JPWO2018207923A1 - 間葉系幹細胞の製造方法、およびその応用 - Google Patents
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Abstract
Description
<1> コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法。
<2> リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が2kDa以上100kDa以下である、<1>に記載の方法。
<3> リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が10kDa以上90kDa以下である、<1>または<2>に記載の方法。
<4> リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンが細胞接着シグナルを一分子中に2配列以上含む、<1>から<3>の何れか一に記載の方法。
<5> 細胞接着シグナルがArg−Gly−Aspで示されるアミノ酸配列である、<4>に記載の方法。
<6> リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、<1>から<5>の何れか一に記載の方法。
A−[(Gly−X−Y)n]m−B式中、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
<7> リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、<1>から<6>の何れか一に記載の方法。
Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
<8> リコンビナントゼラチンが、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、または(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、<1>から<7>の何れか一に記載の方法。
<9> 間葉系幹細胞が、骨髄由来細胞または軟骨由来細胞である、<1>から<8>の何れか一に記載の方法。
<10> コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地が、未分化維持用の液体培地である、<1>から<9>の何れか一に記載の方法。
<11> コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、0.01μg/mL〜500μg/mLである、<1>から<10>の何れか一に記載の方法。
<12> コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、0.02μg/mL〜300μg/mLである、<1>から<10>の何れか一に記載の方法。
<14> <1>から<12>の何れか一に記載の方法により製造される間葉系幹細胞。
<15> <13>に記載の方法により製造される分化誘導された細胞。
<16> コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、脂肪細胞への分化抑制剤。
本発明は、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法に関するものであり、特に、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む方法である。
間葉系幹細胞を用いた細胞治療を行う場合、生体内において周囲の微小環境に影響を受けやすい間葉系幹細胞の意図しない方向(例えば、脂肪細胞)への組織分化を避けることが、治療効果を担保する意味で重要である。本発明の方法により得られる細胞は、例えば再生医療における骨組織修復または軟骨組織修復などに利用することができる。
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列(XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に2配列以上含まれている。リコンビナントゼラチンとしては、ヒトコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のゼラチンである。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質1分子中3〜50個が好ましく、さらに好ましくは4〜30個、特に好ましくは5〜20個である。最も好ましくは12個である。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、または
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上)の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する。
リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地におけるリコンビナントゼラチン濃度は、0.01μg/mL以上500μg/mL未満が好ましく、0.02μg/mL以上300μg/mL未満が好ましく、1μg/mL以上50μg/mL未満が更に好ましく、1μg/以上10μL未満が最も好ましい。
液体培地の種類は、間葉系幹細胞を維持培養または拡大培養できる培地であれば、その種類は特に限定されないが、例えば、MesenPro(2%血清含有、ライフテクノロジーズ)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12(20%FBS(ウシ胎児血清)(Gibco)含有、ライフテクノロジーズ)、DMEM(10%FBS(Gibco)含有、SIGMA)、PRIME−XV XSFM(無血清、JXエネルギー)、MSCGM BulletKit(商標)(タカラバイオ)、Mesencult−ACF(動物由来成分不含)及びMesencult−SF(無血清、何れもベリタス)、MSCGM BullrtKit(血清含有、Lonza)などを挙げることができる。
本発明で使用する間葉系幹細胞(MSC)は、未分化細胞としての複製能力を有し、かつ骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞および脂肪細胞などへの分化能を有する細胞である。
間葉系幹細胞の起源は特に限定されず、ヒト間葉系幹細胞でもよいし、マウス、ラット、ネコ、またはイヌ等の非ヒト動物由来の間葉系幹細胞でもよい。
間葉系幹細胞は、投与する患者の自家細胞でもよいし、他家細胞でもよい。
リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する際の培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。37℃、5%CO2の条件などが例示される。培養中は適切な間隔(好ましくは1日から7日に1回、より好ましくは3日から4日に1回)で培地を交換することが好ましい。培養期間は特に限定されず1日〜20日間、好ましくは3日〜15日間、より好ましくは3日〜10日間培養することができる。
本発明の方法により製造される脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞とは、リコンビナントゼラチンを含有しない液体培地において培養した間葉系幹細胞と比較して、脂肪細胞への分化能が抑制されている間葉系幹細胞のことを意味する。
本発明によれば、上記した本発明の方法により脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造する工程、および分化誘導培地において、上記の脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を培養する工程を含む、細胞の製造方法が提供される。上記の方法によれば、間葉系幹細胞から分化誘導することができる細胞である限り、所望の細胞を製造することができる。間葉系幹細胞から分化誘導することができる細胞としては、骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞および脂肪細胞などを挙げることができるが特に限定されない。
骨細胞への分化誘導を行う場合には、Lonza:Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium BulletKit等を使用することができる。
軟骨細胞への分化誘導を行う場合には、Lonza:Human Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium BulletKit等を使用することができる。
脂肪細胞への分化誘導を行う場合には、Lonza:Human Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium BulletKit、PromoCell:Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium等を使用することができる。
