JP5862915B2 - ハイドロゲルを組み込んだ積層化細胞シート - Google Patents
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Description
[1]ハイドロゲルを用いて細胞シートを積層化することを含む、細胞シートの積層方法。
[2]前記ハイドロゲルが、細胞生存に必要な物質の拡散移動を可能にする材料または形態からなる、[1]に記載の方法。
[3]前記ハイドロゲルが、ゼラチンハイドロゲルである、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記ハイドロゲルが、ハイドロゲル粒子である、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]前記ハイドロゲルゲル粒子が、ゼラチンハイドロゲル粒子である、[4]に記載の方法。
[6]前記ゼラチンハイドロゲル粒子が、ゼラチンに分子間架橋を形成させて得られるゼラチンハイドロゲル粒子である、[5]に記載の方法。
[7]前記ゼラチンハイドロゲル粒子が、乾燥状態で粒子サイズ20μmから32μmの粒子から成る、[5]または[6]に記載の方法。
[8] 前記ハイドロゲル、好ましくはハイドロゲル粒子、より好ましくはゼラチンハイドロゲル粒子を第1の細胞シートもしくは積層細胞シートと第2の細胞シートもしくは積層細胞シートとの間に添加する工程を含む、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記積層細胞シートが、2もしくは3枚の細胞シートからなる、[8]に記載の方法。
[10]前記ハイドロゲル、好ましくはハイドロゲル粒子、より好ましくはゼラチンハイドロゲル粒子を、細胞シートの単位面積あたり500μg/cm2から2000μg/cm2の量で添加する工程を含む、[8]または[9]に記載の方法。
[11][1]〜[10]のいずれかに記載の方法で積層化された積層化細胞シート。
[12]細胞シートを4枚以上積層化した、[11]に記載の積層化細胞シート。
[13][11]または[12]に記載の積層化細胞シートを含む医薬組成物。
[14]前記細胞シートが、心筋細胞シートである、[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[15]前記細胞シートが、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を含む心臓細胞シートである、[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[16]前記心筋細胞が多能性幹細胞から製造された細胞である、[14]または[15]に記載の方法。
[17]前記内皮細胞が多能性幹細胞から製造された細胞である、[15]または[16]に記載の方法。
[18]前記壁細胞が多能幹細胞から製造された細胞である、[15]〜[17]のいずれかに記載の方法。
[19]前記多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞(iPS細胞)である、[14]〜[18]のいずれかに記載の方法。
[20][14]〜[19]のいずれかに記載の方法で積層化された積層化細胞シート。
[21]細胞シートを4枚以上積層化した、[20]に記載の積層化細胞シート。
[22][11]、[12]、[20]および[21]のいずれかに記載の積層化細胞シートを含む心疾患治療剤。
本明細書中で使用される「ハイドロゲル」とは、水を大量に含むことができる物質であり、酸素、水、水溶性の栄養物、酵素やサイトカイン、等のポリペプチド、などの細胞生存に必要な物質、老廃物などを容易に拡散移動させることができる材料または形態であって、通常、生体適合性であるものを意味する。ハイドロゲルの形状もしくは形態としては、細胞シートに組み込むことができれば特に限定されないが、例えば、粒子状、顆粒状、フィルム状、チューブ状、ディスク状、網状、メッシュ状、多孔質状、懸濁状もしくは分散状、などの種々の形状もしくは形態のものが使用できる。その中でも、コロイド粒子を含有する水溶液が固相化した結果としてなるハイドロゲル粒子が好ましい。上記のハイドロゲルの性質をもつものであれば、いずれの材料からなる粒子でも利用することができる。例えば、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの水溶性、水親和性、もしくは水吸収性合成高分子、多糖、タンパク質、核酸などを化学架橋したハイドロゲルからなる粒子である。多糖としては、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、セルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。また、タンパク質としては、コラーゲンおよびその加水分解物であるゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、生体適合性で、かつ、生体内で細胞により分解される材料からなる粒子が本発明には適しており、さらに好ましくはゼラチンからなる粒子である。従って、本発明において、好ましいハイドロゲル粒子は、ゼラチンハイドロゲル粒子である。
