WO2017057547A1 - シート状細胞構造体の製造方法及びシート状細胞構造体 - Google Patents

シート状細胞構造体の製造方法及びシート状細胞構造体 Download PDF

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中村　健太郎
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富士フイルム株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sheet-like cell structure and a sheet-like cell structure.
  • Regenerative medicine is being put to practical use to regenerate living tissues and organs that have fallen into dysfunction or dysfunction.
  • Regenerative medicine is a new medicine that regenerates the same form and function as the original tissue using the three factors of cells, scaffolding, and growth factors from living tissue that can not be recovered only by the natural healing ability of the living body.
  • Technology. In recent years, treatment using cells is gradually being realized. For example, when performing regenerative medicine using cells for the treatment of cardiomyopathy or the like, cell sheet engineering may be used because it is easily pasted on the organ surface (for example, Patent Document 1).
  • Patent Document 2 describes a cell structure including a polymer block having biocompatibility and a cell, wherein a plurality of the polymer blocks are arranged in a gap between the plurality of cells. Yes.
  • nutrients can be delivered from the outside to the inside of the cell structure, and the cell structure has a sufficient thickness and cells are uniformly present in the structure.
  • high cell survival activity has been demonstrated using a polymer block made of recombinant gelatin or a natural gelatin material.
  • Patent Document 3 a plurality of depressions forming a compartment in which a culture object is cultured are formed on the surface of the culture substrate, and the culture substrate surface between the depressions adjacent to each other is a non-flat surface.
  • a culture substrate characterized by the above is described, and spheroid culture using the culture substrate is described.
  • Patent Document 4 discloses a culture surface in which a plurality of depressions that form a compartment in which a culture is cultured, a container body having a culture surface on the bottom, and a depression placed on top of the plurality of depressions.
  • the culture surface has a non-planar surface between the recesses adjacent to each other, and the liquid-permeable lid is immersed in the culture medium in the container body.
  • a cell for performing spheroid culture characterized in that the distance from the apex between the depressions in a state of being formed is arranged to be smaller than the outer diameter of the culture object cultured in the depressions
  • a culture vessel is described.
  • Patent Document 1 In the case of the cell sheet described in Patent Document 1, there is a problem that a cell sheet having a sufficient thickness cannot be produced because nutrients and oxygen do not reach the cells.
  • Patent Document 2 describes a method for producing a cell structure including a biocompatible polymer block and cells. Specifically, producing a sheet having excellent strength and shape maintenance performance is described. Not listed.
  • Patent Documents 3 and 4 describe that spheroid culture is performed using a predetermined cell culture vessel, but there is no description about manufacturing a cell sheet.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a sheet-like cell structure excellent in strength and shape maintenance performance, and a sheet-like cell structure excellent in strength and shape maintenance performance.
  • the present inventors have added a biocompatible polymer block, cells, and a liquid medium on a culture support having a plurality of depressions on the culture surface. It has been found that a sheet-like cell structure excellent in strength and shape maintenance performance can be produced by immersing the functional polymer block and cells in the uppermost part of the depression and culturing the cells in the above state.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • a biocompatible polymer block, cells, and a liquid medium are added to a culture support having a plurality of depressions on the culture surface, and the bioaffinity polymer block and the cells are placed at the bottom of the depressions. Dipping in the upper part; and culturing the cells to obtain a sheet-like cell structure; A method for producing a sheet-like cell structure.
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence
  • n Xs independently represent any of the amino acids
  • n Ys each independently represent an amino acid.
  • N represents an integer of 3 to 100
  • m represents an integer of 2 to 10.
  • the n Gly-XYs may be the same or different.
  • Recombinant gelatin is A peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having biocompatibility; or 80% or more of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 A peptide having an amino acid sequence having the following sequence identity and having biocompatibility; The method for producing a sheet-like cell structure according to (8) or (9), wherein
  • a sheet-like cell structure including a biocompatible polymer block and cells, and having a plurality of protrusions on at least one surface, wherein a plurality of protrusions are provided in the gaps between the plurality of cells in the protrusions.
  • Recombinant gelatin is A peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having biocompatibility; or 80% or more of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 A peptide having an amino acid sequence having the following sequence identity and having biocompatibility; The sheet-like cell structure according to (14) or (15), wherein
  • a sheet-like cell structure having excellent strength and shape maintenance performance can be produced. Since the sheet-like cell structure of the present invention is excellent in strength and shape maintenance performance, handling performance is improved and it is easy to install on the organ surface.
  • FIG. 1 is a perspective view of a culture vessel having a culture support.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a first example of the culture support (the culture support surface between the recesses is non-flat).
  • FIG. 2 (a) shows an example without a cell adhesion inhibitor layer
  • FIG. 2 (b) shows an example with a cell adhesion inhibitor layer.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of a second example of the culture support (the culture support surface between the depressions is flat).
  • FIG. 3 (a) shows an example without a cell adhesion inhibitor layer
  • FIG. 3 (b) shows an example with a cell adhesion inhibitor layer.
  • FIG. 4 is a partially enlarged view of FIG.
  • FIG. 5 is a partially enlarged view of FIG. FIG.
  • FIG. 6 shows an irradiation spot of laser light on the surface of the culture support.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of the sheet-like cell structure of the present invention.
  • FIG. 8 shows a liquid temperature profile under condition A of the example.
  • FIG. 9 shows a liquid temperature profile under condition B of the example.
  • FIG. 10 shows a liquid temperature profile under condition C of the example.
  • FIG. 11 shows the results of producing a sheet-like cell structure having a protrusion.
  • FIG. 12 shows a summary of the results of the example and the comparative example.
  • a biocompatible polymer block, cells, and a liquid medium are added to a culture support having a plurality of depressions on the culture surface, and the biocompatible polymer is added.
  • a biocompatible polymer block, cells and a liquid medium are added to a culture support having a plurality of depressions on the culture surface, the biocompatible polymer block and the cells are cultured. Is cultured in a state of being immersed in the uppermost part of the depression. That is, it is necessary to use a biocompatible polymer block and cells in an amount exceeding the top of the depression.
  • a sheet-like cell structure can be produced by culturing in a state where the biocompatible polymer block and the cells are immersed in the uppermost part of the depression.
  • a brittle sheet-like cell structure is obtained.
  • the sheet is excellent in strength and shape maintenance performance (not rounded). It has been found that cell structures can be produced.
  • Patent Documents 3 and 4 describe a culture support having a plurality of depressions on the culture surface.
  • Patent Documents 3 and 4 it is described that individual spheroids are manufactured in each recess (that is, one spheroid is manufactured per one recess) and a large number of spheroids are manufactured simultaneously.
  • Patent Documents 3 and 4 do not describe the use of biocompatible polymer blocks.
  • the cell support having a flat surface is manufactured with a cell support having a depression on the surface. Better results are obtained.
  • the surface is more flat when produced with a cell support having a depression on the surface. It has been found by the present invention that better results are obtained than when produced with certain cell supports.
  • a sheet-like cell structure excellent in strength and shape maintenance performance can be produced easily and in a short time.
  • cells and biocompatible polymer blocks are The opposite of the more preferred cell support morphology, when used, indicates that the effects of the present invention were totally unexpected.
  • the sheet-like cell structure produced by the method of the present invention includes a biocompatible polymer block and cells.
  • the cell structure may be referred to as a mosaic cell mass (a cell mass in a mosaic shape).
  • Culture support In the present invention, a culture support having a plurality of depressions on the culture surface is used. Examples of the culture support used in the present invention will be described with reference to FIGS.
  • a culture support 1 is the main part of a culture vessel for producing a sheet-like cell structure by culturing a biocompatible polymer block and cells.
  • the culture container has a container body 10 and a lid 12.
  • the bottom plate portion 14 inside the container body 10 is a portion corresponding to the culture support 1.
  • the bottom plate part 14 inside the container body 10, that is, the culture support 1 may be made of a synthetic resin material such as polystyrene or glass, for example.
  • the culture support 1 can be manufactured by injection molding using a synthetic resin material.
  • the container main body 10 has a disk-shaped bottom plate portion 14 and an annular side wall portion 16.
  • the shape of the container may be a shape other than a disk shape or a square shape.
  • the side wall portion 16 stands from the outer peripheral edge of the bottom plate portion 14.
  • the diameter of the bottom plate portion 14 can be, for example, 30 mm to 500 mm
  • the thickness of the bottom plate portion 14 can be, for example, 0.5 mm to 10 mm
  • the height of the side wall portion 16 can be, for example, 20 mm to 100 mm.
  • the lid 12 is formed in the container body 10 in a shape corresponding to the upper opening.
  • the lid 12 can be used by being put on the container body 10 in order to maintain a cell culture environment.
  • a plurality of depressions 20 are formed.
  • the inner surface of the recess 20 is a smooth concave surface.
  • the depression 20 forms a compartment (well) in which the culture object is cultured.
  • the cell adhesion inhibitor layer 30 is provided.
  • the depth of the recess is not particularly limited, but is preferably 10 to 2000 ⁇ m, more preferably 20 to 1000 ⁇ m, still more preferably 30 to 700 ⁇ m, still more preferably 50 to 500 ⁇ m, and most preferably 100 to 400 ⁇ m.
  • the diameter of the recess is not particularly limited, but is preferably 10 to 2000 ⁇ m, more preferably 50 to 1500 ⁇ m, still more preferably 100 to 1500 ⁇ m, still more preferably 200 to 1000 ⁇ m, and most preferably 400. ⁇ 800 ⁇ m. It is preferable that the depth and the diameter of the dent are in the above ranges from the viewpoint of obtaining a sheet-like cell structure excellent in strength and shape maintenance performance in relation to the cell size. In addition, when a hollow part has said depth and diameter, all the hollow parts on a culture support body do not need to have said depth and diameter, and at least one hollow part is said depth. And may have a diameter.
  • the depth of the recess means the height between the lowermost part and the uppermost part of the recess.
  • the diameter of the hollow portion means a length connecting the uppermost points of the hollow portion.
  • the uppermost part of a hollow part is selected so that the length which tied the point of the uppermost part of the hollow part may become the shortest.
  • the shape of the depression may be uniform or non-uniform, but is preferably uniform. It is preferable that the depth and the diameter of the recess are uniform, and it is preferable that the depth and the diameter of all the recesses are substantially the same.
  • the depression 20 can be formed by irradiating the well formation region 24 on the surface of the culture support with laser light. As shown in FIG. 6, laser irradiation is performed by irradiating the upper surface of the bottom plate portion 14 installed on the xy plane with laser light in the z-axis direction.
  • laser light is irradiated at regular intervals (for example, 800 ⁇ m) to form a plurality of depressions 20 aligned in the x axis direction.
  • the laser beam is irradiated at regular intervals (for example, 800 ⁇ m) while the irradiation unit is scanned in the negative direction of the x-axis.
  • a plurality of depressions 20 arranged in the x-axis direction are formed.
  • the irradiation unit is scanned by a certain distance (for example, 400 ⁇ m) in the y-axis direction. By repeating this, a plurality of depressions 20 regularly arranged on the upper surface of the bottom plate part 14 are formed.
  • the center coordinate (x, y) of the irradiation spot A is the origin (0, 0)
  • the center of the irradiation spot B close to the irradiation spot A is (0.8, 0)
  • the center of the irradiation spot C is (0.4, 0.4)
  • the center of the irradiation spot D is ( ⁇ 0.4, 0.4).
  • a CO 2 laser is used as the laser light source, and the laser beam can be irradiated with pulses at an output of 10 W and an irradiation speed of 6100 mm / min, but is not particularly limited.
  • the opening shape of the hollow portion 20 is flattened into a substantially elliptical shape. The flatness of the opening shape is considered to be caused by the direction in which the synthetic resin material is poured into the mold when the container body 10 is molded.
  • the distance between the adjacent depressions 20, the diameter / depth of the depressions 20, and the width of the culture substrate surface between the depressions 20 adjacent to each other ⁇ Height can be adjusted.
