ましい一態様において、形態学的特徴は、胚様体が形成されたと判断された時点での測定を含む複数回測定される。
多能性幹細胞を培養して胚様体が形成されるまでの培養期間は、用いる培養条件および分化誘導条件により異なる。当業者であれば用いた培養条件および分化誘導条件に基づいて、胚様体が形成されるまでの培養期間を直ちに算出することが可能である。例えば心筋細胞を分化誘導する上述の態様の場合、多能性幹細胞の培養開始1日目で細胞凝集体が形成され、培養2日目から4日目までの間で胚様体が形成される。したがってある態様において、胚様体は培養4日目に形成されたと判断される。
形態学的特徴の測定は、侵襲的に行われても非侵襲的に行われてもよいが、測定によってその後の胚様体の分化に影響を及ぼさないという観点から、好ましくは非侵襲的に行われる。非侵襲的な形態学的特徴の測定手法としては、これに限定するものではないが、例えば顕微鏡下での観察、撮像デバイスによる画像データ取得などが挙げられ、好ましくは撮像デバイスによる画像データ取得である。
本発明の一態様において、形態学的特徴として胚様体の大きさが用いられる。胚様体の大きさを表す数値データとしては、これに限定するものではないが、例えば視野中の胚様体が占める面積(垂直投影面積)、視野中の胚様体の外周の長さ、胚様体の径、胚様体の体積などが挙げられる。これらの数値は、顕微鏡下の観察による測定などにより、対象の胚様体から直接得てもよいが、撮像デバイスにより画像データを取得し、該画像データを解析することにより得てもよい。これらのデータは、正確に計測された数値であってもよいし、簡便な計測から算出された近似値であってもよい。
形態学的特徴として胚様体の大きさを用いる場合、好ましくは胚様体が形成されたと判断された時点で胚様体の大きさを測定することを含む。したがってある態様において、胚様体が形成されたと判断された時点で胚様体の大きさを測定して、該胚様体の分化特性を評価する。例えば多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する上記態様においては、培養6日目以降の胚様体の大きさが大きいものほど心筋細胞への分化指向性が高い、すなわちより多くの心筋細胞を含有する細胞集団を得ることができると評価できる。また、培養4日目の胚様体においては、長径が例えば100μm以下など、大きすぎないサイズのものほど心筋細胞への分化指向性が高いと評価できる。
形態学的特徴として胚様体の大きさを用いる場合、分化指向性が高いと評価できる具体的な数値範囲は、計測の時点、目的の分化誘導細胞および測定する特徴などによって異なり、当業者であれば適宜好適な範囲を選択することができる。例えば心筋細胞に分化誘導する場合において、胚様体の径を測定する場合、培養4日目であれば100μm以下が好ましく、培養6日目であれば100μm以下もしくは200μm以上が好ましく、培養12日目以降であれば、300μm以上が好ましく、300~500μmがより好ましい。また胚様体の面積を測定する場合、培養6日目であれば4.0×105μm2~7.0×105μm2が好ましく、培養12日目以降であれば、1.5×106μm2以上が好ましく、2.0×106がより好ましい。
別の態様においては、複数の時点(好ましくは胚様体が形成されたと判断された時点を含む)において胚様体の大きさを測定し、二時点間での変化率を算出することにより、胚様体の分化特性を評価する。例えば多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する上記態様においては、胚様体が形成されるまでの大きさの変化率が大きいものほど心筋細胞への分化指向性が高い、すなわちより多くの心筋細胞を含有する細胞集団を得ることができると評価できる。逆に胚様体が形成された後では、大きさの変化率が小さいものほど心筋細胞への分化指向性が高い、すなわちより多くの心筋細胞を含有する細胞集団を得ることができると評価できる。
上記胚様体の大きさに代えてまたは加えて、形態学的特徴として胚様体の色情報を測定してもよい。胚様体の色情報を表す数値データとしては、これに限定するものではないが、例えば胚様体の輝度、彩度、明度、光度、RGB値、光の透過率、グレースケール変換時の階調値などが挙げられる。これらの数値は、顕微鏡下の観察による測定などにより、対象の胚様体から直接得てもよいが、撮像デバイスにより画像データを取得し、該画像データを解析することにより得てもよい。これらのデータは、正確に計測された数値であってもよいし、簡便な計測から算出された近似値であってもよい。
形態学的特徴として胚様体の色情報を用いる場合、好ましくは胚様体が形成されたと判断された時点で胚様体の色情報を測定することを含む。したがってある態様において、胚様体が形成されたと判断された時点で胚様体の色情報を測定して、該胚様体の分化特性を評価する。例えば多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する上記態様において、透過光を用いて得られた画像情報からその色を判定する場合は、培養4日目の胚様体の色が白に近い(グレースケールの平均階調値が大きい)ものほど心筋細胞への分化指向性が高い、すなわちより多くの心筋細胞を含有する細胞集団を得ることができると評価できる。
また、分化特性として分化誘導後の未分化細胞残存率や分化誘導細胞の含有率を評価する場合、複数の既知データから検量線を描く等により評価することができる。例えば多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する上記態様においては、複数の胚様体の分化誘導においてから得られた胚様体の大きさなどの形態学的特徴の測定結果と、分化誘導後の未分化細胞残存率および/または分化誘導細胞の含有率との関係が線形に相関することが本発明者らにより見出されている。このことを利用すると、多能性幹細胞から分化誘導して、心筋細胞などの目的の分化誘導細胞を、得る際、例えば培養4日目などに胚様体の大きさなどの形態学的特徴を測定し、既知データから得られた検量線と比較することにより、分化誘導後の未分化細胞残存率および/または分化誘導細胞の含有率を予測することが可能となる。
<2>本発明のスクリーニング方法
本発明の検査方法は、対象の胚様体を、好ましくは非侵襲的に検査することができ、そのため本発明の検査方法を用いて胚様体を検査した後も、引き続き該胚様体を分化誘導に供することが可能である。これはすなわち、本発明の検査方法により分化特性を検査し、好ましい結果が得られた胚様体(例えば目的の分化誘導細胞への分化指向性が高い胚様体)を選抜してさらなる分化誘導に供することが可能であることを意味する。また、対象の胚葉体が、好ましくない結果が得られた胚葉体(例えば分化指向性が低い胚葉体)であった場合は、該胚葉体の分化誘導を中止することを含む。
