JP6923204B2 - 積層化細胞シート組成物を製造する方法、それにより製造される積層化細胞シート組成物及びその製造装置 - Google Patents
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Description
(2)刺激応答性培養基材上の第2シート状細胞群の上面、及び/又は、該培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面、に細胞接着性物質を塗布する工程、
(3)該培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面を、該第2シート状細胞群の上面に接触させ、該第2シート状細胞群が該刺激応答性培養基材から剥離する刺激を与え、剥離した第2細胞シートを該第1細胞シートの下面に接着させる工程、を含む、積層化細胞シート組成物を製造する方法。
(4)刺激応答性培養基材上の第3シート状細胞群の上面、及び/又は、該工程(3)で得られた該培養細胞移動治具に付着した積層化細胞シート組成物の下面、に細胞接着性物質を塗布する工程、
(5)該培養細胞移動治具に付着した該積層化細胞シート組成物の下面を、該第3シート状細胞群の上面に接触させ、該第3シート状細胞群が該刺激応答性培養基材から剥離する刺激を与え、剥離した第3細胞シートを該積層化細胞シート組成物の下面に接着させる工程、
(6)該工程(4)〜(5)を任意の回数繰り返す工程、
を含む、[1]又は[2]に記載の方法。
刺激応答性培養基材上の第2シート状細胞群の上面、及び、該培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面、に細胞接着性物質を塗布する工程であって、
該第2シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲン、及び、該第1細胞シートの下面に塗布する細胞接着性物質がトロンビンである、或いは、
該第2シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がトロンビン、及び、該第1細胞シートの下面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲンである、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
刺激応答性培養基材上の第3シート状細胞群の上面、及び、該工程(3)で得られた該培養細胞移動治具に付着した積層化細胞シート組成物の下面、に細胞接着性物質を塗布する工程であって、
該第3シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲン、及び、該積層化細胞シート組成物の下面に塗布する細胞接着性物質がトロンビンである、或いは、
該第3シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がトロンビン、及び、該積層化細胞シート組成物の下面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲンである、[3]〜[6]のいずれか1項に記載の方法。
[13] 前記積層化細胞シート組成物の平均の厚さが、80μm以上である[12]に記載の積層化細胞シート組成物。
該細胞シートを付着させるための培養細胞移動治具と、
該培養細胞移動治具を取り付けて、該培養細胞移動治具に荷重をかけるためのアームと、
該刺激応答性培養基材上の該細胞シートに細胞接着性物質を塗布する細胞接着性物質塗布手段と、を備えた、積層化細胞シート組成物の製造装置。
該載置台に載置された第2シート状細胞群の上面、及び/又は、該第1細胞シートの下面に、該細胞接着性物質塗布手段によって供給される該細胞接着性物質を塗布し、
該培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面を、該第2シート状細胞群の上面に接触させ、該刺激手段によって該刺激応答性培養基材上の該第2シート状細胞群が剥離される刺激を与えると同時に、該培養細胞移動治具に荷重をかけて、得られる第2細胞シートを該第1細胞シートに迅速に積層することを特徴とする、[15]に記載の積層化細胞シート組成物の製造装置。
(1)刺激応答性培養基材上の第1シート状細胞群の上面に、培養細胞移動治具を接触させ、該刺激応答性培養基材上の第1シート状細胞群を剥離させる刺激を与えて、剥離した第1細胞シートを該培養細胞移動治具に付着させる工程、
(2)刺激応答性培養基材上の第2シート状細胞群の上面、及び/又は、該培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面、に細胞接着性物質を塗布する工程、
