TW200844235A

TW200844235A - Method for producing γδT cell population

Info

Publication number: TW200844235A
Application number: TW097108195A
Authority: TW
Inventors: Mitsuko Ideno; Fumiyo Sakai; Tatsuji Enoki; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2008-03-07
Publication date: 2008-11-16
Also published as: JP2013176403A; WO2008111430A1; JPWO2008111430A1; US20110158954A1

Description

200844235 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種製造可用於醫療領域之γδΤ細胞集團之方法。【先前技術】生物體主要係利用免疫反應來保護自身不受異物侵害，

免疫系統係由各種細胞及其所產生之可溶性因子所組成。其中’起著中心作用的是白血球，尤其是淋巴球。該淋巴球主要分為Β淋巴球（以下，有記為β細胞）及τ淋巴球（以下，有記為Τ細胞）之2種主要類型，此;2種類型均可特異性地識別抗原，並對抗原產生作用而保護生物體。 Τ細胞可分類為αβΤ細胞及γδΤ細胞之2個亞群。αβτ細胞具有可識別結合在主要組織相容性複合體（MHC， hist〇c〇mpatibility complex)I或„分子上之抗原肽的邱τ細胞文體，據稱該等約占τ細胞之9〇〜98%。另一方面，丫δτ 細胞具有γδΤ細胞受體，據稱該等占丁細胞之3〜5%。 γδτ細胞於針對細菌及病毒感染之防禦以及自身免疫方面起著重要作用，已知其會於受到感染性疾病(例如，結核、沙氏桿菌病、瘧疾等)感染時進行増殖。已知”打細胞可於無抗原提示細胞之MHC分子提示之狀況下，藉由盘抗原之直接相互作用，而識別該等抗原性配體。即，： γδτ細胞被活性化’則可發揮強力之職非限制型細胞毒性，可特有效地毒殺各種_細胞，尤其是病原性細胞。對於癌症病情，作為繼外科手術、化學療法、放射線療 129597.doc 200844235 法之後的第4治療法，近年來，免疫療法正倍受關注。免疫療法係利用人類本來所具有之免疫力，因此，其對患者之身體負擔比其他治療法輕。免疫療法已知有：將藉由各種方法由在體外誘導之末梢血液淋巴球或τ細胞等進行擴大培養而獲得之淋巴介質活性化細胞、Νκτ細胞、細胞等植入的療法，期待體内之抗原特異性ctl之誘導的樹狀、、、田胞植入療法或肽疫苗療法，Th丨細胞療法，進而於體外向該等細胞中導入可期待各種效果之基因從而植入體内之免疫基因治療法等。關於在活體外或活體内製造㈧丁細胞之方法，至今已經報〇有數種方法，例如揭示有包含在介白素_ i 2及CD2配體存在下之淋巴系細胞之第一培養、及於τ細胞裂殖素、介白素-2存在下之第二培養的方法（例如，專利文獻〇。又，對/舌化γδΤ細胞之化合物，亦進行有各種研究，例如已知有·磷鹵醇類或磷環氧化物類、雙膦酸鹽化合物、焦磷酸異戊烯酯等（例如，專利文獻2〜4、非專利文獻丨）。已知，纖維黏連蛋白係存在於動物之血液中、培養細胞表面、組織之細胞外基質中的分子量為25萬之巨大的糖蛋白貝，且具有多種功能。其區塊結構分為7個（以下，參照第1圖），又，其胺基酸序列中包含3種類似之序列，該等各序列重複排列而構成了其整體。3種類似之序列稱為工型、π型、hi型’其巾’ m型係由71〜96個胺基酸殘基所構成，該等胺基酸殘基之一致率為17〜4〇%。纖維黏連蛋白中存在14個III型序列，其中，8號、9號、1〇號（以下分 129597.doc 200844235 別稱為III-8、III-9、III-10)含於細胞結合區塊中，又，12 號、13號、14號（以下分別稱為ΙΠ-12、III-13、III-14)含於肝素結合區塊中。又，III-10中含有VLA(極遲活化抗原， very late activation antigen)-5結合區域，該核心序列係 RGDS。又，肝素結合區塊之C末端側存在稱為IIICS之區域。IIICS中存在對包含25個胺基酸之VLA-4具有結合活性之稱為CS-1的區域（例如’非專利文獻2〜4)。於免疫療法中，將藉由IL-2及抗CD3抗體之作用由在體外誘導之CTL或末梢血液淋巴球等進行擴大培養而獲得之淋巴介質活性化細胞植入的療法中，關於在擴大培養體外誘導之抗原特異性CTL時，如何維持細胞毒性，如何可於體外高效地擴大培養淋巴球等問題，使用纖維黏連蛋白或其片段所產生之效果已被本發明者等人研究（例如，專利文獻5〜7)。 [非專利文獻1]〖11112111&1111\/\另外5名，81〇〇(1，2000年， Vol. 96，No. 2，第 384〜392 頁 [非專利文獻2] Deane F· Momer著，1988年發行， FIBRONECTIN，ACADEMIC PRESS INC.，第 1〜8 頁 [非專利文獻 3] Kimizuka F.另外 8名，J. Biochem,，1991 年，Vol· 110，No. 2，第 284〜291 頁 [非專利文獻 4] Hanenberg H.另外 5 名，Human Gene Therapy 5 1997 年，Vol· 8，No. 1 8，第 2193〜2206 頁 [專利文獻1]國際公開第99/46365號手冊 [專利文獻2]國際公開第00/12516號手冊 129597.doc 200844235 [專利文獻3]國際公開第oo/i25 19號手冊 [專利文獻4]美國專利第5,639,653號 [專利文獻5]國際公開第〇3/〇 165 11號手冊 [專利文獻6]國際公開第03/0808 17號手冊 [專利文獻7]國際公開第2005/019450號手冊【發明内容】 [發明所欲解決之問題]

本發明之目的在於提供一種對投予生物體有效之γδτ細胞集團之製造方法。 [解決問題之技術手段] 本發明之第1發明係關於一種γ5Τ細胞集團之製造方法，其特徵在於：其包含將含有γδΤ細胞之細胞集團，於（&)纖維黏連蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物，及 π)γδΤ細胞活化因子之存在下進行培養的步驟。於本發明之第1發明中，所謂於纖維黏連蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物之.存在下進行培養的步驟，可例示於几_2 之存在下進行實施。又，作兔總絡 W马纖維黏連蛋白片段，可例示：含有至少1個序列表之序列编缺】w ^ 外幻、、届就1〜8所表示之胺基酸序列而成的多肽（m);或含有至少1個巧王夕i個之上述任一個胺基酸序列中有1個或者多個胺基酸經置換、 m 缺失、插入或者附加之胺基酸序列而成的，且盥上诚矣，、上迹多肽（m)具有相同之功能的多肽（η)。又，作為纖維黏連蛋文变曰片#又，可例不··亦含有序列表之序列編號5〜8所表示之脸其下之胺基酸序列中之任意個的多肽。又，作為纖維黏連蛋白Η 贪白片可例示：包含序列表 129597.doc 200844235 之序列編號9〜22中之任意個所表示之胺基酸序列的多肽。又，於本發明之第1發明中，作為γδΤ細胞活化因子，可例示雙填酸系化合物、及/或焦鱗酸單酯系化合物；作為雙磷酸系化合物，可例示選自由帕米膦酸鹽（pamidronate)、阿侖膦酸鹽（alendronate)、唑來膦酸鹽（zoledronate)、利塞 ^ 膦酸鹽（risedronate)、奈立膦酸鹽（neridronate)、伊班膦酸 ' 鹽（ibandronate)、因卡膦酸鹽（incadronate)、奥帕膦酸鹽 (olpadronate)、索帕膦酸鹽（s〇ipadr〇nate)、米諾膦酸鹽 ® (minodronate)、Εβ1〇53、依替膦酸鹽（etidronate)、氯屈膦酸鹽（clodronate)、替魯膦酸鹽（tiludr〇nate)及亞甲基二膦鹽（medroiiate)所組成群中的至少1種化合物；又，作為焦磷酸單酯系化合物，可例示選自由焦磷酸異戊烯酯、焦磷酸2-甲基-3-丁烯-1_酯及焦磷酸4-羥基甲基-2-丁烯n旨所組成群中的至少1種化合物。又，本發明之第丨發明，可例示：包含進而於細胞集團中導入外來基因之步驟的丫谷丁 φ 細胞集團之製造方法。該外來基因可使用逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體或猿猴病毒載體而進行導入。 • 本發明之第2發明係關於一種㈧丁細胞集團，其可藉由本 . 發明之第1方法而獲得。 g 本發明之p發明係關於—種醫藥，其係含有藉由本發明之第1方法而獲得之γ δ T細胞集團作為有效成分。χ 本：:月之第4發明係關於一種疾病治療方法或預防方 / ，/、匕含向被實驗者投予有效量之藉由本發明之第】方 129597.doc 200844235 法而獲得的γδΤ細胞集團之步驟。本發明之第5發明係關於一種藉由本發明之第丨方法而獲得之γδΤ細胞集團之用途，其係用於製造醫藥。本發明之第6發明係關於一種藉由本發明之第i方法而獲得之γδΤ細胞集團，其係用於過繼免疫療法。 [發明之效果] 根據本發明，可提供一種擴大培養率較高之γδτ細胞集團之製造方法。藉由該製造方法而獲得之γδτ細胞集團，具有較高之細胞毒性，因此，對利用細胞治療所進行的疾病治療極為有用。【實施方式】本發明發現：藉由於（a)纖維黏連蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物，及〇)γδΤ細胞活化因子之存在下培養含有γδΤ細胞之細胞集團，可獲得擴大培養率極高，進而具有較高之細胞毒性的γδΤ細胞集團，從而完成本發明。再者，於本說明書中，藉由本發明之製造方法而獲得之 γδτ細胞集團，意指含有高比率之γδτ細胞的τ細胞集團。又’此處所謂南比率，意指與本發明之製造方法所提供之含有γδτ細胞之細胞集團相比，γ§τ細胞比率較高的情況。以下，對本發明進行具體說明。 (1)本發明所使用之纖維黏連蛋白及纖維黏連蛋白片段本說明書中所揭示之纖維黏連蛋白，可為自天然獲得者或人工a成者中之任意者。纖維黏連蛋白，例如可基於 Ruoslahti E.等人[Ru〇siahti E.，et al·，Journal 〇f 129597.doc 11 200844235 bi〇I〇gical chemistry(J. Bi〇I Chem )，第 256卷第⑷虎，第7277〜7281頁(1981)]所揭示之方法，由來自天然：物質，以實質性純粹之形態而製造。此處，本說明書所揭干之實質性純粹之纖維黏連蛋白，意指該等本質上不含於天然中與纖維黏連蛋白同存之其他蛋白質。 • 再者，已知纖維黏連蛋白存在大量之剪切變異體，作為 • _所使用之纖維黏連蛋白，若為可表現出本發明所期 2之效果者，則可使用任意之變異體。例如已知，於來源於血漿之纖維黏連蛋白之情形時，缺失了存在於細胞結合區塊之上游的稱為ΕΟ·Β之區域、及存在於細胞結合區: 與肝素結合區塊之間的稱為ed_a之區域，如此之來源於血漿之纖維黏連蛋白亦可用於本發明。上述纖維黏連蛋白可分別單獨用於本發明，或者將多種混合而用於本發明。於本發明中，所謂纖維黏連蛋白片段，意指含有纖維黏連蛋白之胺基酸序列之一部分（例如，3個胺基酸以上、較 φ 好的是10個胺基酸以上、更好的是20個胺基酸以上）的人工製造之片段（亦稱為改型纖維黏連蛋白片段）。若該纖維黏連蛋白片段中，含有丨個或者多個該纖維黏連蛋白之胺，基酸序列的一部分，則並無特別限定，可包含天然型纖維 • 黏連蛋白之一部分片段本身、或含有該片段及來源於纖維黏連蛋白以外之胺基酸序列的片段。再者，與可用於本發明之纖維黏連蛋白片段、以及該片段之製備相關的有用之資 Λ 可自 Kimizuka F·等人[Kimizuka F· et al.，Journal of biochemistry(J· Biochem·)，第 110 卷，第 284〜291 頁 129597.doc -12- 200844235 (1991)]、Kornbrihtt A. R·荨人[Kornbrihtt A. R· et al·， EMBO Journal(EMBO J.)，第 4卷，第 7號，第 1755〜1759頁 (1985)]、及 Sekiguchi K·等人[Sekiguchi K. et al.， Biochemistry，第 25卷，第 17號，第 4936 〜4941 頁（1986)]等獲得。又，關於編碼纖維黏連蛋白之核酸序列或纖維黏連蛋白之胺基酸序列，係揭示於基因庫登陸號為 NM一002026、NP—002017。於本發明中，作為纖維黏連蛋白片段，例如可例示：含有至少1個構成如下區域中任意區域之胺基酸序列而成的多肽（m)，即，ΠΙ-8(序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列）、111-9(序列表之序列編號2所表示之胺基酸序列）、 111-10(序列表之序列編號3所表示之胺基酸序列）、 11(序列表之序列編號4所表示之胺基酸序列）、ΙΠ_12(序列表之序列編號5所表示之胺基酸序列）、m-13(序列表之序列編號6所表示之胺基酸序列）、(序列表之序列編號7 所表示之胺基酸序列）、及cs-1(序列表之序列編號8所表示之版基酉文序列）（參照弟1圖）；或含有至少1個上述任意胺基酸序列中，有1個或者多個胺基酸經置換、缺失、插入或者附加之胺基酸序列而成的，且與上述多肽（m)具有相同之功能的多肽⑻。作為片段之長度，例如胺基酸殘基數軏好的是20〜1〇〇〇、更好的是1〇〇〜8〇〇。再者，於本說明書中’所謂多個，係包括數個之概念，較好的是八⑵固、更好的疋2 1 〇個、尤其好的是2〜8個，以下亦相同。又，作為該片段，可適用具有細胞黏接活性及/或肝素 129597.doc 200844235 下方式而調查，即，

