CN114544957A

CN114544957A - Adgrg1作为生物标志物在制备检测造血干细胞体外扩增效率试剂盒中的应用

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Publication number: CN114544957A
Application number: CN202011330728.2A
Authority: CN
Inventors: 郭滨; 陈燕丹; 姚纯旭
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2022-05-27

Abstract

本发明提供ADGRG1作为生物标志物在制备检测造血干细胞体外扩增效率和移植效果的试剂或试剂盒中的应用。增加ADGRG1阳性造血干细胞比率的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用，以及抑制患者造血干细胞中ADGRG1表达的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用。本发明发现了一个全新标志物ADGRG1可有效标记体外扩增培养应激条件下的功能性造血干细胞。一方面可以检测功能性造血干细胞的扩增效率，另一方面可以筛选促进ADGRG1阳性细胞群体的相关药物用于临床上造血干细胞的移植效率。另外，可通过检测ADGRG1阳性CD34⁺CD133⁺细胞中特异富集的基因，进而发现鉴定人类造血干细胞干性维持的新调控因子。

Description

ADGRG1作为生物标志物在制备检测造血干细胞体外扩增效率试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及以造血干细胞移植为治疗手段的相关疾病的医疗领域。

背景技术

目前世界范围内，尚无有效的造血干细胞体外扩增体系。主要原因是因为人们对于人类造血干细胞在体外培养应激条件下干性维持的机制认识不足。造血干细胞在体外培养过程中，从表型到功能都会发生剧烈改变。如果没有一个标志物对体外培养应激条件下的造血干细胞进行监测，无法判断造血干细胞的体外扩增效率。

目前已有的造血干细胞标志物是CD34、CD133、CD38、CD45RA、CD90、 CD49f、CD201、ITGA3(CD49c)，利用靶向它们的抗体组合可以选择性标记造血干细胞。但是，其中CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺标记的细胞群体只适用于静息状态下的新鲜分离造血干细胞，并不适用于体外培养扩增后的功能性造血干细胞的标记；而CD34⁺CD133⁺CD45RA^-CD90⁺CD201⁺ITGA3⁺细胞群体的发现来自于UM171这种小分子化合物处理培养之后，并不能反映没有任何小分子化合物处理的培养体系中的功能性造血干细胞的数目或比例及其移植效率，也就是说这种标志物组合的发现是带有偏向性的。更遗憾的是， UM171能够增加CD34⁺CD133⁺CD45RA^-CD90⁺CD201⁺ITGA3⁺细胞群体，但是却并不能增加造血干细胞在受体小鼠中的移植效率。综上，目前尚没有一种可靠的标志物能够标记体外扩增培养应激条件下功能性造血干细胞，从而真实地反映或评价造血干细胞的扩增效率和移植效果。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供ADGRG1作为生物标志物在制备检测造血干细胞体外扩增效率和移植效果的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的第二个目的在于，提供增加ADGRG1阳性造血干细胞比率的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用。

本发明的第三个目的在于，提供抑制患者造血干细胞中ADGRG1表达的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用。

本发明的第四个目的在于，提供一种检测造血干细胞体外扩增效率和移植效果的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明公开了ADGRG1作为生物标志物在制备检测造血干细胞体外扩增效率和移植效果的试剂或试剂盒中的应用。本发明发现了第一个体外培养应激条件下的功能性造血干细胞标志物ADGRG1，实时标记体外扩增培养应激条件下的造血干细胞，以ADGRG1为靶标检测造血干细胞的体外扩增效率和移植效果。

进一步的，公开了增加ADGRG1阳性造血干细胞比率的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用。利用ADGRG1为靶标建立造血干细胞体外扩增培养体系，筛选靶向ADGRG1的小分子化合物药物用于扩增造血干细胞。以ADGRG1为靶标，扩增造血干细胞用于白血病、贫血等以造血干细胞移植为主要治疗手段的疾病的治疗。

进一步的，公开了抑制患者造血干细胞中ADGRG1表达的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用。直接靶向ADGRG1的白血病的治疗。

进一步的，公开了一种检测造血干细胞体外扩增效率和移植效果的试剂盒，包括以ADGRG1为靶向的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明的思路和方法如下：

