CN109789166A - 营养因子释放剂及炎症疾病处置剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种在细胞移植治疗等中使细胞释放的营养因子的量增加的营养因子释放剂及炎症疾病处置剂。根据本发明，可提供一种营养因子释放剂，其包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，且包含在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体，所述营养因子释放剂中，一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下，且从上述细胞释放营养因子。

Description

营养因子释放剂及炎症疾病处置剂
技术领域
本发明涉及一种营养因子释放剂及炎症疾病处置剂。详细而言，本发明涉及一种包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，且包含在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体的营养因子释放剂、以及炎症疾病处置剂。
背景技术
以往，正在对局部给予细胞，并通过细胞所生成的营养因子进行治疗的营养因子疗法进行研究。作为营养因子疗法，为了在局部给予细胞时，使细胞滞留于给予部并移植，尝试将局部给予的细胞作为细胞块而给予。
非专利文献1中记载有作为球体培养的人间充质干/基质细胞自激活且生成前列腺素E2。非专利文献2中记载有人间充质基质细胞的球体分泌作为抗炎蛋白的TSG-6。
专利文献1中记载有以生物相容性且生物可降解材料为主成分的微小粒子。上述生物相容且生物可降解材料在表面具有移植细胞，上述微小粒子包含渗入微小粒子中，并在埋入时对细胞或其环境呈活性的至少一个作用物质。并且，上述微小粒子具有10～500μm的直径，而且还包含细胞粘附性化合物的涂层。上述作用物质选自包括生长因子、激素及细胞因子的组，通过微小粒子而持续，且被控制而被释放。
近年来，正积极地对使用了间充质干细胞(MSC)的再生医疗及细胞治疗进行研究。其中，作为其对象针对难治性炎症疾病的治疗效果备受瞩目，且正在进行各种研究。例如，专利文献2中公开了用于通过静脉注射MSC来预防、治疗炎性肠病的方法。还实施了一些临床研究或临床试验。然而，发现实际上未显示充分的治疗效果(非专利文献3)。还进行用于通过向MSC本身导入基因而提高抗炎能力的研究(非专利文献4)。然而，若考虑有效性或对安全性的影响，则向细胞本身导入基因的情况未必是优选的选择。
专利文献3中记载有一种细胞结构体，该细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和细胞，且在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。专利文献3中所记载的细胞结构体中，能够从外部向细胞结构体的内部传递营养。专利文献4中记载有一种细胞移植用细胞结构体，该细胞移植用细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和至少一种细胞，且在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。专利文献4的实施例中记载有能够使用细胞移植用细胞结构体而形成血管。
以往技术文献
非专利文献
非专利文献1：JONI H.YLOSTALO等，STEM CELLS(干细胞)2012；30:2283-2296
非专利文献2：Thomas J.Bartosh等，PNAS,August 3,2010,vol.107,no.31,13724-13729
非专利文献3：Aliment Pharmacol Ther 2017；45:205-221
非专利文献4：Inflamm.Res.(2015)64:671-681
专利文献
专利文献1：日本专利第4819356号
专利文献2：日本特开2009-007321号公报
专利文献3：国际公开WO2011/108517号
专利文献4：日本特开2015-134193号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
作为细胞移植治疗，已知一些通过由所移植的细胞释放的营养因子(细胞因子等)促进宿主的再生而进行的治疗。例如，已知间充质干细胞释放具有抗炎效果的细胞因子。但是，仅通过细胞的移植无法充分释放细胞因子，从而频繁存在无法得到目标效果的情况。本发明应解决的课题在于提供一种与使用细胞块的情况相比，增加细胞释放的营养因子的量的营养因子释放剂。而且，本发明应解决的课题在于提供一种炎症疾病处置剂。
用于解决技术课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行深入研究的结果，发现如下并完成了本发明，即在包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体中，与不包含生物相容性高分子嵌段物的细胞块的情况相比，细胞释放的营养因子的量得以增加，以及上述细胞结构体在炎症疾病的处置中有用。
即，根据本发明，可提供以下发明。
＜1＞一种营养因子释放剂，其包含含有生物相容性高分子嵌段物和细胞、且在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体，该营养因子释放剂中，
一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下，且从上述细胞释放营养因子。
＜2＞根据＜1＞所述的营养因子释放剂，其中，
一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为50μm以上且120μm以下。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的营养因子释放剂，其中，
在上述生物相容性高分子嵌段物中，生物相容性高分子通过热、紫外线或酶而交联。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物为不定形生物相容性高分子嵌段物。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
上述细胞结构体在每一细胞中包含0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
上述细胞为体干细胞。
＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
上述营养因子为细胞因子。
＜8＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
生物相容性高分子为明胶、胶原、去端肽胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、ProNectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、RetroNectin(注册商标)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素或壳聚糖。
＜9＞根据＜1＞至＜8＞中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
＜10＞根据＜9＞所述的营养因子释放剂，其中，
重组明胶由下述式1表示；
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
＜11＞根据＜9＞或＜10＞所述的营养因子释放剂，其中，
重组明胶为：
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
(3)由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列相同性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
＜12＞一种炎症疾病处置剂，其包含＜1＞至＜11＞中任一项所述的营养因子释放剂。
＜13＞一种炎症疾病处置剂，其包含含有生物相容性高分子嵌段物和间充质干细胞、且在多个间充质干细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体，该炎症疾病处置剂中，
一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
＜14＞根据＜13＞所述的炎症疾病处置剂，其中，
一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为50μm以上且120μm以下。
＜15＞根据＜13＞或＜14＞所述的炎症疾病处置剂，其中，
在上述生物相容性高分子嵌段物中，生物相容性高分子通过热、紫外线或酶而交联。
＜16＞根据＜13＞至＜15＞中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物为不定形生物相容性高分子嵌段物。
＜17＞根据＜13＞至＜16＞中任一项所述的炎症疾病处置剂
上述细胞结构体在每一细胞中包含0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
＜18＞根据＜13＞至＜17＞中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
上述间充质干细胞为脂肪来源的间充质干细胞或骨髓来源的间充质干细胞。
＜19＞根据＜13＞至＜18＞中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
生物相容性高分子为明胶、胶原、去端肽胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、pronectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、Retronectin(注册商标)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素或壳聚糖。
＜20＞根据＜13＞至＜19＞中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
＜21＞根据＜20＞所述的炎症疾病处置剂，其中，
重组明胶由下述式1表示；
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
＜22＞根据＜20＞或＜21＞所述的炎症疾病处置剂，其中，
重组明胶为：
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
(3)由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列相同性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
＜23＞根据＜13＞至＜22＞中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
上述间充质干细胞为人或狗来源的间充质干细胞。
而且，根据本发明，可提供以下发明。
(A)一种营养因子的释放方法，其包括将细胞结构体移植到需要营养因子的对象物的工序，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
(B)一种炎症疾病的处置方法，其包括将细胞结构体移植到需要对炎症疾病进行处置的对象物的工序，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
(C)一种细胞结构体，其包含用于释放营养因子和/或用于通过释放营养因子而进行的处置的生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
(D)一种细胞结构体，其包含用于对炎症疾病进行处置的生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
(E)一种细胞结构体的使用，其包含用于制造营养因子释放剂的生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
(F)一种细胞结构体的使用，其包含用于制造炎症疾病处置剂的生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，且一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
发明效果
根据本发明的营养因子释放剂及包含该营养因子释放剂的炎症疾病处置剂，与使用细胞块的情况相比，能够增加细胞释放的营养因子的量。并且，根据本发明的炎症疾病处置剂，与使用细胞块的情况相比，能够增强炎症疾病处置效果。
附图说明
图1表示条件A中所记载的实验的液温曲线。
图2表示条件B中所记载的实验的液温曲线。
图3表示条件C中所记载的实验的液温曲线。
图4表示测定依赖炎症刺激TNFα的TSG-6生成释放量而得的结果。
图5表示将依赖炎症刺激TNFα的TSG-6生成释放量作为每一细胞的生成释放量而求出的结果。
图6表示测定2.5质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠的体重而得的结果。
图7表示测定2.5质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠的体重而得的结果。
图8表示测定3.0质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠的体重而得的结果。
图9表示测定3.0质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠的体重而得的结果。
图10表示测定3.0质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠的大肠长度而得的结果。
图11表示3.0质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠的病理学评分。
图12表示各小鼠组的代表性HE组织染色图像。
图13表示各小鼠组的代表性HE组织染色图像。
图14表示T细胞的平均分裂次数的测定结果。
图15表示IL-2的定量结果。
图16表示各小鼠组与正常小鼠的体重比例(％)的平均值。
图17表示测定各小鼠组的大肠的长度而得的结果。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。
本发明中使用的细胞结构体在本说明书中有时被称为镶嵌细胞块(呈镶嵌状的细胞块)。并且，本说明书中，“～”表示将记载于其前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
本发明涉及一种营养因子释放剂，其含有包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体，所述营养因子释放剂中，一个上述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下，且从上述细胞释放营养因子。
如后述的实施例所示，使用镶嵌细胞块和细胞块测定所释放的各种营养因子量的结果，相对于源自细胞块的释放量，从镶嵌细胞块释放的营养因子得以增加(实施例8)。本发明并不受任何理论的束缚，但根据营养因子的种类而释放量的增加程度不同，因此作为营养因子的释放量增加的主要原因，推测不仅通过设为镶嵌细胞块而生成的生细胞数会增加，还通过其他主要原因而发挥释放量的增加效果。
