JPWO2019004446A1 - ライソゾーム病処置剤 - Google Patents
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Abstract
Description
<1> 複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも1種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも1個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含む、ライソゾーム病処置剤。
<2> 上記細胞が、少なくとも間葉系幹細胞または線維芽細胞を含む、<1>に記載の処置剤。
<3> 上記細胞構造体が、細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む、<1>または<2>に記載の処置剤。
<4> 上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが10μm以上300μm以下である、<1>から<3>の何れか一に記載の処置剤。
<5> 上記細胞構造体の厚さ又は直径が100μm以上3cm以下である、<1>から<4>の何れか一に記載の処置剤。
<6> 上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、<1>から<5>の何れか一に記載の処置剤。
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
<8> 上記リコンビナントペプチドが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;または
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、<6>または<7>に記載の処置剤。
<10> 上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、<1>から<9>の何れか一に記載の処置剤。
<11> ライソゾーム病がファブリ病である、<1>から<10>の何れか一に記載の処置剤。
<12> 生体内においてα−ガラクトシダーゼAを分泌することにより、生体内におけるグロボトリアオシルスフィンゴシンを低減させる、<11>に記載の処置剤。
(A) 複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも1種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも1個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を、ライソゾーム病の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む、ライソゾーム病の処置方法。
(B) ライソゾーム病の処置において使用するための、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも1種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも1個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体。
(C) ライソゾーム病処置剤の製造のための、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも1種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも1個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体の使用。
本発明において使用する細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊(モザイク状になっている細胞塊)と称する場合もある。また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
(1−1)生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびMPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で表される、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、およびHAV配列)ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列(XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に2配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、米国特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質1分子中に好ましくは3〜50個であり、さらに好ましくは4〜30個であり、特に好ましくは5〜20個であり、最も好ましくは12個である。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;または
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである
%配列同一性=[(同一残基数)/(アラインメント長)]×100
2つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、BLAST((Basic Local Alignment Search Tool))プログラム(J.Mol.Biol.215:403−410,1990)等を使用して決定することができる。
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック(塊)を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状(顆粒)の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
(式2)は、生体親和性高分子ブロック1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wは生体親和性高分子ブロック質量(mg)を示す。)
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
吸水率=(w2−w1−w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物(生体親和性高分子の多孔質体など)を、粉砕機(ニューパワーミルなど)を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物(多孔質体など)は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