1.对比新鲜分离造血干细胞和体外扩增培养应激条件下的造血干细胞在免疫缺陷小鼠中的移植效果，发现造血CD34阳性细胞经过短期体外培养后，其移植效率(干性)显著下降。

2.利用RNA-seq技术检测新鲜分离和培养应激的造血CD34阳性细胞的转录组，发现造血CD34阳性细胞在体外培养应激条件下线粒体氧化磷酸化代谢活性、线粒体ROS水平、线粒体数目和膜电位都显著增加，说明线粒体氧化应激增加。

3.将体外培养应激条件下的造血CD34阳性细胞进行线粒体ROS染色，再分离线粒体ROS低(mitoROS low)和线粒体ROS高(mitoROS high)两个细胞群体。利用骨髓移植实验发现，具有血液重建能力的功能性造血干细胞存在于线粒体ROS低的CD34⁺细胞中。

4.利用单细胞测序scRNA-seq技术鉴定具有血液重建能力的线粒体ROS 低的CD34⁺细胞中真正的功能性造血干细胞群体和标志物。结果发现 ADGRG1⁺CD34⁺CD133⁺细胞显著表达功能性造血干细胞的特征基因如HLF和 AVP等。

5.利用有限稀释骨髓移植实验证明ADGRG1⁺CD34⁺CD133⁺细胞是真实的具有血液重建能力的功能性造血干细胞。ADGRG1阳性CD34⁺CD133⁺细胞与 ADGRG1阴性CD34⁺CD133⁺细胞相比，具有显著高的移植效率。充分证明 ADGRG1是一个体外培养应激条件下功能性造血干细胞的新标志物。

本发明的优点在于，本发明发现了一个全新标志物ADGRG1可有效标记体外扩增培养应激条件下的功能性造血干细胞。一方面可以检测功能性造血干细胞的扩增效率，另一方面可以筛选促进ADGRG1阳性细胞群体的相关药物用于临床上造血干细胞的移植效率。另外，可通过检测ADGRG1阳性 CD34⁺CD133⁺细胞中特异富集的基因，进而发现鉴定人类造血干细胞干性维持的新调控因子。

附图说明

图1：有限稀释分析新鲜分离和体外扩增培养的人类脐带血CD34⁺细胞的功能性造血干细胞频率。a.新鲜分离Fresh组和体外培养应激Cultured组的泊松分布图显示功能性造血干细胞SRC频率；b.新鲜分离Fresh组和体外培养应激Cultured组中每10⁶个CD34⁺细胞含有的功能性造血干细胞数目。 **p<0.01。

图2：RNA测序后GSEA基因富集分析结果。a.GSEA分析显示人类脐带血CD34⁺细胞体外培养扩增应激后线粒体相关基因的表达显著富集；b.基因功能簇分析显示人类脐带血CD34⁺细胞体外培养扩增应激后线粒体相关基因的功能基因簇显著富集。

图3：Seahorse线粒体呼吸代谢活性检测结果。分析显示与新鲜分离人类脐带血CD34⁺细胞相比，体外扩增培养后的CD34⁺细胞的线粒体呼吸代谢氧气消耗显著上升。

图4：新鲜分离Fresh和体外扩增培养Cultured组线粒体代谢活性指标检测结果。a.线粒体活性氧ROS在体外扩增培养Cultured组CD34⁺细胞中显著上调；b.线粒体Mito-tracker染色显示体外扩增培养Cultured组CD34⁺细胞中的线粒体量显著增加；c.JC-1染色显示体外扩增培养Cultured组CD34⁺细胞中的线粒体膜电位显著增加。***p<0.001。

图5：有限稀释移植实验分析线粒体氧化应激水平高(mitoROS high)和低(mitoROS low)的两个细胞群体的功能性造血干细胞SRC数目。a.mitoROS low组和mitoROShigh组的泊松分布图显示功能性造血干细胞SRC频率；b. mitoROS low组和mitoROS high组中每10⁶个CD34⁺细胞含有的功能性造血干细胞数目。***p<0.001。