肝素結合區塊）與肝素之結合。例如，於上述Williams D· 結合活性者。細胞黏接活性可藉由如使用公知之方法檢定本發明所使用< Α·等人之方法中’ &用肝素，例如標記肝素代替細胞，藉此可利用相同之方法對片段與肝素之結合進行評價。進而，作為纖維黏連蛋白片段，可例示選自由：c_ 274(序列表之序列編號9所表示之胺基酸序列）、H_271 (序列表之序列編號1 〇所表示之胺基酸序列）、H_296(序列表之序列編號11所表示之胺基酸序列）、CH-271 (序列表之序列編號12所表示之胺基酸序列）、cH-296(序列表之序列編號13所表示之胺基酸序列）、C-CS1(序列表之序列編號14 所表示之胺基酸序列）、及CH-296Na(序列表之序列編號15 所表示之胺基酸序列）所組成群中之多肽。上述 CH-271、CH-296、CH-296Na、C-274、C-CS1 之各片段，係具有細胞結合區塊之多肽，該細胞結合區塊具有與 VLA-5結合之活性。又，C-CS1、H-296、CH-296、CH-296Na，係具有CS-1之多肽，該CS-1具有與VLA-4結合之活性。進而，H-271、H-296、CH-271、CH-296 及 CH-296Na，係具有肝素結合區塊之多肽。再者，CH-296Na係 129597.doc -14- 200844235 含有來源於血漿之纖維黏連蛋白中之細胞結合區塊至C S -1 的多肽。於本發明中’亦可使用將上述各區塊改型而成的片段。纖維黏連蛋白之肝素結合區塊係由3個III型序列（ΙΠ-12、 III_13、III-14)所構成。含有上述m型序列中之一個或者兩個缺失之肝素結合區塊的片段，亦可用於本發明。例如可例不：纖維黏連蛋白之細胞結合部位（VLA_5結合區域， Prol239〜Serl515)與一個m型序列結合而成之片段，即 CHV 89(序列表之序列編號丨6所表示之胺基酸序列）、 CHV-90(序列表之序列編號17所表示之胺基酸序列）、 CHV 92(序列表之序列編號丨8所表示之胺基酸序列）；或者與兩個in型序列結合而成的片段，即CHV_179(序列表之序列編號19所表示之胺基酸序列）、CHV_181(序列表之序列編號20所表示之胺基酸序列）。CHV-89、CHV-90、（：Ήν-92 係分別含有111-13、111_14、111-12者，（：^^179含有111-13 及 ΙΙΙ-14，CHV-181 含有 ΙΠ-12 及 ΙΠ-13。又於上述各片丰又中進而附加胺基酸而成之片段，亦可用於本發明。該片段例如可藉由於上述各片段中附加所期望之胺基酸而製造。例如，H-275_Cys(序列表之序列編號 21所表示之胺基酸序列）係具有纖維黏連蛋白之肝素結合區塊’且於C末端具有半胱胺酸殘基的片段。又，作為纖維黏連蛋白片段，亦可使用重複含有序列表之序列編號1〜8所表示之胺基酸序列的多肽。例如，可適用重複含有上述肝素結合區塊及cs-1區塊之多肽，= 129597.doc •15- 200844235 H296-H296(序列表之序列編號22所表示之胺基酸序列）。再者，作為本發明所使用之片段，只要可獲得本發明之所期望之效果’則可為含有如下之多肽者，該多肽與含有上述所例示之天然纖維黏連蛋白之胺基酸序列的至少一部分之片段具有相同的功能，且具有構成該片段之多肽之胺基酸序列中有1個或者多個胺基酸經置換、缺失、插入或者附加的胺基酸序列。胺基酸之置換等，較好的是於可維持多肽本來之功能的範圍内，可使該多肽之物理化學性狀等發生改變之程度者。例如，胺基酸之置換等，較好的是於不實質性改變多肽本來所具有之性質（例如，疏水性、親水性、電荷、pK 等）之範圍保存者。例如，胺基酸之置換係丨·甘胺酸、丙胺酸，2 ·結員胺酸、異白胺酸、白胺酸，3 ·天冬胺酸、麵胺酸、天冬醯胺、麩醯胺，4·絲胺酸、蘇胺酸，5·離胺酸、精胺酸，6·苯丙胺酸、酪胺酸之各群内之置換；胺基酸之缺失、附加、插入，較好的是具有與多肽中之該等對象部位周圍之性質相類似的性質之胺基酸，於不實質性改變對象部位周圍之性質之範圍内的缺失、附加、插入。再者，於以基因工程學方法取得本發明所使用之片段之十月形蚪，例如於以大腸桿菌等作為宿主而進行製造之情形時，有時受到來源於大腸桿菌之甲硫胺酸肽酶等之影響，而使Ν末端之甲硫胺酸缺失，如此之多肽亦可用於本發明。即，序列表之序列編號15及21中所揭示之多肽的N末端之甲硫胺酸缺失而成之多肽，亦可適用於本發明。 129597.doc -16- 200844235 者胺基酸之置換等，彳為因種間或個體差異而天然產生之方亦可為經人工誘發而成者。人卫誘發可藉由公知而制:广于，並無特別限定，例^可藉由公知之手法，錐 τ之特疋核酸’該特定核酸係於將來源於天然纖