  • the culture support 1 is manufactured by injection-molding a synthetic resin material using a mold having a convex portion that forms a plurality of hollow portions 20 and a concave portion that forms a culture support surface between the hollow portions. You can also.
  • the culture support surface between the plurality of depressions 20 and the depressions is formed simultaneously with the formation of the culture substrate 1.
  • the area of the depression on the culture surface is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and 100% with respect to the total area of the culture surface. Most preferably it is. It is preferable from the viewpoint of the effect of the present invention that the ratio of the area of the recesses is in the above range.
  • the area of the dent means the area when the dent is observed in two dimensions when the dent is observed from above, and means the area defined by the diameter of the dent described above in this specification. To do. As shown in FIG. 2 or FIG. 4, when there is no flat part on the culture surface, the area of the depression on the culture surface is 100% with respect to the total area of the culture surface.
  • the two depressions 20 adjacent to each other are formed via the culture support surface between the depressions.
  • the surface of the culture substrate between the recesses 20 adjacent to each other may be flat or non-flat, but is preferably non-flat.
  • the upper surface of the bottom plate portion 14, that is, the culture surface of the culture support is subjected to a treatment for suppressing cell adhesion.
  • a treatment for suppressing cell adhesion include coating with a cell adhesion inhibitor (see FIG. 2 (b) and FIG. 3 (b)).
  • the cell adhesion inhibitor plays a role of inhibiting cells from adhering to the upper surface of the bottom plate portion 14, particularly the inner surface of the recess portion 20.
  • the cell adhesion inhibitor for example, phospholipid polymer, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), polyhydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol or the like is used.
  • Bioaffinity polymer block (2-1) Bioaffinity polymer Bioaffinity refers to significant adverse reactions such as long-term and chronic inflammatory reactions when in contact with the living body. Does not provoke.
  • the biocompatible polymer used in the present invention is not particularly limited as to whether or not it is degraded in vivo as long as it has affinity for the living body, but is preferably a biodegradable polymer.
  • Specific examples of non-biodegradable materials include polytetrafluoroethylene (PTFE), polyurethane, polypropylene, polyester, vinyl chloride, polycarbonate, acrylic, stainless steel, titanium, silicone, and MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine). Can be mentioned.
  • biodegradable material examples include polypeptides such as naturally occurring peptides, recombinant peptides or chemically synthesized peptides (for example, gelatin described below), polylactic acid, polyglycolic acid, and lactic acid / glycolic acid copolymers. (PLGA), hyaluronic acid, glycosaminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethylcellulose, chitin, and chitosan.
  • a recombinant peptide is particularly preferable.
  • biocompatible polymers may be devised to enhance cell adhesion.
  • Cell adhesion substrate fibronectin, vitronectin, laminin
  • cell adhesion sequence expressed in amino acid one letter code, RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, RYVVLPR sequence, LGTIPPG sequence, RNIAEIIKDI sequence, IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence
  • Coating with peptide “Amination of substrate surface, cationization”, or “Plasma treatment of substrate surface, hydrophilic treatment by corona discharge”, etc. You can use the method.
  • polypeptide including recombinant peptide or chemically synthesized peptide is not particularly limited as long as it has biocompatibility.
  • gelatin, collagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, enteractin, thrombosis Spongein and retronectin are preferred, and gelatin, collagen and atelocollagen are most preferred.
  • the gelatin for use in the present invention is preferably natural gelatin, recombinant gelatin, or chemically synthesized seratin, and more preferably recombinant gelatin.
  • natural gelatin means gelatin made from naturally derived collagen.
  • a chemically synthesized peptide or chemically synthesized gelatin means an artificially synthesized peptide or gelatin.
  • the peptide such as gelatin may be synthesized by solid phase synthesis or liquid phase synthesis, but is preferably solid phase synthesis.
  • Solid-phase synthesis of peptides is known to those skilled in the art. For example, Fmoc group synthesis method using Fmoc group (Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl group) as amino group protection, and Boc group (tert-Butyl group) as amino group protection Boc group synthesis method using Oxy Carbonyl group).
  • the preferred embodiment of the chemically synthesized gelatin can be applied to the contents described in (2-3) Recombinant gelatin described later in this specification. Recombinant gelatin will be described later in this specification.
  • the hydrophilicity value “1 / IOB” value of the biocompatible polymer used in the present invention is preferably from 0 to 1.0. More preferably, it is 0 to 0.6, and still more preferably 0 to 0.4.
  • IOB is an index of hydrophilicity / hydrophobicity based on an organic conceptual diagram representing the polarity / non-polarity of an organic compound proposed by Satoshi Fujita. Details thereof can be found in, for example, “Pharmaceutical Bulletin”, vol.2, 2, pp .163-173 (1954), “Area of Chemistry” vol.11, 10, pp.719-725 (1957), “Fragrance Journal”, vol.50, pp.79-82 (1981), etc. Yes.
  • methane (CH 4 ) is the source of all organic compounds, and all the other compounds are all methane derivatives, with certain numbers set for their carbon number, substituents, transformations, rings, etc. Then, the score is added to obtain an organic value (OV) and an inorganic value (IV), and these values are plotted on a diagram with the organic value on the X axis and the inorganic value on the Y axis. It is going.
  • the IOB in the organic conceptual diagram refers to the ratio of the inorganic value (IV) to the organic value (OV) in the organic conceptual diagram, that is, “inorganic value (IV) / organic value (OV)”.
  • hydrophilicity / hydrophobicity is represented by a “1 / IOB” value obtained by taking the reciprocal of IOB. The smaller the “1 / IOB” value (closer to 0), the more hydrophilic it is.
  • the hydrophilicity is high and the water absorption is high, so that it effectively acts to retain nutrient components.
  • the hydrophilicity / hydrophobicity index represented by the Grand average of hydropathicity (GRAVY) value is preferably 0.3 or less, preferably minus 9.0 or more, More preferably, it is 0.0 or less and minus 7.0 or more.
  • Grand average of hydropathicity (GRAVY) values are based on Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A .; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) .pp.
  • the biocompatible polymer used in the present invention may be cross-linked or non-cross-linked, but is preferably cross-linked.
  • a cross-linked biocompatible polymer it is possible to obtain an effect of preventing instantaneous degradation when cultured in a culture medium or transplanted to a living body.
  • crosslinking methods include thermal crosslinking, crosslinking with aldehydes (eg, formaldehyde, glutaraldehyde, etc.), crosslinking with condensing agents (carbodiimide, cyanamide, etc.), enzyme crosslinking, photocrosslinking, UV crosslinking, hydrophobic interaction, Hydrogen bonding, ionic interaction, and the like are known, and the above-described crosslinking method can also be used in the present invention.
  • the crosslinking method used in the present invention is more preferably thermal crosslinking, ultraviolet crosslinking, or enzyme crosslinking, and particularly preferably thermal crosslinking.
  • the enzyme When performing cross-linking with an enzyme, the enzyme is not particularly limited as long as it has a cross-linking action between polymer materials, but preferably trans-glutaminase and laccase, most preferably trans-glutaminase can be used for cross-linking.
  • a specific example of the protein that is enzymatically cross-linked with transglutaminase is not particularly limited as long as it is a protein having a lysine residue and a glutamine residue.
  • the transglutaminase may be derived from a mammal or may be derived from a microorganism. Specifically, transglutaminase derived from a mammal that has been marketed as an Ajinomoto Co., Ltd.
  • Human-derived blood coagulation factors Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc.
  • Factor XIIIa Haematologic Technologies, Inc.
  • guinea pig liver-derived transglutaminase goat-derived transglutaminase
  • rabbit-derived transglutaminase from Oriental Yeast Co., Ltd., Upstate USA Inc., Biodesign Bio International, etc. Etc.
  • the reaction temperature at the time of performing crosslinking is not particularly limited as long as crosslinking is possible, but is preferably ⁇ 100 ° C. to 500 ° C., more preferably 0 ° C. to 300 ° C., and still more preferably. It is 50 ° C to 300 ° C, more preferably 100 ° C to 250 ° C, and further preferably 120 ° C to 200 ° C.
  • the recombinant gelatin referred to in the present invention means a polypeptide or protein-like substance having an amino acid sequence similar to gelatin produced by a gene recombination technique.
  • the recombinant gelatin that can be used in the present invention preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y each independently represents an amino acid).
  • Gly-XY may be the same or different.
  • two or more cell adhesion signals are contained in one molecule.
  • recombinant gelatin used in the present invention recombinant gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen can be used.
  • EP1014176, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • a preferable example of the recombinant gelatin used in the present invention is the recombinant gelatin of the following embodiment.
  • Recombinant gelatin has excellent biocompatibility due to the inherent performance of natural gelatin, and is not naturally derived, so there is no concern about bovine spongiform encephalopathy (BSE) and excellent non-infectivity. Recombinant gelatin is more uniform than natural ceratin and its sequence is determined, so that strength and degradability can be precisely designed with less blur due to cross-linking and the like.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • the molecular weight of the recombinant gelatin is not particularly limited, but is preferably 2000 or more and 100000 or less (2 kDa or more and 100 kDa or less), more preferably 2500 or more and 95000 or less (2.5 kDa or more and 95 kDa or less), and further preferably 5000 or more and 90000 or less. Or less (5 kDa or more and 90 kDa or less), and most preferably 10000 or more and 90000 or less (10 kDa or more and 90 kDa or less).
  • Recombinant gelatin preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acid (preferably any amino acid other than glycine).
  • the sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen, is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin / collagen compared to other proteins. In this part, glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, it is one in three repeats.
  • Glycine is the simplest amino acid, has few constraints on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to the regeneration of the helix structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y are rich in imino acids (proline, oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • 80% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of the amino acid sequence of the recombinant gelatin is a Gly-XY repeating structure.
  • polar amino acids are charged and uncharged at 1: 1.
  • the polar amino acid specifically refers to cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and arginine, and among these polar uncharged amino acids are cysteine, asparagine, glutamine, serine. Refers to threonine and tyrosine.
  • the proportion of polar amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%, of all the constituent amino acids.
  • the proportion of uncharged amino acids in the polar amino acid is preferably 5% or more and less than 20%, preferably less than 10%. Furthermore, it is preferable that any one amino acid, preferably two or more amino acids among serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine are not included in the sequence.
  • the minimum amino acid sequence that acts as a cell adhesion signal in a polypeptide is known (for example, “Pathophysiology”, Vol. 9, No. 7 (1990), page 527, published by Nagai Publishing Co., Ltd.).
  • the recombinant gelatin used in the present invention preferably has two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • Specific sequences include RGD sequences, LDV sequences, REDV sequences, YIGSR sequences, PDSGR sequences, RYVVLPR sequences, LGITIPG sequences, RNIAEIIKDI sequences, which are expressed in one-letter amino acid notation in that many types of cells adhere.
  • IKVAV sequences IKVAV sequences, LRE sequences, DGEA sequences, and HAV sequences are preferred. More preferred are RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence and HAV sequence, and particularly preferred is RGD sequence. Of the RGD sequences, an ERGD sequence is preferred.
  • the amount of cell substrate produced can be improved. For example, in the case of cartilage differentiation using mesenchymal stem cells as cells, production of glycosaminoglycan (GAG) can be improved.
  • GAG glycosaminoglycan
  • the number of amino acids between RGDs is not uniform between 0 and 100, preferably between 25 and 60.
  • the content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 per protein molecule from the viewpoint of cell adhesion / proliferation. Most preferably, it is 12.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%.
  • each stretch of 350 amino acids contains at least one RGD motif.
  • the ratio of RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, more preferably at least 0.8%, more preferably at least 1.0%, more preferably at least 1.2%. And most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the recombinant peptide is preferably at least 4, more preferably 6, more preferably 8, more preferably 12 or more and 16 or less per 250 amino acids.
  • a ratio of 0.4% of the RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids. Since the number of RGD motifs is an integer, a gelatin of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences to meet the 0.4% feature.
  • the recombinant gelatin of the present invention comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably comprises at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 4 per 250 amino acids. Contains the RGD sequence. As a further aspect of the recombinant gelatin of the present invention, it contains at least 4 RGD motifs, preferably 6, more preferably 8, more preferably 12 or more and 16 or less.
