JPWO2019146673A1 - リンパ球の製造方法 - Google Patents

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Abstract

リンパ球を新規の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養することにより、リンパ球が効率的に増殖する。

Description

本発明は、医療分野において有用な、リンパ球の製造方法に関する。
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも特に中心的な役割を果たしているのが白血球のサブタイプの一つである、リンパ球である。リンパ球は、主に、Ｔ細胞（Ｔリンパ球と記載することがある）、Ｂ細胞（Ｂリンパ球と記載することがある）、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞と記載することがある）という３種類の主要なタイプに分けられる。
Ｔ細胞は、さらに、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）４を発現し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞、ＣＤ８を発現し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、キラーＴ細胞とも呼ばれる）、及びその他のＴ細胞に亜分類される。
リンパ球の作製方法に関して、リンパ球の培養用基材として、例えば、マトリゲル、ラミニン及びフィブロネクチンなどの細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ）が利用できる。
フィブロネクチンフラグメントを利用した、リンパ球の作製方法の研究として、例えば、特許文献１が挙げられる。特許文献１では、ＣＨ−２９６等の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下で前駆細胞を培養することにより、細胞障害性Ｔ細胞を効率的に誘導、維持、又は拡大培養する方法が開示されている。しかし、この方法で製造されるのは細胞障害性Ｔ細胞であり、その他の種類のリンパ球を効率よく製造することはできない。
このように、フィブロネクチンフラグメントを利用し、様々な種類のリンパ球を製造する技術は未だ確立していない。
国際公開第ＷＯ２００５／０１９４５０号パンフレット
本発明は、従来のリンパ球の製造方法が有していた問題を解決しようとするものであり、フィブロネクチンフラグメントを利用し、様々な種類のリンパ球を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、新規の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下でリンパ球を培養することにより、リンパ球が効率的に増殖することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
［１］リンパ球を、
（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜３リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜３リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、の存在下で培養する工程を包含する、リンパ球の製造方法、
［２］リンパ球を、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組換えポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドの存在下で培養する工程を包含する、［１］に記載の製造方法、
［３］組換えポリペプチドが、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［２］に記載の製造方法、
［４］組換えポリペプチドが、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号３１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［２］に記載の製造方法、
［５］組換えポリペプチドと抗ＣＤ３抗体の共存下でリンパ球の培養が実施される、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法、
［６］組換えポリペプチドの存在下でリンパ球を培養する工程が、組換えポリペプチドがコートされた固相とリンパ球とが接触した状態で実施される、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法、
［７］固相が、細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、［６］に記載の製造方法、
［８］固相が、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、［６］に記載の製造方法、
［９］リンパ球が、ヒト由来のリンパ球である、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法、
に関する。
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。本発明の方法によれば、リンパ球を効率よく増殖させること、リンパ球の機能を維持すること、及びリンパ球を効率よく誘導することができる。本発明により得られるリンパ球は、例えば、再生医療に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。 本発明の方法により得られたリンパ球のナイーブ細胞比率の一例を示す。図中「−」は組換えポリペプチドをコーティングしていないプレートを用いて培養した陰性対照を示す。
以下に本発明について詳細に説明する。
＜フィブロネクチン＞
ヒト由来や哺乳動物由来のフィブロネクチンがよく研究されており、以下は、主にヒト由来血漿フィブロネクチンについての知見である。
フィブロネクチンは血液中、細胞表面、細胞外マトリックスなどに存在する分子量約２５０ｋＤａ（単量体）の巨大な糖タンパク質で、細胞接着などの多彩な機能を持つことが知られている。フィブロネクチンはドメイン構造から成り（以下、図１参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれている。３種類の類似の配列は、それぞれＩ型リピート、ＩＩ型リピート、ＩＩＩ型リピートと呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型リピートは８７〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、各リピート間でのアミノ酸配列の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１５個のＩＩＩ型リピートが存在するが、そのうち、１番目、２番目、３番目（以下、それぞれＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３と称する）は自己会合ドメインに、４番目、５番目、６番目（以下、それぞれＩＩＩ−４、ＩＩＩ−５、ＩＩＩ−６と称する）はＤＮＡ結合ドメインに、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。ＩＩＩ−１０にはインテグリンα５β１（ＶＬＡ−５ともいう）に対して結合活性を有する領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤである。また、フィブロネクチンのＣ末端側寄りの部位にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳにはＣＳ−１と呼ばれる２５アミノ酸からなる配列が含まれており、当該配列はインテグリンα４β１（ＶＬＡ−４ともいう）に対して結合活性を示す。
ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜１４及びＣＳ−１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１〜１４及び１５として、本明細書の配列表に示す。
１．本発明のリンパ球の製造方法
本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球を組換えフィブロネクチンフラグメントであるポリペプチドの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする。本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞集団を意味する。
