CN108138132A - 片状细胞结构体的制造方法及片状细胞结构体 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体的制造方法、以及强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体。根据本发明，提供一种片状细胞结构体的制造方法，其包括：在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上添加生物相容性高分子嵌段物、细胞及液体培养基，将上述生物相容性高分子嵌段物及上述细胞浸渍于上述凹陷部的最上部的工序；及对上述细胞进行培养来得到片状细胞结构体的工序。
Description
技术领域
本发明涉及一种片状细胞结构体的制造方法及片状细胞结构体。
背景技术
目前，实现陷入功能障碍或功能衰竭的生物组织、器官的再生的再生医疗的实用化正在发展中。再生医疗为使用细胞、支架及生长因子这三因子将无法仅靠生物所具有的自然治愈能力恢复的生物组织再次制作成与原来的组织相同的形态或功能的新医疗技术。近年来，使用细胞的治疗逐渐得以实现。例如，在心肌病的治疗等中实施使用细胞的再生医疗时，从容易贴附于器官表面这一方面考虑，有时会利用到细胞片工程学(例如，专利文献1)。
并且，专利文献2中记载有一种细胞结构体，该细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和细胞，且在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。专利文献2中所记载的细胞结构体中，能够从外部向细胞结构体的内部传递营养，且具有充分的厚度并且细胞在结构体中均匀存在。专利文献2的实施例中，使用由重组明胶或天然明胶原材料构成的高分子嵌段物证实了高细胞生存活性。
另一方面，专利文献3中记载有一种培养基材，其特征在于，在培养基材表面形成有多个凹陷部，该凹陷部形成培养被培养物的隔室，且彼此接近的凹陷部之间的培养基材表面为非平坦面，并记载有使用该培养基材来进行球状体培养。专利文献4中记载有一种用于进行球状体培养的细胞培养容器，其特征在于，具备：培养面，形成有多个凹陷部，该凹陷部形成培养被培养物的隔室；容器主体，在底面具备培养面；及透液性盖体，载置于多个凹陷部的上部并封闭凹陷部的开口，培养面的彼此接近的凹陷部之间的顶部由非平坦面构成，透液性盖体被配置成在浸渍在容器主体内的培养液中的状态下与凹陷部之间的顶部的距离比在凹陷部内培养的被培养物外径尺寸小。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-6490号公报
专利文献2：国际公开WO2011/108517号公报
专利文献3：国际公开WO2012/036011号公报
专利文献4：日本特开2015-73520号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
在为专利文献1中所记载的细胞片的情况下，营养、氧无法到达细胞，因此存在无法制作充分厚度的细胞片这一课题。专利文献2中记载有一种包含具有生物相容性的高分子嵌段物和细胞的细胞结构体的制造方法，但未具体记载制造强度及形状维持性能优异的片体的内容。专利文献3及专利文献4中记载有使用规定的细胞培养容器来进行球状体培养的内容，但未记载制造细胞片的内容。
如上所述，期待确立一种制造包含细胞且强度及形状维持性能优异的片体的方法。本发明的课题在于提供一种强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体的制造方法、以及强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，其结果发现，在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上添加生物相容性高分子嵌段物、细胞及液体培养基，将生物相容性高分子嵌段物及细胞浸渍于凹陷部的最上部，并在上述状态下培养细胞，由此能够制造强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体。本发明是基于这些见解而完成的。
即，根据本发明，可提供以下发明。
(1)一种片状细胞结构体的制造方法，其包括：
在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上添加生物相容性高分子嵌段物、细胞及液体培养基，将上述生物相容性高分子嵌段物及上述细胞浸渍于上述凹陷部的最上部的工序；及
对上述细胞进行培养来得到片状细胞结构体的工序。
(2)根据(1)所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
上述培养支撑体具有深度为10～1500μm，且口径为10～1500μm的凹陷部。
(3)根据(1)或(2)所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
培养面上的凹陷部的面积相对于培养面的总面积为70％以上。
(4)根据(1)或(2)所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
彼此相邻的上述凹陷部之间的培养支撑体表面不平坦。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
上述片状细胞结构体的最薄部的厚度为50μm～5mm。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
培养支撑体的培养表面被实施了用于抑制细胞粘附的处理。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物的大小为1μm～700μm。
(8)根据(1)至(7)中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
(9)根据(8)所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
重组明胶由下述式表示。
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。
(10)根据(8)或(9)所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
重组明胶为以下肽中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或附加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
(11)一种片状细胞结构体，包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，其中，
在至少一个面具有多个突起部，在上述突起部上，多个上述细胞之间的间隙中配置有多个上述生物相容性高分子嵌段物。
(12)根据(11)所述的片状细胞结构体，其具有高度为10～2000μm，且直径为10～2000μm的突起部。
(13)根据(11)或(12)所述的片状细胞结构体，其中，
最薄部的厚度为50μm～5mm。
(14)根据(11)至(13)中任一项所述的片状细胞结构体，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
(15)根据(14)所述的片状细胞结构体，其中，
重组明胶由下述式表示。
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。
(16)根据(14)或(15)所述的片状细胞结构体，其中，
重组明胶为以下肽中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或附加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
发明效果
根据本发明的片状细胞结构体的制造方法，能够制造强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体。
本发明的片状细胞结构体的强度及形状维持性能优异，因此操作性能得以提高，且容易设置于器官表面。
附图说明
图1为具有培养支撑体的培养容器的立体图。
图2为培养支撑体的第一例(凹陷部之间的培养支撑体表面不平坦)的剖视图。图2(a)表示无细胞粘附抑制剂层的例，图2(b)表示有细胞粘附抑制剂层的例。
图3为培养支撑体的第二例(凹陷部之间的培养支撑体表面平坦)的剖视图。图3(a)为表示无细胞粘附抑制剂层的例，图3(b)为表示有细胞粘附抑制剂层的例。
图4为图2(a)的局部放大图。
图5为图3(a)的局部放大图。
图6表示培养支撑体的表面上的激光的照射点。
图7为表示本发明的片状细胞结构体的示意图。
图8为表示实施例的条件A的液温分布。
图9表示实施例的条件B的液温分布。
图10表示实施例的条件C的液温分布。
图11表示制作具有突起部的片状细胞结构体而得出的结果。
图12表示实施例与比较例的结果的总结。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
基于本发明的片状细胞结构体的制造方法为如下方法，该方法包括：在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上添加生物相容性高分子嵌段物、细胞及液体培养基，将上述生物相容性高分子嵌段物及上述细胞浸渍于上述凹陷部的最上部的工序；及对上述细胞进行培养来得到片状细胞结构体的工序。
本发明中，在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上添加生物相容性高分子嵌段物、细胞及液体培养基来进行培养时，在将生物相容性高分子嵌段物及细胞浸渍在凹陷部的最上部的状态下对它们进行培养。即，需要使用超出凹陷部的最上部的量的生物相容性高分子嵌段物及细胞。如上所述，通过在将生物相容性高分子嵌段物及细胞浸渍在凹陷部的最上部的状态下对它们进行培养，能够制造片状细胞结构体。在生物相容性高分子嵌段物及细胞的使用量少，生物相容性高分子嵌段物及细胞未被浸渍于凹陷部的最上部的状态下进行培养时，在每一个凹陷部形成各自的细胞结构体，从而无法形成片状细胞结构体。
在培养面上不具有凹陷部的培养支撑体上，培养生物相容性高分子嵌段物及细胞时会得到较脆的片状细胞结构体。本发明中，发现了在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上，培养生物相容性高分子嵌段物及细胞的情况下，能够制造强度及形状维持性能(不卷曲)优异的片状细胞结构体。
专利文献3及专利文献4中记载有一种在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体。专利文献3及专利文献4中记载有在每一个凹陷部中制造出各自的球状体(即，每1个凹陷部制造出1个球状体)，并同时制造多个球状体的内容，但未记载在将细胞浸渍在凹陷部的最上部的状态下对其进行培养来制造片状细胞结构体的内容。并且，专利文献3及专利文献4中对生物相容性高分子嵌段物的使用也无记载。