图6：单细胞scRNA测序UMAP分析结果显示体外培养扩增的脐带血 CD34⁺细胞可分为18个细胞群体。细胞群体10、11、12和16是主要富集在 mitoROS low细胞中。

图7：体外培养扩增应激CD34⁺细胞中的群体11特异表达造血干细胞标签基因AVP和HLF。

图8：蛋白互作网络关联分析显示细胞群体11中的86个特异表达的基因的相关性。

图9：骨髓移植实验显示ADGRG1⁺CD133⁺CD34⁺细胞具有血液重建和移植能力。a.移植4个月后受体小鼠骨髓细胞hCD45抗体染色显示人类血细胞在小鼠骨髓中的比例；b.移植4个月后受体小鼠骨髓细胞hCD33抗体染色显示人类血细胞在小鼠骨髓中的比例；c.移植4个月后受体小鼠骨髓细胞hCD19 抗体染色显示人类血细胞在小鼠骨髓中的比例；d.移植4个月后受体小鼠骨髓细胞hCD45抗体染色显示人类血细胞在小鼠外周血中的比例。*p<0.05； **p<0.01。

图10：有限稀释分析ADGRG1⁺和ADGRG1^-人类脐带血CD34⁺细胞中功能性造血干细胞频率。a.ADGRG1⁺组和ADGRG1^-组的泊松分布图显示功能性造血干细胞SRC频率；b.ADGRG1⁺组和ADGRG1^-组中每10⁶个CD34⁺CD133⁺细胞含有的功能性造血干细胞数目。***p<0.001。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例

【人脐带血CD34⁺细胞的分离与培养】

首先，用Ficoll溶液(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)对新鲜人类脐带血进行密度梯度离心，分离单个核细胞(Mononuclear cells，MNCs)。然后，使用免疫磁珠分选试剂盒immunomagnetic selection kit(Miltenyi Biotec,Auburn, CA,USA)分选和收集CD34⁺细胞：用MACs缓冲液(含有0.5％BSA,2mM EDTA 的PBS,pH7.2)重悬单个核细胞；加入封闭液FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec,#130-046-702)进行封闭，再加入CD34⁺磁珠(Miltenyi Biotec, #130-046-702)与单个核细胞在4℃孵育30分钟；孵育后，加入MACS缓冲液并离心(300g，10分钟)以清洗细胞。弃上清后，用MACs缓冲液1ml重悬细胞，使用磁珠分选柱MACS column(Miltenyi Biotec,#130-042-401)对细胞悬液进行过柱操作，分选得到的CD34⁺细胞培养在造血干细胞培养基中，该培养基的配方：干细胞扩增培养基(Stem Cell Expansion Medium)(Sigma,S0912) +100ng/ml干细胞生长因子(Stem CellFactor，SCF)(R&D Systems, #7466-SC-010/CF)+100ng/ml促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)(R&D Systems,#288-TP-200/CF)+50ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3ligand，Flt3L)(BioLegend,#710802)+50IU/ml青霉素+50ug/ml链霉素。细胞培养条件为5％O₂，5％CO₂。

【细胞的免疫荧光染色和流式分析】

将细胞离心(300g 10分钟)，用预冷的PBS清洗细胞两次，在重悬在500ul 的PBS中，加入荧光抗体置于4℃染色30分钟后，再用预冷PBS清洗两次，用1％甲醛固定。用流式细胞仪对细胞进行分析。使用如下表面标记物的抗体： CD34-APC(581,BD Bioscience),CD133-BV421(293C3,BD),ADGRG1-PE (4C3,BioLegend),CD19-PE(HIB19,BD),CD33-PEcy7(WM53,BD)and CD45-APC(HI30,BD)。

【细胞的线粒体染色】

脐带血CD34⁺活细胞分别使用MitoSOX^TMRed线粒体超氧化物荧光探针试剂、MitoTracker Green FM线粒体绿色荧光染料和JC1线粒体膜电位荧光探针试剂染色，染色方法由Thermofisher公司提供。细胞先进行表面标志物抗体的染色，离心弃上清清洗细胞后，加入Mito SOX,，MitoTracker或JC-1试剂进行孵育(37℃，15分钟)，细胞用预冷PBS在4℃条件下离心(300g，10 分钟)，弃上清，震荡并重悬于500微升的PBS中，立即上样用流式细胞仪 LSRFortessa flow cytomete(BD Biosciences)进行分析和数据采集。

