CN107427609A

CN107427609A - 软骨再生材料

Info

Publication number: CN107427609A
Application number: CN201680016000.8A
Authority: CN
Inventors: 中村健太郎; 三好隼人; 羽田智子; 渡部正利喜
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd; Fujifilm Corp
Current assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd; Fujifilm Corp
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2017-12-01
Also published as: JPWO2016148245A1; WO2016148245A1; EP3272370A4; US20180064849A1; EP3272370B1; US20200069841A1; JP6586160B2; US11241518B2; EP3272370A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种软骨再生材料，其能够使用细胞而使骨头及软骨再生。根据本发明，可提供一种软骨再生材料，其包括细胞结构体，该细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段。

Description

软骨再生材料

技术领域

本发明涉及一种包括细胞结构体的软骨再生材料，该细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞。

背景技术

关节骨软骨缺损通常很难自然再生，因此正在积极尝试基于细胞移植治疗的再生医疗。作为细胞移植治疗，多次尝试以细胞凝聚体的形态投给细胞。例如，专利文献1中记载有向具有培养液能够通过的微细孔的腔内投入从受检动物或患者采取的来源于组织的细胞的细胞块，通过细胞块的一部分与气相接触的程度的量的培养液包含于腔内的方式在比腔内的培养液更多的培养液中培养细胞块而制作组织塞(TISSUE PLUG)，并移植所制作的组织塞。非专利文献1中记载有为了膝盖软骨的资料而移植由来源于滑膜的细胞和软骨细胞构成，且不包含骨架的球体。

另一方面，专利文献2中记载有一种包含具有生物相容性的高分子嵌段和细胞，并在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段的细胞结构体。专利文献2中所记载的细胞结构体中，能够从外部向细胞结构体的内部输送营养，具有充分的厚度，并且细胞均匀地存在于结构体中。专利文献1的实施例中，使用包括重组明胶和天然明胶材料的高分子嵌段证实了较高的细胞存活率。并且，在专利文献2的实施例11中记载有所制作的细胞结构体的糖胺聚糖(GAG)生产量较高，且软骨分化得到促进。

以往技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4122280号公报

专利文献2：国际公开WO2011/108517号公报

非专利文献

非专利文献1：European Cells and Materials,vol.22,2011.p275-290Transplantation of scaffold-free spheroids composed of synovium-derived cellsand chondrocytes or the treatment of cartilage defects of the knee.J.I.Lee

发明内容

发明要解决的技术课题

如上述，对于关节骨软骨缺损，正在尝试基于细胞移植治疗的再生医疗，但无法仅通过投给细胞来向缺损部位嫁接细胞，且再生效果不够充分，因此多次尝试以细胞凝聚体的形态投给细胞(专利文献1及非专利文献1等)。然而，即使在以细胞凝聚体的形态投给细胞情况下，也很难防止纤维性的软组织的侵入并且使所希望的骨头和软骨同时再生。并且，专利文献2中记载有细胞结构体的糖胺聚糖(GAG)生产量较高，但未证实能够使软骨及骨头同时再生。如上述，与使用了游离的单独细胞的情况相比，在使用细胞凝聚体，并进行骨头/软骨缺损的再生治疗的情况下，再生治疗效果等更高，但该效果未必充分，因此要求显示更高的骨头/软骨再生效果的细胞结构体。

本发明应解决的课题在于提供一种能够使用细胞而使骨头及软骨再生的软骨再生材料。

用于解决技术课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果发现包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段的上述细胞结构体具有优异的软骨再生能力和优异的骨再生能力。本发明是鉴于这些见解而完成的。

即，根据本发明可提高以下发明。

(1)一种软骨再生材料，其包括细胞结构体，该细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段。

(2)根据(1)所述的软骨再生材料，其用于使软骨及骨头再生。

(3)根据(1)或(2)所述的软骨再生材料，其中，上述干细胞为间充质干细胞。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述细胞结构体相对于每一上述干细胞包括0.0000001μg以上且1μg以下的上述生物相容性高分子嵌段。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的软骨再生材料，其中，一个上述生物相容性高分子嵌段的大小为10μm以上且300μm以下。

(6)根据(1)至(5)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述细胞结构体的厚度或直径为100μm以上且1cm以下。

(7)根据(1)至(6)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子嵌段包含重组肽或化学合成肽。

(8)根据(1)至(7)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子嵌段包括重组明胶或化学合成明胶。

(9)根据(8)所述的软骨再生材料，其中，上述重组明胶或化学合成明胶由下述式1表示，

式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

式1中，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一个，m为2～10的整数，n为3～100的整数，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列。

(10)根据(8)或(9)所述的软骨再生材料，其中，

上述重组明胶或化学合成明胶为如下肽中的任一个：

包括序列编号1中所记载的氨基酸序列的肽；

包括在序列编号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成了一个或数个氨基酸的氨基酸序列，并且具有生物相容性的肽；或

包括与序列编号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有生物相容性的肽。

(11)根据(1)至(10)中任一项所述的软骨再生材料，其中，在上述生物相容性高分子嵌段中，生物相容性高分子通过热、紫外线或酶而交联。

(12)根据(1)至(11)中任一项所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子嵌段处于通过将多孔体的生物相容性高分子粉碎而得到的颗粒形态。

(13)一种软骨再生材料，其包括(1)至(12)中任一项所述的软骨再生材料和生物相容性高分子薄膜。

(14)根据(13)所述的软骨再生材料，其中，上述生物相容性高分子薄膜为用于将上述细胞结构体的移植面的一部分或全部与移植部位隔离的薄膜。

(15)一种细胞结构体，其使用于软骨再生的治疗中，上述细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段。

(16)一种软骨再生方法，其包括将上述细胞结构体移植到需要软骨再生的患者的工序，上述细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段。

(17)一种细胞结构体的使用，其用于制造软骨再生材料，且包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段。

发明效果

本发明的软骨再生材料具有优异的软骨再生能力和优异的骨再生能力，且在细胞移植治疗中有用。

附图说明

图1表示条件A的液温特性曲线。

图2表示条件B的液温特性曲线。

图3表示条件C的液温特性曲线。

图4表示条件AA的液温特性曲线。

图5表示条件BB的液温特性曲线。

图6表示仅移植了海绵(无薄膜)的组织的染色结果。

图7表示移植了海绵(无细胞)和薄膜的组织的染色结果。

图8表示移植了细胞培养海绵和薄膜的组织的染色结果。

图9表示移植了细胞块和薄膜的组织的染色结果。

图10表示移植了镶嵌细胞块和薄膜的组织的染色结果。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

本发明的软骨再生材料包括细胞结构体，该细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段。另外，本发明中所使用的细胞结构体在本说明书中有时称作镶嵌细胞块(呈镶嵌状的细胞块)。

本发明的软骨再生材料具有优异的软骨再生能力和优异的骨再生能力，因此不仅使用于使软骨再生，还能够使用于使软骨及骨再生。本发明的软骨再生材料例如能够用作用于移植到软骨缺损部位的移植材料。

