JPWO2019163802A1 - 胚様体の評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む、前記方法。
[2]分化特性が、分化指向性である、[1]の方法。
[3]分化指向性が、心筋細胞への分化指向性である、[2]の方法。
[4]形態学的特徴の測定が、胚様体が形成されたと判断された時点を含む、1または2以上の時点において実施される、[1]〜[3]の方法。
[5]形態学的特徴の測定が、非侵襲的に行われる、[1]〜[4]の方法。
[7]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[1]〜[6]の方法。
[8]多能性幹細胞を培養して得られる胚様体をスクリーニングする方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程を含み、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い胚様体がスクリーニングされる、前記方法。
[9]目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、[8]に記載の方法。
[10]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[8]または[9]の方法。
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して目的の分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;
を含む、目的の分化誘導細胞の調製方法。
[12]目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、[11]の方法。
[13]多能性幹細胞が、iPS細胞である、[11]または[12]の方法。
[15]形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、[11]〜[14]の方法。
[16][8]〜[10]のスクリーニング方法によりスクリーニングされた胚様体。
[17][16]の胚様体を分化誘導して得られる心筋細胞を含む細胞集団を含む、医薬組成物。
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程
を含む、前記方法。
[19]さらに
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;および
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態に調製する工程;
を含む、[18]の方法。
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程
を含む、前記方法。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
本発明の一側面は、多能性幹細胞を培養・分化誘導して得られる胚様体の分化特性を評価する方法に関する。本発明の評価方法は、評価対象である胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む。
本発明において「形態学的特徴」は、視覚的に確認できる特徴を意味する。形態学的特徴の例としては、これに限定するものではないが例えば、胚様体の大きさ、胚様体の形状、胚様体の色などが挙げられる。形態学的特徴の測定結果は数値データとして得られ得るが、例えば画像データなどで得てもよい。形態学的特徴には光学顕微鏡で測定可能なデータだけでなく、光学顕微鏡以外により得られる可視光域以外の光、例えばラマン散乱光、赤外線、OCT、第二高調波などで非侵襲的に得られる情報も含まれる。また、測定結果として得られたデータを解析して得られたデータもまた本発明の形態学的特徴の測定結果に包含される。かかるデータの例としては、これに限定するものではないが、例えば画像データを解析して得られた数値データ、2以上の時点の数値データの変化率などが挙げられる。また、測定結果として得られたデータは、既知データとして蓄積され、次の検査にフィードバックすることができる。
本発明の検査方法は、対象の胚様体を、好ましくは非侵襲的に検査することができ、そのため本発明の検査方法を用いて胚様体を検査した後も、引き続き該胚様体を分化誘導に供することが可能である。これはすなわち、本発明の検査方法により分化特性を検査し、好ましい結果が得られた胚様体(例えば目的の分化誘導細胞への分化指向性が高い胚様体)を選抜してさらなる分化誘導に供することが可能であることを意味する。また、対象の胚葉体が、好ましくない結果が得られた胚葉体(例えば分化指向性が低い胚葉体)であった場合は、該胚葉体の分化誘導を中止することを含む。
したがって本発明の一側面において、上記<1>の検査方法を用いた胚様体のスクリーニング方法が包含される。
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程。
本態様における非侵襲的な形態学的特徴の測定工程(a)については、上記<1>で詳述したとおりである。
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程。
工程(b)において、(a)で得られた測定結果と基準とを比較する。ここで基準は、目的の分化誘導細胞への好適な分化指向性を有することが既知の胚様体における形態学的特徴を意味し、該基準と比較することにより、対象の胚様体が基準と同等またはより好適なデータである場合に、対象の胚様体は目的とする分化誘導細胞への分化指向性が高いものと判断される。基準の例としては、これに限定するものではないが、例えば、目的の分化誘導細胞への分化指向性が高い胚様体の画像データ、分化誘導後に目的の分化誘導細胞の含有率が所定の割合以上であったおよび/または未分化細胞の含有率が所定の割合以下であった胚様体の所定の時点での大きさの平均値などが挙げられる。
また、形態学的特徴を測定する工程、基準と比較する工程および/または好適と判断されたものをスクリーニングする工程が同一の工程であってもよい。例えば上述の所定の大きさの孔を有するフィルターを用いる態様においては、形態学的特徴を測定する胚様体を、前記フィルターに通し、通過できなかった胚様体を好適なものとしてスクリーニングしてもよい。
本発明の別の一側面において、上記<2>のスクリーニング方法を用いた分化誘導細胞、特に心筋細胞の調製方法が包含される。
本発明の調製方法は、上記<2>のスクリーニング方法を用いて、分化誘導に好適な胚様体を、特に分化誘導の早期段階でスクリーニングすることにより、心筋細胞などの目的とする分化誘導細胞を効率的に調製することができるというものであり、したがって以下の工程を含む:
(A)多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞(例えば心筋細胞など)を含む細胞集団を得る工程。
(1)ヒトiPS細胞を、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養するステップ(フィーダーフリー法)、
(2)得られたiPS細胞から胚様体を形成するステップ、
(3)得られた胚様体をアクチビンA、骨形成タンパク質(BMP)4および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含有する培養液中で培養するステップ、