したがって本発明の一側面において、上記<1>の検査方法を用いた胚様体のスクリーニング方法が包含される。
本発明の検査方法は、対象の胚様体を、好ましくは非侵襲的に検査することができ、そのため本発明の検査方法を用いて胚様体を検査した後も、引き続き該胚様体を分化誘導に供することが可能である。これはすなわち、本発明の検査方法により分化特性を検査し、好ましい結果が得られた胚様体(例えば目的の分化誘導細胞への分化指向性が高い胚様体)を選抜してさらなる分化誘導に供することが可能であることを意味する。また、対象の胚葉体が、好ましくない結果が得られた胚葉体(例えば分化指向性が低い胚葉体)であった場合は、該胚葉体の分化誘導を中止することを含む。
したがって本発明の一側面において、上記<1>の検査方法を用いた胚様体のスクリーニング方法が包含される。
本発明において「スクリーニング」は、所定の基準に基づいて対象を分類すること、および所定の基準を満たす対象を選別することのみならず、対象が所定の基準を満たしているか否かをモニタリングすることを含む。
本発明のスクリーニング方法は、上記<1>の検査方法により、心筋細胞などの目的とする分化誘導細胞への分化指向性を検査し、好適な分化指向性を有する胚様体をスクリーニングすることができるというものであり、したがって以下の工程を含む;
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程。
本態様における非侵襲的な形態学的特徴の測定工程(a)については、上記<1>で詳述したとおりである。
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程。
本態様における非侵襲的な形態学的特徴の測定工程(a)については、上記<1>で詳述したとおりである。
本発明のスクリーニング方法は、さらに任意に以下の工程(b)および(c)を含み得る;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程。
工程(b)において、(a)で得られた測定結果と基準とを比較する。ここで基準は、目的の分化誘導細胞への好適な分化指向性を有することが既知の胚様体における形態学的特徴を意味し、該基準と比較することにより、対象の胚様体が基準と同等またはより好適なデータである場合に、対象の胚様体は目的とする分化誘導細胞への分化指向性が高いものと判断される。基準の例としては、これに限定するものではないが、例えば、目的の分化誘導細胞への分化指向性が高い胚様体の画像データ、分化誘導後に目的の分化誘導細胞の含有率が所定の割合以上であったおよび/または未分化細胞の含有率が所定の割合以下であった胚様体の所定の時点での大きさの平均値などが挙げられる。
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程。
工程(b)において、(a)で得られた測定結果と基準とを比較する。ここで基準は、目的の分化誘導細胞への好適な分化指向性を有することが既知の胚様体における形態学的特徴を意味し、該基準と比較することにより、対象の胚様体が基準と同等またはより好適なデータである場合に、対象の胚様体は目的とする分化誘導細胞への分化指向性が高いものと判断される。基準の例としては、これに限定するものではないが、例えば、目的の分化誘導細胞への分化指向性が高い胚様体の画像データ、分化誘導後に目的の分化誘導細胞の含有率が所定の割合以上であったおよび/または未分化細胞の含有率が所定の割合以下であった胚様体の所定の時点での大きさの平均値などが挙げられる。
基準としては、形態学的特徴の測定により得られる画像データや数値データ等のデータであってもよいが、別の基準であってもよい。データ以外の基準としては、これに限定するものではないが、例えば所定の大きさの孔を有するフィルターや色見本などが挙げられる。
また、形態学的特徴を測定する工程、基準と比較する工程および/または好適と判断されたものをスクリーニングする工程が同一の工程であってもよい。例えば上述の所定の大きさの孔を有するフィルターを用いる態様においては、形態学的特徴を測定する胚様体を、前記フィルターに通し、通過できなかった胚様体を好適なものとしてスクリーニングしてもよい。
また、形態学的特徴を測定する工程、基準と比較する工程および/または好適と判断されたものをスクリーニングする工程が同一の工程であってもよい。例えば上述の所定の大きさの孔を有するフィルターを用いる態様においては、形態学的特徴を測定する胚様体を、前記フィルターに通し、通過できなかった胚様体を好適なものとしてスクリーニングしてもよい。
測定により得られたデータが基準よりも好適であるか否かは、測定した形態学的特徴や目的の分化誘導細胞により異なるが、当業者であれば形態学的特徴および/または目的の分化誘導細胞などに基づいてただちに判断することができる。例えば上述の心筋細胞への分化誘導の場合であって、形態学的特徴として培養4日目における胚様体の大きさを測定した場合、測定結果が基準データと同等またはそれよりも大きければ好適なデータであると判断でき、前記胚様体は心筋細胞への分化指向性が高い胚様体であると判断できる。また、例えば上述の心筋細胞への分化誘導の場合であって、形態学的特徴として培養4日目における胚様体の色情報(例えばグレースケール画像の階調値)を測定した場合、測定結果が基準データと同等またはそれよりも大きければ好適なデータであると判断でき、前記胚様体は心筋細胞への分化指向性が高い胚様体であると判断できる。
本発明のスクリーニング方法は、多能性幹細胞から分化誘導される任意の分化誘導細胞を分化誘導する際に用いることができるが、好ましい一態様において、分化誘導細胞は心筋細胞である。また形態学的特徴としても任意のデータを測定することができるが、好ましくは胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報である。
<3>本発明の心筋細胞の調製方法
本発明の別の一側面において、上記<2>のスクリーニング方法を用いた分化誘導細胞、特に心筋細胞の調製方法が包含される。
本発明の調製方法は、上記<2>のスクリーニング方法を用いて、分化誘導に好適な胚様体を、特に分化誘導の早期段階でスクリーニングすることにより、心筋細胞などの目的とする分化誘導細胞を効率的に調製することができるというものであり、したがって以下の工程を含む:
