KR970009935B1 - 안정하게 형질감염된 포유동물 세포에서 사람 에리트로포이에틴 유전자를 고농도 형질발현시키는 방법 - Google Patents

안정하게 형질감염된 포유동물 세포에서 사람 에리트로포이에틴 유전자를 고농도 형질발현시키는 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

안정하게 형질감염된 포유동물 세포에서 사람 에리트로포이에틴 유전자를 고농도 형질발현시키는 방법
제1도는 사람 에리트로포이에틴 유전자 서열을 함유하는 2426 bp의 Apa I 제한 단면의 개요도를 나타낸 것이다.
제2도는 2426 bp의 Apa I 제한 단편을 함유하는 대표적인 플라스미드 형질발현 벡터(pDll-Ep)의 개요도를 나타낸 것이다.
제3도는 Apa I 제한 단편을 함유하는 다른 형질발현 벡터(pBD-EP)를 나타낸 것이다.
본 발명은 유전공학 분야, 구체적으로는 재조합 유전자의 당단백질 생성물의 발현 방법에 관한 것이며, 더 구체적으로는 안정하게 형질감염된 세포로부터 생물학적 활성을 지닌 사람 에리트로포이에틴(erythropoietin)을 고농도로 형질발현시키는 방법에 관한 것이다.
호르몬인 에리트로포이에틴은 적혈구 조혈, 즉 적혈구 형성 과정을 조절하는데 중요한 역할을 하며, 에리트로포이에틴의 결핍은 빈혈증을 초래한다. 정제물질의 부족으로 인하여, 호르몬에 대한 구체적인 연구 및 호르몬대체요법에 대한 시도는 어려움을 겪어왔다.
사람 적혈구가 정상적으로 생산되려면, 에리트로포이에틴이 신장에서, 명확하게는 성숙한 당단백질 상태로서 분비되어야 한다. 정상 상태에서 이 호르몬은 10∼18밀리유니트(128∼230 picogram)/ml의 농도로 혈증을 순환하며, 심각한 조직 저산소증(산소결핍증)에 자극되어 이 수치는 1000배 만큼 증가할 수 있다. 호르몬 농도가 상승하면 골수에서 수용성 간상부(receptive stem)세포 집단의 증식 및 분화가 시작되고 성숙하는 에리트로이드 세포에서의 헤모글로빈 합성을 자극하며, 골수에 있는 적혈구세포를 혈중내로 방출시키므로써, 적혈구량을 증가시키고 저산소증상태를 개선시키게 된다. 만성 신부전증환자처럼 에리트로포이에틴이 결핍된 환자들은 종종 심각한 빈형증을 호소한다.
에리트로포이에틴은 분자량의 약 40%가 탄수화물로 이루어진 34∼38kd의 당단백질이다. 이것이 활성을 가지려면, 하나 이상의 디설파이드 결합이 필요하다. 이 호르몬의 구조에 대해서는 거의 알려진 것이 없으며, 호르몬 합성에 대한 세부사항도 잘 알려지지 않고 있다. 최근 cDNA 및 게놈 클론을 분리해냄으로써 에리트로포이에틴 생성의 조절기작을 분석할 기회가 있었으나, 생물학적 활성을 갖는 사람 에리트로포이에틴을, 대체요법에 사용되기에 충분한 양만큼 형질발현시키지는 못했다.
본 발명에 의하여, 안정하게 형질감염된 포유동물 세포주로부터 생물학적 활성을 갖는 사람 에리트로포이에틴을 고농도(상청액의 2백만 unit/1를 초과하는 명목역가)로 발현시킬 수 있다. 그러므로 임상적으로 사용하기 위한 공급원으로서 충분한 량의 정제된 사람 에리트로포이에틴이 제공된다. 놀랍게도, 사람 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 제한 단편으로 숙주세포주를 형질감염시켜 에리트로포이에틴을 고농도로 형질발현시킬 수 있었다. Apa I 제한 단편의 센스 스트랜드는 제1도에 도시된 것에 상응하는 누클레오타이드 서열을 가진다.