リンパ球はマーカー分子の発現の違い及び／又は機能の違いによって、様々な種類に分類される。リンパ球の３つの主要な種類は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。
末梢に存在するほとんどの成熟したＴ細胞は、細胞表面のマーカー分子としてＣＤ４かＣＤ８のどちらかを発現している。ＣＤ４を発現したＴ細胞は他のＴ細胞の機能発現を誘導したりＢ細胞の分化成熟、抗体産生を誘導したりするヘルパーＴ細胞として機能する。一方、ＣＤ８陽性Ｔ細胞はウイルス感染細胞などを破壊する細胞障害性Ｔ細胞として機能する。また、ＮＫ細胞とＴ細胞の性質を併せ持つＮＫＴ細胞や、ＣＤ２５分子を発現して他のＴ細胞の活性を抑制する働きのある制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇともいう）などもある。最近では胸腺を介さずに分化成熟する末梢性Ｔ細胞が存在することも知られるようになった。
一方、Ｂ細胞は細胞ごとに産生する抗体の種類が決まっている。自分の抗体タイプに見合った病原体が出現した場合にのみ活性化して抗体産生を開始する。
また、ＮＫ細胞は、自然免疫の主要因子として働く細胞傷害性リンパ球の１種であり、特に腫瘍細胞やウイルス感染細胞の拒絶に重要である。
本発明に使用されるリンパ球は上述のいずれのリンパ球でもよい。本発明の好適な態様において、リンパ球は好ましくはＴ細胞であり、より好ましくはＣＤ４を発現するリンパ球であり、さらに好ましくはヘルパーＴ細胞である。
また、本発明の方法は精製されたリンパ球にのみ使用可能なものではなく、例えば、複数種のリンパ球の混合物や、リンパ球とその他の細胞とを含む細胞集団等にも適用できる。例えば、後述の実施例に記載のように、末梢血由来の単核細胞の集団に本発明の方法を適用し、リンパ球を製造することができる。
本発明に使用されるリンパ球の起源は特に限定されず、任意の生物、好ましくは哺乳動物に由来するリンパ球を使用することができる。生物の年齢、性別は特に限定されない。１つの実施形態において、霊長目（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。
ヒトへの投与を目的として本発明の方法によりリンパ球を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された細胞が、リンパ球の製造に供される。例えばレシピエント自身より採取されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、リンパ球の製造に供される。
本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球を後述の組換えポリペプチドの存在下で培養する工程（以下、「本発明の培養工程」と称することがある）を包含することを特徴とする。
本発明のリンパ球の製造方法では、ポリペプチド（ａ）、ポリペプチド（ｂ）、及びポリペプチド（ｃ）の存在下でリンパ球の培養が実施される。さらに、本発明のリンパ球の製造方法では、（ａ）及び（ｂ）を同一分子内に含むポリペプチドとポリペプチド（ｃ）の２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、（ｂ）及び（ｃ）を同一分子内に含むポリペプチドとポリペプチド（ａ）の２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、（ａ）及び（ｃ）を同一分子内に含むポリペプチドとポリペプチド（ｂ）の２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、（ａ）及び（ｂ）を同一分子内に含むポリペプチドと（ｂ）及び（ｃ）を同一分子内に含むポリペプチドの２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、又は、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を同一分子内に含む１種のポリペプチドの存在下にリンパ球の培養を実施してもよい。ただし、前記の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を同一分子内に含む１種のポリペプチドは、全長フィブロネクチンとは異なる。
ポリペプチド（ａ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜３リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜３リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。すなわち、当該ポリペプチド（ａ）は、ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３をすべて含むポリペプチドである。
ポリペプチド（ｂ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。すなわち、当該ポリペプチド（ｂ）は、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０をすべて含むポリペプチドである。
ポリペプチド（ｃ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。すなわち、当該ポリペプチド（ｃ）は、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４をすべて含むポリペプチドである。
同一分子内に（ａ）と（ｂ）を含むポリペプチドとして、１２０ｋＤａのフィブロネクチンフラグメント（１２０ｋ−ｆｒ）が例示される。１２０ｋ−ｆｒは、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３、ＩＩＩ−４、ＩＩＩ−５、ＩＩＩ−６、ＩＩＩ−７、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０を含む、分子量約１２０ｋＤａのポリペプチドである。１２０ｋ−ｆｒの予想されるアミノ酸配列（９３２アミノ酸残基）を、配列番号１６として、本明細書の配列表に示す。１２０ｋ−ｆｒのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを作製して適切な宿主−ベクター系と組み合わせることにより、１２０ｋ−ｆｒを組換えポリペプチドとして製造することができる。また、市販の１２０ｋ−ｆｒを使用してもよい。
同一分子内に（ｂ）と（ｃ）を含むポリペプチドとして、ＣＨ−２７１やＣＨ−２９６が例示される。
ＣＨ−２７１は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４を含む、分子量約６０ｋＤａ（５４９アミノ酸残基）の組換えポリペプチドである。ＣＨ−２７１のアミノ酸配列を、配列番号１７として、本明細書の配列表に示す。
ＣＨ−２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１を含む、分子量約６３ｋＤａ（５７４アミノ酸残基）の組換えポリペプチドである。ＣＨ−２９６のアミノ酸配列を、配列番号１８として、本明細書の配列表に示す。ＣＨ−２９６は、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）として市販されている。
例えば、前記の１２０ｋ−ｆｒと、ＣＨ−２７１又はＣＨ−２９６とを組み合わせて使用することにより、本発明のリンパ球の製造方法を実施することができる。
同一分子内に（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を有するポリペプチドも本発明のリンパ球の製造方法に使用することができる。本発明を特に限定するものではないが、同一分子内に（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含むポリペプチドとして、下記のＦＣＨ−２９６が例示される。
ＦＣＨ−２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１を含む、分子量約９６ｋＤａ（８８１アミノ酸残基）の組換えポリペプチドである。ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列を、配列番号１９として、本明細書の配列表に示す。配列番号１９のうち、アミノ酸番号１〜２９８が（ａ）に該当し、アミノ酸番号２９９〜３０７がＧＳ ｌｉｎｋｅｒに該当し、アミノ酸番号３０８〜５８５が（ｂ）に該当し、アミノ酸番号５８６〜８５６が（ｃ）に該当し、アミノ酸番号８５７〜８８１がＣＳ−１に該当する。なお、配列番号１９のアミノ酸番号９４〜１１１は、ＩＩＩ−１とＩＩＩ−２との間に存在する、ＩＩＩ型リピート以外の領域である。