【Seahorse细胞能量代谢检测】

使用细胞外流量分析系统Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer(AgilentTechnologies)(Guo et al.,2018)检测脐带血CD34⁺细胞的耗氧率(The OxygenConsumption rate，OCR)。200ul的XF校准溶液加到96孔的校准板(utility plate) 中，37℃孵育过夜。细胞培养板(Seahorse Bioscience,#101085-004)使用前先用细胞组织粘合剂Cell-Tak solution(CORNING,#354241)室温孵育1小时。培养板中每个孔铺10⁵个纯化的CD34⁺细胞，并1000g离心10分钟。

在此过程中，oligomycin(Sigma,#75351),FCCP(Sigma,C2920),rotenone(Sigma,R8875)(A,B,C)依次加入校准板中进行OCAR分析。装上感应盖的校准板被放入仪器托盘架中进行校准。校准后将校准板取下，将细胞微孔培养板装入托盘架后点击“开始”测定脐带血CD34⁺cells的OCAR值。

【极限稀释法计数骨髓重建细胞】

使用2012年和2018年报道的极限稀释法计算移植的骨髓重建细胞数 SCID(Repopulating cells，SRCs)(Doulatov et al.,2012；Guo et al.,2018)。不同剂量的对照组或糖皮质激素处理组的CD34⁺细胞尾静脉注射入NSG供者小鼠体内，小鼠预先用低于致死剂量的辐照处理。移植16周后，小鼠处死后取样进行染色和流式分析，测定人源性CD45⁺细胞、髓系细胞以及淋巴细胞的比例。使用L-Calc软件(Stem Cell Technologies Inc,Vancouver,BC,Canada)计算得到功能性造血干细胞的SRC频率，图表使用ELDA软件(bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)绘制。

【RNA测序】

将脐带血CD34+细胞裂解后，用RNA抽提试剂盒RNeasy Mini Kit (QIAGEN,Valencia,CA,USA)提取RNA。测序服务由GE Healthcare公司的子公司SeqWright GenomicServices提供。用RNA测序样本的预处理试剂盒 TruSeq RNA Sample Prep选择带有PolyA尾的选择RNA片段，再进行文库构建、不同细胞类型群的生成。RNA文库构建后上机测序,llumina HiSeq 2500 仪器的测序长度为2×100bp，每个样本读取长度为2×20M。

使用10X Genomics公司的试剂盒Chromium Single Cell 3’V3 Reagent Kits(10X Genomics,Pleasanton,CA)和仪器10X Genomics Chromium Controller Instrument进行单细胞RNA测序和建库。将脐带血的CD34⁺细胞根据线粒体活性氧水平高低分为两群细胞：mitoROS low和mitoROS high，细胞密度调整为 1000个/微升后，每条通道中大约10000个细胞，形成凝胶磁珠-单细胞-油滴结构的油包水微滴(Gel Bead-In-Emulsions，GEMs)，每个样本采集8000个单细胞，且mRNA带有“标签”(barcoding)。

在逆转录后，GEMs溶解，带有“标签”的cDNA被纯化和扩增，单头连上接头序列(adaptors)进行桥式PCR扩增。我们使用高灵敏度DNA定量检测试剂Qubit HighSensitivity DNA assay(Thermo Fisher Scientific)进行定量，用高灵敏度DNA芯片放入仪器Bioanalyzer 2200(Agilent)进行文库分布的测定，所有文库用150bp的测序长度进行两端测序(paired-end run)，测序仪器为HiSeq Xten(Illumina,San Diego,CA)。