(A)多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞(例えば心筋細胞など)を含む細胞集団を得る工程。
本発明の別の一側面において、上記<2>のスクリーニング方法を用いた分化誘導細胞、特に心筋細胞の調製方法が包含される。
本発明の調製方法は、上記<2>のスクリーニング方法を用いて、分化誘導に好適な胚様体を、特に分化誘導の早期段階でスクリーニングすることにより、心筋細胞などの目的とする分化誘導細胞を効率的に調製することができるというものであり、したがって以下の工程を含む:
(A)多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞(例えば心筋細胞など)を含む細胞集団を得る工程。
胚様体の形成工程(A)および分化誘導工程(D)について、用いられる培養方法は、目的とする分化誘導細胞により異なるが、当該技術分野において既知の任意の方法を用いることができる。例えば心筋細胞を分化誘導する場合、上述の心筋細胞の分化誘導方法における胚様体形成方法および分化誘導方法を用いることができる。多能性幹細胞としては上記した任意の多能性幹細胞を用いることができるが、好ましくはiPS細胞、特にヒトiPS細胞である。
ヒトiPS細胞から心筋細胞を得る公知の方法としては、例えば、以下のステップ:
(1)ヒトiPS細胞を、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養するステップ(フィーダーフリー法)、
(2)得られたiPS細胞から胚様体を形成するステップ、
(3)得られた胚様体をアクチビンA、骨形成タンパク質(BMP)4および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含有する培養液中で培養するステップ、
(4)得られた胚様体をWnt阻害剤、BMP4阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む培養液中で培養するステップ、および
(5)得られた胚様体をVEGFおよびbFGFを含む培養液中で培養するステップ
を含む方法が挙げられる。
(1)ヒトiPS細胞を、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養するステップ(フィーダーフリー法)、
(2)得られたiPS細胞から胚様体を形成するステップ、
(3)得られた胚様体をアクチビンA、骨形成タンパク質(BMP)4および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含有する培養液中で培養するステップ、
(4)得られた胚様体をWnt阻害剤、BMP4阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む培養液中で培養するステップ、および
(5)得られた胚様体をVEGFおよびbFGFを含む培養液中で培養するステップ
を含む方法が挙げられる。
上記(1)のステップにおいて、例えばWO2017038562に記載のように、StemFit AK03(味の素)を培地として用い、iMatrix511(ニッピ)上でiPS細胞を培養して適応させ、維持培養を行うことができる。また、例えばNakagawa M.,et al.A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.Sci Rep.2014;4:3594に記載のように、iPS細胞を、7~8日毎に、TrypLE(登録商標)Select(Thermo Fisher Scientific)を使用してシングルセルとして継代を行うことができる。上記(1)~(5)のステップのあとに、任意で、(6)得られた心筋細胞を精製するステップを選択的に行ってもよい。心筋細胞の精製としては、グルコースフリー培地を用いて心筋細胞以外を減少させる方法やWO2017/038562に記載のように熱処理を用いて未分化細胞を減少させる方法などが挙げられる。
本側面における非侵襲的な形態学的特徴の測定工程(b)については、上記<1>で詳述したとおりである。
本側面におけるスクリーニング工程(c)については、上記<2>に詳述したとおりである。
本側面におけるスクリーニング工程(c)については、上記<2>に詳述したとおりである。
<4>多能性幹細胞由来の細胞を含む医薬組成物など
本発明の別の一側面において、上記<2>のスクリーニング方法によりスクリーニングされる胚様体および/または該胚様体から誘導される分化誘導細胞、特に心筋細胞、を含む細胞集団、ならびにそれらを含む医薬組成物が包含される。
本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングされた胚様体は、高い分化指向性を有し、分化誘導に供することにより目的の分化誘導細胞の含有率が高い細胞集団を得ることができる胚様体である。かかる胚様体および/または細胞集団は、特に再生医療などの分野において疾患を処置するための医薬組成物の成分として好適に用いられる。かかる医薬組成物の形態としては、疾患を処置し得る任意の形態であってよく、例えばシート状細胞培養物(細胞シート)、細胞懸濁液、細胞塊、移植片などの形態であり得る。
本発明の別の一側面において、上記<2>のスクリーニング方法によりスクリーニングされる胚様体および/または該胚様体から誘導される分化誘導細胞、特に心筋細胞、を含む細胞集団、ならびにそれらを含む医薬組成物が包含される。
本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングされた胚様体は、高い分化指向性を有し、分化誘導に供することにより目的の分化誘導細胞の含有率が高い細胞集団を得ることができる胚様体である。かかる胚様体および/または細胞集団は、特に再生医療などの分野において疾患を処置するための医薬組成物の成分として好適に用いられる。かかる医薬組成物の形態としては、疾患を処置し得る任意の形態であってよく、例えばシート状細胞培養物(細胞シート)、細胞懸濁液、細胞塊、移植片などの形態であり得る。