如本说明书中后述的实施例及比较例中所示，在仅使用细胞的情况下，与通过在表面具有凹陷部的细胞支撑体来制造的情况相比，通过表面平坦的细胞支撑体来制造时可得到良好的结果。与此相反地，通过本发明发现使用细胞和生物相容性高分子嵌段物来制造细胞结构体的情况下，与通过表面平坦的细胞支撑体来制造的情况相比，通过在表面具有凹陷部的细胞支撑体来制造时可得到良好的结果。
根据本发明，能够简单地且在短时间内制造强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体，但在仅使用细胞的情况下和在使用细胞和生物相容性高分子嵌段物的情况下，更优选的细胞支撑体的形态完全相反则表示本发明的效果是完全出乎预料的。
通过本发明的方法制造的片状细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段物和细胞。另外，本说明书中，有时将细胞结构体还称为镶嵌细胞团(呈镶嵌状细胞团)。
(1)培养支撑体
本发明中，使用在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体。
参考图1至图6来对本发明中所使用的培养支撑体的例进行说明。
图1中，培养支撑体1为培养生物相容性高分子嵌段物及细胞来制造片状细胞结构体的培养容器的主要部分。
如图1所示，培养容器具有容器主体10及盖12。图1所示的例中，容器主体10的内侧的底板部14为相当于培养支撑体1的部分。容器主体10的内侧的底板部14、即培养支撑体1例如可以由聚苯乙烯等合成树脂材料或玻璃构成。培养支撑体1能够通过使用合成树脂材料的注射成型来制造。
容器主体10具有圆板状底板部14及环状侧壁部16。另外，容器的形状可以是圆板状以外的形状，也可以是四方形等形状。侧壁部16从底板部14的外周边缘立起。底板部14的直径例如能够设为30mm～500mm，底板部14的厚度例如能够设为0.5mm～10mm，侧壁部16的高度例如能够设为20mm～100mm，而无特别限定。
盖12在容器主体10形成为与上方的开口部对应的形状。为了维持细胞的培养环境，能够将盖12覆盖在容器主体10而使用。
在底板部14的上表面(即，相当于容器主体10的内侧的面的培养基材的上表面)的阱形成区域24(即，形成培养被培养物的隔室的区域)中，如图2或图3所示，形成有多个凹陷部20。凹陷部20的内表面呈光滑的凹面。凹陷部20形成培养被培养物的隔室(阱)。
图2(a)及图3(a)所示的例中，不存在细胞粘附抑制剂层。图2(b)及图3(b)所示的例中，设置有细胞粘附抑制剂层30。
凹陷部的深度无特别限定，优选为10～2000μm，更优选为20～1000μm，进一步优选为30～700μm，进一步优选为50～500μm，最优选为100～400μm。
凹陷部的口径无特别限定，优选为10～2000μm，更优选为50～1500μm，进一步优选为100～1500μm，进一步优选为200～1000μm，最优选为400～800μm。
在与细胞的大小的关系中，从得到强度及形状维持性能优异的片状细胞结构体的观点考虑，优选将凹陷部的深度及口径设为上述范围。
另外，凹陷部具有上述深度及口径时，无需培养支撑体上的所有的凹陷部具有上述深度及口径，可以是至少一部分凹陷部具有上述深度及口径。
如图4及图5所示，凹陷部的深度是指凹陷部的最下部与最上部之间的高度。如图4及图5所示，凹陷部的口径是指连结凹陷部的最上部的点的长度。另外，如图5所示，当凹陷部的最上部平坦时，选择凹陷部的最上部，以使连结凹陷部的最上部的点的长度最短。
凹陷部的形状(包括深度及口径)可以均匀，也可以不均匀，但优选均匀。凹陷部的深度及口径优选均匀，所有的凹陷部的深度及口径优选实质上相同。
凹陷部20例如能够通过对培养支撑体表面的阱形成区域24照射激光而形成。关于激光照射，如图6所示，对设置在x-y面上的底板部14的上表面，沿z轴方向照射激光来进行。
首先，使激光照射装置的照射部沿x轴的正方向进行扫描的同时按恒定间隔(例如800μm)照射激光，从而形成沿x轴方向排列的多个凹陷部20。接着，使照射部沿y轴方向仅扫描恒定距离(例如400μm)之后，使照射部沿x轴的负方向进行扫描的同时按恒定间隔(例如800μm)照射激光，从而形成沿x轴方向排列的多个凹陷部20。同样地，使照射部沿y轴方向仅扫描恒定距离(例如400μm)。反复进行该操作，从而形成在底板部14的上表面有规则地排列的多个凹陷部20。
如图6所示，将照射点A的中心坐标(x、y)设为原点(0、0)时，接近照射点A的照射点B的中心位于(0.8、0)，照射点C的中心位于(0.4、0.4)，照射点D的中心位于(-0.4、0.4)。如此，通过使照射点A、B的x坐标与照射点C、D的x坐标偏离，能够在阱形成区域24稠密地形成多个凹陷部20。凹陷部20优选在培养基材1的阱形成区域24的每一单位面积形成10个/cm2～10000个/cm2。进一步优选为20个/cm2～8000个/cm2，进一步优选为20个/cm2～3000个/cm2，进一步优选为50个/cm2～1000个/cm2，进一步优选为100个/cm2～500个/cm2，尤其优选为100个/cm2～300个/cm2。
激光光源中使用CO2激光，激光能够以输出10W、照射速度6100mm/min进行脉冲照射，但并无特别限定。
另外，照射点的形状为圆形，相对于此，凹陷部20的开口形状扁平而呈大致椭圆形。认为该开口形状的扁平是在容器主体10成型时合成树脂材料流入模具的方向引起的。
对培养基材表面(底板部14的上表面)照射激光时，构成底板部14的合成树脂材料会溶解而形成凹陷部20。
通过调节激光的照射位置和输出量等照射条件，能够调节接近的凹陷部20之间的距离、凹陷部20的直径/深度、彼此接近的凹陷部20之间的培养基材表面的宽度/高度等。
培养支撑体1还能够使用具备形成多个凹陷部20的凸部及形成凹陷部之间的培养支撑体表面的凹部的模具来对合成树脂材料料进行注射成型而制造。多个凹陷部20及凹陷部之间的培养支撑体表面与培养基材1的成型同时形成。使用模具并通过注射成型来制造培养支撑体1，由此能够形成均匀性更高的凹陷部20。
培养面上的凹陷部的面积相对于培养面的总面积优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，最优选为100％。从本发明的效果的观点考虑，优选将凹陷部的面积的比例设为上述范围。
凹陷部的面积是指，从上方观察凹陷部的情况下二维捕捉到凹陷部时的面积，且是指以本说明书中上述的凹陷部的口径规定的区域的面积。如图2或图4所示，在培养面上不存在平坦部的情况下，培养面上的凹陷部的面积相对于培养面的总面积为100％。
彼此相邻的2个凹陷部20隔着凹陷部之间的培养支撑体表面而形成。彼此接近的凹陷部20之间的培养基材表面可以平坦，也可以不平坦，但优选不平坦。
底板部14的上表面、即培养支撑体的培养表面优选被实施用于抑制细胞粘附的处理。由此，培养出片状细胞结构体之后，能够轻松地进行剥离。作为用于抑制细胞粘附的处理，可列举利用细胞粘附抑制剂进行覆盖的情况(参考图2(b)及图3(b))。细胞粘附抑制剂发挥抑制细胞粘附于底板部14的上表面(尤其凹陷部20的内表面)的作用。作为细胞粘附抑制剂，例如可使用磷脂聚合物、MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)、聚甲基丙烯酸羟乙酯或聚乙二醇等。
(2)生物相容性高分子嵌段物
(2-1)生物相容性高分子
生物相容性是指，与生物接触时，不会引起如长期且慢性炎症反应等明显的不良反应。若本发明中所使用的生物相容性高分子对生物具有相容性，则对于是否在生物内被降解并无特别限定，优选为生物降解性高分子。作为非生物降解性材料，具体而言，可列举聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、不锈钢、钛、硅酮及MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)等。作为生物降解性性材料，具体而言，可列举天然来源的肽、重组肽或化学合成肽等多肽(例如，以下进行说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。上述中，尤其优选重组肽。这些生物相容性高分子中可以被实施提高细胞粘附性的改进。具体而言，能够使用“基于对基材表面的细胞粘附基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白)或细胞粘附序列(以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽的涂布”、“基材表面的氨基化、阳离子化”或“基材表面的等离子体处理、基于电晕放电的亲水处理”等方法。
若包含重组肽或化学合成肽的多肽的种类具有生物相容性，则并无特别限定，例如优选明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、Pronectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、RetroNectin，最优选为明胶、胶原蛋白、去端肽胶原蛋白。作为本发明中所使用的明胶，优选为天然明胶、重组明胶或化学合成明胶，更优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指由天然来源的胶原蛋白制成的明胶。
化学合成肽或化学合成明胶是指人工合成的肽或明胶。明胶等肽的合成可以是固相合成，也可以是液相合成，优选为固相合成。肽的固相合成乃是本领域技术人员所熟知的，例如可列举作为氨基的保护而使用Fmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基：芴-甲氧基-羰基)的Fmoc基合成法、以及作为氨基的保护而使用Boc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基：叔丁基氧基羰基)的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式能够套用本说明书中后述的(2-3)重组明胶中所记载的内容。
关于重组明胶，将在本说明书中进行后述。