(3)該培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面を、該第2シート状細胞群の上面に接触させ、該第2シート状細胞群が該刺激応答性培養基材から剥離する刺激を与え、剥離した第2細胞シートを該第1細胞シートの下面に接着させる工程。
(4)刺激応答性培養基材上の第3シート状細胞群の上面、及び/又は、該工程(3)で得られた該培養細胞移動治具に付着した積層化細胞シート組成物の下面、に細胞接着性物質を塗布する工程、
(5)該培養細胞移動治具に付着した該積層化細胞シート組成物の下面を、該第3シート状細胞群の上面に接触させ、該第3シート状細胞群が該刺激応答性培養基材から剥離する刺激を与え、剥離した第3細胞シートを該積層化細胞シート組成物の下面に接着させる工程、
(6)該工程(4)〜(5)を任意の回数繰り返す工程、
を含んでいる。
刺激応答性培養基材に刺激を与え、該刺激応答性培養基材から細胞シートを剥離させるための刺激手段を具備した載置台と、
該細胞シートを付着させるための培養細胞移動治具と、
該培養細胞移動治具を取り付けて、該培養細胞移植治具に荷重をかけるためのアームと、
該刺激応答性培養基材上の該細胞シートに細胞接着性物質を塗布する細胞接着性物質塗布手段と、を備え、
該載置台に載置された刺激応答性培養基材上の第1シート状細胞群の上面に、該培養細胞移動治具を接触させ、該刺激手段によって該刺激応答性培養基材上の該第1シート状細胞群が剥離される刺激を与えて、得られる第1細胞シートを該培養細胞移動治具に付着させ、
該載置台に載置された第2シート状細胞群の上面、及び/又は、該第1細胞シートの下面に、該細胞接着性物質塗布手段によって供給される該細胞接着性物質を塗布し、
該培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面を、該第2シート状細胞群の上面に接触させ、該刺激手段によって該刺激応答性培養基材上の該第2シート状細胞群が剥離される刺激を与えると同時に、該細胞移動治具に荷重をかけて、得られる第2細胞シートを該第1の細胞シートに迅速に積層することを特徴とする積層化細胞シート組成物の製造装置、が挙げられる。
本実施例において、別途特別に表記が無い限り、以下の動物、細胞、試薬等を使用した。
・ラット(生後1日、日本医科学動物資材研究所社、Hsd:Sprague Dawley SD(系統名))
・HepG2(ATCC社、HB−8065)
・温度応答性培養皿(UpCell(登録商標))(セルシード社)
・ラット心筋細胞培養液(medium199 40%+HANKS balanced salt Solution 54%+FBS6%+penicillin−streptomycin solution1%+166mmol/L NaCl、1.0 mmol/L NaH2PO4、0.8 mmol/L MgSO4、26.2mmol/L NaHCO3、0.9mmol/L CaCl2、5mmol/L glucose)
・HepG2細胞培養液(DMEM+FBS10%+penicillin−streptomycin solution1%)
・FBS(ジャパンバイオシーラム社、S1650−500)
・ハンクス平衡塩溶液(ナカライテスク社、17460−15)
・DMEM(SIGMA、D6429)
・penicillin−streptomycin solution(Life Technologies、15140−122)
・4%パラホルムアルデヒド固定液(武藤化学社、3311−1)
・50%水酸化ナトリウム溶液(和光純薬工業社、197−12375)
・抗ラット心筋トロポニンT(サーモフィッシャーサイエンティフィック社、MS−295−P1)
・CD31抗体 mouse anti ratPECAM−1[CD31](ミリポア社、MAB1393)
・2次染色抗体 Alexa Fluor488 goat anti−mouse(Life technolodies、A11017)
・2次染色抗体 Alexa Fluor594 goat anti−rabbit(Life technolodies、A11037)
・核染色ProLong Gold antifade reagent with DAPI(Life technolodies、P36935)
・Anti−fibronectin抗体(abcam、ab2413)
・フィブリンゲル(フィブリノーゲン+トロンビン)(帝人ファーマ社、ボルヒール組織接着用)
・コラーゲン溶液(高研社、コラーゲン酸性溶液I−AC 5mg/mL)
・ゼラチン(SIGMA社、G1890−100G)
<使用した機器>
・スタンプデバイス(参考:Ngo T.X.et al.Endothelial cell behavior inside myoblast sheets with different thickness.Biotechnol Lett(2013) 35:1001-1008)
・顕微鏡(ニコン社、ECLIPSE,E800)
・共焦点顕微鏡(オリンパス社、FV1200)
