KR20160005366A

KR20160005366A - 하이드로겔을 포함하는 적층화된 세포 시트

Info

Publication number: KR20160005366A
Application number: KR1020157035152A
Authority: KR
Inventors: 준 야마시타; 야스히코 타바타; 타케히코 마츠오
Original assignee: 아이하트 재팬 가부시키가이샤
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2016-01-14
Also published as: JPWO2014192909A1; WO2014192909A1; KR101870174B1; EP3006559A1; US10159766B2; JP5862915B2; CN105247041B; EP3006559B1; CN105247041A; EP3006559A4; US20160121025A1

Abstract

본 발명은 생존 세포를 포함하는 적층된 세포 시트 및 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 하이드로겔, 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔을 이용하여 세포 시트를 적층하는 공정을 포함하는 세포 시트의 적층 방법, 이러한 방법에 의해 제조된 적층화 세포 시트, 및 적층화 세포 시트를 포함하는 약학적 조성물 또는 치료제를 제공한다.

Description

하이드로겔을 포함하는 적층화된 세포 시트{LAYERED CELL SHEET INCORPORATING HYDROGEL}

본 발명은 하이드로겔, 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 통합하는 적층화된 세포 시트(layered cell sheet) 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

최근 질병 또는 손상 등에 의해 세포를 결손된 조직에 세포를 보충하는 의료으로 세포 시트를 이용한 세포 이식 치료가 검토되고 있다. 특히 성인의 심근 세포는 거의 증식하지 않기 때문에, 허혈성 심질환 등으로 결손된 심근 세포는 돌이킬 수 없는 손상이 되며, 심근 세포의 대체 요법(replacement therapy)이 검토되고 있다.

그래서 심근 세포에서 제작된 심근 세포 시트를 이용하는 것이 제안되지만, 이러한 심장 재생 치료의 성공은 심장 혈관 세포 분획의 충분한 생착이 필수적이다. 또한, 이러한 심근 세포로써 배아 줄기 세포(ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래의 심장 세포 분획(비특허문헌 1 및 2, 및 특허문헌 1)을 이용하는 방법이 검토되고 있다.

이러한 세포에서 제작한 3 층의 심장 조직 시트를 이식하여 심근 경색 후 쥐의 심장 기능 저하를 억제하는 것이 확인되었지만, 이것은 유도 심근 세포의 직접적인 효과보다도, 세포에서 방출된 사이토카인 등에 의한 혈관 신생을 비롯한 간접 파라 클라인 효과(paracrine effect)에 의한 좌심실 리모델링의 억제에 의한 것이었다(비특허문헌 3).

따라서 심근 세포 시트를 심근에 생착시키기 위해 더 많은 심근 세포를 투여할 필요가 있으며, 이를 위해서는 더 두껍게 다량의 심근 세포를 포함한 시트가 요구되고 있다. 그러나 혈관이 없는 심근 세포 시트를 4 층 이상 적층화 하여도 산소와 영양이 미치지않는 세포가 사멸하는 데에는 결과적으로 생착하는 세포 수에 변화가 없는 것으로 확인되고 있으며, 세포 대체 요법에서 유효한 심근 세포 시트를 제작하기 위해서는 더욱 기술 개발이 필요하다고 생각된다.

젤라틴 하이드로겔은 세포 배양 기판과 발판 재료로 사용될 수 있는 생분해 가능한 생체 재료이며, 예를 들어 배양 세포 응집체에 상기 겔 입자를 함유시킬 때 산소 공급 등이 좋아져 세포 상태가 개선된다는 보고가 있다(비특허문헌 4 및 특허문헌 2).

또한 이식용 세포 시트의 제작을 위해 젤라틴 하이드로겔을 사용하는 방법으로, 세포 시트를 세포 배양기 재료에서 박리시키기 쉽도록 하기 위해 시트에 젤라틴 하이드로겔을 부착시키는 방법이 알려져 있다 (특허문헌 3, 4 및 5).

[특허문헌 1] WO2009/118928 [특허문헌 2] WO2011/059112 [특허문헌 3] 특개2011-224398 [특허문헌 4] 특개2013-198437 [특허문헌 5] 특개2014-75979

[비특허문헌 1] Yamashita J, et al, Nature. 408:92-6, 2000 [비특허문헌 2] Yamashita JK, et al, FASEB J. 19:1534-6, 2005 [비특허문헌 3] Masumoto H, et al, Stem Cells. 30:1196-205, 2012 [비특허문헌 4] Hayashi K, Tabata Y. Acta Biomater. 7:2797-803, 2011

본 발명의 목적은 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 통합하는 적층화 세포 시트(layered cell sheet), 또는 이 시트를 포함하는 약학적 조성물 및 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 이용한 세포 시트를 적층하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 과제는 세포 시트를 적층함으로써 세포 시트의 생존 세포 수와 그에 따른 세포 기능의 감소를 방지하기 위한 것이다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 특정 유형의 하이드로겔 재료, 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 재료, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 이용하여 세포 시트를 적층화 시킴으로써, 시트 내 생존 세포 수가 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 또한 이 방법으로 시트를 5 개 이상 사용하는 경우에도 세포가 생존, 그 기능을 개선하는 것을 확인했다.

이상의 결과로부터 본 발명자들은, 젤라틴 하이드로겔 입자를 이용한 세포 시트를 적층시키는 것에 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 다음과 같은 특징을 포함한다.

[1] 하이드로겔을 이용하여 세포 시트를 적층화(layering)하는 것을 포함하는, 세포 시트의 적층 방법.

[2] [1]에 있어서, 상기 하이드로겔은 세포 생존에 필요한 물질의 확산 이동을 가능하게 하는 재료 또는 형태로 이루어진 방법.

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 하이드로겔은 젤라틴 하이드로겔인 방법.

[4] [1] 내지 [3]에 있어서, 상기 하이드로겔은 하이드로겔 입자인 방법.

[5] [4]에 있어서, 상기 하이드로겔 젤 입자는 젤라틴 하이드로겔 입자인 방법.

[6] [5]에 있어서, 상기 젤라틴 하이드로겔 입자는 젤라틴 분자 간의 가교를 형성시켜 얻어지는 젤라틴 하이드로겔 입자인 방법.

[7] [5] 또는 [6]에 있어서, 상기 젤라틴 하이드로겔 입자는 건조 상태에서 입자 크기가 20 ㎛ 내지 32 ㎛의 입자로 이루어진 방법.

[8] [1] 내지 [7]에 있어서, 상기 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 제 1의 세포 시트 또는 적층 세포 시트와 제 2의 세포 시트 또는 적층 세포 시트 사이에 첨가하는 공정을 포함하는 방법.

[9] [8]에 있어서, 상기 적층 세포 시트는 2 또는 3 개의 세포 시트로 이루어진 방법.

[10] [8] 또는 [9]에 있어서, 상기 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 세포 시트의 단위 면적당 500 ㎍/㎠ 내지 2000 ㎍/㎠의 양으로 첨가하는 단계를 포함하는 방법.

[11] [1] 내지 [10]의 어느 하나에 기재된 방법으로 적층된 적층화 세포 시트.

[12] [11]에 있어서, 세포 시트를 4 장 이상 적층한 적층화 세포 시트.

[13] [11] 또는 [12]에 기재된 적층화 세포 시트를 포함하는 약학적 조성물.

[14] [1] 내지 [10]의 어느 하나에 있어서, 상기 세포 시트는 심근 세포 시트인 방법.

[15] [1] 내지 [10]의 어느 하나에 있어서, 상기 세포 시트는 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포를 포함하는 심장 세포 시트인 방법.

[16] [14] 또는 [15]에 있어서, 상기 심근 세포는 만능 줄기 세포에서 생산된 세포인 방법.

[17] [15] 또는 [16]에 있어서, 상기 내피 세포는 만능 줄기 세포에서 생산된 세포인 방법.

[18] [15] 내지 [17]의 어느 하나에 있어서, 상기 벽 세포는 만능 줄기 세포에서 생산된 세포인 방법.

[19] [14] 내지 [18]의 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포)인 방법.

[20] [14] 내지 [19]의 어느 하나에 기재된 방법으로 적층된 적층화 세포 시트.

[21] [20]에 있어서, 세포 시트를 4 장 이상 적층한 적층화 세포 시트.

[22] [11], [12], [20] 및 [21] 중 어느 하나의 적층화 세포 시트를 포함하는 심장 질환 치료제.

본 발명의 방법에 의해, 세포가 생존한 상태에서 세포 시트를 적층화(layering) 하는 것이 가능하다. 또한 얻어진 세포 시트를 이용하여 세포 대체 요법에 응용이 가능해진다.