本发明中所使用的生物相容性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选0～1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB是指基于由藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机示意图的亲疏水性的指标，其详细内容例如在“Pharmaceutical Bulletin：药学通报”，vol.2,2,pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11,10,pp.719-725(1957)、“Fragrance Journal”，vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的来源设为甲烷(CH4)，且将其他化合物均视为甲烷的衍生物来将其碳原子数、取代基、转变部、环等分别设定为一定数值，相加其分数来求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值标绘在以有机性值作为X轴，以无机性值作为Y轴的图上。有机示意图中的IOB是指，有机示意图中的无机性值(IV)相对于有机性值(OV)之比、即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机示意图的详细内容，可参考“新版有机示意图-基础与应用”(甲田善生等编著，三共出版、2008)。本说明书中，以取IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲疏水性。“1/IOB”值越小(接近0)，则越为表示亲水性的标注。
通过将本发明中所使用的高分子的“1/IOB”值设为上述范围，亲水性变高，并且吸水性变高，因此将有效地作用于营养成分的保持。
当本发明中所使用的生物相容性高分子为多肽时，由亲水性平均(Grand averageof hydropathicity)(GRAVY)值表示的亲疏水性指标中，优选为0.3以下且负9.0以上，进一步优选为0.0以下且负7.0以上。亲水性平均(GRAVY)值能够通过“Gasteiger E.,HooglandC.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；ProteinIdentification and Analysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“GasteigerE.,Gattiker A.,Hoogland C.,Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：theproteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.；Nucleic AcidsRes.31：3784-3788(2003).”的方法而得到。
通过将本发明中所使用的高分子的GRAVY值设为上述范围，亲水性变高，并且吸水性变高，因此将有效地作用于营养成分的保持。
(2-2)交联
本发明中所使用的生物相容性高分子可以被交联，也可以不被交联，但优选被交联。通过使用被交联的生物相容性高分子，能够得到防止在培养基中培养时及移植到生物时瞬间降解的效果。作为通常的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳二亚胺、氰胺等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键、离子性相互作用等，本发明中也能够使用上述交联方法。作为本发明中所使用的交联方法，进一步优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。
当进行基于酶的交联时，作为酶，只要具有高分子材料之间的交联作用，则并无特别限制，能够优选使用谷氨酰胺转氨酶及漆酶，最优选使用谷氨酰胺转氨酶来进行交联。作为用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的蛋白质的具体例，只要为具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以是哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶，也可以是微生物来源的谷氨酰胺转氨酶，具体而言，可列举AJINOMOTO CO.,INC.制ACTIVA系列、作为试剂而出售的哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶、例如，Oriental Yeast Co.,ltd.制、Upstate USA Inc.制、Biodesign International制等豚鼠肝脏来源谷氨酰胺转氨酶、山羊来源谷氨酰胺转氨酶、兔子来源谷氨酰胺转氨酶等、人来源凝血因子(Factor XIIIa，Haematologic Technologies,Inc.)等。
进行交联(例如，热交联)时的反应温度只要能够进行交联，则并无特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，进一步优选为120℃～200℃。
(2-3)重组明胶
本发明中所述的重组明胶是指，通过基因重组技术制成的类似明胶的具有氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。本发明中能够使用的重组明胶优选具有胶原蛋白中特征性的由Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸的任一种)的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。优选在一分子中含有两个序列以上的细胞粘附信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有来源于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176、US专利6992172号、国际公开WO2004/85473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但并不限定于此。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的重组明胶为以下形态的重组明胶。
重组明胶因天然明胶原有的性能而生物相容性优异，并且因非天然来源而不存在牛海绵状脑病(BSE)等忧患，从而非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀，且序列已确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而模糊较少且精密设计。
重组明胶的分子量并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选具有胶原蛋白中特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选为除甘氨酸以外的任意氨基酸)。胶原蛋白中特征性的由Gly-X-Y表示的序列为明胶-胶原蛋白的氨基酸组成及序列中的与其他蛋白质相比非常特殊的部分结构。在该部分，甘氨酸占整体的约3分之1，在氨基酸序列三个中一个为重复。甘氨酸为最简单的氨基酸，对分子链的配置的束缚也较少，且在凝胶化时大大有助于螺旋结构的再生。由X及Y表示的氨基酸含有较多的亚氨基酸(脯氨酸、氧脯氨酸)，优选占整体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上，进一步优选95％以上，最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
通常的明胶中，极性氨基酸中的带电荷的氨基酸与无电荷的氨基酸以1:1存在。在此，极性氨基酸具体指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，其中极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有的氨基酸中的极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，优选上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例为5％以上且小于20％，优选为小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，优选不包含两个以上的氨基酸。
通常多肽中，已知作为细胞粘附信号而作动的最小氨基酸序列(例如，NagaiShoten Co.,Ltd.发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有两个以上的这些细胞粘附信号。作为具体的序列，从粘附的细胞的种类多这一方面考虑，优选以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。进一步优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产生量。例如，作为细胞，在使用间充质干细胞的软骨分化的情况下，能够提高糖胺聚糖(GAG)的产生。
作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间(优选在25～60之间)并不均匀。
关于该最小氨基酸序列的含量，从细胞粘附、增殖性的观点考虑，在蛋白质1分子中优选为3～50个，进一步优选为4～30个，尤其优选为5～20个。最优选为12个。
本发明中所使用的重组明胶中，优选RGD基序相对于氨基酸总数的比例至少为0.4％。当重组明胶包含350以上的氨基酸时，优选350个氨基酸的各段至少包含一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例进一步优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，进一步优选至少为1.0％，进一步优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。重组肽内的RGD基序的数量在每250个氨基酸中优选至少为4个，进一步优选为6个，进一步优选为8个，进一步优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％这一比例对应于在每250个氨基酸中有至少一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶应至少包含两个RGD序列。优选本发明的重组明胶在每250个氨基酸中至少包含两个RGD序列，更优选在每250个氨基酸中至少包含3个RGD序列，进一步优选在每250个氨基酸中至少包含4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的又一方式，至少包含4个RGD基序，优选包含6个，更优选包含8个，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以部分水解。