包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段的上述细胞结构体不仅具有优异的软骨再生作用且还具有优异的骨再生作用是完全预料之外的显著效果。在专利文献1及非专利文献1中，关于使用生物相容性高分子嵌段的情况既没有公开也没有启示。专利文献1及非专利文献1的技术的特征在于不包含生物相容性高分子嵌段等骨架，在这方面与本发明不同。专利文献2中记载有细胞结构体的糖胺聚糖(GAG)生成量较高，但GAG生产量与能够使软骨及骨头同时再生的情况无关。软骨分化和软骨再生为不同的现象，并且软骨再生能力和骨再生能力为完全不同的概念。并且专利文献2中的GAG生产在使用了生物外且促进软骨分化的特异的培养基(软骨分化培养基)的试验中进行，该实验条件与生物体内的环境大不同。因此，无法根据专利文献2的见解预测生物内环境下的软骨再生，尤其能够同时再生软骨及骨头的情况完全不能根据专利文献2预想到。

(1)生物相容性高分子嵌段

本发明中所使用的细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段。以下对生物相容性高分子嵌段进行说明。

(1-1)生物相容性高分子

生物相容性是指，与生物接触时，不引起如长期且慢性炎症反应等显著的有害反应。若本发明中所使用的生物相容性高分子为具有生物相容性的高分子，则对于是否在生物内进行降解并无特别限定，优选为生物降解性高分子。作为非生物降解性高分子，具体而言可举出聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯、不锈钢、钛、硅酮及MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)等。作为生物降解性高分子，具体而言可举出重组肽或化学合成肽等多肽(例如，以下说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。上述中，尤其优选重组肽。这些生物相容性高分子可以被设计成提高细胞粘附性。具体而言，能够使用如下方法，即“基于相对于基材表面的细胞粘附基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层连蛋白)或细胞粘附序列(以氨基酸单字母代码表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽的涂布”、“基材表面的氨基化、阳离子化”或“基材表面的等离子处理、基于电晕放电的亲水性处理”。

若重组肽或化学合成钛等的多肽的种类具有生物相容性，则并无特别限定，例如，优选明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、pronectin、层连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、Retronectin，最优选为明胶、胶原蛋白、去端肽胶原。本发明中所使用的明胶优选为天然明胶、重组明胶或化学合成钛，更优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指，通过源自天然的胶原蛋白制成的明胶。

化学合成肽或化学合成明胶是指人工合成的肽或明胶。明胶等肽的合成可以为固相合成也可以为液相合成，但优选为固相合成。肽的固相合成对与本领域人员来说是公知的，例如可列举作为氨基的保护基而使用Fmoc基(芴甲氧羰(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl)基)的Fmoc基合成法及作为氨基的保护基而使用Boc基(叔丁基羰(tert-ButylOxy Carbonyl)基)的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式在本说明书中能够与后述(1-3)重组明胶的内容相符。

关于重组明胶，在本说明书中后述。

本发明中所使用的生物相容性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选为0～1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB是指，由藤田穆提出的基于表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的亲水性和疏水性的指数，其详细内容例如在“PharmaceuticalBulletin”，vol.2,2,pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11,10,pp.719-725(1957)、“FRAGRANCE JOURNAL”，vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的根源设为甲烷(CH₄)，将其他化合物全都视为甲烷的衍生物，并将其碳原子数、取代基、相变部、环等分别设定为恒定数值，相加其得分之后求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值绘制在以有机性值为X轴、无机性值为Y轴的图上。有机概念图中的IOB是指，有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)之比、即为“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容可参考《新版有机概念图-基础与应用-》(甲田善生等著、三共出版、2008)。本说明书中，以求出IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲水性和疏水性。该符号表示“1/IOB”值越小(接近0)，越亲水。

通过将本发明中所使用的生物相容性高分子的“1/IOB”值设定在上述范围，上述生物相容性高分子的亲水性变高，并且吸水性变高，因此该高分子有效地作用于营养成分的保持，其结果，推测有助于本发明中的细胞结构体(镶嵌细胞团)中的细胞的稳定性和易生存力。

当本发明中所使用的生物相容性高分子为多肽时，上述多肽的以总平均亲水性(Grand average of hydropathicity(GRAVY))值表示的亲水性和疏水性指数优选为0.3以下且-9.0以上，更优选为0.0以下且-7.0以上。总平均亲水性(Grand average ofhydropathicity(GRAVY))值能够通过“Gastei ger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,DuvaudS.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；Protein Identification and AnalysisTools on the ExP ASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics ProtocolsHandbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“Gasteiger E.,Gatt iker A.,HooglandC.,Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).”中所记载的方法得到。

通过将本发明中所使用的生物相容性高分子的GRAVY值设定在上述范围内，上述生物相容性高分子的亲水性变高并且吸水性变高，由此该高分子有效地作用于营养成分的保持，其结果，推测为有助于本发明中的细胞结构体(镶嵌细胞团)中的细胞的稳定性和易生存力。

(1-2)交联

本发明中所使用的生物相容性高分子可以交联也可以不交联，优选交联。通过使用经交联的生物相容性高分子，可得到防止在培养基中培养本发明的软骨再生材料时及移植到生物时瞬间降解的效果。作为通常的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳化二亚胺、氨腈(cyanamide)等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疎水性相互作用、氢键、离子性相互作用等。本发明中所使用的交联方法优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。

当进行基于酶的交联时，作为酶，若具有高分子之间的交联作用，则并无特别限定，优选能够使用谷氨酰胺转氨酶及漆酶谷氨酰胺转氨酶，最优选能够使用谷氨酰胺转氨酶。作为使用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的高分子的具体例，若为具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以源自哺乳类，也可以源自微生物，具体而言，可举出作为AJINOMOTO CO.,INC.制ACTIVA系列、作为试剂贩卖的源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶、例如，ORIENTAL YEAST CO.,LTD.制、Upstate USA Inc.制、BiodesignIntern ational制等源自豚鼠肝脏的谷氨酰胺转氨酶、源自山羊的谷氨酰胺转氨酶、源自兔子的谷氨酰胺转氨酶等及源自人类的凝血因子(Factor XIIIa、Haemat ologicTechnologies,Inc.)等。

只要能够进行交联，则进行交联(例如，热交联)时的反应温度并无特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，更进一步优选为120℃～200℃。

(1-3)重组明胶

本发明中所述的重组明胶是指，具有通过基因重组技术制成的类似明胶的氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。能够在本发明中所使用的重组明胶优选为在胶原蛋白中具有以特征性Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一个)的重复。在此，多个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。优选在一分子中包含2个序列以上的细胞粘附信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有源自胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176号公报、US专利6992172号公报、国际公开WO2004/85473号公报、国际公开WO2008/103041号公报等中所记载的重组明胶，但并不限定于此。作为本发明中所使用的重组明胶，优选为以下形态的重组明胶。

重组明胶由于天然明胶的固有能力而生物相容性优异，并且并非源自天然，因此无需担心牛海绵状脑病(BSE)等，从而非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀，且序列已被确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而减少模糊并精密地设计。

