JP6865265B2 - 細胞塊または細胞構造体の包埋剤、細胞塊または細胞構造体含有組成物およびキット - Google Patents
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Description
特許文献1(特開2004−357694)には、組織由来幹細胞の細胞塊を使って骨軟骨再生を実施する方法が記載されている。また、特許文献2(国際公開WO2011/108517号)には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献2に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献2の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。特許文献3(特開2005−35945号公報)には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。特許文献3の実施例においては、細胞移植用細胞構造体を用いて血管形成が評価されている。
式1: A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件X:ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の80%以上である。
[2] ポリペプチドがリコンビナントゼラチンである、[1]に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
[3] ポリペプチドが、下記式2で示されるポリペプチドである、[1]または[2]に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
式2: Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly
式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
[4] ポリペプチドが、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、または(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、[1]〜[3]のいずれか一に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
[5] ポリペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する、[1]〜[4]のいずれか一に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
[6] 細胞塊または細胞構造体と、[1]〜[5]のいずれか一に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤とを含み、上記細胞塊または細胞構造体が上記細胞塊または細胞構造体の包埋剤により包埋されている、細胞塊または細胞構造体含有組成物。
[7] 細胞塊または細胞構造体と、[1]〜[5]のいずれか一に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤とを含む、キット。
式1: A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件X:ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の80%以上である。
[9] 細胞塊または細胞構造体の包埋剤の製造のための、下記式1で示され、かつ分子量分布が下記条件Xを満たすポリペプチドの使用。
式1: A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件X:ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の80%以上である。
[10] 細胞塊または細胞構造体を、下記式1で示され、かつ分子量分布が下記条件Xを満たすポリペプチドで包埋することを含む、細胞塊または細胞構造体の包埋方法。
式1: A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件X:ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の80%以上である。
<細胞塊または細胞構造体の包埋剤>
本発明の細胞塊または細胞構造体の包埋剤は、下記式1で示され、かつ分子量分布が下記条件Xを満たすポリペプチドを含む、細胞塊または細胞構造体の包埋剤である。
式1: A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件X:ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の80%以上である。
上記式1で示されるポリペプチドは、溶液の状態で(低温度ではない条件)細胞塊または細胞構造体を包埋し、温度を低下させることにより、ゲル化し、輸送に適した状態となる。なお、細胞の保存の観点でも、輸送の際には低温とする必要がある。また、本発明においては、ポリペプチドが、条件X(ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の80%以上である)を満たすことにより、低温(4℃)でのゲル化と室温(25℃)での溶解とがシャープになり、細胞塊または細胞構造体移植時に、室温において簡便に、細胞塊または細胞構造体の包埋剤から細胞塊または細胞構造体を回収することが可能になる。
上記式1において、nは3〜100の整数であり、好ましくは15〜70の整数であり、より好ましくは50〜65の整数である。
本発明で用いるポリペプチドのGRAVY値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
本発明で用いるポリペプチドは、好ましくはリコンビナントゼラチンである。
リコンビナントゼラチンとしては、例えばEP1014176、米国特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