(a)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(b)工程(a)で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
(c)工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。
本発明で使用する細胞は、その種類は特に限定されるものではなく、本発明の目的であるライソゾーム病を処置する機能を有する細胞を好適に用いることができ、実際の治療目的に応じて、任意の細胞を使用することができる。また、使用する細胞は1種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞(特に、ヒト由来細胞)の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞の何れでもよく、特に好ましくは体性幹細胞である。
本発明の細胞構造体は、上記した本発明にかかる複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも1種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも1個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に3次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に3次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞3次元構造体が形成され、前述したように、物質透過能を有することとなる。
本発明で用いる細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック(生体親和性高分子からなる塊)と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。なお、交互とは、完全な交互を意味するものではなく、例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞とが混合された状態を意味する。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックからなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
ライソゾーム病とは、遺伝子異常によりライソゾームにある酵素の活性がひとつあるいは複数欠損するために、細胞内小器官であるライソゾーム内に分解されない物質が蓄積する、あるいはライソゾームにある膜蛋白の機能障害のために、ライソゾームに物質が蓄積して発症する病気の総称である。
ライソゾーム病としては、ファブリ病、ゴーシェ病、シアリドーシス、ニーマンピック病A,B型、ガラクトシアリドーシス、ニーマンピック病C型、I−cell病、ムコリピドーシスIII型、GM1ガングリオシドーシス、βガラクトシダーゼ欠損症、α−マンノシドーシス、GM2ガングリオシドーシス、β−マンノシドーシス、クラッベ、フコシドーシス、異染性脳白質ジストロフィー、アスパルチルグルコサミン尿症、Multiple sulfatase欠損症、シンドラー/神崎病、ファーバー病、ポンペ病、ハーラー/シャイエ症候群、ウォルマン病、ハンター症候群、ダノン病、サンフィリッポ症候群、遊離シアル酸蓄積症、モルキオ症候群、セロイドリポフスチノーシス、マルトラミー症候群、スライ病、βグルコロニダーゼ活性低下症、サンドホフ病およびコレステロールエステル蓄積症が挙げられる。上記の中でも、ファブリ病が好ましい。
予防とは、対象となる疾患に特有な症状の進行を予め抑制することを意味し、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などが含まれる。進行の抑制の程度は何ら限定されず、程度がごくわずかであっても進行が抑制され得る限り、予防に含まれる。
治療とは、対象となる疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
処置剤とは、処置の目的で供せられる物質を意味する。
本発明のライソゾーム病処置剤の移植回数は、1回だけ移植してもよいし、必要に応じ2回以上の移植を行うこともできる。
本発明によれば、本発明で規定する細胞構造体を、ライソゾーム病の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む、ライソゾーム病の処置方法が提供される。上記のライソゾーム病の処置方法において、細胞構造体の好ましい範囲は、前述と同様である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ3mm、直径51mm、側面厚さ8mm、高さ25mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は8mmのPTFEで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も3mmのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は43mmになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に2.2mmの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
PTFE厚・円筒形容器またはアルミ硝子板・円筒形容器にCBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
アルミ・硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。 棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量10mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件A〜条件Cのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図1〜図3の通りとなった。
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.1℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.2℃
凝固熱発生直前の温度差:1.1℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.0℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.1℃
凝固熱発生直前の温度差:0.9℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:1.1℃
凝固熱発生直前の温度差:2.1℃