如后述的实施例所示，使用镶嵌细胞块和细胞块测定所释放的TSG-6量的结果，相对于源自细胞块的释放量，从镶嵌细胞块释放的营养因子得以增加(实施例11)。并且，使用镶嵌细胞块和细胞块在TNFα刺激之后测定了所释放的TSG-6量的结果，相对于源自细胞块的释放量，从镶嵌细胞块释放的营养因子大幅增加(实施例12)。
非专利文献1或非专利文献2中记载有人间充质干/基质细胞的球体(细胞块)生成营养因子，但没有与镶嵌细胞块有关的记载。专利文献1中记载有以生物相容性且生物可降解材料为主成分的微小粒子包含选自包括生长因子、激素及细胞因子的组中的作用物质，但上述作用物质并不是从细胞释放的，且专利文献1中没有与细胞生成营养因子有关的记载。专利文献2中记载有镶嵌细胞块，但没有与从细胞释放营养因子有关的记载。
并且，非专利文献1的图6及非专利文献2的图6中示出与平面培养相比球体的营养因子的生成量大的情况。通常，认为平面培养时的细胞的营养状态比球体良好，因此推测营养因子生成量并不依赖细胞的营养状态。专利文献2中记载有镶嵌细胞块的营养状态比球体良好，但推测营养因子生成量并不依赖细胞的营养状态，因此本发明的效果并不能够通过非专利文献1及专利文献2、以及专利文献1的记载而预测。
如上所述，包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体中，与细胞块的情况相比，源自细胞的营养因子的释放量增加的情况为完全无法从以往技术预测的效果。
(1)生物相容性高分子嵌段物
(1-1)生物相容性高分子
生物相容性是指，与生物接触时，不会引起如长期且慢性炎症反应等明显的不良反应。若本发明中所使用的生物相容性高分子对生物具有相容性，则对于是否在生物内被降解并无特别限定，优选为生物降解性高分子。作为非生物降解性材料，具体而言，可列举聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、不锈钢、钛、硅酮及MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)等。作为生物降解性性材料，具体而言，可列举天然来源的肽、重组肽或化学合成肽等多肽(例如，以下进行说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。上述中，尤其优选重组肽。这些生物相容性高分子中可以被实施提高细胞粘附性的改进。具体而言，能够使用“基于对基材表面的细胞粘附基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白)或细胞粘附序列(以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽的涂布”、“基材表面的氨基化、阳离子化”或“基材表面的等离子体处理、基于电晕放电的亲水处理”等方法。
只要具有生物相容性则包含重组肽或化学合成肽的多肽的种类并且特别限定，例如优选明胶、胶原、去端肽胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、pronectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、Retronectin(注册商标)，最优选为明胶、胶原、去端肽胶原。作为本发明中所使用的明胶，优选为天然明胶、重组明胶或化学合成明胶，进一步优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指由天然来源的胶原制成的明胶。
化学合成肽或化学合成明胶是指人工合成的肽或明胶。明胶等肽的合成可以是固相合成，也可以是液相合成，优选为固相合成。肽的固相合成乃是本领域技术人员所熟知的，例如可列举作为氨基的保护而使用Fmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基：芴-甲氧基-羰基)的Fmoc基合成法、以及作为氨基的保护而使用Boc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基：叔丁基氧基羰基)的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式能够套用本说明书中后述的重组明胶中所记载的内容。
本发明中所使用的生物相容性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选0～1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB是指基于由藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机示意图的亲疏水性的指标，其详细内容例如在“Pharmaceutical Bulletin：药学通报”，vol.2，2，pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11，10，pp.719-725(1957)、“Fragrance Journal”，vol.50，pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的来源设为甲烷(CH4)，且将其他化合物均视为甲烷的衍生物来将其碳原子数、取代基、转变部、环等分别设定为一定数值，相加其分数来求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值标绘在以有机性值作为X轴，以无机性值作为Y轴的图上。有机示意图中的IOB是指，有机示意图中的无机性值(IV)相对于有机性值(OV)之比、即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机示意图的详细内容，可参考“新版有机示意图-基础与应用”(甲田善生等编著，三共出版、2008)。本说明书中，以取IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲疏水性。“1/IOB”值越小(接近0)，则越为表示亲水性的标注。
通过将本发明中使用的高分子的“1/IOB”值设为上述范围，亲水性变高，且吸水性变高，因此有效地对营养成分的保持起作用，其结果，推定有助于本发明所涉及的细胞结构体(镶嵌细胞块)中的细胞的稳定化、易生存性。
当本发明中所使用的生物相容性高分子为多肽时，由亲水性平均(Grand averageof hydropathicity)(GRAVY)值表示的亲疏水性指标中，优选为0.3以下且负9.0以上且，进一步优选为0.0以下且负7.0以上且。亲水性平均(GRAVY)值能够通过“Gasteiger E.，Hoogland C.，Gattiker A.，Duvaud S.，Wilkins M.R.，Appel R.D.，Bairoch A.；ProteinIdentification and Analysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics Protocols Handbook，Humana Press(2005).pp.571-607”及“GasteigerE.，Gattiker A.，Hoogland C.，Ivanyi I.，Appel R.D.，Bairoch A.；ExPASy：theproteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.；Nucleic AcidsRes.31：3784-3788(2003).”的方法而得到。
通过将本发明中使用的高分子的GRAVY值设为上述范围，亲水性变高，且吸水性变高，因此有效地对营养成分的保持起作用，其结果，推定有助于本发明所涉及的细胞结构体(镶嵌细胞块)中的细胞的稳定化、易生存性。
(1-2)交联
本发明中所使用的生物相容性高分子可以被交联，也可以不被交联，但优选被交联。通过使用被交联的生物相容性高分子，能够得到防止在培养基中培养时及移植到生物时瞬间降解的效果。作为通常的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳二亚胺、氰胺等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键及离子性相互作用等，本发明中也能够使用上述交联方法。作为本发明中所使用的交联方法，进一步优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。
当进行基于酶的交联时，作为酶，只要具有高分子材料之间的交联作用，则并无特别限制，能够优选使用谷氨酰胺转氨酶或漆酶，最优选使用谷氨酰胺转氨酶来进行交联。作为用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的蛋白质的具体例，只要为具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以是哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶，也可以是微生物来源的谷氨酰胺转氨酶，具体而言，可列举AJINOMOTO CO.，INC.制ACTIVA系列、作为试剂而出售的哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶、例如，Oriental Yeast Co.，ltd.制、Upstate USA Inc.制、Biodesign International制等豚鼠肝脏来源谷氨酰胺转氨酶、山羊来源谷氨酰胺转氨酶、兔子来源谷氨酰胺转氨酶等及人来源凝血因子(Factor XIIIa，Haematologic Technologies，Inc.)等。
进行交联(例如，热交联)时的反应温度只要能够进行交联，则并无特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，尤其优选为100℃～250℃，最优选为120℃～200℃。
(1-3)重组明胶
本发明中所述的重组明胶是指，通过基因重组技术制成的类似明胶的具有氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。本发明中能够使用的重组明胶优选具有胶原中特征性的由Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种)的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。优选在一分子中含有两个序列以上且的细胞粘附信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有来源于胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176、美国专利6992172号、国际公开WO2004/085473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但并不限定于这些。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的重组明胶为以下形态的重组明胶。
重组明胶因天然明胶原有的性能而生物相容性优异，并且因非天然来源而不存在牛海绵状脑病(BSE)等忧患，从而非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀，且序列已确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而模糊较少且精密设计。
重组明胶的分子量并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa(千道尔顿)以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选具有胶原中特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选为除甘氨酸以外的任意氨基酸)。胶原中特征性的由Gly-X-Y表示的序列为明胶-胶原的氨基酸组成及序列中的与其他蛋白质相比非常特殊的部分结构。在该部分，甘氨酸占整体的约3分之1，在氨基酸序列三个中一个为重复。甘氨酸为最简单的氨基酸，对分子链的配置的束缚也较少，且在凝胶化时大大有助于螺旋结构的再生。由X及Y表示的氨基酸含有较多的亚氨基酸(脯氨酸、氧脯氨酸)，优选占整体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上且，更优选95％以上且，最优选99％以上且的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
通常的明胶中，极性氨基酸中的带电荷的氨基酸与无电荷的氨基酸以1:1存在。在此，极性氨基酸具体指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，其中极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有的氨基酸中的极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，优选上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例为5％以上且小于20％，优选为5％以上且小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，优选不包含两个以上且的氨基酸。
通常多肽中，已知作为细胞粘附信号而作动的最小氨基酸序列(例如，NagaiShoten Co.，Ltd.出版发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有两个以上且的这些细胞粘附信号。作为具体的序列，从粘附的细胞的种类多这一方面考虑，优选以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。进一步优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产生量。
作为本发明中使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间而不均匀，更优选RGD之间的氨基酸数在25～60之间而不均匀。
从细胞粘附性、生长性的观点考虑，该最小氨基酸序列的含量在蛋白质1分子中优选为3～50个，进一步优选为4～30个，尤其优选为5～20个，最优选为12个。
本发明中所使用的重组明胶中，优选RGD基序相对于氨基酸总数的比例至少为0.4％。当重组明胶包含350以上且的氨基酸时，优选350个氨基酸的各段至少包含一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，进一步更优选至少为1.0％，尤其优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。重组肽内的RGD基序的数量在每250个氨基酸中优选至少为4个，更优选为6个，进一步优选为8个，尤其优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％这一比例对应于在每250个氨基酸中有至少一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶应至少包含两个RGD序列。优选本发明的重组明胶在每250个氨基酸中至少包含两个RGD序列，更优选在每250个氨基酸中至少包含3个RGD序列，进一步优选在每250个氨基酸中至少包含4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的又一方式，优选至少包含4个RGD基序，更优选包含6个RGD基序，进一步优选包含8个RGD基序，尤其优选包含12以上且16以下的RGD基序。