[도 1] 도 1은 심장 세포 시트 형성을 위한 프로토콜을 나타낸다. 그림에서 EC는 내피 세포(endothelial cell), VEGF는 혈관 내피 세포 증식 인자(vascular endothelial growth factor), cAMP는 환 상의 아데노신 일 인산(cyclic AMP), MC는 벽 세포(mural cell), CM은 심근 세포(cardiomyocyte), CsA는 싸이크로스포린 A(cyclosporine A) 및 MC는 배지 교환(medium change)을 각각 의미한다.
[도 2] 도 2는 본 발명의 방법에 의한 젤라틴 하이드로겔 입자를 이용한 세포 시트 적층 공정을 나타내었다. 도 2a는 시트를 젤라틴 코팅 배양 접시에 펼친 상태에서 방치시킨 공정을 도시하고, 도 2b는 배지를 흡인한 배양 접시와 시트를 고정하는 공정을 나타낸다. 도 2c는 세포 시트에 젤라틴 하이드로겔 입자를 적하하는 공정을 나타낸다. 도 2d는 37℃에서 30 분 배양하는 공정을 나타낸다. 도 2e는 젤라틴 하이드로겔 처리 후에 별도의 세포 시트를 적층하는 공정을 나타낸다. 도 2f는 5 층의 적층을 반복한 후 세포 시트의 일러스트를 나타낸다.
[도 3] 도 3은 본 발명의 적층 시트(5 층)의 조직 표본 사진 및 정량화한 결과를 나타낸다. 도 3A는 젤라틴 하이드로겔을 이용하지 않고 적층화 시킨 대상군(Control), 젤라틴 하이드로겔 입자 250 ㎍(건조 상태의 입자 직경 20 ~ 32 ㎛)을 각층에 적하한 군(Low dose), 젤라틴 하이드로겔 입자 750 ㎍(건조 상태의 입자 직경 20 ~ 32 ㎛)을 적하한 군(High dose 군)의 헤마톡실린 에오진(HE) 염색 상을 나타낸다. 그림 중 흑색 화살표는 젤라틴 하이드로겔 입자를 나타낸다. 도 3B에서, 왼쪽 그림은 세포 시트의 벽 두께의 각 군 간의 비교를 나타내고, 오른쪽 그림은 HE 염색 양성 세포 영역 면적의 각 군 간의 비교를 나타낸다.
[도 4] 도 4는 본 발명의 적층 시트(5 층)의 조직 표본 사진 및 정량화한 결과를 나타낸다. 도 4A는 젤라틴 하이드로겔을 이용하지 않고 적층화시킨 대상군(Control), 건조 상태의 입자 직경 20 ㎛ 이하를 적하한 군, 건조 상태의 입자 직경 20 ~ 32 ㎛을 적하한 군, 건조 상태의 입자 지름 32 ~ 53 ㎛을 적하한 군의 헤마톡실린 에오진(HE) 염색 상을 나타낸다. 도 4B의 왼쪽 그림은 세포 시트 벽 두께의 각 군 간의 비교를 나타내고, 오른쪽 그림은 HE 염색 양성 세포 영역 면적의 각 군 간의 비교를 나타낸다.
[도 5] 도 5는 흉선 결손 누드 쥐(수컷, 10 ~ 12 주령)에서 공지의 방법으로 제작한 심근 경색 모델 쥐의 심장 전 벽 표면에 본 발명의 적층 시트(5 층)를 이식했을 때 좌심실(LV) 단축율(%)의 경시 변화를 나타낸 그래프이다. 그림에서 (1)은 가짜 수술 무 처치군(sham-operated non-treatment group)을 나타내고, (2)는 젤라틴 하이드로겔을 사용하지 않는 적층 시트(5 층)을 나타내고, (3)은 본 발명의 적층화 시트(5 층)을 나타낸다.

1. 하이드로겔( Hydrogel )

본 명세서에서 사용되는 "하이드로겔"은 물을 대량으로 포함할 수 있는 물질이며, 산소, 물, 수용성 영양물, 효소 및 사이토카인 등의 폴리펩티드 등의 세포 생존에 필요한 물질, 노폐물 등을 쉽게 전염 이동시킬 수 있는 재료 또는 형태이며, 일반적으로 생체 적합성인 것을 의미한다. 하이드로겔의 형상이나 형태로는 세포 시트에 통합할 수 있다면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 미립자, 과립 형태, 필름 형태, 튜브형, 디스크상, 망상, 메쉬 형상, 다공질 모양, 현탁 상태 혹은 분산형 등 다양한 모양 또는 형태의 것이 사용될 수 있다. 그 중에서도 콜로이드 입자를 함유하는 수용액을 고상화한 결과가 되는 하이드로겔 입자가 바람직하다. 위의 하이드로겔의 성질을 가진 것이면 어느 재료로 이루어지는 입자도 이용할 수 있다. 예를 들어, 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리히드록시에틸 메타아크릴레이트(polyhydroxyethyl methacrylate), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리유산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid) 등의 수용성, 친수성, 또는 물 흡수성 합성 고분자; 및 다당류, 단백질, 및 핵산 등을 화학 가교한 하이드로겔로 이루어진 입자이다. 다당류로는 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이친 황산(chondroitin sulfate) 등의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 전분, 글리코겐, 아가, 펙틴, 섬유소 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 단백질로 콜라겐 및 그 가수 분해물인 젤라틴, 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin), 엔탁틴(entactin), 테나신(tenascin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor), 오스테오폰틴(osteopontin), 피브리노겐(fibrinogen) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 생체 적합성이면서 생체 내에서 세포에 의해 분해되는 재료로 이루어지는 입자가 본 발명에 적합하며, 더욱 바람직하게는 젤라틴으로 이루어진 입자이다. 따라서, 본 발명에서 바람직한 하이드로겔 입자는 젤라틴 하이드로겔 입자이다.

본 발명에서 세포의 배양 조건이나 증식성을 높이기 위해 상기의 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자의 표면에 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸 등 세포 접착성 단백질 및 그 활성 펩타이드 또는 생물학적 기능을 가진 설탕, 올리고당, 다당류 등을 코팅 또는 고정화한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 젤라틴 하이드로겔 입자는 젤라틴 분자 사이에 화학 반응, 열 탈수 처리, 방사선, 자외선 또는 전자선 조사 등을 부여하여 젤라틴 분자 사이에 가교를 형성시켜 얻어진 미립자 상의 젤라틴 하이드로겔이다. 화학적 가교제는 EDC 등의 수용성 카르보디이미드(carbodiimide), 프로필렌 옥사이드(propylene oxide), 디에폭시 화합물(diepoxy compound), 수산기, 카르복실기, 아미노기, 티올기, 이미다졸기 등 사이에 화학 결합을 만드는 축합제(condensing agent)를 사용할 수 있다.

본 발명의 젤라틴은 산 또는 알칼리, 또는 효소 처리 등에 의해 콜라겐 펩타이드 사슬 사이의 염류 결합과 수소 결합이 분열하여 비가역적으로 수용성 단백질에 변화한 변성 콜라겐을 의미하고 콜라겐은 동물과 식물에서 채취하여도 좋고, 혹은 유전자 재조합 콜라겐을 이용해도 좋다. 본 발명에서 사용되는 젤라틴은 산성 젤라틴 및 염기성 젤라틴 중 하나가 될 수 있다. 본 명세서에서 "산성젤라틴"은 콜라겐을 알칼리 처리하여 제조한 등전점이 7.0 미만 2.0 이상 젤라틴, 바람직하게는 약 6.5 이하 약 4.0 이상, 더욱 바람직하게는 약 5.5 이하 4.5 이상의 것을 의미한다. 또한 "염기성젤라틴"은 콜라겐을 산 처리하여 제조한, 등전점이 약 7.0 이상의 약 13.0 이하의 젤라틴, 바람직하게는 약 7.5 이상 약 10.0 이하, 보다 바람직하게는 약 8.5 이상 약 9.5 이하의 것을 의미한다. 예를 들어, "산성젤라틴"으로는 닛타 젤라틴 사의 시료 등전점 (IEP) 약 5.0 등을 사용할 수 있으며, 염기성 젤라틴으로는 같은 닛타 젤라틴 사의 시료 IEP 9.0 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 등전점 약 5.0 "산성 젤라틴"이다.