・光干渉断層撮影装置(OCT、パナソニックヘルスケア社、参考:Kobayashi M.,et al.,Real−time,noninvasive optical coherence tomography of cross−sectional living cell−sheets in vitro and in vivo. JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS vol.103(6),1267−1273,Aug.2015)
心筋細胞シートは、Sakaguchiらの方法(Sakaguchi K.et al.,In Vitro Engineering of Vascularized Tissue Surrogates,Scientific Reports,3,1316,2013.)に従って作製した。具体的には、生後1日の仔ラットより回収した心臓をミンス(mince)して心筋細胞を回収した。回収した細胞をバッファー(HANKSとFBSを1:1で混合したもの)で洗浄し、ラット心筋培養液に懸濁した。心筋細胞は、温度応答性の24wellプレート培養皿(UpCell(登録商標)、セルシード社)に90万cells/wellの濃度で播種し、0.5mLのラット心筋培地中で4日間、5%CO2、飽和水蒸気下の37℃インキュベーターで培養した。その後、20℃で保温することとで、細胞シートとして回収した。
ピペッティング法による細胞シートの積層は、Haraguchiらの方法(Haraguchi Y.et al.,Fabrication of functional three−dimensional tissues by stacking cell sheets in vitro,Nature Protocol,7,850,2012.)に従って実施した。具体的には、培養液に浮遊させた細胞シートを、細胞培養液ごとピペットで吸引し、別の細胞シート上に吸引した培養液を排出することで細胞シートを積層した。
スタンプ法による細胞シートの積層は、基本的にはHaraguchiらの方法(Haraguchi Y.et al.,Fabrication of functional three−dimensional tissues by stacking cell sheets in vitro,Nature Protocol,7,850,2012.)に従い、一部改変して行った(図1及び図2)。具体的には、粉末状のゼラチンを65mg/mlの濃度でハンクス平衡塩溶液に溶かし、pHを7.4付近になるように50%水酸化ナトリウム溶液を加えた。pH調整をしたゼラチン溶液をスタンプデバイスの型に気泡が入らないようにゆっくりと流し込み、4℃で30分間静置することでゼラチンゲル付きスタンプデバイスを完成させた。完成したスタンプデバイスを、培養液を抜いた24wellプレート培養皿上のシート状細胞群に乗せ、上からスタンプデバイスと合わせて合計30gの荷重がかかるようにおもりを乗せ、30分間氷上で静置した。1枚目のシート状細胞群とゼラチンを接着させたら、2枚目以降はゼラチンに付着した細胞シート側にトロンビン2μLを、24wellプレート培養皿上のシート状細胞群側にフィブリノーゲン2μLをピペットマンにより添加し、1枚目と同様に上から合計30gの荷重をかけて積層させた。目的の枚数まで積層が完了したら、スカルペルを使用してゼラチンゲルごとスタンプデバイスから細胞シートを切り出し、積層組織を回収した。
回収した組織をパラフィン固定し5μmの厚さで薄切した後、HE染色や免疫染色をすることで積層組織の形態を評価した。
塩酸でpH3に調整した塩酸水を用いてコラーゲン溶液を10倍希釈した後、温度応答性24wellプレート培養皿に300μL加え30分間静置した。その後、コラーゲン溶液を除去して2時間風乾させ、コラーゲンコーティングを施した。その後、そこにHepG2細胞を20万cells/wellの濃度で播種して3日間37℃インキュベーターで培養する。なお培養液にはDMEM(1%penicillin−streptomycin solution、10%FBSを含む)を使用した。スタンプ積層に関しては前述の心筋細胞シートの積層と同様の方法で行った。
(フィブリンゲルを用いたスタンプ積層条件の検討)
スタンプデバイスとフィブリンゲルを用いた細胞シート積層化方法の条件を検討した結果、検討したいずれの条件(荷重:10、20、30g、ゼラチン濃度:60、65又は75mg/mL、フィブリンゲル量:4μL又は6μL、接着時間:3分又は5分)においても、従来の方法では30分以上を必要としていた積層化時間を短縮することが可能であった。その中でも、表1に示した条件が最も再現よく心筋細胞シートを積層化することが可能であった。本発明によって、これまで、2層目以降の細胞シートの積層時間が30分以上必要であったが、5分以下に短縮可能となった。
(細胞生存率の評価)