去夕蛋白之上述區域或特定片段編碼之核酸中有1個或二：鹼基經置換、缺失、附加或者插入而成者，並使用維獻：核酉夂’來製造如下之多肽，該多肽與來源於天然纖、蛋白之上述區域或特^片段具有相同的功能，且含 ;構成該片段等之多肽之胺基酸序列上發生置換等之胺基酸序列。又於本明書中，所謂「具有相同之功能」，係指使 &用上述纖維黏連蛋白、或纖維黏連蛋白片段而獲得之γδΤ 細胞集團之擴大培養率、或者所獲得之細胞之細胞毒回於比較對照之上述纖維黏連蛋白、或纖維黏連蛋白片段不存在下所獲得之γδτ細胞集團。上述作用可依據下述焉施例1〜7所揭示之方法等而進行適當確認。又，作為匕各發生胺基酸置換等之多肽的片段，較好的是具有細胞站接'舌性及/或肝素結合活性者，具有CS-1區塊者亦較好細胞黏接活性及肝素結合活性，可依據該等之上述活性測定方法進行評價。作為包含發生胺基酸置換等之多肽的片段，例如，於2 個不同區塊之間插入有作為連結子之1個以上胺基酸的片段’亦可用於本發明中。又’作為本發明所使用之纖維黏連蛋白或纖維黏連蛋白 129597.doc -17- 200844235 片#又’只要可獲得本發明所期望之效果，則可使用與含有上述所例示之天然纖維黏連蛋白或其胺基酸序列之至少一部分的片段具有相同的功能，且與構成該纖維黏連蛋白或纖維黏連蛋白片段之多肽的胺基酸序列具有50〇/〇以上之同源性的多肽，較好的是具有70%以上之同源性的多肽，更好的是具有90%以上之同源性的多肽，尤其好的是具有 95 /〇以上之同源性的胜肽。再者，計算同源性時，例如可使用DNASIS Pro Ver· 2,6(TAKARA則股份有限公司製 •造）。再者，於本發明中，作為最適用之纖維黏連蛋白片段，可列舉於胺㈣序财至少含有则2(序列表之序列編號 5所表示之胺基酸序列）、m_13(序列表之序列編號6所表示之胺基酸序列）、111-14(序列表之序列編號7所表示之胺基酉欠序列）及CS-1 (序列表之序列編號8所表示之胺基酸序列）之王ap即έ有肝素結合區塊及CS-1區塊兩者之多肽；更 φ 好的是可列舉，具有上述CH-296、Η296-Η296或如下胺基酉文序列的夕狀’该胺基酸序列係與上述CH_296、Η296- H296具有相同之功能，於構成該片段之多肽之胺基酸序列， i發生1個或者多個胺基酸置換、缺失、插人或者附加而 _ 成者。本說明書巾所揭*之纖轉連蛋自片段，例如亦可基於美國專利第5，198,423號說明書所揭示之方法，利用基因重組體進行製造。例如，該專利說明書中詳細揭示有上述H_ 271(序列編號10)、h_296(序列編號u)、ch_27i(序列編號 129597.doc -18- 200844235 12)、CH-296(序列編號13)之各片段以及取得該等之方法。又，於國際公開第20Ό5/0 19450號手冊中揭示有CH-296Na(序列編號is)及其製造方法。又，上述c_274(序列編號9)片段，可藉由美國專利第5,1〇2,988號說明書所揭示之方法而獲得。進而，C-CS1 (序列編號14)片段，可藉由曰本專利第3104178號說明書所揭示之方法而獲得。上述 CHV-89(序列編號 16)、CHV-90(序列編號 17)、CHV-179(序列編號19)之各片段，可藉由日本專利第2729712號說明書所揭不之方法而獲得。又，CHV_181(序列編號2〇)片段，可依據國際公開第97/1 831 8號手冊所揭示之方法而獲得。 CHV-92(序列編號18)片段，可參照日本專利第2729712號說明書及國際公開第97/18318號手冊，基於該等文獻所揭示之質體而定型地構建質體，並使用該質體，以基因工程學方法而取得。又，H296-H296(序列編號22)片段，可基於該等文獻之資訊，定型地構建質體，並以使用該質體之基因工程學方法而取得。由於纖維黏連蛋白係巨大之糖蛋白質，故而製備使用來源於天然之蛋白質，於產業方面及醫藥品製造方面並不容易。又，纖維黏連蛋白係多功能蛋白質，因此，根據其使用狀況，亦可認為與本發明之方法有效之區域不同之區域會產生不便。根據該等情況，就獲取、易於操作、及安全方面之觀點而言，本發明中較好的是使用纖維黏連蛋白片段。又，就實現較高之擴大培養率之觀點而言，亦較好的是使用上述纖維黏連蛋白片段。x，作為本發明所使用之 129597.doc -19· 200844235 纖維黏連蛋白片段之分子量，並無特別限定，例如為 1〜230 kD、較好的是1〜200 kD、更好的是5〜19〇 kD、尤其好的是5〜180 kD、特別好的是1〇〜180 kD。該分子量例如可藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行測定。再者，於構成本發明之纖維黏連蛋白片段之多狀的胺基酸序列中，來源於纖維黏連蛋白之多肽的胺基酸序列以外之胺基酸序列部分，只要不妨礙表現本發明所期望之效果，則可為任意，並無特別限定。 (2)γδΤ細胞集團之製造方法以下，對本發明之γδΤ細胞集團之製造方法進行具體說明。本發明係製造含有高比率之γδΤ細胞之細胞集團的方法。本發明之方法之特徵在於：其包含將含有㈧丁細胞之細胞集團，於上述（a)纖維黏連蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物（以下，有稱為（a)成分）、及（}3)丫打細胞活化因子（以下，有稱為（b)成分）之存在下進行培養的步驟。本發明之製造方法的γδΤ細胞之擴大培養率較高，又，藉由該方法而獲得之γδΤ細胞集團具有細胞毒性較高之極為有用之性質。再者，於本申請說明書中，所謂「該等之混合物」’思指選自由纖維黏連蛋白及上述纖維黏連蛋白片段所組成群中之2種以上的混合物，即意指纖維黏連蛋白與J 種以上之上述纖維黏連蛋白片段之混合物、或者2種以上之上述纖維黏連蛋白片段之混合物。作為本發明之製造方法所使用之含有丫δΊΓ細胞之細胞集團了例示·外周金單核細胞（peripheral blood 129597.doc -20 - 200844235 觸〇nuclear celIs，PBMC)、造血幹細胞、膦帶血單核細胞寺。再者，本申請說明書中所謂pBMC，意指來源於末梢血之單核細胞，例如可藉由比重離心等方法，自藉由採血而獲付之血液、或藉由成分採血而獲得之成分採血液分離/取得。其中，於取得PBMC時，並無特別限定，亦可利用組織液、骨ϋ液等中所含之前驅細胞等。又，作為上述 -有γ 丁、、、田胞之細胞集團，若為含有丫δτ細胞之血球系細胞，則可用於本發明，例如可使用··末梢血液、腾帶金等 ^液，或自血液除去紅血球或血漿等成分而成者，骨髄液等。又，作為含有γδΤ細胞之細胞集團，可使用··自生物體採本者，或者於生物體外經培養而獲得者，例如直接使用藉由本發明之方法而獲得之γδΤ細胞集團、或者將其冷凍保存者中之任一者。又，例如可使用：從自生物體獲得之PBMC、造血幹細胞、臍帶血單核細胞等中，經由各種分離操作而獲得之γδτ細胞；或利用下述γδτ細胞活化因子進行刺激，而提高γδΤ細胞比率之τ細胞集團。再者，於本發明中’藉由使用含有γδτ細胞作為構成細胞之一部分的細胞集團，而可對γδτ細胞實施高比率之擴大培養，因此’作為本發明所使用之含有γδτ細胞之細胞集團，較好的疋上述PBMC、造血幹細胞、臍帶血單核細胞。於本發明中，作為γδτ細胞活化因子，可使用具有活化或者增殖γδτ細胞之作用的公知者。並無特別限定，例如可例不··帕米膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、唑來麟酸鹽、利塞膦酉文| 奈立膦酸鹽、伊班膦酸鹽、因卡膦酸鹽、奥帕膦酸 129597.doc -21 - 200844235 鹽、索帕膦酸鹽、米諾膦酸鹽、EB1053、依替膦酸鹽、氯屈膦酸鹽、替魯膦酸鹽、亞甲基二膦鹽等雙膦酸系化合物；焦構酸異戊烯酯、焦填酸甲基4- 丁烯n旨、焦鱗酸4-羥基-3-甲基-2-丁烯-卜酯等焦磷酸單_系化合物； 3-(溴甲基）-3-丁醇-1-基-二磷酸（BrHPP)、3-(破甲基）-3-丁醇-1-基-二磷酸（IHPP)、3-(氯甲基）-3-丁醇-1_基-二磷酸 (C1HPP)、3-(溴甲基）-3-丁醇-1-基-三磷酸（BrHPPP)、3-(碘曱基）-3-丁醇-1-基-三磷酸（IHPPP)、α，γ-二-[3-(溴甲基）-3-丁醇-1-基]-三磷酸（diBrHTP)、α，γ-二-[3-(碘甲基）-3-丁醇-1-基]-三磷酸（dilHTP)等磷鹵醇類；3,4-環氧基-3-曱基-1-丁基·二磷酸（Epox-PP)、3,4-環氧基-3·曱基-1-丁基-三填酸（Εροχ-ΡΡΡ)、α，γ-二-3,4-環氧基-3 -曱基-1-丁基-三填酸（di-Epox-TP)等構環氧化物類；二磷酸1-經基-3-(甲基戊基胺基）丙二酯等胺基二填酸酯系化合物；又，pan_3單株抗體等對γδ型T細胞受體（γδΤ€Ι〇具有結合活性之抗體等。於本發明之γδΤ細胞集團之製造方法中，作為用以獲得所製造之γδΤ細胞集團的總培養日數，例如為2〜6〇日、較好的是4〜40日、更好的是6〜30日。又，於本發明之γδτ細胞集團之製造方法中所實施之’於上述（a)成分、及0)成分存在下之含有γδΤ細胞之細胞集團的培養，尤其好的是於整個培養期間中之至少初始階段，於上述⑷成分、及 (b)成分存在下實施培養；更好的是至少於開始培養時，於本發明之有效成分存在下實施培養。再者，於本發明之有 129597.doc •22· 200844235 效成分存在下之培養’可為整個培養期間，又可為任意一部分期間。即’只要γδτ細胞之製造步驟的一部分中包括上述步驟，則包含於本發中。 ^ Τ 1又好的是，於（a)成分、及

㈨成分存在下，自開始培養起實施至少6小時以上的培養、更好的是12小時以上、尤其好的是24小時以上。又，本發明之γδΤ細胞之製造方法中，除該等於⑷成分及⑻成分存在下之培養步驟以外之培養，亦可於上述⑷成分或者 (b)成分中之任—者存在下、或不存在上述⑷成分及⑻成分之情況下實施。你I如收站丄叮將精由於上述（a)成分及（…成分存在下培養2〜7日之步驟而獲得之細胞集團，進而於⑷ 成分或(b)成分存在下、或者不存在上述⑷成分㈣成分之情況下培養4〜14曰。於本發明中，作為（a)成分於培養中之濃度，並無特別限定，例如較好的是0.0001〜5〇〇 ^/mL、尤其好的是〇·〇〇ι〜500 ^/mL。再者，所謂該培養中之⑷成分的濃度，意指溶解於培養基中、或者固定於適當之載體而存在於培養基中時的濃度。於本發明中，作為（b)成分於培養中之濃度，可根據所使用之γδτ細胞活化因子而適當設定，並無特別限制，例如可例示0.001〜1000 μΜ、較好的是0.005〜100 μΜ、尤其好的是0.01〜5〇 μΜ。本發明之γδΤ細胞集團之製造方法中所使用的培養基，並無特別限定，可使用將γδΤ細胞之擴大培養所必需之成刀進行混合而製作的公知之培養基，例如可適當選用市售 129597.d〇c -23· 200844235