젤라틴의 가교도는, 원하는 함수율, 즉 하이드로겔의 생체 흡수성의 수준에 따라 적절하게 선택할 수있다. 젤라틴 하이드로겔을 제조할 때 젤라틴과 가교제의 농도의 바람직한 범위는, 젤라틴 농도 약 1 ~ 약 20 w/w%, 가교제 농도 약 0.01 ~ 약 1w/w%이다. 가교 반응 조건은 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 약 0 ~ 160℃, 약 1 내지 약 48 시간으로 할 수 있다. 일반적으로, 젤라틴 및 가교제의 농도 가교 시간이 증가함과 동시에 하이드로겔의 가교도가 증가하고, 젤라틴 하이드로겔의 생체 흡수성은 낮아진다. 또는 감압 하에서, 고온에서 열탈수가교할 수 있다. 열탈수가교는 예를 들어, 0.1Torr 정도의 감압 하에서 약 80 ~ 160℃, 바람직하게는 약 120 ~ 140℃에서 약 1 내지 약 48 시간으로 할 수 있다. 하이드로겔 입자의 팽윤 정도는 가교 정도에서 변화하고 적층화 세포 시트(layered cell sheet)에 사용하는 경우, 하이드로겔의 가교 정도는 특별히 한정될 필요 없이 실시 가능하다. 가교 정도는 예를 들면, 함수율(물 팽윤 상태의 하이드로겔 무게/건조 상태의 하이드로겔 무게 × 100)로 나타낼 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 하이드로겔 입자의 수분 함량은 특별히 한정되지 않지만 약 85 ~ 99 %이다.

젤라틴 하이드로겔 입자는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법으로 3 구 둥근 바닥 플라스크에 고정된 교반용 모터(예를 들어, 신동 과학사 제, 쓰리원모터, EYELA miniD.C. 교반기 등)와 테프론(등록 상표) 용 프로펠러를 장착하고 플라스크와 함께 고정 장치에 젤라틴 용액을 넣고 여기에 올리브 오일 등 기름을 더해 약 200 ~ 약 600 rpm 정도의 속도로 교반하여 W/O 형 에멀젼으로 하고, 여기에 가교제 수용액을 첨가하여 젤라틴 분자 사이에 가교를 형성함으로써 제조할 수 있다. 또는, 상기 W/O 형 에멀젼을 냉각 후, 아세톤, 에틸 아세테이트 등을 가하여 교반하고 원심 분리하여 미 가교 젤라틴 입자를 회수한다. 회수한 젤라틴 입자를 또한 아세톤, 에틸 아세테이트 등, 이어서 2-프로판올, 에탄올 등으로 세정 후 건조시킨다. 이 단계에서 목적에 따라 적절하게 필요한 크기의 입자를 선별할 수 있다. 이 건조 젤라틴 입자를 가교함으로써 제조할 수 있다. 이 외에도, 젤라틴 수용액을 미리 올리브 오일에 미리 유화(예를 들어, 볼텍스 믹서 Advantec TME-21, 균질기, polytron PT10-35 등을 이용하여)해 놓은 것을 올리브유에 적하하여, 미립자화한 W/O 형 에멀젼을 조제하고, 이에 가교제 수용액을 첨가하여 가교 반응 시켜도 좋다. 이렇게 해서 얻어지는 젤라틴 하이드로겔 입자를 원심 분리하여 회수한 후, 아세톤, 에틸 아세테이트 등으로 세정하고, 2-프로판올, 에탄올 등에 침지하여 가교 반응을 정지시킨다. 얻은 젤라틴 하이드로겔 입자는 2-프로판올, Tween80을 포함하는 증류수, 증류수 등으로 순차적으로 세척한 후 세포 배양에 사용한다. 젤라틴 하이드로겔 입자가 응집하는 경우, 예를 들어, 계면 활성제 등의 첨가 또는 초음파 처리(냉각 하에서 1 분 정도가 바람직하다) 등을 실시하여도 좋다.

얻어지는 젤라틴 하이드로겔 입자의 평균 입경은 상기 입자 제조시 젤라틴 농도, 젤라틴 수용액과 올리브 기름의 부피비 및 교반 속도 등에 따라 변화한다. 일반적으로 입경은 약 500 nm ~ 약 1000 ㎛이며, 목적에 따라 적절하게 필요한 크기의 입자를 선별하여 사용하면 된다. 또한, 본 명세서에서 "입자"를 "입자 크기"라고 기재하는 경우가 있다. "입자", "입자 크기" 및 "입자 경"은 상호 호환적으로 사용된다. 또한, 미리 유화하는 것에 있어서, 입자 크기가 약 50 nm 내지 약 20 ㎛ 이하의 미세 입자의 젤라틴 하이드로겔 입자를 얻을 수 있다. 또한 젤라틴 수용액 상태에서 상분리(phase separation)를 일으켜 자기 조립시켜 약 50 nm 내지 약 1 ㎛ 크기의 입자를 얻을 수 있다. 상분리는 제 2 성분의 첨가 수용액의 pH, 이온 강도 등의 변화 등 공지의 기술에 의해 달성된다.

본 발명에서 선별에 의해 얻어지는 바람직한 입자 크기는 약 50 nm 내지 약 1000 ㎛이며, 약 500 nm ~ 약 1000 ㎛이며, 보다 바람직하게는 약 1 ㎛ ~ 약 200 ㎛이며, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 50 ㎛ 이며, 20 ~ 32 ㎛이다. 여기서, 입자 크기는 용매에서 팽윤할 수 있기 때문에 건조 상태에서의 입자 크기로 표시되는 것이 바람직하다.

이 외에도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, WO 2011/059112에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 젤라틴 하이드로겔 입자 이외의 하이드로겔 입자에 대해서도 유사한 방법 또는 공지의 방법으로 하이드로겔에서 제작될 수 있다. 또한 다양한 입자 크기의 하이드로겔 입자를 이용하여 적층화 세포 시트를 제작한 후, 아래의 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법으로 적층화 세포 시트의 생존 세포 영역의 면적과 벽 두께를 측정하는 것에 있어서 최적 범위의 입경을 결정할 수 있다.

2. 세포 시트를 제작하는 데 사용되는 세포

세포 시트를 제작하기 위해 세포는 한정되지 않지만, 인간을 포함한 포유 동물의 세포이며, 예를 들면 체세포, 그의 전구 세포 또는 그 혼합 세포이다.

본 발명에서 세포 시트는 세포 간 결합에 의해 세포끼리 연결된 시트 모양의 세포 집합체이다. 세포의 종류는 특별히 상관 없지만, 세포는 인간을 포함한 포유 동물의 세포이며, 예를 들면 체세포, 그의 전구 세포 또는 그 혼합 세포이다. 구체적으로는, 세포로서 비 한정으로 심근 세포, 내피 세포 (예를 들어, 혈관 내피 세포 및 림프 내피 세포 등), 벽 세포 (예를 들어, 원주 상피 세포 등), 근육 세포 (예를 들어, 골격근 세포 및 평활근 세포 등), 상피 세포 (예를 들어, 표피 세포, 피부 세포, 소화관 상피 세포 호흡·기도 상피 세포 식도 상피 세포, 신우 상피 세포, 요관 상피 세포, 방광 상피 세포 요도 상피 세포 및 전립선 도관 상피 세포 등), 연골 세포, 치근막 세포, 신경 세포 (예를 들어, 신경 세포 및 교세포 등), 털 유두 세포, 뼈 세포, 이들의 전구 세포 및 이들의 혼합 세포 등을 들 수 있다. 이러한 세포는 어떤 방식으로 단리된 조직에 함유하는 세포일 수 있고, 또는 조직에서 수립된 세포주일 수 있다. 이 외에도 만능 줄기 세포에서 어떤 방식으로 유도된 세포 일 수 있다. 이때 사용 유도 방법은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 특표 2003-523766에 기재되어있는 것처럼 배아체를 형성시키는 방법을 들 수 있다.

또한, 이러한 세포의 혼합물로 이루어진 세포 시트, 또는 다른 종류의 세포 시트를 적층하는 것도 가능하다.

다음은, 심장 세포 시트를 제작하는 데 사용되는 세포에 대해 설명한다.

2.1. 유도 만능 줄기 세포로부터 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포를 제조하는 방법

본 명세서에서 "심근 세포"는 적어도 심장 트로포닌 (cTnT) 또는 αMHC를 발현하는 세포를 의미한다. cTnT는 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_000364가 예시되며, 마우스의 경우 NM_001130174이 예시된다. αMHC은 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_002471가 예시되며, 마우스의 경우 NM_001164171이 예시된다.