上述のとおり一態様において本発明の医薬組成物は、疾患を処置するためのものである。かかる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患、肺疾患、肝疾患、膵臓疾患、腎臓疾患、大腸疾患、小腸疾患、脊髄疾患、中枢神経系疾患、骨疾患、眼疾患、または皮膚疾患などが挙げられる。目的細胞が心筋細胞である場合には、心筋梗塞(心筋梗塞に伴う慢性心不全を含む)、拡張型心筋症、虚血性心筋症、収縮機能障害(例えば、左室収縮機能障害)を伴う心疾患(例えば、心不全、特に慢性心不全)などが挙げられる。かかる疾患としては、目的細胞、および/または、目的細胞のシート状細胞培養物(細胞シート)が、その処置に有用なものであってもよい。
本発明の別の一側面において、上記<2>のスクリーニング方法を一工程として含む、多能性幹細胞を培養して形成された胚様体および/または該胚様体を分化誘導して得られる分化誘導細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明の医薬組成物の製造方法は、上記<2>のスクリーニング方法により、心筋細胞などの所望の分化誘導細胞への好適な分化指向性を有する胚様体を選抜し、かかる胚様体を用いて医薬組成物を製造することができるというものであり、したがって以下の工程(a)~(c)を含む;
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程。
本発明の医薬組成物の製造方法は、上記<2>のスクリーニング方法により、心筋細胞などの所望の分化誘導細胞への好適な分化指向性を有する胚様体を選抜し、かかる胚様体を用いて医薬組成物を製造することができるというものであり、したがって以下の工程(a)~(c)を含む;
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程。
本態様における工程(a)~(c)については、上記<2>で詳述したとおりである。
本発明の医薬組成物の製造方法は、任意にさらに、以下の工程(d)および(e)を含んでよい。
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞(例えば心筋細胞など)を含む細胞集団を得る工程;
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態(例えばシート状細胞培養物)に調製する工程。
分化誘導工程(d)については、上記<3>の(D)工程について詳述したとおりである。
得られた分化誘導細胞を含む細胞集団を所望の形態に調製する方法は、当該技術分野において公知である。例えばシート状細胞培養物を調製する場合、既知の任意の方法(例えば、特許文献1、特開2010-081829、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-172925、WO 2014/185517など参照)で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種すること、播種した細胞をシート化すること、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離することを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種する工程の前に、細胞を凍結する工程および細胞を解凍する工程を行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄する工程を行ってもよい。また、シート状細胞培養物が、複数枚のシート状細胞培養物を積層した積層シート状細胞培養物である場合、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離する工程の後に、複数枚のシート状細胞培養物を積層(重層)する工程を含んでもよい。これら各工程は、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞(例えば心筋細胞など)を含む細胞集団を得る工程;
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態(例えばシート状細胞培養物)に調製する工程。
分化誘導工程(d)については、上記<3>の(D)工程について詳述したとおりである。
得られた分化誘導細胞を含む細胞集団を所望の形態に調製する方法は、当該技術分野において公知である。例えばシート状細胞培養物を調製する場合、既知の任意の方法(例えば、特許文献1、特開2010-081829、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-172925、WO 2014/185517など参照)で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種すること、播種した細胞をシート化すること、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離することを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種する工程の前に、細胞を凍結する工程および細胞を解凍する工程を行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄する工程を行ってもよい。また、シート状細胞培養物が、複数枚のシート状細胞培養物を積層した積層シート状細胞培養物である場合、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離する工程の後に、複数枚のシート状細胞培養物を積層(重層)する工程を含んでもよい。これら各工程は、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物の調製方法は、工程(d)で目的の分化誘導細胞を含む細胞集団を得た後、該細胞集団から腫瘍形成能を有する細胞を除去することをさらに含む。腫瘍形成能を有する細胞の除去は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。かかる手法の非限定例としては、腫瘍形成能を有する細胞に特異的なマーカー(例えば、細胞表面マーカーなど)を用いた種々の分離法、例えば、磁気細胞分離法(MACS)、フローサイトメトリー法、アフィニティ分離法や、特異的プロモーターにより選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子など)を発現させる方法、腫瘍形成能を有する細胞の生存に必要な栄養源(メチオニン等)を除いた培地で培養して未分化細胞を駆逐する方法、腫瘍形成能を有する細胞の表面抗原をターゲットにした薬剤で処理する方法、公知の未分化細胞を除去する方法としては、WO2014/126146、WO2012/056997に記載の方法、WO2012/147992に記載の方法、WO2012/133674に記載の方法、WO2012/012803(特表2013-535194)に記載の方法、WO2012/078153(特表2014-501518)に記載の方法、特開2013-143968およびTohyama S. et al., Cell Stem Cell Vol.12 January 2013, Page 127-137に記載の方法、Lee MO et al., PNAS 2013 Aug 27;110(35):E3281-90に記載の方法、WO2016/072519に記載の方法、WO2013100080に記載の方法、特開2016-093178に記載の方法、WO2017/038526に記載の熱処理を用いる方法などが挙げられる。好ましい態様において、腫瘍形成能を有する細胞の除去は、ブレンツキシマブ・ベドチンを用いて行われる。