重组明胶可以部分水解。
优选本发明中所使用的重组明胶由式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种。m优选为表示2～10的整数，更优选为表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，进一步优选为15～70的整数，最优选为50～65的整数。A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
更优选本发明中所使用的重组明胶由Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同，也可以彼此不同。)表示。
优选重复单元与多个天然存在的胶原的序列单元键合。在此所述的天然存在的胶原是指，若天然存在则可以为任一个，但优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原。更优选为I型、II型或III型胶原。根据另一方式，上述胶原的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选为人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测定，如等电点电泳法(Maxey，C.R.(参考1976；Phitogr.Gelatin 2，Editor Cox，P.J.Academic，London，Engl.))中所记载，能够通过对将1质量％明胶溶液通入阳离子及阴离子交换树脂的混晶柱之后的pH进行测定来实施。
优选重组明胶没有被脱氨化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶为由对氨基酸序列进行编码的核酸制备的实质上的纯多肽。
作为本发明中所使用的重组明胶，尤其优选以下肽中的任一个，
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
(3)由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上(进一步优选为90％以上,尤其优选为95％以上,最优选为98％以上)的序列相同性的氨基酸序列组成,并且具有生物相容性的肽。
本发明中的序列相同性是指通过以下式计算的值。
％序列相同性＝[(相同的残基数)/(对准长度)]×100
本领域技术人员能够通过公知的任意方法来确定2个氨基酸序列中的序列相同性，且能够使用BLAST((Basic Local Alignment Search Tool：本地序列基本搜索工具))程序(J.Mol.Biol.215：403-410,1990)等来确定。
“缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列”中的“一个或多个”是指，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个，尤其优选1～3个。
关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术而制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/85473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，将其编入表达载体来制作重组表达载体，并将其导入到适当的宿主来制作形成转化体。通过使用适当的培养基对所得到的转化体进行培养而产生重组明胶，因此能够通过回收从培养物产生的重组明胶来制备本发明中所使用的重组明胶。
(1-4)生物相容性高分子嵌段物
本发明中，使用由上述生物相容性高分子组成的嵌段物(块)。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状并无特别限定。例如，为无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状、多孔状、纤维状、纺锤状、扁平状及片状，优选无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状及多孔状。无规则形表示表面形状不均匀的形状，例如表示如岩石那样的具有凹凸的物体。另外，上述形状的例示并不是分别独立的，例如有时还作为粒状(颗粒)的下位概念的一例而成为无规则形。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状如上述那样并无特别限定，振实密度优选为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下，更优选为20mg/cm3以上且400mg/cm3以下，进一步优选为40mg/cm3以上且220mg/cm3以下，尤其优选为50mg/cm3以上且150mg/cm3以下。
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，值越小，则越无法紧密地填充，即可知嵌段物的结构复杂。认为生物相容性高分子嵌段物的振实密度表示生物相容性高分子嵌段物的表面结构的复杂性及作为聚集体而聚集生物相容性高分子嵌段物时形成的空隙的量。振实密度越小，生物相容性高分子嵌段物之间的空隙越大，细胞的移植区域越大。并且，认为由于不会过小而能够在细胞彼此之间适当地存在生物相容性高分子嵌段物，且作为细胞结构体时能够向相同结构体内部传递营养成分，因此优选抑制在上述范围内。
本说明书中所述的振实密度能够如下测定。为了测定而准备(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的容器(以下，记载为帽)。首先，仅测定帽的质量。然后，将帽装在漏斗上，并使嵌段物从漏斗流入而使其积蓄在帽中。添加充分量的嵌段物之后，将帽部分在桌子等较硬的部位敲击200次并卸下漏斗，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽的状态下测定质量。通过从与仅帽的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽的体积而能够求出振实密度。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的交联度并无特别限定，优选为2以上且，进一步优选为2以上且30以下，进一步优选为4以上且25以下，尤其优选为4以上且22以下。
生物相容性高分子嵌段物的交联度(每1分子的交联数)的测定方法并无特别限定，当生物相容性高分子为CBE3时，例如能够通过后述实施例中所记载的TNBS(2,4,6-三硝基苯磺)法进行测定。具体而言，制备将生物相容性高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合而在37℃下反应3小时之后停止反应的样品和刚将生物相容性高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合之后停止反应的空白培养基(blank)，并分别测定用纯水进行稀释的样品及空白培养基的吸光度(345nm)，从而能够从以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g生物相容性高分子嵌段物的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示生物相容性高分子嵌段物质量(mg。)
(式3)1-(样品(式2)/未交联的高分子(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的吸水率并无特别限定，优选300％以上且，更优选400％以上且，进一步优选500％以上且，尤其优选600％以上且，最优选700％以上且。另外，吸水率的上限并无特别限定，通常为4000％以下或2000％以下。
生物相容性高分子嵌段物的吸水率的测定方法并无特别限定，例如能够通过后述实施例中所记载的方法进行测定。具体而言，在25℃下于3cm×3cm的尼龙网孔制的袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，并使其在离子交换水中膨润两小时之后，风干10分钟，在每一阶段测定质量，从而能够根据(式4)来求出吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中，w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋的质量，w2表示包括吸水后的材料的袋整体的质量。)
本发明中的一个生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下，优选为20μm以上且150μm以下，更优选为50μm以上且120μm以下，进一步优选为53μm以上且106μm以下。
通过将一个生物相容性高分子嵌段物的大小设定在上述范围内，能够良好地从外部向细胞结构体的内部传递营养。另外，一个生物相容性高分子嵌段物的大小并不是指多个生物相容性高分子嵌段物的大小的平均值在上述范围内，而是指对多个生物相容性高分子嵌段物进行过筛而得到的每一个生物相容性高分子嵌段物的尺寸。
一个嵌段物的大小能够由对嵌段物进行区分时所使用的筛子的大小来定义。例如，能够使将用180μm的筛子进行过筛，并用106μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为106～180μm大小的嵌段物。接着，能够使将用106μm的筛子进行过筛，并用53μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为53～106μm大小的嵌段物。接着，能够使将用53μm的筛子进行过筛，并用25μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物成为25～53μm大小的嵌段物。
(1-5)生物相容性高分子嵌段物的制造方法
生物相容性高分子嵌段物的制造方法并无特别限定，例如使用粉碎机(新动力磨机(New Power Mill)等)对含有生物相容性高分子的固态物质(生物相容性高分子的多孔体等)进行粉碎，由此能够得到生物相容性高分子嵌段物。含有生物相容性高分子的固态物质(多孔体等)例如能够通过对含有生物相容性高分子的水溶液进行冻干来得到。
如上所述，能够通过对含有生物相容性高分子的固态物质进行粉碎来制造表面形状不均匀的无规则形生物相容性高分子嵌段物。
作为制造生物相容性高分子的多孔体的方法，并无特别限定，能够通过冻干包含生物相容性高分子的水溶液而得到。例如，通过包括在溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冷冻状态下成为“溶剂熔点-3℃”以下的冷冻工序，所形成的冰能够成为球状。经过该工序之后，冰被干燥，由此可得到具有球状的各向同性的空孔(球孔)的多孔体。不包括在未冷冻的状态下，溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)成为“溶剂融点-3℃”以上且的冷冻工序而冷冻，由此所形成的冰能够成为柱/平板状。经过该工序之后，若冰被干燥，则可得到在单轴或双轴上较长且具有柱状或平板状空孔(柱/平板孔)的多孔体。当将生物相容性高分子的多孔体进行粉碎而制造生物相容性高分子嵌段物时，粉碎之前的多孔体的空孔会影响所得到的生物相容性高分子嵌段物的形状，因此如上所述，能够通过调整冻干的条件来调整所得到的生物相容性高分子嵌段物的形状。
作为生物相容性高分子的多孔体的制造方法的一例，能够列举如下方法，但并不限定于该方法，该方法包括：
工序(a)，在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，并且在溶液内液温最高的部分的温度为溶剂的熔点以下，将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态；
工序(b)，对在工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻；及
工序(c)，对在工序(b)中所得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冻干。
将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态时，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下(优选2.3℃以下，更优选2.1℃以下)，即通过减小温度差，所得到的多孔质孔的大小偏差得以减少。另外，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差的下限并无特别限定，只要是0℃以上且即可，例如可以是0.1℃以上且、0.5℃以上且、0.8℃以上且或0.9℃以上且。由此，使用了用所制造的多孔体而制造的生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体可实现表示高细胞数这一效果。
关于工序(a)的冷却，例如优选经由导热率比水低的原材料(优选特氟龙(注册商标))进行冷却，能够将在溶液内液温最高的部分假设为最远离冷却侧的部分，且能够将在溶液内液温最低的部分假设为冷却面的液温。
优选在工序(a)中，在即将产生凝固热之前的、在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，更优选为2.3℃以下，进一步优选为2.1℃以下。其中，“即将产生凝固热之前的温度差”是指，产生凝固热时的1秒钟前～10秒钟前之间温度差变最大时的温度差。
优选在工序(a)中，在溶液内液温最低的部分的温度为溶剂熔点-5℃以下，更优选为溶剂熔点-5℃以下且溶剂熔点-20℃以上且，进一步优选溶剂熔点-6℃以下且溶剂熔点-16℃以上且。另外，溶剂熔点的溶剂为生物相容性高分子的溶液的溶剂。
在工序(b)中，对在工序(a)得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序(b)用于冷冻的冷却温度并无特别限制，还取决于进行冷却的机器，但优选为比在溶液内液温最低的部分的温度低3℃～30℃的温度，更优选为低5℃～25℃的温度，进一步优选为低10℃～20℃的温度。
在工序(c)中，对在工序(b)得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冻干。冻干能够通过常规方法进行，例如能够通过在比溶剂的熔点低的温度下进行真空干燥，进而在室温(20℃)下进行真空干燥来进行冻干。
本发明中优选能够通过对在上述工序(c)中得到的多孔体进行粉碎而制造生物相容性高分子嵌段物。
(2)细胞
关于本发明中使用的细胞，其种类并无特别限定，而能够优选地使用作为本发明的目的的释放营养因子的细胞，并能够根据实际治疗目的而使用任意的细胞。并且，所使用的细胞可以是1种，也可以组合使用多种细胞。作为所使用的细胞，优选为动物细胞，更优选为脊椎动物来源细胞，尤其优选为人来源细胞。脊椎动物来源的细胞(尤其，人来源的细胞)的种类可以为多能细胞、体干细胞、前体细胞或成熟细胞中的任一个，尤其优选为体干细胞。