优选本发明中所使用的重组明胶由式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种。m优选表示2～10的整数，更优选表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，进一步优选为15～70的整数，最优选为50～65的整数。A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。
更优选本发明中所使用的重组明胶由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸的任一种，63个Y分别独立地表示氨基酸的任一种。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。)表示。
优选重复单元与多个天然存在的胶原蛋白的序列单元键合。在此所述的天然存在的胶原蛋白只要是天然存在的，则并无限制，优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原蛋白。更优选为I型、II型或III型胶原蛋白。根据另一方式，上述胶原蛋白的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选为人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测定，如等电点电泳法(Maxey,C.R.(参考1976；Phitogr.Gelatin 2,Editor Cox,P.J.Academic,London,Engl.))中所记载，能够通过对将1质量％明胶溶液通入阳离子及阴离子交换树脂的混晶柱之后的pH进行测定来实施。
优选重组明胶没有被脱氨化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶为由对氨基酸序列进行编码的核酸制备的实质上的纯多肽。
作为本发明中所使用的重组明胶，尤其优选以下肽中的任一个：
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或附加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
(3)由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上(进一步优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
“缺失、替换或附加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列”中的“一个或多个”是指，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个，尤其优选1～3个。
关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术而制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/85473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，将其编入表达载体来制作重组表达载体，并将其导入到适当的宿主来制作形成转化体。通过使用适当的培养基对所得到的转化体进行培养而产生重组明胶，因此能够通过回收从培养物产生的重组明胶来制备本发明中所使用的重组明胶。
(2-4)生物相容性高分子嵌段物
本发明中，使用由上述生物相容性高分子组成的嵌段物(块)。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状并无特别限定。例如，为无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状、多孔状、纤维状、纺锤状、扁平状及片状，优选无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状及多孔状。无规则形表示表面形状不均匀的形状，例如表示如岩石那样的具有凹凸的物体。另外，上述形状的例示并不是分别独立的，例如有时还作为粒状(颗粒)的下位概念的一例而成为无规则形。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状如上述那样并无特别限定，振实密度优选为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下，更优选为20mg/cm3以上且400mg/cm3以下，进一步优选为40mg/cm3以上且220mg/cm3以下，尤其优选为50mg/cm3以上且150mg/cm3以下。
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，值越小，则越无法紧密地填充，即可知嵌段物的结构复杂。认为生物相容性高分子嵌段物的振实密度表示生物相容性高分子嵌段物的表面结构的复杂性及作为聚集体而聚集生物相容性高分子嵌段物时形成的空隙的量。振实密度越小，生物相容性高分子嵌段物之间的空隙越大，细胞的移植区域越大。并且，认为由于不会过小而能够在细胞彼此之间适当地存在生物相容性高分子嵌段物，且作为细胞结构体时能够向相同结构体内部传递营养成分，因此优选抑制在上述范围内。
本说明书中所述的振实密度能够如下测定。为了测定而准备(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的容器(以下，记载为帽)。首先，仅测定帽的质量。然后，将帽装在漏斗上，并使嵌段物从漏斗流入而使其积蓄在帽中。添加充分量的嵌段物之后，将帽部分在桌子等较硬的部位敲击200次并卸下漏斗，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽的状态下测定质量。通过从与仅帽的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽的体积而能够求出振实密度。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的交联度并无特别限定，优选为2以上，进一步优选为2以上且30以下，进一步优选为4以上且25以下，尤其优选为4以上且22以下。
生物相容性高分子嵌段物的交联度(每一分子的交联数)的测定方法并无特别限定，例如能够通过后述实施例中所记载的TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法来测定。具体而言，制备将生物相容性高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合而在37℃下反应3小时之后停止反应的样品和刚将生物相容性高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合之后停止反应的空白培养基(blank)，并分别测定用纯水进行稀释的样品及空白培养基的吸光度(345nm)，从而能够从以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g生物相容性高分子嵌段物的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示生物相容性高分子嵌段物质量(mg)。)
(式3)1-(样品(式2)/未交联的高分子(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的吸水率并无特别限定，优选300％以上，更优选400％以上，进一步优选500％以上，尤其优选700％以上，最优选800％以上。另外，吸水率的上限并无特别限定，通常为4000％以下或2000％以下。
生物相容性高分子嵌段物的吸水率的测定方法并无特别限定，例如能够通过后述实施例中所记载的方法进行测定。具体而言，在25℃下于3cm×3cm的尼龙网孔制的袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，并使其在离子交换水中膨润两小时之后，风干10分钟，在每一阶段测定质量，从而能够根据(式4)来求出吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中，w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋的质量，w2表示包括吸水后的材料的袋整体的质量。)
本发明中的一个生物相容性高分子嵌段物的大小并无特别限定，优选为1μm以上且700μm以下，更优选为10μm以上且700μm以下，进一步优选为10μm以上且300μm以下，进一步优选为20μm以上且200μm以下，进一步优选为20μm以上且150μm以下，尤其优选为53μm以上且106μm以下。通过将一个生物相容性高分子嵌段物的大小设定在上述范围内，能够良好地从外部向细胞结构体的内部传递营养。另外，一个生物相容性高分子嵌段物的大小并不是指多个生物相容性高分子嵌段物的大小的平均值在上述范围内，而是指对多个生物相容性高分子嵌段物进行过筛而得到的每一个生物相容性高分子嵌段物的尺寸。
一个嵌段物的大小能够由对嵌段物进行区分时所使用的筛子的大小来定义。例如，能够使将用180μm的筛子进行过筛，并用106μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为106～180μm大小的嵌段物。接着，能够使将用106μm的筛子进行过筛，并用53μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为53～106μm大小的嵌段物。接着，能够使将用53μm的筛子进行过筛，并用25μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为25～53μm大小的嵌段物。
(2-5)生物相容性高分子嵌段物的制造方法
生物相容性高分子嵌段物的制造方法并无特别限定，例如使用粉碎机(New PowerMill等)对含有生物相容性高分子的固态物质(生物相容性高分子的多孔体等)进行粉碎，由此能够得到生物相容性高分子嵌段物。含有生物相容性高分子的固态物质(多孔体等)例如能够通过对含有生物相容性高分子的水溶液进行冷冻干燥来得到。
如上所述，能够通过对含有生物相容性高分子的固态物质进行粉碎来制造表面形状不均匀的无规则形生物相容性高分子嵌段物。
作为生物相容性高分子的多孔体的制造方法的一例，能够列举如下方法，该方法包括：
工序(a)，在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，并且在溶液内液温最高的部分的温度为溶剂的熔点以下，将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态；
工序(b)，对在工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻；及
