JP6586160B2 - 軟骨再生材料 - Google Patents
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Description
(1)生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体を含む、軟骨再生材料。
(2)軟骨及び骨を再生するための、(1)に記載の軟骨再生材料。
(3)上記幹細胞が、間葉系幹細胞である、(1)又は(2)に記載の軟骨再生材料。
(4)上記細胞構造体が、上記幹細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の上記生体親和性高分子ブロックを含む、(1)から(3)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(5)上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが10μm以上300μm以下である、(1)から(4)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(6)上記細胞構造体の厚さ又は直径が100μm以上1cm以下である、(1)から(5)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(8)上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンからなる、(1)から(7)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(9)上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式1で示される、(8)に記載の軟骨再生材料。
式1:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式1中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
(10)上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、(8)又は(9)に記載の軟骨再生材料。
(12)上記生体親和性高分子ブロックが、多孔質体の生体親和性高分子を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、(1)から(11)の何れか一に記載の軟骨再生材料。
(13)(1)から(12)の何れか一に記載の軟骨再生材料と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料。
(14)上記生体親和性高分子フィルムが、上記細胞構造体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムである、(13)に記載の軟骨再生材料。
(16)生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体を、軟骨再生を必要とする患者に移植する工程を含む、軟骨再生方法。
(17)軟骨再生材料の製造のための、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体の使用。
本発明の軟骨再生材料は、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体を含む材料である。なお、本発明で用いる細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊(モザイク状になっている細胞塊)と称する場合もある。
本発明で用いる細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックを含む。生体親和性高分子ブロックについて以下に説明する。
(1−1)生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性高分子として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン及びMPC(2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)などが挙げられる。生分解性高分子としては、具体的には、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で表される、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、及びHAV配列)ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護基としてFmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基)を使用するFmoc基合成法、及び、アミノ基の保護基としてBoc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基)を使用するBoc基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中、後記する(1−3)リコンビナントゼラチンの内容を当てはめることができる。
リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、本発明の軟骨再生材料を培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られている。本発明で使用する架橋方法は、好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に2配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176号公報、US特許6992172号公報、国際公開WO2004/85473号公報、国際公開WO2008/103041号公報等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質1分子中3〜50個であることが好ましく、より好ましくは4〜30個、さらに好ましくは5〜20個である。最も好ましくは12個である。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
である。
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック(塊)を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状、多孔質状(多孔質体)、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状(顆粒)の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕機(ニューパワーミルなど)を用いて粉砕することにより、顆粒形態の一例である不定形の生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
(a)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下の温度で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(b)工程(a)で得られた生体親和性高分子の未凍結状態の溶液を凍結する工程、および
(c)工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子の溶液を凍結乾燥する工程
を含む製造方法を挙げることができる。