作为多能细胞，例如能够使用胚性干(ES)细胞、生殖干(GS)细胞或人工多能性干(iPS)细胞。作为体干细胞，例如能够使用间充质干细胞(MSC)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、骨髓来源的细胞(例如，骨髓来源MSC等)、心肌干细胞、脂肪来源的干细胞或神经干细胞。作为前体细胞及成熟细胞，例如能够使用来源于皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨骼、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、脾脏、口腔内、角膜、骨髓、脐带血、羊膜或毛的细胞。作为人来源细胞，例如能够使用ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、成骨前体细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、成心肌细胞、神经细胞、肝细胞、β细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、骨髓来源细胞或造血干细胞。并且，细胞的来源可以是自体细胞或异体细胞中的任一个。上述中，作为细胞，优选使用间充质干细胞。作为间充质干细胞，优选脂肪来源的间充质干细胞或骨髓来源的间充质干细胞。作为间充质干细胞的来源，优选人来源的或狗来源。
(3)细胞结构体
本发明的细胞结构体为包括上述的本发明所涉及的生物相容性高分子嵌段物和至少一种细胞，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体。本发明中，通过使用上述的生物相容性高分子嵌段物和上述的细胞，在多个细胞之间的间隙以镶嵌状三维配置多个高分子嵌段物，生物相容性高分子嵌段物和细胞以镶嵌状三维配置，由此形成在结构体中细胞均匀存在的细胞三维结构体，且如前述，具有物质渗透性。
本发明的细胞结构体在多个细胞之间的间隙配置有多个高分子嵌段物，其中，“细胞之间的间隙”是指，被细胞夹住即可，而无需为因所构成的细胞而密闭的空间。另外，无需在所有的细胞之间存在间隙，也可以存在细胞彼此接触的部位。隔着高分子嵌段物的细胞之间的间隙的距离、即选择一细胞与存在于离该细胞最短距离处的细胞时的间隙距离并无特别限制，优选为高分子嵌段物的大小，优选的距离也为高分子嵌段物的优选的大小范围。
并且，本发明所涉及的高分子嵌段物成为被细胞夹住的结构，但无需在所有的高分子嵌段物之间存在细胞，而可以存在高分子嵌段物彼此接触的部位。隔着细胞的高分子嵌段物之间的距离、即选择高分子嵌段物和存在于离该高分子嵌段物最短距离处的高分子嵌段物时的距离并无特别限制，优选为所使用的细胞聚集1～数个时的细胞块的大小，例如为10μm以上且1000μm以下，优选为10μm以上且100μm以下，更优选为10μm以上且50μm以下。
另外，本说明书中使用了“在结构体中细胞均匀存在的细胞三维结构体”等“均匀存在”这一表达方式，但并不是指完全均匀。
本发明的细胞结构体的厚度或直径能够设为所希望的厚度，作为下限，优选为215μm以上且，更优选为400μm以上且，最优选为730μm以上且。厚度或直径的上限并无特别限定，但作为使用上的通常范围，优选3cm以下，更优选2cm以下，进一步优选1cm以下。并且，作为细胞结构体的厚度或直径的范围，优选400μm以上且3cm以下，更优选500μm以上且2cm以下，进一步优选720μm以上且1cm以下。
本发明的细胞结构体优选由高分子嵌段物组成的区域和由细胞组成的区域被配置成镶嵌状。另外，本说明书中的“细胞结构体的厚度或直径”表示以下。选择细胞结构体中的某一点A时，在通过该点A的直线内，以距离细胞结构体外界的距离成为最短距离的方式将分割细胞结构体的线段的长度设为线段A。在细胞结构体中选择该线段A成为最长的点A，将此时的线段A的长度作为“细胞结构体的厚度或直径”。
本发明的细胞结构体中，细胞与高分子嵌段物的比率并无特别限定，优选每一细胞的高分子嵌段物的质量为0.0000001μg以上且1μg以下，更优选为0.000001μg以上且0.1μg以下，进一步优选为0.00001μg以上且0.01μg以下，最优选为0.00002μg以上且0.006μg以下。通过设为上述范围，能够使细胞更均匀地存在。并且，将下限设定在上述范围内，由此能够在使用于上述用途时发挥细胞的效果，并将上限设定在上述范围内，由此能够向细胞供给任意存在的高分子嵌段物中的成分。在此，高分子嵌段物中的成分并无特别限制，可列举后述的培养基中所含有的成分。
(4)细胞结构体的制造方法
本发明中使用的细胞结构体能够通过将生物相容性高分子嵌段物与至少一种细胞进行混合而制造。更具体而言，本发明的细胞结构体能够通过将生物相容性高分子嵌段物(由生物相容性高分子组成的块)与细胞交替配置而制造。制造方法并无特别限定，优选为在形成高分子嵌段物之后，播种细胞的方法。具体而言，能够通过孵化生物相容性高分子嵌段物与含细胞培养液的混合物而能够制造细胞结构体。例如，在容器中、保持于容器的液体中，将细胞和预先制作的生物相容性高分子嵌段物配置成镶嵌状。作为配置方法，优选通过使用自然凝聚、自然下落、离心、搅拌来促进、控制包括细胞和生物相容性基材的镶嵌状序列的形成。
作为所使用的容器，优选包括细胞低粘附性材料、细胞非粘附性材料的容器，更优选为包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯的容器。容器底面的形状优选为平底型、U字型、V字型。
通过上述方法得到的镶嵌状细胞结构体例如能够通过如下方法而制造所希望大小的细胞结构体，即(a)使分开调整的镶嵌状细胞块彼此融合或(b)在分化培养基或生长培养基下增量等。融合方法、增量方法并无特别限定。
例如，在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵化的工序中，通过将培养基交换为分化培养基或增长培养基，能够对细胞结构体进行增量。优选在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵化的工序中，通过进一步添加生物相容性高分子嵌段物，能够制造规定大小的细胞结构体，且细胞均匀存在于细胞结构体中的细胞结构体。
关于上述使分开调整的镶嵌状细胞块彼此融合的方法，具体而言是指细胞结构体的制造方法，该方法包括使细胞结构体融合多个的工序，该细胞结构体包含多个生物相容性高分子嵌段物和多个细胞，且在由上述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一个或多个上述生物相容性高分子嵌段物。
本发明中使用的细胞结构体的制造方法中的“生物相容性高分子嵌段物(种类、大小等)”、“细胞”、“细胞之间的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与高分子嵌段物的比率”等优选的范围与本说明书中上述的范围相同。
(5)营养因子释放剂
根据本发明的营养因子释放剂，从细胞结构体的细胞释放营养因子。从细胞释放营养因子是指，在细胞内生成营养因子，且在细胞内生成的营养因子被分泌到细胞外。
营养因子是指，具有生理活性或生物活性的物质(尤其是细胞生成的物质)。作为营养因子，可举出细胞因子、激素及生长因子及酶等。
细胞因子是指，从细胞释放，且介导细胞之间相互作用的蛋白质性因子。
激素是指，在动物体内(通常为内分泌腺)生成，且被分泌到体液中，在特定的器官、组织或细胞等的活动中发生一定的变化的化学物质。
生长因子是指，促进或控制细胞的生长的物质。
酶是指，催化生物体内的各种化学反应的蛋白质。
另外，细胞因子、激素及生长因子及酶并不具有相互排斥的含义。
作为营养因子的具体例，可举出TSG-6(TNF-stimulated gene 6protein：TNF-刺激基因6蛋白)(TNF为Tumor Necrosis Factor：肿瘤坏死因子)、ANG(Angiogenin：血管生成素)、EGF(Epidermal Growth Factor：表皮生长因子)、ENA-78(epithelial-derivedneutrophil-activating peptide 78：上皮源性中性粒细胞激活肽78)、bFGF(Basicfibroblast growth factor：基本的成纤维细胞生长因子)、IGF(Insulin-like growthfactors：胰岛素样生长因子)(IGF-1等)、MCP(Membrane Cofactor Protein：膜辅蛋白)(MCP-1等)、PDGF(Platelet-Derived Growth Factor：血小板衍生生长因子)(PDGF-BB等)、TGF(Transforming growth factor：转化生长因子)(TGFβ等)、TIMP(tissue inhibitorsof matrix metalloproteinase：基质金属蛋白酶组织抑制剂)(TIMP-1、TIMP-2等)、THPO(Thrombopoietin：血小板生成素)、VEGF(vascular endothelial growth factor：血管内皮生长因子)、VEGF-D(vascular endothelial growth factor D：血管内皮生长因子D)、NGF(nerve growth factor：神经生长因子)、BDNF(Brain-derived neurotrophic factor：脑源性神经营养因子)、G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor：粒细胞集落刺激因子)、GM-CSF(Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、EPO(Erythropoietin：促红细胞生成素)、TPO(Thrombopoietin：促血小板生成素)、HGF(Hepatocyte growth factor：肝细胞生长因子)、BMP(Bone MorphogeneticProtein：骨形态发生蛋白)、FGF(Fibroblast growth factor：成纤维细胞生长因子)、白细胞介素(IL-6(Interleukin-6：白细胞介素-6)、IL-8(Interleukin-8：白细胞介素-8)等)、趋化因子、干扰素(IFNγ(Interferon gamma：干扰素γ)等)、TNF(Tumor NecrosisFactor：肿瘤坏死因子)、脂肪细胞因子、抑制素、甲状旁腺激素、降钙素、促甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素、血管加压素、促肾上腺皮质激素释放激素、促肾上腺皮质激素、促性腺激素释放激素、促性腺激素、催乳素(prolactin)、褪黑激素、催产素、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素释放激素、生长激素、甲状腺激素、甲状腺素、肾上腺髓质激素、肾上腺素、去甲肾上腺素、雄激素、睾酮、雌激素、黄体酮、醛固酮及皮质醇等。
营养因子优选为TSG-6、ANG、EGF、ENA-78、bFGF、IFNγ、IGF-1、IL-6、IL-8、MCP-1、PDGF-BB、TGFβ、TIMP-1、TIMP-2、THPO、VEGF及VEGF-D中的任意一种以上。
营养因子更优选为TSG-6、ANG、EGF、ENA-78、IGF-1、IL-8、PDGF-BB、TGFβ、THPO及VEGF-D中的任意一种以上。
营养因子尤其优选为TSG-6。
另一方式中，营养因子优选为细胞因子，更优选为抗炎细胞因子，尤其优选为TSG-6。
作为抗炎细胞因子，是指具有抗炎效果的细胞因子。作为抗炎细胞因子，可举出TSG-6、TGFβ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-14、IL-22、IL-27、IL-33、IL-37、IL-38、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra(Interleukin-1Receptor Antagonist))、Fas配体(FasL(Fas ligand))、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL(TNF-ralated apotosis-inducingligand))、I型干扰素(IFNα(Interferon alfa：干扰素α)、IFNβ(Interferon beta：干扰素β))人白细胞型抗原-G5(HLA-G5(human leukocyte antigen G5)、吲哚胺-2,3-二加氧酶(IDO(indoleamine-2,3-dioxigenase))及前列腺素E2(PGE2(Prostaglandin E2))。
另外，作为营养因子，优选细胞块中的生成释放量与镶嵌细胞块中的生成释放量之比为1.1倍以上，更优选1.2倍以上，进一步优选1.3倍以上，尤其优选1.4倍以上。
生成释放量能够通过分别培养镶嵌细胞块和细胞块并在3天之后对向培养上清液释放的营养因子量进行定量而测定。营养因子量的定量能够根据营养因子的种类利用市售的试剂盒等并通过常规方法而进行。
本发明的营养因子释放剂能够移植到生物而使用。作为移植方法，能够使用切开、注射、内窥镜等。本发明的营养因子释放剂与细胞片这一细胞移植物不同，且能够缩小结构体的尺寸，因此能够实行通过注射进行的移植这一微创移植方法。
移植本发明的营养因子释放剂时的量能够根据移植对象物的状态等而适当选择，但作为移植的细胞数，优选1.0×105个细胞/kg以上且2.0×109个细胞/kg以下，更优选1.0×106个细胞/kg以上且2.0×108个细胞/kg以下。
关于本发明的营养因子释放剂的移植次数，可以仅移植1次，也能够根据需要而进行2次以上的移植。
(6)炎症疾病处置剂
从后述的实施例12所示的炎症刺激TNFα依赖性TSG-6生成释放量试验的结构可知在本发明的营养因子释放剂中，与未通过TNFα进行刺激的情况相比，通过进行TNFα刺激而确认到明显的TSG-6生成释放。即，本发明的营养因子释放剂对炎症刺激的响应性高，且能够释放大量的抗炎细胞因子，因此作为炎症疾病处置剂而有用。根据本发明，可提供包含上述的本发明的营养因子释放剂的炎症疾病处置剂。
而且，如后述的实施例所示，包含生物相容性高分子嵌段物和间充质干细胞，在多个间充质干细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体能够发挥炎症疾病处置效果。认为本发明的炎症疾病处置剂通过抗炎细胞因子的释放或T细胞的生长或活性化的抑制等而发挥炎症疾病处置效果。
炎症疾病是指，通过确认生物中的炎症反应而表示病态的疾病。
作为炎症疾病，可举出炎性肠病、溃疡性大肠炎、克罗恩病、肾炎、急性肾炎、慢性肾炎、肾小球肾炎、IgA肾病、糖尿病性肾病、膜性肾病、肾积水、造影剂肾病、肾盂肾炎、肾功能衰竭、急性肾炎、慢性肾炎、间质性肾炎、肾障碍、肾病综合征、高血压性肾硬化、糖尿病性肾小球硬化、肾结石、淀粉样肾、肾静脉血栓形成、Alport综合征、肝炎、肝硬化、胰腺炎、肺炎、鼻窦炎、鼻炎、关节炎、类风湿性关节炎、周期性发热-口疮性口炎-咽炎-淋巴结炎综合征(PFAPA)、成人发病型斯蒂尔(Still)病、白塞氏(Behcet’s)病、痛风、假性痛风、Schnitzler综合征、慢性复发性多发性骨髓炎(CRMO)、Cryopyrin相关的周期性综合征(CAPS)、家族性寒冷荨麻疹、穆-韦二氏综合征、慢性婴儿神经性关节炎综合征(CINCA综合征)/新生儿多系统炎性疾病(NOMID(neonatal-onset multisysteminflammatorydisease))、TNF(肿瘤坏死因子)受体相关的周期性综合征(TRAPS)、高IgD综合征(甲羟戊酸激酶缺乏症)、Blau综合/早发型结节病(early-onset sarcoidosis)、家族性地中海热、PAPA(化脓性关节炎-坏疽性脓皮病-痤疮)综合征、中条-西村综合征、Majeed综合征、NLRP12相关的周期性发热综合征(NAPS12)、白细胞介素1受体拮抗剂缺乏症(DIRA)、白细胞介素36受体拮抗剂缺乏症(DITRA)、磷脂酶Cγ2相关的抗体缺乏-免疫异常症(PLAID)、HOIL-1缺乏症、SLC29A3缺乏症、CARD14异常症、ADA2(腺苷脱氨酶2)缺乏症、婴儿期发病相关的血管病(SAVI)及NLRC4异常症，优选炎性肠病。