  • Recombinant gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the recombinant gelatin used in the present invention is represented by the formula 1: A-[(Gly-XY) n ] m -B.
  • n Xs independently represents any of amino acids
  • n Ys independently represents any of amino acids.
  • m is preferably an integer of 2 to 10, more preferably an integer of 3 to 5.
  • n is preferably an integer of 3 to 100, more preferably an integer of 15 to 70, and most preferably an integer of 50 to 65.
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence.
  • the n Gly-XYs may be the same or different.
  • the recombinant gelatin used in the present invention has the formula: Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly (wherein 63 X independently represent any of the amino acids). 63 Y's each independently represent any of the amino acids, wherein 63 Gly-XY may be the same or different.
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, or type V collagen. More preferred is type I, type II, or type III collagen.
  • the collagen origin is preferably human, bovine, porcine, mouse or rat, more preferably human.
  • the isoelectric point of the recombinant gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and further preferably 7 to 9.5.
  • the measurement of the isoelectric point of recombinant gelatin was described in the isoelectric focusing method (see Maxey, CR (1976; Phitogr. Gelatin 2, Editor Cox, PJ Academic, London, Engl.). As described above, it can be carried out by measuring the pH after passing a 1% by weight gelatin solution through a mixed crystal column of cation and anion exchange resin.
  • the recombinant gelatin is not deaminated.
  • the recombinant gelatin has no telopeptide.
  • the recombinant gelatin is a substantially pure polypeptide prepared with a nucleic acid encoding an amino acid sequence.
  • a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (2) A peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having biocompatibility; or (3) described in SEQ ID NO: 1 A peptide having an amino acid sequence and an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more (more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, most preferably 98% or more) and having biocompatibility; Any of
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. Means, particularly preferably 1 to 3.
  • the recombinant gelatin used in the present invention can be produced by a genetic recombination technique known to those skilled in the art. For example, in EP1014176A2, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, etc. It can be produced according to the method described. Specifically, a gene encoding the amino acid sequence of a predetermined recombinant gelatin is obtained, and this is incorporated into an expression vector to produce a recombinant expression vector, which is introduced into an appropriate host to produce a transformant. . Recombinant gelatin is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium. Therefore, the recombinant gelatin used in the present invention can be prepared by recovering the recombinant gelatin produced from the culture. .
  • the block (lumps) made of the above-described biocompatible polymer is used.
  • the shape of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited. For example, amorphous, spherical, particulate (granule), powder, porous, fiber, spindle, flat and sheet, preferably amorphous, spherical, particulate (granule), powder And porous.
  • An indeterminate shape indicates that the surface shape is not uniform, for example, an object having irregularities such as rocks.
  • illustration of said shape is not different, respectively, For example, it may become an indefinite form as an example of the subordinate concept of a particulate form (granule).
  • the shape of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited as described above, but the tap density is preferably 10 mg / cm 3 or more and 500 mg / cm 3 or less, more preferably 20 mg / cm 3. It is 400 mg / cm 3 or less, more preferably 40 mg / cm 3 or more and 220 mg / cm 3 or less, and particularly preferably 50 mg / cm 3 or more and 150 mg / cm 3 or less.
  • the tap density is a value that indicates how many blocks can be densely packed in a certain volume. It can be seen that the smaller the value, the more densely packed, that is, the more complicated the block structure.
  • the tap density of the biocompatible polymer block represents the complexity of the surface structure of the biocompatible polymer block and the amount of voids formed when the biocompatible polymer block is collected as an aggregate. it is conceivable that. The smaller the tap density, the more voids between the biocompatible polymer blocks and the larger the cell engraftment area.
  • a biocompatible polymer block can appropriately exist between cells, and when a cell structure is formed, nutrients can be delivered to the inside of the structure. It is considered that it is preferable to be within the range.
  • the tap density as used in this specification can be measured as follows.
  • a container hereinafter referred to as a cap
  • a funnel is attached to the cap and the block is poured from the funnel so that the block accumulates in the cap.
  • tap the cap part 200 times on a hard place such as a desk, remove the funnel and clean with a spatula.
  • the mass is measured with the cap fully filled.
  • the degree of crosslinking of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 2 or more, more preferably 2 or more and 30 or less, still more preferably 4 or more and 25 or less, and particularly preferably 4 It is 22 or less.
  • the method for measuring the degree of cross-linking of the biocompatible polymer block is not particularly limited.
  • the TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) method described in Examples below will be used.
  • the biocompatible polymer block, the NaHCO 3 aqueous solution and the TNBS aqueous solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 3 hours, and then the reaction was stopped.
  • the biocompatible polymer block, the NaHCO 3 aqueous solution and the TNBS aqueous solution A blank whose reaction was stopped immediately after mixing was prepared, and the absorbance (345 nm) of the sample diluted with pure water and the blank was measured. From the following (Equation 2) and (Equation 3), the crosslinking degree (1 The number of crosslinks per molecule) can be calculated.
  • Forma 2 (As-Ab) / 14600 ⁇ V / w (Formula 2) shows the amount of lysine (molar equivalent) per 1 g of the biocompatible polymer block.
  • Ab is the blank absorbance
  • V is the amount of the reaction solution (g)
  • w is the biocompatible polymer block mass (mg).
  • the water absorption rate of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 300% or more, more preferably 400% or more, further preferably 500% or more, particularly preferably 700% or more, and most preferably 800. % Or more.
  • the upper limit of water absorption is not particularly limited, but is generally 4000% or less, or 2000% or less.
  • the method for measuring the water absorption rate of the biocompatible polymer block is not particularly limited, and for example, it can be measured by the method described in Examples below. Specifically, a biocompatible polymer block of about 15 mg is filled in a 3 cm ⁇ 3 cm nylon mesh bag at 25 ° C., swollen in ion exchange water for 2 hours, and then air-dried for 10 minutes. In this stage, the mass is measured, and the water absorption rate can be obtained according to (Equation 4).
  • the size of one biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ m or more and 700 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or more and 700 ⁇ m or less, further preferably 10 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less, Preferably they are 20 micrometers or more and 200 micrometers or less, More preferably, they are 20 micrometers or more and 150 micrometers or less, Especially preferably, they are 53 micrometers or more and 106 micrometers or less.
  • the size of one biocompatible polymer block does not mean that the average value of the sizes of a plurality of biocompatible polymer blocks is in the above range. It means the size of each biocompatible polymer block obtained by sieving the block.
  • the size of one block can be defined by the size of the sieve used to separate the blocks.
  • a block remaining on the sieve when the passed block is passed through a 106 ⁇ m sieve after passing through a 180 ⁇ m sieve can be a block having a size of 106 to 180 ⁇ m.
  • the block remaining on the sieve when the block passed through the sieve of 106 ⁇ m and the passed block is passed through the sieve of 53 ⁇ m can be a block having a size of 53 to 106 ⁇ m.
  • a block remaining on the sieve when the passed block is passed through a sieve of 53 ⁇ m and passed through a sieve of 25 ⁇ m can be made a block having a size of 25 to 53 ⁇ m.
  • the method for producing the bioaffinity polymer block is not particularly limited.
  • the solid material containing the bioaffinity polymer porous material of the bioaffinity polymer
  • the biocompatible polymer block can be obtained by pulverizing the material and the like using a pulverizer (such as a new power mill).
  • a solid (eg, a porous body) containing a biocompatible polymer can be obtained, for example, by lyophilizing an aqueous solution containing a biocompatible polymer.
  • an amorphous biocompatible polymer block having a nonuniform surface shape can be produced by pulverizing a solid containing a biocompatible polymer.
  • a method for producing a porous body of a biocompatible polymer As an example of a method for producing a porous body of a biocompatible polymer, (A) The difference between the temperature of the highest liquid temperature in the solution and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is 2.5 ° C. or less, and Cooling the biocompatible polymer solution to an unfrozen state at a temperature below the melting point of the solvent; (B) A method comprising the steps of freezing the biocompatible polymer solution obtained in step (a), and (c) lyophilizing the frozen biocompatible polymer obtained in step (b). Can be mentioned.
  • the difference between the highest liquid temperature and the lowest liquid temperature in the solution is 2.5 ° C. or less (preferably 2 .3 ° C. or lower, more preferably 2.1 ° C. or lower), that is, by reducing the temperature difference, the variation in the size of the porous pores obtained is reduced.
  • the lower limit of the difference between the temperature of the highest liquid temperature and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is not particularly limited, and may be 0 ° C. or higher, for example, 0.1 ° C. or higher, 0.5 It may be at least 0 ° C, at least 0.8 ° C, or at least 0.9 ° C.
  • the cooling in the step (a) is preferably performed via, for example, a material having a lower thermal conductivity than water (preferably, Teflon (registered trademark)), and the portion having the highest liquid temperature in the solution is cooled.
  • a material having a lower thermal conductivity than water preferably, Teflon (registered trademark)
  • Teflon registered trademark
  • the difference between the temperature of the highest liquid temperature in the solution and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution immediately before the generation of heat of solidification is 2.5 ° C. or less, More preferably, it is 2.3 degrees C or less, More preferably, it is 2.1 degrees C or less.
  • the “temperature difference immediately before the generation of solidification heat” means a temperature difference when the temperature difference becomes the largest between 1 second and 10 seconds before the generation of solidification heat.
  • the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is a solvent melting point of ⁇ 5 ° C. or lower, more preferably a solvent melting point of ⁇ 5 ° C. or lower and a solvent melting point of ⁇ 20 ° C. or higher. More preferably, the solvent melting point is ⁇ 6 ° C. or lower and the solvent melting point is ⁇ 16 ° C. or higher.
  • the solvent having a solvent melting point is a solvent for a biocompatible polymer solution.
  • step (b) the biocompatible polymer solution obtained in step (a) is frozen.
  • the cooling temperature for freezing in the step (b) is not particularly limited and depends on the equipment to be cooled, but preferably from 3 ° C. from the temperature of the lowest liquid temperature in the solution.
  • the temperature is 30 ° C lower, more preferably 5 ° C to 25 ° C lower, still more preferably 10 ° C to 20 ° C lower.
  • step (c) the frozen biocompatible polymer obtained in step (b) is lyophilized.
  • Freeze-drying can be performed by a conventional method.
  • freeze-drying can be performed by vacuum drying at a temperature lower than the melting point of the solvent and further vacuum drying at room temperature (20 ° C.).
  • the biocompatible polymer block can be produced by pulverizing the porous body obtained in the step (c).
  • any cell can be used as long as it can perform cell transplantation, which is the purpose of the sheet-like cell structure of the present invention, and the type thereof is not particularly limited. Further, one type of cell may be used, or a plurality of types of cells may be used in combination.
  • the cells to be used are preferably animal cells, more preferably vertebrate cells, and particularly preferably human cells. Vertebrate-derived cells (particularly human-derived cells) may be any of universal cells, somatic stem cells, progenitor cells, or mature cells. For example, embryonic stem (ES) cells, reproductive stem (GS) cells, or induced pluripotent stem (iPS) cells can be used as the universal cells.
  • ES embryonic stem
  • GS reproductive stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • somatic stem cells for example, mesenchymal stem cells (MSC), hematopoietic stem cells, amniotic cells, umbilical cord blood cells, bone marrow-derived cells, myocardial stem cells, adipose-derived stem cells, or neural stem cells can be used.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • progenitor cells and mature cells include skin, dermis, epidermis, muscle, myocardium, nerve, bone, cartilage, endothelium, brain, epithelium, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, oral cavity, cornea, bone marrow, umbilical cord Cells derived from blood, amniotic membrane, or hair can be used.
  • human-derived cells examples include ES cells, iPS cells, MSCs, chondrocytes, osteoblasts, osteoprogenitor cells, mesenchymal cells, myoblasts, cardiomyocytes, cardioblasts, neurons, hepatocytes, Beta cells, fibroblasts, corneal endothelial cells, vascular endothelial cells, corneal epithelial cells, amniotic cells, umbilical cord blood cells, bone marrow-derived cells, or hematopoietic stem cells can be used.