之培養基。该等培養基，除了其本來之構成成分以外，亦可含有細胞激素類、適當之蛋白質、其他成分。作為細胞激素類’例如可例示 IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ、IFN-α、 IFN-β、IL-15等，較好的是使用含有IL_2之培養基。作為 IL-2(—般為細胞激素類）於培養基中之濃度，並無特別限定’例如較好的是〇.〇1〜lxl〇5 u/mL、更好的是〇·1〜lxl〇4 U/mL °又’作為適當之蛋白質，可例示CD3配體或配體、例如抗CD3抗體或抗CD28抗體。該成分於培養基中之？辰度’若可獲得所期望之效果，則並無特別限定。然而，於本發明中，亦如下述實施例所示，即便於不存在抗 CD3抗體之情況下，亦可以較高之γδτ細胞比率實現擴大培養。即，於本發明中，較好的是於不存在抗cD3抗體之

It況下貝％培養。又，作為其他成分，可例示有助於活化 T細胞之各種裂殖素等。進而於培養中，亦可於培養基中添加血清或血漿。該等在培養基中之添加量並無特別限定，可例示超過 0/〇(ν/ν) 20/〇(v/v)，又，可根據培養階段而改變所使用之血清或血漿之量。例如，亦可階段性減少血清或血漿濃度而進行使肖再者’作為血清或血漿之來源，可為自身 (意指來源與所培養之細胞相同）或者非自身（意指來源盘所培養之細胞不同)中之任一者，就安全性之觀點而言，較好的是可㈣㈣於自身者。又，亦可不於培養基中添加血清或血漿而實施培養。本發明之γδτ細胞集團之製造，通常於上述⑷纖維黏連 129597.doc -24- 200844235 蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物，及⑻何細胞活化因子存在下，於含有特定成分之培養基中進行。作為本發明中所使用之培養開始時的細胞數，並無特別限定，例如可例示：較好的M eeU/mL〜lxlG8 eells/mL、更好的

是！〜5xl〇7 cells/mL、尤其好的是】“驗Μ嗜7 ―。又’培養條件並無特別限定，可使用通常細胞培養所使用之條件。例如，可於2()〜贼、較好的是Π 下，於CG2等存在下進行培養。又，可以適當之時間間隔，加人新鮮之培養基來稀釋細胞培養液，或更換培養基’或者更換細胞培養用器材。作為本發明之γδΤ細胞集團之製造方法中所使用之細胞培養用器材，並無特別限定，例如可使用：培養皿、声瓶、培養袋、大型培養槽、生物反應器等。再者，作為^ 養袋，可使用細胞培養用c〇2氣體透過性培養袋。又，^ 工業上製造大量γδΤ細胞集團之情形時，可使用大型培養槽。又’培養可於開放系統、封閉系統中之任—者中實施’就所獲得之γδΤ細胞集團之安全性的觀點而言，較二的是於封閉系統中進行培養。再者，上述纖維黏連蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物、γδΤ細胞活化因子、細胞激素類、適當之蛋白質及其他成分’除於培養基中溶解而共存以夕卜，亦可固定於適當之固相，例如培養皿、燒瓶、培養袋等細胞培養用哭材（亦包括開放系者及封閉系者中之任一者）、或珠粒、& 膜、載玻片等細胞培養用栽體上而進行使用。1¾等固相之 129597.doc -25- 200844235 材質，若為可用於細胞培養者，則並無特別限定。體：於細胞培養時浸潰於細胞培養用器材中之培養液進订使用。將上述成分固定於上述載體之情形時，若定量可獲得所期望之效果，則並無特別限定。 ’、作為上述成分固定於固相之方法，並無特別限定’例如，可於適當之緩衝液中，使該等物質與固相接觸而進行固定。例如，關於纖維黏連蛋白片段固定於固由國際公開第97/1㈣號手冊、以及國際公開第咖9168 就手冊所揭不之方法而實施固定。若預先將上述各種成分固定於固相，則藉由本發明之方法而獲得γδτ細胞集團後，僅將該了細胞集團與固相分離，由此便可容易地使有效成分等與該τ細胞集團相分離，從而可防止有效成分等混入至該τ細胞集團。又，亦可使用藉由本發明之製造方法而獲得之州細胞木團’進而將含有两比率之γδτ細胞的辦細胞集團、或者僅_細胞分離。作為分離操作，並無特別限定，例如可使用細胞分選儀、磁珠、管柱等，藉由公知之手法進行分離0 對藉由本發明之方法所製造之γδτ細胞進行選殖， • #此亦可維持穩定之㈣胞。又，使用藉由本發明之方法而獲得之γδΤ細胞集團，進而藉由本發明之方法或眾所周=之方法進行培養，藉此亦可重新獲得仰細胞集團。藉由技予利用本發明之方法所製造之辦細胞集團而表現出效果之疾病，即對藉由本發明之方法所製造之γδΤ細 I29597.doc -26 - 200844235 胞集團表現出敏感性的疾病，並無特別限定，例如可例示：癌症、白血病，惡性腫瘤，肝炎，或因流行性感冒病毋、艾滋病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)等病毒、細菌、真菌所引起之感染性疾病，例如結核、 MRSA(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus) > VRE(vancomycin resistant enteroccoccus)、深層真菌病。又，如下述進而導入基因治療用外來基因之情形時，對目

標之各種基因疾病等亦會表現出效果。又，藉由本發明之方去而製造之γδΤ細胞集團，亦可用於以預防骨髄移植或放射線照射後之感染症、緩解復發性白血病為目的之予體淋巴球輸液等。進而，本發明提供一種藉由上述本發明之製造方法而獲得之γδτ細胞集團。又，本發明提供一種含有該τ細胞集^ 作為有效成分之醫藥（治療劑）。含有該τ細胞集團之上述醫藥’適用於免疫療法，例如可料過繼免疫療法或予體淋巴球輸液用之醫藥。於免疫療法中，適心患者之治療的γδτ細胞集團，·可藉由㈣注射或滴注投予至靜脈、動脈、皮下、腹腔内等之方法而投予給患者。該醫藥可非常有效地用於上述疾病或予體淋巴球輪液。該醫藥可依據製藥領域公知之方法，例如，將藉由本發明之方法而製備之該τ細胞集團作為有效成分，與適用於公知之非經口投予的有機或無機载體、賦形劑、穩定劑等混合，而製 :成滴注劑、/射劑等。再者，冑藥中之本發明之γδΤ細胞集團的含量、醫筚夕如；旦也#防 -桌之杈予里、與該醫藥相關之各種條 129597.doc -27· 200844235 可依據公知之免疫療法㈣當決定。例如，作為醫率中之本發明之γδτ細胞集團的含量，並無特別限定，例如可例示：較好的是丨><103〜1><1〇11 ceUs/mL、更好

Ixl04~l xio10 cells/mL·、尤 1 好 θ 疋九再好的是1Χΐ〇5〜1χ1〇9 —。又’作為本發明之醫藥之投予*，並無特別限疋，例如可例示：成人每日較好的是lxl〇5〜ixi〇12c仙/ 日、6更好的*!—10n _日、尤其好的是 0 1χ1〇 cells/曰。進而’亦可將利用該醫藥之免疫療法’與公知之藉由投Η劑之_治療或放射線治療、糟由外科手術之治療進行並用。χ，於投予該醫藥時，同 ¥投予上述γδτ細胞活化因+，藉此可期待投予給生㈣細胞之更高的治療效果。再者，作為本發明之另外悲樣’可提供亦含有藉由本發明之製造方法而獲得之γ汀細胞集團及上述γδτ細胞活化因子中之任一者的醫盒。於本發明之γδτ細胞集團之製造方法中，可進而包含在該Τ細胞中導入外來基因之步驟。即，本發明提供-種進而包含在該τ細胞集團中導入外來基因之步驟的γδτ細胞集團之製k方法’作為其一態#。再者，所謂「外來基因」’意指人工導入至基因導入對象之γδτ細胞中之基因，亦包括與基因導入對象之γδτ細胞來源相同者。、藉由進行本發明之製造方法，可使所培養之γδτ細胞的增瘦能力增強，藉由將本發明之γδτ細胞之製造方法，與基因之導人步驟相組合，而可期待提高基因之導入效率。 129597.doc •28- 200844235 外來基因之導入手段並無特別限定，可根據公知之基因導入方法而選用適當者。可於製造γδτ細胞集團時，於任 f時刻實施基因導人之步驟。例如，就操作效率之觀點而言，較好的是與上述τ細胞集團之製造同時實施，或者於中途實施，或者於該步驟之後實施。作為上述基因“方法，使用病毒載體之方法、不使用該載體之方法均可用於本發明。該等方法之詳細内容已被大量文獻所發表。上述病毒載體並無特別限定，通常可使用：基因導入方 =所使用之公知之病毒載體，例如逆轉錄病毒載體、慢病毋載體豸病常載體、腺相關病毒载體、猿猴病毒載體、牛痘病毒載體或仙台病毒載體等。尤其好的是使用逆轉錄 =:、腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體或 g病毋载體’來作為病毒載體。作為上述病毒載體 Γ是於所感染之細胞中缺乏複製能力而無法自我複製 T二Α Γ於基因導入時使用—(註冊商標， RABI〇公司製造）等提高基因導人效率之物質。逆轉錄病毒载體以及慢病毒外來基因，穩定地組入至該載體戶J將插入=§亥载體之 DNA中，m /戟體所導入之細胞的染色體殖中之4 ^、用於基因治療等目的。該載體對分裂、增、、、田胞的感染效率較高，因曰製造步驟中進行基因導人。’讀的是於本發明之作為不使用病毒載體之行限定，例如可利用：使用：質广：未對本發明進巾乃曰貝體、配體_聚離胺酸等載 129597.doc -29- 200844235 體之方法或磷_法，電穿孔法、粒子搶法等。於該情形時，可導入組入至質體DNA、直鏈狀_Α或驗之外來基因。於本U中，導人至γδΤ細胞集團之外來基因並無特別 ,Ρ艮定’可選擇期望導入至上述細胞中之任意基因。作為如此之基因，例如，除編碼蛋白質(例如，酶、細胞激素 • 類、受體類等）者以夕卜，亦可使用反義核酸或仙财（小干擾RNA，smaU interfering RNA)、編竭核酶者。又，亦可 •同時導入可選擇經基因導入之細胞之適當的標記基因。上述外來基g)，例如可以於適#之啟動子控制下進行表達之方式，插入至载體或質體等中而使用。又，為了實現高效之基因轉錄，可於載體内存在與啟動子或轉錄開始部位具有協同作用之其他調節要素，例如促進子序列或終止子序列。又’為了藉由同源重組將外來基因插入至導入對象之T細胞的染色體中，例如可於包含鹼基序列之毗鄰序 • 狀間配置外來基因，該驗基序列與處於該染色體中之該基因所期望之標把插入部位兩側的驗基序列分別具有同源性。所導入之外來基因可為天然者，或為人工製作者’或 . 者可為藉由連接等公知之方法使起源不同之DNA分子結合 ‘ @成者。進而，根據其目的，亦可為具有於天然序列中導入有變異之序列者。作為所導入之基因’可例示：將識別標靶細胞之表面抗原之TCR編碼的基因，或將具有針對標乾細胞之表面抗原之抗體的抗原識別部位、且含有取複合體之部分區域 129597.doc -30- 200844235 (CD3或其部分區域等）之嵌合受體編碼的基因。此處，作為TCR，根據對象疾病，不僅可選擇邛型、㈧型，亦可選擇適當之TCR。

