JP2013176403A

JP2013176403A - γδＴ細胞集団の製造方法

Info

Publication number: JP2013176403A
Application number: JP2013134928A
Authority: JP
Inventors: Mitsuko Ideno; 美津子出野; Fumiyo Sakai; 文代酒井; Ryuji Enoki; 竜嗣榎; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2013-06-27
Publication date: 2013-09-09
Also published as: WO2008111430A1; JPWO2008111430A1; TW200844235A; US20110158954A1

Abstract

【課題】γδＴ細胞集団の製造方法を提供すること。
【解決手段】γδＴ細胞を含有する細胞集団を、（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物、および（ｂ）γδＴ細胞活性化因子の存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、γδＴ細胞集団の製造方法。当該方法により得られるγδＴ細胞は、例えば、免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【選択図】なし

Description

本発明は、医療分野において有用なγδＴ細胞集団を製造する方法に関する。

生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。

Ｔ細胞は、αβＴ細胞とγδＴ細胞の２つのサブグループに分類される。αβＴ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ＩまたはＩＩ分子に結合する抗原ペプチドを認識するαβＴ細胞レセプターを有し、これらはＴ細胞の約９０から９８％を占めるといわれている。一方、γδＴ細胞は、γδＴ細胞レセプターを有し、これらはＴ細胞の３〜５％を占めると言われている。

γδＴ細胞は、細菌およびウイルス感染に対する防御ならびに自己免疫において重要な役割を果たし、感染性疾患（例えば、結核、サルモネラ症、マラリア等）に感染した際に増殖することが知られている。γδＴ細胞は抗原提示細胞によるＭＨＣ分子の提示なしに、抗原との直接の相互作用によって、それらの抗原性リガンドを認識することが知られている。すなわち、γδＴ細胞は活性化されると強力なＭＨＣ非拘束型の細胞傷害活性を発揮し、特に各種タイプの細胞の殺傷、とりわけ病原性細胞の殺傷に効果的である。

癌の病態において、外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４の治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導した末梢血リンパ球やＴ細胞等から種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、さらにこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。

γδＴ細胞をｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで製造する方法については、これまでにもいくつかの報告があり、例えばインターロイキン−１２およびＣＤ２リガンド存在下でのリンパ系細胞の第一培養、およびＴ細胞マイトジェン、インターロイキン−２存在下での第二培養を含む方法が開示されている（例えば、特許文献１）。また、γδＴ細胞を活性化する化合物についても種々検討されており、例えばホスホハロヒドリン類やホスホエポキシド類、ビスホスホネート化合物、イソペンテニルピロリン酸等が知られている（例えば、特許文献２〜４、非特許文献１）。

フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型は７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙｌａｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する（例えば、非特許文献２〜４）。

免疫療法の中で、体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等からＩＬ−２と抗ＣＤ３抗体の作用により拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞を移入する療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるか等の問題については、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することによる効果が、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献５〜７）。

ＫｕｎｚｍａｎｎＶ．他５名，Ｂｌｏｏｄ，２０００年，Ｖｏｌ．９６，Ｎｏ．２，ｐ３８４−３９２ＤｅａｎｅＦ．Ｍｏｍｅｒ著，１９８８年発行，ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，ＡＣＡＤＥＭＩＣＰＲＥＳＳＩＮＣ．，Ｐ１〜８ＫｉｍｉｚｕｋａＦ．他８名，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４−２９１ＨａｎｅｎｂｅｒｇＨ．他５名，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１９９７年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１８，ｐ２１９３−２２０６

国際公開第９９／４６３６５号パンフレット国際公開第００／１２５１６号パンフレット国際公開第００／１２５１９号パンフレット米国特許第５，６３９，６５３号国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット

本発明の目的は、生体への投与に有効なγδＴ細胞集団の製造方法を提供することにある。

本発明の第１の発明は、γδＴ細胞を含有する細胞集団を、（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物、および（ｂ）γδＴ細胞活性化因子の存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、γδＴ細胞集団の製造方法に関する。本発明の第１の発明において、フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物の存在下で培養する工程とは、ＩＬ−２の存在下で実施されることが例示される。また、フィブロネクチンフラグメントとしては、配列表の配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）であるか、または前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）が例示される。また、フィブロネクチンフラグメントとしては、配列表の配列番号５〜８で表されるアミノ酸配列のいずれをも含むポリペプチドが例示される。また、フィブロネクチンフラグメントとしては、配列表の配列番号９〜２２いずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。また、本発明の第１の発明において、γδＴ細胞活性化因子としては、ビスフォスフォン酸系化合物、および／またはピロリン酸モノエステル系化合物が例示され、ビスフォスフォン酸系化合物としては、パミドロネート、アレンドロネート、ゾレドロネート、リセドロネート、ネリドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、オルバドロネート、ソルバドロネート、ミノドロネート、ＥＢ１０５３、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネートおよびメドロネートからなる群より選択される少なくとも１つの化合物が、またピロリン酸モノエステル系化合物としては、イソペンテニルピロリン酸、２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸および４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル−１−ピロリン酸からなる群より選択される少なくとも１つの化合物が例示される。また、本発明の第１の発明は、さらに細胞集団に外来遺伝子を導入する工程を包含するγδＴ細胞集団の製造方法が例示される。当該外来遺伝子はレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターを用いて導入することが出来る。

本発明の第２の発明は、本発明の第１の方法により得られるγδＴ細胞集団に関する。

本発明の第３の発明は、本発明の第１の方法により得られるγδＴ細胞集団を有効成分として含有する医薬に関する。

本発明の第４の発明は、被験体に、有効量の本発明の第１の方法により得られるγδＴ細胞集団を投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法に関する。

本発明の第５の発明は、医薬の製造のための、本発明の第１の方法により得られるγδＴ細胞集団の使用に関する。

本発明の第６の発明は、養子免疫療法における使用のための本発明の第１の方法により得られるγδＴ細胞集団に関する。

本発明により、拡大培養率が高いγδＴ細胞集団の製造方法が提供される。当該製造方法により得られるγδＴ細胞集団は、高い細胞傷害活性を有することから、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。

フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製法を示す図である。

本発明は、（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物、および（ｂ）γδＴ細胞活性化因子の存在下でγδＴ細胞を含有する細胞集団を培養することにより、極めて拡大培養率が高く、さらに高い細胞傷害活性を有するγδＴ細胞集団が得られることを見出し、完成するに至ったものである。

なお、本明細書において、本発明の製造方法により得られるγδＴ細胞集団とは、γδＴ細胞を高比率に含むＴ細胞集団を意味する。また、ここで高比率とは、本発明の製造方法に供されるγδＴ細胞を含有する細胞集団と比較してγδＴ細胞比率が高いことを意味する。