바람직한 구체예로서, 제1도에 도시된 Apa I 제한 단편의 유전공학적 구조물을 제2도 및 제3도에서 제시된 바와 같이 포유동물 형질발현용 벡터내로 삽입한 후, 포유동물 세포주내로 도입시켜 생물학적 활성을 갖는 사람 에리트로포이에틴을 다량 생산하는 안정하게 형질감염된 세포를 제조한다. 에리트로포이에틴 mRNA의 효율적인 전사, RNA의 효율적인 해독 및 해독후 변경(post-translational modification)에 의한 생물학적 활성을 갖는 성숙 에리트로포이에틴 당단백질의 발현을 극대화 할 수 있는, 사람 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 제한 단편을 선별하였다.
특히, 에리트로포이에틴 유전자의 5' 말단에서 간섭(interfering) 서열을 제거하고 촉진(enhancing) 서열을 유지시키는 것이 중요하다. 잠재적인 주요 촉진 서열을 포함시키기 위해 인트론을 Apa I 제한 단편내에 보유시켰다. 추정상의 조절 서열을 최적화시키기 위해 유전자의 3' 말단에 몇개의 3' 비해독서열을 보유시켰다. Apa I 제한 단편에 의한 형질발현능의 향상은 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 2개의 프로모터 및 2개의 세포주와 함께 이 단편을 사용하므로써 고농도의 에리트로포이에틴이 지속적으로 형질발현되는 사실에 의해 증명된다.
하기 실시예는 본 발명의 장점을 예시하기 위해 제시된 것으로서, 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기 위한 것이다. 본 실시예는 본 발명에 허여될 특허권의 보호범위나 개시범위를 제한하려는 것이 아니다.
[실시예 1]
게놈 클론의 분리
본원에서 참고로서 인요된 문헌(
Figure kpo00002
: 287∼297, 1984)에 제시된 바와 같은 올리고누클레오타이드 프로브의 혼합물 및 엄격도(stringency)가 낮은 하이브리드화 조건을 이용하여, 박테리오파지 람다내에 존재하는 사람 게놈 라이브러리(
Figure kpo00003
: 1157∼1174, 1978)를 선별하였다.
응용 바이오시스템 합성기(Applied Biosystems synthesizer)를 이용하여 올리고 누클레오타이드 혼합물을 제조하고32p-ATP 및 T4 폴리누클레오타이드 카이나제를 사용하여 말단을 표지화하였다.
합성 올리고누클로오타이드는 하기 아미노말단 아미노산 서열 부분에 상응하도록 설계되었다.
H2N-Ala-Pro-?-Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Ala-Lys=Glu-Ala-Glu-?-Ile-Thr-Asp-Gly-Ala
상기 아미노산 서열은 재생불량성 빈혈환자의 소변에서 정제된 사람 단백질의 형태로서 야나가와 등[참조 ; J. Biol.Chem. 259 : 2707∼2710. 1984]에 의해 수득되었다. 이 영역의 아미노산 서열에 대한 코돈의 축퇴성(degeneracy)을 감소시키기 위해, 그란담 등[참조 ; Nucleic Acids Research 8 : 43∼59, 1981] 및 자예 등[참조 ; Nucleic Acids Research 11 : 2325∼2335,1983]의 코돈 사용 규칙이 사용되었다. 이러한 규칙은 척추동물의 DNA 내에서 CpG 디누클레오타이드가 비교적 드물게 존재하는 점을 고려한 것으로서, 발생가능한 A : G의 미스매치 짝짓기를 피하게 한다. 24번 아미노산 위치에는 대부분의 경우 아스파라긴이 존재한다.(J.Biol.Chem. 259 : 2707∼2710, 1984). Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn 아미노산에 대하여 72개 서열의 푸울 2개를 각각 예정된 코돈에 상응하도록 합성하였다. 한 푸울은 20개 누클레오타이드 프로브에 대해 TT(c/t)TC(a/g/t)GC(c/t)TC(c/t)TT(a/g/t)GCTTC였고, 다른 풀은 18번 위이체서 T 대신에 C를 사용했다.
Glu-Asn-Ile-Thr-Asp-Gly 아미노산에 대하여는 서울(AGG TCC TCC ATC AGT ATT ATT T[c/t])의 푸울 1개가 23개 누클레오타이드 프로브에 대해 구축되었다.
