JPH03228683A - 生理活性ペプチドＬＤ７８α、ＬＤ７８βおよびその製法、これに用いる組換えプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生理活性ペプチドＬＤ７８αおよびＬＤ７８
β、これらのペプチドを酵母番こより産生させるための
組換えプラスミド番こ関する。さら（こは、これらのペ
プチドの効率的な製法およびその利用方法に関する。

〔発明の前景〕

ヒトリンパ球を、１２−０−テトラデカノイ！レホ！レ
ボルー１３−アセテート（ＴＰＡ）或はファイトへマグ
ルチニン（ＰＨＡ）等で刺激すると、インターロイキン
２、γ−インターフェロン等の発現が誘導されること力
（知られている［Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　Ｖｏｌ
　１６３．　ｐ９２２（１９８６）　］　。

本発明者らは、ヒト扁桃腺リンノく球のｃＤＦＩＡ力）
らＴＰＡ、　ＰＩ（Ａで刺激することにより特異的に発
現が誘導される新規の生理活性ポリペプチドをコードす
ることが予想されるｃＤＮＡクローン（ｐＬＤ７８ｃＤ
ＮＡ）を得た［　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
ｖｏｌ　９９．８８５−８９４　（１９８６）　］、　
　Ｌかしながら、ＬＤ７８に相当するヒト由来ポリペプ
チドは未だ同定されていない、そのため、ＬＤ７８ポリ
ペプチドの生理活性は全（未知のものであった。

ＬＤ７８はそのｃＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ
酸配列より、β−スロンボグロプリンスーパーファミリ
ジー属すると考えられる。β−スロンボグロプリンスー
パーファミリジー属するポリペプチドの機能は、炎症、
損傷治癒、造腫瘍性との関連が示唆されている［　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ、’、Ｖｏｌ　８４．７１８８−７１９２（１９
８７）、　Ｃｅ１ｌ、　Ｖｏｌ　４９゜３２１−３２８
（１９８７）、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、、　Ｖｏｌ
　１６６、１０８４１０９７　（１９８７）　］　。

以上のような状況の中で、ＬＤ７８の生理活性を明らか
にするにあたっては、ヒト由来ＬＤ７Ｂポリペプチドが
得られていない現状では大きな制約があり、生化学的に
抗ＬＤ７８抗体すら得られていないことからその解析は
困難を極めていた。

リンパ球は、リンフ才力インと呼ばれる免疫反応のメデ
イエータ−である生理活性ポリペプチドを産生ずる０分
子生物学および細胞生物学の急速な発達により、各種リ
ンフ才力イン、およびマクロファージにより産生される
モノ力イン（これらを総称してサイト力インと呼ばれて
いる）の生物学的機能、役割が徐々に解明されつつある
。

血球系細胞の増殖・分化には種々のサイト力インが関与
し、複雑なネットワークを形成していることが知られて
いる　し実験医学、ＶＯＬ　７．２５−３０（１９８９
）　１　、　　造血に関与する主なサイト力インは、イ
ンターロイキン（ＩＬ−１〜７．９）、顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−Ｃ５Ｆ）、顆粒球−マクロファージコロ
ニ刺ｆｆｉ　因子（Ｇ！４−Ｃ３Ｆ）、マクロファージ
コロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）、エリスロボイエチン
（ＥＰＯ）等である。

それらの多くは、標的となる細胞によって程々の生理活
性をあられす０分化後期の血球系細胞に作用する因子、
たとえばＧ−Ｃ８ＦやＥＰＯの場合には、それぞれ、好
中球コロニー形成促進および活性化、赤血球産生の調節
といった作用が顕著にあられれ、一部は既に治療薬とし
て用いられている。

また、ＩＬ−３はマルチコロニー刺激因子としても知ら
れ、骨髄細胞から種々のコロニーを産生させることから
、非常に未分化の細胞（骨髄幹細胞）に作用しているも
のと考えられている。これらは、いずれも細胞の増殖、
コロニー形成に対して促進作用をもっており、血球系細
胞の正の制御因子である。

一方、血球系細胞の増殖・分化の調節において、血球系
細胞のホメオスタシスを維持するため、負の制御因子も
重要視されている。骨髄ｍ＠のコロニー形成を抑制する
ことが知られている因子は、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ−β
）、インターフェロン類、ナチュラルキラー細胞由来因
子等である［　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　　　Ｖｏｌ　　１６８．　７３７−７５０（
１９８８）、　　Ｅｘｐ、　　Ｈｅｍａｔｏｌ、。

Ｖｏｌ　１６．１３１−１３８（１９８８）１．　　中
でも、ＴＧＦ−βは、腫瘍増殖因子として単離されたも
のであるが、血球系細胞に対しては１分化初期の前駆細
胞の増殖と分化を選択的に抑制する。そして、分化後期
の細胞については増殖・分化を抑制しない、このように
、対象となる細胞種によって同一のポリペプチドでも全
く異なる作用を示す例も少なくない。

一つのポリペプチドが作用する細胞によって種々の活性
を示す例として、白血病細胞増殖抑制因子（ＬＩＦ）が
あげられる、ＬＩＦは、もともとマウスの白血病細胞株
Ｍ１細胞の増殖抑制・分化誘導因子として同定された［
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、　、　Ｖｏｌ　２６３
９２３８−９２４３（１９８８）］、　　Ｌかしその後
、ＬＩＦは以下に示すような様々な生理活性を持つ因子
と同一のポリペプチドであることが判明した。たとえば
、ヒトＴ細胞が産生ずる、マウス　ＩＬ−３依存性細胞
ＤＡ１ａの増殖因子［Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ　３３６
．６９０−６９１＜１９８８）　］、肝細胞に作用して
急性期タンパク質を誘導する肝細胞刺激因子ｍ　（Ｈ８
ＦＩｎ　）　［Ｊ、　１ｗ＋１ｉｕｎｏｌ。

Ｖｏｌ　１４３．１１６３−１１６７（１９８９）］、
全能性胚性幹細胞ＥＳ細胞、テトラカルシノーマ幹細胞
および脂性癌細胞ＥＣ細胞に作用してその未分化状態を
保持する因子［Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ　３３６．６８
４−６８７（１９８８）、　Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ　３３６．６６８−６９０（１９８８）］　等テ
アＬ。

また、血球系細胞に作用する因子であるからといって、
必ずしもリンパ球のみが産生ずるわけではなく、ＬＩＦ
をはじめ顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン６
等は繊維芽細胞等によっても産生されることが明かとな
っている。

このように、生体内では、一つの生理活性ポリペプチド
が様々の細胞に対して働きうる可能性が示唆されるよう
になってきた。

ＬＤ７８遺伝子に関しては、その生理活性が明らかにさ
れないうちに、分子生物学的手法によって遺伝子がクロ
ーニングされた。そのような場合、遺伝子産物の同定と
生理活性の探索には困難を極める０通常は、遺伝子操作
技術を用いて適当な宿主にリコンビナントポリペプチド
を産生させ、その物理的、化学的、生物学的性状を検討
することになる。しかし、すべての遺伝子が同様に発現
されるわけではなく、遺伝子発現に用いるベクターおよ
び宿主の選択に一般的な規則性は見いだされてはいない
、また、発現されるタンパク質が、本来生体内に存在す
るタンパク質と同一の生理活性を持つという保証は全く
といってよいほどない。

多くの場合、タンパク質の二次構造、三次構造の違い、
タンパク質修飾の有無（糖鎖およびアシル化等）が異な
ることが知られている。さらには、サイト力イン類の場
合には、非常に微量でも相乗的に働くことも知られてお
り（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、Ｖｏ１１６６、１８５
Ｈ１９８７））、遺伝子発現系に起因する混入物が研究
をさらに困難にしている。