重组明胶的分子量并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。

重组明胶优选在胶原蛋白中具有以特征性Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，多个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。在Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选甘氨酸以外的任意氨基酸)。在胶原蛋白中，以特征性Gly-X-Y表示的序列是指，明胶/胶原蛋白的氨基酸成分及序列中，与其他蛋白质相比为非常特殊的部分结构。在该部分结构中，甘氨酸占总体的约3分之1，在氨基酸序列中是每3个中重复一个。甘氨酸为最简单的氨基酸，针对分子链的配置的束缚也较少，对凝胶化时的螺旋结构的再生贡献较大。以X及Y表示的氨基酸中包含较多的亚氨酸(脯氨酸、羟脯氨酸)，优选占总体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上，更优选95％以上，最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。

通常的明胶中，极性氨基酸中具有电荷的氨基酸与无电荷氨基酸以1:1的比率存在。在此，极性氨基酸是指，具体而言，半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，这些中极性无电荷氨基酸是指，半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。在本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有氨基酸中，极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例优选为5％以上且小于20％，更优选为5％以上且小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，优选两个以上的氨基酸。

在通常的多肽中，已知有作为细胞粘附信号而起作用的最小氨基酸序列(例如，Nagai Co.,Ltd.出版发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有两个以上的作为这些细胞粘附信号而发挥作用的最小氨基酸序列。作为具体的序列，从粘附的细胞的种类较多的方面考虑，优选以氨基酸单字母代码表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列。更优选RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质生产量。例如，作为细胞，在使用了间充质干细胞的情况下，在软骨分化中能够提高糖胺聚糖(GAG)的生产。

作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间，优选在25～60之间不均匀。

从细胞粘附、增值性的观点考虑，该最小氨基酸序列的含量优选在蛋白质1分子中为3～50个，更优选为4～30个，进一步优选为5～20个。最优选为12个。

在本发明中所使用的重组明胶中，RGD序列(基序)相对于氨基酸总数的比例优选至少为0.4％。当重组明胶包括350个以上的氨基酸时，优选350个氨基酸的每一段至少包含一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，进一步优选至少为1.0％，更进一步优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。关于重组肽内的RGD基序的数量，每250个氨基酸优选至少为4个，更优选至少为6个，进一步优选至少为8个，进一步优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％的比例中，每250个氨基酸对应于至少一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征而包括251个氨基酸的明胶应包含至少两个RGD序列。关于本发明的重组明胶，优选每250个氨基酸包含至少两个RGD序列，更优选每250个氨基酸至少包含3个RGD序列，进一步优选每250个氨基酸包含至少4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的另一方式，包含至少4个RGD基序，优选至少包含6个，更优选至少包含8个，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。

重组明胶可以局部性水解。

优选本发明中所使用的重组明胶由式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一个。m为2～10的整数，优选为3～5。n为3～100的整数，优选15～70，更优选50～65。A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列。

更优选本发明中所使用的重组明胶由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸的任一个，63个Y分别独立地表示氨基酸的任一个。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。)表示。

重复单元中优选键合多个天然存在的胶原蛋白的序列单元。在此所述的天然存在的胶原蛋白是指，若天然存在则可以为任一个，优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原蛋白。更优选为I型、II型或III型胶原蛋白。根据另一方式，上述胶原蛋白的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选源自人。

本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。

优选重组明胶未被去胺基化。

优选重组明胶不具有端肽。

优选重组明胶为通过对氨基酸序列进行编码的核酸而制备的实质上纯多肽。

作为本发明中所使用的重组明胶尤其优选为如下钛：

(1)包括序列编号1中所记载的氨基酸序列的肽；

(2)包括序列编号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成了一个或数个氨基酸的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽；或

(3)包括具有80％以上(优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上)与序列编号1中所记载的氨基酸序列相同的序列同一性的氨基酸序列，且具有生物相容性的肽。

“缺失、取代或加成了一个或数个氨基酸的氨基酸序列”中的“一个或数个”是指，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，尤其优选为1～3个。

关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术来制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/85473号公报、国际公开WO2008/103041号公报等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，并将其编入表达载体而制作重组表达载体，将其导入适当的宿主而制作转化体。以适当的培养基培养所得到的转化体，由此生成重组明胶，因此通过从培养物回收所产生的重组明胶，能够制备本发明中所使用的重组明胶。

(1-4)生物相容性高分子嵌段

本发明中，使用包括上述生物相容性高分子的嵌段(block)。

本发明中的生物相容性高分子嵌段的形状并无特别限定。例如，为无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉末状、多孔状(多孔体)、纤维状、纺锤状、扁平状及片状，优选无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉末状及多孔状。无规则形表示表面形状不均匀，例如，表示如岩石具有凹凸的形状。另外，上述形状的例示并不是分别不同的形状，例如，有时作为粒状(颗粒)的下位概念的一例而成为无规则形状。

本发明中的一个生物相容性高分子嵌段的大小并无特别限定，优选为1μm以上且1000μm以下，更优选为10μm以上且1000μm以下，进一步优选为10μm以上且700μm以下，进一步优选为10μm以上且300μm以下，更进一步优选为10μm以上且200μm以下，更进一步优选为20μm以上且200μm以下，尤其优选为20μm以上且150μm以下，最优选为50μm以上且110μm以下。从软骨再生的观点考虑，优选将一个生物相容性高分子嵌段的大小设定在上述范围内。另外，一个生物相容性高分子嵌段的大小并非是指多个生物相容性高分子嵌段的大小的平均值在上述范围内，而是指将多个生物相容性高分子嵌段过筛之后得到的一个一个的生物相容性高分子嵌段的尺寸。

一个嵌段的大小能够通过分离嵌段时所使用的筛的大小来定义。例如，能够将以180μm的筛进行过筛，并以106μm的筛对所通过的嵌段进行过筛时残留于筛上的嵌段设为大小为106～180μm的嵌段。接着，能够将以106μm的筛进行过筛，并以53μm的筛对所通过的嵌段进行过筛时残留于筛上的嵌段设为大小为53～106μm的嵌段。接着，能够将以53μm的筛进行过筛，并以25μm的筛对所通过的嵌段进行过筛时残留于筛上的嵌段设为大小为25～53μm的嵌段。

(1-5)生物相容性高分子嵌段的制造方法

生物相容性高分子嵌段的制造方法并无特别限定，例如，通过使用粉碎机(NewPower Mill等)粉碎生物相容性高分子的多孔体，能够得到颗粒形态一例的无规则形状的生物相容性高分子嵌段。

生物相容性高分子的多孔体的制造方法并无特别限定，例如能够列举如下制造方法，其包括：

(a)在溶液内液温最高的部分的温度和在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，且以在溶液内液温最高的部分的温度为溶剂的熔点以下的温度将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态的工序；

(b)对在工序(a)中得到的生物相容性高分子的未冷冻状态的溶液进行冷冻的工序；及

(c)对在工序(b)中得到的已冷冻的生物相容性高分子的溶液进行冷冻干燥的工序。

将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态时，在溶液内液温最高的部分的温度和在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下(优选2.3℃以下，更优选2.1℃以下)，即通过将温度之差设为较小，所得到的多孔体的孔隙不均变少。另外在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差的下限并无特别限定，只要为0℃以上即可，例如可以为0.1℃以上、0.5℃以上、0.8℃以上或0.9℃以上。由此，使用了生物相容性高分子嵌段的细胞结构体可实现所谓显示较高细胞数的效果，该生物相容性高分子嵌段通过使用所制造的生物相容性高分子的多孔体而制造。