ブレンツキシマブ・ベドチンとは、CD30抗原を標的とする抗体と微小管阻害作用有する低分子薬剤(モノメチルアウリスタチンE:MMAE)とを結合させた抗体薬物複合体であり、アドセトリスの商標名で販売されている。再発・難治性のCD30陽性のホジキンリンパ腫等に対する治療薬であり、CD30抗原を発現する細胞に選択的に作用することができる。CD30抗原は、未分化細胞において高度に発現しているため、ブレンツキシマブ・ベドチンにより未分化細胞を除去することができる(WO2016/072519)。具体的な操作としては、ブレンツキシマブ・ベドチンを培養培地に添加してインキュベートすることにより行われる。
<5>分化指向性の高い多能性幹細胞株のスクリーニング方法
本発明の別の一側面において、胚様体の形態学的特徴に基づいて、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株をスクリーニングする方法が包含される。
本発明者らにより、多能性幹細胞は細胞株ごとに分化誘導細胞への分化指向性が異なる可能性が見出された。本発明者らは、目的の分化誘導細胞(例えば心筋細胞)への分化誘導性が高い細胞株は、低い細胞株と比較して、当該目的の分化誘導細胞(例えば心筋細胞)に分化するように分化誘導させた場合、上記<1>の評価方法において分化指向性が高いとされる胚様体と同様の形態学的特徴を示すことが見出された。
本発明の別の一側面において、胚様体の形態学的特徴に基づいて、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株をスクリーニングする方法が包含される。
本発明者らにより、多能性幹細胞は細胞株ごとに分化誘導細胞への分化指向性が異なる可能性が見出された。本発明者らは、目的の分化誘導細胞(例えば心筋細胞)への分化誘導性が高い細胞株は、低い細胞株と比較して、当該目的の分化誘導細胞(例えば心筋細胞)に分化するように分化誘導させた場合、上記<1>の評価方法において分化指向性が高いとされる胚様体と同様の形態学的特徴を示すことが見出された。
したがって本側面のスクリーニング方法は、以下の工程を含む:
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程。
(1)の胚様体形成工程については、上記<3>の(A)工程において詳述したとおりである。
(2)の測定工程については、上記<1>で詳述したとおりである。
(3)の比較工程については、上記<2>の(b)工程において詳述したとおりである。
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程。
(1)の胚様体形成工程については、上記<3>の(A)工程において詳述したとおりである。
(2)の測定工程については、上記<1>で詳述したとおりである。
(3)の比較工程については、上記<2>の(b)工程において詳述したとおりである。
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
例1.胚様体の形態学的特徴と心筋細胞分化誘導との相関解析
(1)心筋細胞への分化誘導
Nunclon Sphera96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)に10000個/ウェルの割合でヒトiPS細胞を播種し、StemPro34(Life Technologies)培地に以下の添加物を加えた条件で分化誘導を行った:
0~1日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml、Y-27632 10mM
1~4日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml
4~6日目:IWR-1 4μM、IWP-2 10μM
6~12日目:VEGF 5ng/ml、FGF-2 10ng/ml。
(1)心筋細胞への分化誘導
Nunclon Sphera96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)に10000個/ウェルの割合でヒトiPS細胞を播種し、StemPro34(Life Technologies)培地に以下の添加物を加えた条件で分化誘導を行った:
0~1日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml、Y-27632 10mM
1~4日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml
4~6日目:IWR-1 4μM、IWP-2 10μM
6~12日目:VEGF 5ng/ml、FGF-2 10ng/ml。
培養12日目に、得られた胚様体(EB)をTrypLE(登録商標)Select Enzyme (10X),no phenol red(Thermo Fisher Scientific)を1mM EDTAにて3×の濃度に希釈した溶液を用い、37℃で10分間インキュベートすることにより、単一細胞へと分散した。分散した細胞をBD Cytofix/Cytoperm(登録商標)Fixation/Permeabilization Solution Kit(BD Bioscience)を用いて固定、透過処理した後、抗ヒトトロポニン抗体(Thermo Fisher Scientific)、Alexa488標識ヤギ由来抗マウスIgG(A-11001)(Thermo Fisher Scientific)を順次反応させた後、フローサイトメーターにより測定を行い、cTnT陽性率を算出した。