〔発明の目的〕

本発明者らは、新規のサイト力インをコードすると期待
されるヒトＬＤ７８αおよびβをコードする遺伝子をク
ローニングし、これを適当な遺伝子発現プロモーターの
制御下に組み込み、酵母において発現させ、該酵母細胞
を培養することによって、ＬＤ７８ポリペプチドを純粋
なポリペプチドとして得ることに成功した。さらにこの
ポリペプチドがこれまでに知られていない生理活性を有
することを見いだし本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、新規な生理活性ペプチドＬＤ７８
αおよびＬＤ７８β、これらを大量に得る製法を提供し
、さらにこのペプチドの新たな生理活性を明らかにする
ことによりこのペプチドの新たな利用方法を提供するも
のである。

〔発明の構成及び効果〕

本発明のＬＤ７８αおよびＬＤ７８βポリペプチドは、
骨髄単核細胞の培養において、血液系細胞の源である骨
髄幹細胞の増殖・分化を抑制する物質で、増殖性の高い
細胞を死滅させる抗癌剤等、化学療法剤等の投与時にみ
られる骨髄抑制を軽減する治療薬として利用しうる有用
な物質である。

また、ＬＤ７８αおよびＬＤ７８βポリペプチドは自家
骨髄移植や骨髄バンクを構築する上で、骨髄幹細胞を未
分化のままで保存、あるいは培養することを可能にしう
る有用な物質である。

本発明者らは、上記目的を達成する為に研究を行った結
果、ヒトＬＤ７８β遺伝子のクローニング、塩基配列の
決定、ＬＤ７８α及び該ＬＤ７８β遺伝子を組み込んだ
プラスミドにより形質転換され、リコンビナントＬＤ７
８α及びＬＤ７８βを発現する酵母を培養することによ
り、目的とするリコンビナントＬＤ７８α及びＬＤ７８
βポリペプチドを大量に製造する方法を確立した。

本発明では、発現されるリコンビナントＬＤ７８α及び
ＬＤ７８βはほとんど＃母菌体内に蓄積されることなく
、培養液中に効率的に分泌された。

ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遠伝子に口伝子されるタンパ
ク質は比較的低分子であって、酵母菌由来のプロテアー
ゼによって分解を受けやすい０分泌発現系は、このよう
なプロテアーゼによる損傷を最小限に抑えることができ
る優れた生産方法である。また、培地中に放出される酵
母由来タンパク質は僅かであるので、目的物質の精製が
容易であるだけでなく、生理活性を探索する上では、微
量タンパク質が混在する可能性が掻めてうすい為、信頼
性の高い結果を得ることが出来るなど、菌体内発現の場
合と比較してきわめて有利である。

このようにして初めて、ＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリ
ペプチドの生理活性を探索することが可能となった０本
発明者らは、このペプチドの様々な生理活性を検討した
結果、ＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドが、骨髄
単核細胞の培養において、骨髄造血幹細胞に直接的或い
は間接的に作用し、その増殖・分化を抑制することを明
らかにしたことにより、本発明を完成に至らしめた。

本発明の完成によって、純粋なリコンビナントＬＤ７８
α及びＬＤ７８βポリペプチドが容易にかつ大量に入手
し得る手段が提供され、さらには、リコンビナントＬＤ
７８α及びＬＤ７８βは白血病などの癌治療に用いられ
る化学療法剤の投与時にみられる骨髄抑制の防止薬とし
て、自家骨髄移植や、骨髄幹細胞移植、骨髄バンクの構
築に必須となる骨髄幹細胞の分化抑制剤として、将来予
想される遺伝子治療の標的細胞となる骨髄幹細胞の培養
技術の開発等に必須な研究試薬として、医学の発達に貢
献するところは大きい。

以下に本発明の組換えプラスミド、形質転ｔｔａｕ母、
それによる純粋なリコンビナントＬＤ７８α及びＬＤ７
８βポリペプチドの製造、及びリコンビナントＬＤ７８
α及びＬＤ７８βポリペプチドの生理活性についてさら
に詳細に説明する。

ＬＤ　　　α　　ＬＤ７ 本発明に用いられるシャトルベクターに組み込むための
ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子は、ＴＰＡ及びＰＨＡ
で刺激した扁桃腺リンパ球より調製したｌＲＮ＾を出発
材料として常法に従い逆転写酵素により二本鎖ｃＤＮＡ
を合成し、これを大腸直によりクローニングしたもので
ある。

ＬＤ７８α遺伝子ｃＤＮＡは約９００塩基対からなり、
アミノ酸をコードする領域の完全な配列を含む、このＬ
Ｄ７８α遺伝子ｃＤＮ＾をプローブとしてヒト染色体Ｄ
ＮＡのサザン分析を行うと、三本のバンドが検出された
（サイズは、４．２Ｋｂ、　４．８Ｋｂ、　６．５Ｋｂ
　）。　　ヒトデノミツクＤＮＡライブラリーをＬＤ７
８α遺伝子ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングを
行い、４．８）ＩｂのゲノミックＤＮＡを含んだ陽性ク
ローンの塩基配列を決定したところ、ＬＤ７８αとアミ
ノ酸配列が５個のみ異なるペプチドをコードするＬＤ７
８αと相同性の高い遺伝子の存在を確認した。以下、こ
れをＬＤ７８βと呼ぶ。

ＬＤ７８β遺伝子ｃ　ＤＮＡは、すでに得ていたしＤ７
８α遺伝子ｃＤＮＡをプローブとして、ＬＤ７８α遺伝
子ｃＤＮＡのクローニングを行ったものと同じｃＤＮＡ
ライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法に
よって陽性クローンを得、その中からＬＤ７８β遺伝子
に特異的な制限酵素の切断部位を持つクローンを得て、
塩基配列を決定することで、ＬＤ７８β遺伝子ｃＤＮ＾
であることを確認した。

このようにしてクローニングされたＬＤ７８α及びＬＤ
７８β遺伝子は、タンパク質をコードする全領域を含み
、その塩基配列も本発明者らにより決定されたもので、
第１ａ図および第１ｂ図に示す配列を有する０以上のよ
うにして得たＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子ｃ遺伝子
上ＤＮＡ限酵素Ｘｈｏ　Ｉ及び旧ｎｄ　ｍ　による消化
によりアミノ酸をコードする全領域のＬＤ７８α及びＬ
Ｄ７８β遺伝子断片を調製し、後述のプラスミド構築に
供する。

ｚ　トルベ　　− 本発明で用いられるシャトルベクターは、酵母遺伝子と
大腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵母内で機能する外来遺
伝子発現用プロモーターを持ったプラスミドベクターで
ある。

酵母の遺伝子としては、一般にプラスミドが酵母菌体内
で独立したＤＮＡとして複製、増殖するのに必要なりＮ
Ａ配列、例えば酵母の染色体ＤＮＡの自立複製に必要な
りＮＡ配列（ａｒｓ＞と　２μｍＤＮＡの複製に必要な
りＮＡ配列（２μＤＮ＾ｏｒｉ）があり、所望によりさ
らに形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子が含まれ
る。この選択マーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、
ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウ
ラシル産生遺伝子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、
これらの一種または二種以上が用いられる。

大腸菌側の遺伝子としては、大腸菌体内においてプラス
ミドが複製するために必要なりＮＡ配列、たとえばＣｏ
１Ｅｌ系のプラスミドの複製開始点のＤＮＡ配列を有し
、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとし
てはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子
、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール
耐性遺伝子などが挙げられる。このような大腸菌ＤＮＡ
として、アンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐
性遺伝子とを有するプラスミドｐＢＲ３２２が一般的に
使用されている。

ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子を発現させる為の酵母
内で機能するプロモーターとしては、酵母のグリセルア
ルデヒド　３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）プロ
モーター、抑制性酸性フォスファターゼ（ＰＨ０５）プ
ロモーター等が好ましい一例として挙げられる。さらに
、このようなプロモーターの下流には外来遺伝子を組み
込むための適当な制限酵素切断部位を有し、この部位に
ＬＤ７８ペプチドの構造遺伝子を導入することによって
、ＬＤ７８遺伝子本来の翻訳開始コドンから正確にポリ
ペプチドに翻訳させることができる。

本発明の組換えプラスミド、すなわちＬＤ７８αまたは
ＬＤ７８β遺伝子を組み込んだプラスミドの調製は、ま
ず前記シャトルベクターをプロモーター下流の外来遺伝
子挿入部位の制限酵素（Ｓａｌ■）で消化して開裂させ
、これに上記ＬＤ７８αまたはＬＤ７８βＤＮＡを加え
てＤＮＡリガーゼにより連結させる。これを大腸菌にて
増幅し、各種制限酵素分析によって正しい部位に正しい
方向で組み込まれたクローンを選択し、目的とする組換
えプラスミドを得る。

用いられるＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子は、構造遺
伝子全領域、或は構造遺伝子の一部、好ましくはＬＤ７
８α及びＬＤ７８βポリペプチドのマチュア部分に相当
するＤＮＡ断片である。この場合、組み込んだＬＤ７８
α或はＬＤ７８β遺伝子を発現させる為に、翻訳開始コ
ドン（ＡＴＧ）を含むＤＮＡ配列を付加する必要がある
。そのＤＮＡ配列としては、分泌タンパク質の分泌シグ
ナル配列をコードするＤＮＡ配列、例えば酵母インベル
ターゼ遺伝子の分泌シグナルをコードするＤ　Ｎ　Ａ。

ヒトアミラーゼ遺伝子の分泌シグナルをコードするＤＮ
Ａ等が挙げられる。また、ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺
伝子の分泌シグナル配列内に変異を導入し、発現量の向
上、シグナル配列切断部位の変更等を行うこともできる
。さらには、ＬＤ７８α或はＬＤ７８βマチュアボリベ
プチドのアミノ末端のアミノ酸配列を変更することによ
って、生理活性に影響を及ぼすことなく、産生されるポ
リペプチドの安定化、発現量の向上を図ることもできる
。

ン 形質転換されるべき酵母としては、プラスミドで担われ
た形質転換の選択マーカー遺伝子によって相補される変
異を持った変異株、例えばロイシン要求性変異株である
サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　ＡＨ２２（ａ　　
１ｅｕ２　　ｈｉｓ４Ｃａｎ　１　）を用いる。また、
低分子量のポリペプチドを効串よく発現させる為に、プ
ロテアーゼ欠損変異株、例えばサツカロミセス・セレビ
シェＪＮ８９０６（ａ　１ｅｕ２　ｕｒａ３　Ｐｅｐ４
：ＩＪＲＡ３）を用いることができる。

上記組換えプラスミドを大腸菌にて増幅させた後、該酵
母変異株に常法により作用させ、例えばＤＮＡを菌体内
に取り込みうるように処理した菌体とプラスミドＤＮＡ
とを混合して形質転換を起こさせる。このように処理さ
れた酵母をベクタープラスミド上に担われている宿主酵
母の変異を相補する遺伝子、例えばロイシン産生遺伝子
の発現を指標として形質転換酵母を選択し分離する。な
お、酵母としてはロイシン要求性の他に、ヒスチジン要
求性変異株、ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変
異株等が挙げられる。

の　　　　　　　ＬＤ　　　　の 上記の方法で得られた形質転換酵母を通常の培養条件下
で培養し、培養後、その培養上清中には分泌されたＬＤ
７８α及びＬＤ７８βポリペプチドが集積される。酵母
で産生じたＬＤ７８ポリペプチドの分子量は、精製後、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで還元条件下、電気泳
動すると、ＬＤ７８α及びＬＤ７８β共に約８ＫＤであ
る。しかし、分画分子量１．０００　　（ロミコンＨＦ
ｌ−４３−Ｐ間１；オルガノ社）の限外濾過膜を用いて
ＬＤ７８を産生じている酵母の培養上清を濃縮してもＬ
Ｄ７８ポリペプチドを回収することはできない、その為
、ＬＤ７８ポリペプチドの回収は酵母菌培養上清に酢酸
バッファーを加えてＰＨを調製した後、陽イオン交換カ
ラム〈東ソ、ＳＰ）ヨパール）を用いて行う。

また、ＬＤ７８ポリペプチドは高塩濃度下で凝集性があ
ることがわかったので、酵母菌を酢酸アンモニウム存在
下で培養することにより、分画分子量１０．０００の限
外濾過膜（ミリポア社）を用いて酵母菌培養上清中から
ＬＤ７８ポリペプチドを濃縮・回収することが可能であ
る。酢酸アンモニウムの存在下で酵母菌を培養しても、
酵母菌の増殖及びＬＤ７８ポリペプチドの産生量にほと
んど影響は見られない。

ＬＤ７８ポリペプチドの分泌・産生量を向上させるため
には、酵母菌を無機リン酸非存在下で培養し、さらに炭
素源として通常用いられるブドウ糖の代わりに、高濃度
の蔗糖を用いると効果的である。

ＬＤ７８の予想される生理活性の一つとして内在性パイ
ロジエンの可能性があげられる。そのため、ＬＤ７８の
生理活性を追究するためには、パイロジエンの混入を掻
力避叶る必要がある０本発明においては、宿主として大
腸菌よりはるかに進化の程度が高い真核生物である酵母
を用いており、さらにＬＤ７８ポリペプチドが酵母によ
り分泌されることから、例えば外因性パイロジエンとし
て知られるＬＰＳをその成分として有する大腸菌を宿主
とした発現系よりもパイロジエンの混入を大幅に抑える
ことが可能である。　　また、動物細胞の培養発現系の
場合には、培養時に通常添加する牛胎児血清中あるいは
培養細胞培養上清中に存在する微量生理活性物質の混入
を避けることは非常に困難である。これらのことから、
酵母を用いた発現系、望ましくは分泌発現系は非常に有
用である。

本発明において酵母により分泌発現されるＬＤ７８α及
びＬＤ７８βポリペプチドは、酵母菌体中で発現され菌
体外へ分泌される際に、そのシグナルペプチド部分が切
断され、本来のＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチド
の形となり培養上清中に蓄積されるものと考えられる。

このことは、培養上清中から回収されるＬＤ７８α及び
ＬＤ７８βポリペプチドの分子量、そしてそれらのアミ
ノ末端のアミノ酸配列から裏付けられた。

酵母により産生されるＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペ
プチドを高純度に精製し、アミノ酸シーケンサ−（ＡＢ
Ｉ社製）によりアミノ末端のアミノ酸配列を決定した。

ＬＤ７８α及びＬＤ７８β構造遺伝子の翻訳開始コドン
から３２塩基上流にある制限酵素Ｘｈｏ　１部位から、
構造遺伝子の翻訳終止コドン（ＴＧＡ）から下流１０塩
基にある制限酵素旧ｎｄ　ｍ部位までのＬＤ７８α及び
ＬＤ７８βの全構造領域を含むＤＮＡ断片を酵母で発現
させた場合には、アミノ末端のアミノ酸配列は以下のと
おりである。