工序(a)的冷却例如优选经由热传导率比水低的原材料(优选特氟龙(注册商标))而冷却，且能够将在溶液内液温最高的部分假设成距离冷却面最远的部分，并能够将在溶液内液温最低的部分假设成冷却面的液温。

优选在工序(a)中，产生凝固热紧前的在溶液内液温最高部分的温度和在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，更优选为2.3℃以下，进一步优选为2.1℃以下。在此“产生凝固热紧前的温度差”是指，在产生凝固热时的1秒钟前～10秒钟前之间温度差变最大时的温度差。

优选在工序(a)中，在溶液内液温最低的部分的温度为溶剂的熔点-5℃以下，更优选为溶剂的熔点-5℃以下且溶剂的熔点-20℃以上，更优选为溶剂的熔点-6℃以下且溶剂的熔点-16℃以上。另外，“溶剂的熔点”的溶剂是指，生物相容性高分子的溶液的溶剂。

工序(b)中，对在工序(a)中得到的未冷冻状态的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序(b)中用于冷冻的冷却温度并无特别限制，根据进行冷却的设备而不同，但优选为比在溶液内液温最低的部分的温度低3℃～30℃的温度，更优选为低5℃～25℃的温度，进一步优选为低10℃～20℃的温度。

工序(c)中，对在工序(b)中得到的已冷冻的生物相容性高分子的溶液进行冷冻干燥。冷冻干燥能够通过常规方法进行，例如以比溶剂的熔点低的温度进行真空干燥，还能够在室温(20℃)下通过进行真空干燥来进行冷冻干燥。

(2)干细胞

本发明中所使用的干细胞只要能够进行细胞移植，且能够发挥软骨再生能力，则能够使用任意干细胞，且其种类并无特别限定。并且，所使用的干细胞可以为一种，也可以组合使用多种干细胞。并且，作为所使用的干细胞，优选为动物细胞，更优选为源自脊椎动物的细胞，尤其优选为源自人类的细胞。源自脊椎动物的细胞(尤其，源自人类的细胞)的种类可以为多能细胞或体性干细胞中的任一个。作为多能细胞，例如能够使用胚性干细胞(ES细胞)、生殖系列干细胞(GS细胞)或诱导性多能干细胞(iPS细胞)。作为体性干细胞，例如能够使用间充质干细胞(MSC)、羊膜细胞、源自脐带血的细胞、源自骨髓的细胞或源自脂肪的干细胞，尤其优选为间充质干细胞(MSC)。并且，细胞的来源可以为自体细胞或异体细胞中的任一个。

(3)细胞结构体

本发明中，使用上述生物相容性高分子嵌段和上述干细胞，并通过将在多个干细胞之间的间隙以镶嵌状3维配置多个生物相容性高分子嵌段来制作细胞结构体。以镶嵌状3维配置生物相容性高分子嵌段和干细胞，由此形成在细胞结构体中干细胞均匀存在的细胞结构体，并能够从外部向细胞结构体的内部传输培养基成分等营养。

本发明中所使用的细胞结构体中，在多个干细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段，在此，“干细胞之间的间隙”是指，无需为被所构成的干细胞封闭的空间，而被干细胞夹持即可。另外，无需在所有的细胞之间存在间隙，也可以存在干细胞彼此相接触的部位。夹着生物相容性高分子嵌段的干细胞之间的间隙的距离、即选择某一干细胞和存在于距离该干细胞最短距离内的干细胞时的间隙距离并无特别限制，优选为生物相容性高分子嵌段的大小，优选的距离也在生物相容性高分子嵌段的优选的大小的范围内。

并且，生物相容性高分子嵌段构成为被干细胞夹持的结构，但无需在所有的生物相容性高分子嵌段之间存在干细胞，也可以存在生物相容性高分子嵌段彼此相接触的部位。夹着干细胞的生物相容性高分子嵌段之间的距离、即选择生物相容性高分子嵌段和存在于距离该生物相容性高分子嵌段最短距离内的生物相容性高分子嵌段时的距离并无特别限制，优选为聚集一个～数个所使用的干细胞时的干细胞的嵌段的大小，例如为10μm以上且1000μm以下，优选为10μm以上且100μm以下，更优选为10μm以上且50μm以下。

另外，本说明书中，使用了“在细胞结构体中干细胞均匀存在的细胞结构体”等、“均匀存在”的表达方式，但并不指完全均匀，而是指能够从外部向细胞结构体内部传输培养基成分等营养。

细胞结构体的厚度或直径能够设为所希望的厚度，但作为下限，优选为215μm以上，更优选400μm以上，进一步优选500μm以上。厚度或直径的上限并无特别限定，但作为使用上的通常范围，优选3cm以下，更优选2cm以下，进一步优选1cm以下。并且，作为细胞结构体的厚度或直径的范围，优选400μm以上且3cm以下，更优选500μm以上且2cm以下，进一步优选500μm以上且1cm以下。将细胞结构体的厚度或直径设定在上述范围内，由此轻松地发挥软骨再生能力。

细胞结构体中，优选包括生物相容性高分子嵌段的区域和包括干细胞的区域被配置成镶嵌状。另外，本说明书中的“细胞结构体的厚度或直径”表示以下内容。选择细胞结构体中的某一点A时，在通过该点A的直线内，将以距离细胞结构体外界的距离成为最短的方式分割细胞结构体的线段的长度设为线段A。在细胞结构体中选择该线段A成为最长的点A，将此时的线段A的长度作为“细胞结构体的厚度或直径”。

细胞结构体中的干细胞与生物相容性高分子嵌段的比率并无特别限定，优选每一个干细胞的生物相容性高分子嵌段的质量为0.0000001μg以上且1μg以下，更优选为0.000001μg以上且0.1μg以下，进一步优选为0.00001μg以上且0.01μg以下，最优选为0.00002μg以上且0.006μg以下。将干细胞与生物相容性高分子嵌段的比率设定在上述范围，由此能够使干细胞更加均匀地存在。并且，将下限设定在上述范围，由此能够在使用于上述用途时发挥干细胞的效果，并将上限设定在上述范围，由此能够向干细胞供给任意存在的生物相容性高分子嵌段中的成分。在此，生物相容性高分子嵌段中的成分并无特别限制，可举出后述培养基中所含有的成分。

(4)细胞结构体的制造方法

细胞结构体能够通过混合生物相容性高分子嵌段和干细胞而制造。更具体而言，细胞结构体能够通过交替配置生物相容性高分子嵌段和干细胞而制造。制造方法并无特别限定，优选为在形成生物相容性高分子嵌段之后，接种干细胞的方法。

具体而言，能够通过孵化生物相容性高分子嵌段与含干细胞培养液的混合物而能够制造细胞结构体。例如，在容器中、保持于容器的液体中，将干细胞和预先制作的生物相容性高分子嵌段配置成镶嵌状。作为配置方法，优选通过使用自然凝聚、自然下落、离心、搅拌来促进或控制包括干细胞和生物相容性高分子嵌段的镶嵌状配置的形成。