ゼラチンハイドロゲル粒子以外のハイドロゲル粒子についても類似の手法または公知の手法でハイドロゲルから作製しうる。また、種々の粒径のハイドロゲル粒子を用いて積層化細胞シートを作製したのち、後述の実施例1に記載のような手法で積層化細胞シートの生存細胞領域面積や壁厚を測定することによって最適な範囲の粒径を決定しうる。
細胞シートを作製するための細胞は、限定されないが、ヒトを含む哺乳動物の細胞であり、例えば体細胞、その前駆細胞またはそれらの混合細胞である。
本発明において細胞シートとは、細胞間結合により細胞同士が連結されたシート状の細胞集合体である。細胞の種類は特に問わないが、細胞は、ヒトを含む哺乳動物の細胞であり、例えば体細胞、その前駆細胞またはそれらの混合細胞である。具体的には、細胞として、非限定的に、心筋細胞、内皮細胞(例えば、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞など)、壁細胞(例えば、周皮細胞など)、筋細胞(例えば、骨格筋細胞および平滑筋細胞など)、上皮細胞(例えば、表皮細胞、真皮細胞、消化管上皮細胞、呼吸器・気道上皮細胞、食道上皮細胞、腎盂上皮細胞、尿管上皮細胞,膀胱上皮細胞、尿道上皮細胞および前立腺導管上皮細胞など)、軟骨細胞、歯根膜細胞、神経系細胞(例えば、神経細胞およびグリア細胞など)、毛乳頭細胞、骨細胞、これらの前駆細胞およびこれらの混合細胞などが挙げられる。これらの細胞は、任意の方法で単離した組織に含有する細胞であってもよく、または組織から樹立された細胞株であってもよい。この他にも、多能性幹細胞から任意の方法で誘導された細胞であってもよい。この時用いる誘導方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、例えば、特表2003-523766に記載されているように胚様体を形成させる方法が挙げられる。
本明細書において「心筋細胞」とは、少なくとも心筋トロポニン(cTnT)またはαMHCを発現している細胞を意味する。cTnTは、ヒトの場合NCBIのaccession番号NM_000364が例示され、マウスの場合、NM_001130174が例示される。αMHCは、ヒトの場合NCBIのaccession番号NM_002471が例示され、マウスの場合、NM_001164171が例示される。
(a)誘導多能性幹細胞から心筋細胞を製造する工程
(b)工程(a)で得られた心筋細胞を血管内皮細胞成長因子(VEGF)の存在下で培養する工程
心筋細胞を製造するための別の好ましい方法について、以下に説明する。
(i)誘導多能性幹細胞を、Activin Aを含む培地で培養する工程
(ii)工程(i)の後、さらに、BMP4とbFGFとを含む培地で培養する工程
本工程では、誘導多能性幹細胞を公知の方法で作製して分離し、浮遊培養、コーティング処理された培養皿を用いる接着培養などの方法、好ましくは接着培養、によって培養する。
また、接着培養においては、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル(BD)、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。より好ましくは、マトリゲルでコーティング処理された培養皿へ誘導多能性幹細胞を接着させ、さらにマトリゲルを添加することで、誘導多能性幹細胞全体をマトリゲルでコーティングするマトリゲルサンドイッチ法による接着培養である。
本工程では、前工程が浮遊培養で行われた場合、得られた細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル(BD)、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。または、前工程が接着培養で行われた場合、培地の交換により培養を続けてもよい。
本工程では、前述した方法で得られた心筋細胞をさらにVEGFの存在下で培養することにより、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞が所望の構成比率から成る混合細胞を製造することができる。
さらに、上記の工程により作製された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞から未分化な細胞を除去することが好ましい。
<細胞シート>