工序(c)，对在工序(b)中所得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥。
将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态时，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下(优选2.3℃以下，更优选2.1℃以下)，即通过减小温度差，所得到的多孔质孔的大小偏差得以减少。另外，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差的下限并无特别限定，只要是0℃以上即可，例如可以是0.1℃以上、0.5℃以上、0.8℃以上或0.9℃以上。
关于工序(a)的冷却，例如优选经由导热率比水低的原材料(优选特氟龙(注册商标))进行冷却，能够将在溶液内液温最高的部分假设为最远离冷却侧的部分，且能够将在溶液内液温最低的部分假设为冷却面的液温。
优选在工序(a)中，在即将产生凝固热之前的、在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，更优选为2.3℃以下，进一步优选为2.1℃以下。其中，“即将产生凝固热之前的温度差”是指，产生凝固热时的1秒钟前～10秒钟前之间温度差变最大时的温度差。
优选在工序(a)中，在溶液内液温最低的部分的温度为溶剂熔点-5℃以下，更优选为溶剂熔点-5℃以下且溶剂熔点-20℃以上，进一步优选溶剂熔点-6℃以下且溶剂熔点-16℃以上。另外，溶剂熔点的溶剂为生物相容性高分子的溶液的溶剂。
在工序(b)中，对在工序(a)得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序(b)用于冷冻的冷却温度并无特别限制，还取决于进行冷却的机器，但优选为比在溶液内液温最低的部分的温度低3℃～30℃的温度，更优选为低5℃～25℃的温度，进一步优选为低10℃～20℃的温度。
在工序(c)中，对在工序(b)得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥。冷冻干燥能够通过常规方法进行，例如能够通过在比溶剂的熔点低的温度下进行真空干燥，进而在室温(20℃)下进行真空干燥来进行冷冻干燥。
本发明中优选能够通过对在上述工序(c)中得到的多孔体进行粉碎而制造生物相容性高分子嵌段物。
(3)细胞
本发明中所使用的细胞只要是可进行作为本发明的片状细胞结构体的目的的细胞移植的细胞，则能够使用任意细胞，其种类无特别限定。并且，所使用的细胞可以是1种，也可以组合使用多种细胞。并且，作为所使用的细胞，优选为动物细胞，更优选为脊椎动物来源细胞，尤其优选为人来源细胞。脊椎动物来源细胞(尤其人来源细胞)的种类可以是多能细胞、成体干细胞、前体细胞、或成熟细胞中的任一种。作为多能细胞，例如能够使用胚性干(ES)细胞、生殖干(GS)细胞或人工多能性干(iPS)细胞。作为成体干细胞，例如能够使用间充质干细胞(MSC)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、骨髓来源细胞、心肌干细胞、脂肪来源干细胞或神经干细胞。作为前体细胞及成熟细胞，例如能够使用来源于皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨骼、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、脾脏、口腔内、角膜、骨髓、脐带血、羊膜或毛的细胞。作为人来源细胞，例如能够使用ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、成骨前体细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、成心肌细胞、神经细胞、肝细胞、β细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、骨髓来源细胞或造血干细胞。并且，细胞的来源可以是自体细胞或异体细胞中的任一种。
例如，重症心力衰竭、重度心肌梗塞等心脏疾病中，能够优选使用从自体及异体摘取的心肌细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、骨骼肌来源细胞(尤其卫星细胞)、骨髓细胞(尤其分化成心肌样细胞的骨髓细胞)等。而且，在其他器官中，能够适当选择移植细胞。例如，能够列举对脑缺血/脑梗塞部位的神经前体细胞或能够分化成神经细胞的细胞的移植、对心肌梗塞部位/骨骼肌缺血部位的血管内皮细胞或能够分化成血管内皮细胞的细胞的移植等。
并且，可列举对糖尿病性器官障碍的细胞移植中所使用的细胞。例如，可列举对于肾脏、胰腺、末梢神经、眼、四肢的血液循环障碍等疾病进行了各种研究的细胞移植治疗法用细胞。即，尝试向胰岛素分泌能力降低的胰腺移植胰岛素分泌细胞，且研究了对于四肢血液循环障碍的骨髓来源细胞的移植等，并能够使用这种细胞。
并且，本发明中，还能够使用血管细胞。本说明书中，血管细胞是指与血管形成有关的细胞，且为构成血管及血液的细胞及能够分化成该细胞的前体细胞、成体干细胞。其中，血管细胞中不包含不会自然分化成ES细胞、GS细胞或iPS细胞等多能细胞、如间充质干细胞(MSC)那样的构成血管及血液的细胞的细胞。作为血管细胞，优选为构成血管的细胞。脊椎动物来源细胞(尤其人来源细胞)中，作为构成血管的细胞的具体例，能够列举血管内皮细胞及血管平滑肌细胞。血管内皮细胞可以是静脉内皮细胞及动脉内皮细胞中的任一种。作为血管内皮细胞的前体细胞，能够使用血管内皮前体细胞。优选为血管内皮细胞及血管内皮前体细胞。作为构成血液的细胞，能够使用血细胞，并能够使用淋巴细胞和中性粒细胞等白细胞、单核细胞、作为它们的干细胞的造血干细胞。
本说明书中，非血管细胞是指除上述血管细胞以外的细胞。例如，能够使用ES细胞、iPS细胞、间充质干细胞(MSC)、心肌干细胞、心肌细胞、成纤维细胞、成肌细胞、软骨细胞、成肌细胞、肝细胞或神经细胞。优选能够使用MSC、软骨细胞、成肌细胞、心肌干细胞、心肌细胞、肝细胞或iPS细胞。更优选为MSC、心肌干细胞、心肌细胞或成肌细胞。
(4)片状细胞结构体的制造方法
本发明中，通过如下工序来制造片状细胞结构体，即在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上添加生物相容性高分子嵌段物、细胞及液体培养基，将上述生物相容性高分子嵌段物及上述细胞浸渍于上述凹陷部的最上部的工序；及培养上述细胞来得到片状细胞结构体的工序。在培养细胞来得到片状细胞结构体之后，可以根据需要而包括从培养支撑体剥离片状细胞结构体的工序。
具体而言，制备在液体培养基中包含生物相容性高分子嵌段物和细胞的悬浮液，将上述悬浮液添加到具有凹陷部的培养支撑体上，并将生物相容性高分子嵌段物及细胞浸渍于凹陷部的最上部即可。
作为液体培养基，例如可以是生长培养基或分化培养基。
作为生长培养基，能够列举TAKARA BIO：MSCGM BulletKit(商标)、Lonza：EGM-2+ECFC serum supplement等，但并无特别限定。
作为分化培养基，能够列举TAKARA BIO：间充质干细胞软骨细胞分化培养基：Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium、TAKARA BIO：间充质干细胞成骨细胞分化培养基：Mesenchymal Stem Cell Osteogenic DifferentiationMedium等，但并无特别限定。
细胞的培养能够根据需要而在CO2培养箱内进行，通常能够在30～45℃下，优选在35℃～40℃(例如，37℃)下进行1小时～72小时，优选进行1小时～24小时，更优选进行1小时～12小时，进一步进行2小时～8小时。培养可以是静置培养，也可以是振荡培养。
通过上述的培养，细胞彼此直接融合和/或细胞彼此经由生物相容性高分子嵌段物而融合，从而制造片状细胞结构体。
所制造的片状细胞结构体的大小无特别限定，最薄部的厚度优选为50μm～5mm，更优选为100μm～3mm，进一步优选为200μm～2mm。
将本发明的片状细胞结构体的示意图示于图7。片状细胞结构体由片部41和多个突起部42构成。片状细胞结构体的最薄部的厚度X表示除了突起部以外的片部的厚度。片状细胞结构体的最厚部的厚度Y表示包括片状细胞结构体的突起部的最厚的部分的厚度。
(5)片状细胞结构体
本发明的片状细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，其中，在至少一个面具有多个突起部，在上述突起部上，多个上述细胞之间的间隙中配置有多个上述生物相容性高分子嵌段物。本发明的片状细胞结构体具有多个突起部，由此发挥强度及形状维持性能优异的效果。
在本发明的片状细胞结构体的至少一部分中，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物。即，可以在在片状细胞结构体的所有的部位中，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，或者也可以在片状细胞结构体的一部分部位中，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且在片状细胞结构体的其他部位仅存在细胞。并且，也可以存在仅存在生物相容性高分子嵌段物的部位。
作为本发明的片状细胞结构体的一例，能够列举在片状细胞结构体的下部(例如，突起部)，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且在片状细胞结构体的上部(例如，片部)仅存在细胞的片状细胞结构体。
作为本发明的片状细胞结构体的另一例，能够列举在片状细胞结构体的下部(例如，突起部)及片状细胞结构体的上部(例如，片部)，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的片状细胞结构体。
本发明中，从片状细胞结构体的强度及形状维持性能的观点考虑，优选至少在突起部上，在多个细胞之间的间隙之间配置有多个生物相容性高分子嵌段物。
片状细胞结构体的突起部为由培养支撑体的凹陷部形成的部分，因此突起部的高度及直径与凹陷部的深度及口径对应。但是，从细胞的培养至剥离期间，有时片状细胞结构体的突起部会收缩，因此突起部的高度及直径有时也会变得比凹陷部的深度及口径小。
突起部的深度无特别限定，优选为10～2000μm，更优选为20～1000μm，进一步优选为30～700μm，进一步优选为50～500μm，最优选为100～400μm。
突起部的直径无特别限定，优选为10～2000μm，更优选为50～1500μm，进一步优选为100～1500μm，进一步优选为200～1000μm，最优选为400～800μm。
另外，当突起部具有上述深度及直径时，片状细胞结构体的所有的突起部无需都具有上述深度及直径，可以是至少一部分凹陷部具有上述深度及直径。
突起部的形状(包含深度及直径)可以均匀，也可以不均匀，优选均匀。突起部的深度及直径优选均匀，所有的突起部的深度及直径优选实质上相同。