作为所使用的容器，优选包括细胞低粘附性材料或细胞非粘附性材料的容器，更优选为包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯的容器。容器底面的形状优选为平底型、U字型、V字型。

具有通过上述方法得到的镶嵌状配置的细胞结构体例如能够通过如下方法而制造所希望的大小的细胞结构体：

(a)使分别制作的镶嵌状细胞块彼此融合或

(b)在分化培养基或增殖培养基下体积增大等。

融合方法、体积增大的方法并无特别限定。

例如，在对生物相容性高分子嵌段与含干细胞培养液的混合物进行孵化的工序中，通过将培养基更换为分化培养基或增殖培养基而能够使细胞结构体的体积增大。优选在对生物相容性高分子嵌段与含干细胞培养液的混合物进行孵化的工序中，通过进一步添加生物相容性高分子嵌段而能够制造所希望大小的细胞结构体，该细胞结构体中干细胞均匀存在。

使分别制作的镶嵌状细胞块彼此融合的方法具体而言是指包括使细胞结构体融合多个的工序的细胞结构体的制造方法，该细胞结构体包括多个生物相容性高分子嵌段和多个干细胞，且在由多个干细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一个或多个生物相容性高分子嵌段。

优选融合或体积增大前的各细胞结构体的厚度或直径为10μm以上且1cm以下，且融合或增大后的厚度或直径为100μm以上且3cm以下。在此，作为融合前的各细胞结构体的厚度或直径，更优选10μm以上且2000μm以下，进一步优选为15μm以上且1500μm以下，最优选为20μm以上且1300μm以下，并且，作为融合后的厚度或直径的范围，更优选100μm以上且2cm以下，进一步优选100μm以上且1cm以下，更进一步优选200μm以上且1cm以下，尤其优选400μm以上且1cm以下。

欲融合的细胞结构体彼此优选以0μm以上且50μm以下的距离配置，更优选0μm以上且20μm以下的距离，进一步优选0μm以上且5μm以下的距离。使细胞结构体彼此融合时，可考虑通过细胞的增殖/扩散而细胞或生成细胞的基质发挥粘合剂的作用，且可进行接合，并通过设为上述范围，细胞结构体彼此可轻松地粘合。

通过进一步添加生物相容性高分子嵌段，还能够制作所希望的大小的细胞结构体。具体而言，能够对包括多个第一生物相容性高分子嵌段和多个干细胞，且在由多个干细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一个或多个生物相容性高分子嵌段进一步添加第二生物相容性高分子嵌段而进行孵化。

对细胞结构体进一步添加第二生物相容性高分子嵌段而进行孵化时的添加第二生物相容性高分子嵌段的进度优选对应于所使用的干细胞的增殖速度而适当选择。

具体而言，若添加第二生物相容性高分子嵌段的进度较快，则干细胞移动至细胞结构体的外侧，且干细胞的均匀性降低，若添加的进度较慢，则能够形成干细胞的比例变多的部位，且干细胞的均匀性降低，因此考虑所使用的干细胞的增殖速度来选择。

(5)软骨再生材料的使用方法

本发明中，将上述细胞结构体用作软骨再生材料。本发明的软骨再生材料能够以对软骨缺损的疾患部位移植细胞的目的而使用。作为伴随软骨缺损的疾患，能够列举变形性关节炎、骨软骨缺损、剥脱性骨软骨炎、外伤性软骨损伤、骨关节炎、复发性多发软骨炎、软骨发育不全症、椎间盘损伤或椎间盘突出等，但并无特别限定。

作为移植方法，可列举使用了切割、注射、关节镜、内窥镜等的方法。本发明的细胞结构体与细胞片等细胞移植物不同，并能够缩小结构体的尺寸，因此能够使用所谓基于注射的移植的微创移植方法。

移植本发明的软骨再生材料时的量能够根据疾患的状态等而适当选择，作为移植的细胞数优选1.0×10⁵个细胞/cm³～1.0×10¹⁰个细胞/cm³，更优选1.0×10⁶个细胞/cm³～1.0×10⁹个细胞/cm³。

作为本发明的软骨再生材料的移植次数，可以仅移植一次，也能够根据需要进行两次以上的移植。

(6)生物相容性高分子薄膜

上述本发明的软骨再生材料可以单独用作软骨再生材料，也能够与生物相容性高分子薄膜组合而用作软骨再生材料。上述本发明的软骨再生材料与生物相容性高分子薄膜分别可以以不同的套件的形态提供，也可以以将上述本发明的软骨再生材料和生物相容性高分子薄膜贴合在一起的形态来提供。当分别以不同的套件的形态提供软骨再生材料和生物相容性高分子薄膜时，使用者能够在将软骨再生材料和生物相容性高分子薄膜贴合在一起之后进行移植。或者，使用者可以在将生物相容性高分子薄膜移植之后移植软骨再生材料。

当使用生物相容性高分子薄膜时，优选将生物相容性高分子薄膜用作用于将细胞结构体的移植面的一部分或全部与移植部位隔离的薄膜。例如，优选首先将生物相容性高分子薄膜移植到移植部位，然后将细胞结构体移植到生物相容性高分子薄膜的上表面(与和移植部位相接的面相反一侧的面)。或者，当将本发明的包含细胞结构体的软骨再生材料和生物相容性高分子薄膜贴合在一起之后进行移植时，优选以生物相容性高分子薄膜与移植部位直接接触的方式进行移植。

关于构成生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子的具体例及优选的范围，与构成生物相容性高分子嵌段的生物相容性高分子的情况相同，具体而言，与本说明书中的上述(1-1)生物相容性高分子、(1-2)交联及(1-3)重组明胶中所记载的内容相同。另外，构成生物相容性高分子薄膜的生物相容性高分子可以与构成生物相容性高分子嵌段的生物相容性高分子相同，也可以不同。

生物相容性高分子薄膜的制造方法并无特别限定，能够通过常规方法来实施。例如，将生物相容性高分子的水溶液浇注到塑料托盘，并通过在低温下(例如，冰箱中等)进行干燥而能够制造生物相容性高分子薄膜。

生物相容性高分子薄膜能够进行交联。当进行交联时，交联度并无特别限定，通常为4～15，更优选为6～13。交联度为每一分子的交联数。交联度的测定能够利用实施例的[7]交联度测定方法中所记载的TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法来实施。

生物相容性高分子薄膜的降解速度根据交联度而变动。生物相容性高分子薄膜的降解速度能够通过后述实施例的[8]降解速度的测定方法中所记载的方法来进行测定及评价。通过上述方法测定的生物相容性高分子薄膜的降解速度并无特别限定，通常为0.1～10[质量％/小时]，更优选为0.5～6.9[质量％/小时]。

(7)用途及软骨再生方法

根据本发明，可提供一种用于软骨再生的治疗中的细胞结构体，上述细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个上述干细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段。不仅能够组合细胞结构体，还能够组合上述生物相容性高分子薄膜。生物相容性高分子嵌段、干细胞、细胞结构体及生物相容性高分子薄膜的优选范围与本说明书中的上述内容相同。