  • the origin of the cell may be either an autologous cell or an allogeneic cell.
  • cardiomyocytes smooth muscle cells, fibroblasts, skeletal muscle-derived cells (especially satellite cells), bone marrow cells (especially myocardial cells)
  • skeletal muscle-derived cells especially satellite cells
  • bone marrow cells especially myocardial cells
  • transplanted cells can be appropriately selected in other organs.
  • transplantation of neural progenitor cells or cells that can differentiate into nerve cells to cerebral ischemia / cerebral infarction, vascular endothelial cells or cells that can differentiate into vascular endothelial cells to myocardial infarction / skeletal muscle ischemia examples include transplantation.
  • cells used for cell transplantation for diabetic organ damage can be mentioned.
  • cells for cell transplantation treatment that have been variously studied for diseases such as kidney, pancreas, peripheral nerves, eyes, and blood circulation disorders of the extremities. That is, attempts have been made to transplant insulin-secreting cells into the pancreas whose insulin secreting ability has been reduced, transplantation of bone marrow-derived cells for limb circulation disorders, and such cells can be used.
  • vascular cells can also be used.
  • the vascular cell means a cell related to angiogenesis, and is a cell constituting blood vessels and blood, and a progenitor cell and a somatic stem cell that can differentiate into the cell.
  • the vascular cells include cells that do not naturally differentiate into cells that constitute blood vessels and blood such as ES cells, GS cells, or iPS cells, and mesenchymal stem cells (MSC). Not included.
  • the vascular system cell is preferably a cell constituting a blood vessel.
  • specific examples of cells constituting blood vessels include vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells.
  • Vascular endothelial cells may be either venous endothelial cells or arterial endothelial cells.
  • Vascular endothelial progenitor cells can be used as progenitor cells for vascular endothelial cells.
  • Vascular endothelial cells and vascular endothelial progenitor cells are preferred.
  • As cells constituting blood blood cells can be used, white blood cells such as lymphocytes and neutrophils, monocytes, and hematopoietic stem cells which are stem cells thereof can be used.
  • the non-vascular cell means a cell other than the above-mentioned vascular cell.
  • ES cells iPS cells, mesenchymal stem cells (MSC), myocardial stem cells, cardiomyocytes, fibroblasts, myoblasts, chondrocytes, myoblasts, hepatocytes or nerve cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • myocardial stem cells cardiomyocytes
  • fibroblasts fibroblasts
  • myoblasts myoblasts
  • chondrocytes myoblasts
  • hepatocytes or nerve cells can be used.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • chondrocyte, myoblast, myocardial stem cell, cardiomyocyte, hepatocyte or iPS cell can be used.
  • cardiac stem cell cardiac muscle cell or myoblast.
  • a biocompatible polymer block, cells and a liquid medium are added onto a culture support having a plurality of depressions on the culture surface, and the bioaffinity described above
  • the sheet-like cell structure is produced by a step of immersing the functional polymer block and the cell in the uppermost part of the depression, and a step of culturing the cell to obtain a sheet-like cell structure. After the cells are cultured to obtain a sheet-like cell structure, a step of peeling the sheet-like cell structure from the culture support may be included as desired.
  • a suspension containing a biocompatible polymer block and cells in a liquid medium is prepared, and the suspension is added onto a culture support having a depression, and the biocompatible polymer is added. What is necessary is just to immerse a block and a cell in the uppermost part of a hollow part.
  • a growth medium or a differentiation medium may be used.
  • the growth medium include, but are not limited to, Takara Bio: MSCGM BulletKit (trademark) and Lonza: EGM-2 + ECFC serum supplement.
  • the differentiation medium include Takara Bio: Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium: Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium, Takara Bio: Mesenchymal Stem Cell Osteoblast Differentiation Medium: Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, and the like. There is no particular limitation.
  • Cell culture can be carried out in a CO 2 incubator if desired, and is generally 30 to 45 ° C., preferably 35 ° C. to 40 ° C. (eg, 37 ° C.) for 1 hour to 72 hours, preferably 1
  • the time can be from 24 to 24 hours, more preferably from 1 to 12 hours, and even more preferably from 2 to 8 hours.
  • the culture may be stationary culture or shaking culture.
  • the above-described culture cells are directly fused and / or cells are fused via a biocompatible polymer block to produce a sheet-like cell structure.
  • the size of the sheet-like cell structure to be produced is not particularly limited, but the thickness of the thinnest part is preferably 50 ⁇ m to 5 mm, more preferably 100 ⁇ m to 3 mm, and preferably 200 ⁇ m to 2 mm. Further preferred.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of the sheet-like cell structure of the present invention.
  • the sheet-like cell structure includes a sheet part 41 and a plurality of protrusions 42.
  • the thickness X of the thinnest part of the sheet-like cell structure indicates the thickness of the sheet part excluding the protrusions.
  • the thickness Y of the thickest part of the sheet-like cell structure indicates the thickness of the thickest part including the protrusions of the sheet-like cell structure.
  • the sheet-like cell structure of the present invention is a sheet-like cell structure containing a biocompatible polymer block and cells, and has a plurality of protrusions on at least one side, In the protrusion, a sheet-like cell structure in which a plurality of the biocompatible polymer blocks are disposed in gaps between the plurality of cells.
  • the sheet-like cell structure of the present invention has an effect of being excellent in strength and shape maintenance performance by having a plurality of protrusions.
  • a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells. That is, in all parts of the sheet-like cell structure, a plurality of biocompatible polymer blocks may be arranged in the gaps between the plurality of cells, or a part of the sheet-like cell structure. In the above, a plurality of biocompatible polymer blocks may be disposed in the gaps between the plurality of cells, and only cells may be present in other parts of the sheet-like cell structure. Moreover, the site
  • a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a space between a plurality of cells in the lower part (for example, a protrusion) of the sheet-like cell structure.
  • the upper part (for example, the sheet part) of the sheet-like cell structure a sheet-like cell structure in which only cells are present can be mentioned.
  • the sheet-like cell structure of the present invention between the plurality of cells in the lower part (for example, the protrusion) of the sheet-like cell structure and the upper part (for example, the sheet part) of the sheet-like cell structure.
  • An example is a sheet-like cell structure in which a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in the gap.
  • the protrusions are arranged with a plurality of biocompatible polymer blocks in the gaps between the plurality of cells.
  • the protrusion of the sheet-like cell structure is a part formed by the depression of the culture support, the height and diameter of the protrusion correspond to the depth and diameter of the depression. However, since the protrusions of the sheet-like cell structure may contract during cell detachment from cell culture, the height and diameter of the protrusions may be smaller than the depth and diameter of the depressions. .
  • the depth of the protrusion is not particularly limited, but is preferably 10 to 2000 ⁇ m, more preferably 20 to 1000 ⁇ m, still more preferably 30 to 700 ⁇ m, still more preferably 50 to 500 ⁇ m, and most preferably 100 to 400 ⁇ m.
  • the diameter of the protrusion is not particularly limited, but is preferably 10 to 2000 ⁇ m, more preferably 50 to 1500 ⁇ m, still more preferably 100 to 1500 ⁇ m, still more preferably 200 to 1000 ⁇ m, and most preferably 400. ⁇ 800 ⁇ m.
  • the protrusions have the above depth and diameter, it is not necessary for all the protrusions of the sheet-like cell structure to have the above depth and diameter, and at least some of the depressions have the above depth. It may have a thickness and a diameter.
  • the shape (including depth and diameter) of the protrusion may be uniform or non-uniform, but is preferably uniform.
  • the depths and diameters of the protrusions are preferably uniform, and the depths and diameters of all the protrusions are preferably substantially the same.
  • the thickness of the thinnest part of the sheet-like cell structure is as described above in the present specification.
  • a plurality of biocompatible polymer blocks are three-dimensionally arranged in a gap between a plurality of cells. This enables nutrient delivery from the outside to the inside of the cell structure.
  • a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells.
  • the gap distance between the cells via the biocompatible polymer block that is, the gap distance when selecting a cell and a cell that is present at the shortest distance from the cell is not particularly limited.
  • the size is preferably the size of the polymer block, and the preferred distance is also within the preferred size range of the biocompatible polymer block.
  • the biocompatible polymer block is sandwiched between cells, but there is no need for cells between all the biocompatible polymer blocks, and the biocompatible polymer blocks are in contact with each other. There may be.
  • the distance between the biocompatible polymer blocks via the cells that is, the distance when the biocompatible polymer block and the biocompatible polymer block existing at the shortest distance from the biocompatible polymer block are selected are particularly Although not limited, it is preferably the size of a cell mass when one to several cells are used, for example, 10 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less. More preferably, it is 10 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the ratio of cells to the biocompatible polymer block is not particularly limited, but the ratio of the biocompatible polymer block per cell is preferably 0.0000001 ⁇ g or more and 1 ⁇ g or less. It is preferably 0.000001 ⁇ g to 0.1 ⁇ g, more preferably 0.00001 ⁇ g to 0.01 ⁇ g, and most preferably 0.00002 ⁇ g to 0.006 ⁇ g. By setting the ratio of the cells to the biocompatible polymer block within the above range, the cells can be present more uniformly.
  • the component in the biocompatible polymer block is not particularly limited, and examples include components contained in the liquid medium.
  • the sheet-like cell structure of the present invention can be used for cell transplantation.
  • the sheet-like cell structure of the present invention can be used for the purpose of cell transplantation at a disease site such as heart disease such as severe heart failure or severe myocardial infarction, or cerebral ischemia / cerebral infarction. It can also be used for diseases such as diabetic kidneys, pancreas, liver, peripheral nerves, eyes, and limb circulation disorders.
  • an incision or an endoscope can be used as an implantation method.
  • a cell transplantation method including the step of transplanting the sheet-like cell structure of the present invention to a patient who needs cell transplantation.
  • the above-described sheet-like cell structure of the present invention is used.
  • the preferred range of the sheet-like cell structure is the same as described above.
  • the sheet-like cell structure of the present invention for the production of a cell transplantation therapeutic agent.
  • the preferred range of the sheet-like cell structure is preferably the same as described above.
  • a cell transplantation therapeutic agent comprising the sheet-like cell structure of the present invention.
  • the preferred range of the sheet-like cell structure is the same as described above.
  • CBE3 Recombinant peptide (recombinant gelatin)
  • the following CBE3 was prepared as a recombinant peptide (recombinant gelatin) (described in International Publication No. WO2008 / 103041).
  • CBE3 Molecular weight: 51.6 kD Structure: GAP [(GXY) 63 ] 3
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has an ERGD sequence.
  • GAP GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKG
  • Example 2 Production of recombinant peptide porous body [PTFE thickness / cylindrical container]
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the cylindrical cup has a curved surface as a side surface, the side surface is closed with 8 mm PTFE, and the bottom surface (flat plate shape) is also closed with 3 mm PTFE.
  • the upper surface has an open shape. Therefore, the inner diameter of the cylindrical cup is 43 mm.
  • this container is referred to as a PTFE thick / cylindrical container.
  • the CBE3 aqueous solution was poured into a PTFE thick / cylindrical container, an aluminum glass plate / cylindrical container, and the CBE3 aqueous solution was cooled from the bottom using a cooling shelf in a vacuum freeze dryer (TF5-85ATNNN: Takara Seisakusho).
  • TF5-85ATNNN Takara Seisakusho
  • the combination of the container, the final concentration of the CBE3 aqueous solution, the liquid amount, and the shelf temperature setting was prepared as described below.
  • Condition A PTFE thick cylindrical container, final concentration of CBE3 aqueous solution 4% by mass, amount of aqueous solution 4mL.
  • the frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C.
  • the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued. Then, vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer. Thereby, a porous body was obtained.
  • Condition B Aluminum / glass plate / cylindrical container, final concentration of CBE3 aqueous solution 4% by mass, amount of aqueous solution 4mL. Set the shelf temperature to -10 ° C, cool to -10 ° C for 1 hour, then -20 ° C for 2 hours, further -40 ° C for 3 hours, and finally freeze at -50 ° C for 1 hour It was. The frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C. After 24 hours, the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued. Then, vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer. Thereby, a porous body was obtained.