本発明に使用されるポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、機能的に同等であれば、あるいはリンパ球を増殖させる機能、リンパ球の機能を維持する機能、又はリンパ球を誘導する機能を保持するかぎり、ＩＩＩ−１〜３リピート、ＩＩＩ−８〜１０リピート、又はＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。本明細書において、「１もしくは数個」とは、特に限定はされないが、１〜１５個の範囲、好ましくは１〜１０個の範囲、更に好ましくは１〜５個の範囲、特に好ましくは１〜３個の範囲である。特には限定されないが、例えば、ＩＩＩ−１（配列番号１）を含む代わりに、ＩＩＩ−１のＮ末９アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２１）、ＩＩＩ−１のＮ末６アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２２）、ＩＩＩ−１のＮ末５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２３）、又はＩＩＩ−１のＮ末３アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２４）を含むポリペプチドも、当該ポリペプチドに含まれる。更に、（ａ）〜（ｃ）を含むポリペプチドとして、ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１９）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示され、より具体的には、限定するものではないが、Ｎ末９アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２５）、Ｎ末６アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２６）、Ｎ末５アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２７）、Ｎ末３アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２８）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３０）、Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３１）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３２）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３３）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３４）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３５）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３６）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３７）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３８）、Ｎ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３９）、及びＮ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＣＨ−２９６（配列番号２０）が、例示される。なお、本明細書に記載された「Ｎ末（数字）アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６」とは、ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列をコードする核酸の開始コドンの直後に、前記数字で表された個数のアミノ酸をコードする塩基配列の核酸が挿入された核酸より転写・翻訳されるポリペプチドをいう。翻訳後修飾により前記ポリペプチドから開始コドンにコードされたメチオニンが除去されたポリペプチドも、前記のＮ末アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６に包含される。例えば、「Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６」は、ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列をコードする核酸の開始コドンの直後に３個のアミノ酸をコードする塩基配列の核酸が挿入された核酸より転写・翻訳されるポリペプチド、および翻訳後修飾により前記ポリペプチドから開始コドンにコードされたメチオニンが除去されたポリペプチドを包含する。同様に、本明細書に記載された「Ｎ末（数字）アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６」とは、ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列をコードする核酸の開始コドンの直後の前記数字で表された個数のアミノ酸をコードする塩基配列の核酸が欠失した核酸より転写・翻訳されるポリペプチドをいう。翻訳後修飾により前記ポリペプチドから開始コドンにコードされたメチオニンが除去されたポリペプチドも、前記のＮ末アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６に包含される。例えば、「Ｎ末３アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６」は、ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列をコードする核酸の開始コドンの直後の３個のアミノ酸をコードする塩基配列の核酸が欠失した核酸より転写・翻訳されるポリペプチド、および翻訳後修飾により前記ポリペプチドから開始コドンにコードされたメチオニンが除去されたポリペプチドを包含する。また同様に、本明細書において、「Ｎ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＣＨ−２９６」は、ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列をコードする核酸の開始コドンの直後にＨｉｓ−ｔａｇをコードする塩基配列の核酸が挿入された核酸より転写・翻訳されるポリペプチド、および翻訳後修飾により前記ポリペプチドから開始コドンにコードされたメチオニンが除去されたポリペプチドを包含する。
また、本発明に使用されるポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、機能的に同等であれば、あるいはリンパ球を増殖させる機能、リンパ球の機能を維持する機能、又はリンパ球を誘導する機能を保持するかぎり、ＩＩＩ−１〜３リピート、ＩＩＩ−８〜１０リピート、又はＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。特に限定はされないが、ＩＩＩ−１〜３リピート、ＩＩＩ−８〜１０リピート、又はＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが例示される。
アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加（以下、「アミノ酸の置換等」と称する場合がある）は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度が好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。
アミノ酸の置換等は種差や個体差に起因して天然に生じたものであってもよく、また、人工的に導入されたものであってもよい。人工的な導入は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入を前述のポリペプチドをコードする核酸に導入した核酸を使用することにより、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。