본 명세서에서 「내피 세포」는 PE-CAM, VE-cadherin 및 폰-윌 브란트 인자(vWF) 중 하나를 발현하는 세포를 의미한다. 또한 벽 세포는 Smooth muscle actin(SMA)을 발현하는 세포를 의미한다. 여기에서 PE-CAM은 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_000442이 예시되어 마우스의 경우 NM_001032378이 예시된다. VE-cadherin은 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_001795이 예시되며, 마우스의 경우 NM_009868이 예시된다. vWF는 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_000552가 예시되며, 마우스의 경우 NM_011708이 예시된다. SMA는 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_001141945가 예시되며 마우스의 경우 NM_007392이 예시된다.

본 발명에서 사용 가능한 만능 줄기 세포는 생체에 존재하는 모든 세포로 분화 가능한 다능성을 가지며 또한 증식 능력도 겸비한 줄기 세포이며, 특히 한정되지 않지만 예를 들어 배아 줄기(ES) 세포, 핵 이식에 의해 얻어지는 복제 배아 유래 배아 줄기(ntES) 세포, 정자 줄기 세포(「GS 세포」), 배아 생식 세포(「EG 세포」), 유도 만능성 줄기(iPS) 세포, 배양 섬유 아세포와 골수 줄기 세포 유래 다능성 세포(Muse 세포) 등이 포함된다. 바람직한 만능 줄기 세포는 제조 공정에서 배아, 난자 등의 파괴를 하지 않고 사용할 수 있다는 관점에서 유도 만능 줄기 세포(「iPS 세포」)이다.

iPS 세포는 모든 체세포에 초기화 인자를 도입함으로써 제조될 수 있다. 여기서 초기화 인자는 예를 들어, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 또는 Glis1 등의 유전자 또는 유전자 산물이 예시되고, 이러한 초기화 인자는 단독으로 이용해도 좋고, 함께 사용하여도 좋다. 초기화 인자의 조합으로는 WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO 2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26 : 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell StemCell 2 : 525-528, Eminli S, et al. (2008) Stem Cells 26 : 2467- 2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26 : 1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3 : 475-479, Marson A (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11 : 197-203, RL Judson et al. (2009), Nat. Biotech., 27 : 459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci US A. 106 : 8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461 : 649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell 5 : 491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell 6 : 167-74, Han J, et al. (2010) Nature 463 : 1096-100, Mali P, et al. (2010) Stem Cells 28 : 713-720, Maekawa M, et al. (2011) Nature. 474 : 225-9.에 기재된 조합이 예시된다.

체세포에는 비한정적으로 태아(새끼)의 체세포 신생아(새끼)의 체세포 및 성숙한 건전한 혹은 질환성 체세포 모두 포함되고, 또한 일차 배양 세포, 계대 세포 및 주화 세포 모두 포함된다. 구체적으로는 체세포, 예를 들면 (1) 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 펄프 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포 (체세포 줄기 세포), (2) 조직 전구 세포, (3) 림프구, 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 섬유 아세포 (피부 세포 등), 머리 세포, 간세포, 위 점막 세포, 장 세포, 비장 세포, 췌장 세포 (췌장 분비 세포 등), 뇌 세포, 폐 세포, 신장 세포 및 지방 세포 등의 분화된 세포 등이 예시된다.

또한 iPS 세포를 이식용 세포의 재료로서 사용하는 경우, 거부 반응이 일어나지 않는다는 관점에서 이식 대상 개체의 HLA 유전자형이 동일하거나 실질적으로 동일한 체세포를 이용하는 것이 바람직하다. 여기에서 「실질적으로 동일한」은 이식된 세포에 면역 억제제에 의해 면역 반응을 억제할 정도로 HLA 유전자형이 일치하는 것이며, 예를 들어, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3 유전자 좌 또는 HLA-C를 더한 4 유전자 좌가 일치하는 HLA 형을 가진 체세포이다.

다음 공정 (a)와 (b)는 유도 만능 줄기 세포(「iPS 세포」)에서 심근 세포, 내피 세포와 벽 세포를 동시에 제조할 수 있다.

(a) 유도 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 제조하는 공정

(b) 공정 (a)에서 얻어진 심근 세포를 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)의 존재 하에서 배양하는 공정

또한 구체적인 설명을 하지 않지만, 유도 만능 줄기 세포로 바꾸어 배아 줄기 세포(「ES 세포」) 등의 줄기 세포도 마찬가지로 심근 세포, 내피 세포와 벽 세포를 제조할 수 있다.

유도 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 제조하는 방법으로서, 예를 들면 Laflamme MA들에 의해 보고된 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 제조할 수 있다(Laflamme MA & Murry CE, Nature 2011, Review). 이 외에도 특히 특정되지 않지만, 예를 들어, 유도 만능 줄기 세포를 부유 배양하여 세포 덩어리(배아 모양)를 형성시켜 심근 세포를 제조하는 방법, BMP 신호 전달을 억제하는 물질의 존재 하에서 심근 세포를 제조하는 방법(WO2005/033298), Activin A와 BMP를 순서대로 첨가시켜 심근 세포를 제조하는 방법(WO2007/002136), 또한 Canonical Wnt 신호의 활성화를 촉진하는 물질의 존재 하에서 심근 세포를 생산 방법(WO2007/126077) 및 유도 만능 줄기 세포에서 Flk/KDR 양성 세포를 단리하여, 사이클로스포린 A의 존재 하에서 심근 세포를 제조하는 방법(WO2009/118928)을 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 세포 시트의 안전성을 고려하여, 상기의 공정에 의해 제작된 심근 세포, 내피 세포와 벽 세포를 포함하는 혼합 세포에서 미분화된 세포를 제거하는 공정을 더 포함할 수 있다.

2.2. 유도 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 포함하는 혼합 세포를 제조하는 방법

심근 세포를 생산하기 위한 다른 바람직한 방법은 하기에서 설명한다.

즉, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다.

(i) 유도 만능 줄기 세포를 Activin A를 포함하는 배지에서 배양하는 공정

(ii) 단계 (i)의 이후, BMP4 및 bFGF를 포함하는 배지에서 더 배양하는 공정

본 공정에서 유도 만능 줄기 세포를 공지의 방법으로 제작하여 분리하고 부유 배양, 코팅 처리된 배양 접시를 이용하는 접착 배양 등의 방법, 바람직하게는 접착 배양하여 배양한다.

분리 방법으로는 역학적, 프로테아제 활성과 콜라게나제 활성을 갖는 분리 용액(예를 들어, Accutase(TM) 및 Accumax(TM)을 들 수 있다) 또는 콜라게나제 활성만을 갖는 분리액을 사용해도 좋다. 바람직하게는 콜라게나제 활성만을 갖는 분리액을 이용하여 분리되어 역학적으로 세세하게 분리하는 방법이다. 여기에서 사용하는 유도 만능 줄기 세포는 사용한 접시에 80% 찰 때까지 배양된 콜로니를 이용하는 것이 바람직하다.

여기에서 부유 배양은 세포를 배양 접시에 비 접착 상태로 배양하는 것이며, 특히 제한되지 않지만, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예를 들면, 세포 외 기질 등으로 코팅 처리)되어 있지 않은 것, 또는 인위적으로 접착제를 억제 처리(예를 들면, 폴리 히드록시에틸메타크릴레이트(poly-HEMA)에 의한 코팅 처리)한 것을 사용하여 수행할 수 있다.

또한 접착 배양에서는 코팅 처리된 배양 접시에서 어떤 배지에서 배양한다. 코팅제로서, 예를 들어 마트리젤(BD), 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 또는 엔탁틴 및 이들의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는 마트리젤(Matrigel)이다. 보다 바람직하게는 마트리젤로 코팅 처리된 배양 접시에 유도 만능 줄기 세포를 접착시켜 마트리젤을 더 첨가하는 것으로, 유도 만능 줄기 세포 전체를 마트리젤로 코팅한 마트리젤 샌드위치 법에 의한 접착 배양이다.

본 공정에서의 배지는 동물 세포 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 제조할 수 있다. 기초 배지로는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Doulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 바람직하게는 RPMI 1640 배지이다. 배지는 혈청이 함유되어 있어도 좋고, 또는 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, Knockout Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양시 FBS의 혈청 대체물), N2 보충(Invitrogen), B27 보충제(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토 에탄올, 3'-티올 글리세롤 등 하나 이상의 혈청 대체물을 포함할 수 있고, 지질, 아미노산, L-글루타민, Glutamax(Invitrogen), 비필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 항생물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 바람직한 성장 인자로는 Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt7a, TGF-β, Activin A, Nodal, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, GDF, bFGF와 VEGF를 들 수 있다. 적어도 본 공정에서는 Activin A(예를 들어, (재조합) 인간 Activin A)을 증식 인자로 사용하는 것이 바람직하다.