处置是指，针对各种疾病的预防或治疗等。
预防是指，预先抑制成为对象的疾病特有的症状的进展，且包括抑制发作，降低发病危险或延迟发病等。进展的抑制程度无任何限定，程度即使很小但只要可抑制进展，则也包含于预防中。
治疗是指，改善成为对象的疾病或状态，或者抑制进展等。
处置剂是指，以处置的目的而提供的物质。
本发明的炎症疾病处置剂能够移植到生物而使用。作为移植方法，能够使用切开、注射、内窥镜等。本发明的炎症疾病处置剂与所谓的细胞片的细胞移植物不同，且能够减小结构体的尺寸，因此能够进行所谓的基于注射的移植的微创移植方法。
移植本发明的炎症疾病处置剂时的量能够根据移植对象者的状态等而适当选择，但作为移植的细胞数，优选1.0×105个细胞/kg以上且2.0×109个细胞/kg以下，更优选1.0×106个细胞/kg以上且2.0×108个细胞/kg以下。关于本发明的炎症疾病处置剂的移植次数，可以仅移植1次，也能够根据需要而进行2次以上的移植。
(7)各种用途
根据本发明，可提供包括将在本发明中规定的细胞结构体移植到需要营养因子的对象者的工序的营养因子的释放方法。根据本发明，可提供包括将在本发明中规定的细胞结构体移植到需要对炎症疾病进行处置的对象者的工序的炎症疾病的处置方法。上述方法中，细胞结构体及营养因子的优选的范围与前述相同。
根据本发明，可提供用于释放营养因子和/或用于通过释放营养因子而进行的处置的在本发明中规定的细胞结构体。根据本发明，可提供用于对炎症疾病进行处置的在本发明中规定的细胞结构体。上述细胞结构体中，细胞结构体及营养因子的优选的范围与前述相同。
根据本发明，可提供用于制造营养因子释放剂的在本发明中规定的细胞结构体的使用。根据本发明，可提供用于制造炎症疾病处置剂的在本发明中规定的细胞结构体的使用。上述使用中，细胞结构体及营养因子的优选的范围与前述相同。
通过以下实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定于实施例。
实施例
[实施例1]重组肽(重组明胶)
作为重组肽(重组明胶)准备了以下CBE3(记载于国际公开WO2008/103041号公报中)。
CBE3：
分子量：51.6kDa
结构：GAP[(GXY)63]3G
氨基酸数：571个
RGD序列：12个
亚氨基酸含量：33％
大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323
氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。但将末尾的X修正为“P”)
GAP
(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[实施例2]重组肽多孔体的制作
[PTFE厚/圆筒形容器]
准备了底面厚度3mm、直径51mm、侧面厚度8mm、高度25mm的聚四氟乙烯(PTFE)制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被8mm的PTFE密封，且底面(平板圆形)也被3mm的PTFE密封。另一方面，上面呈开放的形状。从而，圆筒杯的内径成为43mm。以下，将该容器称为PTFE厚/圆筒形容器。
[铝玻璃板、圆筒形容器]
准备了厚度1mm、直径47mm的铝制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被1mm的铝密封，且底面(平板圆形)也被1mm的铝密封。另一方面，上面呈开放的形状。并且，仅在侧面的内部均匀地铺满了壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果，圆筒杯的内径成为45mm。并且，将该容器的底面设为呈在铝的外侧接合2.2mm的玻璃板的状态。以下，将该容器称为铝玻璃/圆筒形容器。
[温度差小的冷冻工序及干燥工序]
使CBE3水溶液流入PTFE厚/圆筒形容器或铝玻璃板/圆筒形容器，并在真空冻干机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却搁板从底面冷却了CBE3水溶液。此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及搁板温度的设定的组合按照如下所记载的那样进行了准备。
条件A：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下使搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冻干机取出。如上述那样得到了多孔体。
条件B：
铝/玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下使搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冻干机取出。如上述那样得到了多孔体。
条件C：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量10mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，并在-10℃下进行了1小时，然后在-20℃下进行了2小时，进而在-40℃下进行了3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行了24小时的真空干燥，在24小时之后直接在持续进行真空干燥的状态下使搁板温度上升至20℃，并直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冻干机取出。如上述那样得到了多孔体。
[各冷冻工序中的温度测定]
关于条件A～条件C的每一个，作为在溶液内最远离冷却侧的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的水表面液温，并且，作为在溶液内最接近冷却侧的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。
其结果，各自的温度与其温度差的分布成为如图1～图3。
从图1、图2、图3可知，在条件A、条件B、条件C下，液温在搁板温度-10℃设定区间(降低到-20℃之前)低于熔点即0℃，并且其状态处于不会发生冷冻(未冷冻/过冷却)状态。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2.5℃以下。另外，本说明书中，“温度差”是指“非冷却面液温”-“冷却面液温”。然后，将搁板温度进一步降低到-20℃，由此确认到液温向0℃附近急速上升的时刻，可知是在此产生凝固热而开始进行冷冻的。并且，确认到是在该时刻实际上开始形成冰的。然后，温度在0℃附近经过一定时间。在此，成为存在水与冰的混合物的状态。最后，温度从0℃再次开始下降，此时，液体部分消失而成为冰。从而，所测定的温度成为冰内部的固态温度，即并非液温。
以下，关于条件A、条件B、条件C，记载非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差、将搁板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差及产生凝固热紧前的温度差。另外，本发明中所述的“紧前的温度差”表示能够在活动(产生凝固热等)的1秒钟前～20秒钟前的期间检测出的温度差内的最高温度。
条件A
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.1℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.2℃
产生凝固热紧前的温度差：1.1℃
条件B
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.0℃
从-10℃降低之-20℃紧前的温度差：0.1℃
产生凝固热紧前的温度差：0.9℃
条件C
非冷却面液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.8℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：1.1℃
产生凝固热紧前的温度差：2.1℃
[实施例3]生物相容性高分子嵌段物的制作(多孔体的粉碎和交联)
利用新动力磨机(New Power Mill)(OSAKA CHEMICAL Co.，Ltd.，新动力磨机(NewPower Mill)PM-2005)粉碎了在实施例2中得到的条件A及条件B的CBE3多孔体。关于粉碎，以最大转速1分钟×5次，合计进行了5分钟的粉碎。对所得到的粉碎物，利用不锈钢制筛子进行了尺寸分类，从而得到了25～53μm、53～106μm、106～180μm的未交联嵌段物。然后，在减压下以160℃实施热交联(实施了交联时间为8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时这6种)来得到了生物相容性高分子嵌段物(CBE3嵌段物)。
以下，将实施了48小时交联的条件A的多孔体来源嵌段物称为E，将实施了48小时交联的条件B的多孔体来源嵌段物称为F。E及F为由通过温度差小的冷冻工序制造的多孔体制成的温度差小的嵌段物。另外，未发现交联时间的不同在本实施例的评价中影响性能，因此以下以实施了48小时交联的嵌段物为代表而使用。并且，E及F中在性能方面未发现差异。以下的实施例中，使用了在条件A、尺寸53～106μm、交联时间48小时下制作的生物相容性高分子嵌段物。
[实施例4]生物相容性高分子嵌段物的振实密度测定
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，且值越小，则越无法紧密地填充，即可以说嵌段物的结构复杂。如下测定了振实密度。首先，准备在漏斗的前端带帽(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的漏斗，并仅测定了帽的质量。然后，将帽装在漏斗上，并使嵌段物从漏斗流入而使其积蓄在帽中。添加充分量的嵌段物之后，将帽部分在桌子等较硬的部位敲击200次并卸下漏斗，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽的状态下测定了质量。通过从与仅帽的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽的体积而求出了振实密度。
其结果，实施例3的生物相容性高分子嵌段物的振实密度为98mg/cm3。
[实施例5]生物相容性高分子嵌段物的交联度测定
计算出在实施例3中交联的嵌段物的交联度(每一分子的交联数)。测定利用了TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)法。
＜样品制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(10mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上且来作为样品。
＜空白培养基制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，紧接着加入37质量％的盐酸(3mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(7mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上且来作为空白培养基。
对用纯水稀释了10倍的样品及空白培养基的吸光度(345nm)进行测定，并从以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g重组肽的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示重组肽质量(mg)。
(式3)1-(样品(式2)/未交联重组肽(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
其结果，实施例3的生物相容性高分子嵌段物的交联度为4.2。
[实施例6]生物相容性高分子嵌段物的吸水率测定
计算出在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物的吸水率。
在25℃下，在3cm×3cm的尼龙网孔制袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，并使其在离子交换中膨润两小时之后，风干了10分钟。在每一阶段测定质量，并根据(式4)求出了吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中，w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋的质量，w2表示包括吸水后的材料的袋整体的质量。)
其结果，实施例3的嵌段物的吸水率为786％。
[实施例7]镶嵌细胞块的制作
使人骨髓来源的间充质干细胞(hMSC：Human Mesenchymal Stem Cells(人间充质干细胞))在生长培养基(TAKARA BIO INC.：MSCGM BulletKit(商标))中悬浮，对其添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，最终以hMSC(1.2×106个细胞)和生物相容性高分子嵌段物(1mg)悬浮在4mL的培养基中的状态播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903(球体井口径800μm、球体井深度300μm、球体井为数井～约1000井。AGC TECHNO GLASS CO.,LTD.制)。
通过CO2孵化器在37℃下静置20小时，其结果作为由hMSC和生物相容性高分子嵌段物构成的直径0.4mm左右的球状能够回收多个镶嵌细胞块。
另外，确认到作为培养皿而使用了Type900(井口径400～500μm、井深度100～200μm)、Type902(井口径500μm、井深度200μm)、Type904(井口径800μm、井深度400μm)或Type905(井口径1400μm、井深度600μm)中的任一个的情况下，也与上述同样地可得到球状镶嵌细胞块。
[比较例1]仅由细胞组成的细胞块的制作
使人骨髓来源间充质干细胞(hMSC)在生长培养基(TAKARA BIO：MSCGM BulletKit(商标))中悬浮，最终以hMSC(1.2×106个细胞)悬浮在4mL的培养基的状态播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903(球体井口径800μm、球体井深度300μm、球体井为数井～约1000井。AGC TECHNO GLASS CO.，LTD.制)。
通过CO2孵化器在37℃下静置20小时，其结果能够回收多个仅由hMSC组成的细胞块。
[实施例8]营养因子的释放量的测定