本明細書において「機能的に同等」または「同等な機能」とは、アミノ酸置換等を導入されていない対応するポリペプチドと機能的に同等または同等な機能を意味し、すなわち、比較対象であるポリペプチドを使用して後述のリンパ球の製造を実施した場合、アミノ酸置換等を導入されていない対応するポリペプチドを使用した場合と同等のリンパ球の細胞増殖率が得られること、同等のリンパ球の機能が維持されていること、又は同等のリンパ球の誘導率が得られることをいう。すなわち、後述の実施例に記載の方法に沿ってその性質の評価を実施することにより、ポリペプチドの機能を適宜確認することができる。
本発明に使用されるポリペプチドは、リンパ球の培養における有用性を失わない範囲で、上記のＩＩＩ型リピート以外のペプチドやアミノ酸残基、及び／又は上記のＩＩＩ型リピート以外のフィブロネクチン中に存在する領域、例えば、ＣＳ−１等を含んでいてもよい。例えば、上記のＩＩＩ型リピート以外の領域に任意のペプチドやアミノ酸残基を導入することができ、各リピートの間にリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）としてアミノ酸残基やペプチドが挿入された本発明のポリペプチドや、組換えポリペプチドの精製に有用なペプチド（ｔａｇ）が付加された本発明のポリペプチドが例示される。ｌｉｎｋｅｒとして、ｇｌｙｃｉｎｅ−ｓｅｒｉｎｅ ｌｉｎｋｅｒ（ＧＳ ｌｉｎｋｅｒ）が例示されるが、これらに限定されない。ｔａｇとして、ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｆｌａｇ−ｔａｇやＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔａｇ（ＧＳＴ−ｔａｇ）が例示されるが、これらに限定されない。特に限定されないが、例えば、Ｎ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＣＨ−２９６ポリペプチド（配列番号２０）は、本発明に使用されるポリペプチドに含まれる。
本発明の培養工程により、リンパ球が、高い細胞増殖率で培養される。本発明のリンパ球の製造方法は、公知のフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６を使用する方法と比較して、細胞増殖率が高いことから、非常に有用である。
ポリペプチドの調製に関して、フィブロネクチンに関する情報は、キミヅカ Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ Ａ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等を参照することができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
本発明に使用されるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造される。組換え体の製造、あるいは、取扱いの点で、本発明に使用されるポリペプチドの分子量は１５０ｋＤａ以下、１４０ｋＤａ以下、１３０ｋＤａ以下、１２０ｋＤａ以下、１１０ｋＤａ以下、又は１００ｋＤａ以下が望ましい。本明細書におけるポリペプチドにはアセチル化などの化学修飾体も包含される。
本発明の好適な態様において、リンパ球の培養は、前記のポリペプチドがコートされた固相とリンパ球とが接触した状態で実施される。前記の固相としては、例えば細胞培養に使用される容器又は担体（マイクロビーズ等）が挙げられる。前記のポリペプチドがコートされた固相はリンパ球を安定に保持する能力を有しており、当該細胞の培養に有用である。培養容器は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる素材、形状のものを用いることが出来る。培養容器の素材としては、例えばガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂又は金属等がある。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱や円柱、三角錐、四角錐などの多角錘や円錐、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等がある。
リンパ球の培養に使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、メンブレン、スライドガラス、大型培養槽、バイオリアクター、中空糸型の培養装置等を使用することができる。好適には、プレートが使用され、さらに好適には、細胞培養プレートが使用される。
なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
固相のコーティング、すなわちポリペプチドの固相表面への固定化は、公知の手法によって実施すればよく、例えば国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。ポリペプチドを固相に固定化しておけば、本発明の方法によりリンパ球を得た後、該細胞と固相とを分離するのみで、該細胞と本発明のポリペプチドとを容易に分離することができ、リンパ球へのポリペプチド等の混入を防ぐことができる。
より具体的には、ポリペプチドを滅菌蒸留水、緩衝液あるいは生理食塩水等に溶解したコーティング溶液を調製しておき、固定化に使用することができる。好適にはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、特に好適には、ポリペプチドをダルベッコＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ：Ｄ−ＰＢＳ）を溶媒に用いたコーティング溶液が使用される。
コーティング溶液中のポリペプチドのモル濃度としては、特に限定はないが、例えば１〜１００００ｎＭ、好適には１０〜２０００ｎＭ、さらに好適には３０〜１０００ｎＭが例示される。ポリペプチドとしてＦＣＨ−２９６を使用する場合、上記のモル濃度を重量濃度で表すと０．１〜１０００μｇ／ｍＬ、好適には１〜２００μｇ／ｍＬ、さらに好適には３〜１００μｇ／ｍＬとなる。
本発明の好適な態様では、コーティング溶液には抗ＣＤ３抗体がさらに添加される。本態様で使用されるコーティング溶液に添加される抗ＣＤ３抗体の濃度は、例えば、終濃度で、０．５〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２〜１０μｇ／ｍＬである。さらに、本発明の奏する効果を損なわない範囲でコーティング溶液に他の成分等が添加されてもよい。
上記コーティング溶液を培養容器に添加し、適当な時間保持することでコーティングを実施することができる。コーティング溶液を保持する際の条件は適宜設定すればよいが、例えば室温で１時間、あるいは４℃で一晩、といった条件が挙げられる。
フィブロネクチンフラグメントがコートされた容器は、そのまま使用するか又は使用時まで低温、例えば０〜１０℃で保存することができる。使用直前にはこれらの培養容器からコーティング溶液を除去し、例えばＤ−ＰＢＳで２回、次いで、必要に応じて細胞培養用培地で１回洗浄してから細胞培養に供する。
本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において、リンパ球を前記のポリペプチドの存在下で培養することにより行われる。すなわち、リンパ球の製造過程の一部に本発明の培養工程を含むものであれば本発明に包含される。例えば、リンパ球を含まない細胞集団を用いてリンパ球の製造過程を開始した場合であっても、開始後にリンパ球が誘導され、当該リンパ球を前記ポリペプチドの存在下で培養する工程を含むものであれば、本発明に包含される。
本発明の培養工程は、リンパ球の誘導、リンパ球の維持、及び／又はリンパ球の拡大培養を含む。したがって、本発明は、例えば、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下に、リンパ球を誘導し、維持し、拡大培養することを含むリンパ球の製造方法、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下に、リンパ球を誘導し、維持することを含むリンパ球の製造方法、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下にリンパ球を維持及び拡大培養することを含むリンパ球の製造方法、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下にリンパ球を誘導することを含むリンパ球の製造方法、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下にリンパ球を維持することを含むリンパ球の製造方法、ならびに、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下にリンパ球を拡大培養することを含むリンパ球の製造方法を提供する。本発明のリンパ球の製造方法においては、該方法に供するリンパ球の種類や、培養の条件等を適宜調整してリンパ球の培養を行うことにより、再生医療等に有用なリンパ球を製造することができる。なお、本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞集団を意味する。