ＬＤ７８α； ＾ｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＡｓｐＬＤ７８β； Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ＾ｌａヒト細胞株由来のＬＤ７８
ポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列はこれまで知
れれていなかったが、本発明者らは、ＨＴＬＶＩ感染Ｔ
細胞株が発現するＬＤ７８ポリペプチドを酵母産生ＬＤ
７８ポリペプチドの精製法に準じて精製し、そのアミノ
末端配列を明らかにした。それを以下に示す。

Ｎａｔｉｖｅ　　Ｌ　Ｄ　７　８・ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　−
−−−−−Ｐｈｅ　５ｅｒＴｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ
　　Ａｒｇ　ＧｉｎマチュアＬＤ７８ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を、種・ンの分泌タンパク質のシグ
ナル配列に相当するＤＮＡ配列と結合したＬＤ７８α及
びＬＤ７８β遺伝子ＤＮＡ断片、或は実施例２に示すよ
うに、ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子のシグナルペプ
チド配列に相当するＤＮＡ配列を改変したＬＤ７８α或
はＬＤ７８β遺伝子を含むＤＮＡ断片を酵母で分泌発現
させると、上記ＮａｔｉｖｅＬＤ７８と同じアミノ末端
配列を持つＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドを得
ることができる。

７　　　　　　たＬＤ　　　ａ　　　ＬＤベプ　　の　
　　　°　　ヒ 酵母により分泌発現されたＬＤ７８ポリペプチドを酵母
培養上清から濃縮・回収し、イオン交換カラム、ヘパリ
ンカラム、ヒドロキシアパタイトカラム等により高純度
に精製し、精製ＬＤ７８ポリペプチドの生理活性を検討
した。

ＬＤ７８　鳳ＲＮＡは、ＴＰＡ、ＰＨＡ等の刺激により
種々のＴ細胞株、ヒト組織球系リンパＩＩＵ９３７、急
性前骨髄白血病細胞株ＨＬ６０、神経膠腫細胞株Ｕ１０
５ＭＧ、繊維芽細胞等で発現する。アミノ酸配列の比較
から、ＬＤ７８ポリペプチドはβトロンボグロブリンフ
ァミリーに属すると考えられ、炎症、損傷治癒等に関与
することが示唆される。

高純度に精製した酵母産生ＬＤ７８ポリペプチドを、１
００μｇ／Ｋｇの濃度でＳＰＦウサギに投与しても発熱
を誘導しない、また、白血球遊走、Ｈ２Ｏ２産生誘導も
顕著に示さない、これらの点から、ＬＤ７８ポリペプチ
ドは、アミノ酸レベルで相同性の高いマウスＭＩＰ１ポ
リペプチド（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

、　　Ｖｏｌ　　１６７、　５７０−５８１（１９８８
）、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　Ｖｏｌ　　２４３゜１０
６６−１０６８　（１９８９））とは異なる物質である
と考えられる。

未分化な血球系細胞に対して、ＬＤ７８ポリペプチドは
順著な作用を示す、増殖因子依存性ヒト骨髄単球系細胞
株ＫＭＴ２　　（Ｂｌｏｏｄ、　Ｖｏｌ　７６、５０１
５０７　（１９９０＞　）に対して、酵母産生ＬＤ７８
α及びＬＤ７８βはヒトインターロイキン３存在下で細
胞の増殖を抑制する。また、正常ヒト骨髄細胞をヒトイ
ンターロイキン３の存在下で培養すると、顆粒球−マク
ロファージコロニー、巨核球コロニー等が形成されるが
、ＬＤ７８α或はＬＤ７８βポリペプチドをこの系に添
加するとコロニー形成は抑制される。

さらには、正常ヒト骨髄細胞がらＣＤ３４陽性細胞をセ
ルンーターにより分離・収集し、これをヒトインターロ
イキン３及びＬＤ７８α或いはＬＤ７８αとの存在下で
一週問培養しく前培養）、その後、ＰＨＡで刺激したリ
ンパ球培養土清（ＰＨＡ−ＬＣＭ）とエリスロボイエチ
ン（ＥＰＯンとによりコロニーを形成させると、ＩＬ３
だけを用いて前培養を行った場合に比べて、形成される
コロニーの数は減少する。

ところが、ＣＤ３４陽性細胞を前培養することなく、Ｌ
Ｄ７８α或いはＬＤ７８β、ＩＬ３、ＥＰＯｌＰＨＡ−
ＬＣＭの存在下で培養すると、形成されるコロニー数は
ＬＤ７８α或いはＬＤ７８β未添加の場合と比べて変化
はない。

これらのことは、ＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチ
ドは骨髄幹細胞に対して直接的或いは間接的に作用して
、その増殖・分化を抑制することを示している。

ＣＤ３４抗原は赤血球系、顆粒球−マクロファージ系及
び巨核球系細胞のコロニーを形成する未分化な前駆細胞
に発現しており、ＣＤ３４陽性細胞は骨髄再構築能を持
つＣＪ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、Ｖｏｌ　８１、
９５１−９５５（１９８８＞）ことから、血液幹細胞を
含むものと考えられている。

造血幹細胞の増殖・分化を抑制する因子としては、他に
ＴＧＦβＣＮａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ　３２９．５３９−
５４１　（１９８７））ＭＩＰ　１　（Ｎａｔｕｒｅ、
　Ｖｏｌ　３４４．４４２−４４４（１９９０））等が
報告に見られる。ＭＩＰＩとＬＤ７８とはアミノ酸配列
のレベルで相同性は高いが、上述したように生理活性が
異なるため、生物学的には異なる種類の物質である。

次に実施例を挙げてさらに本発明を具体的に説明する。

ＬＤ７　　　α　　　　ＬＤ 耳１ ＬＤ７８αｃＤＮＡは０ｂａｒｕらが示した方法で得た
（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、　　Ｖｏｌ　９９．８８５−８
９４＜１９８６））、　　本発明者らはＬＤ７８β遺伝
子を得るため、常法によりヒト胎盤ＤＮＡを調製した後
（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ：ｎｇ、　２８０−２
８１．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｌａｒｂｏ
ｒ、　ＮＹ、　ＵＳＡ（１９８２））、制限酵素Ｅｃｏ
　Ｒ１で消化し、ファージベクターＣｈａｒｏｎ　４Ａ
（Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ　１１．２９１（１９８０））に
クローニングした。

そして、ＬＤ７８α　ｃＤＮＡをプローブとしてプラー
クハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得た
。陽性クローンのうち、ＬＤ７８αゲノミックＤＮＡの
サイズ　（４，２Ｋｂ）とＤＮＡサイズの異なる挿入Ｄ
　Ｎ　Ａ　　（４，８Ｋｂ）について、市販の塩基配列
決定キット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；　ｔｌ、ｓ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ、　Ｃ１ｅｖｅｆａｎｄ、
　０ｈｔｏ　ＵＳＡ）を用いて塩基配列の決定を行った
。その結果、このＤＮＡ断片に含まれる遺伝子はＬＤ７
８α遺伝子と相同性は高いが興なる遺伝子（ＬＤ７８β
）であることを確認した。塩基配列の情報から、ＬＤ７
８β構造遺伝子にはＬＤ７８α構造遺伝子にないユニー
クな制限酵素部位（Ｂｓｔ　Ｎｌ）があり、この制限酵
素で消化することで、ＬＤ７８α遺伝子とＬＤ７８β遺
伝子とを区別できる。