本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、脂肪細胞への分化抑制剤が提供される。リコンビナントゼラチンの詳細は本明細書中に記載した通りである。リコンビナントゼラチンは、本明細書中に記載した通り、間葉系幹細胞の培養のための液体培地に溶解することによって、脂肪細胞への分化抑制剤として使用することができる。リコンビナントゼラチンを脂肪細胞への分化抑制剤として提供する場合の形態は特に限定されず、リコンビナントゼラチンを溶液または粉末として提供してもよいし、リコンビナントゼラチンを液体培地に溶解させた状態で提供してもよい。
リコンビナントゼラチンとして以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:分子量:51.6kD構造: Gly−Ala−Pro[(Gly−X−Y)63]3−Glyアミノ酸数:571個
RGD配列:12個イミノ酸含量:33%ほぼ100%のアミノ酸がGly−X−Yの繰り返し構造である。
CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。
CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
(1)実験1:CBE3添加(添加量:28ng/mL)
実験2:CBE3無添加
使用細胞:
Yub2505(国立成育医療研究センター(以降、成育研)で樹立された軟骨由来細胞)
Yub2505は参考文献(Nasu M, Takayama S, Umezawa A. Endochondral ossification model system: designed cell fate of human epiphyseal chondrocytes during long−term implantation.J.Cell Physiol.2015;230:1376−1388)に記載の方法に準じて樹立した。
UDE BMは以下の方法で樹立した。骨から骨髄液を取り出し、密度勾配遠心分離によって細胞を集めた。回収した細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、DMEM(10%FBS含有)培地中に播種して培養した。培養容器に接着した細胞を回収した。
MesenPro(2%血清含有、ライフテクノロジーズ):Yub2505、UDE BM
DMEM/F12(20%FBS(Gibco)含有、ライフテクノロジーズ):Yub2505
DMEM(10%FBS(Gibco)含有、SIGMA):UDE BM
PRIME−XV XSFM(無血清、JXエネルギー):Yub2505、UDE BM
脂肪分化誘導培地:Human Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium BulletKit(Lonza)
以下の細胞の培養は全て、37℃5%CO2にて行った。
直径10cmの培養皿にMesenPro培地8mLを分注して各細胞を維持培養した。細胞播種量は1×106cell/培養皿とし、培養期間は5〜7日間とした。
脂肪への分化を確認した結果を図1〜図4に示す。
細胞がUDE BMであり、培地がMesenProである場合(図1)、細胞がUDE BMであり、培地がDMEMである場合(図2)、細胞がUDE BMであり、培地がPRIME−XVである場合(図3)、細胞がYub2505であり、培地がPRIME−XVである場合(図4)の何れの組み合わせにおいても、実験2(CBE3無添加)に比べて実験1(CBE3添加)は脂肪への分化が抑制されていた。
(1)実験:CBE3添加(添加量:0、0.028、2.8、28、280μg/mL)
使用細胞:
ヒト骨髄由来細胞BMSC(Lonza:PT-2501)
MesenPro(2%血清含有、ライフテクノロジーズ)
脂肪分化誘導培地:Human Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium BulletKit(Lonza)、PromoCell:Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium
以下の細胞の培養は全て、37℃5%CO2にて行った。
直径10cmの培養皿にMesenPro培地8mLを分注してBMSC細胞を維持培養した。細胞播種量は5×105cell/wellとし、培養期間は6日間とした。
脂肪への分化を確認した結果を図5、6に示す。(図5の脂肪細胞染色写真より、脂肪細胞に誘導された細胞数をカウントした結果が図6である)
細胞がBMSCであり、培地がMesenProである場合、脂肪分化誘導培地がLonza,PromoCellの何れの場合においても、CBE3添加によって脂肪分化が抑制されていた。CBE3添加量が2.8〜280μg/mLである場合に顕著に脂肪分化抑制された。
(1)実験:CBE3添加(添加量:0、0.028、2.8、28μg/mL)
使用細胞:
ヒト骨髄由来細胞BMSC(Lonza:PT-2501)
使用培地:MesenPro(2%血清含有、ライフテクノロジーズ)
0.1質量%CBE3水溶液:cellnest(登録商標)(富士フイルム)
以下の細胞の培養は全て、37℃5%CO2にて行った。
直径10cmの培養皿にMesenPro培地8mLを分注して、passage5(第五継代細胞)まで維持培養した。細胞播種量は0.4〜1.0×106cell/培養皿とし、培養期間は各継代毎に7日間前後とした。
細胞数を計測した結果を図7に示す。各々のCBE3濃度においてN=3で培養を行い、測定した結果の平均値を表す。CBE3無添加に比べ、CBE3の添加により7日間培養後の細胞数は増加した。細胞数の増加は2.8μg/mLのときがピークであり、更に高濃度とすることで細胞数は、減少傾向を示した。
Claims (16)
- コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法。
- リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が2kDa以上100kDa以下である、請求項1に記載の方法。
- リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が10kDa以上90kDa以下である、請求項1または2に記載の方法。
- リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンが細胞接着シグナルを一分子中に2配列以上含む、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 細胞接着シグナルがArg−Gly−Aspで示されるアミノ酸配列である、請求項4に記載の方法。
- リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
A−[(Gly−X−Y)n]m−B式中、Aは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。 - リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。 - リコンビナントゼラチンが、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、または(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- 間葉系幹細胞が、骨髄由来細胞または軟骨由来細胞である、請求項1から8の何れか一項に記載の方法。
- コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地が、未分化維持用の液体培地である、請求項1から9の何れか一項に記載の方法。
- コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、0.01μg/mL〜500μg/mLである、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、0.02μg/mL〜300μg/mLである、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1から12の何れか一項に記載の方法により脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造する工程、および分化誘導培地において、前記の脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を培養する工程を含む、分化誘導された細胞の製造方法。
- 請求項1から12の何れか一項に記載の方法により製造される間葉系幹細胞。
- 請求項13に記載の方法により製造される分化誘導された細胞。
- コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、脂肪細胞への分化抑制剤。
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