リンパ球の誘導を目的とする場合、本発明の培養工程において、培養開始時の細胞の種類や、リンパ球の誘導方法に特に限定はない。培養開始時の細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞であってもよいし、さらに分化の進んだ造血幹細胞やリンパ球の前駆細胞、ナイーブ細胞であってもよい。また、リンパ球の誘導方法は、既知の方法であれば特に限定はされない。
リンパ球の維持及び拡大培養を目的とする場合、本発明の培養工程において、培養開始時の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００５〜２０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には０．０２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には０．０５〜２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
本発明の培養工程には、リンパ球の培養に用いられる種々の培地を使用することができる。好適には、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ又はｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）やヒツジ血清などの異種由来成分を含まない培地、無血清培地、未知成分を含有しない培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。このような異種由来成分不含（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）培地は適宜調製することができるが、公知の培地や市販の培地をそのまま、あるいは改変して使用してもよい。市販の異種由来成分不含培地としては、例えばＧＴ−Ｔ５５１培地（タカラバイオ社製）を使用することができる。
本発明の好適な態様では、培地にはインターロイキン−２（ＩＬ−２）がさらに添加される。本態様で使用される培地に添加されるＩＬ−２の濃度は、例えば、終濃度で、１０〜１０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは１００〜３００ＩＵ／ｍＬである。さらに、本発明の奏する効果を損なわない範囲で培地に他の成分等が添加されてもよい。
リンパ球の培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養条件を採用できる。前記培養条件として、温度３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。例えば、温度３０〜４０℃、湿度９０〜９８％、ＣＯ２濃度３〜７％、での培養が例示されるが、所望のリンパ球の増殖が達成できる条件であれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。培養中は、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、必要に応じて培養容器を交換することが好ましい。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は、適宜設定することができる。
本発明の好適な態様において、リンパ球の維持及び拡大培養を目的とする場合、リンパ球は本発明に使用されるポリペプチドがコートされた容器中で適切な培地を使用し、培地交換と継代を行いながら、例えば５日以上、好ましくは１０日以上培養される。この培養により、リンパ球を増殖させることができる。
本発明の製造方法により得られたリンパ球は、マーカー分子の発現に基づいて分類することが可能である。前記のマーカー分子の発現は、例えばマーカー分子を認識する抗体を用いて確認することができる。
特に限定されないが、リンパ球のマーカー分子として、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８が挙げられる。ＣＤ３は、成熟Ｔリンパ球に発現する糖タンパク質で細胞表面抗原の１つである。ＣＤ４は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞などに発現している。一般的に、ＣＤ３陽性かつＣＤ４陽性の細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）は、ヘルパーＴ細胞である。一方、ＣＤ８は、細胞障害性Ｔ細胞や一部のＮＫ細胞などに発現している。一般的に、ＣＤ３陽性かつＣＤ８陽性の細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）は、細胞障害性Ｔ細胞である。
本発明の製造方法により得られたリンパ球は、ＣＤ４を高発現している。特に限定されないが、本発明の製造方法により得られたリンパ球のうち、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上がＣＤ４を発現している。また、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）の不在下で培養した場合（陰性対照）と比べて、本発明の製造方法により得られたリンパ球は、ＣＤ４を発現している細胞の割合が高い。特に限定されないが、例えば、本発明の製造方法により得られたリンパ球におけるＣＤ４を発現している細胞の割合は、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）の不在下で培養した場合（陰性対照）の１．３倍以上、１．５倍以上、１．７倍以上、２倍以上、２．３倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、又は３倍以上になる。
また、その他のリンパ球のマーカー分子として、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７が挙げられる。一般的に、ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）はナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）はセントラルメモリー細胞、ＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＣＲ７陰性（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）はエフェクターメモリー細胞の表現型としてそれぞれ知られている。
本発明の製造方法により得られたリンパ球は、ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、すなわちナイーブ細胞の比率が高い。特に限定されないが、本発明の製造方法により得られたリンパ球のうち、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上がＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７を発現している。また、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）の不在下で培養した場合（陰性対照）と比べて、本発明の製造方法により得られたリンパ球は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７を発現している細胞の割合が高い。特に限定されないが、例えば、本発明の製造方法により得られたリンパ球におけるＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７を発現している細胞の割合は、ポリペプチド（ａ）〜（ｃ）の不在下で培養した場合（陰性対照）の１．３倍以上、１．５倍以上、１．７倍以上、２倍以上、２．３倍以上、２．５倍以上、２．７倍以上、又は３倍以上になる。
更に、本発明の製造方法により得られる細胞集団より目的のリンパ球を単離し、他の細胞から分離されたリンパ球を取得することができる。目的のリンパ球に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明により得られたリンパ球を単離、精製するうえで有用である。こうして単離されたリンパ球は、公知の方法により細胞株として樹立することができる。すなわち、本発明の態様の一つとして、本発明のリンパ球を含有する細胞集団の製造方法の工程及び得られた細胞集団よりリンパ球を単離する工程を包含するリンパ球の製造方法が挙げられる。