根据本发明，可提供一种包括将上述细胞结构体移植到需要软骨再生的患者的工序的软骨再生方法。本发明的软骨再生方法中，将上述细胞结构体用作软骨再生材料。移植细胞结构体时，可以移植上述生物相容性高分子薄膜。生物相容性高分子嵌段、干细胞、细胞结构体及生物相容性高分子薄膜的优选范围与本说明书中的上述内容相同。

进而，根据本发明，可提供一种用于制造软骨再生材料的上述细胞结构体的使用。不仅能够组合细胞结构体，还能够组合上述生物相容性高分子薄膜。生物相容性高分子嵌段、干细胞、细胞结构体及生物相容性高分子薄膜的优选范围与本说明书中的上述内容相同。

通过以下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明并不限定于以下实施例。

实施例

[1]重组肽(重组明胶)

作为重组肽(重组明胶)准备了以下CBE3(记载于国际公开WO2008/103041号公报中)。

CBE3：

分子量：51.6kD

结构：GAP[(GXY)₆₃]₃G

氨基酸数：571个

RGD序列：12个

亚氨基酸含量：33％

大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不含有丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。

等电点：9.34

GRAVY值：-0.682

1/IOB值：0.323

氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。但是将末尾的X修改成“P”)

GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G

并且，本说明书中的多孔体与海绵的定义相同。

[2]重组肽多孔体的制作

[PTFE厚度/圆筒形容器]

准备了底面厚度3mm、直径51mm、侧面厚度8mm、高度25mm的聚四氟乙烯(PTFE)制圆筒杯状容器。将圆筒杯的曲面作为侧面时，侧面被8mm的PTFE密封，底面(平板的圆形)也被3mmPTFE密封。另一方面，上表面呈开放形状。由此，圆筒杯的内径为43mm。以下，将该容器称作PTFE厚度/圆筒形容器。

[铝玻璃板/円筒形容器]

准备了厚度1mm、直径47mm的铝制圆筒杯状容器。将圆筒杯的曲面作为侧面时，侧面被1mm的铝密封，且底面(平板圆形)也被1mm的铝密封。另一方面，上表面呈开放形状。并且，仅对侧面的内部均匀铺满壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果圆筒杯的内径为45mm。并且，将该圆筒杯状容器设为在该容器的底面除了铝以外还接合有2.2mm的玻璃板的状态。以下，将该容器称作铝玻璃/圆筒形容器。

[温度差较小的冷冻工序及干燥工序]

对PTFE厚度/圆筒形容器及铝玻璃板/圆筒形容器分别浇注CBE3水溶液，并在真空冷冻干燥机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却棚板从底面冷却了CBE3水溶液。

此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及棚板温度的设定如以下所记载。

条件A：

PTFE厚度/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行了1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降(1.9×10⁵Pa)为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

条件B：

铝玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行了1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降(1.9×10⁵Pa)为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

条件C：

PTFE厚度/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量10mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行了1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降(1.9×10⁵Pa)为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

[3]各冷冻工序中的温度差测定

关于条件A～条件C的每一个，作为在溶液内距离冷却侧最远的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的液面的液温，并且，作为在溶液内距离冷却侧最近的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。

其结果，各自的温度和其温度差的特性曲线如图1～图3。

根据该图1、图2、图3得知在条件A、条件B、条件C下为如下状态，即在棚板温度-10℃设定区间(降低到-20℃度之前)液温低于作为熔点的0℃，且在该状态下未发生冷冻(未冷冻/过冷却)。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2.5℃以下。然后，将棚板温度进一步降低至-20℃，由此确认到液温急速上升至0℃附近的时刻，在此得知产生凝固热且开始冷冻。并且，还确认到在该时刻实际开始形成冰。然后，温度在0℃附近经过了一定时间。在此，呈存在水和冰的混合物的状态。最后，温度再次从0℃开始降低，但此时无液体部分而成为冰。因此，所测定的温度为冰内部的固体温度，即并非液温。

以下，关于条件A、条件B、条件C，记载非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差、将棚板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差、产生凝固热紧前的温度差。另外，本说明书中所述的“紧前的温度差”表示在本次活动的1秒钟前至20秒钟前的期间能够检测的温度差内最大的温度差。

条件A

非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.1℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.2℃

产生凝固热紧前的温度差：1.1℃

条件B

非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.0℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.1℃

产生凝固热紧前的温度差：0.9℃

条件C

非冷却面的液温成为熔点(0℃)时的温度差：1.8℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：1.1℃

产生凝固热紧前的温度差：2.1℃

以下，将这些称作“温度差较小的冷冻工序/多孔体”。

[4]含1质量％乙醇的溶液中的温度差较小的冷冻工序及干燥工序

对PTFE厚度/圆筒形容器及铝玻璃板/圆筒形容器分别浇注含1质量％(w/w)乙醇的CBE3水溶液，在真空冷冻干燥机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却棚板从底面冷却了CBE3水溶液。通过设为含最终浓度为1质量％的乙醇的水溶液，熔点成为-0.4℃。乙醇/水浓度中的熔点变化根据文献“Picke ring S.U.：A Study of the Properties ofsome Strong Solutions.J.Chem.Soc.London 63(1893)998-1027”计算出。

条件AA：

PTFE厚度/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、乙醇最终浓度1质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降为止，进一步在20℃下实施了48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

条件BB：

铝玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、乙醇最终浓度1质量％、水溶液量4mL。关于棚板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时的冷冻，之后在-20℃下进行了2小时的冷冻，进而在-40℃下进行了3小时的冷冻，最后在-50℃下进行了1小时的冷冻。关于本冷冻品，在之后将棚板温度返回到-20℃设定而在-20℃下进行24小时的真空干燥，并在24小时后直接在持续进行真空干燥的状态下将棚板温度上升至20℃，且直至真空度充分下降为止，进一步在20℃下实施48了小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。

[含1质量％乙醇溶液的冷冻工序中的温度差测定]

关于条件AA及条件BB，作为在溶液内距离冷却侧最远的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的液面的液温，并且，作为在溶液内距离冷却侧最近的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。另外，在此1质量％乙醇成为溶剂，因此溶剂熔点成为-0.4℃。乙醇/水浓度比中的熔点变化根据文献“Pickering S.U.：A Study of theProperties of some Strong Solutions.J.Chem.Soc.London 63(1893)998-1027”计算出。

其结果，各自的温度和该温度差的特性曲线如图4及图5。从图4及图5得知在条件AA及条件BB下为如下状态，即在棚板温度-10℃的设定区间液温低于作为熔点的-0.4℃，且在该状态下未发生冷冻(未冷冻/过冷却)。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2℃以下。然后，将棚板温度进一步降低至-20℃，由此确认到液温急速上升至-0.4℃附近的时刻，在此得知产生凝固热且开始冷冻。并且，还确认到在该时刻实际开始形成冰。然后，温度在-0.4℃附近经过了一定时间。在此，呈存在水和冰的混合物的状态。最后，温度再次从0℃开始降低，但此时无液体部分而成为冰。因此，所测定的温度为冰内部的固体温度，即并非液温。

以下，关于条件AA、条件BB，记载非冷却面的液温为熔点(-0.4℃)时的温度差、将棚板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差、产生凝固热紧前的温度差。