以下、本発明を具体的に説明する。

（１）本発明に使用されるフィブロネクチンおよびフィブロネクチンフラグメント
本明細書中に記載のフィブロネクチンは、天然から得られたもの、または人為的に合成されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンは、例えば、ルオスラーティＥ．ら〔ＲｕｏｓｌａｈｔｉＥ．，ｅｔａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。

なお、フィブロネクチンは多くのスプライシングバリアントの存在が知られているが、本発明に使用されるフィブロネクチンとしては、本発明の所望の効果を発現するものであれば、いずれのバリアントも使用することができる。例えば、血漿由来のフィブロネクチンの場合、細胞結合ドメインの上流に存在するＥＤ−Ｂと呼ばれる領域、細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインの間に存在するＥＤ−Ａと呼ばれる領域が欠失していることが知られているが、このような血漿由来のフィブロネクチンも本発明に使用することができる。上記のフィブロネクチンは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。

本発明において、フィブロネクチンフラグメントとは、フィブロネクチンのアミノ酸配列の一部（例えば、３アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは２０アミノ酸以上）を含む人為的に製造されたフラグメント（改変型フィブロネクチンフラグメントともいう）を意味する。当該フィブロネクチンフラグメントには、当該フィブロネクチンのアミノ酸配列の一部が、１個もしくは数個含まれていれば特に限定はなく、天然型フィブロネクチンの一部の断片そのものや、当該断片とフィブロネクチン以外に由来するアミノ酸配列を含むフラグメントが包含される。なお、本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカＦ．ら〔ＫｉｍｉｚｕｋａＦ．ｅｔａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリットＡ．Ｒ．ら〔ＫｏｒｎｂｒｉｈｔｔＡ．Ｒ．，ｅｔａｌ．、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯＪ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチＫ．ら〔ＳｅｋｉｇｕｃｈｉＫ．，ｅｔａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等より得ることができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。

本発明において、フィブロネクチンフラグメントとしては、例えば、ＩＩＩ−８（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−９（配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１０（配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１１（配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）、およびＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）（第１図参照）や、前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）が例示される。フラグメントの長さとしては、例えば、アミノ酸残基数として２０〜１０００が好ましく、１００〜８００がより好ましい。なお、本明細書において、複数個とは数個を含む概念であり、２〜１２個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜８個がさらに好ましく、以下においても同様である。

また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズＤ．Ａ．らの方法〔ＷｉｌｌｉａｍｓＤ．Ａ．，ｅｔａｌ．、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズＤ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。

さらにフィブロネクチンフラグメントとしては、Ｃ−２７４（配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２７１（配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号１１で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２７１（配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列）、Ｃ−ＣＳ１（配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列）、およびＣＨ−２９６Ｎａ（配列表の配列番号１５で表されるアミノ酸配列）からなる群より選択されるポリペプチドが例示される。

上記のＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６Ｎａ、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６ＮａはＶＬＡ−４に結合する活性を有するＣＳ−１を有するポリペプチドである。さらに、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６およびＣＨ−２９６Ｎａはヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。なお、ＣＨ−２９６Ｎａは血漿由来のフィブロネクチンにおける細胞結合ドメインからＣＳ−１までを含むポリペプチドである。

本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは３つのＩＩＩ型配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型配列のうちの一つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合領域、Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）と一つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列表の配列番号１６で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９０（配列表の配列番号１７で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９２（配列表の配列番号１８で表されるアミノ酸配列）、あるいは二つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列表の配列番号１９で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−１８１（配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３をそれぞれ含んでいる。

また、上記の各フラグメントにさらにアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用することができる。当該フラグメントは、例えば、上記各フラグメントに所望のアミノ酸を付加することにより製造可能である。例えば、Ｈ−２７５−Ｃｙｓ（配列表の配列番号２１で表されるアミノ酸配列）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。

また、フィブロネクチンフラグメントとしては、配列表の配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を重複して含むポリペプチドを使用することもできる。例えば、前述のヘパリン結合ドメイン及びＣＳ−１ドメインを重複して含むポリペプチドであるＨ２９６−Ｈ２９６（配列表の配列番号２２で表されるアミノ酸配列）が好適に使用される。

なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。

アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。

なお、本発明に使用されるフラグメントを遺伝子工学的に取得した場合、例えば大腸菌などを宿主として製造する場合は、大腸菌由来のメチオニンペプチダーゼ等の影響により、Ｎ末端のメチオニンが欠失される場合があるが、このようなポリペプチドも本発明において使用することができる。すなわち、配列表の配列番号１５および２１に記載のポリペプチドのＮ末端のメチオニンが欠失したポリペプチドも本発明においては好適に使用できる。

アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよく、また、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、天然のフィブロネクチン由来の前記領域や所定のフラグメントをコードする核酸において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し、それを使用して、天然のフィブロネクチン由来の前記領域や所定のフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメント等を構成するポリペプチドのアミノ酸配列に置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。

また、本明細書において「同等な機能を有する」とは、上記のフィブロネクチン、またはフィブロネクチンフラグメントを使用して得られる、γδＴ細胞集団の拡大培養率、もしくは得られるγδＴ細胞の細胞傷害活性が、比較対照の上記のフィブロネクチン、またはフィブロネクチンフラグメントの非存在下で得られるγδＴ細胞集団よりも高いことをいう。前記作用は後述の実施例１〜７に記載の方法等に準じて適宜確認することができる。また、アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適であり、ＣＳ−１ドメインを有するものも好適である。細胞接着活性およびヘパリン結合活性は、それらの前記活性測定方法に準じて評価することができる。

アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとして、例えば、２つの異なるドメイン間にリンカーとして１以上のアミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明に使用することができる。

また、本発明に使用されるフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンやそのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するポリペプチド、好ましくは７０％以上の同一性を有するポリペプチド、より好ましくは９０％以上の同一性を有するポリペプチド、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するペプチドが使用できる。なお、同一性の算出には、例えばＤＮＡＳＩＳＰｒｏＶｅｒ．２．６（タカラバイオ（株）製）を用いることができる。

なお、本発明において、最も好適に使用されるフィブロネクチンフラグメントとしては、アミノ酸配列中に少なくともＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）およびＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）のすべてを含む、すなわちヘパリン結合ドメインとＣＳ−１ドメインの両方を含むポリペプチドが挙げられ、さらに好適には前述のＣＨ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６もしくはそれらと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。