本発明で得られるリンパ球は、例えばリンパ球の研究や種々の疾患に関する医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くのリンパ球を取得することができることから、これまでのように細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能となる。
本発明は医薬に使用するためのリンパ球、医薬の製造に使用するためのリンパ球を提供する。当該リンパ球は、本発明により製造される細胞集団である。当該リンパ球を含有する医薬は免疫療法への使用に適している。例えば、本発明により製造されたリンパ球を有効成分とし、所望により他の成分（公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦活剤、安定剤等）と混合し、点滴剤又は注射剤とすることができる。なお、これら治療剤における本発明の細胞集団の含有量、治療剤の投与量、及び当該治療剤の使用に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜決定できる。更に、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤療法治療や放射線治療、又は外科的手術による治療との併用を行うこともできる。
前記の細胞集団の投与が有効である疾患としては、特に限定はないが、例えば、がん、白血病、悪性腫瘍、肝炎、感染症疾患（例えばインフルエンザ、結核、ヒト免疫不全ウイルス感染症、ＡＩＤＳ、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、もしくは深在性真菌症）等が例示される。特に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染するＨＩＶが原因となるＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の治療に有用である。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体治療、温熱治療、他の免疫療法等、従来の治療法と組み合わせて利用できる。また、所望の外来遺伝子を導入することにより、当該外来遺伝子の発現により効果を示すさまざまな疾患の治療又は予防に有用なリンパ球を製造することもできる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。
実施例１ ＦＣＨ−２９６の調製
メチオニン残基及び６個のヒスチジン残基から成るＨｉｓ−ｔａｇをＮ末に有するＦＣＨ−２９６ポリペプチド（配列番号２０）を、以下の操作により調製した。
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを人工合成し、発現プラスミドに組み込んだ。当該プラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を前記ポリペプチドが発現する条件で培養した。培養物より集めた菌体を、超音波破砕機（Ｋｕｂｏｔａ社製）で破砕し、無細胞抽出液を得た。この抽出液を出発材料とし、Ｎｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（４０μｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、の一連のカラムクロマトグラフィーにより、ＦＣＨ−２９６を精製した。精製過程におけるＦＣＨ−２９６の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色により実施した。得られたサンプルのＢｕｆｆｅｒを〔０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．１５ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４〕に置換し、ＦＣＨ−２９６標品６ｍＬを得た。
ＦＣＨ−２９６標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色で単一のバンドを示した。ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、ＦＣＨ−２９６標品のタンパク質濃度を測定したところ、１．２１ｍｇ／ｍＬ（分子量から計算すると１２．４μＭ）だった。
実施例２ 抗ヒトＣＤ３抗体とＦＣＨ−２９６のコーティング
以下の実施例で使用する培養器材に、抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、タカラバイオ社製）及び実施例１で調製したＨｉｓ−ｔａｇ付きＦＣＨ−２９６を固定化した。固定化は２４穴細胞培養プレート（ファルコン社製）に終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体と終濃度２５μｇ／ｍＬの上記Ｈｉｓ−ｔａｇ付きＦＣＨ−２９６とを含むＤ−ＰＢＳ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製、Ｃ−４０２３２）を０．４ｍＬ／ウェルずつ添加した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて５時間以上静置して実施した。固定化プレートは使用直前に溶液を除去し、０．５ｍＬ／ウェルのＤ−ＰＢＳで２回洗浄した。また、対照として終濃度２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６（レトロネクチン：タカラバイオ社製）と終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体とを含むＤ−ＰＢＳでコートされたプレートも同様の方法で調製した。陰性対照にはコーティングをしていないプレートを用いた。
実施例３ リンパ球の培養（ＴＣ００３３）
（１）細胞集団の拡大培養
インフォームド・コンセントの得られた健常人ドナー（ＴＣ００３３）から常法に従い調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、終濃度２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、ニプロ社製）を添加したＧＴ−Ｔ５５１培地（タカラバイオ社製、以下、ＧＴ−Ｔ５５１ＣＭと称す）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。上記細胞を、２．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルでプレートにＮ＝２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した（０日目）。
細胞継代は４日目及び７日目に行った。４日目には、コーティングをしていない１２穴細胞培養プレート（コーニング社製）に２．６１２ｍＬ／ウェルのＧＴ−Ｔ５５１ＣＭと０．３５８ｍＬ／ウェルの細胞懸濁液を混合して培養を継続した。７日目には、コーティングをしていない１２穴細胞培養プレートに１．４８５ｍＬ／ウェルのＧＴ−Ｔ５５１ＣＭと１．４８５ｍＬ／ウェルの細胞懸濁液を混合して培養を継続した。細胞継代日の４日目と７日目、及び培養終了日の１０日目に各試験区の細胞数をトリパンブルー染色法にてカウントした。０日目の細胞数を１としたときの、４日目、７日目、及び１０日目の細胞数を表１に示す。
Figure 2019146673
陰性対照及びＣＨ−２９６でコートされたプレートと比べて、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレートでは、細胞増殖率が高かった。
（２）細胞表面マーカーの解析
実施例３−（１）で得られた１０日目の細胞集団を、０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）で洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞集団を懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体、ＲＤ−１標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体、ＰＣ−５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体のカクテル抗体（ベックマンコールター社製）を添加し抗体反応を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞集団を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞集団をフローサイトメトリー（ＦＣ−５００、ベックマンコールター社製）に供し、各々の細胞集団のＣＤ３陽性かつＣＤ４陽性の細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）率を算出した。細胞表面マーカー測定の結果を表２に示す。なお、全細胞中のＣＤ３陽性率はすべての試験区で９４％以上であった。