片状细胞结构体的最薄部的厚度与本说明书中上述的内容相同。
本发明中，使用生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙将多个生物相容性高分子嵌段物三维配置成镶嵌状。由此，能够从外部向细胞结构体的内部传递营养。
本发明的细胞结构体的至少一部分区域中，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，在此“细胞之间的间隙”无需为被所构成的细胞封闭的空间，而只要被细胞夹持即可。另外，无需在所有的细胞之间存在间隙，也可以存在细胞彼此接触的部位。隔着生物相容性高分子嵌段物的细胞之间的间隙的距离、即选择一细胞与存在于离该细胞最短距离处的细胞时的间隙距离并无特别限制，优选为生物相容性高分子嵌段物的大小，优选的距离也为生物相容性高分子嵌段物的优选的大小范围。
并且，生物相容性高分子嵌段物成为被细胞夹持的构成，但无需在所有的生物相容性高分子嵌段物之间存在细胞，也可以存在生物相容性高分子嵌段物彼此接触的部位。隔着细胞的生物相容性高分子嵌段物之间的距离、即选择生物相容性高分子嵌段物和存在于离该生物相容性高分子嵌段物最短距离处的生物相容性高分子嵌段物时的距离并无特别限制，优选为所使用的细胞聚集1～数个时的细胞块的大小，例如为10μm以上且1000μm以下，优选为10μm以上且500μm以下，更优选为10μm以上且200μm以下。
本发明的片状细胞结构体中，细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率并无特别限定，优选每一个细胞的生物相容性高分子嵌段物的比率为0.0000001μg以上且1μg以下，进一步优选为0.000001μg以上且0.1μg以下，更优选为0.00001μg以上且0.01μg以下，最优选为0.00002μg以上且0.006μg以下。通过将细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率设为上述范围，能够使细胞更加均匀的存在。通过将下限设为上述范围，能够发挥在所希望的用途中使用时的细胞的效果，通过将上限设为上述范围，能够向细胞供给任意存在的生物相容性高分子嵌段物中的成分。在此，生物相容性高分子嵌段物中的成分并无特别限制，可列举液体培养基中所含有的成分。
(6)片状细胞结构体的用途
本发明的片状细胞结构体能够使用于细胞移植中。具体而言，本发明的片状细胞结构体例如能够以对重症心力衰竭、重度心肌梗塞等心脏疾病、脑缺血/脑梗塞等疾病部位移植细胞为目的而使用。并且，还能够对糖尿病性的肾脏、胰腺、肝脏、末梢神经、眼、四肢血液循环障碍等疾病使用。
作为移植方法，能够使用切割、内窥镜等。
并且，根据本发明，提供一种包括将本发明的片状细胞结构体移植到需要细胞移植的患者的工序的细胞移植方法。本发明的细胞移植方法中，使用上述本发明的片状细胞结构体。片状细胞结构体的优选范围与上述相同。
而且，根据本发明，提供一种用于制造细胞移植治疗剂的本发明的片状细胞结构体的使用。根据本发明，优选片状细胞结构体的优选范围与上述相同。
而且，根据本发明，提供一种包含本发明的片状细胞结构体的细胞移植治疗剂。根据本发明，片状细胞结构体的优选范围与上述相同。
通过以下实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定于实施例。
实施例
[实施例1]重组肽(重组明胶)
作为重组肽(重组明胶)准备了以下CBE3(记载于国际公开WO2008/103041号公报中)。
CBE3：
分子量：51.6kD
结构：GAP[(GXY)63]3G
氨基酸数：571个
RGD序列：12个
亚氨基酸含量：33％
大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323
氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。但将末尾的X修正为“P”)
GAP
(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[实施例2]重组肽多孔体的制作
[PTFE厚/圆筒形容器]
准备了底面厚度3mm、直径51mm、侧面厚度8mm、高度25mm的聚四氟乙烯(PTFE)制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被8mm的PTFE密封，且底面(平板圆形)也被3mm的PTFE密封。另一方面，上面呈开放的形状。从而，圆筒杯的内径成为43mm。以下，将该容器称为PTFE厚/圆筒形容器。
[铝玻璃板/圆筒形容器]
准备了厚度1mm、直径47mm的铝制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被1mm的铝密封，且底面(平板圆形)也被1mm的铝密封。另一方面，上面呈开放的形状。并且，仅在侧面的内部均匀地铺满了壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果，圆筒杯的内径成为45mm。并且，将该容器的底面设为呈在铝的外侧接合2.2mm的玻璃板的状态。以下，将该容器称为铝玻璃/圆筒形容器。
[温度差小的冷冻工序及干燥工序]
使CBE3水溶液流入PTFE厚/圆筒形容器、铝玻璃板/圆筒形容器，并在真空冷冻干燥机(TF5-85ATNNN：宝制作所)内使用冷却搁板从底面冷却了CBE3水溶液。此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及搁板温度的设定的组合按照如下所记载的那样进行了准备。
条件A：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下使搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
条件B：
铝/玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
条件C：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量10mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
[各冷冻工序中的温度测定]
关于条件A～条件C的每一个，作为在溶液内最远离冷却侧的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的水表面液温，并且，作为在溶液内最接近冷却侧的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。
其结果，各自的温度与其温度差的分布成为如图8～图10。
从图8、图9、图10可知，在条件A、条件B、条件C下，液温在搁板温度-10℃设定区间(降低到-20℃之前)低于熔点即0℃，并且其状态处于不会发生冷冻(未冷冻/过冷却)状态。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2.5℃以下。另外，本说明书中，“温度差”是指“非冷却面液温”-“冷却面液温”。然后，将搁板温度进一步降低到-20℃，由此确认到液温向0℃附近急速上升的时刻，可知是在此产生凝固热而开始进行冷冻的。并且，确认到是在该时刻实际上开始形成冰的。然后，温度在0℃附近经过一定时间。在此，成为存在水与冰的混合物的状态。最后，温度从0℃再次开始下降，此时，液体部分消失而成为冰。从而，所测定的温度成为冰内部的固态温度，即并非液温。
以下，关于条件A、条件B、条件C，记载非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差、将搁板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差及产生凝固热紧前的温度差。另外，本发明中所述的“紧前的温度差”表示能够在活动(产生凝固热等)的1秒钟前～20秒钟前的期间检测出的温度差内的最高温度。
条件A
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.1℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.2℃
产生凝固热紧前的温度差：1.1℃
条件B
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.0℃
从-10℃降低之-20℃紧前的温度差：0.1℃
产生凝固热紧前的温度差：0.9℃
条件C
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.8℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：1.1℃
产生凝固热紧前的温度差：2.1℃
[实施例3]生物相容性高分子嵌段物的制作(多孔体的粉碎和交联)
利用New Power Mill(OSAKA CHEMICAL Co.,Ltd.，New Power Mill PM-2005)粉碎了在实施例2中得到的条件A及条件B的CBE3多孔体。关于粉碎，以最大转速1分钟×5次，合计进行了5分钟的粉碎。对所得到的粉碎物，利用不锈钢制筛子进行了尺寸分类，从而得到了25～53μm、53～106μm、106～180μm的未交联嵌段物。然后，在减压下以160℃实施热交联(实施了交联时间为8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时这6种)来得到了生物相容性高分子嵌段物(CBE3嵌段物)。
以下，将实施了48小时交联的条件A的多孔体来源嵌段物称为E，将实施了48小时交联的条件B的多孔体来源嵌段物称为F。E及F为由通过温度差小的冷冻工序制造的多孔体制成的温度差小的嵌段物。另外，未发现交联时间的不同在本申请的评价中影响性能，因此以下以实施了48小时交联的嵌段物为代表而使用。并且，在E及F中未发现性能差异。以下，还将在实施例3中得到的生物相容性高分子嵌段物称为“花瓣状嵌段物”。以下的实施例及比较例中，使用了在条件A、尺寸53～106μm、交联时间48小时下制作的生物相容性高分子嵌段物。
[实施例4]生物相容性高分子嵌段物的振实密度测定
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，且值越小，则越无法紧密地填充，即可以说嵌段物的结构复杂。如下测定了振实密度。首先，准备在漏斗的前端带帽(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的漏斗，并仅测定了帽的质量。然后，将帽装在漏斗上，并使嵌段物从漏斗流入而使其积蓄在帽中。添加充分量的嵌段物之后，将帽部分在桌子等较硬的部位敲击200次并卸下漏斗，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽的状态下测定了质量。通过从与仅帽的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽的体积而求出了振实密度。