生後1日の仔ラットの心臓から回収した細胞を90万cells/wellの濃度で温度応答性培養皿(24well)に播種し、37℃ CO2インキュベーターで4日間培養した。その後、ゼラチンを形成したスタンプデバイスを、培養液を抜いた細胞の上に置き、30gの荷重をかけながら30分静置させ、1枚目の細胞をスタンプデバイスに接着させた。2枚目の積層は、従来の30分かけて積層する方法と、間にフィブリンゲルを加えることで接着時間を5分にする本発明の積層方法により、準備した。2つの方法で2層の積層が完了した後、ゼラチンごと2層の細胞シートを60mm dishに移動させ、5分 37℃インキュベーターで培養することでゼラチンゲルを溶解して取り除いた。2層の細胞シートを回収した後、トリプシン酵素処理を行って細胞シートを個々の細胞へとバラバラにし、トリパンブルー染色を使用して死細胞、生細胞をカウントした。コントロールには、積層前の細胞を準備し、同様の処理をした後に死細胞、生細胞をそれぞれカウントした。
細胞の生存率は、以下の式で算出した(図4)。
(積層心筋組織の拍動同期評価)
心筋細胞シートは拍動していることが知られ、また積層させることで2枚の心筋細胞シートの拍動が同期することも確認されている。そこで、本手法により構築した立体心筋組織が拍動を行っているか、また拍動が同期するのかをOCTと明視野顕微鏡による観察により確かめた(図5)。
(積層心筋組織の拍動電位の同期評価)
フィブリンゲル用いて積層した心筋細胞シート間において、拍動電位が同期するかどうかを確認した。生後1日の仔ラットの心臓から回収した細胞を90万cells/wellの濃度で温度応答性培養皿(24well)に播種し、37℃ CO2インキュベーターで4日間培養した。その後、ゼラチンを形成したスタンプデバイスを、培養液を抜いた細胞の上に置き、30gの荷重をかけながら30分間静置させ、1枚目の細胞をスタンプデバイスに接着させた。この方法で2層の心筋細胞シートを積層させたものを2セット作製したら、1セット目を電位測定用の特殊な培養皿に接着させ、37℃ CO2インキュベーターで5分間培養し、ゼラチンを溶解させて取り除いた。次に2セット目の積層化細胞シートを1セット目の積層化細胞シートに一部が重なるように接着させた(図6(A))。なお、この際に2つの積層化細胞シートの間には4μLのフィブリンゲルを挟み込んだ。37℃ CO2インキュベーターで5分間培養し、ゼラチンを溶解させて取り除いた後、拍動電位の測定を行った。なお、電位測定はMatsuuraらの方法(Matsuura K.et al.,Creation of mouse embryonic stem cell−derived cardiac cell sheets,Biomaterials 32(2011)7355-7362.)と同様の方法で行った。
(積層心筋組織内における血管網評価)
これまでの研究から立体細胞組織を生体外で培養するためには、血管網の構築が必要不可欠であることが分かっている。そこで本手法により構築した積層組織内における血管網の様子を血管内皮細胞特異的な抗原であるCD31を用いて抗体免疫染色することで確かめた。本発明により2枚スタンプ積層したラット心筋細胞シートを4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した後、PBSで10%希釈したヤギ血清で2時間ブロッキングをした。その後PBSで100:1に希釈したCD31抗体で4℃オーバーナイトして反応させた後、PBSで100:1に希釈した2次染色抗体 Alexa Fluor488 goat anti−mouse(Life technolodies、A11017)を1時間、室温で反応させた。最後に細胞核をPBSで300:1に希釈したHoechst33258で15分間染色し、共焦点顕微鏡により観察した。
(高速スタンプ積層組織の移植評価)
生後1日の仔ラットの心臓から回収した細胞を90万cells/wellの濃度で温度応答性培養皿(UpCell(登録商標)、24well)に播種し、37℃ CO2インキュベーターで4日間培養した。その後、ゼラチンを形成したスタンプデバイスを、培養液を抜いた細胞の上に置き、30gの荷重をかけながら30分間静置させ、1枚目の細胞をスタンプデバイスに接着させた。2枚目以降の積層からは、再び30分間かけて積層する方法と、細胞シートと細胞シートとの間にフィブリンゲルを加えることで接着時間を5分間にして積層する方法によって積層化細胞シートを準備した。2つの方法で5層まで積層を行った。なお、2つの方法で5層積層した細胞シートの完成時間が同時になるように、積層の始める時間を調整した。積層が完了したら、直ちに8〜12週齢の麻酔(イソフルラン)をかけたヌードラット(系統名:F344/NJcl−rnu/rnu、日本クレア社)の背中を開き、皮下側に2つの積層化細胞シートをゼラチンゲルごと切り離して置くようにして移植した。その後、移植した部位が特定できるように、移植した組織の上からシリコンシート(アズワン社、6−611−01)を被せ、開いた背中を閉じて2週間飼育した(図8、図9)。移植2週間後同様に背中を開き、移植した部位を回収し、4%パラホルムアルデヒドに24時間浸けて組織を固定した。