次に、ＬＤ７８βｃＤＮ＾を得るために、本発明者らは
、上記０ｂａｒｕらが示したｃＤＮ＾ライブラリーから
、ＬＤ７８α　ｃ　ＤＮＡをプローブとして陽性クロー
ンをスクリーニングし、制限＠素Ｂｓｔ　Ｎ１部位の有
無によりＬＤ７８β　ｃＤＮＡを単離した。

ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子のペプチドをコードす
る領域の塩基配列及びアミノ酸配列を第１ａ図及び第１
ｂ図に示す、ＬＤ７８α遺伝子とＬＤ７８β遺伝子は、
アミノ酸配列において５つのアミノ酸が異なる。

このようにして得られたＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝
子ｃＤＮ＾は、いずれも制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ及びＨｉｎ
ｄ　［１切断部位を持ち、これらの酵素で消化すると、
ＬＤ７８α及びＬＤ７８β構造遺伝子を遺伝子発現ベク
ターに結合挿入するためのＤＮＡ断片を得ることができ
る。

Ｎａｔｉｖｅ型ＬＤ７８遺伝子と同じアミノ末端配列を
持つＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドを発現させ
るために、以下に示すオリゴヌクレオチドを合成し、そ
れらをブライマーとするポリメラーゼチェーン反応（Ｐ
ＣＲ）によって、ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子の分
泌シグナルＤＮＡ配列の改変を行った。

オリゴヌクレオチドの合成は、アブライドバイオシステ
ムズ社製ＤＮＡシンセサイザーモデル３８１Ａを用い、
β−シアノエチルアミダイト法によリヌクレオチド結合
反応を行った。常法により保護基を除去した後、ＯＰＣ
（アブライドバイオシステムズ社）を用いて目的とする
オリゴヌクレオチドを精製した。

合成したオリゴヌクレオチドを以下に示す。

Ｐｒ１ｓ＋ｅｒ　＃ｌ； ５’　ＣＡＣＴＣＧ　ＡＧＣＣＣＡ　ＣＡＴ　ＴＣＣＧ
ＴＣ３’Ｐｒｉｍｅｒ　＃２； ５’　ＧＣＣＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣ
ＣＣＣＴ　３’Ｐｒｉｍｅｒ　　＃３： ５’　ＡＧＣＡＣＣＡＧＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡ
ＧＣＡＡＧ　ＧＧＣＡ　３゜Ｐｒｉｍｅｒ　＃４； ５　　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＧＣ
Ｔ　ＧＡＣＡＣＧ　ＣＣＧ　３″Ｐｒｉｍｅｒ　＃５； ５’　ＡＧＣＡＣＣＡＧＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣＧ
ＧＣＡＡＧ　ＧＧＣＡ　ＲＰｒｉｍｅｒ　＃１は第１ａ
図の塩基配列上で２６〜４６塩基、Ｐｒｉｍｅｒ　＃２
は３６０〜３３９塩基に対応し、これらのブライマーを
用いてＰＣＲを行うと、ＬＤ７８α、ＬＤ７８β共に、
ポリペプチドをコードする全領域のＤＮＡ配列を増幅す
ることができる。

シグナル配列切断部位の改変のため、ＬＤ７８α遠伝子
についてはＰｒｉｍｅｒ　＃３，４を、ＬＤ７８βにつ
いてはＰｒｉｍｅｒ　＃５．４を用いたく第２図）、　
　ｐｃＲは市販のキット（宝酒造）を用いて行った。

ＬＤ７８αについては、まずＬＤ７８α　ｃＤＮ＾全長
を含むプラスミドｐＬＤ７８αをテンプレートとして、
ブライマー＃１と３、ブライマー＃２と４によりＰＣＲ
を行い、それぞれ約９０　ｈｐ　、２４０ｂｐの増幅さ
れたＤＮＡ断片を得、ポリアクリルアミド電気泳動によ
り、これら二種のＤＮＡを分離回収した１次に、得られ
た二つのＤＮＡ断片を１対１の割合で混合し、沸騰洛中
で５分間、その後室温まで冷却してＤＮＡをアニールさ
せた。そして、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ反応を行い、
さらにブライマー＃１と２を加えてＰＣＲを行った。

ポリアクリルアミド電気泳動にて、約３２０ｂｐのＤＮ
Ａ断片が増幅されているのを確認した。この断片を分離
回収して制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで消化した後、発現ベクタ
ーに直接クローニングした。クローニングされたＤＮＡ
が、シグナル配列部分に相当するＤＮＡ配列に変異を持
つＬＤ７８α遺伝子であることは、市販のキットを用い
て塩基配列を決定することで確認した。

ＬＤ７８β遺伝子についても、同様な方法で改変を行っ
た。この場合、ＰＣＲを行う際、ブライマー＃３の代わ
りに１ライマー＃５を用いた。

酵母−大腸菌シャトルベクターｐＹＧ１０　　と実施例
１．２で得たＬＤ７８α及びＬＤ７８βｃＤＮＡを用い
て、酵母でＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドを発
現可能な組換えプラスミドを構築した（第３図）。

シャトルベクターｐＹＧ１０は、酵母の遺伝子としてａ
ｒｓ　１．２μｍＤＮ＾ｏｒ　ｔ、　ロイシン産生遺伝
子　（ＬＥＵ２）、及びＧＡＰＤＨプロモーターとター
ミネータ−とを有する酵母ＤＮＡと、大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２のＤＮＡ複製開始点を含む領域及びアンピ
シリン耐性遺伝子ＤＮＡとを持つプラスミドベクターで
、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で外来遺伝子を効率
良く、純粋な形で発現させることができる。このシャト
ルベクターは、制限酵素Ｓａｌ！で消化することにより
容易にその外来遺伝子組み込み部位を開裂させることが
できるため、所望の遺伝子を組み込むのには最適である
。

ＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドをコードする全
領域と、それらの５′及び３′非翻訳領域の一部を含む
ＤＮＡ断片が挿入されているプラスミド　（ｐＬＤ７８
−α、　ｐＬＩ１７８−βとその誘導体）を制限酵素Ｘ
ｈＯＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、ＬＤ７８α及び
ＬＤ７８β遺伝子部分を切りだした。Ｈｉｎｄｎ［部位
をＸｈｏ　１部位に変換するために、　ＡＧＣＴＴＧＧ
ＡＴＣＣＴＣＧＡＧの配列からなる旧ｎｄ　ｍ−ＢａＩ
ＩＨ■−Ｘｈｏ　Ｔ部位を有するリンカ−ＤＮＡを合成
し、これをＬＤ７８α及びＬＤ７８βｃＤＮ＾にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。ついで、得られたＤ
ＮＡ断片をＸｈｏ　ｒで消化して、ＤＮＡ断片の両末端
がＸｈｏ　１部位となったＤＮＡ断片を得た。

このＤＮＡ断片を、Ｓａｌ　Ｉで開裂したシャトルベク
ターｐＹＧ１０の外来遺伝子挿入部位にＴ４リガーゼを
用いて挿入した。得られた組換えＤＮＡを大腸菌８８１
０１株に導入してアンピシリン耐性株を選択し、得られ
た株からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切
断パターンから、ＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子がＧ
ＡＰＤＨプロモーターの下流に正方向に挿入されたプラ
スミド（ｐＹＧ１０ＬＤ７８α、　　ｐＹｏｌｏ−ＬＤ
７８β）を選定した。