又，例如可將編碼酶之基因導入至γδΤ細胞中，而對該T 細胞賦予耐藥性，上述酶係與對用於治療癌症等之患者的藥劑之耐性相關。若使用如此之㈧丁細胞，則可將免疫療法與藥劑療法組合，因此，可獲得更高之治療效果。作為

耐樂性基因，例如可例示多重抗藥性基因加此 resistance gene) 〇另一方面，與上述態樣相反，亦可將賦予對特定藥劑之敏感性之基因導入至γδΤ細胞集團中，而賦予對該藥劑之敏感性。於&情形日夺，可藉由#予該藥劑而除去移植於生物體後之T細胞。作為賦予對藥劑之敏感性之基因，例如可例示胸苷激酶基因。本發明又提供—種疾病之治療方法或預防方法，JL包含對被實驗者投予有效量之藉由上述方法而獲得之γδΤ細胞集團的步驟。於本說明書中，所謂被實驗者，並無特別限定’較好的是表示罹患如下疾病之患者：可投予藉由本發明之方法而製造之Τ細胞集團的如上述所揭示之疾病，即對該τ細胞制表現出敏感性之疾病n為該治療方法，可例示過繼免疫療法或予體淋巴球輸液療法。再者，亦可將上述γδΤ細胞活化因子與該Τ細胞㈣-併投予給患

者。 U 又，於本說明書中所謂有效量，係於將藉由上述方法 129597.doc 200844235 而獲得之γδΤ細胞集團投予給上述被每饿馬驗者之情形時，盥未投予該Τ細胞集團之被實驗者相$ ^ I邳比，可發揮治療或防效果之該Τ細胞集團的量。作為具體之有效量:、根：予形態、投予方法、使用目的及被實又诋汽驗者之年齡、體重、症狀等而適當設定，並不固定，作一車父好的是與上述醫藥投予量相同。投予方法亦無限定例如，與上述醫藥地’ It由滴注或注射等進行投予即可。 7 又，本發明亦提供一種用以製造醫藥之藉由上述方法而獲得之γδτ細胞集團的用途。該醫藥之製造方法可以盘上述醫藥相同之方式進行。又，對對於可投予該醫藥之疾病，亦無特別限定，與上述醫筚相因 — 4酉果相冋。又，作為該醫藥，可例示過繼免疫療法用或予體淋巴球輸液用之醫藥。又’本發明亦提供一種用於滿繼&产士、但川過Ik免疫療法或予體淋巴球輸液之上述γδτ細胞集團的用；全 , 巿图的用延。本用途中之上述γδΤ細胞集團之使用量並無限定，例如 J ^ 4刊舉·作為醫樂中之上述 γδτ細胞集團之含量而所例示的量。 [實施例] 以下’列舉實施例對本發明進行更具體說明，但本發明並不限定於該等所揭示之内容。製備例1 CH-296之製備 .296(包含纖維黏連蛋白之細胞結合區塊、肝素結合區塊及CS 1區塊之多肽）係使用Escherichia coli HB101/pCH102，且其认呈咖士基於吴國專利第5，198,423號說明書所揭示之方法進行製備。 129597.doc -32 - 200844235 製備例2 H296-H296之製作關於本說明書所揭示之操作中的質體之製備、限制酶消化等基本操作，係依據2001年，美國冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory)發行，Τ· Maniatis等人所編輯之 Molecular Cloning : A Laboratory Manual 第 3版中所揭示之方法。 (1)表達載體之構建 (i) H-296表達载體之構建將自序列表之序列編號13所揭示之CH-296的胺基酸序列之N末端側起包含胺基酸278〜574(鹼基編號83 5〜1725)之多肽設為H-296，為了使2個該H-296連結而成之變異體蛋白質（H296-H296)獲得表達，而以如下方式構建表達載體。以下，參照圖2。首先，藉由DNA合成機（Applied Biosystems公司製造， Expesite 8909(型號）），由序列表之序列編號13所揭示之 CH-296的鹼基序列（參照國際公開第03/080817號手冊），合成具有序列表之序列編號23及24所揭示之鹼基序列的合成引子H296-NcoF及H296-HindR，並藉由通常方法進行純化。上述合成引子H296-NcoF，係於鹼基編號11〜16中具有限制酶Ncol之識別序列，進而於鹼基編號13〜30中具有與 CH-296之胺基酸序列（序列編號13)之胺基酸編號278〜283 相當之鹼基序列的合成DNA。又，合成引子H296-HindR係於鹼基編號11〜16中具有限制酶Hindlll之識別序列，進而於鹼基編號20〜34中具有與CH-296之胺基酸序歹彳（序列編號 129597.doc -33- 200844235 13)之胺基酸編號570〜574相當之鹼基序列的合成DNA。使用上述合成引子，進行PCR。PCR之反應條件如下所示。即，加入約0·1 pg之作為模板DNA的pCH102、5 μι之 l〇xEx Taq緩衝液（TAKARA BIO公司製造）、5 pL之dNTP混 ^ 合液（TAKARA BIO公司製造）、10 pmol之合成引子H296- - NcoF、10 pmol 之合成引子 H296-HindR、0.5 U之 TaKaRa