(2)胚様体の面積とcTnT陽性率との相関
培養1日目、4日目、6日目、8日目、12日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像し、画像中の胚様体の面積および周囲長を解析した。
顕微鏡像から解析された胚様体の面積を横軸に、培養12日目の胚様体を分散して得られた心筋細胞含有組成物中の心筋細胞含有率(cTnT陽性率)を縦軸にして測定結果をプロットした。結果を図1に示す。
培養1日目においては、形成された細胞凝集体の面積に大きな差異はなく、最終的に得られるcTnT陽性率との相関は見られなかった。一方、培養4日目以降においては、胚様体の面積とcTnT陽性率との間には顕著な正の線形相関が見られた。
培養1日目、4日目、6日目、8日目、12日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像し、画像中の胚様体の面積および周囲長を解析した。
顕微鏡像から解析された胚様体の面積を横軸に、培養12日目の胚様体を分散して得られた心筋細胞含有組成物中の心筋細胞含有率(cTnT陽性率)を縦軸にして測定結果をプロットした。結果を図1に示す。
培養1日目においては、形成された細胞凝集体の面積に大きな差異はなく、最終的に得られるcTnT陽性率との相関は見られなかった。一方、培養4日目以降においては、胚様体の面積とcTnT陽性率との間には顕著な正の線形相関が見られた。
(3)胚様体の面積および周囲長と拍動細胞との相関
上記(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導した。各日における添加因子は下記の通りとした。
0~1日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml、Y-27632 10mM
1~5日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml
5~7日目:IWR-1 4μM
7~10日目:VEGF 5ng/ml、FGF-2 10ng/ml。
培養1~10日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像し、画像中の胚様体の面積および周囲長を解析した。培養10日目に、心筋細胞へ分化誘導後の胚葉体の拍動の有無を観察した。
結果を図2に示す。拍動が観察された胚様体は、培養5日目および7日目の時点で面積および周囲長共に大きい値を示す傾向にあった。
上記(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導した。各日における添加因子は下記の通りとした。
0~1日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml、Y-27632 10mM
1~5日目:BMP4 10ng/ml、FGF-2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml
5~7日目:IWR-1 4μM
7~10日目:VEGF 5ng/ml、FGF-2 10ng/ml。
培養1~10日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像し、画像中の胚様体の面積および周囲長を解析した。培養10日目に、心筋細胞へ分化誘導後の胚葉体の拍動の有無を観察した。
結果を図2に示す。拍動が観察された胚様体は、培養5日目および7日目の時点で面積および周囲長共に大きい値を示す傾向にあった。
例2.胚様体の観察
上記例1.(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導して胚様体を形成した。培養12日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像した。撮像後、撮像した胚様体から切片を作成し、マウス由来抗cTnT抗体(ab10223)、Alexa488標識ヤギ由来抗マウスIgG(A-11001)、およびhoechst33342(dojindo)で染色し、観察した。
上記例1.(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導して胚様体を形成した。培養12日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像した。撮像後、撮像した胚様体から切片を作成し、マウス由来抗cTnT抗体(ab10223)、Alexa488標識ヤギ由来抗マウスIgG(A-11001)、およびhoechst33342(dojindo)で染色し、観察した。
結果を図3に示す。視野中の面積の大きい胚様体においては、胚様体は全体的に色が薄くなっている。切片染色像で確認すると、顕微鏡像では色が濃い(黒っぽい)部分において、青く染色された細胞核が密集して存在している(すなわち細胞が密集して存在している)のが観察された。一方、緑色に染色された細胞(心筋細胞)は、顕微鏡像で色が薄い(白っぽい)部分に集中して存在しており、またその部分では細胞間も広く、細胞が存在しない領域も観察される。顕微鏡像での観察や胚様体の視野中面積の大きさなども併せ考えると、心筋細胞の分化誘導においては、胚様体の分化とともに胚様体内部に腔構造が形成され、これにより胚様体自体が大きくなること、そのために腔構造が形成された部分の色が薄くなって観察されること、腔構造の周囲の細胞が心筋細胞に分化すること、心筋細胞が非心筋細胞に比べて細胞サイズもしくは細胞間距離が大きいことなどが推測される。
例3.胚様体のサイズ変化とcTnT陽性率との相関
上記例1.において得られた面積データをさらに解析して、胚様体のサイズ変化とcTnT陽性率との相関関係を検討した。培養1日目、4日目、8日目および12日目のデータを用いて、培養1日目から4日目のサイズ変化率および培養8日目から12日目のサイズ変化率と、最終的に得られた胚様体におけるcTnT陽性率との関係を解析した。
上記例1.において得られた面積データをさらに解析して、胚様体のサイズ変化とcTnT陽性率との相関関係を検討した。培養1日目、4日目、8日目および12日目のデータを用いて、培養1日目から4日目のサイズ変化率および培養8日目から12日目のサイズ変化率と、最終的に得られた胚様体におけるcTnT陽性率との関係を解析した。