条件AA

非冷却面的液温成为熔点(-0.4℃)时的温度差：0.8℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.3℃

产生凝固热紧前的温度差：0.8℃

条件BB

非冷却面的液温成为熔点(-0.4℃)时的温度差：1.3℃

从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.0℃

产生凝固热紧前的温度差：1.3℃

从这些结果得知即使在条件AA及条件BB下也与条件A及条件B相同，能够作为“温度差较小的冷冻工序/多孔体”而制作。

[5]由温度差较小的冷冻工序/多孔体制作花瓣状嵌段(多孔体的粉碎与交联)

将在上述[2](温度差测定为[3])得到的条件A及条件B的CBE3多孔体通过NewPower Mill(OSAKA CHEMICAL Co.,Ltd.、New Power Mill PM-2005)进行了粉碎。粉碎以最大转速进行了1分钟×5次、即合计进行了5分钟。关于所得到的粉碎物，利用不锈钢制筛区分尺寸，从而得到了25～53μm、53～106μm、106μm～180μm的未交联嵌段。然后，在减压下并在160℃下实施热交联(交联时间实施了8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时这6种)，从而得到了式样CBE3嵌段。以下，将实施了48小时交联的源自条件A的多孔体的嵌段称作E，将实施了48小时交联的源自条件B的多孔体的嵌段称作F。即，E及F为由温度差较小的冷冻工序/多孔体制作的温度差较小的嵌段。另外，关于交联时间的不同，在本申请发明的评价中未发现对能力产生影响，因此在此以进行了48小时交联的嵌段作为代表而使用。并且，结果在E及F中未发现能力之差，因此将这些汇总而作为花瓣状嵌段来在以下使用。

[6]重组肽薄膜的制作方法

制备4质量％浓度的CBE3水溶液，将该CBE3水溶液5.4ml浇注到设置有硅框架(8cm×3.5cm)的塑料托盘。将该塑料托盘移到冷藏库内，且进行干燥直至无水分而得到了重组肽薄膜。从塑料托盘/硅制框取出上述重组肽薄膜，并在减压下并在160℃下实施热交联(交联小时为48小时、72小时)，从而得到了动物实验。

[7]交联度的测定方法

计算出上述[6]中所制作的薄膜的交联度(每一分子的交联数)。测定时利用了TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法。

＜样品制备＞

向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％NaHCO₃水溶液(1mL)及1质量％TNBS水溶液(2mL)，并在37℃下将混合物振荡3小时。然后，添加37质量％盐酸(10mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上而制成样品。

＜空白调整＞

向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％NaHCO₃水溶液(1mL)及1质量％TNBS水溶液(2mL)，紧接着添加37质量％盐酸(3mL)，并在37℃下将混合物振荡了3小时。然后，添加37质量％盐酸(7mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上而制成空白。

测定用纯水稀释10倍的样品及空白的吸光度(345nm)，并根据以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。

(式2)(As-Ab)/14600×V/w

(式2)表示每1g重组肽的赖氨酸量(摩尔当量)。

式2中，As表示样品吸光度，Ab表示空白吸光度，V表示反应液量(g)，w表示重组肽质量(mg)。

(式3)1-(样品(式1)/未交联重组肽(式1))×34

(式3)表示每一分子的交联数。

其结果，上述[6]的进行了48小时交联的薄膜的交联度为6，且上述[6]的进行了72小时交联的薄膜的交联度为13。

[8]降解速度的测定方法

对上述[6]中制作的薄膜的降解速度进行评价。

对预先测定了质量的塑料制软管添加在上述[6]中制作的5mg的式样，并记录了实际添加量。

将2.5mg的源自放线菌的胶原酶溶解于50ml的磷酸缓冲生理盐水(PBS)而得到了胶原酶溶液。将1ml的该胶原酶溶液添加到已添加式样的软管中，并通过涡流混合后，在37℃下振荡了5小时。然后，将软管以10000G离心1分钟，并利用吸液管去除了上清液。而且，将1ml的超纯水添加到软管，并通过涡流混合后，将软管以10000G离心1分钟，并利用吸液管去除了上清液。将该操作再次反复进行一次。然后，将试样冷冻干燥，并记录了添加有试样的软管的质量。

根据以下的式(式4)计算出薄膜的降解速度。

(式4)降解速度＝((W-We)-wo)/wo/T

式4中，W表示在冷冻干燥后记录的添加有试样的软管的质量，We表示预先记录的软管的空质量。wo表示试样的实际添加量。T表示在胶原酶溶液中的振荡时间，且本次试验中为5小时。

其结果，上述[6]的薄膜中，在48小时的交联中降解速度为6.9[质量％/小时]，在72小时的交联中降解速度为0.5[质量％/小时]。

[9]兔子间充质干细胞(MSC)的提取

从5只日本白色家兔(3周龄的雄性)的10根大腿骨头和10根胫骨头提取了骨髓液。首先，利用聚乙烯吡咯酮碘(isodine)稀释液进行消毒，并利用Dulbecco磷酸缓冲生理盐水(DPBS)进行了清洗，将骨头移至10cm盘中，并用切骨头用剪刀切断了骨头的两端。提取5mL的利用安装有18G的注射针的10mL注射筒分注的培养基，并利用DAY SPIN把持大腿骨头，在50mL软管上向骨髓侧扎刺了注射针。

然后，将培养基浇注到骨髓内，并将骨髓提取到50mL软管内。将所提取到的骨髓液均匀地吹打，并使其通过细胞滤网。然后，以1,000rpm离心5分钟之后，去除上清液，悬浮在培养基之后向烧瓶接种。接种后次日更换培养基，接种后第5天回收所粘和的细胞，从而结束兔子MSC细胞的提取。之后，为了增殖而适当实施继代而使用细胞。另外，上述中所使用的培养基全部都使用了Dulbecco改进的Eagle培养基/高葡萄糖(DMEM high glucose)、10体积％胎牛血清(FBS)及青霉素/链霉素(50,000U)的培养基。

[10]使用了花瓣状嵌段的镶嵌细胞块的制作(兔子MSC)

将在上述[9]中提取的源自兔子骨髓的间充质干细胞(兔子MSC)通过培养基调整成1×10⁵个细胞/mL或4×10⁵个细胞/mL，并将在上述[5]中制作的花瓣状嵌段53-106μm以成为0.1mg/mL的方式添加之后，将所得到的细胞悬浮液中的200μL接种到SUMILON CELLTIGHTX96U板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.，底部为U字形)，并利用桌面板离心机进行离心(600g，5分钟)，静置了24小时，从而制作出直径1mm或直径1.3mm左右的包括球状的花瓣状嵌段和兔子MSC细胞的镶嵌细胞块(每一个细胞为0.001μg的嵌段)。另外，由于在U字形板中制作，因此本镶嵌细胞块为球状。将以1×10⁵个细胞/mL制作的镶嵌细胞块称作小镶嵌细胞块，且将以4×10⁵个细胞/mL制作的镶嵌细胞块称作大镶嵌细胞块。

[11]细胞块的制作(兔子MSC)