本明細書中に記載のフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて遺伝子組換え体より製造することもできる。例えば、上記のＨ−２７１（配列番号１０）、Ｈ−２９６（配列番号１１）、ＣＨ−２７１（配列番号１２）、ＣＨ−２９６（配列番号１３）の各フラグメントならびにこれらを取得する方法は当該特許明細書に詳細に記載されている。また、ＣＨ−２９６Ｎａ（配列番号１５）とその製造方法については国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレットに記載されている。また、上記のＣ−２７４（配列番号９）フラグメントは米国特許第５，１０２，９８８号明細書に記載された方法により得ることができる。さらに、Ｃ−ＣＳ１（配列番号１４）フラグメントは日本特許第３１０４１７８号明細書に記載された方法により得ることができる。上記ＣＨＶ−８９（配列番号１６）、ＣＨＶ−９０（配列番号１７）、ＣＨＶ−１７９（配列番号１９）の各フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書に記載された方法により得ることができる。また、ＣＨＶ−１８１（配列番号２０）フラグメントは国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載された方法に準じて得ることができる。ＣＨＶ−９２（配列番号１８）フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書および国際公開第９７／１８３１８号パンフレットを参照し、それらの文献に記載されたプラスミドに基づいて定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子工学的に取得することができる。また、Ｈ２９６−Ｈ２９６（配列番号２２）フラグメントは、これらの文献の情報をもとに、定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いた遺伝子工学的に取得することができる。

これらのフラグメントまたはこれらのフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託された微生物を用いて製造する、あるいは各微生物の保持するプラスミドを公知の方法により改変することにより製造することもできる；
ＦＥＲＭＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９８９年１月３０日）、
ＦＥＲＭＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭＢＰ−２７９９（ＣＨ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭＢＰ−７４２０（Ｈ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭＢＰ−１９１５（Ｃ−２７４をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９８８年６月１７日）、
ＦＥＲＭＢＰ−５７２３（Ｃ−ＣＳ１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９９０年３月５日）、
ＦＥＲＭＢＰ−１００７３（ＣＨ−２９６Ｎａをコードするプラスミド；寄託日２００４年７月２３日）
ＦＥＲＭＰ−１２１８２（ＣＨＶ−８９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９９１年４月８日）、
ＦＥＲＭＰ−１２１８３（ＣＨＶ−１７９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日１９９１年４月８日）。
ＦＥＲＭＰ−２０６０２（Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸を含有するプラスミド；寄託日２００５年７月２２日）。

フィブロネクチンは巨大な糖タンパク質であるため、天然起源のタンパク質を調製して使用することは産業上および医薬品製造上、必ずしも容易ではない。また、フィブロネクチンは多機能タンパク質であることから、その使用の状況によっては、本発明の方法に効果を示す領域とは異なる領域に起因する不都合が起こることも考えられる。これらのことから、本発明においては、入手、取り扱いの容易さ、安全面の観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメントを使用することが好ましい。また、高い拡大培養率を実現するという観点からも、前述のフィブロネクチンフラグメントを使用することが好ましい。また、本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量としては、特に限定はないが、例えば１〜２３０ｋＤ、好適には１〜２００ｋＤ、より好適には５〜１９０ｋＤ、さらに好適には５〜１８０ｋＤ、さらにより好適には１０〜１８０ｋＤである。当該分子量は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。

なお、本発明のフィブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列において、フィブロネクチン由来のポリペプチドのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列部分は、本発明の所望の効果の発現を阻害しない限り任意であり、特に限定されるものではない。

（２）γδＴ細胞集団の製造方法
以下、本発明のγδＴ細胞集団の製造方法について具体的に説明する。本発明はγδＴ細胞を高比率に含有する細胞集団を製造する方法である。本発明の方法は、前述の（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物（以下、（ａ）成分と称することがある）、および（ｂ）γδＴ細胞活性化因子（以下、（ｂ）成分と称することがある）の存在下でγδＴ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含有することを特徴とする。本発明の製造方法はγδＴ細胞の拡大培養率が高く、また当該方法により得られるγδＴ細胞集団は、高い細胞傷害活性を有するという、極めて有用な性質を有する。なお、本願明細書において「それらの混合物」とは、フィブロネクチン及び前記したフィブロネクチンフラグメントからなる群より選択される２種以上の混合物を意味し、フィブロネクチン及び１種以上の前記フィブロネクチンフラグメントの混合物、もしくは２種以上の前記フィブロネクチンフラグメントの混合物を意味する。

本発明の製造方法に使用される、γδＴ細胞を含有する細胞集団としては、ＰＢＭＣ、造血幹細胞、臍帯血単核球等が例示される。なお、本願明細書においてＰＢＭＣとは、末梢血由来単核球を意味し、例えば、採血によって得られた血液や、成分採血によって得られた成分採血液から比重遠心などの方法により分離・取得することができる。ただし、ＰＢＭＣの取得に際しては、特に限定されるものではなく組織液、骨髄液などに含まれる前躯細胞等も利用できる。また、前記γδＴ細胞を含む細胞集団としては、γδＴ細胞を含む血球系細胞であれば本発明に使用でき、例えば、末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。また、γδＴ細胞集団を含む細胞集団としては、生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の方法により得られたγδＴ細胞集団をそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。また、例えば生体から得られたＰＢＭＣ、造血幹細胞、臍帯血単核球等から種々の分離操作を経て得られたγδＴ細胞や、後述のγδＴ細胞活性化因子による刺激を付与することによってγδＴ細胞比率が高められたＴ細胞集団を使用することもできる。なお、本発明においては、γδＴ細胞を構成細胞の一部として含む細胞集団を使用することにより、γδＴ細胞の高比率な拡大培養を実施できることから、本発明に使用されるγδＴ細胞を含有する細胞集団としては、前記のＰＢＭＣ、造血幹細胞、臍帯血単核球が好ましい。

本発明において、γδＴ細胞活性化因子としては、γδＴ細胞を活性化、もしくは増殖する作用を有する公知のものが使用できる。特に限定はないが、例えば、パミドロネート、アレンドロネート、ゾレドロネート、リセドロネート、ネリドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、オルバドロネート、ソルバドロネート、ミノドロネート、ＥＢ１０５３、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、メドロネート等のビスホスフォン酸系化合物、イソペンテニルピロリン酸、２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル−１−ピロリン酸等のピロリン酸モノエステル系化合物、３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＢｒＨＰＰ）、３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＩＨＰＰ）、３−（クロロメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＣｌＨＰＰ）、３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−３リン酸（ＢｒＨＰＰＰ）、３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−３リン酸（ＩＨＰＰＰ）、α，γ−ジ−［３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル］−３リン酸（ｄｉＢｒＨＴＰ）、α，γ−ジ−［３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル］−３リン酸（ｄｉＩＨＴＰ）等のホスホハロヒドリン類、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−２リン酸（Ｅｐｏｘ−ＰＰ）、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−３リン酸（Ｅｐｏｘ−ＰＰＰ）、α，γ−ジ−３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−３リン酸（ｄｉ−Ｅｐｏｘ−ＴＰ）等のホスホエポキシド類、１−ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）プロピリデン−バイホスホン酸等のアミノバイホスホネート系化合物、またｐａｎ−δモノクローナル抗体等のγδ型のＴ細胞レセプター（γδＴＣＲ）に結合活性を有する抗体等が例示される。