Ex Taq(TAKARA BIO公司製造），加入滅菌水，使總量達 _ 到 50 pL。將上述反應液置於TaKaRa PCR Thermal Cycler SP(TAKARA BIO公司製造）中，將於94°C下反應1分鐘、於 5 5°C下反應1分鐘、於72°C下反應3分鐘設為1個循環，進行3 0個循環之反應。反應完畢後，將5 pL該反應液用於1.0%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，確認有目標之約〇·9 kbp之DNA片段。對剩餘之PCR 反應液進行電泳，對此種片段進行回收/純化，並進行乙醇沈澱。將乙醇沈澱後之回收DNA懸浮於10 pL之滅菌水中，以限制酶NcoI(TAKARA BIO公司製造）及限制酶 HindIII(TAKARA BIO公司製造）進行雙重消化，藉由 . 1.0%(w/v)瓊脂糖電泳，對此Ncol-Hindlll消化物進行萃取純化，而獲得Ncol-Hindlll消化DNA片段。繼而，依據國際公開第9 9 /2 7117號手冊之實施例1〜6所揭示之方法，製備pCold04NC2載體（以下，將該 pCold04NC2 載體設為 pColdl4 載體）。繼而，以與製備上述Ncol-Hindlll消化DNA片段時所使 129597.doc -34 - 200844235 用者相同之限制酶，將上述Pc〇idl4載體切斷，而製備對末端進行脫磷酸處理者，將其與上述Ncol-Hindlll消化 DNA片段相混合’使用DNA連接試劑盒（TAKARA BIO公司製造）進行連接。其後，使用20 連接反應液，對大腸桿菌JM1 09進行形質轉換，使其形質轉換體於含有1 ·5°/❶(w/v) 濃度之瓊脂的LB培養基（含有50 gg/mL之安比西林）上繁殖。插入有目標之DNA片段之質體，藉由進行定序而確認，將該重組質體設為pC〇ldl4-H296。該pColdl4-H296，係含有將CH-296之胺基酸編號278〜574之胺基酸序列進行編碼的鹼基序列之質體。 (ii) H296-H296表達載體之構建其次，藉由DNA合成機，由國際公開第03/080817號手冊中所公開之鹼基序列，合成具有序列表之序列編號25所揭示之鹼基序列的合成引子H296-NcoR，並藉由通常方法進行純化。上述合成引子H296-NcoR，係於鹼基編號 1 0〜1 5中具有限制酶Ncol之識別序列，進而於鹼基編號 17〜34中具有與CH-296之胺基酸序列（序列編號13)之胺基酸編號574〜569相當的鹼基序列之合成DNA。使用上述合成引子及黏合在序列表之序列編號26所揭示之NC2載體的 5’UTR部分上之引子（NC2-5，UTR)進行PCR。PCR之反應條件如下所示。即，加入約0·1 pg之作為模板DNA的pColdl4-H296、10 μΐ^之 lOxpyrobest緩衝液（TAKARA BIO公司製造）、8 pL之 129597.doc -35- 200844235 dNTP 混合液（TAKARA BIO 公司製造）、20 pmol tNC2-5’UTR、20 pmol·之合成引子 H296-NcoR、5 U之 pyrobest DNA聚合酶（TAKARA BIO公司製造），並加入滅菌水，使總量達到1 〇〇 μί。將上述反應液置於TaKaRa PCR Thermal Cycler SP(TAKARA BIO公司製造）中，將於96°C下反應1分鐘、於68°C下反應4分鐘設為1個循環，進行30個循環之反應。反應完畢後，將5 μί該反應液用於1 ·0%(\ν/ν)瓊脂糖凝膠電泳，確認有目標之約0.9 kbp之DNA片段。利用Bio rad管柱，對剩餘之PCR反應液進行回收/純化，並進行乙醇沈澱。將乙醇沈澱後之回收DNA懸浮於39 之滅菌水中，以限制酶NcoI(TAKARA ΒΙΟ公司製造）消化總量達到50 μί 之反應液，藉由L〇(w/v)%瓊脂糖電泳對此Ncol-Ncol消化物進行萃取純化，而獲得Ncol-Ncol消化DNA片段。繼而，以限制酶Ncol消化（i)中所製備之pColdl4-H296，製備對末端進行脫磷酸處理者，將其與上述Ncol-Ncol消化DNA片段相混合，使用DNA連接試劑盒（TAKARA BIO公司製造）進行連接。其後，使用20 pL連接反應液，對大腸桿菌JM109進行形質轉換，使其形質轉換體於含有 1.5%(w/v)濃度之瓊脂的LB培養基（含有50 pg/mL之安比西林）上繁殖。插入有目標之DNA片段之質體，藉由進行定序而確認，將該重組質體設為 pColdl4-H296-H296。該 pC〇ldl4-H296-H296係以2個將CH-296之胺基酸編號278〜574之胺基酸序 129597.doc -36- 200844235 列編碼的鹼基序列，於該等間夾持胺基酸"A"而連接之形式，含有該等鹼基序列的質體。將該蛋白質之胺基酸序列示於序列表之序列編號22。 (2)表達、純化使用上述（1)中所製備之pCoMl‘H296-H296，對大腸桿菌BL21進行形質轉換，使其形質轉換體於含有1.5%(w/v) 濃度之瓊脂的LB培養基（含有50 pg/mL之安比西林）上繁殖。將所繁殖之菌落移植於30 mL之LB液體培養基（含有50 pg/mL之安比西林）中，於37°C下培養一晚。將全部量移植於3 L該LB培養基中，於37°C下進行培養直至對數增殖期為止。再者，於該培養時，係使用5 L容積之Mini Jar Fermenter(Biott公司製造），於 120 rpm、Air=l ·0 1/min之條件下進行培養。於上述培養後，冷卻至15°C後，以最終濃度達到1.0 mM之方式添加IPTG(TAKARA BIO公司製造），直接於15°C下培養24小時，而使其表達誘導。其後，藉由離心分離而收集菌體，再次懸浮於约40 mL之細胞粉碎溶液[50 mM之 Tris-HCl(pH值為 7.5)、1 mM之 EDTA、1 mM之 DTT、1 mM之PMSF、50 mM之NaCl]中。藉由超音波粉碎將菌體粉碎，藉由離心分離（11，〇〇〇 rpm，20分鐘）而分離成上清液之萃取液與沈澱。將其於2 L之緩衝液A[5〇 mM 之Tris-HCl(pH值為7·5)、50 mM之NaCl]中進行透析，使用其約40 mL，進而藉由離子交換層析以如下方式進行純化。即，準備以缓衝液A[50 mM之Tris-HCl(pH值為7.5)、50 129597.doc -37- 200844235 mM 之 NaCl]，使樹脂容積為 100 mL 之 SP-Sepharose (Amersham Pharmacia 公司製造）飽和的管柱（Φ4 cm><20 cm)，對其供給透析後之樣品。其後，以250 mL之緩衝液 A及 250 mL之缓衝液B[50 mM之Tris-HCl(pH值為 7·5)、1 Μ 之NaCl]，藉由50 mM至1 Μ之氯化鈉之濃度梯度，使目標蛋白質溶析。每5 mL進行溶離，藉由使用l〇%(w/v)丙烯醯胺凝膠之SDS-PAGE(以下記為SDS-PAGE)，回收約100 mL 之含有較多分子量約為64.6 kDa之目標蛋白質的溶離分，於2 1之缓衝液A中進行透析。繼而，準備以缓衝液A使樹脂容積為50 mL之Q-Sepharose(Amersham Pharmacia公司製造）飽和之管柱（Φ3 cmx 16 cm)，對其供給透析後之樣品。其後，以250 mL之緩衝液A及25 0 mL之緩衝液B，藉由50 mM至1 Μ之氯化鈉之濃度梯度，使目標蛋白質溶析。藉由i〇°/〇sds-page調查僅含有較多目標蛋白質之溶離分，結果非吸附溶離分中含有較多該目標蛋白質，回收其約1〇〇 mL，於2 1之緩衝液 D[5 0 mM之碳酸鈉緩衝液，pH值為9·5]中進行透析。其後，以Centricon-10(Millipore公司製造），進行約20倍之濃縮，至5 mL，進而藉由10%SDS-PAGE進行確認，結果根據大致單一條帶檢測出分子量約為64.6 kDa之目標蛋白質，將其作為H296-H296。其後，使用MicroBCA試劑盒 (Pierce公司製造），測定蛋白質濃度，結果為2·16 mg/mL(根據分子量進行計算，約為33.4 μΜ)。又，進行Ν 末端分析，結果為曱硫胺酸被消化，Ν末端為Ala。 129597.doc -38- 200844235 實施例1 帕米膦酸鹽及焦鱗酸異戊稀醋（Isopentenyl pyrophosphate) 使用（IPP)之γδΤ細胞集團之擴大培養 (1) PBMC之分離及保存自於知情同意下所獲得之人類健康人予體，實施成分採血或採血50 mL後，以磷酸緩衝生理食鹽水（NEXELL公司製造或SIGMA公司製造，以下記為PBS)將採血液稀釋2 倍，於Ficoll-paque(GE Healthcare Bio-Sciences公司製造）上進行重層，以600xg離心20分鐘。以吸管回收中間層之末梢血單核細胞（以下，記為PBMC)，並進行清洗。所採集之 PBMC，係懸浮於包含90%(v/v)FBS(MP Biomedicals 公司製造）/10%(v/v)DMSO(SIGMA公司製造）之保存液，或者包含含有8%(w/v)人類血清白蛋白（製劑名，Buminate : Baxter公司製造，以下記為HSA)之CP-1(極東製藥公司製造）與RPMI1640培養基（SIGMA公司製造）之等量混合液的保存液中，並保存於液氮中。於γδτ細胞擴大培養時，將該等保存PBMC於37°C之水浴中進行急速融解，以含有10 μg/mL之DNase(Calbiochem公司製造）、10%(v/v)人類AB型血清（Cambrex公司製造）、2 mM之L-麩酸胺（Cambrex公司製造）、100 pg/mL之硫酸鏈黴素（明治製果（Meiji Seika)公司製造）的RPMI164〇培養基（以下，記為10HRPMI+L-Gln)，或含有 10 pg/mL 之 DNase、10%(v/v)人類 AB 型血清之 Iscove’s Modified Dulbeceo’s Medium(IMDM)(Invitrogen 公司製造）（以下，記為10HIMDM)進行清洗後，藉由錐蟲 129597.doc 39- 200844235 藍染色法算出活細胞數而用於各實驗。 (2) 纖維黏連蛋白片段（CH-296及H296-H296)之固定將纖維黏連蛋白片段（以下，記為FN片段）（CH-296及 H296-H296)固定於以下實驗所使用之培養器材上。即24孔細胞培養皿（Becton Dickinson公司製造或Corning公司製造）之每個孔中添加240 pL之含有CH-296(最終濃度為25 pg/mL)或H296-H296(最終濃度為3 pg/mL)之包含 2.20%(w/v)檸檬酸鈉二水合物、0.80%(w/v)檸檬酸一水合物、2.20%(w/v)葡萄糠（均由Nacalai Tesque公司製造）的pH 值為5.0之緩衝液（以下，記為ACD-A液（pH值為5.0))。將該等培養器材於室溫下培養5小時以上。使用前，自該等培養器材吸取除去含有CH-296或H296-H296之ACD-A 液（pH值為5·0)後，對各孔以PBS清洗2次，以RPMI1640培養基清洗1次，並用於各實驗。作為對照，係使用未固定任何物質之培養皿。 (3) γδΤ細胞集團之擴大培養以達到lxlO6 cells/mL之方式，將實施例1-(1)中所製備之PBMC懸浮於10HRPMI+L-Gln或10HIMDM中，而製備細胞液，之後，將上述細胞液以1 mL/孔之方式添加至未固定任何物質之培養皿、或固定有實施例1-(2)中所製備之 CH-296或H296-H296之培養皿中。以最終濃度達到20 U/mL之方式，添加IL-2(製劑名，Proleukin : Chiron公司製造）後，添加帕米膦酸二鈉（帕米膦酸鹽，製劑名， Aredia注射劑：NOVARTIS公司製造）（最終濃度為5 μΜ)或 129597.doc -40 - 200844235 焦磷酸異戊烯酯銨鹽溶液（IPP)(SIGMA公司製造）（最終濃度為5 μΜ)。將該等培養孤於5%C02中，於37°C下進行培養（培養第0曰）。於培養開始第4日，以最終濃度達到20 U/mL之方式，將 IL-2添加於各孔。此時，關於CH-296或H296-H296刺激條件，係將細胞液全部量轉移至未固定任何物質之新的培養 JT71 中〇於培養開始第7日、第11日，以達到0.5xl06 cells/mL之方式，以培養用之培養基進行稀釋，並轉移至未固定任何物質之6孔或12孔細胞培養皿（Becton Dickinson公司製造或 Corning公司製造）中，之後，以最終濃度達到20 U/mL之方式，將IL-2添加於各孔。繼續培養，直至培養開始後第 14日。 (4) γδΤΟΙΙ表達T細胞比率之分析利用流式細胞儀（Cytomics FC 500 ·· Beckman Coulter公司製造），對實施例1-(1)中所製備之PBMC及實施例1-(3)中所製備之培養開始後第14日之細胞分析γδΤ細胞比率。即，以PBS清洗PBMC或培養開始後第14日之細胞後，將細胞懸浮於含有0.1 %(w/v)牛血清白蛋白（SIGMA公司製造，以下，記為BSA)之PBS(以下，記為0.1%(w/v) BSA/PBS)中，並添加FITC標記小白鼠抗人類Y5TCR抗體 (Becton Dickinson公司製造）及PC5標記小白鼠抗人類CD3 抗體（Beckman Coulter公司製造）。同樣地，於各細胞集團之一部分中，添加作為陰性對照的FITC標記小白鼠 129597.doc •41 - 200844235