선호하는 배지로서 L-글루타민, B27 보충제 및 Activin A를 함유하는 RPMI 배지가 예시된다.

배지에 첨가되는 Activin A의 농도는 예를 들어, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL, 110 ng/mL, 120 ng/mL, 130 ng/mL, 140 ng/mL, 150 ng/mL, 175 ng/mL 또는 200 ng/mL이지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 배지에 첨가되는 Activin A의 농도는 100 ng/mL이다.

배양 온도는 다음에 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO₂ 함유 공기 분위기 하에서 배양하여 CO₂ 농도는 바람직하게는 약 2 ~ 5% 이다. 배양시간은 예를 들어 1일부터 5 일간 배양이며, 바람직하게는 1일이다.

본 공정에서는 이전 공정이 부유 배양에서 일어난 경우, 얻어진 세포 집단을 그대로 코팅 처리된 배양 접시에서 임의의 배지에서 배양할 수 있다. 코팅제로서, 예를 들어 마트리젤(BD), 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 또는 엔탁틴 및 이들의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는 마트리젤이다. 또는 이전 공정이 접착 배양으로 행해진 경우 배지 교환을 통해 배양을 계속할 수 있다.

본 공정에서 사용되는 배지는 동물 세포 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 제조 할 수있다. 기초 배지로는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Doulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 바람직하게는 RPMI 1640 배지이다. 배지는 혈청이 포함되지 않은 것이 바람직하다. 필요한 경우, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨, ITS-X(Invitrogen)(인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨 함유), Knockout Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양시 FBS의 혈청 대체 물건), N2 보충(Invitrogen), B27 보충제(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2- 머캅토 에탄올, 3'-티올 글리세롤 등 하나 이상의 혈청 대체물을 포함할 수 있고, 지질, 아미노산, L- 글루타민, Glutamax, 비필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 성장 인자는 Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt7a, TGF-β, Activin A, Nodal, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, GDF, bFGF와 VEGF를 들 수 있다. 적어도 본 공정에서는 BMP4(예를 들어, (재조합) 인간 BMP4) 및 bFGF(예를 들어, (재조합) 인간 bFGF)를 증식 인자로 사용하는 것이 바람직하다.

본 공정에서 바람직한 배지로서 L-글루타민, B27 보충제, BMP4 및 bFGF를 함유하는 RPMI 배지가 예시된다.

배지에 첨가되는 BMP4의 농도는 예를 들어, 0.1 ng/mL, 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 2.5 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL , 10 ng/mL, 11 ng/mL, 12 ng/mL, 13 ng/mL, 14 ng/mL, 15 ng/mL, 17.5 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL 또는 50 ng/mL이지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는 배지에 첨가되는 BMP4의 농도는 10 ng/mL이다.

배지에 첨가되는 bFGF의 농도는 예를 들어, 0.1 ng/mL, 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 2.5 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL , 10 ng/mL, 11 ng/mL, 12 ng/mL, 13 ng/mL, 14 ng/mL, 15 ng/mL, 17.5 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL 또는 50 ng/mL이지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는 배지에 첨가되는 bFGF의 농도는 10 ng/mL이다.

배양 온도는 다음에 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO₂ 함유 공기 분위기 하에서 배양하여, CO₂ 농도는 바람직하게는 약 2 ~ 5%이다. 잠복기는 예를 들어 1일부터 10 일간의 배양, 바람직하게는 4일이다.

<VEGF의 존재 하에서 심근 세포를 배양하는 방법>

본 공정에서는 전술한 방법으로 얻어진 심근 세포를 VEGF의 존재 하에서 더 배양하여 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포가 원하는 구성 비율로 이루어진 혼합 세포를 제조할 수 있다.

예를 들어, 얻어진 심근 세포는 이전 공정이 부유 배양 후 세포 집단의 경우, 코팅 처리된 배양 접시에서 임의의 배지에서 배양할 수 있다. 코팅제로서, 예를 들어 마트리젤(BD), 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 또는 엔탁틴 및 이들의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는 마트리젤이다. 또는 본 공정에서는 전술한 공정에서 접착제 배양하여 얻은 세포를 배지 교환하여 배양을 계속할 수 있다.

본 공정에서 사용되는 배지는 동물 세포 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 제조할 수 있다. 기초 배지로는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Doulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 바람직하게는 RPMI 1640 배지이다. 배지는 혈청이 포함되지 않은 것이 바람직하다. 필요한 경우, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨, ITS-X (Invitrogen)(인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨 함유), Knockout Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양시 FBS의 혈청 대체 물건), N2 보충(Invitrogen), B27 보충제(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토 에탄올, 3'-티올 글리세롤 등 하나 이상의 혈청 대체물을 포함할 수 있고, 지질, 아미노산, L-글루타민, Glutamax, 비필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자 화합물, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 바람직한 성장 인자로는 Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt7a, TGF-β, Activin A, Nodal, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, GDF, bFGF 및 VEGF를 들 수 있다. 적어도 본 공정에서는 VEGF를 증식 인자로 사용하는 것이 바람직하다.

선호하는 배지로서 L-글루타민, B27 보충제 및 VEGF를 함유하는 RPMI 1640 배지가 예시된다.

배지에 첨가되는 VEGF의 농도는 예를 들어, 10 ng/mL ~ 500 ng/mL, 25 ng/mL ~ 300 ng/mL, 40 ng/mL ~ 200 ng/mL, 50 ng/mL ~ 100 ng/mL, 60 ng/mL ~ 90 ng/mL 또는 65 ng/mL ~ 85 ng/mL의 범위일 수 있다. 바람직하게는 배지에 첨가되는 VEGF의 농도는 50 ng/mL ~ 100 ng/mL이다. 또한 배지에 첨가되는 VEGF의 농도는 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 55 ng/mL, 60 ng/mL, 65 ng/mL, 70 ng/mL, 75 ng/mL, 80 ng/mL, 85 ng/mL, 90 ng/mL, 95 ng/mL, 100 ng/mL, 110 ng/mL, 120 ng/mL, 130 ng/mL, 140 ng/mL, 150 ng/mL 또는 200 ng/mL도 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 배지에 첨가되는 VEGF의 농도는 75 ng/mL이다.

배양 온도는 다음에 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO₂ 함유 공기 분위기 하에서 배양하여 CO₂ 농도는 바람직하게는 약 2 ~ 5%이다. 배양 시간은, 예를 들면 4일부터 20 일간(예를 들어, 5 ~ 15일)의 배양이며, 바람직하게는 10일이다.

상기의 방법에 의해 제작된 FACS 분석에 의해 측정된 전체 세포 수 당, 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포의 구성비는 다음의 것으로 한정되지 않지만 심근 세포 40 ~ 80%, 내피 세포 1 ~ 20%, 벽 세포 1 ~ 45%, 미분화 세포 0.1 ~ 10% 미만이다. 적어도 내피 세포는 3 ~ 12% 정도 함유하고 있는 것이 바람직하다. 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포의 구성비는 심근 세포 62.7%, 내피 세포 7.9%, 벽 세포 18.3%, 미분화 세포 2.7%의 구성비의 혼합 세포, 또는 심근 세포 45.6 ± 3.8%, 내피 세포 9.9 ± 1.7%, 벽 세포 41.8 ± 3.3%의 구성비의 혼합 세포 등이 예시된다. 본 발명에 따른 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포의 구성비는 VEGF의 농도 및 기타 다양한 배양 조건에 따라 임의로 변화시킬 수 있으며, 세포를 시트화 했을 때 적당한 강도를 유지할 수 있는 범위 내에서 임의로 변화될 수 있다.

<미분화 세포(TRA-1-60 양성 세포)를 제거하는 공정>

상기의 공정에 의해 제작된 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포의 혼합 세포에서 또한 미분화된 세포를 제거하는 것이 바람직하다.

본 공정은 혼합 세포에서 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포와, 미분화 세포를 분리할 수 있는 모든 방법을 채용할 수 있다. 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포와, 미분화 세포의 분리는 미분화된 세포의 지표를 바탕으로 혼합 세포에서 미분화된 세포만을 추출하는 방법일 수 있고, 또는 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포의 지표를 바탕으로 혼합 세포로부터 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포를 추출하는 방법도 있다. 바람직하게는, 본 공정에서 전자의 방법이 사용된다.