其结果，实施例3的生物相容性高分子嵌段物的振实密度为98mg/cm3。
[实施例5]生物相容性高分子嵌段物的交联度测定
计算出在实施例3中交联的嵌段物的交联度(每一分子的交联数)。测定利用了TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法。
＜样品制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(10mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上来作为样品。
＜空白培养基制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，紧接着加入37质量％的盐酸(3mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(7mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上来作为空白培养基。
对用纯水稀释了10倍的样品及空白培养基的吸光度(345nm)进行测定，并从以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g重组肽的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示重组肽质量(mg)。)
(式3)1-(样品(式2)/未交联重组肽(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
其结果，实施例3的生物相容性高分子嵌段物的交联度为4.2。
[实施例6]生物相容性高分子嵌段物的吸水率测定
计算出在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物的吸水率。
在25℃下，在3cm×3cm的尼龙网孔制袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，并使其在离子交换中膨润两小时之后，风干了10分钟。在每一阶段测定质量，并根据(式4)求出了吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中，w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋的质量，w2表示吸水后的包含材料的袋整体的质量。)
其结果，实施例3的嵌段物的吸水率为786％。
[实施例7]具有突起部的片状细胞结构体(具有突起部的片状镶嵌细胞团)的制作
将人骨髓来源间充质干细胞(hMSC)悬浮于生长培养基(TAKARA BIO：MSCGMBulletKit(商标))，对其添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，最终在hMSC(2×107cells)与生物相容性高分子嵌段物(20mg)悬浮在4mL的培养基的状态下，播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mmType903(球状体阱口径800μm、球状体阱深度300μm、球状体阱数～约1000阱。AGC TECHNOGLASS CO.,LTD.制)。另外，在EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903中，培养面上的凹陷部的面积相对于培养面的总面积为100％，彼此相邻的凹陷部之间的培养支撑体表面不平坦。
在CO2培养箱中在37℃下静置了4小时，其结果将具有突起部的片状细胞结构体制作成由hMSC与生物相容性高分子嵌段物构成的直径30mm大、厚度500μm左右的圆盘片状，并得以将其回收(图11)。得知该具有突起部的片状细胞结构体具有强度，且不会卷曲而能够维持形状。所得到的具有突起部的片状细胞结构体的最厚部为500μm，最薄部为150μm左右。关于通过本方法得到的具有突起部的片状细胞结构体，因细胞支撑体具有凹陷部的形状而得到了在得到的突起部中混合存在细胞和嵌段物且在相反面侧的平坦部分仅存在细胞的状态的片状细胞结构体。
并且，将5×107cells的hMSC和生物相容性高分子嵌段物50mg悬浮在4mL的培养基而播种到相同的EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903中，同样地在培养箱中静置了4小时，其结果将具有突起部的片状细胞结构体制作成了直径30mm大、厚度1.4mm左右的圆盘片状，并得以将其回收。所得到的具有突起部的片状细胞结构体的最厚部为1.4mm，最薄部为500μm左右。关于通过本方法得到的具有突起部的片状细胞结构体，因细胞结构体具有凹陷部的形状而得到了在得到的突起部中混合存在细胞和嵌段物且在相反面侧的平坦部分也混合存在细胞和嵌段物的状态的片状细胞结构体。
另外，确认到所使用的培养皿即使使用Type900(阱口径400～500μm、阱深度100～200μm)、Type902(阱口径500μm、阱深度200μm)、Type904(阱口径800μm、阱深度400μm)中的任一个，均可同样地制作出具有突起部的片状细胞结构体(具有突起部的片状镶嵌细胞团)。得知在任意条件下，具有突起部的片状细胞结构体均具有强度，且不会卷曲而能够维持形状。另外，在培养皿Type900、Type902及Type904中，培养面上的凹陷部的面积相对于培养面的总面积为100％，彼此相邻的凹陷部之间的培养支撑体表面不平坦。
关于强度的评价，确认到为了用镊子将使用EZSPHERE(注册商标)培养皿35mmType903容器并用hMSC(2×107cells)与生物相容性高分子嵌段物(20mg)来制作的具有突起部的片状细胞结构体贴附于器官表面而将其举起时，能够在不断裂的情况下进行移植，由此得知具有充分的强度。
如上所述，得知仅通过向在底面具有凹陷部的细胞支撑体导入细胞和生物相容性高分子嵌段物，能够简单地制作厚的片状细胞结构体。
[比较例1]平坦的片状细胞结构体(平坦的片状镶嵌细胞团)的制作
将人骨髓来源间充质干细胞(hMSC)悬浮于生长培养基(TAKARA BIO：MSCGMBulletKit(商标))，对其添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，最终在hMSC(2×107cells)与生物相容性高分子嵌段物(20mg)悬浮在4mL的培养基的状态下，播种到底面平坦的细胞非粘附性35mm培养皿即PrimeSurface Dish直径35mm(SumitomoBakelite Co.,Ltd.制)。
在CO2培养箱中在37℃下静置了4小时，其结果将平坦的片状细胞结构体制作成了由hMSC与生物相容性高分子嵌段物构成的直径30mm大、厚度500μm左右的圆盘片状并得以将其回收。然而，得知实施例7的具有突起部的片状细胞结构体具有强度，且能够维持形状，与此相比，平坦的片状细胞结构体具有强度弱且容易破裂，并且容易卷曲的缺点。
另外，将细胞的浓度设为2×107cells～8×107cells而实施了制作，但确认到即使使用任一个均可同样地制作出平坦的片状细胞结构体(平坦的片状镶嵌细胞块)。然而，作为一致的结果确认到与实施例7的具有突起部的片状细胞结构体相比，作为性质则强度弱且容易破裂，并且容易卷曲。
关于强度的评价，得知为了用镊子将使用PrimeSurface Dish直径35mm容器并用hMSC(2×107cells)与生物相容性高分子嵌段物(20mg)制作的平坦的片状细胞结构体贴附到器官表面而将其举起时，与实施例7的具有突起部的片状细胞结构体相比，很难在不断裂的情况下直接进行移植，因此不具有充分的强度。
[比较例2]具有突起部的细胞片(仅细胞)的制作
将人骨髓来源间充质干细胞(hMSC)悬浮于生长培养基(TAKARA BIO：MSCGMBulletKit(商标))，最终在hMSC(8×107cells)悬浮在4mL的培养基的状态下，播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903(球状体阱口径800μm、球状体阱深度300μm、球状体阱数～约1000阱。AGC TECHNO GLASS CO.,LTD.制)。
在CO2培养箱中在37℃下静置了4小时，其结果得知hMSC无法如片状细胞结构体那样以悬浮液状态直接回收。
并且，将所使用的培养皿变更为Type900(阱口径400～500μm、阱深度100～200μm)、Type902(阱口径500μm、阱深度200μm)、Type904(阱口径800μm、阱深度400μm)，将细胞的浓度设为2×107cells～8×107cells而尝试了其制作，但均未能制作出具有突起部的细胞片。从而，得知无法使用在底面具有凹陷部的细胞支撑体来制作具有突起部的细胞片。
[比较例3]平坦的细胞片(仅细胞)的制作
将人骨髓来源间充质干细胞(hMSC)悬浮于生长培养基(TAKARA BIO：MSCGMBulletKit(商标))，最终在hMSC(2×107cells)悬浮在4mL的培养基的状态下，播种到底面平坦的细胞非粘附性35mm培养皿即PrimeSurface Dish直径35mm(Sumitomo BakeliteCo.,Ltd.制)。
在CO2培养箱中在37℃下静置了4小时，其结果将平坦的细胞片制作成了仅由hMSC构成的直径20mm大、厚度300μm左右的圆盘片状并得以将其回收。然而，得知实施例7的具有突起部的片状细胞结构体具有强度，且能够维持形状，与此相比，平坦的细胞片的强度非常弱且很难举起，并且以非常快的速度收缩，因此导致在所形成的4小时之内收缩至20mm大，从而无法维持初始形状。得知比较例1的平坦的片状细胞结构体能够维持大小，即使与此相比，平坦的细胞片也无法维持大小。
另外，将细胞的浓度设为2×107cells～8×107cells而实施了制作，但确认到使用任一个均可同样地制作平坦的细胞片(仅细胞)。然而，作为性质，实施例7的具有突起部的片状细胞结构体具有强度，且能够维持形状，与此相比，平坦的细胞片的强度非常弱且很难举起的情况则未改变。并且，以非常快的速度收缩，因此导致在所形成的4小时之内收缩至20mm大，且无法维持初始形状的情况也相同。而且，得知比较例1的平坦的片状细胞结构体能够维持大小，即使与此相比，任一个平坦的细胞片均无法维持大小。
[实施例与比较例的结果总结]
将在实施例7中制作的具有突起部的片状细胞结构体、在比较例1中制作的平坦的片状细胞结构体、在比较例2中未能制作的具有突起部的细胞片、以及在比较例3中制作的平坦的细胞片的结果示于图12及表1。
[表1]