IgGl/RDl標記小白鼠IgGl/PC5標記小白鼠IgGl(Beckman Coulter公司製造）。添加各抗體後，於冰浴上培養30分鐘。於培養後，以0.1%(w/v)BSA/PBS清洗細胞，再次懸浮於PBS中。將該等細胞用於流式細胞儀，將γδΤΌΙΙ及CD3 陽性細胞群作為γδΤ細胞，並算出γδΤ細胞之比率。其結果，γδτ細胞比率分別係，pBMc為8·9%，培養開始後第14 日之細胞為30.7〜52.0%。 (5) γδΤ細胞之擴大培養率

藉由錐蟲藍染色法，對實施例1-(3)中所製備之培養開始後第14日之細胞計測活細胞數，使用實施例卜⑷中所測定之γδτ細胞比率測定結果’根據下式算出與培養開始時之 γδτ細胞數相比較的擴大培養率。式（1) ·· 細胞數X培養細胞數X培養 γδτ細胞之擴大培養率=(培養開始第14日之活開始第14日之γδτ細胞比率）/(培養開始時之活開始時之γδΤ細胞比率）將其結果示於表1。 [表1] I29597.doc •42- 200844235 表1 培養用培養基刺激劑固定FN片段 γδΤ細胞擴大培養率 (倍率）培養第14曰 10HRPMI +L-Gln 帕米膦酸鹽對照(未固定FN片段） xl.34 CH-296 χ3·85 H296-H296 χ5.76 IPP 對照(未固定FN片段） χ3·92 H296-H296 χ16.27 10HIMDM 帕米膦酸鹽對照(未固定FN片段) χ2.03 H296-H296 Χ3.18 IPP 對照(未固定FN片段） χ〇·67 H296-H296 χ4.39 如表1所示，使用於γδΤ細胞擴大培養初始將固定有CH-296或H296-H296之培養器材的群，與對照群相比，可獲得培養中之γδΤ細胞擴大培養率較高之結果。該效果並非由於刺激劑或培養用培養基而獲得。根據該等結果可明確’ 藉由於擴大培養初始使CH-296或Η296-Η296共存，而可增加培養後所獲得之γδΤ細胞。實施例2使用帕米膦酸鹽所培養之γδΤ細胞集團之擴大培養率 (1) γδΤ細胞集團之擴大培養以達到2xl06 cells/mL之方式，將實施例1-(1)中所製備之PBMC ，懸浮於含有0.25%(w/v)HAS之IMDM中，而製備細胞液，之後，將上述細胞液以1 mL/孔之方式添加至未固定任何物質之培養皿、或固定有實施例1 -(2)中所製備 129597.doc -43- 200844235 之H296-H296之培養皿中。以最終濃度達到5 μΜ之方式，將帕米麟酸鹽添加於各孔。將該等培養皿，於5 % c 〇 2中，於37 C下進行培養（培養第〇曰）。於培養開始第2日，以最終濃度達到100 U/mL之方式，將IL-2添加於各孔。於培養開始第3日，自各孔除去一半量之培養上清液後，以5〇〇 μί/孔之方式添加含有2〇%(v/v)人類AB型血清iIMDM(人類AB型血清，最終濃度為1 〇。/❶(v/v))，進而，以最終濃度達到100 U/mL之方式添加IL-2。於培養開始第5日，以達到0.6〜0·9χ106 ceUs/mL之方式，均利用1〇111]^〇]^來稀釋各群，之後，以最終濃度達到1〇〇 U/mL·之方式添加IL_2。於培養開始第8日及第11日，以達到1 ·〇χ丨〇6 ceus/mL之方式’均利用1 0HIMDM來稀釋各群，之後，轉移至未固定任何物質之6孔或12孔細胞培養皿中，以最終濃度達到1 〇〇 U/mL之方式，將il-2添加於各孔。繼續培養，直至培養開始後第14曰。 (2) γδΤ細胞比率之分析以與實施例1-(4)相同之方法，利用流式細胞儀，對實施例1-(1)中所製備之PBMC及實施例2_(1)中所製備之培養開始後第14曰之細胞分析γδΤ細胞比率。其結果，γδτ細胞比率分別係，PBMC為8.9%，培養開始後第14日之細胞為 96.0〜96.7% 〇 (3) γδΤ細胞之擴大培養率藉由錐蟲藍染色法，對實施例2_(1)中所製備之培養開始後第I4日之細胞計測活細胞數，以與實施例相同之方 129597.doc -44- 200844235 法，算出與培養開始時之γδΤ細胞數相比較的擴大培養率0 將結果示於表2。 [表2] 表2 刺激劑固定FN片段 γδΤ細胞擴大培養率 (倍率）培養第14曰帕米膦酸鹽對照(未固定FN片段） χ74.1 Η296-Η296 χΙΟΙ.8 如表2所示，使用於γδΤ細胞擴大培養初始將固定有 Η296-Η296之培養器材的群，與對照群相比，可獲得γδΤ細胞擴大培養率較高之結果。實施例3 使用帕米膦酸鹽所培養之γδΤ細胞集團之細胞毒性測定 (1) γδΤ細胞集團之擴大培養除了使用固定有實施例1-(2)中所製備之CH-296之培養皿以外，以與實施例2相同之方法實施培養。 (2) γδΤ細胞比率之分析以與實施例1 -(4)相同之方法，利用流式細胞儀，對實施例1-(1)中所製備之PBMC及實施例3-(1)中所製備之培養開始後第14日之細胞分析γδΤ細胞比率。其結果，γδΤ細胞比率分別係，PBMC為8.9%，培養開始後第14曰之細胞為 96.0〜96.9%。 (3) γδΤ細胞之擴大培養率 129597.doc -45- 200844235 藉由錐蟲藍染色法，對實施例3_(1)中所製備之培養開始後第14曰之細胞計測活細胞數，以與實施例1-(5)相同之方法，算出與培養開始時之γδΤ細胞數相比較的擴大培養率，結果可確認，使用固定有CH-296之培養器材的群，與對照群相比，培養中之γδΤ細胞擴大培養率較高。 (4)細胞毒性之測定

對實施例3-(1)中所製備之培養開始後第14日之細胞測定細胞毒性。細胞毒性係藉由使用Calcein-AM之細胞毒性測定法[Lichtenfels R. et al.，J. Immunol· Methods，第 172 卷，第2號，第227〜239頁（1994)]進行評價。即，以達到 1 〜2><106 cells/mL 之方式，將 K562 細胞（Health Science Research Resources Bank，JCRB0019)、Daudi細胞（Health Science Research Resources Bank，JCRB9071)懸浮於含有 5%(v/v)FBS之RPMI1640培養基中，之後，以最終濃度達到25 μΜ之方式添加Calcein-AM(同仁化學研究所公司製造），於37°C下培養1小時。以不含Calcein-AM之培養基清洗細胞後，製成Calcein標記標靶細胞。將實施例3-(1)中所製備之培養開始後第14日之細胞作為效應細胞，以達到3x106 cells/mL之方式，利用含有 5%(v/v)人類AB型血清、0.1 mM之NEAA混合物、1 mM之丙酮酸鈉（均由Cambrex公司製造）、2 mM之L-麩醯胺、100 pg/mL之硫酸鏈黴素的RPMI1640培養基（以下，記為 5HRPMI)進行稀釋後，於96孔細胞培養皿（Becton Dickinson公司製造或Corning公司製造）之各孔中分別注入 129597.doc •46- 200844235 Η)〇 μΙ-以⑽心孔之方式，於該等中添加將⑸心標記標靶細胞調整成ixiV/mLtCalcein標記標靶細胞。此時，將效應細胞（E)相對於Caicein標記標靶細胞（τ)之比表示為E/T比，對E/T比為30之情況進行測定。對裝入上述^ 胞懸浮液之培養皿以400xg離心i分鐘後，於5%c〇2之培養 * 箱内，於37°C下培養4小時。其後’自各孔採集1〇〇培 • 養上清液，利用螢光分析儀（Mithras LB 940 : Berthold公司製造）（激發波長485 nm/測定波長535 nm)，測定釋放至馨培養上清液中之Caicein量。「細胞毒性（％)」係根據下式算出。式（2): 細胞毒性（％)= {(各孔之測定値-最小釋放量）/(最大釋放量-最小釋放量）} x〗〇〇上式中，最小釋放量係指僅含有Caicein標記標靶細胞之孔的Caicein釋放量，並指來自Caicein標記標乾細胞的 _ Caicein自然釋放量。又，最大釋放量係指於caicein標記標靶細胞中加入〇·1%(ν/ν)界面活性劑Triton X-l〇〇(；Naealai Tesque公司製造）而完全破壞細胞時之Caicein釋放量。將 . 細胞毒性測定之結果示於表3。 [表3] 129597.doc •47- 200844235 表3 標靶細胞 E/T 細胞毒性(％) 對照(未固定FN片段） CH-296 Κ562 30 1737 25.45 Daudi 30 25.34 33.23 如表3所示，使用於γδτ細胞擴大培養初始將固定有cH_ 296之培養器材的群，與對照群相比，細胞毒性較高。即可明確’使用於γδΊΓ細胞擴大培養初始將固定有CH-296之培養器材的培養細胞，係細胞毒性更高之γδτ細胞。實施例4使用帕米膦酸鹽所培養之γδτ細胞集團之擴大培養率 (使用Yssel培養基之培養） (1) γδΤ細胞集團之擴大培養以與貫施例2-(1)相同之方法，進行γδτ細胞集團之擴大培養。其中，作為培養用基本培養基，係使用與Yssel培養基組成相同之自製培養基（以下，記為Yssel培養基）來代替IMDM，於培養開始第5日，於各孔中添加丨mL之含有 1〇%(ν/ν)人類AB型血清之丫“61培養基，以稀釋細胞液。 (2) γδΤ細胞比率之分析以與實施例1-⑷相同之方法，制流式細胞儀，對實施例1-⑴中所製備之PBMC及實施例4_⑴中所製備之培養開始後第14日之細胞分析γδτ細胞比率。其結果，⑽細胞比率分別係’ PBMC為8,9%，培養開始後第14日之細胞為 89.7〜94·3% 〇 129597.doc -48- 200844235 (3) γδΤ細胞之擴大培養率藉由錐蟲藍染色法，對實施例4-(1)中所製備之培養開始後第14日之細胞計測活細胞數，以與實施例1-(5)相同之方法算出與培養開始時之γδΤ細胞數相比較的擴大培養率。將其結果示於表4。 [表4] 表4 刺激劑固定FN片段 γδΤ細胞擴大培養率 (倍率）培養第14曰帕米膦酸鹽對照(未固定FN片段） χ65.2 CH-296 xlOl.4 如表4所示，使用於γδΤ細胞擴大培養初始將固定有CH-296之培養器材的群，與對照群相比，可獲得γδΤ細胞擴大培養率較高之結果。實施例5 使用唑來膦酸鹽所培養之γδΤ細胞集團之擴大培養率 (1) FN 片段（Η296-Η296)之固定以與實施例1-(2)相同之方法，進行FN片段之固定。其中，固定化培養皿係使用6孔細胞培養皿，於各孔中添加 1.2 mL之含有Η296-Η296(最終濃度為3 pg/mL)之ACD-A液 (pH值為 5.0)。 (2) γδΤ細胞培養集團之擴大培養以達到IxlO6 cells/mL之方式，將實施例1-(1)中所製備之PBMC懸浮於含有0.25%(w/v)HSA之RPMI1640培養基 129597.doc -49- 200844235 中’而製備細胞液，之後，以5 mL/孔之方式將上述細胞添加於未固定任何物質之培養孤、或固定有實施例)中所製備之H296-H296之培養皿中。以最終濃度達到1 μΜ之方式，於各孔中添加唑來膦酸水合物（唑來膦酸鹽，製劑名’ Zometa注射液：NOVARTIS公司製造）。將該等培養皿於5%C〇2中，於37°C下進行培養（培養第〇日）。自培養開始起4 8小時後，自培養孤剝離細胞，回收至15 niL之離心管（Corning公司製造）中，以25〇xg離心4分鐘。除去上清液（含有唑來膦酸鹽）後，使用lOHRPMI+L-Glri，調整成1 xlO6 cens/mL，並將其添加至未固定任何物質之 12孔細胞培養用培養皿中。以最終濃度達到1〇〇 u/mL之方式，於各孔中添加IL-2。於培養第4曰，以達到IxlO6 cells/mL之方式，以培養用之培養基進行稀釋’以最終濃度達到1q〇 U/mL之方式，於各孔中添加IL-2。於培養第7日、第10日，以達到0·5χ10ό cells/mL之方式’以培養用之培養基進行稀釋，將其轉移至未固定任何物質之6孔細胞培養用培養皿中。以最終濃度達到 U/mL之方式，於各孔中添加il-2。繼續培養，直至培養開始後第14日。 (3) γδΤ細胞比率之分析以與實施例1-(4)相同之方法，利用流式細胞儀，對實施例1-(1)中所製備之？81\4(：及實施例5-(2)中所製備之培養開始後第14曰之細胞分析γδΤ細胞比率。其結果，γδτ細胞比 129597.doc •50- 200844235 率分別係，PBMC為6.2%，培養開始後第14日之細胞為 89,3〜91.3% 〇 (4) γδΤ細胞之擴大培養率藉由錐蟲藍染色法，對實施例5_(2)中所製備之培養開始後第1 4日之細胞計測活細胞數.，以與實施例i _(5)相同之方法，异出與培養開始時之γ§Τ細胞數相比較的擴大培養率。將其結果示於表5。 [表5] 表5 刺激劑固定FN片段 γδΤ細胞擴大培養率 (倍率）培養第Η曰唑來膦酸鹽對照(未固定FN片段） χ80.8 Η296-Η296 Χ107.5 如表5所示’使用於γδτ細胞擴大培養初始將固定有 Η296-Η296之培養器材的群，與對照群相比，可獲得培養中之γδΤ細胞擴大培養率較高之結果。實施例6 於實施例1、2、3或4中，使用阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、奈立膦酸鹽、伊班膦酸鹽、因卡膦酸鹽、奥帕膦酸鹽、索帕膦酸鹽、米語膦酸鹽、ΕΒ1053、依替膦酸鹽、氯屈膦酸鹽、替魯膦酸鹽、亞甲基二膦鹽等雙磷酸系化合物來代替帕米膦酸鹽之情形時，可獲得相同之結果。實施例7 於實施例1中，使用焦磷酸2-甲基_3_ 丁烯-1-酯、焦磷酸 129597.doc -51 - 200844235 4-羥基-3-曱基-2-丁烯-1，酯等焦磷酸單酯系化合物來代替 ΙΡΡ之情形時，可獲得相同之結果。製備例本發明之醫藥之製備例如下所示。大量製備基於實施例1〜7所揭示之方法的γδΤ細胞集團後，將lxlO4〜1011 cells之製備γδΤ細胞集團懸浮於〇.5〜500 mL之生理食鹽水中，而用作注射劑或者滴注劑。