【RNA测序的数据分析】

将不含内含子的RNA-seq序列(RNA-seq reads)用比对分析软件RNA-seq alignerSTAR(v2.5)(Dobin et al.,2013)与构建好的参考基因组hg38索引进行比对(参数：“--outSAMmapqUnique 60”)，再用计算片段数的软件The feature Counts进行计数独特基因的表达量，和参考基因组GENCODE 25进行比对， (参数："-s 2–p–Q 10”)。三分之二以上的样本过滤CPM＜0.5(CPM：Read Count per Million，即比对到某个基因的序列数readcount和比对到所有基因的总序列数比值乘以10⁶)的低质量数据之后，用TMM算法进行标准化数据，便于用edgeR(v3.20.8)软件包进行差异表达分析(McCarthy et al.,2012；Robinson et al.,2010)。取假阳性率(False Discovery Rate，FDR)校正后的P值＜0.001和差异倍数(Fold Change，FC)>2的数据，再使用基因富集分析软件DAVID 进行功能性分析(Dennis Jr et al.,2003；Huang et al.,2009)，测定差异表达基因 (theDifferentially Expressed Genes，DEGs)。将所有基因按照倍数变化排布后，进行基因簇富集分析(GSEA)(Subramanian et al.,2005)。

【单细胞RNA测序的数据分析】

将所读取的序列去掉接头序列和低质量序列，使用单细胞测序数据处理软件CellRanger(version 3.1.0)将所测得的序列与构建好的GRCh38基因索引和注释数据库GENCODE V28 annotationn做比对，计算单细胞测序的片段数。将 mitoROS low和mitoROShigh的CD34⁺细胞进行样本处理，总细胞数＜0.1％的基因或者检测低于200个基因的细胞均被剔除，再使用分析软件Seurat R package(Bulter et al.,2018；Stuart et al.,2019；)进行后续分析。

独特基因数量和线粒体数量的存在分布差异，我们采用“LogNormalized”方法，选择独特基因个数在2800–6000范围之间且线粒体计数小于10％的细胞，以10000为换算系数对数据进行归一化。对mitoROS低水平和高水平组的数据整合并进行线性转换。通过对所有细胞进行主成分分析(Principal Component Analysis PCA)，选取前19个主成分(Principal Components，PC)，采用基于共享最近邻(Shared Nearest Neighbor，SNN)模块优化的算法得到19个细胞类型群。

为了确定在聚类分析结果中，细胞类群cluster 11中高表达的基因，我们使用Seurat package的“findmarker”功能和Wilcoxon秩和检验来比较基因在 cluster 11中和其它细胞类型群中的表达情况。选择Bonferroni校正后p值＜ 0.05，平均FC值>线性1.2的细胞，找出cluster 11中特异表达的标志基因。我们使用蛋白互作关系数据库STRINGdatabase(Szklarczyk et al.，2015)构建了 cluster-11中标志基因所参与的蛋白-蛋白互作(Protein-protein Interaction，PPI) 网络。

【统计学分析】

文中数据使用统计学软件GraphPad Prism 5.0.分析，以均数±标准差(Standard Deviation，SD)，或者标准误(Standard Error of the Mean，SEM)表示。MitoROS低水平组和高水平组的统计分析使用双侧T检验，P<0.05为有统计学意义(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

具体发明过程如下：我们首先利用NSG免疫缺陷小鼠骨髓移植实验对比了新鲜分离和体外扩增后的人类脐带血CD34⁺细胞的移植能力。有限稀释分析结果显示，脐带血CD34⁺细胞经短期体外培养后，其骨髓移植能力显著下降(图 1)，功能性造血干细胞SRCs(SCIDrepopulating cells)的频率由1:3424降为 1:271949(表1和表2)，表明体外扩增培养应激会导致人类脐带血造血干细胞干性丢失。