参考例2で得られた条件Aおよび条件BのCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm、53〜106μm、106〜180μmの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は8時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間の6種類を実施した)を施して、生体親和性高分子ブロック(CBE3ブロック)を得た。
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ(直径6mm、長さ21.8mmの円筒状:容量0.616cm3)が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を200回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
その結果、参考例3の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は98mg/cm3であった。
参考例3で架橋したブロックの架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。測定はTNBS(2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸)法を用いた。
<サンプル調製>
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)および1質量%のTNBS水溶液(2mL)を添加し、混合物を37℃で3時間振とうさせた。その後、37質量%塩酸(10mL)および純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、サンプルとした。
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)および1質量%TNBS水溶液(2mL)を添加し、直後に37質量%塩酸(3mL)を加え、混合物を37℃で3時間振とうした。その後、37質量%塩酸(7mL)および純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、ブランクとした。
純水で10倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度(345nm)を測定し、以下の(式2)、及び(式3)から架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。
(式2)は、リコンビナントペプチド1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wはリコンビナントペプチド質量(mg)を示す。)
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
参考例3で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
25℃において、3cm×3cmのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約15mgを充填し、2時間イオン交換水中で膨潤させた後、10分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、(式4)に従って、吸水率を求めた。
吸水率=(w2−w1−w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBMSC)、ヒト脂肪由来幹細胞(hADSC)、ヒト歯髄由来幹細胞(hDPSC)について、細胞のmRNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で検出することにより、ライソゾーム病関連酵素の発現有無を評価した。その結果、図4〜図7に示す通り、hBMSC、hADSCおよびhDPSCは、下記表に示す50種類の関連酵素の遺伝子を発現していることが分かった。図4〜図7において、hBMSC、hADSCおよびhDPSCはそれぞれBMSC、ADSCおよびDPSCと表記し、P5とは、継代5回目を示す。
細胞構造体の準備:
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)をDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:ダルベッコ改変イーグル培地)+10%FBS(Fetal Bovine Serum:ウシ胎児血清)培地にて10万cells/mLに調整し、参考例3で作製した生体親和性高分子ブロック(53−106μm)を0.1mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mmの球状の、生体親和性高分子ブロックとhMSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。
上記のようにして得られた細胞構造体について、48時間培養後の上清中に含まれる、ライソゾーム病原因酵素であるαGalAを酵素結合免疫吸着法(ELISA)(GLA/ALPHA Galactosidase ELISA Kit。LifeSpan Biosciences。LS−F−10765−1)で測定した。尚、比較として、細胞構造体を形成させないで同じ細胞数で平面培養した場合の上清についても測定した。その結果、図8に示すように、1細胞数当たりのαGalA(別名GLA)酵素分泌量は、平面培養時(細胞のみ)では1.5×10−6ng/cellであるのに対して細胞構造体中では3.6×10−5ng/cellであり、予想外にも細胞構造体からのαGalA酵素分泌量は飛躍的(24倍程度)に多くなることが分かった。
マウス脂肪由来幹細胞(mADSC)を10%FBS含有のD−MEM培地に懸濁し、そこに参考例3で作製した生体親和性高分子ブロック(53−106μm)を加えて、最終的にmADSC(1.2×108cells)と生体親和性高分子ブロック(0.25mg)が4mLの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の35mmディッシュであるEZSPHERE(登録商標)ディッシュType903(スフェロイドウェル口径800μm、スフェロイドウェル深さ300μm、スフェロイドウェル数〜約1,200ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。AGCテクノグラス製)に播種した。CO2インキュベーターで37℃で48時間静置することで、約1,200個の均一な細胞構造体を取得した。
ファブリ病マウスはB6;129−Glawblo/GrsrJ(日本チャールス・リバー)の6週令を用いた。上記マウスでは肝臓中に病因物質としてLysoGb3が蓄積していくことが知られており、これがファブリ病の原因である。有効性試験としては被験物質を投与して、4週間後の肝臓中のLysoGb3量が減っているかを測定することで評価した。なお、LysoGb3の定量はLC−MS/MS(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry)で行い総蛋白質量で規格化することで評価した。具体的には、以下の通りである。