  • Condition C PTFE thick / cylindrical container, final concentration of 4 mass% of CBE3 aqueous solution, 10 mL of aqueous solution.
  • Set the shelf temperature to -10 ° C cool to -10 ° C for 1 hour, then -20 ° C for 2 hours, further -40 ° C for 3 hours, and finally freeze at -50 ° C for 1 hour It was.
  • the frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C.
  • the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued.
  • vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer. Thereby, a porous body was obtained.
  • condition A condition B, and condition C
  • the liquid temperature is below the melting point of 0 ° C. in the shelf plate temperature ⁇ 10 ° C. setting section (before lowering to ⁇ 20 ° C.), and in this state It can be seen that freezing has not occurred (unfrozen / supercooled).
  • temperature difference means “non-cooling surface liquid temperature” ⁇ “cooling surface liquid temperature”.
  • the term “temperature difference immediately before” as used in the present invention refers to the highest temperature among the temperature differences that can be detected between 1 second and 20 seconds before the event (solidification heat generation, etc.). Yes.
  • Example 3 Preparation of biocompatible polymer block (pulverization and crosslinking of porous material)
  • the CBE3 porous material obtained in Example 2 under the conditions A and B was pulverized with a new power mill (Osaka Chemical, New Power Mill PM-2005).
  • the pulverization was performed by pulverization for 5 minutes in total for 1 minute ⁇ 5 times at the maximum rotation speed.
  • the obtained pulverized product was sized with a stainless steel sieve to obtain uncrosslinked blocks of 25 to 53 ⁇ m, 53 to 106 ⁇ m, and 106 to 180 ⁇ m.
  • thermal crosslinking was performed at 160 ° C. under reduced pressure (6 types of crosslinking times of 8 hours, 16 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours) were performed, and biocompatible polymer block (CBE3 block) )
  • the porous body-derived block of Condition A that has been crosslinked for 48 hours is referred to as E
  • the porous body-derived block of Condition B that has been crosslinked for 48 hours is referred to as F.
  • E and F are small temperature difference blocks made from a porous material produced by a freezing process with a small temperature difference.
  • the difference in the crosslinking time did not affect the performance in the evaluation of the present application, those that were crosslinked for 48 hours were used as representatives.
  • E and F there was no difference in performance.
  • the biocompatible polymer block obtained in Example 3 is also referred to as “petal block”.
  • biocompatible polymer blocks prepared under Condition A, size 53 to 106 ⁇ m, and crosslinking time 48 hours were used.
  • Example 4 Measurement of tap density of biocompatible polymer block The tap density is a value indicating how many blocks can be densely packed in a certain volume. It can be said that the structure is complicated.
  • the tap density was measured as follows. First, a funnel with a cap (diameter 6 mm, length 21.8 mm cylindrical: capacity 0.616 cm 3 ) was prepared, and the mass of the cap alone was measured. After that, a cap was attached to the funnel, and the block was poured from the funnel so that the block accumulated in the cap. After putting a sufficient amount of blocks, the cap part was struck 200 times on a hard place such as a desk, the funnel was removed, and it was rubbed with a spatula. The mass was measured with the cap fully filled. The mass of only the block was calculated from the difference from the mass of only the cap, and the tap density was determined by dividing by the volume of the cap. As a result, the tap density of the biocompatible polymer block of Example 3 was 98 mg / cm 3 .
  • Example 5 Measurement of degree of cross-linking of biocompatible polymer block The degree of cross-linking of the block cross-linked in Example 3 (number of cross-links per molecule) was calculated. The measurement used the TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) method.
  • sample preparation> To a glass vial, sample (about 10 mg), 4% aqueous NaHCO 3 solution (1 mL) and 1 wt% aqueous TNBS solution (2 mL) were added and the mixture was shaken at 37 ° C. for 3 hours. Then, after adding 37 mass% hydrochloric acid (10 mL) and pure water (5 mL), the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours or more to prepare a sample.
  • Example 6 Measurement of water absorption rate of biocompatible polymer block The water absorption rate of the biocompatible polymer block prepared in Example 3 was calculated. At 25 ° C., a 15 cm ⁇ 3 cm nylon mesh bag was filled with about 15 mg of the biocompatible polymer block, swollen in ion-exchanged water for 2 hours, and then air-dried for 10 minutes. The mass was measured at each stage, and the water absorption was determined according to (Equation 4).
  • the water absorption rate of the block of Example 3 was 786%.
  • Example 7 Production of sheet-like cell structure having protrusions (sheet-like mosaic cell mass having protrusions) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) were grown in a growth medium (Takara Bio: MSCGM BulletKit (trademark)). The biocompatible polymer block (53-106 ⁇ m) prepared in Example 3 was added thereto, and finally 4 mL of hMSC (2 ⁇ 10 7 cells) and the biocompatible polymer block (20 mg) were added.
  • hMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • EZSPHERE (registered trademark) dish 35 mm Type 903 spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, spheroid well depth to about 1000 wells (manufactured by AGC Techno Glass).
  • the area of the depression on the culture surface is 100% of the total area of the culture surface, and the surface of the culture support between the depressions adjacent to each other is uneven. It is.
  • a sheet-like cell structure having protrusions was produced in a disk sheet shape having a diameter of 30 mm and a thickness of about 500 ⁇ m consisting of hMSC and a biocompatible polymer block.
  • FIG. 11 It was found that the sheet-like cell structure having this protrusion has strength and can maintain its shape without being rounded.
  • the obtained sheet-like cell structure having protrusions had a thickest part of about 500 ⁇ m and a thinnest part of about 150 ⁇ m.
  • cells and blocks are mixed in the protrusion obtained due to the shape of the cell support having a depression, and the flat part on the opposite side is The thing with only the cell was obtained.
  • the dish used is Type 900 (well diameter 400 to 500 ⁇ m, well depth 100 to 200 ⁇ m), Type 902 (well diameter 500 ⁇ m, well depth 200 ⁇ m), Type 904 (well diameter 800 ⁇ m, well depth 400 ⁇ m).
  • a sheet-like cell structure having a protrusion sheet-like mosaic cell mass having a protrusion
  • the dish Type 900, Type 902, and Type 904 the area of the depression on the culture surface is 100% of the total area of the culture surface, and the culture support surface between the depressions adjacent to each other is non-flat. .
  • a sheet-like cellular structure having protrusions prepared using an EZSPHERE (registered trademark) dish 35 mm Type903 container with hMSC (2 ⁇ 10 7 cells) and a biocompatible polymer block (20 mg) is tweezers. When it was lifted to stick it on the organ surface, it was confirmed that it could be transplanted without cutting, and that it had sufficient strength.
  • a thick sheet-like cell structure can be easily produced simply by inserting cells and a biocompatible polymer block into a cell support having a depression at the bottom.
  • a flat sheet-like cell structure could be produced and recovered into a disc sheet having a diameter of 30 mm and a thickness of about 500 ⁇ m comprising hMSC and a biocompatible polymer block.
  • the sheet-like cell structure having the protrusions of Example 7 has strength and can maintain the shape, whereas the flat sheet-like cell structure has low strength and is easy to tear or round. I found out.
  • hMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • a growth medium Tekara Bio: MSCGM BulletKit (trademark)
  • hMSC 8 EZSPHERE (registered trademark) dish 35 mm Type 903 (spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth) which is a non-cell-adherent 35 mm dish having a depression on the bottom surface in a state suspended in 4 mL of medium ⁇ 10 7 cells) 300 ⁇ m, number of spheroid wells to about 1000 wells (manufactured by AGC Techno Glass).
  • the preparation was carried out by shaking the cell concentration at 2 ⁇ 10 7 cells to 8 ⁇ 10 7 cells, but it was confirmed that a flat cell sheet (only cells) could be produced using any of them.
  • the flat cell sheet is very weak and difficult to lift compared to the sheet-like cell structure having the protrusions of Example 7 having strength and being able to maintain the shape. That didn't change.
  • it shrinks at a very high speed it shrinks to 20 mm in 4 hours during formation, and the initial shape cannot be maintained.
  • any flat cell sheet could not maintain the size compared to the flat sheet-like cell structure of Comparative Example 1 which could maintain the size.
  • the cell sheet in the process of cell aggregation of cells only, can be formed with a cell support with a flat bottom surface while the cell sheet is formed with a cell support with a recessed portion on the bottom surface I understand that I can't.
  • the cell structure composed of the cell and the biocompatible polymer block has a sheet-like cell structure, whether it is a cell support with a flat bottom surface or a cell support with a recessed bottom surface. The body was able to form.
  • a protrusion made of a cell support having a recessed portion on the bottom surface is provided. It was found that the sheet-like cell structure possessed by the sheet-like cell structure has strength, is easy to maintain its shape, and has good handling properties.