分别培养实施例7的镶嵌细胞块和比较例1的细胞块并在3天之后对向培养上清液释放的营养因子量进行了测定。测定时使用了Human Angiogenesis Antibody Array C1(人血管生成抗体阵列C1)(#AAH-ANG-1-8RayBio)的试剂盒。其结果，可知与源自细胞块的释放量相比，从镶嵌细胞块释放的营养因子的量得以增加。具体而言，可知ANG为1.74倍、EGF为1.92倍、ENA-78为2.22倍、bFGF为1.09倍、IFNγ为1.11倍、IGF-1为1.44倍、IL-6为1.37倍、IL-8为1.86倍、MCP-1为1.29倍、PDGF-BB为3.60倍、TGFβ为1.40倍、TIMP-1为1.13倍、TIMP-2为1.33倍、THPO为1.43倍、VEGF为1.37倍、VEGF-D为2.54倍、且通过设为镶嵌细胞块而得以增加。从上述结果明确可知通过设为镶嵌细胞块而营养因子的生成释放量得以增加(表1)。
[表1]
[实施例9]镶嵌细胞块的制作(hMSC)
将人骨髓来源的间充质干细胞(hMSC)在DMEM(Dulbecco's Modified EagleMedium：达尔伯克改良依格尔培养基)+10％FBS(Fetal Bovine Serum：胎牛血清)培养基中调整为10万个细胞/mL，并添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物53-106μm而使其成为0.1mg/mL之后，将200μL播种到SUMIL ONCELLTIGHT X96U微孔板(SumitomoBakelite Company Limited、底呈U字型)，用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分)，并静置24小时，从而制作了由生物相容性高分子嵌段物和hMSC细胞组成且直径1mm的球状镶嵌细胞块(每一细胞为0.001μg的嵌段物)。另外，由于是在U字型的微孔板中制作的，因此本镶嵌细胞块为球状。
[实施例10]镶嵌细胞块的制作(hADSC)
将人脂肪来源的干细胞(hADSC)(Human Adipose Derived Stem Cells)在DMEM+10％FBS培养基中调整为10万个细胞/mL，并添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物53-106μm而使其成为0.1mg/mL之后，将200μL播种到SUMILONCELLTIGHT X96U微孔板(Sumitomo Bakelite Company Limited、底呈U字型)，用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分)，并静置24小时，从而制作了由生物相容性高分子嵌段物和hMSC细胞组成且直径1mm的球状镶嵌细胞块(每一细胞为0.001μg的嵌段物)。另外，由于是在U字型的微孔板中制作的，因此本镶嵌细胞块为球状。
[比较例2]细胞块的制作(hMSC)
将人骨髓来源的间充质干细胞(hMSC)在DMEM+10％FBS培养基中调整为10万个细胞/mL，将200μL播种到SUMILONCELLTIGHT X96U微孔板(Sumitomo Bakelite CompanyLimited、底呈U字型)，用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分)，并静置24小时而制作了仅由hMSC细胞组成的细胞块。另外，由于是在U字型的微孔板中制作的，因此本细胞块为球状。
[比较例3]细胞块的制作(hADSC)
将人脂肪来源的干细胞(hADSC)在DMEM+10％FBS培养基中调整为10万个细胞/mL，将200μL播种到SUMILONCELLTIGHT X96U微孔板(Sumitomo Bakelite Company Limited、底呈U字型)，用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分)，并静置24小时而制作了仅由hADSC细胞组成的细胞块。另外，由于是在U字型的微孔板中制作的，因此本细胞块为球状。
[实施例11]抗炎细胞因子TSG-6的释放量试验
分别培养在实施例9及实施例10中得到的镶嵌细胞块、以及在比较例2及比较例3中得到的细胞块，并在3天之后对释放到培养上清液的TSG-6进行了定量。进行定量时使用了RayBio Human TSG-6ELISA Kit(cat#：ELH-TSG6(RayBiotech,Inc.))。
将TSG-6的定量结果示于图4(参考FBS(+)的栏)。其结果，可知在hMSC中镶嵌细胞块比细胞块多1.4倍释放量，在hADSC中镶嵌细胞块比细胞块多1.8倍释放量。由此，关于TSG-6也明确可知通过设为镶嵌细胞块而生成释放量得以增加。
[实施例12]炎症刺激TNFα(Tumor Necrosis Factorα：肿瘤坏死因子α)依赖性TSG-6生成释放量试验
关于在实施例9及实施例10中得到的镶嵌细胞块、以及在比较例2及比较例3中得到的细胞块，在取代为不包含FBS的DMEM培养基之后，进一步在含有TNFα的DMEM培养基中实施48小时的培养，并对向培养上清液释放的TSG-6进行了定量。进行定量时使用了RayBioHuman TSG-6ELISA Kit(cat#：ELH-TSG6(RayBiotech,Inc.))。
将TSG-6的定量结果示于图4(参考TNFα(+)的栏)。
其结果，可知在hMSC中镶嵌细胞块比细胞块多5.7倍释放量，在hADSC中镶嵌细胞块比细胞块多3.1倍释放量。并且，与未通过TNFα进行刺激的情况相比，通过进行TNFα刺激而确认到明显的TSG-6生成释放(图4：参考TNFα(-)和TNFα(+)栏)。
另外，在释放量除以生细胞数而得的每一细胞的生成释放量中也确认到相同的情况(图5)。
TNFα刺激会促进TSG-6生成的情况为已知事实，但关于对该TNFα刺激的响应性，完全出乎预料的是若设为镶嵌细胞块则响应性飞跃性提高。由此，关于TSG-6，明确可知通过设为镶嵌细胞块不仅生成释放量增加，对TNFα刺激的响应性也得以提高。这表示镶嵌细胞块对炎症刺激的响应性高，且释放大量的抗炎细胞因子，并表示镶嵌细胞块作为抗炎治疗剂而非常有用。
[实施例13]镶嵌细胞块的制作(hADSC)
使人脂肪来源的干细胞(hADSC)在生长培养基(Lonza公司：ADSC-BulletKit(商标)、以下，还称为ADSC用培养基)中悬浮，并添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，以hADSC(1.2×106个细胞)和生物相容性高分子嵌段物(1mg)悬浮在4mL培养基中的状态播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性的35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903(球体井口径800μm、球体井深度300μm、球体井为数井～约1000井。AGC TECHNO GLASS CO.，LTD.制)。
[实施例14]2.5质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠大肠炎模型的制作和评价
小鼠使用了6-7周龄、体重17-21g的SPF C57BL/6n雌性小鼠(CHARLES RIVERLABORATORIES JAPAN,INC.)。对于C57BL/6n雌性小鼠6周龄，使其自由饮用2.5质量％DSS(MP Biomedicals,LLC.：Dextran Sodium Sulfate(葡聚糖硫酸钠)，分子量(MW)＝36,000-50,000)水溶液，并将自由饮水开始日设为诱发开始日(第0天)。使小鼠在诱发开始日至7天期间自由饮用2.5质量％DSS水溶液，第7天将上述2.5质量％DSS水溶液更换为蒸馏水，使小鼠进一步自由饮用蒸馏水7天。诱发开始日至0、1、2、5、6、7、8、9、12、13及14天之后对各小鼠的体重进行了测量。
大肠炎的评价中，根据体重及最后一天(诱发开始至第14天)的大肠的长度进行了评价。另外，若炎症进展则体重会减少，若恢复则体重会增加。并且，大肠的长度被用作炎症程度的形态学参数，越发生炎症则越发生大肠的短小化(JIN SEOK PARK等、J.CLIN.BIOCHEM.NUTR,2015；57:192-203)。
体重的评价中，关于各小鼠计算相对于正常小鼠的体重比例(％)而进行了评价。另外，按照以下的(式5)及(式6)求出了相对于正常小鼠的体重比例。并且，按照(式7)求出了体重恢复率(％)。
(式5)各小鼠相对于第0天的体重比(％)＝(Wt/W0)×100
(式中，W0表示诱发开始日的体重测量值，Wt表示诱发开始日至t天之后的体重测量值。其中，t为1、2、5、6、7、8、9、12、13或14，并将W0与Wt设为同一个体的体重。)
(式6)各小鼠相对于正常小鼠的体重比例(％)＝(Wt/W0)×100×(100/At)
(式中，W0表示诱发开始日的体重测量值，Wt表示诱发开始日至t天之后的体重测量值。At表示关于诱发开始日至t天之后的各正常小鼠，按照(式5)分别计算相对于第0天的体重比(％)，并对这些进行评价而得的平均值。其中，t为1、2、5、6、7、8、9、12、13或14，将W0与Wt设为同一个体的体重。)
(式7)体重恢复率(％)＝((Vt-Dt)-(Vt-Xt))/(Vt-Dt)
(式中，Vt表示诱发开始日至t天之后的正常小鼠“相对于正常小鼠的体重比例”的平均值。Dt表示诱发开始日至t天之后的ADSC用培养基小鼠组“相对于正常小鼠的体重比例”的平均值。Xt表示诱发开始日至t天之后各小鼠组“相对于正常小鼠的体重比例”的平均值。其中，t为1、2、5、6、7、8、9、12、13或14。正常小鼠组的体重恢复率成为100％，ADSC用培养基小鼠组的体重恢复率成为0％。)
关于大肠的长度，测量从各小鼠的肛门前端至盲肠为止的长度，并按照(式8)求出了短肠化恢复率。(正常小鼠组的短肠化恢复率成为100％，ADSC用培养基组的短肠化恢复率成为0％。)
(式8)短肠化恢复率(％)＝((Lx-L2)×100)/(L1-L2)
(式中，L1表示正常小鼠组的大肠的长度的中央值，L2表示ADSC用培养基小鼠组的大肠的长度的中央值，Lx表示各小鼠组的大肠的长度的中央值。)
[实施例15]向2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的hADSC的镶嵌细胞块的给予
对于在实施例14中制作的2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠，在诱发开始日至1天之后，在腹膜内给予了在实施例13中制作的ADSC镶嵌细胞块。给予了hADSC镶嵌细胞块1000个(hADSC1.2×106个细胞+生物相容性高分子嵌段物1mg/只)或hADSC镶嵌细胞块5000个(hADSC6.0×106个细胞+生物相容性高分子嵌段物5mg/只)。
[比较例4]向2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的hADSC细胞悬浮液或ADSC用培养基的给予
对于在实施例14中制作的2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠，在诱发开始日至1天之后，在腹膜内给予了使与实施例13相同的细胞悬浮在ADSC用培养基200μL的状态的hADSC细胞悬浮液或ADSC用培养基200μL。hADSC细胞悬浮液中所包含的细胞数为1.2×106个细胞/只。
将实施例15及比较例4中的各小鼠组相对于正常小鼠的体重比例(％)的平均值示于图6。如图6所示，hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组在诱发开始日至12、13及14天之后，“相对于正常小鼠的体重比例”比比较例的ADSC培养基小鼠组高。hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组显示体重的恢复比ADSC培养基小鼠组快。并且，hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组在诱发开始日至2、5、6、7、8、9、12、13及14天之后，“相对于正常小鼠的体重比例”比比较例的ADSC培养基小鼠组高。hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组显示与ADSC培养基小鼠组相比体重的减少得以抑制，而且体重的恢复比ADSC培养基小鼠组快。在最后一天(诱发开始日至14天之后)，hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组中体重恢复率为39％，hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组中体重恢复率为96％。hADSC镶嵌细胞块1000个及hADSC镶嵌细胞块5000个中发现体重减少的改善效果。并且，该改善的效果在镶嵌细胞块的数量多的一方比镶嵌细胞块的数量少的一方高。
将比较例4中的各小鼠组相对于正常小鼠的体重比例(％)的平均值示于图7。如图7所示，hADSC细胞悬浮液小鼠组在诱发开始日至2、5、6、7、8及9天之后，显示与ADSC培养基小鼠组相同的体重变化。并且，在诱发开始日至12、13及14天之后，“相对于正常小鼠的体重比例”比ADSC培养基小鼠组低。在最后一天(诱发开始日至14天之后)，hADSC细胞悬浮液小鼠组中体重恢复率为-44％。由此，显示hADSC细胞悬浮液未改善2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的体重减少。
总结以上的体重评价结果，在hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组及hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组中确认到改善2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的体重减少的效果。另一方面，在细胞数与hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组相同的hADSC细胞悬浮液小鼠组中，确认到改善2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的体重减少的效果。
实施例15中，在hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组中短肠化恢复率为75％，在hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组中短肠化恢复率为50％。在hADSC镶嵌细胞块1000个及hADSC镶嵌细胞块5000个中确认到改善了2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的短肠化。
比较例4中，在hADSC细胞悬浮液小鼠组中短肠化恢复率为14％。确认到hADSC细胞悬浮液虽改善2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的短肠化，但针对大肠的短肠化的改善效果比给予了相同的细胞数的hADSC镶嵌细胞块1000个低。
总结以上的大肠的长度的评价结果，在hADSC镶嵌细胞块1000个及hADSC镶嵌细胞块5000个中确认到改善2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的短肠化的效果，这表示效果比改善hADSC细胞悬浮液的短肠化的效果高。
以上的体重及大肠的长度的结果，显示基于hADSC镶嵌细胞块对2.5质量％DSS大肠炎模型小鼠的炎症改善效果，而且显示该效果比hADSC细胞悬浮液的效果高。
[实施例16]3.0质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的小鼠大肠炎模型的制作和评价