本発明のγδＴ細胞集団の製造方法において、製造されるγδＴ細胞集団を得るための総培養日数としては、例えば２〜６０日間、好適には４〜４０日間、より好適には６〜３０日間とすることが好ましい。また、本発明のγδＴ細胞集団の製造方法において実施される、上記（ａ）成分、および（ｂ）成分の存在下でのγδＴ細胞集団を含む細胞集団の培養は、特に好適には全培養期間中の少なくとも初期段階において上記（ａ）成分、および（ｂ）成分の存在下に培養を実施することが好適であり、より好適には少なくとも培養開始時に本発明の有効成分の存在下での培養を実施していることが好ましい。なお、本発明の有効成分の存在下での培養は培養期間中の全期間であってもよく、また任意の一部の期間であってもよい。すなわち、γδＴ細胞の製造工程の一部に前記工程を含むものであれば本発明に包含される。好適には（ａ）成分、および（ｂ）成分の存在下での培養を、培養開始時から少なくとも６時間以上、より好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上実施することが好ましい。また、本発明のγδＴ細胞の製造方法における、これらの（ａ）成分および（ｂ）成分の存在下での培養工程以外の培養は、上記（ａ）成分もしくは（ｂ）成分のいずれかの存在下、または上記（ａ）成分および（ｂ）成分の非存在下で実施することもできる。例えば上記（ａ）成分および（ｂ）成分の存在下での２〜７日間の培養工程により得られた細胞集団を、（ａ）成分もしくは（ｂ）成分の存在下、または上記（ａ）成分および（ｂ）成分の非存在下でさらに４〜１４日間培養することができる。

本発明において、（ａ）成分の培養中の濃度としては、特に限定はなく、例えば０．０００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．００１〜５００μｇ／ｍＬが好適である。なお、当該培養中の（ａ）成分の濃度とは、培地中に溶解させるか、もしくは適当な担体に固定化して培地中に存在させた際の濃度を意味する。

本発明において、（ｂ）成分の培養中の濃度としては、使用されるγδＴ細胞活性化因子により適宜設定でき、特に限定されるものではないが、例えば０．００１〜１０００μＭ、好適には０．００５〜１００μＭ、特に好適には０．０１〜５０μＭが例示される。

本発明のγδＴ細胞集団の製造方法において使用される培地は、特に限定はなく、γδＴ細胞の拡大培養に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外にサイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分を含んでいてもよい。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１５等が例示され、好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２（サイトカイン類一般）の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０⁵Ｕ／ｍＬ、より好適には０．１〜１×１０⁴Ｕ／ｍＬである。また、適当なタンパク質としては、ＣＤ３リガンドやＣＤ２８リガンド、例えば抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ２８抗体が例示される。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。しかしながら、本発明においては、後述の実施例にも記載のとおり、抗ＣＤ３抗体の非存在下でも高いγδＴ細胞比率で拡大培養を実現することができる。すなわち、本発明において、好ましくは抗ＣＤ３抗体非存在下での培養が実施される。また、その他の成分としては、Ｔ細胞の活性化に寄与する各種マイトジェン等が例示される。

さらに、培養においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０％（ｖ／ｖ）超〜２０％（ｖ／ｖ）が例示され、また培養段階に応じて使用する血清や血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。また、培地中に血清や血漿を添加せずに培養を実施することもできる。

本発明のγδＴ細胞集団の製造は、通常、上記の（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物、および（ｂ）γδＴ細胞活性化因子の存在下に、所定の成分を含む培地中で行なわれる。本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０⁸ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜２×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃で、ＣＯ₂等の存在下で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交換することができる。

本発明のγδＴ細胞集団の製造方法において使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ₂ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のγδＴ細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるγδＴ細胞集団の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。

なお、上記のフィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物、γδＴ細胞活性化因子、サイトカイン類、適当なタンパク質やその他成分は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、その固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。

上記成分の固相への固定化方法としては、特に限定はないが、例えば、適当な緩衝液の中でこれらの物質を固相と接触させることにより固定化することができる。例えば、フィブロネクチンフラグメントの固相への固定化については、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法によっても固定化を実施することができる。

前記の種々の成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法によりγδＴ細胞集団を得た後、該Ｔ細胞集団と固相とを分離するのみで、有効成分等と該Ｔ細胞集団とを容易に分離することができ、該Ｔ細胞集団への有効成分等の混入を防ぐことができる。

また、本発明の製造方法により得られたγδＴ細胞集団を用いて、さらにγδＴ細胞を高比率に含有するγδＴ細胞集団、もしくはγδＴ細胞のみを分離することもできる。分離操作としては、特に限定はないが、例えばセルソーター、磁気ビーズ、カラム等を用いて公知の手法で分離することが出来る。

また、本発明の方法により製造されたγδＴ細胞をクローン化することにより、安定したγδＴ細胞として維持することもできる。また、本発明の方法により得られたγδＴ細胞集団を用いて、さらに本発明の方法や公知の方法により培養することで新たにγδＴ細胞集団を得ることもできる。

本発明の方法により製造されるγδＴ細胞集団の投与により効果を示す疾患、すなわち本発明の方法により製造されるγδＴ細胞集団に感受性を示す疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、白血病、悪性腫瘍、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶ等のウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。また、後述のようにさらに遺伝子治療用の外来遺伝子を導入した場合は、目的の各種遺伝子疾患等に対しても効果を示す。また、本発明の方法により製造されるγδＴ細胞集団は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。