本発明において、上記の細胞をシート化するためには、例えば、細胞を(メタ)アクリルアミド化合物、N-(若しくはN,N-ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体(特開2010-255001)、又はビニルエーテル誘導体を重合させた温度応答性ポリマーを被覆した培養器材を用いて培養し、温度を変化させることにより、細胞をシート状にて取り出すことができる。ここで好ましい培養器材として、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミドを固定した培養器材が例示される。尚、本培養器材は、UpCellとしてセルシード社より購入することもできる。この他にも、温度応答性のコーティング剤として、Chen CH, et al, Biomacromolecules. 7:736-43, 2006に記載のメチルセルロースをコーティングした培養器材またはTakamoto Y, et al, J. Biomater. Sci. Polymer Edn, 18:1211-1222, 2007に記載の2-エトキシエチルビニルエーテル(2-ethoxyethyl vinyl ether)および2-フェノキシエチルビニルエーテル(2-phenoxyethyl vinyl ether)から成るブロック共重合体をコーティングしたポリ(エチレンテレフタレート)(poly(ethyleneterephthalate); PET)フィルムを有する培養器材が例示され、細胞をシート化するにあたり、適宜、これらの培養器材を用いることができる。
本発明において、細胞シートが、心筋細胞を含む場合、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を含む混合細胞からなる「心臓細胞シート」であることが望ましい。このとき、心筋細胞を主として(例えば全細胞数あたり80%超)含むようなとき便宜的に上記の「心臓細胞シート」と区別して「心筋細胞シート」と称する。このような心臓細胞シートを多能性幹細胞から製造する方法は、WO2012/133945に記載された方法のように、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を個々に作製し、作成後、混合させることによって行われてもよく、PCT/JP2013/058460に記載された方法(上記の2.)のように、各分化誘導方法を合わせて、同時に3種誘導することによって行われてもよい。
本発明において、細胞シートを積層化させる方法として、上述の方法で得られた細胞シートを重ねることで積層化することができる。細胞シートを重ねる方法として、任意の培養液中で重ねて、培養液を除去することによって行われ得る。この時、細胞シートの重ねる面に対して、上記のハイドロゲル、例えばゼラチンハイドロゲル、好ましくはハイドロゲル粒子、例えばゼラチンハイドロゲル粒子、をリン酸バッファー溶液(PBS)あるいは培養液に分散させた状態で添加(例えば一部もしくは全面への塗布を包含する。)する。この際、ハイドロゲル、好ましくはハイドロゲル粒子は、乾燥状態でも、PBSあるいは培養液で膨潤させた状態でもよい。ハイドロゲル、例えばゼラチンハイドロゲル、好ましくはハイドロゲル粒子、例えばゼラチンハイドロゲル粒子の添加後、10分以上、好ましくは30分程度、37℃にて静置することが好ましい。この時用いるハイドロゲル、例えばゼラチンハイドロゲル、好ましくはハイドロゲル粒子、例えばゼラチンハイドロゲル粒子は、任意の濃度により等張溶液に溶解させて用いても良い。ここで用いられる等張溶液は、生理的食塩水やPBSなどが例示される。添加もしくは塗布されるハイドロゲル、例えばゼラチンハイドロゲル、好ましくはハイドロゲル粒子、例えばゼラチンハイドロゲル粒子、の量は、例えば、細胞シートの単位面積(cm2)あたり、100μg〜6000μg、200μg〜5000μg、300μg〜4000μg、400μg〜3000μg、または500μg〜2000μg程度であり、好ましくは、細胞シートの単位面積(cm2)あたり500μg/cm2から2000μg/cm2の量である。
本発明において、上述の方法で得られた積層化細胞シートは、疾患や障害により欠損した部分へ直接貼付することによって、治療に用いることができる。従って、本発明では、積層化細胞シートを含む医薬組成物を提供できる。積層化細胞シートは、疾患の対象となる動物種、疾患の治療部位の大きさ、疾患の治療方法などに応じて任意の細胞数もしくは任意の大きさまたは数のシートを用いることができる。
<マウスES細胞株>
Yamashita JKら, FASEB J. 19:1534-6, 2005に記載のaMHCプロモーターによりEGFPの発現が制御されるよう操作されたマウスES細胞株(EMG7)およびTFPを恒常的に発現するようにZambrowicz BPら, Proc Natl Acad Sci USA, 94:3789-3794, 1997記載の方法で改変されたES細胞株(TFP-ROSA)を用いた。