미분화 세포의 지표는 예를 들어, 미분화된 세포에 특이적으로 발현하는 유전자 또는 단백질일 수 있다. 이러한 유전자 또는 단백질은 당 분야에서 충분히 알려져 있으며(Cell., 2005 Sep 23; 122 (6) : 947-56, Stem Cells. 2004; 22 (1) : 51-64, Mol Biol Cell. 2002 Apr; 13 (4) : 1274-81) 예를 들어, Oct3/4, Nanog(이상 전사 인자), SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81(이상, 세포 표면 항원) 등을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본 공정에서의 지표는 바람직하게는 세포 표면 항원이 사용되고, 특히 바람직하게는 TRA-1-60이 지표로 사용된다.

심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포 각각의 지표로서 예를 들어, cardiac troponin-T(cTnT)(심근 세포), VE-cadherin(내피), PDGFRb(벽 세포) 등이 이용되지만 이에 국한되지 않는다.

본 공정에서 미분화 세포의 제거는 상기의 지표를 바탕으로 예를 들면, 유동 세포 계측법(flow cytometry; FACS), 자기 세포 분리법(magnetic cell separation method; MACS) 등의 방법을 이용하여 이루어진다. 바람직하게는 MACS이 사용된다.

바람직한 실시형태에서, 혼합 세포에서 미분화된 세포를 제거하는 공정은 TRA-1-60 항체에 의해 미분화된 세포를 포착하고 포착한 미분화 세포(TRA-1-60 양성 세포)를 면역 자성적 방법(MACS)으로 제거함으로써 이루어진다.

미분화된 세포를 제거하는 공정을 수행한 후 혼합 세포는 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포만으로 구성되어 있을 수 있고, 또는 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포 이외에 임의의 세포가 포함되어 있을 수 있다. 임의의 세포 속에는 미분화된 세포가 포함되어 있을 수도 있다.

3. 세포 시트의 적층화

<세포 시트>

본 발명에 있어서, 상기 세포를 시트화 하기 위해, 예를 들어 세포를 (메타) 아크릴 아미드 화합물, N-(또는 N, N-디) 알킬 치환 (메타) 아크릴 아미드 유도체(특개 2010-255001), 또는 비닐 에테르 유도체를 중합시킨 온도 응답성 폴리머를 코팅한 배양 기재를 이용하여 배양 온도를 변화시킴으로써 세포를 시트 형태로 추출할 수 있다. 여기에서 바람직한 배양 기재로서 폴리-N-이소 프로필 아크릴 아미드을 고정한 배양 기재가 예시된다. 또한 본 배양 장비는 UpCell로 셀시드 사로부터 구입할 수 있다. 이 외에도 온도 응답성 코팅제로 Chen CH, et al, Biomacromolecules 7 : 736-43, 2006에 기재된 셀룰로오스를 코팅한 배양 기재 또는 Takamoto Y, et al, J. Biomater. Sci. Polymer Edn 18 : 1211-1222, 2007에 기재된 2-에톡시 에틸 비닐 에테르(2-ethoxyethyl vinyl ether) 및 2-페녹시 에틸 비닐 에테르(2-phenoxyethyl vinyl ether)로 이루어진 블록 공중 합체를 코팅한 폴리(에틸렌 테레 프탈레이트)(poly (ethyleneterephthalate); PET) 필름을 갖는 배양 기재가 예시되며, 세포를 시트화 함에있어 적절하게 이러한 배양기구를 사용할 수 있다.

<심장 세포 시트>

본 발명에서 세포 시트가 심근 세포를 포함하는 경우 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포를 포함하는 혼합 세포로 구성된 「심장 세포 시트」인 것이 바람직하다. 이때, 심근 세포를 주로(예를 들어 전체 세포 수 기준 80% 이상) 함유할 때 편의적으로 상기의 「심장 세포 시트」와 구별하여 「심근 세포 시트」라고 칭한다. 이러한 심장 세포 시트를 다능성 줄기 세포에서 생산하는 방법은 WO2012/133945에 기재된 방법처럼, 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포를 개별적으로 만들고 후 혼합시킴으로써 행해질 수 있고, PCT/JP2013/058460에 기재된 방법(상기의 2.)처럼 각 분화 유도 방법을 맞추고, 동시에 3 종 유도하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서 심근 세포는 심근 트로포닌(cTnT) 또는 αMHC를 발현하는 세포를 말한다. cTnT는 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_000364로 예시되고, 마우스의 경우 NM_001130174이 예시된다. αMHC은 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_002471로 예시되고 마우스의 경우 NM_001164171이 예시된다.

본 발명에서 내피 세포는 PE-CAM, VE-cadherin 및 폰-윌 브란트 인자(vWF) 중 하나를 발현하는 세포를 말한다. 또한 벽 세포는 Smooth muscle actin(SMA)을 발현하는 세포를 의미한다. 여기에서 PE-CAM은 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_000442이 예시되고, 마우스의 경우 NM_001032378이 예시된다. VE-cadherin은 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_001795이 예시되고 마우스의 경우 NM_009868이 예시된다. vWF는 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_000552이 예시되고 마우스의 경우 NM_011708이 예시된다. SMA는 인간의 경우 NCBI의 accession 번호 NM_001141945이 예시되고 마우스의 경우 NM_007392이 예시된다.

<세포 시트의 적층화>

본 발명에서 세포 시트를 적층시키는 방법으로써, 상기 방법으로 얻어진 세포 시트를 겹쳐서 적층 할 수 있다. 세포 시트를 겹치는 방법으로 임의의 배양액 중에서 겹쳐져 배양액을 제거함으로써 수행될 수 있다. 이때 세포 시트의 겹쳐진 면에 대해서, 상기의 하이드로겔, 예를 들어 젤라틴 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 예를 들어 젤라틴 하이드로겔 입자를 인산 버퍼 용액(PBS) 또는 배양액에 분산시킨 상태로 첨가(예를 들어 일부 또는 전면에 도포를 포함한다.)한다. 이때, 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자는 건조 상태에서도 PBS 또는 배양액으로 팽창시킨 상태 일 수 있다. 하이드로겔 예를 들어 젤라틴 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 예를 들어 젤라틴 하이드로겔 입자의 첨가 후 10 분 이상, 바람직하게는 30 분 정도, 37℃에서 방치하는 것이 바람직하다. 이때 사용하는 하이드로겔 예를 들어 젤라틴 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 예를 들어 젤라틴 하이드로겔 입자는 임의의 농도에 따라 등장 용액에 용해시켜 사용할 수 있다. 여기에 사용되는 등장 용액은 생리 식염수와 PBS 등이 예시된다. 첨가 또는 도포되는 하이드로겔 예를 들어 젤라틴 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 예를 들어 젤라틴 하이드로겔 입자의 양은 예를 들어, 세포 시트의 단위 면적(cm₂) 당 100 μg ~ 6000 μg, 200 μg ~ 5000 μg, 300 μg ~ 4000 μg, 400 μg ~ 3000 μg 또는 500 μg ~ 2000 μg 정도이며, 바람직하게는 세포 시트의 단위 면적(cm₂) 당 500 μg/cm₂에서 2000 μg/cm₂의 양이다.

본 발명에 있어서, 적층화된 세포 시트는 적층된 세포 시트끼리 겹쳐 이루어 있을 수 있고, 적층된 세포 시트에 단층의 세포 시트를 거듭하여 이루어 질 수도 있다. 이때 해당 시트 사이에 상기 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자가 첨가된다. 또는 본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 제 1의 세포 시트 또는 적층 세포 시트와 제 2의 세포 시트 또는 적층 세포 시트 사이에 첨가한다. 이 경우 상기 적층 세포 시트는 바람직하게는 2 또는 3 개의 세포 시트일 수 있다. 상기 배경 기술에 기재한 바와 같이 일반적으로 하이드로겔이 포함되지 않은 4 개 이상의 적층화 세포 시트는 세포에 산소와 영양 등의 보급이 어렵기 때문에 특별히 생착하는 세포 수가 증가하지 않고 세포 사멸도 생긴다. 이에 본 발명의 적층화 세포 시트는 세포 시트를 4 장 이상 적층해도 세포 수가 증가하며 적층화 세포 시트의 벽 두께가 증가하는 유리한 특징이 있다.

상기 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 세포 시트 사이에 첨가하는 양은, 세포 시트면의 일부(예를 들어, 전면의 10 ~ 30% 또는 그 이상, 바람직하게는 40 ~ 70% 이상) 또는 전면에 퍼지는 정도의 양이며, 예를 들면, 세포 시트의 단위 면적당 양은 상기 예시와 같다.