宿主酵母としてサツカロミセス・セレビシェＪＮ８９０
６　（ａ　Ｉｅｕ２　ｕｒａ３　ＰＥＰ４：ＯＲ＾３）
を用い、アルカリ金属法により形質転換を行った。酵ｔ
　ＪＮ８９０６を１０−１のＹＰＤ培地（１％酵母エキ
ス、２％ポリペプトン、２％グルコース）で３０℃にて
培養し、対数増殖期（６００ｎ諺における吸光度０．８
〜１．５）の細胞を３５００　ｒｐｍ、で５分間遠心し
て集めた。滅菌水で一回洗浄した後、１　ｍｌの０．１
Ｍ酢酸リチウム溶液に細胞を懇濁し、３０℃で３０分間
振盪した。

細胞懸濁液のうち０．１１を取り、実施例３で示したＬ
Ｄ７８発現プラスミド１μｇを加え、３０℃で１５分間
振盪しな、これに０．１ｍｌ　６０　Ｋポリエチレング
リコール４０００溶液を加え、軽く攪拌した後、室温で
９０分間靜１した。滅菌水で二回細胞を洗浄した後、０
．１１の最小培地（０，６７％　Ｂａｃｔｏ　ｙｅａｓ
ｔｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗｌｏ　ａｍｉｎｏ　
ａｃｉｄ　（ＤＩＦＣＯ）、２％グルコースンに細胞を
懸濁し、最小培地を含む寒天プレートに塗布した。３０
℃で培養してロイシン非要求性となった形質転換酵母の
コロニーを得た。

この形質転換酵母がＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプ
チドの発現していることは、形質転換酵母を　１０■ｌ
の最小培地にて培養し、その培養上清及び菌体をグラス
ビーズで粉砕して得た抽出液について、予め作成した、
ＬＤ７８αの部分ペプチドに対するウサギ抗体を用いた
ＥＩＡ及びウェスタンプロット法により確認した。

ＬＤ７８発現プラスミドで形質転換した＃母の培養上清
には、抗ＬＤ７８α合成ペプチド抗体と明らかに反応す
る物質が確認され、ウェスタンプロットからその分子量
は約８．０００であった。　　ＬＤ７８発現プラスミド
で形質転換された酵母菌体白シこは、抗ＬＤ７８α合成
ペプチド抗体と反応する物質は確認されなかった。

実施例４で得られた形質転換酵母を２％グルコースを含
むパークホルダーの最小培地〔Ａ■、Ｊ。

Ｂｏｔ、、　Ｖｏｌ　３０．２０６（１９４３＞）　１
００　＋ｔｌに植菌し、３０℃にて定常期まで培養する
。これを８％ショ糖、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含
む無機リン酸不合バークホルダー最小培地（リン酸カリ
ウムの代わりに塩化カリウムを等量加えたもの）ＩＬに
植菌し、３０℃でさらに６０時間培養した。

遠心により酵母菌体を除き、その培養上清を０、、＋５
μ園のフィルター（ファルコン）に通した後、分画分子
量１０．０００の限外ヂ過Ｍ（ミリポア社）により約４
００倍濃縮した。この状態で、ＬＤ７８α及びＬＤ７８
βポリペプチドは凝集体を形成しているので、１５，０
００　ｒｐ醜、２０分間遠心することで、沈澱に回収す
ることができる。得られた沈澱を１０１の２０冒間トリ
スー塩酸緩衝液ＰＨ７，５に懸濁し、再度遠心して不溶
物を除いた後に、カラムクロマトゲラフイーによる精製
に処した。

ＬＤ７８ポリペプチドの精製は、ファルマシア社製ＦＰ
ＬＣシステムを用いて行った。上記の方法で得たＬＤ７
８α及びＬＤ７８β粗精製ポリペプチドを　２０−間ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）−５０■間塩化ナトリウ
ムで平衡化したＭｏｎｏＱ　５１５陰イオン交換カラム
（ファルマシア社製）に添加した後、塩化ナトリウムの
直線濃度勾配（２腸Ｍ／腸り、流速１ｍＬ／ｓｉｎ、　
）によりタンパク質を溶出した。

ＬＤ７８ポリペプチドは、３００〜３５０腸間の塩化ナ
トリウム濃度で溶出された。この画分のピークをＳＤＳ
ポリアクリルアミド電気泳動で分析すると、クマシーブ
リリアントブルー（ＣＢＢ）染色により分子量的８．０
００のバンドが唯一検出された。

このバンドは、ウェスタンプロットによって抗しＤ７８
α合成ペプチド抗体と反応することから、ＬＤ７８ポリ
ペプチドであることが確認された。

上記の方法による、酵母によるＬＤ７８α及びＬＤ７８
βポリペプチドの典型的な産生量は、ＬＤ７８ａについ
ては約２ｍｇ／Ｌ、ＬＤ７８βについては約４　ｍ　ｇ
　／　Ｌであった。

３．５ｃ−のシャーレ（ファルコン社）で、増殖因子依
存性ヒト骨髄単球系細胞株ＫＭＴ２　　（Ｂｌｏｏｄ。

Ｖｏｌ　７６、５０１−５０７（１９９０））　　２，
０００個を、　１．２％メチルセルロース及び１０％牛
脂児血清を含む　ＩＭＤＨ（Ｉｓｃｏｖｅ　ｓ　ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｅｄｉｕ＋＋）
培地（ＧＩＢＣＯ社＞　（６０ｔｔ　ｇ／ｍｌ　カナマ
イシン、２　ｗ−ｏ１／Ｌ　Ｌグルタミン、５０μｍｏ
ｌ　２−メルカプトエタノール、２　ｎｇ／ｓｌ　ヒト
インターロイキン３含有）中で、５ｘＣＯ２の存在下、
９日間培養すると、約４５０個のコロニーが形成される
。この系に、１０〜１，０００１１ｇ／ｍｌの実施例５
で調製したリコンビナントＬＤ７８ポリペプチドを添加
して培養した。

その結果、第４図に示すように、培養６日目では添加し
たリコンビナントＬＤ７８ポリペプチドの効果は見られ
なかったが、培養９日目、１２２日目は１００　ｎ１７
１１以上のＬＤ７８αを添加した場合にＫＭＴ２細胞の
増殖・コロニー形成が顕著に抑制された。

ヒト骨髄細胞を健康人ボランティアがら了解を得て採取
し、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ
　５ａｌｉｎｅＨＧＩＢＣＯ社）で希釈し、Ｆｉｃｏｌ
ｌ−Ｍｅｔｒｉｚｏａｔｅ　（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ；
　Ｎｙｅｇａａｄ、０ｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）に重層し
て、室温で４００Ｇ、　３０分間遠心した。中間層をＰ
ＢＳで二回洗い、遠心してヒト骨髄単核細胞を沈澱に回
収した。

１ｘ１０’個のヒト骨髄単核細胞を、３ｏχヒト貧血小
板血漿、ｌｘ脱イオン化牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ
社）、５０　μ腸２−メルカプトエタノールチルセルロ
ース、２　ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン３を含む　
５１の　ＩＭＤＭ培地に懸濁し、１０〜１０００ｎｇ／
園１のリコンビナントＬＤ７８ポリペプチドを添加した
．気泡除去後、１．０■１ずつ３．５ｃｍのシャーレに
入れ、培養シャーレ二枚と、乾燥を防ぐために蒸留水を
張ったシャーレを一枚とを１０ｃｍの培養皿に入れて５
ｘのＣＯ２存在下、３７℃で１５日間培養した。