本発明で用いる幹細胞は、細胞移植を行うことができ、軟骨再生能を発揮できる限り、任意の幹細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する幹細胞は1種でもよいし、複数種の幹細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する幹細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞(特に、ヒト由来細胞)の種類は、万能細胞、又は体性幹細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、生殖系列幹細胞(GS細胞)、又は人工多能性幹細胞(iPS細胞)を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞(MSC)、羊膜細胞、臍帯血由来細胞、骨髄由来細胞、又は脂肪由来幹細胞を使用することができ、特に好ましくは間葉系幹細胞(MSC)である。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
本発明においては、上記生体親和性高分子ブロックと上記幹細胞とを用いて、複数個の幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に3次元的に配置させることによって細胞構造体を作製する。生体親和性高分子ブロックと幹細胞とがモザイク状に3次元に配置されることにより、細胞構造体中で幹細胞が均一に存在する細胞構造体が形成され、外部から細胞構造体の内部への、培地成分などの栄養の送達が可能となる。
細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、幹細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、幹細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、幹細胞を播種する方法である。
(a)別々に作製したモザイク状細胞塊同士を融合させる、又は
(b)分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
本発明において、上記した細胞構造体は、軟骨再生材料として使用する。本発明の軟骨再生材料は、軟骨欠損の疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。軟骨欠損を伴う疾患としては、変形性関節症、骨軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、外傷性軟骨損傷、骨関節炎、再発性多発軟骨炎、軟骨無形成症、椎間板損傷、又は椎間板ヘルニア等を挙げることができるが、特に限定されない。
移植方法としては、切開、注射、関節鏡、内視鏡等を使用した方法が挙げられる。本発明の細胞構造体は、細胞シート等の細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
本発明の軟骨再生材料の移植回数としては、1回だけ移植してもよいし、必要応じ2回以上の移植を行うこともできる。
上記した本発明の軟骨再生材料は、単独で軟骨再生材料として使用してもよいが、生体親和性高分子フィルムと組み合わせて、軟骨再生材料として使用することもできる。上記した本発明の軟骨再生材料と、生体親和性高分子フィルムとは、それぞれ別々にキットの形態で提供してもよいし、上記した本発明の軟骨再生材料と、生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた形態で提供してもよい。軟骨再生材料と生体親和性高分子フィルムとをそれぞれ別々にキットの形態で提供する場合、使用者は、軟骨再生材料と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた後に移植することができる。あるいは、使用者は、生体親和性高分子フィルムを移植した後に、軟骨再生材料を移植してもよい。
本発明によれば、軟骨再生の治療において使用するための細胞構造体であって、上記細胞構造体が、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含み、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体が提供される。細胞構造体に加えて、上記した生体親和性高分子フィルムを組み合わせることもできる。生体親和性高分子ブロック、幹細胞、細胞構造体及び生体親和性高分子フィルムの好ましい範囲は本明細書中上記と同様である。
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
また、本明細書における多孔質体とスポンジとは同義である。
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ3mm、直径51mm、側面厚さ8mm、高さ25mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製の円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は8mmのPTFEで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も3mmのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は43mmになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に2.2mmの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
PTFE厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれCBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。
この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
アルミ硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量10mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件A〜条件Cのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図1〜図3の通りとなった。
この図1、図2、図3から、条件A、条件B、条件Cでは棚板温度−10℃設定区間(−20℃度に下げる前)において液温が融点である0℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない(未凍結・過冷却)状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温との温度差が2.5℃以下となっていた。その後、棚板温度を−20℃へ更に下げていくことによって、液温が0℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は0℃付近で一定時間経過した。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後に0℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっていた。従って、測定している温度は氷内部の固体温度であり、つまり液温ではない。
非冷却面の液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.1℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.2℃