試薬
内部標準物質としてN,N−Dimethyl−D−erythro−sphingosineを使用した。Lyso−Gb3およびN,N−Dimethyl−D−erythro−sphingosineは、Matreya社(Pleasant Gap,PA)から購入した。
マウス臓器は、健常マウス、mADSCの細胞構造体を投与したファブリ病マウス、ならびに、mADSCの細胞構造体を投与していないファブリ病マウスから採取し、液体窒素中で急速凍結した。凍結臓器はマルチビーズショッカー(安井器械株式会社)を使用して粉砕し、組織重量の10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加して臓器懸濁液とした。まず、N,N−Dimethyl−D−erythro−sphingosineを終濃度0.5ng/mLになるようにメタノールで希釈し、IS溶液(内部標準溶液)を作製した。次に、標準サンプルを作製した。具体的には、健常マウスの臓器懸濁液20μLに、内部標準物質のメタノール溶液を100μL添加し、更に、0、2、4、20、40及び200nmol/Lの終濃度になるようにLyso−Gb3溶液5μLを添加して標準サンプルを作製した。これを混合後に遠心し、タンパク質を除去した。一方、mADSCの細胞構造体を投与したファブリ病マウス、及び投与していないファブリ病マウスの臓器も同様に臓器懸濁液を作製し、この臓器懸濁液20μLに対して、内部標準物質のメタノール溶液を100μL添加し、メタノール5μLを添加して混合後に遠心し、タンパク質を除去した。遠心後、得られた混合液の上清80μLに0.1%ギ酸水溶液80μLを添加し混合した。この混合液を遠心後、上清を0.1%ギ酸水溶液/50%メタノールで4倍希釈し、得られたサンプルをUPLC(ultra performance liquid chromatography)−MS/MSシステムに注入した。
UPLCシステムとして、LCはACQUITY UPLC(Waters、Milford、 MA、USA)を使用した。サンプル注入量は5μL、カラムはACQUITY UPLC BEH Phenyl Column,130Å(オングストーム), 1.7μm,2.1mm×50mm(Waters)を使用した。溶媒Aは0.1%ギ酸水溶液、溶媒Bは0.1%ギ酸メタノール溶液を用い、4.5分間のグラジエントを使用した(0分、50%溶媒B;0.5分、70%溶媒B;1分、90%溶媒B;2.5分、100%溶媒B;3.5分、100%溶媒B;3.51分、50%溶媒B;4.5分、50%溶媒B)。流速は0.4μL/分とした。MSはTriple Quad5500(ABSCIEXFramingham、 MA、US)を使用した。Lyso−Gb3の定量はMRM(多重反応モニタリング)モードで実施した。ターゲットとした質量は、Lyso−Gb3に対してm/z786.336、Lyso−Gb3−ISに対してm/z328.190とした。定量のためにはスフィンゴシン由来のもっとも強度が強いピークを使用した。Lyso−Gb3に対してm/z282.400、Lyso−Gb3−ISに対してm/z110.000とした。
タンパク質定量として、検量線用BSAはキットに添付のAlbumin Standard Ampules、2mg/mLを用い、LC−MS/MSに注入したサンプルと同一組成の溶媒で、終濃度2000、1500、1000、750、500、250、125、25及び0μg/mLになるよう希釈して作製した。検出にはTECAN infinite F200を使用し、550nmの吸光度を測定した。
本明細書中において、ファブリマウスとは、ファブリ病マウスを意味する。
マウス胎児由来線維芽細胞(MEF)を10%FBS含有のD−MEM培地に懸濁し、10万cells/mLに調整し、参考例3で作製した生体親和性高分子ブロック53−106μmを0.1mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mmの球状の、生体親和性高分子ブロックとhADSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本細胞構造体は球状であった。
実施例3と同様にファブリ病マウスへの投与により肝臓中のLysoGb3が減少するかを評価した。実施例4で作製したMEFの細胞構造体を腎被膜下に20個、あるいは40個移植した。尚、20個移植では1匹あたり細胞数が4.0x105cellsで高分子ブロックが0.4mgを投与されたことになり、40個移植では1匹あたり細胞数が8.0x105cellsで高分子ブロックが0.8mgを投与されたことになる。試験の流れを図13に示した。
Claims (12)
- 複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも1種類の複数個の細胞とを含み、複数個の前記細胞の隙間に、少なくとも1個の前記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含む、ライソゾーム病処置剤。
- 前記細胞が、少なくとも間葉系幹細胞または線維芽細胞を含む、請求項1に記載の処置剤。
- 前記細胞構造体が、細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項1または2に記載の処置剤。
- 前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが10μm以上300μm以下である、請求項1から3の何れか一項に記載の処置剤。
- 前記細胞構造体の厚さ又は直径が100μm以上3cm以下である、請求項1から4の何れか一項に記載の処置剤。
- 前記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、請求項1から5の何れか一項に記載の処置剤。
- 前記リコンビナントペプチドが、下記式で示される、請求項6に記載の処置剤。
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。 - 前記リコンビナントペプチドが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;または
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、請求項6または7に記載の処置剤。 - 前記生体親和性高分子ブロックにおいて、前記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、請求項1から8の何れか一項に記載の処置剤。
- 前記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、請求項1から9の何れか一項に記載の処置剤。
- ライソゾーム病がファブリ病である、請求項1から10の何れか一項に記載の処置剤。
- 生体内においてα−ガラクトシダーゼAを分泌することにより、生体内におけるグロボトリアオシルスフィンゴシンを低減させる、請求項11に記載の処置剤。
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