Abstract

本発明の課題は、強度および形状維持性能に優れたシート状細胞構造体の製造方法、並びに強度および形状維持性能に優れたシート状細胞構造体を提供することである。本発明によれば、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加し、上記生体親和性高分子ブロックおよび上記細胞を上記窪み部の最上部に浸漬させる工程；及び上記細胞を培養して、シート状細胞構造体を得る工程； を含む、シート状細胞構造体の製造方法が提供される。

Description

シート状細胞構造体の製造方法及びシート状細胞構造体
　本発明は、シート状細胞構造体の製造方法及びシート状細胞構造体に関する。
　現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、心筋症の治療などに細胞を用いた再生医療を施す際、臓器表面に貼り付けやすいという点から、細胞シート工学が利用されることがある（例えば、特許文献１）。
　また、特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献２に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚さを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献２の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて、高い細胞生存活性が実証されている。
　一方、特許文献３には、被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が培養基材表面に複数形成されており、互いに近接する窪み部の間の培養基材表面が非平坦面であることを特徴とする培養基材が記載されており、この培養基材を用いてスフェロイド培養を行うことが記載されている。特許文献４には、 被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が複数形成された培養面と、培養面を底面に備える容器本体と、複数の窪み部の上部に載置され窪み部の開口を塞ぐ透液性蓋体とを備え、培養面は、互いに近接する窪み部の間の頂部が非平坦面からなり、透液性蓋体は、容器本体内の培養液中に浸漬された状態で窪み部の間の頂部との距離が、窪み部内で培養された被培養物の外径寸法よりも小さくなるよう配置されていることを特徴とする、スフェロイド培養を行うための細胞培養容器が記載されている。
特開２０１１－６４９０号公報 国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号公報 国際公開ＷＯ２０１２／０３６０１１号公報 特開２０１５－７３５２０号公報
　特許文献１に記載されている細胞シートの場合には、栄養・酸素が細胞まで届かないため、十分な厚さの細胞シートを作製できないという課題がある。特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含む細胞構造体の製造方法が記載されているが、強度および形状維持性能に優れたシートを製造することは具体的には記載されていない。特許文献３及び４には、所定の細胞培養容器を用いてスフェロイド培養を行うことが記載されているが、細胞シートを製造することについては記載がない。
　上記の通り、細胞を含むシートであって、強度および形状維持性能に優れたシートを製造する方法を確立することが望まれている。本発明の課題は、強度および形状維持性能に優れたシート状細胞構造体の製造方法、並びに強度および形状維持性能に優れたシート状細胞構造体を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加し、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を窪み部の最上部に浸漬させ、上記の状態で細胞を培養することによって、強度および形状維持性能に優れたシート状細胞構造体を製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加し、上記生体親和性高分子ブロックおよび上記細胞を上記窪み部の最上部に浸漬させる工程；及び
上記細胞を培養して、シート状細胞構造体を得る工程；
を含む、シート状細胞構造体の製造方法。
（２）　上記培養支持体が、深さが１０～１５００μｍであり、口径が１０～１５００μｍである窪み部を有する、（１）に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（３）　培養面上の窪み部の面積が、培養面の全面積に対して７０％以上である、（１）又は（２）に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（４）　互いに隣接する上記窪み部の間の培養支持体表面が、非平坦である、（１）又は（２）に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（５）　上記シート状細胞構造体の最薄部の厚さが５０μｍ～５ｍｍである、（１）から（４）のいずれか一に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（６）　培養支持体の培養表面が、細胞接着抑制のための処理がなされている、（１）から（５）のいずれか一に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（７）　上記生体親和性高分子ブロックの大きさが１μｍ～７００μｍである、（１）から（６）のいずれか一に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（８）　生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、（１）から（７）のいずれか一に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（９）　リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、（８）に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
（１０）　リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（８）又は（９）に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
（１１）　生体親和性高分子ブロックと細胞とを含むシート状細胞構造体であって、少なくとも片面に、複数の突起部を有し、上記突起部において、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、シート状細胞構造体。
（１２）　高さが１０～２０００μｍであり、直径が１０～２０００μｍである突起部を有する、（１１）に記載のシート状細胞構造体。
（１３）　最薄部の厚さが５０μｍ～５ｍｍである、（１１）又は（１２）に記載のシート状細胞構造体。
（１４）　生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、（１１）から（１３）のいずれか一に記載のシート状細胞構造体。
（１５）　リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、（１４）に記載のシート状細胞構造体。
式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
（１６）　リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（１４）又は（１５）に記載のシート状細胞構造体。
　本発明のシート状細胞構造体の製造方法によれば、強度および形状維持性能に優れたシート状の細胞構造体を製造することができる。
　本発明のシート状細胞構造体は、強度および形状維持性能に優れていることから、ハンドリング性能が向上し、臓器表面に設置しやすい。
図１は、培養支持体を有する培養容器の斜視図である。 図２は、培養支持体の第一の例（窪み部の間の培養支持体表面が非平坦）の断面図である。図２（ａ）は、細胞接着抑制剤層がない例を示し、図２（ｂ）は、細胞接着抑制剤層がある例を示す。 図３は、培養支持体の第二の例（窪み部の間の培養支持体表面が平坦）の断面図である。図３（ａ）は、細胞接着抑制剤層がない例を示し、図３（ｂ）は、細胞接着抑制剤層がある例を示す。 図４は、図２（ａ）の部分拡大図である。 図５は、図３（ａ）の部分拡大図である。 図６は、培養支持体の表面上のレーザー光の照射スポットを示す。 図７は、本発明のシート状細胞構造体の模式図を示す。 図８は、実施例の条件Ａの液温プロファイルを示す。 図９は、実施例の条件Ｂの液温プロファイルを示す。 図１０は、実施例の条件Ｃの液温プロファイルを示す。 図１１は、突起部を有するシート状細胞構造体を作製した結果を示す。 図１２は、実施例と比較例の結果のまとめを示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明によるシート状細胞構造体の製造方法は、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加し、上記生体親和性高分子ブロックおよび上記細胞を上記窪み部の最上部に浸漬させる工程；及び上記細胞を培養して、シート状細胞構造体を得る工程を含む方法である。
　本発明においては、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加して培養を行う際に、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を窪み部の最上部に浸漬させた状態で培養を行う。即ち、窪み部の最上部を超える量の生体親和性高分子ブロックおよび細胞を使用することが必要である。上記の通り、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を窪み部の最上部に浸漬させた状態で培養を行うことにより、シート状細胞構造体を製造することが可能になる。生体親和性高分子ブロックおよび細胞の使用量が少なく、生体親和性高分子ブロックおよび細胞により窪み部の最上部が浸漬されない状態で培養を行った場合には、個々の窪み部で、個々の細胞構造体が形成され、シート状細胞構造体を形成することはできない。
　培養面上に窪み部を有さない培養支持体上において、生体親和性高分子ブロック及び細胞を培養した場合には脆いシート状細胞構造体が得られる。本発明においては、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上において、生体親和性高分子ブロック及び細胞を培養した場合には、強度および形状維持性能（丸まらない）に優れたシート状細胞構造体を製造できることが見出された。
　特許文献３及び４には、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体が記載されている。特許文献３及び４においては、個々の窪み部において個々のスフェロイドを製造し（即ち、１個の窪み部あたり１個のスフェロイドを製造される）、多数のスフェロイドを同時に製造することが記載されているが、細胞を窪み部の最上部に浸漬させた状態で培養を行ってシート状細胞構造体を製造することの記載はない。また、特許文献３及び４には、生体親和性高分子ブロックの使用についても記載はない。
　本明細書において後記する実施例及び比較例において示す通り、細胞のみを使用した場合には、表面が平坦である細胞支持体で製造する方が、表面に窪み部を有する細胞支持体で製造する場合より良好な結果が得られる。これとは対照的に、細胞と生体親和性高分子ブロックを使用して細胞構造体を製造する場合には、表面に窪み部を有する細胞支持体で製造する場合の方が、表面が平坦である細胞支持体で製造する場合より良好な結果が得られることが、本発明により見いだされた。
　本発明によれば、強度および形状維持性能に優れたシート状の細胞構造体を簡便かつ短時間に製造することができるが、細胞のみを使用する場合と、細胞と生体親和性高分子ブロックを使用する場合とにおいて、より好ましい細胞支持体の形態が正反対であることは、本発明の効果が全く予想外であったことを示している。
　本発明の方法で製造されるシート状細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含む。なお、本明細書において、細胞構造体は、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
（１）培養支持体
　本発明においては、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体を使用する。
　本発明で用いる培養支持体の例を、図１から図６を参照して説明する。
　図１において、培養支持体１は、生体親和性高分子ブロック及び細胞を培養して、シート状細胞構造体を製造する培養容器の主要部である。
  図１に示したように、培養容器は、容器本体１０および蓋１２を有する。図１に示す例においては、容器本体１０の内側の底板部１４が、培養支持体１に相当する部分である。容器本体１０の内側の底板部１４、すなわち培養支持体１は、例えばポリスチレンなどの合成樹脂材、又はガラスから構成されていてもよい。培養支持体１は、合成樹脂材料を用いた射出成形により製造することができる。
  容器本体１０は、円板状の底板部１４および環状の側壁部１６を有している。なお、容器の形状は、円板状以外の形状でもよく、四角などの形状でもよい。側壁部１６は、底板部１４の外周縁から起立している。底板部１４の直径は、例えば３０ｍｍ～５００ｍｍ、底板部１４の厚さは、例えば０．５ｍｍ～１０ｍｍ、側壁部１６の高さは、例えば２０ｍｍ～１００ｍｍとすることができるが、特に限定されない。
  蓋１２は、容器本体１０に上方の開口部に対応した形状に形成されている。蓋１２は、細胞の培養環境を維持するために、容器本体１０に被せられて使用することができる。
  底板部１４の上面（すなわち、容器本体１０の内側の面に相当する培養基材の上面）のウェル形成領域２４（すなわち、被培養物が培養される隔室が形成される領域）には、図２又は図３に示したように、複数の窪み部２０が形成されている。窪み部２０の内面は、滑らかな凹面になっている。窪み部２０は、被培養物が培養される隔室（ウェル）を形成する。
　図２（ａ）及び図３（ａ）に示す例においては、細胞接着抑制剤層が存在しない。図２（ｂ）及び図３（ｂ）に示す例においては、細胞接着抑制剤層３０が、設けられている。
　窪み部の深さは、特に限定されないが、好ましくは１０～２０００μｍであり、より好ましくは２０～１０００μｍであり、さらに好ましくは３０～７００μｍであり、さらに好ましくは５０～５００μｍであり、最も好ましくは１００～４００μｍである。
　窪み部の口径は、特に限定されないが、好ましくは１０～２０００μｍであり、より好ましくは５０～１５００μｍであり、さらに好ましくは１００～１５００μｍであり、さらに好ましくは２００～１０００μｍであり、最も好ましくは４００～８００μｍである。
　窪み部の深さ及び口径を上記の範囲とすることは、細胞の大きさとの関係において、強度および形状維持性能に優れたシート状細胞構造体を得るという観点から好ましい。
　なお、窪み部が、上記の深さ及び口径を有する場合、培養支持体上の全ての窪み部が、上記の深さ及び口径を有する必要はなく、少なくとも一部の窪み部が上記の深さ及び口径を有するものであってもよい。
　窪み部の深さとは、図４及び図５に示す通り、窪み部の最下部と最上部との間の高さを意味する。窪み部の口径は、図４及び図５に示す通り、窪み部の最上部の点を結んだ長さを意味する。なお、図５に示す通り、窪み部の最上部が平坦である場合には、窪み部の最上部の点を結んだ長さが最短になるように、窪み部の最上部を選択する。
　窪み部の形状（深さ及び口径を含む）は、均一でもよいし不均一でもよいが、好ましくは均一である。窪み部の深さ及び口径は、均一であることが好ましく、すべての窪み部の深さ及び口径は、実質的に同一であることが好ましい。
  窪み部２０は、例えば、培養支持体表面のウェル形成領域２４に対してレーザ光を照射することにより形成することができる。レーザ照射は、図６に示したように、ｘ－ｙ面上に設置された底板部１４の上面に対して、レーザ光をｚ軸方向に照射して行う。
  まず、レーザ照射装置の照射部をｘ軸の正方向に走査させつつ、一定の間隔（例えば８００μｍ）ごとにレーザ光を照射して、ｘ軸方向に並んだ複数の窪み部２０を形成する。続けて、照射部をｙ軸方向に一定の距離（例えば４００μｍ）だけ走査させた後、照射部をｘ軸の負方向に走査させつつ、一定の間隔（例えば８００μｍ）ごとにレーザ光を照射して、ｘ軸方向に並んだ複数の窪み部２０を形成する。同様に、照射部をｙ軸方向に一定の距離（例えば４００μｍ）だけ走査させる。これを繰り返して、底板部１４の上面に規則的に配列された複数の窪み部２０を形成する。
　図６に示したように、照射スポットＡの中心座標（ｘ，ｙ）を原点（０，０）とすると、照射スポットＡに近接した照射スポットＢの中心は、（０．８，０）、照射スポットＣの中心は、（０．４，０．４）、照射スポットＤの中心は、（－０．４，０．４）に位置する。このように、照射スポットＡ，Ｂのｘ座標と照射スポットＣ，Ｄのｘ座標とをずらすことにより、ウェル形成領域２４に複数の窪み部２０を稠密に形成することができる。窪み部２０は、培養基材１のウェル形成領域２４の単位面積あたり、１０個／ｃｍ2～１００００個／ｃｍ2、形成するのが好ましい。さらに好ましくは、２０個／ｃｍ2～８０００個／ｃｍ2、さらに好ましくは２０個／ｃｍ2～３０００個／ｃｍ2であり、さらに好ましくは５０個／ｃｍ2～１０００個／ｃｍ2であり、さらに好ましくは１００個／ｃｍ2～５００個／ｃｍ2であり、特に好ましくは１００個／ｃｍ2～３００個／ｃｍ2である。
　 レーザ光源には、ＣＯ2レーザを用い、レーザ光は、出力１０Ｗ、照射速度６１００ｍｍ／ｍｉｎでパルス照射することができるが、特に限定されない。
  なお、照射スポットの形状は、円形であるのに対して、窪み部２０の開口形状は、略楕円形に偏平している。この開口形状の偏平は、容器本体１０の成形時において金型に合成樹脂材を流し込む方向に起因するものと考えられる。
  培養基材表面（底板部１４の上面）にレーザ光が照射されると、底板部１４を構成する合成樹脂材が溶解して、窪み部２０が形成される。
  レーザ光の照射位置や出力量などの照射条件を調節することにより、近接する窪み部２０間の距離、窪み部２０の径・深さ、互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面の幅・高さなどを調節できる。
　培養支持体１は、複数の窪み部２０を形成する凸部、および窪み部の間の培養支持体表面を形成する凹部を備えた金型を用いて、合成樹脂材料を射出成形して製造することもできる。複数の窪み部２０および窪み部の間の培養支持体表面は、培養基材１の成形と同時に形成される。金型を用いて射出成型により培養支持体１を製造することにより、より均一性の高い窪み部２０を形成することができる。
　培養面上の窪み部の面積が、培養面の全面積に対して７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが最も好ましい。窪み部の面積の割合を上記の範囲とすることは、本発明の効果の観点から好ましい。
　窪み部の面積とは、窪み部を上方から観察した場合に窪み部を二次元で捉えたときの面積を意味し、本明細書中上記した窪み部の口径で規定される領域の面積を意味する。図２又は図４に示すように、培養面上に平坦部が存在しない場合には、培養面上の窪み部の面積が、培養面の全面積に対して１００％になる。
　互いに隣り合った２個の窪み部２０は、窪み部の間の培養支持体表面を介して形成されている。互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面は、平坦でも非平坦でもよいが、好ましくは非平坦である。
　底板部１４の上面、すなわち培養支持体の培養表面は、細胞接着抑制のための処理がなされていることが好ましい。これにより、シート状の細胞構造体を培養した後、剥離しやすくすることができる。細胞接着抑制のための処理としては、細胞接着抑制剤により被膜することが挙げられる（図２（ｂ）及び図３（ｂ）を参照）。細胞接着抑制剤は、細胞が底板部１４の上面、特に、窪み部２０の内面に接着するのを抑制する役割を果たす。細胞接着抑制剤としては、例えば、リン脂質ポリマー、ＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、あるいは、ポリエチレングリコールなどが用いられる。
（２）生体親和性高分子ブロック
（２－１）生体性親和性高分子
　生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、及びＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
　リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成セラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
　化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記の（２－３）リコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
　リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