Figure 2019146673
陰性対照及びＣＨ−２９６でコートされたプレートと比べて、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレートでは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋率が高かった。ＣＤ３＋ＣＤ４＋は、一般的にヘルパーＴ細胞を表す。表１と表２の結果より、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上では、ヘルパーＴ細胞が効率的に増殖することが示された。
実施例４ 複数のドナー由来のリンパ球の培養（ＴＣ００３３及びＴＣ００７１）
（１）細胞集団の拡大培養
実施例３と同じ健常人ドナー（ＴＣ００３３）及び異なる健常人ドナー（ＴＣ００７１）から調製したＰＢＭＣを用いて、実施例３−（１）と同様の方法で細胞培養を行った。０日目の細胞数を１としたときの、４日目、７日目、及び１０日目の細胞数を表３に示す。
Figure 2019146673
ＴＣ００３３とＴＣ００７１のどちらのドナーにおいても、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレートでは、細胞増殖率が高かった。
（２）細胞表面マーカーの解析
実施例４−（１）で得られた１０日目の細胞集団の細胞表面マーカーを、実施例３−（２）と同様の方法で測定した。結果を表４に示す。なお、全細胞中のＣＤ３陽性率はすべての試験区で９４％以上であった。
Figure 2019146673
ＴＣ００３３とＴＣ００７１のどちらのドナーにおいても、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレートでは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋率が高かった。ＣＤ３＋ＣＤ４＋は、一般的にヘルパーＴ細胞を表す。表３と表４の結果より、ドナーに関わらず、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上では、ヘルパーＴ細胞が効率的に増殖することが示された。
実施例５ ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞（ナイーブ細胞）比率の測定
（１）細胞集団の拡大培養
健常人ドナー（ＴＣ００３３及びＴＣ００７１）から調製したＰＢＭＣを、終濃度２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を添加したＧＴ−Ｔ５５１ＣＭに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。上記細胞を、２．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルでプレートにＮ＝２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した（０日目）。０日〜４日目までの培養には、抗ヒトＣＤ３抗体と、ＦＣＨ−２９６ポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ付き、配列番号２０）又は９アミノ酸をＮ末に挿入したＦＣＨ−２９６ポリペプチド（配列番号３１）をコーティングしたプレートを用いた。細胞継代は４日目及び７日目に行った。４日目には、コーティングをしていない１２穴細胞培養プレートに２．６１２ｍＬ／ウェルのＧＴ−Ｔ５５１ＣＭと０．３５８ｍＬ／ウェルの細胞懸濁液を混合して培養を継続した。７日目には、コーティングをしていない１２穴細胞培養プレートに１．４８５ｍＬ／ウェルのＧＴ−Ｔ５５１ＣＭと１．４８５ｍＬ／ウェルの細胞懸濁液を混合して培養を継続した。陰性対照には、培養０日目から、コーティングをしていないプレートを用いた。なお、９アミノ酸をＮ末に挿入したＦＣＨ−２９６ポリペプチドは、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）等の通常のカラムを用いて常法により調製した。
（２）細胞表面マーカーの解析
１０日目の細胞集団の細胞表面マーカーを、実施例３−（２）と同様の方法で測定した。結果を表５に示す。なお、全細胞中のＣＤ３陽性率はすべての試験区で９４％以上であった。
Figure 2019146673
ＴＣ００３３とＴＣ００７１のどちらのドナーにおいても、ＦＣＨ−２９６ポリペプチド又は９アミノ酸をＮ末に挿入したＦＣＨ−２９６ポリペプチド（表５中、「Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６」）でコートされたプレートでは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋率が高かった。
（３）ナイーブ細胞比率の解析
実施例５−（１）で得られた１０日目の細胞集団を、０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）で洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞集団を懸濁し、ＲＤ−１標識ＩｇＧ１マウス抗ヒト２Ｈ４（ＣＤ４５ＲＡ）抗体（ベックマンコールター社製）及びＦＩＴＣ標識ＩｇＧ２Ａマウス抗ヒトＣＣＲ７抗体（Ｒ＆Ｄ社製）、を添加し抗体反応を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞集団を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞集団をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団のナイーブ細胞比率（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）を算出した。測定の結果を図２に示す。
ＴＣ００３３とＴＣ００７１のどちらのドナーにおいても、ＦＣＨ−２９６又は「Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６」でコートされたプレートでは、ナイーブ細胞比率（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）が高かった。
実施例６ 様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６の評価
様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６を調製した。すなわち、Ｎ末９アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２５）、Ｎ末６アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２６）、Ｎ末５アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２７）、Ｎ末３アミノ酸欠失のＦＣＨ−２９６（配列番号２８）、ＦＣＨ−２９６（配列番号１９）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３０）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３２）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３３）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３４）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３５）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３６）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３７）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３８）、及びＮ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３９）を調製した。