さらに本発明は、上記の本発明の製造方法で得られたγδＴ細胞集団を提供する。また、本発明は、当該Ｔ細胞集団を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。当該Ｔ細胞集団を含有する前記医薬は免疫療法への使用に適しており、例えば養子免疫療法又はドナーリンパ球輸注用の医薬として使用できる。免疫療法においては、患者の治療に適したγδＴ細胞集団が、例えば注射や点滴による静脈、動脈、皮下、腹腔内等の投与方法によって患者に投与される。当該医薬は前述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該医薬は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該Ｔ細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合し、点滴剤、注射剤等として調製できる。なお、医薬における本発明のγδＴ細胞集団の含有量、医薬の投与量、当該医薬に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜、決定できる。例えば、医薬における本発明のγδＴ細胞集団の含有量としては、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０³〜１×１０¹¹ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０^４〜１×１０¹⁰ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０⁵〜１×１０⁹ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量としては、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０⁵〜１×１０¹²ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０⁶〜５×１０¹¹ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０⁶〜１×１０¹¹ｃｅｌｌｓ／日が例示される。さらに、当該医薬による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療や放射線治療、外科的手術による治療との併用を行なうこともできる。また、当該医薬の投与には、前述のγδＴ細胞活性化因子を同時に投与することにより、生体に投与されたγδＴ細胞のより高い治療効果が期待できる。なお、本発明の別の態様として、本発明の製造方法により得られたγδＴ細胞集団および前述のγδＴ細胞活性化因子のいずれをも含む医薬キットが提供される。

本発明のγδＴ細胞集団の製造方法において、当該Ｔ細胞に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含することができる。すなわち、本発明は、その一態様として、当該Ｔ細胞集団に外来遺伝子を導入する工程をさらに含むγδＴ細胞集団の製造方法を提供する。なお、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入対象のγδＴ細胞に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、遺伝子導入対象のγδＴ細胞と同種由来のものも包含される。

本発明の製造方法を行うことにより、培養されるγδＴ細胞の増殖能が増強されるが、本発明のγδＴ細胞の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。

外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、γδＴ細胞集団の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記Ｔ細胞集団の製造と同時もしくは途中で、あるいは該工程の後に実施するのが、作業効率の観点から好適である。

前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。

前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。

レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における製造の工程において遺伝子導入を行うのに好適である。

ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡやＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。

本発明においてγδＴ細胞集団に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。

前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のＴ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々同一性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。

導入する遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子や、標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲ複合体の部分領域（ＣＤ３やその部分領域等）を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。ここでＴＣＲとしては対象となる疾患に応じてαβ型、γδ型にかかわらず、適切なＴＣＲを選択することができる。

また、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をγδＴ細胞に導入して該Ｔ細胞に薬剤耐性を付与することができる。そのようなγδＴ細胞を用いれば、免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ）が例示される。

一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をγδＴ細胞集団に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のＴ細胞を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。

本発明はまた、被験体に、有効量の前述の方法により得られるγδＴ細胞集団を投与することを含む、疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において被験体とは、特に限定はないが、好ましくは本発明の方法により製造されるＴ細胞集団を投与される前述に記載するような疾患、すなわち当該Ｔ細胞集団に感受性を示す疾患の患者を示す。また、当該治療方法としては養子免疫療法又はドナーリンパ球輸注療法が例示される。なお、当該Ｔ細胞集団とともに、前述のγδＴ細胞活性化因子を患者に投与することもできる。

また、本明細書中において有効量とは、前述の方法により得られるγδＴ細胞集団を上記被験体に投与した場合に、該Ｔ細胞集団を投与していない被験体と比較して、治療もしくは予防効果を発揮する該Ｔ細胞集団の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的および被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬の投与量と同様にすればよい。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴や注射等により投与すればよい。

また、本発明は、医薬の製造のための前述の方法により得られるγδＴ細胞集団の使用も提供される。当該医薬の製造方法は前述の医薬と同様に行われる。また、当該医薬の投与される疾患についても、特に限定はないが、前述の医薬と同様である。また、当該医薬としては、養子免疫療法用又はドナーリンパ球輸注用の医薬が例示される。

また、本発明は、養子免疫療法又はドナーリンパ球輸注への使用のための前記γδＴ細胞集団の使用も提供される。本使用における前記γδＴ細胞集団の使用量には限定はないが、例えば、医薬における前記γδＴ細胞集団の含有量として例示される量が挙げられる。

以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
調製例１ＣＨ−２９６の調製
ＣＨ−２９６（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭＢＰ−２８００）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。

調製例２Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製
本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル第３版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３ｒｄｅｄ．）に記載の方法によった。

（１）発現ベクターの構築
（ｉ）Ｈ−２９６発現ベクターの構築
配列表の配列番号１３記載のＣＨ−２９６のアミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸２７８〜５７４（塩基番号８３５〜１７２５）よりなるポリペプチドをＨ−２９６とし、このＨ−２９６が２つ連結した変異体タンパク質（Ｈ２９６−Ｈ２９６）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。以下、図２を参照。

まず、配列表の配列番号１３記載のＣＨ−２９６の塩基配列（国際公開第０３／０８０８１７パンフレット参照）より、配列表の配列番号２３及び２４に記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ及びＨ２９６−ＨｉｎｄＲをＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｅｘｐｅｓｉｔｅ８９０９（型番））で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号２７８〜２８３に相当する塩基配列を塩基番号１３〜３０にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７０〜５７４に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３４にもつ合成ＤＮＡである。

上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２約０．１μｇ、５μＬの１０×ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μＬのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。

反応終了後、該反応液５μＬを１．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動によりそのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。

次に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターを調製した（これ以降、このｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターをｐＣｏｌｄ１４ベクターとする）。

次に上記ｐＣｏｌｄ１４ベクターを上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。

目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。

（ｉｉ）Ｈ２９６−Ｈ２９６発現ベクターの構築
次に、国際公開第０３／０８０８１７パンフレットで公開されている塩基配列より、配列表の配列番号２５記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７４〜５６９に相当する塩基配列を塩基番号１７〜３４にもつ合成ＤＮＡである。上記合成プライマーと配列表の配列番号２６記載のＮＣ２ベクターの５’ＵＴＲ部分にアニ−リングするプライマー（ＮＣ２−５’ＵＴＲ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。

すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６約０．１μｇ、１０μＬの１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μＬのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、２０ｐｍｏｌのＮＣ２−５’ＵＴＲ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲ、５ＵのｐｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９６℃ １分、６８℃ ４分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。

反応終了後、該反応液５μＬを１．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をＢｉｏｒａｄカラムにより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを３９μＬの滅菌水に懸濁、全量５０μＬとした反応液で制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）消化し、１．０（ｗ／ｖ）％アガロース電気泳動によりそのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。

次に、（ｉ）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。

目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６とした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６と命名、表示され、２００５年７月２２日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭＰ−２０６０２として寄託されている。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が、間にアミノ酸“Ａ”を挟んで２つ連結した形で含むプラスミドである。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２２に示す。