組織を固定後、1×PBSで洗浄し最後にパラフィン置換してパラフィンブロックを作製した。パラフィンブロックを作製後、ミクロトームを用いて5μmの厚さで薄切し、組織切片を作製した。組織切片を作製したら慣例的な方法によりアザン染色をして形態評価を行った。また、組織切片をキシレンとエタノールを使って脱パラフィン処理を行い、賦活化(Target Retrieval Solution 10×concentrate(Dako、S1699))溶液にて処理を行った後、室温で1時間のNormal Goat Serum(アバカム社、ab7481)にてブロッキング処理、PBSで200倍に希釈した1次抗体(anti−cardiac ToroponinT)で4℃オーバーナイト、PBSで200倍に希釈した2次抗体(Alexafluor488)で2時間室温反応、Hoechst33258で15分室温反応させ封入剤で封入することで、抗体免疫染色切片を作製して共焦点顕微鏡により観察した。
(スタンプ積層技術によるHepG2細胞シートの積層化)
フィブリンゲルを用いた新規スタンプ積層技術の検討は全てラット心臓由来細胞シートを用いて行われた。そこで他細胞種の細胞シートにも本手法が適用可能かを検討するためHepG2細胞シート(ヒト肝癌由来細胞)を用いてラット心筋細胞シートと同様に積層実験を行い、組織切片を作製し形態を評価した。コラーゲンコーティングした温度応答性培養皿にHepG2細胞を播種して3日間培養することでHepG2細胞シートを作製し、新規スタンプ積層技術により積層した結果を図7に示した。図7の結果から厚みのあるHepG2細胞組織が構築されている様子が確認でき、他細胞種においても本発明の積層技術が適用できる可能性が示唆された。
(積層化細胞シート組成物(10層)の移植評価)
実施例6と同様、フィブリンゲルを使用した方法によって、生後1日の仔ラットの心臓から回収した細胞を用いて10層の積層化細胞シートを作製した。また、得られた積層化細胞シートを実施例6と同様の方法でヌードラットへ移植した。移植2週間後の移植部位周辺より組織切片を作製し、免疫染色法によって心筋トロポニンT(緑、心筋細胞の位置を示す)及びCD31(赤、血管内皮細胞の位置を示す)を染色し、同時にHoechst33258にて細胞核を染色した。得られた組織切片を共焦点顕微鏡で観察した(図13)。
本発明の積層化細胞シート組成物を製造するための装置を例示する。図12は、本発明の細胞シート積層化装置1を示す斜視図である。10は、細胞シートを保持する培養細胞移動治具10である。この培養細胞移動治具10は、アーム11先端下部に着脱可能である。培養細胞移動治具10の細胞シートと接触する細胞付着には、細胞シートを捕捉できる機能を有するものであればよく、例えば、材料としては、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、シリコーン樹脂、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリンゲル等を用いることができる。これにより、細胞シートを貼り付けて持ち上げることができる。アーム11は、(四角柱形状の)基部材の上部に垂直平面内で揺動可能に取り付けられている。アーム11の揺動回転軸12を挟んで図中左側には培養細胞移動治具10と、図中右側には押圧力(重さ)を計測する押圧力測定手段13を備える。基部材15の下部は蛇腹シール14でシールされている。その基部材の下部には、基部材15を水平面内のX方向及びY方向に移動可能にする(図示しない)駆動手段と基部材をZ方向に昇降動作させる昇降駆動手段を備える。
10 培養細胞移動治具
11 アーム
12 揺動回転軸
13 横圧力測定手段
14 蛇腹シール
15 基部材
16 載置台
16a 回転軸
17 細胞接着性物質塗布手段
18 刺激供与手段
20 細胞培養基材
30 基台
31 搬出入口
Claims (9)
- (1)刺激応答性培養基材上の第1シート状細胞群の上面に、培養細胞移動治具を接触させ、前記刺激応答性培養基材上の第1シート状細胞群を剥離させる刺激を与えて、剥離した第1細胞シートを前記培養細胞移動治具に付着させる工程、
(2)刺激応答性培養基材上の第2シート状細胞群の上面、及び、前記培養細胞移動治具に付着した前記第1細胞シートの下面、に細胞接着性物質を塗布する工程、
(3)前記培養細胞移動治具に付着した前記第1細胞シートの下面を、前記第2シート状細胞群の上面に接触させ、前記第2シート状細胞群が前記刺激応答性培養基材から剥離する刺激を与えながら同時に1g〜30g/cm2で荷重し、剥離した第2細胞シートを前記第1細胞シートの下面に接着させる工程、
を含む、積層化細胞シート組成物を製造する方法であって、
ここで、前記工程(2)において、
前記第2シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲンであり、前記第1細胞シートの下面に塗布する細胞接着性物質がトロンビンである、又は、