倒立顕微鏡でコロニーを観察し、形成した顆粒球−マク
ロファージ（ＧＭ）コロニー及び巨核球（１４ｅｇ）コ
ロニーの数を測定した。結果を第５ａ図、第５ｂ図に示
す。

ヒトインターロイキン３及びリコンビナントＬＤ７８ポ
リペプチドを加えない場合には、コロニーは形成されな
い．ヒトインターロイキン３のみでは、ＧＭ−コロニー
は約９０個、Ｍｅｇ−コロニーは約３５個形成された．
リコンビナントＬＤ７８ポリペプチドの添加により、コ
ロニー形成は明らカニ抑制を受け、１，０００　ｎｇ／
ｉ＋Ｉ　Ｌ　Ｄ　７　８ポリヘブチドを添加した場合に
は、形成されるコロニ数は、ＧＭ−コロニーで約１／２
、Ｍｅｇ−コロニでは約１７３に減少した。

なお、ＬＤ７８ポリペプチドそのものには細胞増殖刺激
活性はなく、マウスの骨髄細胞に対しては、ＬＤ７８ポ
リペプチドは全く作用を示さなかった。

（実施例８）正　ヒト　　ＣＤ３４ １コンビ　ン　ＬＤ７　　　１べ 正常ヒト骨髄単核細胞を、Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識
したＨ　Ｐ　ＣＡ−１モノクロ一ナル抗体（抗ＣＤ３４
抗体）で染色し、セルソーター（ＦＡＣ５ｔａｒ　ｐｌ
ｕｓ；　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用い
てＣＤ３４陽性細胞を分離、収集した（Ｂｌｏｏｄ、　
Ｖｏｌ　７５．１９４１−１９４６（１９９０））。

２、５００個のＣＤ３４陽性細胞を、３０％牛脂児血清
、１％脱イオン化牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社）、
５０μｍ２−メルカプトエタノール、２　ｎｇ／■ｌヒ
トインターロイキン３　（ＩＬ−３）或いは２０　ｎｇ
／ｍｌヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）を含
む　５■ｌの■ＭＤＭ培地、及び１００　ｎｇ／ｍｌの
リコンビナントＬＤ７８ポリペプチドと混合し、５％　
ＣＯ２存在下、３７℃で一週間培養した。培養後、細胞
を　１．５０Ｏｒｐｍ、で５分間遠心して集め、１，２
％メチルセルロース、５％　ＰＨＡ刺激リンす球培養土
清、２ｕ／ｍｌエリスロボイエチンを含む上記培地５謹
１に懸濁し、気泡除去後、１．０１ずつ３．５ｃｍのシ
ャーレに加えた。

培養シャーレ二つと、乾燥を防ぐ為に蒸留水を張ったシ
ャーレを一つを　１０　ｃｍの培養皿に入れて５χのＣ
Ｏ２存在下、３７℃で１５日間培養した。

倒立顕微鏡でコロニーを観察し、形成した顆粒球−マク
ロファージ（ＧＭ）コロニー、マクロファージコロニー
、赤芽球コロニーの数を測定した。

マクロファージコロニー、赤芽球コロニーについては、
ＬＤ７８ポリペプチド添加の影響は出なかったが、０Ｍ
コロニーでは顕著な効果が見られた。結果を第６図に示
す。

ＩＬ−３或いはＧ−Ｃ３Ｆだけを添加した培養では、１
０日目でそれぞれ、１０個、１２個、　１５日目で９個
、１５個のＧＭ−コロニーを形成した。リコンビナント
ＬＤ７８ポリペプチドを添加すると、形成されるコロニ
ーの数は、いずれの場合も減少した。培養１０日目では
、添加したリコンビナントＬＤ７８の効果は顕著ではな
いが、培養１５日目においては、リコンビナントＬＤ７
８ポリペプチドの細胞増殖・コロニー形成抑制効果は明
白である。

特に、ＩＬ−３とリコンビナントＬＤ７８ポリペプチド
を共に添加した場合、形成されるコロニーの数は、ＩＬ
−３のみを添加した場合に比べて約１／３に減少した。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図および第１ｂ図は、それぞれ本発明においてク
ローニングされたＬＤ７８α及びＬＤ７８β遺伝子ｃＤ
ＮＡのポリペプチドをコードする領域の塩基配列及びア
ミノ酸配列を示す。 第２図は、ＬＤ７８α及びＬＤ７８βの分泌シグナルに
改変を入れるため、ＰＣＲ法を用いたＤＮＡ変異導入法
の概略を示す。 第３図は、ＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドを酵
母において発現させるための発現プラスミドの横築法を
示す。 第４図は、増殖因子依存性ヒト骨髄単球系細胞株ＫＭＴ
２の増殖に関して、ヒトインターロイキン３（ＩＬ−３
＞の存在下でのＬＤ７８ポリペプチドの作用を示す。 第５ａ図および第５ｂ図は、それぞれ正常ヒト骨髄単核
細胞からのヒトインターロイキン３で誘導されるコロニ
ーについて、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）コロニー
形成および巨核球（Ｍｅｇ）コロニー形成に対するＬＤ
７８ポリペプチドの作用を示す。 第６図は、正常ヒト骨髄単核細胞から収集したＣＤ３４
陽性細胞に対して、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−
Ｃ３Ｆ）及びヒトインターロイキン３（ＩＬ−３＞で誘
導されるコロニー形成におけるＬＤ７８ポリペプチドの
作用を示す。 第１ａ図 ＧＴＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡ
ＣＡＣ１工負ＡＧＣＣＣ＾ＣＡＴＴＣｈｏ　　１ ＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＡ　ＧＡ　ＡＴＣＡＴＧＣＡ
　ＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴ
ＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＭｅｔＧＩｎＶａｌＳｅｒ
ＴｈｒＡｌａＡｌａＬｅｕＡｌａＶａｌＬｅｕＬｅｕＣ
ｙｓＴｈｒ１１０　　　　１２０　　　　１３０　　　
　　・１４０　　　　１５０　　　　１６０ＡＴＧＧＣ
ＴＣＴＣＴＧＣＡ　ＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣ
ＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣ
ＴＧＣＴＧＣＭｅｔ八１ａＬｃｕＣｙｓへ５ｎＧｌｎＰ
ｈｅＳｅｒＡｌａＳｅｒＬｅｕＡｌａ＾ＩａＡｓｐＴｈ
ｒＰｒｏＴｈｒＡｌａＣｙｓＣｙｓ１７０　　　　　ｔ
ａｏ　　　　　１９０　　　　２００　　　　２１０　
　　　２２０ＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＣ
ＡＧＡＴＴＣＣＡＣＡＧ＾＾ＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴＧＡ
ＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＣＧＡＧＣＰｈｅＳｅｒＴｙｒ
ＴｈｒＳｅｒ＾ｒｇＧｌｎ１１ｅｌ’ｒｏＧ％ｎＡｓｎ
ｆ’ｈｅｌｌｅ＾１ａＡｓｐＴｙｒＴ’ｈｅＧｌｕＴｈ
ｒＳｅｒＡ　ＧＣＣＡ　ＧＴＧＣＴＣＣＡ　ＡＧ　ＣＣ
ＣＧＧＴＧＴＣＡ　ＴＣＴＴＣＣＴＡ　ＡＣＣＡＡＧＣ
Ｇ　Ａ　ＡＧＣＣＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣＴＧＴＧ　ＣＴ
Ｓｅ　ｒＧ　Ｉ　ｎＣｙｓＳｅ　ｒＬｙｓ　ＰｒｏＧ　
Ｉ　ｙｖａ　Ｉ　Ｉ　ＩｅＰｈｅＬｅｕＴｈｒＬｙｓＡ
ｒ　ｇＳｅｒ　ＡｒｇＧ　ｌ　ｎＶａ　ＩＣｙｓＡ　１
ａＧ　ＡＣＣＣＣＡＧＴＧ　ＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣ
ＡＧＡＡ　ＡＴＡＴＧＴＣＡＧＣＧＡＣＣＴＡＧ　ＡＧ
ＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧ　ＡＧＧＧＡｓｐＰｒｏＳｅｒ
ＧＩ　ｕＧｌｕＴｒｐＶａＩＧＩ　ｎＬｙｓＴｙｒＶａ
ｌｓｅｒＡｓｐＬｅｕＧｌｕＬｅｕｓｅｒＡＩ　ａ＊＊
木ＧＴＣＣＡＧＡＡ没ロゴＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＧＡ
ＣＣＴＣＧＧＴＧＧＧＨｉｎｄ　　ｍ 第１１：）図 ＧＴＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡ
ＣＡＣＴＣΦ鴇ＣＣＣ＾ＣＡＴＴＣｈｏ　　１ ＣＡＴＣＡ　ＣＣＴＧＣＴＣＣＣＡＡＴＣＡＴＧＣＡＧ
ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＣＧＴＣＣ
ＴＣＣＴＣＴＧＣＡ　ＣＣＭｅｔＧｌｎＶａｌＳｅｒＴ
ｈｒＡｌａＡＩａＬｅｕＡｌａＶａｌＬｅｕＬｅｕＣｙ
ｓＴｈｒｌｌｏ　　　　　１２０　　　　１３０　　　
　１４０　　　　１５０　　　　１６０ＡＴＧ　ＧＣＴ
ＣＴＣＴＧＣＡ　ＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡ
ＣＣＡ　ＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧ　ＡＣＡＣＧＣＣＧ　Ａ
ＣＣＧＣＣＴＧＣＭｃｔＡ　ｌ　ａＬｅ　ｕＣｙｓＡｓ
ｎＧ　ＩｎＶａｌＬｅ　ｕｓｅｒＡ　１ａＰｒｏＬｅ　
ｕＡ　ｌａＡ　Ｉ　ａＡｓｐＴｈｒＰｒｏＴｈｒＡ　ｌ
　ａＣｙｓＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧ
ＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴ
ＧＡＣ丁ＡＣＴＴＴＧＡＧＡＣＧＣｙｓ　ＰｈｅＳｅ　
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ＴＣＡＧＴＧＧＧＨｉｎｄ　　ｍ 第２図 ＝−＝−＝−−−−−−−−−−−−Ａ＾＾＾＾ＬＤ７
８　ｓ關＾ ｈｏ　１ ↓ ↓アニール ↓ブライマー＃】、＃２ ↓４づメラーゼ予エーノ反応 ｈｏ　１ ＬＤ７１１　ＤＮＡ断片 ｈｏ　１ 第３図 第４図 添加因子 第５ａ図 ＬＤ７８濃度（ｎｇ／ｍｌ） 第５ｂ図 Ｌ　Ｄ　７８　？ａ度（ｎｇ／ｍｌ　）第６図