　本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図－基礎と応用－」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
　本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
　本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
　本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
（２－２）架橋
　本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
　架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、－１００℃～５００℃であり、より好ましくは０℃～３００℃であり、更に好ましくは５０℃～３００℃であり、更に好ましくは１００℃～２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃～２００℃である。
（２－３）リコンビナントゼラチン
　本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
　リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
　リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。
　一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２～１０の整数を示し、より好ましくは３～５の整数を示す。ｎは３～１００の整数が好ましく、１５～７０の整数がさらに好ましく、５０～６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、　式：Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）63］3－Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオン及びアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
　「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
（２－４）生体親和性高分子ブロック
　本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は上記の通り特に限定されるものではないが、タップ密度が、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、より好ましくは２０ｍｇ／ｃｍ3以上４００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ3以上２２０ｍｇ／ｃｍ3以下であり、特に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ3以上１５０ｍｇ／ｃｍ3以下である。
　タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、及び生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
　本明細書でいうタップ密度は、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは２以上であり、さらに好ましくは２以上３０以下であり、さらに好ましくは４以上２５以下であり、特に好ましくは４以上２２以下である。
　生体親和性高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプル及びブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
（式２）　（As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、生体親和性高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗは生体親和性高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）
（式３）　１－（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは７００％以上、最も好ましくは８００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、又は２０００％以下である。
　生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って吸水率を求めることができる。
（式４）
　吸水率＝（ｗ２－ｗ１－ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
　本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上７００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
　ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６～１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３～１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５～５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
（２－５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
　生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
　上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
　生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができる。
　生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、又は０．９℃以上でもよい。
　工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
　好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前～１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
　好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点－５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点－５℃以下かつ溶媒融点－２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点－６℃以下かつ溶媒融点－１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
　工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
　工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
　本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
（３）細胞
　本発明で用いる細胞は、本発明のシート状細胞構造体の目的である、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
　例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患においては、自家および他家から摘出した心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、骨格筋由来細胞（特にサテライト細胞）、骨髄細胞（特に心筋様細胞に分化させた骨髄細胞）などを好適に使用することができる。更に、他の臓器においても、適宜移植細胞を選択することができる。例えば、脳虚血・脳梗塞部位への神経前駆細胞または、神経細胞に分化可能な細胞の移植、心筋梗塞部位・骨格筋虚血部位への血管内皮細胞または血管内皮細胞に分化可能な細胞の移植などを挙げることができる。
　また、糖尿病性の臓器障害に対する細胞移植に使用される細胞が挙げられる。例えば、腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対して、種々検討されている細胞移植治療法用の細胞が挙げられる。即ち、インスリン分泌能が低下した膵臓にインスリン分泌細胞を移植する試みや、四肢の血行障害に対する骨髄由来細胞の移植などが検討されており、このような細胞を使用することができる。
　また本発明においては、血管系細胞を使用することもできる。本明細書において、血管系細胞とは、血管形成に関連する細胞を意味し、血管および血液を構成する細胞、およびその細胞に分化することができる前駆細胞、体性幹細胞である。ここで、血管系細胞には、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞等の万能細胞や、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような血管および血液を構成する細胞に、自然には分化しないものは含まれない。血管系細胞として、好ましくは血管を構成する細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）では、血管を構成する細胞の具体例としては、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を挙げることができる。血管内皮細胞は、静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の何れでもよい。血管内皮細胞の前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞を使用することができる。好ましくは血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞である。血液を構成する細胞としては、血球細胞が使用でき、リンパ球や好中球などの白血球細胞、単球細胞、それらの幹細胞である造血幹細胞を使用できる。
　本明細書において、非血管系細胞とは、上記の血管系細胞以外の細胞を意味する。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、肝細胞または神経細胞を使用することができる。好ましくは、ＭＳＣ、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋幹細胞、心筋細胞、肝細胞またはｉＰＳ細胞を使用することができる。より好ましくは、ＭＳＣ、心筋幹細胞、心筋細胞または筋芽細胞である。
（４）シート状細胞構造体の製造方法
　本発明においては、培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加し、上記生体親和性高分子ブロックおよび上記細胞を上記窪み部の最上部に浸漬させる工程；及び上記細胞を培養して、シート状細胞構造体を得る工程によって、シート状細胞構造体を製造する。細胞を培養して、シート状細胞構造体を得た後に、所望により、シート状細胞構造体を培養支持体上から剥離させる工程を含めてもよい。
　具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞とを液体培地中に含む懸濁液を調製し、上記懸濁液を、窪み部を有する培養支持体上に添加し、生体親和性高分子ブロックおよび細胞を窪み部の最上部に浸漬させればよい。
　液体培地としては、例えば、増殖培地、又は分化培地でもよい。
　増殖培地としては、タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標）、Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ－２＋ＥＣＦＣ serum supplementなどを挙げることができるが、特に限定されない。
　分化培地としては、タカラバイオ：間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地：Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium、タカラバイオ：間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地：Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Mediumなどを挙げることができるが、特に限定されない。
　細胞の培養は、所望によりＣＯ2インキュベーター内で行うことができ、一般的には３０～４５℃、好ましくは３５℃～４０℃（例えば、３７℃）で、１時間～７２時間、好ましくは１時間～２４時間、より好ましくは１時間～１２時間、さらに好ましくは２時間～８時間行うことができる。培養は静置培養でもよいし、振盪培養でもよい。
　上記した培養により、細胞同士は直接融合するか、および／または細胞同士は生体親和性高分子ブロックを介して融合し、シート状細胞構造体が製造される。
　製造されるシート状細胞構造体の大きさは特に限定されないが、最薄部の厚さが５０μｍ～５ｍｍであることが好ましく、１００μｍ～３ｍｍであることがより好ましく、２００μｍ～２ｍｍであることがさらに好ましい。
　本発明のシート状細胞構造体の模式図を図７に示す。シート状細胞構造体は、シート部４１と、複数の突起部４２から構成される。シート状細胞構造体の最薄部の厚さＸとは、突起部を除くシート部の厚さを示す。シート状細胞構造体の最厚部の厚さＹとは、シート状細胞構造体の突起部を含む最も厚い部分の厚さを示す。
（５）シート状細胞構造体
　本発明のシート状細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含むシート状細胞構造体であって、少なくとも片面に、複数の突起部を有し、上記突起部において、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、シート状細胞構造体である。本発明のシート状細胞構造体は、複数の突起部を有することにより、強度および形状維持性能に優れるという効果を奏する。
　本発明のシート状細胞構造体の少なくとも一部においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている。即ち、シート状細胞構造体の全ての部位において、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されていてもよいし、あるいはシート状細胞構造体の一部の部位において、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されていて、シート状細胞構造体の他の部位においては、細胞のみが存在していてもよい。また、生体親和性高分子ブロックのみが存在する部位が存在していてもよい。
　本発明のシート状細胞構造体の一例としては、シート状細胞構造体の下部（例えば、突起部）において、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されており、シート状細胞構造体の上部（例えば、シート部）においては、細胞のみが存在する、シート状細胞構造体を挙げることができる。
　本発明のシート状細胞構造体の別の例としては、シート状細胞構造体の下部（例えば、突起部）及びシート状細胞構造体の上部（例えば、シート部）において、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているシート状細胞構造体を挙げることができる。
　本発明においては、少なくとも突起部において、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されていることが、シート状細胞構造体の強度および形状維持性能の観点から好ましい。
　シート状細胞構造体の突起部は、培養支持体の窪み部により形成される部分であることから、突起部の高さ及び直径は、窪み部の深さ及び口径に対応する。しかし、細胞の培養から剥離の際に、シート状細胞構造体の突起部は収縮する場合があることから、突起部の高さ及び直径は、窪み部の深さ及び口径より小さくなる場合もある。
　突起部の深さは、特に限定されないが、好ましくは１０～２０００μｍであり、より好ましくは２０～１０００μｍであり、さらに好ましくは３０～７００μｍであり、さらに好ましくは５０～５００μｍであり、最も好ましくは１００～４００μｍである。
　突起部の直径は、特に限定されないが、好ましくは１０～２０００μｍであり、より好ましくは５０～１５００μｍであり、さらに好ましくは１００～１５００μｍであり、さらに好ましくは２００～１０００μｍであり、最も好ましくは４００～８００μｍである。
　なお、突起部が、上記の深さ及び直径を有する場合、シート状細胞構造体の全ての突起部が、上記の深さ及び直径を有する必要はなく、少なくとも一部の窪み部が上記の深さ及び直径を有するものであってもよい。
　突起部の形状（深さ及び直径を含む）は、均一でもよいし不均一でもよいが、好ましくは均一である。突起部の深さ及び直径は、均一であることが好ましく、すべての突起部の深さ及び直径は、実質的に同一であることが好ましい。
　シート状細胞構造体の最薄部の厚さは、本明細書中上記した通りである。
　本発明においては、生体親和性高分子ブロックと細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させる。これにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能となる。
　本発明の細胞構造体の少なくとも一部の領域においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
　また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１～数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上５００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２００μｍ以下である。
　本発明のシート状細胞構造体における、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞１個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、細胞をより均一に存在させることができる。下限を上記範囲とすることにより、所望の用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、液体培地に含まれる成分が挙げられる。
（６）シート状細胞構造体の用途
　本発明のシート状細胞構造体は、細胞移植のために使用することができる。具体的には、本発明のシート状細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、肝臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることができる。
　移植方法としては、切開、内視鏡といったものが使用可能である。
　また、本発明によれば、本発明のシート状細胞構造体を、細胞移植を必要とする患者に移植する工程を含む細胞移植方法が提供される。本発明の細胞移植方法においては、上記した本発明のシート状細胞構造体を用いる。シート状細胞構造体の好適な範囲は上記と同様である。
　更に本発明によれば、細胞移植治療剤の製造のための、本発明のシート状細胞構造体の使用が提供される。本発明によれば、好ましくは、シート状細胞構造体の好適な範囲は上記と同様である。
　更に本発明によれば、本発明のシート状細胞構造体を含む、細胞移植治療剤が提供される。本発明によれば、シート状細胞構造体の好適な範囲は上記と同様である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
　リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：　ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：－０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
　底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
[アルミ硝子板・円筒形容器]
　厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
[温度差の小さい凍結工程、及び乾燥工程]
　PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５－８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、及び棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