凝固熱発生直前の温度差:1.1℃
非冷却面の液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.0℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.1℃
凝固熱発生直前の温度差:0.9℃
非冷却面の液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:1.1℃
凝固熱発生直前の温度差:2.1℃
PTFE厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれ1質量%(w/w)エタノール含有CBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。最終濃度1質量%のエタノール含有水溶液とすることで、融点は−0.4℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、エタノール最終濃度1質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
アルミ硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、エタノール最終濃度1質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件AA及び条件BBについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。尚、ここでは1質量%エタノールが溶媒となる為、溶媒融点は−0.4℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
非冷却面の液温が融点(−0.4℃)になった時の温度差:0.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.3℃
凝固熱発生直前の温度差:0.8℃
非冷却面の液温が融点(−0.4℃)になった時の温度差:1.3℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.0℃
凝固熱発生直前の温度差:1.3℃
上記[2](温度差測定は[3])で得られた条件A及び条件BのCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm、53〜106μm、106μm〜180μmの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は8時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間の6種類を実施した)を施して、試料CBE3ブロックを得た。以下、48時間架橋を施した条件Aの多孔質体由来ブロックをE、48時間架橋を施した条件Bの多孔質体由来ブロックをFと呼称する。つまり、E及びFは、温度差の小さい凍結工程・多孔質体から作られた温度差小ブロックである。尚、架橋時間の違いは、本願発明の評価においては性能に影響が見られないため、ここでは48時間架橋したものを代表として使用している。また、結果的にE及びFでは性能に差が見られないことから、これらをまとめて花弁状ブロックとして、以後、使用した。
4質量%濃度のCBE3水溶液を調製し、このCBE3水溶液5.4mlを、シリコン枠(8cm x 3.5cm)を設置したプラスチックトレーに流し込んだ。このプラスチックトレーを冷蔵庫内に移し、水分が無くなるまで乾燥させることでリコンビナントペプチドのフィルムを得た。上記のリコンビナントペプチドのフィルムをプラスチックトレー/シリコン枠から取り出し、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は48時間、72時間)を施し、動物実験の試料を得た。
上記[6]で作製したフィルムの架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。測定にはTNBS(2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸)法を用いた。
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)及び1質量%TNBS水溶液(2mL)を添加し、混合物を37℃で3時間振とうした。その後、37質量%塩酸(10mL)及び純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、サンプルとした。
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)及び1質量%TNBS水溶液(2mL)を添加し、直後に37質量%塩酸(3mL)を加え、混合物を37℃で3時間振とうした。その後、37質量%塩酸(7mL)及び純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、ブランクとした。
純水で10倍希釈したサンプル、及び、ブランクの吸光度(345nm)を測定し、以下の(式2)及び(式3)から架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。
(式2)は、リコンビナントペプチド1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
式2中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wはリコンビナントペプチド質量(mg)を示す。
(式3) 1−(サンプル(式1)/未架橋リコンビナントペプチド(式1))×34
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
上記[6]で作製したフィルムの分解速度を評価した。
予め質量を測定したプラスチック製のチューブに、上記[6]で作製した試料5mgを添加し、実際の添加量を記録した。
放線菌由来のコラゲナーゼ2.5mgを50mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解させ、コラゲナーゼ溶液を得た。このコラゲナーゼ溶液1mlを、試料を添加したチューブに加え、ボルテックスにて混合後、37℃で5時間振とうさせた。その後、チューブを10000Gで1分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。さらに、超純水1mlをチューブに加え、ボルテックスにて混合後、チューブを10000Gで1分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。この操作をもう一度繰り返した。その後、試料を凍結乾燥し、試料の入ったチューブの質量を記録した。
(式4) 分解速度 = ((W−We)―wo)/wo/T
式4において、Wは、凍結乾燥後に記録した、試料の入ったチューブの質量を示し、Weは予め記録しておいた、チューブの空質量を示す。woは、試料の実際の添加量を示す。Tは、コラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示し、今回の試験では5時間である。
日本白色家兎(3週齢の雄)5羽の、大腿骨10本と脛骨10本から骨髄液を採取した。まず、イソジン希釈液で消毒し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄し、骨を10cmディッシュに移し、骨切バサミで骨の両端を切断した。18Gの注射針を装着した10mL注射筒で分注した培地を5mL採取し、ディスピンを用いて大腿骨を持ち、50mLチューブ上で骨髄内に注射針を刺した。