結果を図4に表す。培養1日目から4日目のサイズ変化率とcTnT陽性率とは顕著に正に線形相関していた。このことは、培養1日目から4日目にかけて大きくサイズが変化する胚様体は、心筋細胞への分化指向性が高く、最終的な胚様体中の心筋細胞含有率も高いことを示している。また逆に、培養8日目から12日目のサイズ変化率とcTnT陽性率とは負に線形相関していた。このことは、培養8日目から12日目にかけてはサイズにあまり変化が見られない胚様体ほど、心筋細胞への分化指向性が高く、最終的な胚様体中の心筋細胞含有率も高いことを示している。
例4.各時点における胚様体の大きさとcTnT陽性率との相関
各培養時点における胚様体の大きさと、最終的に得られるcTnT陽性率(心筋細胞率)との関係を検討した。
培養0日目において一部のiPS細胞の培養にスフェロイド形成培養用容器EZSPHERE(R)を用いたこと、および6~12日目の培養条件で6~18日目まで培養を行ったこと以外は上記例1.(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導した。培養4日目、6日目および18日目において胚様体の長径の長さを計測し、長さ別に分取した。18日目まで培養した後、上記例1.(1)と同様にcTnT陽性率を計測した。
各培養時点における胚様体の大きさと、最終的に得られるcTnT陽性率(心筋細胞率)との関係を検討した。
培養0日目において一部のiPS細胞の培養にスフェロイド形成培養用容器EZSPHERE(R)を用いたこと、および6~12日目の培養条件で6~18日目まで培養を行ったこと以外は上記例1.(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導した。培養4日目、6日目および18日目において胚様体の長径の長さを計測し、長さ別に分取した。18日目まで培養した後、上記例1.(1)と同様にcTnT陽性率を計測した。
培養4日目、6日目および18日目の長径の長さと心筋細胞率との関係を、それぞれ図5~7に示す。培養4日目においては、長径が100μm以下の場合に、最終的に得られた心筋細胞率(純度)が向上する傾向があった。このことから培養4日目においても、形態学的特徴に基づいて胚様体を分類することにより、心筋細胞の純度を予測し、スクリーニングできることが示された。培養6日目においては、100μm以下もしくは200μm以上の場合に最終的に得られた心筋細胞率(純度)が向上する傾向があった。このことから培養6日目においても、形態学的特徴に基づいて胚様体を分類することにより、心筋細胞の純度を予測し、スクリーニングできることが示された。培養18日目においては、最終的に得られた心筋細胞の長径が長いほど心筋細胞率(純度)が高く、特に300μm以上の場合に顕著に心筋細胞率が上昇した。また、培養0日目においてスフェロイド形成培養用容器EZSPHERE(R)を用いた場合であっても、上記傾向に違いは見られなかった。このことから、例えば培養4日目における胚様体の長径が100μm以上の場合は培養を中止する、もしくは100μm以下のものを分取するなどのスクリーニング方法への応用が考えられる。
例5.細胞株ごとの分化指向性の差異と胚様体の大きさとの相関
iPS細胞株として、理研バイオリソースセンターより入手した以下の6種の細胞を用いた:201B7、253G1、409B2、HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2AおよびHiPS-RIKEN-12A。これらのiPS細胞株を、Matsuura, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327、Miki K. Cell Stem Cell (2015)、WO2014/185358A1およびWO2017/038562などに記載の方法を参考に、例1.(1)と同様の手法により心筋細胞まで分化誘導した。具体的には、Primate ES培地(ReproCell)に5ng/mLのbFGFを添加したものを未分化維持培地として用い、フィーダー細胞であるマイトマイシンC処理済みのMEF(ReproCell)上で未分化ヒトiPS細胞を培養して、3~4日に1回継代を行った。
iPS細胞株として、理研バイオリソースセンターより入手した以下の6種の細胞を用いた:201B7、253G1、409B2、HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2AおよびHiPS-RIKEN-12A。これらのiPS細胞株を、Matsuura, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327、Miki K. Cell Stem Cell (2015)、WO2014/185358A1およびWO2017/038562などに記載の方法を参考に、例1.(1)と同様の手法により心筋細胞まで分化誘導した。具体的には、Primate ES培地(ReproCell)に5ng/mLのbFGFを添加したものを未分化維持培地として用い、フィーダー細胞であるマイトマイシンC処理済みのMEF(ReproCell)上で未分化ヒトiPS細胞を培養して、3~4日に1回継代を行った。
分化誘導はヒトiPS細胞をDissociation solution(ReproCell)およびAccumax(イノベーションセルテクノロジーズ)で解離して、0.5ng/mLのBMP-4と10μMのY27632(Rock阻害剤)を添加したStemPro34(ライフテクノロジーズ)で懸濁し、EZSPHERE(IWAKI)で1日培養して集塊を形成させた。得られた胚様体をアクチビンA、骨形成タンパク質(BMP)4および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含有する培養液中で4日目まで培養し、その後Wnt阻害剤(IWR1)を含む培養液中で6日目まで培養し、その後VEGFおよびbFGFを含む培養液中で培養し、心筋細胞への分化誘導を行った。上記例1.(1)と同様にして心筋細胞への分化誘導後のトロポニン陽性率を測定し、上記6種の細胞株を心筋細胞への分化誘導効率の上位(High群:201B7、253G1、409B2)と下位(Low群:HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2A、HiPS-RIKEN-12A)で2群に分けた。図8に示すように、その2群ではフローサイトメトリー解析結果によるcTnT陽性率に有意な差があった(High群対Low群:83.2%±0.2%対15.8±2.6%;p<0.01;n=3)。