从所得到的结果得知，在制作仅细胞的细胞凝聚、细胞片的过程中，用底面平坦的细胞支撑体便能够形成细胞片，另一方面，用底面具有凹陷部的细胞支撑体则无法制作细胞片。从该结果考虑，在由细胞与生物相容性高分子嵌段物构成的细胞结构体中，无论是底面平坦的细胞支撑体，还是底面具有凹陷部的细胞支撑体，均能够形成片状细胞结构体这一结果是出乎意料的。而且，出乎预料地得知，与仅细胞的结果(比较例)相反，在由细胞与生物相容性高分子嵌段物构成的细胞结构体中，用底面具有凹陷部的细胞支撑体制作的具有突起部的片状细胞结构体更会成为具有强度，容易维持形状且操作性优异的片状细胞结构体。
符号说明
1 培养支撑体
10 容器主体
12 盖
14 底板部
16 侧壁部
20 凹陷部
24 阱形成区域
30 细胞粘附抑制剂层
41 片部
42 突起部
X 最薄部的厚度
Y 最厚部的厚度。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 片状细胞结构体的制造方法及片状细胞结构体
<130> 16F00427
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 571
<212> PRT
<213> Recombinant
<400> 1
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly
1 5 10 15
Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
50 55 60
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro
85 90 95
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
100 105 110
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
115 120 125
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro
130 135 140
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly
145 150 155 160
Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala
165 170 175
Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro
180 185 190
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly
195 200 205
Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp
210 215 220
Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
225 230 235 240
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
245 250 255
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg
275 280 285
Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly
290 295 300
Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu
305 310 315 320
Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro
325 330 335
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
340 345 350
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro
370 375 380
Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly
385 390 395 400
Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro
405 410 415
Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro
420 425 430
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
435 440 445
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
450 455 460
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala
465 470 475 480
Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
485 490 495
Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro
500 505 510
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
515 520 525
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
530 535 540
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
545 550 555 560
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
565 570
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 2
Arg Glu Asp Val
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 3
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 4
Pro Asp Ser Gly Arg
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 5
Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 6
Leu Gly Thr Ile Pro Gly
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 7
Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 8
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 9
Asp Gly Glu Ala
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 10
Glu Arg Gly Asp
1
Claims (16)
1.一种片状细胞结构体的制造方法，其包括：
在培养面上具有多个凹陷部的培养支撑体上添加生物相容性高分子嵌段物、细胞及液体培养基，将所述生物相容性高分子嵌段物及所述细胞浸渍于所述凹陷部的最上部的工序；及
对所述细胞进行培养来得到片状细胞结构体的工序。
2.根据权利要求1所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
所述培养支撑体具有深度为10～2000μm且口径为10～2000μm的凹陷部。
3.根据权利要求1或2所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
培养面上的凹陷部的面积相对于培养面的总面积为70％以上。
4.根据权利要求1或2所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
彼此相邻的所述凹陷部之间的培养支撑体表面不平坦。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
所述片状细胞结构体的最薄部的厚度为50μm～5mm。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
培养支撑体的培养表面被实施了用于抑制细胞粘附的处理。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物的大小为1μm～700μm。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
9.根据权利要求8所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
重组明胶由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。
10.根据权利要求8或9所述的片状细胞结构体的制造方法，其中，
重组明胶为以下肽中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或附加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
11.一种片状细胞结构体，包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，其中，
在至少一个面具有多个突起部，在所述突起部上，多个所述细胞之间的间隙中配置有多个所述生物相容性高分子嵌段物。
12.根据权利要求11所述的片状细胞结构体，其具有高度为10～2000μm且直径为10～2000μm的突起部。
13.根据权利要求11或12所述的片状细胞结构体，其中，
最薄部的厚度为50μm～5mm。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的片状细胞结构体，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
15.根据权利要求14所述的片状细胞结构体，其中，
重组明胶由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。
16.根据权利要求14或15所述的片状细胞结构体，其中，
重组明胶为以下肽中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或附加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
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