或者，於將製備後之γδΤ細胞集團懸浮於包含49,5%之 RPMI1640、34.0% 之 CIM、16·5% 之 β麵inate 溶液 (Buminate : 25%人類血清白蛋白溶液）之冷凍保存溶液中的狀態下D東保存於液既或·8(Γ(：Τ。冷康保存辦細胞集團，係於37.GT：熱水浴巾急速融解後，直制作注射劑或者滴注劑，或者在懸浮於1〇〜5〇〇 mL之生理食鹽水之狀態下用作注射劑或者滴注劑。

該醫藥表現出實施例3所示之細胞毒性，病之治療有效。又，該醫藥對藉由過繼免疫各疾病有效。並對上述各疾療法治療上述 [產業上之可利用性;] 很骤本發明，可提供田飑集團之製造方法由該方法而獲得之γδτ細胞’例如適用於法此，本發明之方法可期待對醫療二 [序列表自由文本] η作出極大貢獻。藉因序列編號1 序列編號2 纖維黏連蛋白之部分纖維黏連蛋白之部分區域III-8 區域III-9 129597.doc -52· 200844235 序列編號3 :纖維黏連蛋& 曰之部分區域III-10 序列編號4 :纖維黏連蛋白 <部分區域III-11 序列編號5 ·纖維黏連蛋白贫曰之部分區域ΙΠ-12 序列編ί虎6 ·纖維黏連蛋白 I曰之部分區域III-13 序列編號7 :纖維黏連蛋白 I曰之部分區域III-14 • 序列編號8:纖維黏連蛋白之部分區域⑴

• 序列編號9 :纖維黏連蛋白片段c_274 序列編號1 〇 ·纖維黏連蛋白片段H 馨序列編號11 .纖維黏連蛋白片段Η 296 序列編號12 ·纖維黏連蛋白片段! 序列編號13 ·纖維黏連蛋白片段cH_296 序列編號14:纖維黏連蛋白片段c_csi 序列編號15 ··纖維黏連蛋白片段cH_296Na 序列編號16 :纖維黏連蛋白片段cHV_89 序列編號17 :纖維黏連蛋白片段CHV-9〇序列編號1 8 :纖維黏連蛋白片段cHV_92 _ 序列編號19 :纖維黏連蛋白片段cHV-i79 序列編號20 :纖維黏連蛋白片段chV-181 « 序列編5虎21 ·纖維黏連蛋白片段H-275-Cys

• 序列編號22 ·纖維黏連蛋白片段H296-H296 序列編號23 ·引子H296-NeoF

序列編號24 :引子只296-1^11(111 序列編號25:引子H296-Nc〇R 序列編號26 ·引子NC2-5’UTR 129597.doc -53- 200844235 【圖式簡單說明】圖1係表示纖維黏連蛋白之區塊結構的模式圖。圖2係表示H296-H296之製作方法的圖。

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Claims

200844235 十、申請專利範圍： 1. 一種γδΤ細胞集團之製造方法，其特徵在於：其包含將含有γδΤ細胞之細胞集團，於⑷纖維黏連蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物，及（bhST細胞活化因子之存在下進行培養的步驟。 2. 如凊求項1之製造方法，其中於纖維黏連蛋白、纖維黏連蛋白片段或該等之混合物之存在下進行培養之步驟，係於IL-2之存在下而實施。 3·如請求項1或2之製造方法，其中纖維黏連蛋白片段為：含有至少1個序列表之序列編號i〜8所表示之胺基酸序列而成的多肽（m);或含有至少1個於上述任意個胺基酸序列中有1個或者多個胺基酸經置換、缺失、插入或者附加之胺基酸序列而成、且與上述多肽（m)具有相同功能的多肽（η)。 4·如請求項3之製造方法，其中纖維黏連蛋白片段係亦含有序列表之序列編號5〜8所表示之胺基酸序列中之任一個的多肽。 5·如請求項3之製造方法，其中纖維黏連蛋白片段係包含序列表之序列編號9〜22中之任一個所表示之胺基酸序列的多肽。 6·如請求項1或2之製造方法，其中γδΤ細胞活化因子係雙磷酸系化合物及/或焦磷酸單酯系化合物。 7·如請求項6之製造方法，其中雙磷酸系化合物係選自由帕米膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、唑來膦酸鹽、利塞膦酸鹽、 129597.doc 200844235 奈立膦酸鹽、伊班膦酸鹽、因卡膦酸鹽、奥帕膦酸睫、索帕鱗酸鹽、米諾膦酸鹽、EB1053、依替膦酸鹽、氣屈騰酸鹽、替魯膦酸鹽及亞甲基二膦鹽所組成群： 1種化合物。 ) 8如月求項6之製造方法，其中焦磷酸單酯系化合物係選自由焦蝣酸異戊烯酯、焦磷酸2_甲基_3_丁烯_1_酯及焦磷酉欠4搜基_3·甲基_2_丁烯小醋所組成群中的至少1種化合物。

9.如請求項!或2之製造方法，其進而包含於細胞集團中導入外來基因之步驟。 1〇.如=求項9之製造方法，其係使用逆轉錄病毒載體、腺病毒载體、腺相關病毒載體、慢病毒載體或猿猴病毒載體而導入外來基因。 11· 一種γδτ細胞集團，其係藉由如請求項no中任一項之製造方法而獲得。 i2. -種醫藥’其係含有藉由如請求項中任一項之製造方法而獲得之γδΤ細胞集團作為有效成分。 13 · —種疾病治療方法或預防方法々乃沄其係包含對被實驗者投予有效量之藉由如請求項1曼 ^ 峭1 2 3主10中任一項之製造方法而獲得之γδΤ細胞集團的步驟。 I4· 一種藉由如請求項1至10中任一 τ仕項之製造方法而獲得的 γδτ細跑集團之用途’其係用於製造醫藥。 I29591.doc 1 5· —種藉由如請求項1至〗〇中任— 2 1 項之製造方法而獲得之 3 γδτ細胞集團，其係用於過繼免疫療法。