表1有限稀释移植实验移植小鼠分析统计情况表

表2新鲜分离和体外扩增后的人类脐带血CD34⁺细胞中功能性造血干细胞SRC频率

RNA-seq转录组分析对比新鲜分离和体外扩增后的人类脐带血CD34⁺细胞的基因表达变化。结果显示，体外扩增后的人类脐带血CD34⁺细胞线粒体代谢相关基因的表达水平显著上调(图2)。Seahorse线粒体代谢活性检测显示体外培养后的人类脐带血CD34⁺细胞得线粒体呼吸代谢显著升高(图3)。线粒体的一系列代谢指标检测包括线粒体ROS、线粒体量、线粒体膜电位检测显示体外扩增培养的脐带血CD34⁺细胞线粒体氧化应激水平显著上调(图4)。接下来，将体外扩增培养的人类脐带血CD34⁺细胞分为线粒体氧化应激水平高(mitoROS high)和低(mitoROS low)的两个细胞群体。利用NSG免疫缺陷小鼠骨髓移植实验分析对比这两个细胞群体的血液重建和骨髓移植能力。实验结果显示，具有血液重建能力的功能性造血干细胞主要聚集在线粒体氧化应激水平低的CD34⁺细胞群体中(图5)。mitoROS high细胞群体的功能性造血干细胞SRC频率为1:112939，而mitoROS low细胞群体的功能性造血干细胞SRC 频率为1:8918(图5、表3)。

表3.mitoROS low组和mitoROS high组中人类脐带血CD34⁺细胞中功能性造血干细胞SRC频率

单细胞测序技术是研究细胞异质性和分析鉴定细胞群体的有力工具。接下来我们利用单细胞测序转录组分析scRNA-seq技术同时对比分析了mitoROS low细胞群体和mitoROS high细胞群体，从而鉴定mitoROS low细胞群体中潜在的功能造血干细胞群体。我们分析了7663个mitoROS low细胞和12688个 mitoROS high细胞。通过UMAP分析发现体外培养扩增CD34⁺细胞总共可分为18个细胞群体。而其中群体10、11、12和16是主要富集在mitoROS low 细胞中的(图6)。更重要的是细胞群体11中表达人类造血干细胞的标签基因AVP和HLF(图7、图8)；同时几个造血干细胞的重要正向调控因子包括 HOXA9、MSI2和MLLT3都在细胞群体11中显著富集(图8)。这些结果表明细胞群体11很可能是功能性造血干细胞。

利用蛋白互作网络分析在细胞群体11中特异富集的86个基因，结果显示 ADGRG1基因与人类造血干细胞表面标志蛋白CD34和CD133密切关联(图 8)。ADGRG1基因在细胞群体11中显著富集，因此我们认为体外培养扩增应激的人类脐带血CD34⁺细胞中CD34⁺CD133⁺ADGRG1⁺细胞是功能性造血干细胞。

经流式细胞仪分选获得CD34⁺CD133⁺ADGRG1⁺细胞和 CD34⁺CD133⁺ADGRG1^-细胞后，移植到NSG免疫缺陷小鼠中分析骨髓移植和血液重建能力。实验结果显示移植CD34⁺CD133⁺ADGRG1⁺细胞的受体小鼠中人类血细胞的比例无论在骨髓还是外周血中均显著富集，而移植 CD34⁺CD133⁺ADGRG1^-细胞的受体小鼠中的人类细胞比例均相对较少(图9)。

有限稀释实验分析结果显示CD34⁺CD133⁺ADGRG1⁺细胞中的功能性造血干细胞SRC数目频率为1:10077，而CD34⁺CD133⁺ADGRG1^-细胞中功能性造血干细胞SRC数目频率为1:135972。这些结果充分表明人类脐带血CD34⁺干祖细胞经体外扩增培养后，其中ADGRG1标记的CD34⁺CD133⁺细胞是具有血液重建能力的功能性造血干细胞。ADGRG1可作为一种体外培养扩增的功能性造血干细胞的标志物，靶向CD34⁺CD133⁺ADGRG1⁺细胞群体可用于筛选功能性造血干细胞体外扩增的激活剂药物(图10)。

表4.ADGRG1⁺组和ADGRG1^-组中人类脐带血CD34⁺细胞中功能性造血干细胞SRC频率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.ADGRG1作为生物标志物在制备检测造血干细胞体外扩增效率和移植效果的试剂或试剂盒中的应用。

2.增加ADGRG1阳性造血干细胞比率的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用。

3.抑制患者造血干细胞中ADGRG1表达的药物在制备治疗白血病以及贫血性疾病药物中的应用。

4.一种检测造血干细胞体外扩增效率和移植效果的试剂盒，其特征在于，包括以ADGRG1为靶向的单克隆抗体或多克隆抗体。