（２）発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。生育したコロニーを３０ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を３Ｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。なお、この培養の際には、５Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を使用し、１２０ｒｐｍ、Ａｉｒ＝１．０ｌ／ｍｉｎの条件で行なった。前記培養後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、約４０ｍＬの細胞破砕溶液［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ，１ｍＭＰＭＳＦ，５０ｍＭＮａＣｌ］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。これを２ＬのｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭＮａＣｌ］で透析を行い、その約４０ｍＬを用いてさらにイオン交換クロマトによる精製を以下のように行なった。

すなわち、樹脂容積にして１００ｍＬ分のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭＮａＣｌ］で飽和させたカラム（Φ４ｃｍ×２０ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＢ［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ＭＮａＣｌ］で５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。５ｍＬずつ分画を行い、１０％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと記載）により、分子量約６４．６ｋＤａの目的タンパク質を多く含む画分、約１００ｍＬを回収し、２ｌのｂｕｆｆｅｒＡで透析を行なった。

次に、樹脂容積にして５０ｍＬ分のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ３ｃｍ×１６ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＢで５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより目的タンパク質のみを多く含む画分を調べたところ、非吸着画分に多く含まれ、この約１００ｍＬを回収し、２ｌのｂｕｆｆｅｒＤ［５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５］で透析を行なった。

その後、セントリコン−１０（ミリポア社製）で約２０倍の５ｍＬまで濃縮を行い、さらに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約６４．６ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２９６−Ｈ２９６とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアース社製）を使用して、タンパク質濃度を測定したところ、２．１６ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３３．４μＭ）。また、Ｎ末端解析を行なったところ、メチオニンは消化されており、Ｎ末端はＡｌａであった。

実施例１パミドロネートおよびＩｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＰＰ）を用いたγδＴ細胞集団の拡大培養
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血または５０ｍＬ採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＮＥＸＥＬＬ社製またはシグマ社製、以下、ＰＢＳと記載）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）上に重層して６００×ｇで２０分間遠心した。中間層の末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣと記載）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＭＰバイオメディカルズ社製）／１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（シグマ社製）からなる保存液あるいは８％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（製剤名ブミネート：Ｂａｘｔｅｒ社製、以下、ＨＳＡと記載）を含むＣＰ−１（極東製薬社製）とＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）の等量混合液からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。γδＴ細胞拡大培養時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）、１０％（ｖ／ｖ）ｈｕｍａｎＡＢ型血清（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下、１０ＨＲＰＭＩ＋Ｌ−Ｇｌｎと記載）または１０μｇ／ｍＬＤＮａｓｅ、１０％（ｖ／ｖ）ｈｕｍａｎＡＢ型血清を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）（インビトロジェン社製）（以下、１０ＨＩＭＤＭと記載）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。

（２）フィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６およびＨ２９６−Ｈ２９６）の固定化
以下の実験で使用する培養器材にフィブロネクチンフラグメント（以下ＦＮフラグメントと記載）（ＣＨ−２９６およびＨ２９６−Ｈ２９６）を固定化した。すなわち２４穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製またはコーニング社製）にＣＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）またはＨ２９６−Ｈ２９６（終濃度３μｇ／ｍＬ）を含む２．２０％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウム二水和物、０．８０％（ｗ／ｖ）クエン酸一水和物、２．２０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖(全てナカライテスク社製)からなるｐＨ５．０緩衝液（以下ＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）と記載）を２４０μＬずつ添加した。

これらの培養器材を室温で５時間以上インキュベートした。使用直前にはこれらの培養器材からＣＨ−２９６またはＨ２９６−Ｈ２９６を含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。対照としては何も固定化していないプレートを使用した。

（３）γδＴ細胞集団の拡大培養
１０ＨＲＰＭＩ＋Ｌ−Ｇｌｎまたは１０ＨＩＭＤＭに１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、何も固定化していないプレートまたは実施例１−（２）で調製したＣＨ−２９６またはＨ２９６−Ｈ２９６固定化プレートに上記細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。終濃度２０Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２（製剤名プロロイキン：カイロン社製）を添加後、パミドロン酸二ナトリウム（パミドロネート製剤名アレディア注：ＮＯＶＡＲＴＩＳ社製）（終濃度５μＭ）またはＩｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅアンモニウム塩溶液（ＩＰＰ）（シグマ社製）（終濃度５μＭ）を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ₂中３７℃で培養した（培養０日目）。

培養開始４日目には、各ウェルに終濃度２０Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。この際、ＣＨ−２９６またはＨ２９６−Ｈ２９６刺激条件については何も固定化していない新しいプレートに細胞液全量を移し変えた。

培養開始７日目、１１日目には、０．５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用の培地で希釈し、何も固定化していない６穴または１２穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製またはコーニング社製）に移し変えた後、各ウェルに終濃度２０Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目まで培養を継続した。

（４）γδＴＣＲ発現Ｔ細胞比率の解析
実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣおよび実施例１−（３）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてγδＴ細胞比率をフローサイトメトリー（ＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００：ベックマンコールター社製）で解析した。すなわちＰＢＭＣまたは培養開始後１４日目の細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン（シグマ社製、以下、ＢＳＡと記載）を含むＰＢＳ（以下、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトγδＴＣＲ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）およびＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター社製）を添加した。同様に各細胞集団の一部には、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加後、氷上で３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、再度ＰＢＳに懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、γδＴＣＲおよびＣＤ３陽性細胞群をγδＴ細胞としγδＴ細胞の割合を算出した。その結果、γδＴ細胞比率はそれぞれＰＢＭＣが８．９％、培養開始後１４日目の細胞は３０．７〜５２．０％であった。

（５）γδＴ細胞の拡大培養率
実施例１−（３）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、実施例１−（４）で測定したγδＴ細胞比率測定結果を用いて、培養開始時のγδＴ細胞数と比較しての拡大培養率を下記の式に従って算出した。

式（１）：
γδＴ細胞の拡大培養率＝（培養開始１４日目の生細胞数×培養開始１４日目のγδＴ細胞比率）／（培養開始時の生細胞数×培養開始時のγδＴ細胞比率）

その結果を表１に示す。

表１に示されるように、γδＴ細胞拡大培養初期にＣＨ−２９６またはＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のγδＴ細胞拡大培養率が高い結果が得られた。この効果は刺激剤や培養用培地によらず得られた。これらの結果から拡大培養初期にＣＨ−２９６またはＨ２９６−Ｈ２９６を共存させることにより、培養後に得られるγδＴ細胞が多くなることが明らかとなった。