条件Ａ：
　ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。　棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件Ｂ：
　アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。　棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件Ｃ：
　ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。　棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
[各凍結工程での温度測定]
　条件Ａ～条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
　その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図８～図１０の通りとなった。
　図８、図９、図１０から条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度－１０℃設定区間（－２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」－「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を－２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
　以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前～２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。
条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃
条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃
条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃
 [実施例３] 生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
　実施例２で得られた条件Ａ及び条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ－２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５～５３μｍ、５３～１０６μｍ、１０６～１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。
　以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。Ｅ及びＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、Ｅ及びＦでは性能に差が見られなかった。以下、実施例３で得られた生体親和性高分子ブロックを「花弁状ブロック」とも称する。以下の実施例及び比較例では、条件Ａ、サイズ５３～１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。
 [実施例４] 生体親和性高分子ブロックのタップ密度測定
　タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。　タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
　その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は９８ｍｇ/ｃｍ3であった。
[実施例５] 生体親和性高分子ブロックの架橋度測定
　実施例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
　ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％のＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうさせた。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。
＜ブランク調整＞
　ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
　純水で１０倍希釈したサンプル、及び、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。
（式２）　（As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）
（式３）　１－（サンプル（式２）/未架橋リコンビナントペプチド（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
　その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックの架橋度は、４．２であった。
[実施例６] 生体親和性高分子ブロックの吸水率測定
　実施例３で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
　２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って、吸水率を求めた。
（式４）
　吸水率＝（ｗ２－ｗ１－ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
　その結果、実施例３のブロックの吸水率は、７８６％であった。
[実施例７]  突起部を有するシート状細胞構造体（突起部を有するシート状モザイク細胞塊）の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（２×１０7cells）と生体親和性高分子ブロック（２０ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径800μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。なお、EZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903では、培養面上の窪み部の面積が、培養面の全面積に対し１００％であり、互いに隣接する窪み部の間の培養支持体表面が、非平坦である。
　ＣＯ2インキュベーターで３７℃で４時間静置したところ、ｈＭＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径３０ｍｍ大、厚さ５００μｍ程度の円盤シート状に、突起部を有するシート状細胞構造体を作製し、回収できた（図１１）。この突起部を有するシート状細胞構造体は強度を有し、丸まらずに形状を維持できることが分かった。得られた突起部を有するシート状細胞構造体は、最厚部が５００μｍ、最薄部が１５０μｍ程度であった。本方法で得られた突起部を有するシート状細胞構造体は、細胞支持体が窪み部を有する形状に起因して得られる突起部に細胞とブロックが混在し、逆面側の平坦部分には細胞のみが存在した状態のものが得られていた。
　また、同じEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903に、ｈＭＳＣを５×１０7cellsと生体親和性高分子ブロックを５０ｍｇ、を培地で４ｍＬに懸濁して播種し、同様にインキュベーターで４時間静置したところ、直径３０ｍｍ大、厚さ１．４ｍｍ程度の円盤シート状に、突起部を有するシート状細胞構造体が作製回収できた。得られた突起部を有するシート状細胞構造体は、最厚部が１．４ｍｍ、最薄部が５００μｍ程度であった。本方法で得られた突起部を有するシート状細胞構造体は、細胞構造体が窪み部を有する形状に起因して得られる突起部に細胞とブロックが混在し、逆面側の平坦部分にも細胞とブロックが混在した状態のものが得られていた。
　尚、使用するディッシュはＴｙｐｅ９００（ウェル口径４００～５００μｍ、ウェル深さ１００～２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０２（ウェル口径５００μｍ、ウェル深さ２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０４（ウェル口径８００μｍ、ウェル深さ４００μｍ）、いずれを使っても同様に突起部を有するシート状細胞構造体（突起部を有するシート状モザイク細胞塊）を作れることが確認された。いずれの条件でも、突起部を有するシート状細胞構造体は強度を有し、丸まらずに形状を維持できることが分かった。なお、ディッシュＴｙｐｅ９００、Ｔｙｐｅ９０２及びＴｙｐｅ９０４では、培養面上の窪み部の面積が、培養面の全面積に対し１００％であり、互いに隣接する窪み部の間の培養支持体表面が、非平坦である。
　強度の評価については、ｈＭＳＣ（２×１０7cells）と生体親和性高分子ブロック（２０ｍｇ）でEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903容器を用いて作製した突起部を有するシート状細胞構造体をピンセットで臓器表面に貼るために持ち上げた際、切れずに移植できることが確認できたことで十分な強度を有することが分かった。
　上記の通り、底面に窪み部を有する細胞支持体に細胞と生体親和性高分子ブロックを入れるだけで、簡便に厚いシート状細胞構造体が作製できることが分かった。
[比較例１]  平坦なシート状細胞構造体（平坦なシート状モザイク細胞塊）の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（２×１０7cells）と生体親和性高分子ブロック（２０ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面が平坦な細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるPrimeSurface Dish 直径35mm（住友ベークライト製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターで３７℃で４時間静置したところ、ｈＭＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径３０ｍｍ大、厚さ５００μｍ程度の円盤シート状に、平坦なシート状細胞構造体が作製回収できた。但し、実施例７の突起部を有するシート状細胞構造体が強度を有し、形状を維持できるのに比べて、平坦なシート状細胞構造体は強度が弱く裂けやすい、また丸まりやすいという欠点のあることが分かった。
　尚、細胞の濃度を２×１０7cells～８×１０7cellsで振って作製を実施したが、いずれを使っても同様に平坦なシート状細胞構造体（平坦なシート状モザイク細胞塊）を作れることが確認された。但し、性質としては実施例７の突起部を有するシート状細胞構造体に比べて、強度が弱く裂けやすい、丸まりやすいことが一致した結果として確認された。
　強度の評価については、ｈＭＳＣ（２×１０7cells）と生体親和性高分子ブロック（２０ｍｇ）でPrimeSurface Dish 直径35mm容器を用いて作製した平坦なシート状細胞構造体をピンセットで臓器表面に貼るために持ち上げた際、実施例７の突起部を有するシート状細胞構造体に比べて、切れやすくそのまま移植することが難しかったことから、十分な強度を有さないことが分かった。
[比較例２]  突起部を有する細胞シート（細胞のみ）の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、最終的にｈＭＳＣ（８×１０7cells）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径800μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターで３７℃で４時間静置したところ、ｈＭＳＣは懸濁液状態のままで、シート状細胞構造体のようには回収できないことが分かった。
　また、使用するディッシュをType900（ウェル口径４００～５００μｍ、ウェル深さ１００～２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０２（ウェル口径５００μｍ、ウェル深さ２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０４（ウェル口径８００μｍ、ウェル深さ４００μｍ）、と変えて、細胞の濃度を２×１０7cells～８×１０7cellsで振って作製を試みたが、いずれも突起部を有する細胞シートは作製できなかった。よって、底面に窪み部を有する細胞支持体を使って、突起部を有する細胞シートは作れないことが分かった。
[比較例３]  平坦な細胞シート（細胞のみ）の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、最終的にｈＭＳＣ（２×１０7cells）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面が平坦な細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるPrimeSurface Dish 直径35mm（住友ベークライト製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターで３７℃で４時間静置したところ、ｈＭＳＣのみから成る直径２０ｍｍ大、厚さ３００μｍ程度の円盤シート状に、平坦な細胞シートが作製回収できた。但し、実施例７の突起部を有するシート状細胞構造体が強度を有し、形状を維持できるのに比べて、平坦な細胞シートは強度が非常に弱く持ち上げることが困難であり、かつ、非常に早い速度で縮むため、形成している４時間の間に２０ｍｍ大にまで縮んでしまい、初期の形状を維持できないことが分かった。比較例１の平坦なシート状細胞構造体は大きさを維持できるのと比べても、平坦な細胞シートは大きさを維持できないことが分かる。
　尚、細胞の濃度を２×１０7cells～８×１０7cellsで振って作製を実施したが、いずれを使っても同様に平坦な細胞シート（細胞のみ）を作れることが確認された。但し、性質としては、実施例７の突起部を有するシート状細胞構造体が強度を有し、形状を維持できるのに比べて、平坦な細胞シートは強度が非常に弱く持ち上げることが困難であることは変わらなかった。また、非常に早い速度で縮むため、形成している４時間の間に２０ｍｍ大にまで縮んでしまい、初期の形状を維持できないことも同様であった。さらに、比較例１の平坦なシート状細胞構造体は大きさを維持できのと比べても、いずれの平坦な細胞シートは大きさを維持できないことが分かった。
［実施例と比較例の結果のまとめ］
　実施例７で作製の突起部を有するシート状細胞構造体、比較例１で作製の平坦なシート状細胞構造体、比較例２で作製できなかった突起部を有する細胞シート、並びに比較例３で作製した平坦な細胞シートの結果を図１２及び表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた結果から、細胞のみの細胞凝集、細胞シートを作る過程では底面が平坦な細胞支持体では細胞シートの形成が可能である一方、底面が窪み部を有する細胞支持体では細胞シートが作製できないことが分かる。その結果からは予想外な結果として、細胞と生体親和性高分子ブロックから成る細胞構造体においては、底面が平坦な細胞支持体でも、底面が窪み部を有する細胞支持体でも、シート状細胞構造体は形成が可能であった。さらに意外なことに、細胞のみの結果（比較例）とは逆に、細胞と生体親和性高分子ブロックから成る細胞構造体においては、底面が窪み部を有する細胞支持体で作製した突起部を有するシート状細胞構造体方が、強度を有し、形状を維持しやすくハンドリング性の良いシート状細胞構造体となることが分かった。
１　　培養支持体
１０　容器本体
１２　蓋
１４　底板部
１６　側壁部
２０　窪み部
２４　ウェル形成領域
３０　細胞接着抑制剤層
４１　シート部
４２　突起部
Ｘ　最薄部の厚さ
Ｙ　最厚部の厚さ

Claims (16)

  1. 培養面上に複数の窪み部を有する培養支持体上に、生体親和性高分子ブロック、細胞および液体培地を添加し、前記生体親和性高分子ブロックおよび前記細胞を前記窪み部の最上部に浸漬させる工程；及び
    前記細胞を培養して、シート状細胞構造体を得る工程；
    を含む、シート状細胞構造体の製造方法。
  2. 前記培養支持体が、深さが１０～２０００μｍであり、口径が１０～２０００μｍである窪み部を有する、請求項１に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  3. 培養面上の窪み部の面積が、培養面の全面積に対して７０％以上である、請求項１又は２に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  4. 互いに隣接する前記窪み部の間の培養支持体表面が、非平坦である、請求項１又は２に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  5. 前記シート状細胞構造体の最薄部の厚さが５０μｍ～５ｍｍである、請求項１から４のいずれか一項に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  6. 培養支持体の培養表面が、細胞接着抑制のための処理がなされている、請求項１から５のいずれか一項に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  7. 前記生体親和性高分子ブロックの大きさが１μｍ～７００μｍである、請求項１から６のいずれか一項に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  8. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から７のいずれか一項に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  9. リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、請求項８に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
    式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
    式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  10. リコンビナントゼラチンが、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
    配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
    の何れかである、請求項８又は９に記載のシート状細胞構造体の製造方法。
  11. 生体親和性高分子ブロックと細胞とを含むシート状細胞構造体であって、少なくとも片面に、複数の突起部を有し、前記突起部において、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている、シート状細胞構造体。
  12. 高さが１０～２０００μｍであり、直径が１０～２０００μｍである突起部を有する、請求項１１に記載のシート状細胞構造体。
  13. 最薄部の厚さが５０μｍ～５ｍｍである、請求項１１又は１２に記載のシート状細胞構造体。
  14. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のシート状細胞構造体。
  15. リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、請求項１４に記載のシート状細胞構造体。
    式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
    式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  16. リコンビナントゼラチンが、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
    配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
    の何れかである、請求項１４又は１５に記載のシート状細胞構造体。
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SATOSHI SHIRAMIZU ET AL.: "Assembly of cell sheet tissue by spheroid fusion", ABSTRACTS OF AUTUMN MEETING OF THE SOCIETY OF CHEMICAL ENGINEERS, vol. 46, 2014, Japan, XP009505396 *
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