この最小アミノ酸配列の含有量は、タンパク質1分子中3〜50個が好ましく、さらに好ましくは4〜30個、特に好ましくは5〜20個である。最も好ましくは12個である。
式2: Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly
式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列;または
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上)の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列:
を有する。
なお、生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。
リコンビナントゼラチンは、最も好ましくは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する。
%配列同一性=[(同一残基数)/(アラインメント長)]×100
2つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、BLAST((Basic Local Alignment Search Tool))プログラム(J.Mol.Biol.215:403−410,1990)等を使用して決定することができる。
本発明の細胞塊または細胞構造体の包埋剤の形態は特に限定されず、式1で示され、かつ分子量分布が条件Xを満たすポリペプチドを含む限り、任意の形態とすることができる。例えば、溶液(水溶液など)、懸濁液、粉末、またはゲルなどの何れでもよい。粉末、またはゲル等の場合には使用時に、水などの溶媒に溶解して使用することができる。
本発明の細胞塊または細胞構造体の包埋剤を適用する細胞塊または細胞構造体については、本明細書中後記する。
本発明はさらに、細胞塊または細胞構造体と、本発明の細胞塊または細胞構造体の包埋剤とを含み、上記細胞塊または細胞構造体が上記細胞塊または細胞構造体の包埋剤により包埋されている、細胞塊または細胞構造体含有組成物に関する。
本発明における細胞塊とは、細胞が複数個会合して一つの塊になった状態であり、一つの塊の直径が100μm以上、かつ、一つの塊の長軸÷短軸の値が200以下のものを意味する。
本発明における細胞構造体とは、細胞と細胞支持体とが接触または接着し、三次元的な形態を有するものを意味する。
細胞構造体としては、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体が好ましい。
(1)生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、及びMPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、ポリペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で表される、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、及びHAV配列)ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
生体親和性高分子として好適なポリペプチドは本発明で用いる式1で示されるポリペプチドと同様である。
生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、及びイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状(顆粒)の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
生体親和性高分子ブロックの大きさは、好ましくは1μm以上700μm以下であり、より好ましくは10μm以上700μm以下であり、さらに好ましくは10μm以上300μm以下であり、さらに好ましくは20μm以上150μm以下である。
本発明における細胞塊または細胞構造体または細胞構造体には、細胞塊または細胞構造体または細胞構造体を形成し得る任意の細胞が含まれる。使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞(特に、ヒト由来細胞)の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよく、特に好ましくは体性幹細胞である。
本発明における細胞構造体は、上記した生体親和性を有する高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の該高分子ブロックをモザイク状に3次元的に配置させたものである。
細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることが出来るが、下限としては、150μm以上であることが好ましく、215μm以上がさらに好ましく、400μm以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては3cm以下が好ましく、2cm以下がより好ましく、1cm以下であることが更に好ましい。
上記した細胞塊または細胞構造体を本発明の細胞塊または細胞構造体の包埋剤により包埋することによって、細胞塊または細胞構造体含有組成物を製造することができる。包埋の方法は特に限定されないが、細胞塊または細胞構造体を含む容器に、本発明の包埋剤(好ましくは溶液)を添加して、低温(例えば、2〜12℃)で冷却することによって、溶液をゲル化させることができる。上記により、細胞塊または細胞構造体が細胞塊または細胞構造体の包埋剤により包埋されている細胞塊または細胞構造体含有組成物を製造することができる。
本発明によればさらに、上記した細胞塊または細胞構造体と、本発明の細胞塊または細胞構造体の包埋剤とを含む、キットが提供される。細胞塊または細胞構造体および細胞塊または細胞構造体の包埋剤の詳細、好ましい態様は本明細書中上記した通りである。キットにはさらに、包埋処理を行うための容器、および取扱説明書などが含まれていてもよい。
リコンビナントゼラチンとして以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