実施例２パミドロネートを用いて培養したγδＴ細胞集団の拡大培養率
（１）γδＴ細胞集団の拡大培養
０．２５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含むＩＭＤＭに２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、何も固定化していないプレートまたは実施例１−（２）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６固定化プレートに上記細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。各ウェルにパミドロネートを終濃度５μＭとなるように添加した。これらのプレートを５％ＣＯ₂中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始２日目には、各ウェルに終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始３日目には、各ウェルから培養上清を半量除去後、２０％（ｖ／ｖ）ｈｕｍａｎＡＢ型血清を含むＩＭＤＭを５００μＬ／ウェルずつ添加し（ｈｕｍａｎＡＢ型血清終濃度１０％（ｖ／ｖ））、さらに終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始５日目には、各群とも０．６から０．９×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０ＨＩＭＤＭにより希釈後、終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始８日目および１１日目には、各群とも１．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０ＨＩＭＤＭにより希釈後、何も固定化していない６穴または１２穴細胞培養プレートに移し変え、各ウェルに終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目まで培養を継続した。

（２）γδＴ細胞比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣおよび実施例２−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてγδＴ細胞比率をフローサイトメトリーで解析した。その結果、γδＴ細胞比率はそれぞれＰＢＭＣが８．９％、培養開始後１４日目の細胞は９６．０〜９６．７％であった。

（３）γδＴ細胞の拡大培養率
実施例２−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、実施例１−（５）と同様の方法で培養開始時のγδＴ細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。
結果を表２に示す。

表２に示されるように、γδＴ細胞拡大培養初期にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、γδＴ細胞拡大培養率が高い結果が得られた。

実施例３パミドロネートを用いて培養したγδＴ細胞集団の細胞傷害活性測定
（１）γδＴ細胞集団の拡大培養
実施例１−（２）で調製したＣＨ−２９６固定化プレートを使用する以外は実施例２と同様の方法で、培養を実施した。

（２）γδＴ細胞比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣおよび実施例３−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてγδＴ細胞比率をフローサイトメトリーで解析した。その結果、γδＴ細胞比率はそれぞれＰＢＭＣが８．９％、培養開始後１４日目の細胞は９６．０〜９６．９％であった。

（３）γδＴ細胞の拡大培養率
実施例３−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、実施例１−（５）と同様の方法で培養開始時のγδＴ細胞数と比較しての拡大培養率を算出したところ、ＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のγδＴ細胞拡大培養率が高いことを確認した。

（４）細胞傷害活性の測定
実施例３−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞について、細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズＲ．ら（ＬｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓＲ．ｅｔａｌ．）、Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。すなわちＫ５６２細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクＪＣＲＢ００１９）、Ｄａｕｄｉ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクＪＣＲＢ９０７１）を１〜２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。

実施例３−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞をエフェクター細胞として３×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％（ｖ／ｖ）ｈｕｍａｎＡＢ型血清、０．１ｍＭＮＥＡＡｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｙｒｕｖａｔｅ（全てＣａｍｂｒｅｘ社製）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下５ＨＲＰＭＩと記載）で希釈後、９６穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製またはコーニング社製）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらにＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞が１×１０⁵／ｍＬとなるように調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比をＥ／Ｔ比として示し、Ｅ／Ｔ比３０について測定を行った。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、５％ＣＯ₂インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０：ベルトールド社製）（励起４８５ｎｍ／測定５３５ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「細胞傷害活性（％）」は以下の式にしたがって算出した。

式（２）：
細胞傷害活性（％）＝
｛（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）｝×１００

上式において最小放出量はＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量はＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に０．１％（ｖ／ｖ）界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。細胞傷害活性測定の結果を表３に示す。

表３に示されるように、γδＴ細胞拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して細胞傷害活性が高かった。すなわち、γδＴ細胞拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞は、細胞傷害活性がより高いγδＴ細胞であることが明らかとなった。

実施例４パミドロネートを用いて培養したγδＴ細胞集団の拡大培養率
（Ｙｓｓｅｌ’ｓ培地を用いた培養）
（１）γδＴ細胞集団の拡大培養
実施例２−（１）と同様の方法でγδＴ細胞集団の拡大培養を行った。ただし、培養用基本培地としてはＩＭＤＭの代わりにＹｓｓｅｌ’ｓＭｅｄｉｕｍと同一組成の自製培地（以下Ｙｓｓｅｌ’ｓ培地と記載）を使用し、培養開始５日目には、各ウェルに１０％（ｖ／ｖ）ｈｕｍａｎＡＢ型血清を含むＹｓｓｅｌ’ｓ培地１ｍＬを添加し、細胞液を希釈した。

（２）γδＴ細胞比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣおよび実施例４−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてγδＴ細胞比率をフローサイトメトリーで解析した。その結果、γδＴ細胞比率はそれぞれＰＢＭＣが８．９％、培養開始後１４日目の細胞は８９．７〜９４．３％であった。

（３）γδＴ細胞の拡大培養率
実施例４−（１）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、実施例１−（５）と同様の方法で培養開始時のγδＴ細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。その結果を表４に示す。

表４に示されるように、γδＴ細胞拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、γδＴ細胞拡大培養率が高い結果が得られた。

実施例５ゾレドロネートを用いて培養したγδＴ細胞集団の拡大培養率
（１）ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６）の固定化
実施例１−（２）と同様の方法でＦＮフラグメントの固定化を行った。ただし、固定化プレートは６穴細胞培養プレートを用い、Ｈ２９６−Ｈ２９６（終濃度３μｇ／ｍＬ）を含むＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を１．２ｍＬずつ添加した。
（２）γδＴ細胞培養集団の拡大培養
０．２５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地に１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、何も固定化していないプレートまたは実施例５−（１）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６固定化プレートに上記細胞を５ｍＬ／ウェルずつ添加した。各ウェルにはゾレドロン酸水和物（ゾレドロネート製剤名ゾメタ注射液：ＮＯＶＡＲＴＩＳ社製）を終濃度１μＭとなるよう添加した。これらのプレートを５％ＣＯ₂中３７℃で培養した（培養０日目）。

培養開始より４８時間後に、プレートより細胞を剥がし１５ｍＬ遠心チューブ（コーニング社製）に回収し、２５０×ｇで４分間遠心した。上清（ゾレドロネートを含む）を除去した後、１０ＨＲＰＭＩ＋Ｌ−Ｇｌｎを用いて１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、何も固定化していない１２穴細胞培養用プレートに添加した。各ウェルに終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。

培養４日目に、１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用の培地で希釈し、各ウェルに終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。

培養７日目、１０日目には、０．５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう培養用の培地で希釈し、何も固定化していない６穴細胞培養用プレートに移し変えた。各ウェルに終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目まで培養を継続した。