적층화된 세포 시트의 매수는 사용 목적에 따라 적절하게 변경될 수 있고, 4 장 이상, 5 장 이상, 6 장 이상, 7 장 이상, 8 장 이상, 9 장 이상, 10 장 이상, 15 장 이상 또는 20 장 이상이 예시된다. 심근 세포 시트 또는 심장 세포 시트의 경우 예를 들어, 적층화 후 시트의 두께가 500 μm 이상, 600 μm 이상, 700 μm 이상, 800 μm 이상, 900 μm 이상 또는 1 mm 이상 정도가 되는 것이 바람직하다.

4. 적층화 세포 시트를 포함한 약학 조성물

본 발명에 있어서, 상기 방법으로 얻어진 적층화 세포 시트는 질환이나 장애로 인해 결손된 부분에 직접 부착하여 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 적층화 세포 시트를 포함한 약학 조성물을 제공할 수 있다. 적층화 세포 시트는 질환의 대상이 되는 동물종, 질병의 치료 부위의 크기, 질병의 치료 방법 등에 따라 임의의 세포 수 또는 임의의 크기 또는 몇 개의 시트를 사용할 수 있다.

세포의 종류에 따라 치료 대상 질환은 적절히 선택되는데, 예를 들어, 각막 상피 세포 시트 또는 구강 점막 상피 세포 시트를 이용한 각막 상피 질환용 치료제, 심근 세포 시트 또는 심장 세포 시트를 이용한 심부전 만성 심부전, 중증 심부전, 허혈성 심장 질환, 심근 경색, 급성 심근 만성 심근 경색, 심근증, 허혈성 심근증, 심근염, 비대 심근증, 확장상 비대 심근증, 확장형 심근증용 치료제, 식당 상피 세포 시트 또는 구강 점막 상피 세포 시트를 이용한 식도 상피의 재건 염증 반응의 억제, 식도 협착의 방지를 위한 치료제, 치근막 세포 시트, 펄프 줄기 세포 시트를 이용한 치주 조직 재생용 치료제 및 연골 세포를 포함한 연골 시트를 이용한 관절염 치료제 등을 들 수 있다.

다음의 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 그 실시예 제한되지 않는 것으로 한다. 즉 다음의 실시예에서는 적층화 심장 세포 시트를 구체적인 예로 설명하지만, 이것은 단순한 예에 불과하다는 것으로서, 본 발명에 따라 다른 종류의 세포에 대해서도 마찬가지로 적층화 세포 시트를 제작 할 수 있으며, 또한 생체에 좋은 세포 생착을 가능하게 하는 것에 유의해야 한다.

실시예

[실시예 1] 적층화 심장 세포 시트 제작

<마우스 ES 세포주>

Yamashita JK 등, FASEB J. 19 : 1534-6, 2005에 기재된 aMHC 프로모터에 의해 EGFP 발현이 제어되도록 조작된 마우스 ES 세포주(EMG7) 및 TFP를 항시적으로 발현하도록 Zambrowicz BP 등, Proc Natl Acad Sci USA, 94 : 3789-3794, 1997에 기재된 방법으로 수정된 ES 세포주 (TFP-ROSA)을 사용하였다.

<Flk+ 세포>

Flk+ 세포는 지금까지 보고된 방법에 의해 제작하였다(Yamashita J, et al. Nature. 408 : 92-6, 2000 또는 Yamashita JK, et al. FASEB J. 19 : 1534-6, 2005). 간단하게, EMG7 또는 TFP-ROSA를 분화 배지(10% 소 태아 혈청 및 5x10⁵ mol/L의 2-mercaptoethanol을 첨가 한 αMEM)를 이용하여 젤라틴 코팅 접시에서 4 일간 배양 한 후 FACS에 의해 Flk 양성 세포를 순화하여 제작하였다.

<내피 세포와 벽 세포의 혼합 세포>

위의 방법으로 얻은 TFP-ROSA 유래 Flk+ 세포에서 지금까지 보고된 방법을 이용하여 내피 세포와 벽 세포의 혼합 세포를 제작하였다(Yamashita J, et al. Nature. 408 : 92-6 2000 또는 Yurugi-Kobayashi T, et al. Arterioscler ThrombVasc Biol. 26 : 1977-84, 2006). 간단하게, 50 ng/mL의 VEGF와 0.5 mmol/L의 8-bromo-cAMP를 첨가한 분화 배지를 이용하여 젤라틴 코팅 접시에서 3 일간 배양함으로써 얻을 수 있었다.

<심근 세포>

위의 방법으로 얻은 EMG7 유래 Flk+ 세포에서 지금까지 보고된 방법을 이용하여 심근 세포를 제작하였다(WO2009/118928 또는 Yan P, et al. Biochem Biophys Res Commun. 379 : 115-20, 2009). 간단하게, 1 ~ 3 μg/mL의 Cyclosporin-A를 첨가 한 분화 배지를 사용하여 mitomycin C 처리를 한 OP9 세포에서 4 일간 배양한 후 GFP 양성 분획을 분리함으로써 얻을 수 있었다.

<심장 세포 시트>

위의 Flk+ 세포, 내피 세포와 벽 세포의 혼합 세포 및 심근 세포를 이용하여 도 1에 나타낸 Masumoto H, et al, Stem Cells. 301196-205 2012에 기재된 방법에 의해 제작되었다. 간단하게 2.5 × 10⁴에서 4.0 × 10⁴의 TFP-ROSA 유래 Flk+ 세포를 12 well의 온도 감수성 배양 접시(UpCell, 셀시드사)에 파종하여 배양 시작 4 일째에 5.0 × 10⁵의 상술한 내피 세포와 벽 세포의 혼합 세포 및 5.0 × 10⁵의 상술한 심근 세포를 함께 배양 접시에 접종하고 VEGF를 첨가한 분화 배지를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 심근 세포 첨가 4일 후(배양 개시 7 일째)에 실온에 복원하여 배양 접시에서 세포를 시트 모양으로 박리시키고 심장 세포 시트를 얻었다. 또한, 2 종의 세포 혼합 후 2 일째에 배지를 교환했다.

<젤라틴 하이드로겔 입자>

세 입 1L 용 플라스크(three neck flask)에 올리브 오일(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 600 ml를 첨가하여 프로펠러에서 교반하면서 40℃의 찜질로 1 시간 가열하였다. 다음 40℃로 가열한 젤라틴(bovine bone 유래, 등전점 5.0 중량 평균 분자량 1.0 × 10⁵, Nitta Gelatin Inc.)의 10 wt % 수용액 20 ml를 플라스크에 가해 회전 속도 400 rpm에서 10 분간 교반하여 W/O 에멀젼을 형성시켰다. 이 에멀젼을 0℃까지 냉각하고, 회전 속도 400 rpm에서 1 시간 동안 교반하여 젤라틴 수용액을 겔화시켰다. 이어 냉각한 아세톤 200 ml를 첨가하고 회전 속도 200 rpm에서 15 분간 교반하여 탈수 처리를 실시했다. 그 후, 플라스크 내의 용액을 50 ml 팔콘 튜브에 회수하여 4℃에서 회전 속도 5000 rpm에서 5 분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 냉각 아세톤으로 세척하고 호모게나이저(회전 속도 10,000 rpm)로 1 분간 교반하였다. 이어 4℃에서 회전 속도 5000 rpm에서 5 분간 원심 분리하였다. 다시 상층을 제거하고 세척, 원심, 이 조작을 3 회 반복했다. 냉각 아세톤으로 세척하면서 젤라틴 입자를 체(20, 32 및 53 μm 오프닝)에 의해 분획, 입자 지름별로 회수하여 진공 건조하여 건조 입자를 얻었다. 다음은 미 가교 젤라틴 입자를 진공 오븐에서 감압, 140℃에서 48 시간 가열 탈수 처리하여 젤라틴 입자를 화학 가교하여 젤라틴 하이드로겔 입자를 얻었다. 건조 상태의 입자 지름이 20 μm 이하, 20 ~ 32 μm 및 32-53 μm의 것을 이용했다.