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも下記のアミノ酸配列を有し、ヒト骨髄
   幹細胞の増殖・分化の抑制を誘導する活性をもつペプチ
   ドＬＤ７８α。 【アミノ酸配列があります】
2. （２）少なくとも下記のアミノ酸配列を有し、ヒト骨髄
   幹細胞の増殖・分化の抑制を誘導する活性をもつペプチ
   ドＬＤ７８β。 【アミノ酸配列があります】
3. （３）下記のアミノ酸配列からなる前期第（１）項記載
   のペプチドＬＤ７８α。 【アミノ酸配列があります】
4. （４）下記のアミノ酸配列からなる前期第（２）項記載
   のペプチドＬＤ７８β。 【アミノ酸配列があります】
5. （５）増殖因子依存牲骨髄単球系細胞の増殖を抑制する
   活性を有する、前記第（１）項から（４）項のいずれか
   に記載のペプチド。
6. （６）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵
   母内で機能するプロモーターを担ったプラスミドベクタ
   ーの該プロモーターの制御下にＬＤ７８αまたはＬＤ７
   ８βをコードする遺伝子を組み込んだことを特徴とする
   組換えプラスミド。
7. （７）該ＬＤ７８αまたはＬＤ７８βをコードする遺伝
   子がヒト由来のものである前記第（６）項記載の組換え
   プラスミド。
8. （８）該ＬＤ７８αおよび該ＬＤ７８βをコードする遺
   伝子がそれぞれ下記のアミノ酸配列をコードする遺伝子
   である前記第（６）項記載の組換えプラスミド。 ＬＤ７８α： 【アミノ酸配列があります】
9. （９）該ＬＤ７８αおよび該ＬＤ７８βをコードする遺
   伝子がそれぞれ下記の塩基配列からなる遺伝子である前
   記第（８）項記載の組換えプラスミド。 ＬＤ７８α： 【塩基配列があります】 ＬＤ７８β： 【塩基配列があります】
10. （１０）該ＬＤ７８αおよび該ＬＤ７８βをコードする
    遺伝子が、下記のアミノ酸をコードする遺伝子断片を有
    する遺伝子である前記第（６）項記載のプラスミド。 ＬＤ７８α： 【遺伝子配列があります】 ＬＤ７８β： 【遺伝子配列があります】
11. （１１）該ＬＤ７８αおよび該ＬＤ７８βをコードする
    遺伝子がそれぞれ下記の塩基配列を有する遺伝子である
    前記第（１０）項記載の組換えプラスミド。 ＬＤ７８α： 【遺伝子配列があります】 ＬＤ７８β： 【遺伝子配列があります】
12. （１２）該ＬＤ７８αおよび該ＬＤ７８βをコードする
    遺伝子が、下記のアミノ酸をコードする遺伝子断片を有
    する遺伝子である前記第（６）項記載のプラスミド。 ＬＤ７８α： 【遺伝子配列があります】 ＬＤ７８β： 【遺伝子配列があります】
13. （１３）該ＬＤ７８αおよび該ＬＤ７８βをコードする
    遺伝子がそれぞれ下記の塩基配列を有する遺伝子である
    前記第（１２）項記載の組換えプラスミド。 ＬＤ７８α： 【遺伝子配列があります】 ＬＤ７８β： 【遺伝子配列があります】
14. （１４）前記第（６）項から第（１３）項のいずれかに
    記載のプラスミドにより形質転換された酵母を培養する
    ことによりリコンビナントＬＤ７８αまたはＬＤ７８β
    ペプチドを産生せしめ、該リコンビナントＬＤ７８αま
    たはＬＤ７８βペプチドを培地中あるいは細胞中から回
    収することを特徴とするリコンビナントＬＤ７８ａまた
    はＬＤ７８βペプチドの製法。
15. （１５）該リコンビナントＬＤ７８αおよび該ＬＤ７８
    βペプチドが、下記のアミノ酸配列からなるペプチドで
    ある前記第（１４）項記載の製法。 ＬＤ７８ａ： 【アミノ酸配列があります】
16. （１６）該リコンビナントペプチドが下記のアミノ酸か
    らなるペプチドである前記第（１４）項記載の製法。 ＬＤ７８ａ： 【アミノ酸配列があります】 ＬＤ７８β： 【アミノ酸配列があります】
17. （１７）前記第（１）〜（５）項のいずれかに記載のＬ
    Ｄ７８αまたはＬＤ７８βペプチドを免疫原として用い
    確立される、ＬＤ７８αまたはＬＤ７８βペプチドに特
    異的な抗体を産生するハイブリドーマ。
18. （１８）前記第（１７）項記載のハイブリドーマにより
    産生されたモノクローナル抗体。