(4)得られた胚様体をWnt阻害剤、BMP4阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む培養液中で培養するステップ、および
(5)得られた胚様体をVEGFおよびbFGFを含む培養液中で培養するステップ
を含む方法が挙げられる。
本側面におけるスクリーニング工程(c)については、上記<2>に詳述したとおりである。
本発明の別の一側面において、上記<2>のスクリーニング方法によりスクリーニングされる胚様体および/または該胚様体から誘導される分化誘導細胞、特に心筋細胞、を含む細胞集団、ならびにそれらを含む医薬組成物が包含される。
本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングされた胚様体は、高い分化指向性を有し、分化誘導に供することにより目的の分化誘導細胞の含有率が高い細胞集団を得ることができる胚様体である。かかる胚様体および/または細胞集団は、特に再生医療などの分野において疾患を処置するための医薬組成物の成分として好適に用いられる。かかる医薬組成物の形態としては、疾患を処置し得る任意の形態であってよく、例えばシート状細胞培養物(細胞シート)、細胞懸濁液、細胞塊、移植片などの形態であり得る。
本発明の医薬組成物の製造方法は、上記<2>のスクリーニング方法により、心筋細胞などの所望の分化誘導細胞への好適な分化指向性を有する胚様体を選抜し、かかる胚様体を用いて医薬組成物を製造することができるというものであり、したがって以下の工程(a)〜(c)を含む;
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程。
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞(例えば心筋細胞など)を含む細胞集団を得る工程;
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態(例えばシート状細胞培養物)に調製する工程。
分化誘導工程(d)については、上記<3>の(D)工程について詳述したとおりである。
得られた分化誘導細胞を含む細胞集団を所望の形態に調製する方法は、当該技術分野において公知である。例えばシート状細胞培養物を調製する場合、既知の任意の方法(例えば、特許文献1、特開2010-081829、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-172925、WO 2014/185517など参照)で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種すること、播種した細胞をシート化すること、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離することを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種する工程の前に、細胞を凍結する工程および細胞を解凍する工程を行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄する工程を行ってもよい。また、シート状細胞培養物が、複数枚のシート状細胞培養物を積層した積層シート状細胞培養物である場合、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離する工程の後に、複数枚のシート状細胞培養物を積層(重層)する工程を含んでもよい。これら各工程は、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。
本発明の別の一側面において、胚様体の形態学的特徴に基づいて、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株をスクリーニングする方法が包含される。
本発明者らにより、多能性幹細胞は細胞株ごとに分化誘導細胞への分化指向性が異なる可能性が見出された。本発明者らは、目的の分化誘導細胞(例えば心筋細胞)への分化誘導性が高い細胞株は、低い細胞株と比較して、当該目的の分化誘導細胞(例えば心筋細胞)に分化するように分化誘導させた場合、上記<1>の評価方法において分化指向性が高いとされる胚様体と同様の形態学的特徴を示すことが見出された。
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程。
(1)の胚様体形成工程については、上記<3>の(A)工程において詳述したとおりである。
(2)の測定工程については、上記<1>で詳述したとおりである。
(3)の比較工程については、上記<2>の(b)工程において詳述したとおりである。
(1)心筋細胞への分化誘導
Nunclon Sphera96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)に10000個/ウェルの割合でヒトiPS細胞を播種し、StemPro34(Life Technologies)培地に以下の添加物を加えた条件で分化誘導を行った:
0〜1日目:BMP4 10ng/ml、FGF−2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml、Y−27632 10mM
1〜4日目:BMP4 10ng/ml、FGF−2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml
4〜6日目:IWR−1 4μM、IWP−2 10μM
6〜12日目:VEGF 5ng/ml、FGF−2 10ng/ml。
培養1日目、4日目、6日目、8日目、12日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像し、画像中の胚様体の面積および周囲長を解析した。
顕微鏡像から解析された胚様体の面積を横軸に、培養12日目の胚様体を分散して得られた心筋細胞含有組成物中の心筋細胞含有率(cTnT陽性率)を縦軸にして測定結果をプロットした。結果を図1に示す。
培養1日目においては、形成された細胞凝集体の面積に大きな差異はなく、最終的に得られるcTnT陽性率との相関は見られなかった。一方、培養4日目以降においては、胚様体の面積とcTnT陽性率との間には顕著な正の線形相関が見られた。
上記(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導した。各日における添加因子は下記の通りとした。
0〜1日目:BMP4 10ng/ml、FGF−2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml、Y−27632 10mM
1〜5日目:BMP4 10ng/ml、FGF−2 5ng/ml、アクチビンA 6ng/ml
5〜7日目:IWR−1 4μM
7〜10日目:VEGF 5ng/ml、FGF−2 10ng/ml。
培養1〜10日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像し、画像中の胚様体の面積および周囲長を解析した。培養10日目に、心筋細胞へ分化誘導後の胚葉体の拍動の有無を観察した。
結果を図2に示す。拍動が観察された胚様体は、培養5日目および7日目の時点で面積および周囲長共に大きい値を示す傾向にあった。