トロポニン陽性率は、胚様体をTrypLE Selectを用いて分散後、分散した細胞をBD Cytofix/Cytoperm(R)Fixation/Permeabilization Solution Kit(BD Bioscience)を用いて固定、透過処理した後、抗ヒトトロポニン抗体(Thermo Fisher Scientific)、Alexa488標識ヤギ由来抗マウスIgG(A-11001)(Thermo Fisher Scientific)を順次反応させた後、フローサイトメーターにより測定を行って算出した。
各iPS細胞株から心筋細胞へ分化誘導途中の胚葉体をKEYENCE社 オールインワン蛍光顕微鏡BZ-X700を用いて対物レンズの倍率が4倍の条件で撮影した画像を、BZ-X700解析アプリケーションver1.3.1.1を用いて、寸法計測、エリア計測で各iPS細胞株について50~100個の胚葉体の長径および面積を測定した。図9は培養中のiPS細胞の写真図で、図10は分化誘導6日目の胚葉体の写真図である。
分化誘導6日目で胚葉体の長径および面積を測定した結果、高純度群と低純度群で胚葉体の長径(High群対Low群:286μm±36μm対202μm±22μm;p<0.01)および胚葉体の面積(High群対Low群:67329μm2±17503μm2対33676μm2±7084μm2;p<0.01)に有意な差があることが分かった(図11)。これらの結果から、分化指向性の高いiPS細胞株は、分化指向性の高い形態学的特徴を示すことが示された。これらのことは、胚様体の分化指向性と形態学的特徴が密接に関連する可能性を示唆する。
分化誘導6日目で胚葉体の長径および面積を測定した結果、高純度群と低純度群で胚葉体の長径(High群対Low群:286μm±36μm対202μm±22μm;p<0.01)および胚葉体の面積(High群対Low群:67329μm2±17503μm2対33676μm2±7084μm2;p<0.01)に有意な差があることが分かった(図11)。これらの結果から、分化指向性の高いiPS細胞株は、分化指向性の高い形態学的特徴を示すことが示された。これらのことは、胚様体の分化指向性と形態学的特徴が密接に関連する可能性を示唆する。
本発明によれば、多能性幹細胞を分化誘導して分化誘導細胞を得る際に、分化誘導の早期段階において、非破壊的に分化誘導結果を推測することができるため、分化誘導細胞を効率的に得ることができ、特に再生医療等製品の製造などにおいて非常に有用である。
Claims (20)
- 多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む、前記方法。
- 分化特性が、分化指向性である、請求項1に記載の方法。
- 分化指向性が、心筋細胞への分化指向性である、請求項2に記載の方法。
- 形態学的特徴の測定が、胚様体が形成されたと判断された時点を含む、1または2以上の時点において実施される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 形態学的特徴の測定が、非侵襲的に行われる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 胚様体の形態学的特徴を測定する工程が、胚様体を撮像することを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞を培養して得られる胚様体をスクリーニングする方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程を含み、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い胚様体がスクリーニングされる、前記方法。
- 目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、請求項8に記載の方法。
- 形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、請求項8または9に記載の方法。
- (A)多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して目的の分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;
を含む、目的の分化誘導細胞の調製方法。 - 目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、請求項11に記載の方法。
- 多能性幹細胞が、iPS細胞である、請求項11または12に記載の方法。
- 工程(b)が、胚様体を撮像することを含む、請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。
- 形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、請求項11~14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項8~10のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた胚様体。
- 請求項16に記載の胚様体を分化誘導して得られる心筋細胞を含む細胞集団を含む、医薬組成物。
- 多能性幹細胞を培養して形成された胚様体および/または該胚様体を分化誘導して得られる分化誘導細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物の製造方法であって、
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程
を含む、前記方法。 - さらに
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;および
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態に調製する工程;
を含む、請求項18に記載の方法。 - 目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株をスクリーニングする方法であって、
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程
を含む、前記方法。
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