上記(1)に記載のリコンビナントゼラチンCBE3(実施例1)について、ゲル浸透クロマトグラフ(GPC)を用いて分子量分布の測定を実施した。分子量分布の測定はHPLC(Waters社製AQUITY UPLCシステムEmpower2)を使用し、緩衝液には100mmol/Lリン酸バッファー(pH6.8)を用いた。これらを用いてリコンビナントゼラチンの分子量分布の相対性を測定した。
比較として、天然動物ゼラチン(比較例1)について、上記(2)と同様にGPCを用いて分子量分布の測定を実施した。結果を図2に示す。天然動物ゼラチンの分子量ピークが2つ存在していた。それら2つのピークについて面積比から全ピーク中の占有率を計算したところ、1つ目のピークが47.6%、2つ目のピークが52.4%となっていた。このことから、天然動物ゼラチンは占有率の高いピークとして、52%の分子量ピークを有することが分かった。
細胞塊または細胞構造体を輸送する際の包埋剤として使うためには、低温でのゲル化速度が速く、逆に可逆反応である常温下では素早く液体に戻る性能が重要となる。そこで1質量%濃度で、低温でのゲル化速度、常温での液体へ戻る速さを試験した。
具体的には、CBE3では4℃に移すことで40分後からゲル化が始まり50分後にはほぼ安定なゲルになった。また、そのゲルは強度があり、手で押してもつぶれることのないゲルであった。そのゲルを25℃の室温に戻すと、40分で完全な液体に戻った。
具体的には、天然動物ゼラチンでは、4℃に移すことで60分後からゲル化が始まるが、90分後でもゆるいゲル状にしかならなかった。その後も強度のあるゲルには移行せず、手で押すと簡単に潰れる程度のゆるいゲル状でとどまった。ゲル状のものを25℃の室温に戻した場合、天然動物ゼラチンでは完全な液体に戻るまでに、70分要した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKit(商標))に懸濁し、そこにWO2015046216 A1と同様の生体親和性高分子ブロック(53−106μm)を加えて、最終的にhMSC(1.2×106c ells)と生体親和性高分子ブロック(1mg)が4mLの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の35mmディッシュであるEZSPHERE(登録商標)ディッシュType903(スフェロイドウェル口径800μm、スフェロイドウェル深さ300μm、スフェロイドウェル数〜約1,000ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。AGCテクノグラス製)に播種した。69時間培養することで約1,000個の細胞構造体を得た。尚、別途、生体親和性高分子ブロックを加えずに同様の作業をすることで細胞塊も得られた。
得られた細胞構造体、または細胞塊を数個ずつ96well plateに分取し、1質量%CBE3を含むHBSS+(Thermo Fisher Scientific社製)200uLを添加し,2〜8℃で1時間冷却してゲル化させ、CBE3包埋細胞塊またはCBE3包埋細胞構造体を作製した。HBSSは、Hanks’ Balanced Salt solutionの略称である。
(6−1)
上記(5)で作製したCBE3包埋細胞塊またはCBE3包埋細胞構造体をMicroPlateMixer(NS−P,アズワン製)に載せ、最大振とう数に設定し2〜8℃で2日間振とうさせた。対照として、細胞塊または細胞構造体にCBE3を含まないHBSS+を添加して、同様に振とうさせた。振とう後,CBE3包埋細胞塊またはCBE3包埋細胞構造体を室温に静置し、ゲルを融解して細胞塊または細胞構造体を回収した。振とう前および振とう後の細胞構造体の形状を図3に示す。
1質量%CBE3を含むHBSS+を添加して、振とうさせた後に回収した細胞塊または細胞構造体を培養したところ、細胞塊また細胞構造体同士が融合することが確認された。これは細胞塊また細胞構造体中の細胞が生存していることを示しており、十分にその性能を発揮できる細胞塊または細胞構造体であることが確認された。
Claims (7)
- 下記式1で示され、かつ分子量分布が下記条件Xを満たすポリペプチドを含む、細胞塊または細胞構造体の包埋剤であって、
ポリペプチドが、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、または(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、包埋剤。
式1: A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件X:ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の80%以上である。 - ポリペプチドがリコンビナントゼラチンである、請求項1に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
- ポリペプチドが、下記式2で示されるポリペプチドである、請求項1または2に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
式2:Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly
式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。 - ポリペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
- 細胞構造体において、生体親和性高分子ブロックと細胞とが交互に配置されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤。
- 細胞塊または細胞構造体と、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤とを含み、前記細胞塊または細胞構造体が前記細胞塊または細胞構造体の包埋剤により包埋されている、細胞塊または細胞構造体含有組成物。
- 細胞塊または細胞構造体と、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞塊または細胞構造体の包埋剤とを含む、キット。
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