上記例1.(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導して胚様体を形成した。培養12日目に胚様体の位相差顕微鏡像を撮像した。撮像後、撮像した胚様体から切片を作成し、マウス由来抗cTnT抗体(ab10223)、Alexa488標識ヤギ由来抗マウスIgG(A-11001)、およびhoechst33342(dojindo)で染色し、観察した。
上記例1.において得られた面積データをさらに解析して、胚様体のサイズ変化とcTnT陽性率との相関関係を検討した。培養1日目、4日目、8日目および12日目のデータを用いて、培養1日目から4日目のサイズ変化率および培養8日目から12日目のサイズ変化率と、最終的に得られた胚様体におけるcTnT陽性率との関係を解析した。
各培養時点における胚様体の大きさと、最終的に得られるcTnT陽性率(心筋細胞率)との関係を検討した。
培養0日目において一部のiPS細胞の培養にスフェロイド形成培養用容器EZSPHERE(R)を用いたこと、および6〜12日目の培養条件で6〜18日目まで培養を行ったこと以外は上記例1.(1)と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導した。培養4日目、6日目および18日目において胚様体の長径の長さを計測し、長さ別に分取した。18日目まで培養した後、上記例1.(1)と同様にcTnT陽性率を計測した。
iPS細胞株として、理研バイオリソースセンターより入手した以下の6種の細胞を用いた:201B7、253G1、409B2、HiPS−RIKEN−1A、HiPS−RIKEN−2AおよびHiPS−RIKEN−12A。これらのiPS細胞株を、Matsuura, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327、Miki K. Cell Stem Cell (2015)、WO2014/185358A1およびWO2017/038562などに記載の方法を参考に、例1.(1)と同様の手法により心筋細胞まで分化誘導した。具体的には、Primate ES培地(ReproCell)に5ng/mLのbFGFを添加したものを未分化維持培地として用い、フィーダー細胞であるマイトマイシンC処理済みのMEF(ReproCell)上で未分化ヒトiPS細胞を培養して、3〜4日に1回継代を行った。
分化誘導6日目で胚葉体の長径および面積を測定した結果、高純度群と低純度群で胚葉体の長径(High群対Low群:286μm±36μm対202μm±22μm;p<0.01)および胚葉体の面積(High群対Low群:67329μm2±17503μm2対33676μm2±7084μm2;p<0.01)に有意な差があることが分かった(図11)。これらの結果から、分化指向性の高いiPS細胞株は、分化指向性の高い形態学的特徴を示すことが示された。これらのことは、胚様体の分化指向性と形態学的特徴が密接に関連する可能性を示唆する。
Claims (20)
- 多能性幹細胞を培養して得られる胚様体の分化特性を評価する方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を測定する工程を含む、前記方法。
- 分化特性が、分化指向性である、請求項1に記載の方法。
- 分化指向性が、心筋細胞への分化指向性である、請求項2に記載の方法。
- 形態学的特徴の測定が、胚様体が形成されたと判断された時点を含む、1または2以上の時点において実施される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 形態学的特徴の測定が、非侵襲的に行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 胚様体の形態学的特徴を測定する工程が、胚様体を撮像することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞を培養して得られる胚様体をスクリーニングする方法であって、胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程を含み、目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い胚様体がスクリーニングされる、前記方法。
- 目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、請求項8に記載の方法。
- 形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、請求項8または9に記載の方法。
- (A)多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(B)(A)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(C)(B)で得られた測定結果に基づいて胚様体をスクリーニングする工程;および
(D)(C)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して目的の分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;
を含む、目的の分化誘導細胞の調製方法。 - 目的の分化誘導細胞が、心筋細胞である、請求項11に記載の方法。
- 多能性幹細胞が、iPS細胞である、請求項11または12に記載の方法。
- 工程(b)が、胚様体を撮像することを含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 形態学的特徴が、胚様体の大きさおよび/または胚様体の色情報を含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項8〜10のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた胚様体。
- 請求項16に記載の胚様体を分化誘導して得られる心筋細胞を含む細胞集団を含む、医薬組成物。
- 多能性幹細胞を培養して形成された胚様体および/または該胚様体を分化誘導して得られる分化誘導細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物の製造方法であって、
(a)胚様体の1または2以上の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;
(b)工程(a)で得られた測定結果と基準とを比較する工程;および
(c)分化指向性が高いと判断された胚様体をスクリーニングする工程
を含む、前記方法。 - さらに
(d)(c)でスクリーニングされた胚様体を分化誘導して分化誘導細胞を含む細胞集団を得る工程;および
(e)(d)で得られた細胞集団を、所望の形態に調製する工程;
を含む、請求項18に記載の方法。 - 目的の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株をスクリーニングする方法であって、
(1)対象の多能性幹細胞を培養して、胚様体を形成する工程;
(2)(1)で得られた胚様体の形態学的特徴を非侵襲的に測定する工程;および
(3)(2)で測定された形態学的特徴と基準とを比較する工程
を含む、前記方法。
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