（３）γδＴ細胞比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣおよび実施例５−（２）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてγδＴ細胞比率をフローサイトリーで解析した。その結果、γδＴ細胞比率はそれぞれＰＢＭＣが６．２％、培養開始後１４日目の細胞は８９．３〜９１．３％であった。
（４）γδＴ細胞の拡大培養率
実施例５−（２）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、実施例１−（５）と同様の方法で培養開始時のγδＴ細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。その結果を表５に示す。

表５に示されるように、γδＴ細胞拡大培養初期にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のγδＴ細胞拡大培養率が高い結果が得られた。

実施例６
実施例１、２、３又は４において、パミドロネートに代えて、アレンドロネート、リゼドロネート、ネリドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、オルバドロネート、ソルバドロネート、ミノドロネート、ＥＢ１０５３、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、メドロネート等のビスフォスフォン酸系化合物を用いた場合、同様の結果が得られる。

実施例７
実施例１において、ＩＰＰに代えて、２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル−１−ピロリン酸等のピロリン酸モノエステル系化合物を用いた場合、同様の結果が得られる。

調製例
本発明の医薬の調製例を以下に示す。
実施例１〜７に記載の方法を基としたγδＴ細胞集団の大量調製を行った後、１×１０⁴〜１０¹¹ｃｅｌｌｓの調製γδＴ細胞集団を０．５〜５００ｍＬの生理食塩水に懸濁し、注射剤もしくは点滴剤として用いる。
あるいは、調製後のγδＴ細胞集団を４９．５％ＲＰＭＩ１６４０、３４．０％ＣＰ−１、１６．５％ブミネート溶液（ブミネート：２５％ヒト血清アルブミン溶液）からなる凍結保存溶液に懸濁した状態で液体窒素または−８０℃中で凍結保存する。凍結保存γδＴ細胞集団は、３７．０℃湯浴中で急速融解後、そのままもしくは１０〜５００ｍＬの生理食塩水に懸濁した状態で注射剤もしくは点滴剤として用いる。
この医薬は、実施例３で示した細胞傷害活性を示し、前記の各疾患の治療に有効である。また、この医薬は、養子免疫療法による前記の各疾患の治療に有効である。

なお、本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
[1]γδＴ細胞を含有する細胞集団を、（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物、および（ｂ）γδＴ細胞活性化因子の存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、γδＴ細胞集団の製造方法。
[2]フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物の存在下で培養する工程が、ＩＬ−２の存在下で実施される前記[1]記載の製造方法。
[3]フィブロネクチンフラグメントが、配列表の配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）であるか、または前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）である前記[1]または[2]に記載の製造方法。
[4]フィブロネクチンフラグメントが、配列表の配列番号５〜８で表されるアミノ酸配列のいずれをも含むポリペプチドである前記[3]記載の製造方法。

[5]フィブロネクチンフラグメントが、配列表の配列番号９〜２２いずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである前記[3]記載の製造方法。
[6]γδＴ細胞活性化因子が、ビスフォスフォン酸系化合物、および／またはピロリン酸モノエステル系化合物である前記[1]〜[5]いずれか１項に記載の製造方法。
[7]ビスフォスフォン酸系化合物が、パミドロネート、アレンドロネート、ゾレドロネート、リセドロネート、ネリドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、オルバドロネート、ソルバドロネート、ミノドロネート、ＥＢ１０５３、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネートおよびメドロネートからなる群より選択される少なくとも１つの化合物である前記[6]記載の製造方法。
[8]ピロリン酸モノエステル系化合物が、イソペンテニルピロリン酸、２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸および４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル−１−ピロリン酸からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である前記[6]記載の製造方法。
[9]さらに細胞集団に外来遺伝子を導入する工程を包含する前記[1]〜[8]いずれか１項に記載の製造方法。

[10]外来遺伝子をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターを用いて導入する前記[9]記載の製造方法。
[11]前記[1]〜[10]いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団。
[12]前記[1]〜[10]いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団を有効成分として含有する医薬。
[13]被験体に、有効量の前記[1]〜[10]いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団を投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法。
[14]医薬の製造のための、前記[1]〜[10]いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団の使用。
[15]養子免疫療法における使用のための前記[1]〜[10]いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団。

本発明により、γδＴ細胞集団の製造方法が提供される。当該方法により得られるγδＴ細胞は、例えば、免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。

SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11.
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:10 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:11 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:12 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:13 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:14 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:15 ; Fibronectin fragment named CH-296Na.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CHV-90.
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named CHV-179.
SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named CHV-181.
SEQ ID NO:21 ; Fibronectin fragment named H-275-Cys.
SEQ ID NO:22 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:23 ; Primer H296-NcoF.
SEQ ID NO:24 ; Primer H296-HindR.
SEQ ID NO:25 ; Primer H296-NcoR.
SEQ ID NO:26 ; Primer NC2-5' UTR.

Claims

γδＴ細胞を含有する細胞集団を、（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物、および（ｂ）γδＴ細胞活性化因子の存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、γδＴ細胞集団の製造方法。
フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物の存在下で培養する工程が、ＩＬ−２の存在下で実施される請求項１記載の製造方法。
フィブロネクチンフラグメントが、配列表の配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）であるか、または前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）である請求項１または２に記載の製造方法。
フィブロネクチンフラグメントが、配列表の配列番号５〜８で表されるアミノ酸配列のいずれをも含むポリペプチドである請求項３記載の製造方法。
フィブロネクチンフラグメントが、配列表の配列番号９〜２２いずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項３記載の製造方法。
γδＴ細胞活性化因子が、ビスフォスフォン酸系化合物、および／またはピロリン酸モノエステル系化合物である請求項１〜５いずれか１項に記載の製造方法。
ビスフォスフォン酸系化合物が、パミドロネート、アレンドロネート、ゾレドロネート、リセドロネート、ネリドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、オルバドロネート、ソルバドロネート、ミノドロネート、ＥＢ１０５３、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネートおよびメドロネートからなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項６記載の製造方法。
ピロリン酸モノエステル系化合物が、イソペンテニルピロリン酸、２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸および４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル−１−ピロリン酸からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項６記載の製造方法。
さらに細胞集団に外来遺伝子を導入する工程を包含する請求項１〜８いずれか１項に記載の製造方法。
外来遺伝子をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターを用いて導入する請求項９記載の製造方法。
請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団。
請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団を有効成分として含有する医薬。
被験体に、有効量の請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団を投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法。
医薬の製造のための、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団の使用。
養子免疫療法における使用のための請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法により得られるγδＴ細胞集団。