Flk+細胞は、これまでに報告された方法により作製した(Yamashita J, et al. Nature. 408:92-6, 2000またはYamashita JK, et al. FASEB J. 19:1534-6, 2005)。簡潔には、EMG7またはTFP-ROSAを、分化培地(10%ウシ胎児血清および5x105mol/Lの 2-mercaptoethanolを添加したαMEM)を用いて、ゼラチンコーティングディッシュ上で4日間培養した後、FACSによりFlk陽性細胞を純化することで作製した。
上述の方法で得られたTFP-ROSA由来のFlk+細胞からこれまでに報告された方法を用いて内皮細胞および壁細胞の混合細胞を作製した(Yamashita J, et al. Nature. 408:92-6, 2000またはYurugi-Kobayashi T, et al. Arterioscler ThrombVasc Biol. 26:1977-84, 2006)。簡潔には、50 ng/mlのVEGFと0.5 mmol/Lの8-bromo-cAMPを添加した分化培地を用いて、ゼラチンコーティングディッシュ上で3日間培養することにより得られた。
上述の方法で得られたEMG7由来のFlk+細胞からこれまでに報告された方法を用いて心筋細胞を作製した(WO2009/118928またはYan P, et al. Biochem Biophys Res Commun. 379:115-20, 2009)。簡潔には、1〜3μg/mLのCyclosporin-Aを添加した分化培地を用いて、mitomycin C処理をしたOP9細胞上で4日間培養した後、GFP陽性分画を分離することにより得られた。
上記のFlk+細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞ならびに心筋細胞を用いて、図1に示したMasumoto H, et al, Stem Cells. 301196-205, 2012に記載の方法により作製された。簡潔には、2.5×104から4.0×104のTFP-ROSA由来のFlk+細胞を12 wellの温度感受性培養皿(UpCell、セルーシード社)上に播種し、培養開始4日目に、5.0×105の上述の内皮細胞および壁細胞の混合細胞ならびに5.0×105の上述の心筋細胞を同培養皿へ播種し、VEGFを添加した分化培地を用いて37℃にて培養した。心筋細胞添加4日後(培養開始7日目)に室温に戻すことで培養皿より細胞をシート状に剥離させ、心臓細胞シートを得た。尚、2種の細胞混合後2日目に培地の交換を行った。
三つ口1L容フラスコにオリーブ油(和光純薬工業株式会社製) 600 mlを加え、プロペラで攪拌しながら、40 ℃の湯浴中で1時間加熱した。次に、40 ℃に加熱したゼラチン(牛骨由来、等電点5.0、重量平均分子量1.0×105、新田ゼラチン株式会社から供与)の10 wt%水溶液 20 mlをフラスコに加え、回転速度400 rpmで10分間攪拌することでW/Oエマルジョンを形成させた。このエマルジョンを0 ℃まで冷却し、回転速度400 rpmで1時間攪拌することで、ゼラチン水溶液をゲル化させた。続いて、冷却したアセトン200 mlを加え、回転速度200 rpmで15分間攪拌することで脱水処理を行った。その後、フラスコ内の溶液を50 mlファルコンチューブに回収し、4 ℃中、回転速度5000 rpmで5分間遠心分離した。上清を除去した後、冷却アセトンで洗浄し、ホモジナイザー(回転速度10000 rpm)で1分間攪拌した。続いて、4℃中、回転速度5000 rpmで5分間遠心分離した。再び上清を除去し、洗浄、遠心、この操作を3回繰り返した。冷却アセトンで洗浄しながら、ゼラチン粒子を篩(20, 32, および53 μmオープニング)により分画、粒径別に回収し、真空乾燥することにより乾燥粒子を得た。次に、未架橋ゼラチン粒子を真空オーブンで減圧下、140 ℃で48時間熱脱水処理することによって、ゼラチン粒子を化学架橋することで、ゼラチンハイドロゲル粒子を得た。乾燥状態の粒子径が20μm以下、20〜32μm、および32-53μmのものを用いた。
上述の方法において、全ての細胞量を半量にして、24wellプレートを用いて作製された心臓細胞シートをゼラチンコート培養皿に広げた状態で静置し、培地を吸引し培養皿とシートを固定した。この時、心臓細胞シートとしては直径約6mm程度であった。この上に0.1mg/μlの濃度でPBS溶液中へ分散させた乾燥状態の粒子径が20〜32μmのゼラチンハイドロゲル粒子を2.5μl(約885μg/cm2)(low dose)または7.5μl(約2654μg/cm2)(high dose)を滴下し、37℃にて30分インキュベートした。続いて、別の心臓細胞シートを分化培地と共に加え、ゼラチンハイドロゲル粒子処理した心臓細胞シートの上に重ね、培地を除去した。同様の操作を繰り返し、心臓細胞シート5枚を積層化させた(図2)。この時、2,3,4,5層目は少しずつ位置をずらして重ねた。最後に、ピペットマンを用いて培養皿底面を沿わせるように分化培地を流し、積層化された心臓細胞シートを培養皿からはがした。