<심장 세포 시트의 적층화>

상기 방법에 있어서, 모든 세포의 양을 반으로 하여 24 well 플레이트를 이용하여 제작된 심장 세포 시트를 젤라틴 코팅 배양 접시에 펼친 상태로 방치하고 배지를 흡인 배양 접시와 시트를 고정하였다. 이때 심장 시트로는 지름 6 mm 정도였다. 이 위에 0.1 mg/㎕의 농도로 PBS 용액에 분산시킨 건조 상태의 입자 지름이 20 ~ 32 μm의 젤라틴 하이드로겔 입자를 2.5 ㎕(약 885 μg/cm²) (low dose) 또는 7.5 ㎕ (약 2654 μg/cm²) (high dose)을 적하하여 37℃에서 30 분간 인큐베이션했다. 이어 다른 심장 세포 시트를 분화 배지와 함께 추가, 젤라틴 하이드로겔 입자 처리된 심장 세포 시트 위에 겹쳐 배지를 제거했다. 같은 작업을 반복 심장 세포 시트 5 장을 적층화 하였다(도 2). 이때 2, 3, 4, 5 번째 레이어는 조금씩 위치를 비켜서 적층하였다. 마지막으로, 피펫맨을 이용하여 배양 접시 바닥에 차도록 분화 배지를 흘려 적층된 심장 세포 시트를 배양 접시에서 떼어냈다.

얻어진 적층화 심장 세포 시트를 대조군과 비교하여 젤라틴 하이드로겔 입자 군에서는 더 지속하는 자기 박동을 인정했다. 이때 대조군으로 젤라틴 하이드로겔 입자를 첨가하지 않은 적층된 심장 세포 시트를 이용하였다.

얻어진 적층화 심근 세포 시트를 염색상으로 확인하기 위해 4% PFA를 사용하여 고정 탈수 탈지 탈 알코올 후, 파라핀 침투 후 포매하였다. 6 μm에서 절편 생성 후 헤마톡실린에오진(HE) 염색을 실시했다(도 3A). 그 결과, 적층 시트의 벽 두께 및 생존 세포 영역의 크기는 대조군과 고용량(high dose) 군에 비해 저용량(low dose) 군에서 유의하게 컸다(도 2B). (벽 두께; ctrl (대조군) : 250.9 ± 17.7, n=7 vs. low dose 군 : 597.1 ± 24.0, n=10 vs. high dose 군 : 449.2 ± 25.6 μm, n=5, p <0.0001, HE 염색 양성 세포 영역 면적; ctrl(대조군) : 0.03511 ± 0.009244, n=5, low dose 군 : 0.4746 ± 0.04162, n=3 vs. high dose 군 : 0.1211 ± 0.007000 mm², n=4, p=0.0090) .

또한 12 웰 플레이트를 이용하여 제작된 심장 세포 시트(직경 약 1 cm 정도)에 대해서도 마찬가지로 0.1 mg/㎕의 농도로 PBS 용액에 용해시킨 건조 상태의 입자 지름이 20 ~ 32 μm의 젤라틴 하이드로겔 입자를 5 ㎕(약 637 g/cm²) 또는 15 ㎕(약 1911 μg/cm²)를 적하하여 5 층의 적층화 심장 세포 시트를 얻을 수 있었다.

또한 같은 공정에 의해, 15 층에서도 적층된 심장 세포 시트(벽 두께 약 1 mm)가 얻어지는 것을 확인할 수 있었다.

<젤라틴 하이드로겔 입자의 입경에 따른 효과 검토>

상술한 심장 세포 시트의 적층화에서 건조 상태의 입자 지름이 20 μm 이하, 20 ~ 32 μm, 32 ~ 53 μm의 젤라틴 하이드로겔 입자를 각각 이용하여 심장 세포 시트를 적층시킨 결과, 적층 시트의 벽 두께 및 생존 세포 영역 면적은 ctrl 군(대조군), 20 μm 이하 군, 20 ~ 32 μm 군, 32 ~ 53 μm 군의 4 군 중 20 ~ 32 μm 군에서 가장 컸다(도 4A 및 B). (벽 두께; ctrl : 204.7 ± 9.5, n=5 vs. 20 μm 이하 군 : 389.1 ± 7.6, n=3 vs. 20-32 μm 군 : 597.1 ± 24.0 μm, n=10 vs. 32-53 μm 군 : 333.5 ± 5.7 μm, n=3, p<0.0001, HE 염색 양성 세포 영역 면적; ctrl : 0.03446 ± 0.005362, n=3 vs. 20 μm 이하 군 : 0.2051 ± 0.004676, n=3 vs. 20-32 μm 군 : 0.4746 ± 0.04162 μm, n=3 vs. 32-53 μm 군 : 0.1487 ± 0.003894 μm, n=3, p<0.0001).

[실시예 2] 심근 경색 모델 쥐에 적층된 심장 세포 시트의 이식 시험

흉선 결손 누드쥐(수컷 10 ~ 12 주령)에서 공지의 방법(Masumoto H, et al., Stem Cell 30 : 1196-1205 (2012); Nishina T, et al., Circulation 104 : 1241-1245 (2001); Sakakibara Y., et al., Circulation 104 : 106 : 1193-1197 (2002))에서 제작한 심근 경색 모델 쥐의 심장 전에 벽 표면에 Masumoto의 방법(위)에 의해, 실시예 1에서 제작된 적층화 심장 세포 시트(5 층)을 이식하고 심장 초음파 검사(Echocardiography)를 결선 전(기준, baseline), 심근 경색 후 6 일째(pre TX), 1 주일 후, 2 주 후, 4 주 후, 8 주 후 및 12 주 후에 실시하여, 좌심실의 확장기 직경(left ventricular diastolic diameter; LVDd)과 수축기 직경(LVDs) 및 좌심실의 경색 벽 및 비 경색 벽 확장기 벽 두께(left ventricular diastolic diameter; LVWTd)와 수축기 벽 두께(LVWTs)를 측정하여 좌심실(LV) 단축율(FS(%))의 경시 변화를 다음 식에서 계산되었다.

FS(%) = (LVDd-LVDs)/LVDd

결과를 도 5에 나타내었다. 도에서 젤라틴 하이드로겔 입자를 이용하여 적층된 심장 세포 시트 군이 무처리 군 뿐만 아니라 젤라틴 하이드로겔 입자를 이용하지 않고 적층된 심장 세포 시트 군보다 통계적으로 유의한 차이를 가지고, 심기능을 개선시킨 것으로 나타났다.

본 발명의 적층화 세포 시트(layered cell sheet)의 제작은 세포가 생존한 상태에서 세포 시트를 적층할 수 있으며, 따라서 얻어진 세포 시트를 이용하여 세포 대체 요법에 응용이 가능하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로써 본원에 도입한다.

Claims

하이드로겔을 이용하여 세포 시트를 적층화(layering)하는 것을 포함하는, 세포 시트의 적층 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 세포 생존에 필요한 물질의 확산 이동을 가능하게 하는 재료 또는 형태로 이루어진 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 하이드로겔은 젤라틴 하이드로겔인 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 하이드로겔 입자인 방법.
제 4항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자는 젤라틴 하이드로겔 입자인 방법.
제 5항에 있어서, 상기 젤라틴 하이드로겔 입자는 젤라틴 분자 간의 가교를 형성시켜 얻어지는 젤라틴 하이드로겔 입자인 방법.
제 5항 또는 6항에 있어서, 상기 젤라틴 하이드로겔 입자는 건조 상태에서 입자 크기가 20 ㎛ 내지 32 ㎛의 입자로 이루어진 방법.
제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 제 1의 세포 시트 또는 적층 세포 시트와 제 2의 세포 시트 또는 적층 세포 시트 사이에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 적층 세포 시트는 2 또는 3 개의 세포 시트로 이루어진 방법.
제 8항 또는 9항에 있어서, 상기 하이드로겔, 바람직하게는 하이드로겔 입자, 보다 바람직하게는 젤라틴 하이드로겔 입자를 세포 시트의 단위 면적당 500 ㎍/㎠ 내지 2000 ㎍/㎠의 양으로 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 적층된 적층화 세포 시트(layered cell sheet).
제 11항에 있어서, 세포 시트를 4 장 이상 적층한 적층화 세포 시트.
제 11항 또는 제 12항에 기재된 적층화 세포 시트를 포함하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 시트는 심근 세포 시트인 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 시트는 심근 세포, 내피 세포 및 벽 세포를 포함하는 심장 세포 시트인 방법.
제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 심근 세포는 만능 줄기 세포에서 생산된 세포인 방법.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 내피 세포는 만능 줄기 세포에서 생산된 세포인 방법.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벽 세포는 만능 줄기 세포에서 생산된 세포인 방법.
제 14항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포)인 방법.
제 14항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 적층된 적층화 세포 시트.
제 20항에 있어서, 세포 시트를 4 장 이상 적층한 적층화 세포 시트.
제 11항, 제 12항, 제 20항 및 제 21항 중 어느 한 항에 기재된 적층화 세포 시트를 포함하는 심장 질환 치료제.