小鼠使用了6-7周龄、体重17-21g的SPF C57BL/6n雌性小鼠(CHARLES RIVERLABORATORIES JAPAN,INC.)。
对于C57BL/6n雌性小鼠6周龄，使其自由饮用3.0质量％DSS(MP Biomedicals,LLC.：Dextran Sodium Sulfate(葡聚糖硫酸钠)，MW＝36,000-50,000)水溶液。将自由饮水开始日设为诱发开始日(第0天)。使小鼠在诱发开始日至7天期间自由饮用3.0质量％DSS水溶液，第7天将上述3.0质量％DSS水溶液更换为蒸馏水，使小鼠进一步自由饮用蒸馏水6天。诱发开始日至0、1、2、5、6、7、8、9、12及13天之后对各小鼠的体重进行了测量。大肠炎的评价中，以与实施例14相同的方式，根据体重和最后一天(诱发开始至第13天)的大肠的长度进行了评价。
[实施例17]向3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的hADSC的镶嵌细胞块的给予
对于在实施例16中制作的3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠，在诱发开始日至1天之后，在腹膜内给予了在实施例13中制作的hADSC镶嵌细胞块。给予了hADSC镶嵌细胞块1000个(hADSC1.2×106个细胞+生物相容性高分子嵌段物1mg/只)或hADSC镶嵌细胞块5000个(hADSC6.0×106个细胞+生物相容性高分子嵌段物5mg/只)。
[比较例5]向3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的ADSC用培养基的给予
对于在实施例16中制作的3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠，在诱发开始日至1天之后，在腹膜内给予了ADSC用培养基200μL。
将实施例17及比较例5中的各小鼠组相对于正常小鼠的体重比例(％)的平均值示于图8。如图8所示，hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组在诱发开始日至12及13天之后，“相对于正常小鼠的体重比例”比比较例的ADSC培养基小鼠组高。hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组显示体重的恢复比ADSC培养基小鼠组快。并且，hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组显示在诱发开始日至12及13天之后，“与正常小鼠的体重比例”比比较例的ADSC培养基小鼠组高，而且体重比例比hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组高。在最后一天(诱发开始日至13天之后)，hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组的体重恢复率为20％，hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组的体重恢复率为69％。hADSC镶嵌细胞块1000个及ADSC镶嵌细胞块5000个中发现体重减少的改善效果。并且，该改善的效果在镶嵌细胞块的数量多的一方比镶嵌细胞块的数量少的一方高。
实施例17及比较例5中，在hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组中短肠化恢复率为68％，在hADSC镶嵌细胞块5000个小鼠组中短肠化恢复率为81％。在hADSC镶嵌细胞块1000个及hADSC镶嵌细胞块5000个中确认到改善了3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的短肠化。
从以上的体重及大肠的长度的结果确认到基于hADSC镶嵌细胞块对3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的炎症改善效果。
[实施例18]3.0质量％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的小鼠大肠炎模型的制作和评价
小鼠使用了6-7周龄、体重17-21g的SPF C57BL/6n雌性小鼠(CHARLES RIVERLABORATORIES JAPAN,INC.)。
对于C57BL/6n雌性小鼠6周龄，使其自由饮用3.0质量％DSS(MP Biomedicals,LLC.：Dextran Sodium Sulfate(葡聚糖硫酸钠)，MW＝36,000-50,000)水溶液。将自由饮水开始日设为诱发开始日(第0天)。使小鼠在诱发开始日至7天期间自由饮用3.0质量％DSS水溶液，在第7天将上述3.0质量％DSS水溶液更换为蒸馏水，使小鼠进一步自由饮用蒸馏水7天。在诱发开始日至0、1、4、5、6、7、8、11、12、13及14天之后对各小鼠的体重进行了测量。大肠炎的评价中，通过体重、最后一天(诱发开始至第14天)的大肠的长度及最后一天的大肠病理学评价进行了评价。
体重及大肠的长度的评价中，以与实施例14相同的方式进行了评价。
病理学评价中，将在最后一天取出的大肠组织用福尔马林固定，并实施了石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色(HE染色)。
关于所制作的标本使用光学显微镜，对溃疡深度、溃疡宽度、水肿和炎性细胞浸润进行了评价。将溃疡深度的评价设为如下，即0分：上皮完整，1分：粘膜固有层受损，2分：损伤达到粘膜下层，3分：损伤达到浆膜。将溃疡宽度的评价设为如下，即0分：受损的面积比例为0％，1分：受损的面积比例大于0％且为25％以下，2分：受损的面积比例大于25％且为50％以下，3分：受损的面积比例为大于50％且为75％以下，4分：受损的面积比例为大于75％。将水肿及炎性细胞浸润的评价设为如下，即0分：未确认到水肿及炎性细胞浸润浸，1分：轻度，2分：中程度，3分：高度，4分：更高度。通过以上的方法对各小鼠的结肠上部、结肠下部、直肠这3个部位进行了评价，并将上述3个部位的合计评分作为病理评分而进行了综合评价。另外，越发生炎症则病理评分的评分越高。
[实施例19]向3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的hADSC的镶嵌细胞块的给予
对于在实施例18中制作的3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠，在诱发开始日至7天之后，以使在实施例13中制作的hADSC镶嵌细胞块1000个(hADSC1.2×106个细胞+生物相容性高分子嵌段物1mg/只)悬浮在ADSC用培养基400μL中的状态进行了腹膜给予。
[比较例6]向3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的hADSC细胞悬浮液或ADSC用培养基的给予
对于在实施例18中制作的3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠，腹膜内给予了使与实施例13相同的细胞悬浮在ADSC用培养基400μL中的状态的hADSC细胞悬浮液或ADSC用培养基400μL。将hADSC细胞悬浮液中所包含的细胞数设为1.2×106个细胞/只。
将实施例19及比较例6中的各小鼠组相对于正常小鼠的体重比例(％)的平均值示于图9。如图9所示，hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组在诱发开始日至11、12、13及14天之后，“相对于正常小鼠的体重比例”比比较例的ADSC用培养基小鼠组及hADSC细胞悬浮液小鼠组高。hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组显示体重恢复比ADSC用培养基小鼠组及hADSC细胞悬浮液小鼠组快。因此，确认到hADSC镶嵌细胞块1000个的体重减少的改善效果。
另一方面，如图9所示，hADSC细胞悬浮液小鼠组在诱发开始日至11、12、13及14天之后，显示与ADSC用培养基小鼠组相同的体重变化。因此，确认到hADSC细胞悬浮液的体重减少的改善效果。
总结以上的体重的评价结果，在hADSC镶嵌细胞块1000个中确认到改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的体重减少的效果。另一方面，在hADSC细胞悬浮液中未确认到改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的体重减少的效果。
将实施例19及比较例6中的各小鼠组的大肠的长度作为箱线图而示于图10(图中，*：P＜0.05(t检定))。
如图10所示，显示了相对于正常小鼠故意缩短了ADSC用培养基小鼠组的大肠的长度。
实施例19中，显示了相对于比较例的ADSC用培养基小鼠组故意加长了hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组的大肠的长度。因此，在hADSC镶嵌细胞块1000个中确认到3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的短肠化。
另一方面，在比较例6，显示了hADSC细胞悬浮液小鼠组的大肠的长度相对于比较例的ADSC用培养基小鼠组并无差异。因此，确认到hADSC细胞悬浮液未改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的短肠化。
另外，各小鼠组的大肠的长度的中央值中，正常小鼠组为7.4cm，ADSC用培养基小鼠组为6.0cm，hADSC细胞悬浮液小鼠组为5.5cm，hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组为7.1cm。
总结以上的大肠的长度的评价结果，在hADSC镶嵌细胞块1000个中确认到改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的短肠化的效果。另一方面，在hADSC细胞悬浮液中未确认到改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的短肠化的效果。
将实施例19及比较例6中的各小鼠组的病理评分作为箱线图而示于图11(图中，*：P＜0.05(t检定))。如图11所示，在实施例19，显示了相对于比较例的ADSC用培养基小鼠组及hADSC细胞悬浮液小鼠组故意降低了hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组的病理评分。因此，在hADSC镶嵌细胞块1000个中确认到改善了3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的炎症。
另一方面，在比较例6，显示了hADSC细胞悬浮液小鼠组的病理评分相对于比较例的ADSC用培养基小鼠组并无差异。因此，确认到hADSC细胞悬浮液未改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的炎症。
另外，各小鼠组的病理评分的中央值中，正常小鼠组为0分，ADSC用培养基小鼠组为13.0分，hADSC细胞悬浮液小鼠组为18.0分，hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组为7.0分。
并且，将各小鼠组的各部位(结肠上部、结肠下部及直肠)的病理评分的中央值示于表2。
[表2]
将实施例19及比较例6中的各小鼠组的代表性HE组织染色图像示于图12及图13。如图12及图13所示，在正常小鼠组中未确认到溃疡、炎性细胞浸润及水肿。在比较例的ADSC用培养基小鼠组中，广范围确认到溃疡、炎性细胞浸润及水肿。与ADSC用培养基小鼠组同样地，在hADSC细胞悬浮液小鼠组中，广范围确认到溃疡、炎性细胞浸润及水肿。
另一方面，在实施例19，在hADSC镶嵌细胞块1000个小鼠组中溃疡及炎性细胞浸润的范围窄。并且，未确认到水肿。
总结以上的病理学的评价的结果，在hADSC镶嵌细胞块1000个中确认到针对3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的炎症的治疗效果。另一方面，在hADSC细胞悬浮液中未确认到针对3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的炎症的治疗效果。
从以上的体重、大肠的长度及病理学的评价结果确认到基于hADSC镶嵌细胞块的针对3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的炎症改善效果。
[实施例20]hBMSC镶嵌细胞块的制作
使人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSC：Human Bone Marrow DerivedMesenchymal Stem Cells)悬浮于生长培养基(TAKARA BIO INC.：MSCGM Bullet Kit(商标))，对其添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，最终以hBMSC(2.0×105个细胞)和生物相容性高分子嵌段物(0.2mg)悬浮在4mL的培养基中的状态播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mmType903(球体井口径800μm、球体井深度300μm、球体井为数井～约1000井。AGC TECHNOGLASS CO.，LTD.制)。
通过CO2孵化器在37℃下静置20小时，其结果作为由hBMSC和生物相容性高分子嵌段物组成的直径0.2mm左右的球状能够回收多个镶嵌细胞块。
[比较例7]hBMSC细胞块的制作
将人骨髓来源间充质干细胞(hBMSC)悬浮于生长培养基(TAKARA BIO：MSCGMBulletKit(商标))，最终以hBMSC(2.0×105个细胞)悬浮在4mL的培养基的状态播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903(球体井口径800μm、球体井深度300μm、球体井为数井～约1000井。AGC TECHNO GLASS CO.，LTD.制)。
通过CO2孵化器在37℃下静置20小时，其结果能够回收多个仅由hBMSC组成的细胞块。
[实施例21]T细胞的生长抑制试验(hBMSC镶嵌细胞块)
关于在实施例20中制作的hBMSC镶嵌细胞块，对T细胞的生长抑制能进行了评价。在24孔的微孔板上，将hBMSC镶嵌细胞块(hBMSC5.0×104个细胞+生物相容性高分子嵌段物0.2mg/孔)及标记为CFSE(cat#：565082(BD Biosciences公司))的T细胞(1.0×105个细胞/孔)共培养了5天。培养在含有2mM glutamine(谷氨酰胺)、100IU/mL penicillin(青霉素)、100ug/ml streptomycin(链霉素)、10％FBS及50uM单硫代甘油的RPMI1640培养基中添加有抗CD3CD28抗体珠(Dynabeads(商标)：Human T-Activator CD3/CD28(cat#：DB11161(VERITAS Corporation.))的培养液(以下，还称为T细胞培养基)中实施。另外，抗CD3CD28抗体珠按照产品的使用方法在每T细胞1.0×105个细胞中使用了10μl的抗CD3CD28抗体珠。