将在上述[9]中提取的源自兔子骨髓的间充质干细胞(兔子MSC)通过培养基调整为1×10⁵个细胞/mL或4×10⁵个细胞/mL。将所得到的细胞悬浮液中的200μL接种到SUMILONCELLTIGHT X96U板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.，底部为U字形)，并利用桌面板离心机进行离心(600g，5分)，静置了24小时。由此制作了直径约400μm或直径约1mm的球状细胞块。将以1×10⁵个细胞/mL制作的细胞块称作小细胞块，且以4×10⁵个细胞/mL制作的细胞块称作大细胞块。

[12]细胞培养海绵的制作(兔子MSC)

准备了从在上述[4]的条件AA下制作的CBE3海绵切取直径5mm、厚度1mm的尺寸，并接种有在上述[9]中提取的源自兔子的间充质干细胞(兔子MSC)的细胞培养海绵。

[13]兔子骨软骨缺损模型的制作

在22周龄的日本白色家兔(KITAYAMA LABES Co.,Ltd.，SPF)的雄性兔子的膝关节部位制作了直径5mm、深度1mm左右的骨软骨缺损。

[14]对兔子骨软骨缺损的样品移植

在通过上述[13]制作的兔子骨软骨缺损部位，首先设置了将在上述[6]中准备的薄膜(交联度为6)切取成缺损的底面积大小(直径5mm)的薄膜。在其上移植了以下。

比较例2：上述[12]中的去除了接种细胞的工序的无细胞的海绵

比较例3：在上述[12]中制作的细胞培养海绵

比较例4：在上述[11]中制作的细胞块小144个

实施例1：在上述[10]中制作的镶嵌细胞块小144个

并且，作为比较例之一，还准备了无需设置在上述[6]中准备的薄膜而仅移植了无细胞的海绵的组(比较例1)。

[15]兔子骨软骨缺损模型中的骨头/软骨再生效果

将在上述[14]中移植的兔子在8周后进行剖检，制作了移植部位周边的骨软骨组织切片。组织在进行了甲醛固定之后，用石蜡包埋，从而制作了包括镶嵌细胞块的皮肤的组织切片。关于切片的染色，进行了HE染色(苏木精/伊红染色)或藏红O染色。

将染色的结果示于图6～图10。并且，以以下基准对软骨再生、骨再生、纤维性软组织的抑制及骨头/软骨界面的形成进行了评价。将评价结果示于表1。

软骨再生

AA：在整体上观察到良好的软骨再生。

A：在整体上观察到软骨再生。

B：在一部分观察到少许软骨再生。

C：未观察到软骨再生。

骨再生

A：观察到骨再生。

B：在一部分观察到少许骨再生。

C：未观察到骨再生。

纤维性软组织的浸润抑制

A：观察到纤维性软组织的浸润抑制。

B：观察到一些纤维性软组织的浸润抑制。

C：未观察到纤维性软组织的浸润抑制。

D：无法抑制炎症浸润，且纤维性软组织的浸润抑制不良。

骨头/软骨界面的形成

A：再生骨和再生软骨的界限(潮线)形成在正确的位置。

B：形成一些再生骨和再生软骨的界限(潮线)。

C：未形成再生骨和再生软骨的界限(潮线)。

[表1]

仅移植了海绵(无薄膜)时(图6)及移植海绵(无细胞)和薄膜时(图7)，未观察到软骨再生，且还未观察到骨再生。

当细胞培养海绵和薄膜时(图8)，在一部分观察到少许软骨再生及骨再生，但大部分组织都成为组织性软组织，从而软骨再生及骨再生没有成功。

当移植了细胞块和薄膜时(图9)，在一部分观察到少许软骨再生，并且观察到骨再生，但在应成为软骨的位置大部分成为纤维性软组织，从而软骨再生及骨再生没有成功。

当移植了镶嵌细胞块和薄膜时(图10)，在整体上观察到良好的软骨再生，并且，再生骨头和再生软骨的界限(潮线)形成在正确的位置。关于骨再生也在正确的位置观察到骨再生，且几乎未形成纤维性软组织，从而能够实现良好的软骨再生及骨再生。

序列表

<110> 富士胶片公司

<120> 软骨再生材料

<130> 15F02882

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 571

<212> PRT

<213> 重组体()

<400> 1

Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly

1 5 10 15

Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu

20 25 30

Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

50 55 60

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro

85 90 95

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

100 105 110

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

115 120 125

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro

130 135 140

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

145 150 155 160

Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala

165 170 175

Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro

180 185 190

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly

195 200 205

Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp

210 215 220

Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

225 230 235 240

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

245 250 255

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

260 265 270

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg

275 280 285

Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly

290 295 300

Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu

305 310 315 320

Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro

325 330 335

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

340 345 350

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

355 360 365

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro

370 375 380

Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly

385 390 395 400

Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro

405 410 415

Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro

420 425 430

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

435 440 445

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

450 455 460

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

465 470 475 480

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

485 490 495

Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro

500 505 510

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

515 520 525

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

530 535 540

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

545 550 555 560

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly

565 570

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 2

Arg Glu Asp Val

1

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 3

Tyr Ile Gly Ser Arg

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 4

Pro Asp Ser Gly Arg

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 5

Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 6

Leu Gly Thr Ile Pro Gly

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 7

Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile

1 5 10

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 8

Ile Lys Val Ala Val

1 5

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 9

Asp Gly Glu Ala

1

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列()

<220>

<223> Description of 人工序列: 接头序列

<400> 10

Glu Arg Gly Asp

1

Claims

1.一种软骨再生材料，其包括细胞结构体，该细胞结构体包括生物相容性高分子嵌段和干细胞，且在多个所述干细胞之间的间隙配置有多个所述生物相容性高分子嵌段。

2.根据权利要求1所述的软骨再生材料，其用于使软骨及骨头再生。

3.根据权利要求1或2所述的软骨再生材料，其中，

所述干细胞为间充质干细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述细胞结构体相对于每一所述干细胞包括0.0000001μg以上且1μg以下的所述生物相容性高分子嵌段。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的软骨再生材料，其中。

一个所述生物相容性高分子嵌段的大小为10μm以上且300μm以下。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述细胞结构体的厚度或直径为100μm以上且1cm以下。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子嵌段包含重组肽或化学合成肽。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子嵌段包括重组明胶或化学合成明胶。

9.根据权利要求8所述的软骨再生材料，其中，

所述重组明胶或化学合成明胶由下述式1表示，

式1：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

10.根据权利要求8或9所述的软骨再生材料，其中，

所述重组明胶或化学合成明胶为如下肽中的任一个：

包括序列号1中所记载的氨基酸序列的肽；

包括与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且具有生物相容性的肽。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的软骨再生材料，其中，

在所述生物相容性高分子嵌段中，生物相容性高分子通过热、紫外线或酶而交联。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子嵌段处于通过将生物相容性高分子的多孔体粉碎而得到的颗粒形态。

13.一种软骨再生材料，其包括权利要求1至12中任一项所述的软骨再生材料和生物相容性高分子薄膜。

14.根据权利要求13所述的软骨再生材料，其中，

所述生物相容性高分子薄膜为用于将所述细胞结构体的移植面的一部分或全部与移植部位隔离的薄膜。