vs. low dose群: 597.1 ± 24.0μm, n=10 vs. high dose群: 449.2 ± 25.6μm, n=5, p < 0.0001, HE染色陽性細胞領域面積; ctrl(対照群): 0.03511 ± 0.009244 mm 2 , n=5, low dose群: 0.4746 ± 0.04162 mm 2 , n=3 vs. high dose群: 0.1211 ± 0.007000 mm2, n=4, p=0.0090)。
上述した心臓細胞シートの積層化において、乾燥状態の粒子径が20μm以下、20〜32μm、および32〜53μmのゼラチンハイドロゲル粒子をそれぞれ用いて、心臓細胞シートを積層化させたところ、積層化シートの壁厚および生存細胞領域面積はctrl群(対照群)、20μm以下群、20〜32μm群、32〜53μm群の4群中で20〜32μm群において最も大きかった(図4AおよびB)。 (壁厚; ctrl: 204.7 ± 9.5μm, n=5 vs. 20μm以下群: 389.1 ± 7.6μm, n=3 vs. 20-32μm群: 597.1 ± 24.0μm, n=10 vs. 32-53μm群: 333.5 ± 5.7μm, n=3, p < 0.0001, HE染色陽性細胞領域面積; ctrl: 0.03446 ±0.005362 mm 2 , n=3 vs. 20μm以下群: 0.2051 ±0.004676 mm 2 , n=3 vs. 20-32μm群: 0.4746 ±0.04162 mm 2 , n=3 vs. 32-53μm群: 0.1487 ±0.003894 mm 2 , n=3, p < 0.0001)。
胸腺欠損ヌードラット(雄、10〜12週齢)から公知の手法(Masumoto H, et al., Stem
Cell 30: 1196-1205 (2012); Nishina T, et al., Circulation 104: I241-I245 (2001); Sakakibara Y., et al., Circulation 106: I193-I197 (2002))で作製した心筋梗塞モデルラットの心臓前壁表面に、Masumotoらの方法(上記)により、実施例1で作製された積層化心臓細胞シート(5層)を移植し、心エコー検査を、結紮前(ベースライン)、心筋梗塞後6日目(pre TX)、1週間後、2週間後、4週間後、8週間後、および12週間後に行い、左心室の拡張期径(LVDd)と収縮期径(LVDs)、ならびに、左心室の梗塞壁および非梗塞壁の拡張期壁厚(LVWTd)と収縮期壁厚 (LVWTs)を測定し、左心室(LV)短縮率(FS(%))の経時変化を以下の式から算出した。
FS(%)=(LVDd-LVDs)/LVDd
結果を、図5に示した。図から、ゼラチンハイドロゲル粒子を用いて積層化した心臓細胞シート群が無処置群だけでなくゼラチンハイドロゲル粒子を用いずに積層化した心臓細胞シート群よりも、統計的有意差をもって、心機能を改善させたことが分かる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (8)
- ハイドロゲル粒子を用いて積層された細胞シートの積層体であって、
前記ハイドロゲル粒子は、前記細胞シートと前記細胞シートの間に配置されている、
前記ハイドロゲル粒子の乾燥状態の粒子径が20〜53μmである、および、
前記ハイドロゲル粒子は、前記細胞シートと前記細胞シートの間に単位面積あたり500〜2000μg/cm2の量で含まれる、
前記積層体。 - 前記ハイドロゲル粒子はゼラチンハイドロゲル粒子である、請求項1に記載の積層体。
- 前記細胞シートが心筋細胞を含む、請求項1または2に記載の積層体。
- 前記ハイドロゲル粒子の乾燥状態の粒子径が20〜32μmである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の積層体。
- 前記細胞シートの総数が4枚〜20枚である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の積層体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の積層体を含む、医薬組成物。
- 心疾患治療用である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の積層体の製造方法であって、
(1)複数の細胞シートを用意する工程、
(2)前記細胞シートの上にハイドロゲル粒子を添加し、さらに別の前記細胞シートを積層する工程、
(3)工程(2)を繰り返す工程、および、
(4)所定枚数の前記細胞シートからなる積層体を得る工程、
を含み、
前記ハイドロゲル粒子の乾燥状態の粒子径が20〜53μmであり、および、前記ハイドロゲル粒子は、前記細胞シートと前記細胞シートの間に単位面積あたり500〜2000μg/cm2の量で添加されることを特徴とする前記方法。
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