共培养5天之后，以CFSE的荧光强度为指标而对与hBMSC镶嵌细胞块共培养的T细胞的平均分裂次数进行了测定。共培养之前染色的CFSE的荧光信号会随着细胞分裂而衰减，因此通过对CFSE的荧光强度进行测定，能够鉴定细胞分裂次数。T细胞的平均分裂次数是按照式9计算的。
(式9)T细胞的平均分裂次数(次)＝(((分裂了0次的T细胞数)×0)+((分裂了1次的T细胞数)×1)+((分裂了2次的T细胞数)×2)+((分裂了3次的T细胞数)×3)+((分裂了4次的T细胞数)×4)+((分裂了5次的T细胞数)×5)+((分裂了6次的T细胞数)×6))/(分裂了0、1、2、3、4、5及6次的T细胞数的合计值)
[比较例8]T细胞的生长抑制试验(hBMSC细胞块)
与实施例21同样地，关于在比较例7中制作的hBMSC细胞块，对T细胞的生长抑制能进行了评价。
在24孔的微孔板上，将hBMSC细胞块(hBMSC5.0×104个细胞/孔)及标记为CFSE的T细胞(1.0×105个细胞/孔)共培养了5天。培养在与实施例21相同的T细胞培养基中进行。
共培养5天之后，对与hBMSC细胞块共培养的T细胞的CFSE荧光轻度进行测定，并按照式9对T细胞的平均分裂次数进行了计算。
将T细胞的平均分裂次数的测定结果示于图14(图中，***：P＜0.001(t检定))。其结果，相对于仅用T细胞进行了培养的情况，故意减少了与hBMSC镶嵌细胞块及hBMSC细胞块共培养的情况的T细胞的平均分裂次数。并且，与hBMSC细胞块共培养的情况相比，减少了与hBMSC镶嵌细胞块共培养的情况的T细胞的平均分裂次数。因此，hBMSC镶嵌细胞块及hBMSC细胞块表示T细胞的生长抑制能，其结果hBMSC镶嵌细胞块的生长抑制能高。
另外，各培养条件的T细胞的平均分裂次数中，仅用T细胞进行了培养的情况为3.87±2.60次，与hBMSC细胞块共培养的情况为1.00±0.12次，与hBMSC镶嵌细胞块共培养的情况为0.77±0.10次。
[实施例22]hADSC镶嵌细胞块的制作
使人脂肪来源的干细胞(hADSC)悬浮于生长培养基(Lonza公司：ADSC-BulletKit(商标)，以下，还称为ADSC用培养基)，添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，以使hADSC(2.0×105个细胞)和生物相容性高分子嵌段物(0.2mg)悬浮在4mL的培养基中的状态播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSPHERE(注册商标)培养皿35mm Type903(球体井口径800μm、球体井深度300μm、球体井为数井～约1000井。AGC TECHNO GLASS CO.，LTD.制)。
通过CO2孵化器在37℃下静置20小时，其结果作为由hADSC和生物相容性高分子嵌段物组成的直径0.2mm左右的球状能够回收多个镶嵌细胞块。
[实施例23]T细胞活性化抑制试验(IL-2释放量试验)
将在实施例20及实施例22中得到的镶嵌细胞块(5.0×104个细胞+生物相容性高分子嵌段物0.2mg/孔)分别与T细胞共培养，在48小时之后对释放到培养上清液的IL-2进行了定量。若T细胞呈活性状态则分泌IL-2，因此通过对IL-2进行定量能够鉴定T细胞的活性化程度。培养在与实施例21相同的T细胞培养基中进行。并且，将每1孔的T细胞数设为1.0×105个细胞/孔。
进行定量时使用了Human IL-2 ELISA Kit(cat#：RAB0286(SIGMA-ALDRICH.CO.LLC.))。
[比较例9]T细胞活性化抑制试验(IL-2释放量试验)
将以粘附状态培养的与实施例20及实施例22相同的细胞(5.0×104个细胞/孔)分别与T细胞共培养，在48小时之后对释放到培养上清液的IL-2进行了定量。培养在与实施例21相同的T细胞培养基中进行。并且，将每1孔的T细胞数设为1.0×105个细胞/孔。
进行定量时使用了Human IL-2 ELISA Kit(cat#：RAB0286(SIGMA-ALDRICH.CO.LLC.))。
将在实施例23及比较例9中测定的IL-2的定量结果示于图15(图中，*：P＜0.05、***：P＜0.001(t检定))。其结果，在与hBMSC镶嵌细胞块及hBMSC(粘附状态)共培养的情况下，与仅用T细胞培养的情况相比故意减少了T细胞的IL-2释放量。并且，和与hBMSC(粘附状态)共培养的情况相比，故意减少了与hBMSC镶嵌细胞块共培养的T细胞的IL-2释放量。因此，hBMSC镶嵌细胞块及hBMSC(粘附状态)显示T细胞的活性化抑制能，该效果比hBMSC镶嵌细胞块高。
同样地，与仅用T细胞培养的情况相比，故意减少了与hADSC的镶嵌细胞块及hADSC(粘附状态)共培养的情况的IL-2释放量。并且，和与hADSC(粘附状态)共培养的情况相比，故意减少了与hADSC镶嵌细胞块共培养的T细胞的IL-2分泌量。因此，hADSC镶嵌细胞块及hADSC(粘附状态)显示T细胞的活性化抑制能，该效果比hADSC镶嵌细胞块高。
[实施例24]狗来源的细胞镶嵌细胞块的制作
使狗脂肪来源的干细胞(cADSC：Canine Adipose Derived Stem Cells)悬浮于含有10％FBS及1％青霉素链霉素的DMEM培养基(以下，还称为cADSC用培养基)，添加在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)，以使cADSC(1.2×106个细胞)和生物相容性高分子嵌段物(0.25mg)悬浮在4mL的培养基中的状态播种到在底面具有凹陷部的细胞非粘附性35mm培养皿即EZSP HERE(注册商标)培养皿35mm Type903(球体井口径800μm、球体井深度300μm、球体井为数井～约1000井。AGC TECHNO GLASS CO.，LTD.制)。
通过CO2孵化器在37℃下静置69小时，其结果作为由cADSC和生物相容性高分子嵌段物组成的直径0.2mm左右的球状能够回收多个镶嵌细胞块。
[实施例25]狗来源的细胞镶嵌细胞块中的炎症治疗效果
以与实施例19相同的方式，对于实施例18的3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠，在炎症诱发开始日至7天之后，以使在实施例24中制作的cADSC镶嵌细胞块(cA DSC1.2×106个细胞+生物相容性高分子嵌段物0.25mg/只)悬浮在cADSC用培养基400μL中的状态进行了腹膜给予。
[比较例10]cADSC细胞悬浮液或ADSC用培养基中的炎症治疗效果
以与实施例25相同的方式，对于实施例18的3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠，在诱发开始日至7天之后，尾静脉给予cADSC用培养基100μL或使与实施例25相同的细胞悬浮在cADSC用培养基100μL中的状态的cADSC细胞悬浮液。cADSC细胞悬浮液中所包含的细胞数为4.0×104个细胞/只或1.2×106个细胞/只。
将实施例25及比较例10中的各小鼠组相对于正常小鼠的体重比例(％)的平均值示于图16。如图16所示，cADSC镶嵌细胞块小鼠组在诱发开始日至11、12、13及14天之后，“相对于正常小鼠的体重比例”比比较例的cADSC用培养基小鼠组及cADSC细胞悬浮液小鼠组高。cADSC镶嵌细胞块小鼠组显示体重的恢复比ADSC用培养基小鼠组及cADSC细胞悬浮液小鼠组快。因此，确认到cADSC镶嵌细胞块的体重减少的改善效果。
另一方面，如图16所示，cADSC细胞悬浮液小鼠组在诱发开始日至11、12、13及14天之后，显示比cADSC用培养基小鼠组低的体重变化。因此，确认到cADSC细胞悬浮液的体重减少的改善效果。
总结以上的体重的评价结果，确认到cADSC镶嵌细胞块改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的体重减少的效果。另一方面，cADSC细胞悬浮液中确认到改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的体重减少的效果。
将实施例25及比较例10中的各小鼠组的大肠的长度作为箱线图而示于图17(图中，*：P＜0.05、**：P＜0.01(t检定))。如图17所示，显示了相对于正常小鼠组故意缩短了cADSC用培养基小鼠组的大肠的长度。
实施例25中，显示了相对于比较例的cADSC用培养基小鼠组故意加长了cADSC镶嵌细胞块小鼠组的大肠的长度。因此，确认到cADSC镶嵌细胞块改善了3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的短肠化。
另一方面，比较例10中，显示了cADSC细胞悬浮液小鼠组的大肠的长度与比较例的cADSC用培养基小鼠组的大肠的长度无差异。因此，确认到cADSC细胞悬浮液未改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的大肠的短肠化。
另外，各小鼠组的大肠的长度的中央值中，正常小鼠组为7.50cm，cADSC用培养基小鼠组为6.64cm，4万cADSC细胞悬浮液小鼠组为6.48cm，120万cADSC细胞悬浮液小鼠组为6.14cm，cADSC镶嵌细胞块小鼠组为7.98cm。
总结以上的大肠的长度的评价结果，确认到cADSC镶嵌细胞块改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的短肠化的效果。另一方面，在cADSC细胞悬浮液中确认到改善3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的短肠化的效果。
从以上的体重及大肠的长度的结果确认到基于cADSC镶嵌细胞块的对3.0质量％DSS大肠炎模型小鼠的炎症改善效果。

Claims (23)

1.一种营养因子释放剂，其包含含有生物相容性高分子嵌段物和细胞、且在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体，一个所述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下，且从所述细胞释放营养因子。
2.根据权利要求1所述的营养因子释放剂，其中，
一个所述生物相容性高分子嵌段物的大小为50μm以上且120μm以下。
3.根据权利要求1或2所述的营养因子释放剂，其中，
在所述生物相容性高分子嵌段物中，生物相容性高分子通过热、紫外线或酶而交联。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物为不定形生物相容性高分子嵌段物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
所述细胞结构体在每一细胞中包含0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
所述细胞为体干细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
所述营养因子为细胞因子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
生物相容性高分子为明胶、胶原、去端肽胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、ProNectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、RetroNectin(注册商标)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素或壳聚糖。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的营养因子释放剂，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
10.根据权利要求9所述的营养因子释放剂，其中，
重组明胶由下述式1表示；
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B，
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y分别相同或不同。
11.根据权利要求9或10所述的营养因子释放剂，其中，
重组明胶为：
(1)包含序列号1中所记载的氨基酸序列的肽；
(2)包含序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列、并且具有生物相容性的肽；或
(3)包含与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列相同性的氨基酸序列、并且具有生物相容性的肽。
12.一种炎症疾病处置剂，其包含权利要求1至11中任一项所述的营养因子释放剂。
13.一种炎症疾病处置剂，其包含含有生物相容性高分子嵌段物和间充质干细胞、且在多个间充质干细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体，
一个所述生物相容性高分子嵌段物的大小为20μm以上且200μm以下。
14.根据权利要求13所述的炎症疾病处置剂，其中，
一个所述生物相容性高分子嵌段物的大小为50μm以上且120μm以下。
15.根据权利要求13或14所述的炎症疾病处置剂，其中，
在所述生物相容性高分子嵌段物中，生物相容性高分子通过热、紫外线或酶而交联。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物为不定形生物相容性高分子嵌段物。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
所述细胞结构体在每一细胞中包含0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
所述间充质干细胞为脂肪来源的间充质干细胞或骨髓来源的间充质干细胞。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
生物相容性高分子为明胶、胶原、去端肽胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、ProNectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、RetroNectin(注册商标)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素或壳聚糖。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
21.根据权利要求20所述的炎症疾病处置剂，其中，
重组明胶由下述式1表示；
式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B，
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y分别相同或不同。
22.根据权利要求20或21所述的炎症疾病处置剂，其中，
重组明胶为：
(1)包含序列号1中所记载的氨基酸序列的肽；
(2)包含序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列、并且具有生物相容性的肽；或
(3)包含与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列相同性的氨基酸序列、并且具有生物相容性的肽。
23.根据权利要求13至22中任一项所述的炎症疾病处置剂，其中，
所述间充质干细胞为人或狗来源的间充质干细胞。
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