ＦＣＨ−２９６（Ｈｉｓ−ｔａｇ付き、配列番号２０）及びＮ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３１）に代えて、上記の様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６のいずれかを使用して、実施例２〜５に記載された内容を実施する。様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６は、ＦＣＨ−２９６（Ｈｉｓ−ｔａｇ付き、配列番号２０）及びＮ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３１）と同様の効果を有する。
本発明により、短期間に大量のリンパ球を製造する方法が提供される。
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-1
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-2
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-3
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-4
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-5
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-6
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-7
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named III-8
SEQ ID NO:9 ; Partial region of fibronectin named III-9
SEQ ID NO:10 ; Partial region of fibronectin named III-10
SEQ ID NO:11 ; Partial region of fibronectin named III-11
SEQ ID NO:12 ; Partial region of fibronectin named III-12
SEQ ID NO:13 ; Partial region of fibronectin named III-13
SEQ ID NO:14 ; Partial region of fibronectin named III-14
SEQ ID NO:15 ; Partial region of fibronectin named CS-1
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named 120k-fr
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CH-271
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CH-296 (RetroNectin)
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named FCH-296
SEQ ID NO:20 ; His-tag FCH-296
SEQ ID NO:21 ; N-terminal 9a.a. deletion of III-1
SEQ ID NO:22 ; N-terminal 6a.a. deletion of III-1
SEQ ID NO:23 ; N-terminal 5a.a. deletion of III-1
SEQ ID NO:24 ; N-terminal 3a.a. deletion of III-1
SEQ ID NO:25 ; N-terminal 9a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:26 ; N-terminal 6a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:27 ; N-terminal 5a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:28 ; N-terminal 3a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:29 ; N-terminal 3a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:30 ; N-terminal 6a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:31 ; N-terminal 9a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:32 ; N-terminal 11a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:33 ; N-terminal 12a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:34 ; N-terminal 14a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:35 ; N-terminal 15a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:36 ; N-terminal HKRHEEGH insertion of FCH-296
SEQ ID NO:37 ; N-terminal HKRH insertion of FCH-296
SEQ ID NO:38 ; N-terminal HH insertion of FCH-296
SEQ ID NO:39 ; N-terminal HHH insertion of FCH-296

Claims (9)

  1. リンパ球を、
    （ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜３リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜３リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
    （ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
    （ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、の存在下で培養する工程を包含する、リンパ球の製造方法。
  2. リンパ球を、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組換えポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドの存在下で培養する工程を包含する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 組換えポリペプチドが、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項２に記載の製造方法。
  4. 組換えポリペプチドが、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号３１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項２に記載の製造方法。
  5. 組換えポリペプチドと抗ＣＤ３抗体の共存下でリンパ球の培養が実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 組換えポリペプチドの存在下でリンパ球を培養する工程が、組換えポリペプチドがコートされた固相とリンパ球とが接触した状態で実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 固相が、細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、請求項６に記載の製造方法。
  8. 固相が、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、請求項６に記載の製造方法。
  9. リンパ球が、ヒト由来のリンパ球である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
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