上記[9]で採取したウサギ骨髄由来間葉系幹細胞(ウサギMSC)を培地にて1×105cells/mLまたは4×105cells/mLに調整し、上記[5]で作製した花弁状ブロック53−106μmを0.1mg/mLとなるように加えた後、得られた細胞懸濁液のうち200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mm又は直径1.3mm程度の球状の、花弁状ブロックとウサギMSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。1×105cells/mLで作製したモザイク細胞塊はモザイク細胞塊小、4×105cells/mLで作製したモザイク細胞塊はモザイク細胞塊大と称する。
上記[9]で採取したウサギ骨髄由来間葉系幹細胞(ウサギMSC)を培地にて1×105cells/mLまたは4×105cells/mLに調整した。得られた細胞懸濁液のうち200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置した。これにより、直径約400μm又は直径約1mmの球状の細胞塊を作製した。1×105cells/mLで作製した細胞塊は細胞塊小、4×105cells/mLで作製した細胞塊は細胞塊大と称する。
上記[4]の条件AAで作製したCBE3スポンジから直径5mm、厚さ1mmサイズを切り出し、上記[9]で採取したウサギ骨髄由来間葉系幹細胞(ウサギMSC)を播種した細胞培養スポンジを用意した。
日本白色家兎(北山ラベス、SPF)22週齢オスの膝関節部位に直径5mm、深さ1mm程度の骨軟骨欠損を作製した。
上記[13]にて作製したウサギ骨軟骨欠損部位に、まず、上記[6]で用意したフィルム(架橋度6のもの)を欠損の底面積大(直径5mm)に切り出したものを設置した。その上に、以下のものを移植した。
比較例2:上記[12]での細胞を播種する工程を除いた細胞なしのスポンジ
比較例3:上記[12]で作製した細胞培養スポンジ
比較例4:上記[11]で作製した細胞塊小144個
実施例1:上記[10]で作製したモザイク細胞塊小144個
また、比較例の一つとして、上記[6]で用意したフィルムを設置せずに、細胞なしのスポンジのみを移植した群(比較例1)も用意した。
上記[14]で移植したウサギを8週後に剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片の染色は、HE染色(ヘマトキシリン・エオシン染色)、またはサフラニンO染色を行った。
AA:全般に良好な軟骨再生が認められる。
A:全般に軟骨再生が認められる。
B:一部でわずかな軟骨再生が認められる。
C:軟骨再生が認められない。
A:骨再生が認められる。
B:一部でわずかな骨再生が認められる。
C:骨再生が認められない。
A:繊維性軟組織の浸潤抑制が認められる。
B:繊維性軟組織の浸潤抑制が若干認められる。
C:繊維性軟組織の浸潤抑制は認められない。
D:炎症浸潤を抑制することができず、繊維性軟組織の浸潤抑制は不良である。
A:再生骨と再生軟骨の境目(タイドマーク)が正しい位置に形成される。
B:再生骨と再生軟骨の境目(タイドマーク)が若干形成される。
C:再生骨と再生軟骨の境目(タイドマーク)が形成されない。
Claims (15)
- 生分解性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の前記幹細胞間の隙間に複数個の前記生分解性高分子ブロックが配置されている前記細胞構造体を含み、前記幹細胞が間葉系幹細胞、羊膜細胞、臍帯血由来細胞、骨髄由来細胞、又は脂肪由来幹細胞である、軟骨再生材料。
- 前記生分解性高分子ブロックがリコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドからなる、請求項1に記載の軟骨再生材料。
- 前記生分解性高分子ブロックがリコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンからなる、請求項1又は2に記載の軟骨再生材料。
- 前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式1で示される、請求項3に記載の軟骨再生材料。
式1:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式1中、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、mは2〜10の整数であり、nは3〜100の整数であり、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。 - 前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生分解性を有するペプチド;又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生分解性を有するペプチド;
の何れかである、請求項3又は4に記載の軟骨再生材料。 - 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項1から5の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生分解性高分子ブロックがリコンビナントゼラチンからなり、前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項1から6の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 軟骨及び骨を再生するための、請求項1から7の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記細胞構造体が、前記幹細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の前記生分解性高分子ブロックを含む、請求項1から8の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生分解性高分子ブロックの一つの大きさが10μm以上300μm以下である、請求項1から9の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記細胞構造体の厚さ又は直径が100μm以上1cm以下である、請求項1から10の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生分解性高分子ブロックにおいて、生分解性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、請求項1から11の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 前記生分解性高分子ブロックが、生分解性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、請求項1から12の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
- 請求項1から13の何れか一項に記載の軟骨再生材料と、生分解性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料。
- 前記生分解性高分子フィルムが、前記細胞構造体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムである、請求項14に記載の軟骨再生材料。
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