前記第2シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がトロンビンであり、前記第1細胞シートの下面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲンである、
方法。 - 前記工程(3)の実施時間が、5分以内である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(3)で得られた、前記培養細胞移動治具に付着した積層化細胞シート組成物に対し、
さらに、
(4)刺激応答性培養基材上の第3シート状細胞群の上面、及び、前記工程(3)で得られた前記培養細胞移動治具に付着した積層化細胞シート組成物の下面、に細胞接着性物質を塗布する工程、
(5)前記培養細胞移動治具に付着した前記積層化細胞シート組成物の下面を、前記第3シート状細胞群の上面に接触させ、前記第3シート状細胞群が前記刺激応答性培養基材から剥離する刺激を与えながら同時に1g〜30g/cm2で荷重し、剥離した第3細胞シートを前記積層化細胞シート組成物の下面に接着させる工程、
(6)前記工程(4)〜(5)を任意の回数繰り返す工程、
を含み、ここで、前記工程(4)において、
前記第3シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲンであり、及び、前記積層化細胞シート組成物の下面に塗布する細胞接着性物質がトロンビンである、又は、
前記第3シート状細胞群の上面に塗布する細胞接着性物質がトロンビンであり、前記積層化細胞シート組成物の下面に塗布する細胞接着性物質がフィブリノーゲンである、
請求項1又は2に記載の方法。 - 前記刺激応答性培養基材が、温度応答性培養基材であって、前記刺激が、下限臨界溶解温度以下又は上限臨界溶解温度以上の温度である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記刺激応答性培養基材が、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミドが少なくともその培養面の一部に被覆された培養基材である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養細胞移動治具が、細胞接着性タンパク質、細胞接着性ペプチド又は親水性ポリマーの1種又は2種以上からなる細胞付着部を有する培養細胞移動治具である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記積層化細胞シート組成物が、心筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、膵細胞、腎細胞、血管内皮細胞、上皮細胞からなる群から選択される1又は2以上の細胞を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- シート状細胞群が培養されている刺激応答性培養基材に刺激を与え、前記刺激応答性培養基材から細胞シートを剥離させるための刺激手段を具備した載置台と、
前記細胞シートを付着させるための培養細胞移動治具と、
前記培養細胞移動治具を取り付けて、前記培養細胞移動治具に1g〜30g/cm2の荷重をかけるためのアームと、
細胞シートにトロンビン又はフィブリノーゲンを塗布する第1細胞接着性物質塗布手段と、
シート状細胞群にトロンビン又はフィブリノーゲンを塗布する第2細胞接着性物質塗布手段と、
を備えた、積層化細胞シート組成物の製造装置。 - 前記載置台に載置された前記刺激応答性培養基材上の第1シート状細胞群の上面に、前記培養細胞移動治具を接触させ、前記刺激手段によって前記刺激応答性培養基材上の該第1シート状細胞群が剥離される刺激を与えて、得られる第1細胞シートを前記培養細胞移動治具に付着させ、
前記載置台に載置された第2シート状細胞群の上面、及び、前記第1細胞シートの下面に、前記第1及び第2細胞接着性物質塗布手段によって供給されるトロンビン又はフィブリノーゲンを塗布し、
前記培養細胞移動治具に付着した該第1細胞シートの下面を、前記第2シート状細胞群の上面に接触させ、前記刺激手段によって前記刺激応答性培養基材上の前記第2シート状細胞群が剥離される刺激を与えると同時に、前記培養細胞移動治具に1g〜30g/cm2の荷重をかけて、得られる第2細胞シートを前記第1細胞シートに迅速に積層することを特徴とするものであって、
ここで、前記第2シート状細胞群の上面には、フィブリノーゲンを塗布し、前記第1細胞シートの下面には、トロンビンを塗布する、又は、
前記第2シート状細胞群の上面には、トロンビンを塗布し、前記第1細胞シートの下面には、フィブリノーゲンを塗布する、
請求項8に記載の積層化細胞シート組成物の製造装置。
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