올리고누클레오타이드 프로브에 하이브리드화된 플라크가 순수한 형태가 될 때까지 저밀도에서 재선별하였다. 초기 양성 파아지 클론이 플라크-정제된 후에, 에리트로포이에틴 유전자에 대한 추가 서열 정보가 야콥 등(Nature 313 : 806∼810, 1985)에 의하여 발표되었다. 이 정보로부터 올리고누클레오타이드가 제조되었고, 양성 클론의 정체를 확인하는데 사용되었다. 양성 클론을 Eco RI 제한 효소 분해시킨후, 삽입 CNA를 겔-정제시키고, 표준기법에 의해 Eco RI으로 미리 제한효소-분해시킨 pUC 13 플라스미드에 결찰시켰다. dATP(α-35S) 및 17-머(mer)의 일반적 프라이머를 사용하거나, 또는 선별된 영역에서는 특정한 올리고누클레오타이드 프라이머를 사용하여 디데옥시누클레오타이드 체인 말단화 방법(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74 : 5436∼5467, 1977)으로 DNA 서열을 결정한다.32-ATP는 ICN에서 구입하였고, 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs) 또는 베데스다 연구실험실(Bethesda Research Laborationes)에서 입수하였다.
복제된 니트로셀룰로오스 필터의 하이브리드화에 의해 대략 4.8×106개의 박테리오파지가 선별되었다. 플라크 정제를 통하여 3개의 각기 다른 클론이 양성으로 나타났고, DNA 삽입체는 제한 매핑 및 부분적인 디데옥시누클레오타이드 서열화(sequencing)에 의해 분석되었다. 세개중 두개의 클론은 에리트로포이에틴 유전자에 대한 완전한 정보를 명확하게 함유하고 있었다. 이들 클론의 2426 bp Apa I 단편에 대한 제한 지도 및 서열은 제1도에 나타나 있는데, 야콥 등이 최근에 발표한 사람 에리트로포이에틴에 대한 유전자의 경우(Nature 313 : 806∼810, 1985)와 실질적으로는 동일하다. 증폭된 라이브러리내에서 에리트로포이에틴 유전자를 함유하는 파아지 분리개체의 빈도가 낮은 것(대략 2×106개의 박테리오파아지중 하나)은, 에리트포이에틴이 사람 게놈내에 단일 카피(copy)로서 존재한다는 추측과 일치한다. 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 단편 또는 다른 제한 단편으로 전체 사람 게놈 DNA를 서던 블롯 하이브리드화하면 고도의 상동성을 지닌 DNA가 부가적인 영역이 없는 단일 하이브리드화 밴드만으로 나타난다.
실시예 2
Apa I 제한 단편의 선별
형질발현 벡터의 구축을 위해, 본원에 참고로 인용된 문헌(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74 : 5463∼5467, 1967)에 기재된 기법을 사용하여 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 제한 단편을 수득했다. 즉, 분리된 파아지 DNA를 제한효소 Apa I(Bethesda Research Laboratiriees)으로 분해시킨 후, 1% 아가로즈겔상에 분리시키고 전기용출, 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하여 분리하였다. 단편은 실시예 1에서와 같이 부분 서열화에 의해 확인되었다.
제1도와 관련하여, 삽입된 Apa I 제한 단편은, 58 bp의 5' 비해독 서열(누클레오타이드 0001∼0058), 그 뒤로 추정상의 27개의 아미노산 신호 펩타이드(성숙 단백질)을 암호화하는 서열, 4개의 추정 방해(intervening) 서열 및 222 bp의 3' 비암호화 DNA 서열을 함유한다. 이 유전자의 5' 말단에서 Apa I 부위는 단백질 서열에 대한 ATG 개시 코돈(0058)으로부터 58개 염기쌍 위쪽에 위치한다. 이 5' 부위(0001)는, 효율적인 리보솜 결합 및 프로세싱에 중요한 것으로 여겨지는 추정상 조절 서열을 포함하는 반면에, Apa I 부위는 그 이하의 하부 서열을 결실되면서 3' 비해독서열의 대부분에 추정상의 프로세싱 시그날을 함유하도록 선별되었다. 에리트로포이에틴 유전자의 형질발현 또는 단백질의 변형 및 분리에 기여할 수 있는 인트론내에 위치하는 잠재적인 조절 또는 촉진 서열을 포함하도록 인트론 서열을 함유하는 완전한 에리트로포이에틴 유전자가 사용되었다.
실시예 3
Apa I 제한 단편을 함유하는 형질발현 플라스미드의 제조
완전한 사람 에리트로포이에틴 유전자를 함유하는 2426 bp Apa I 제한 단편을 2개의 형질발현 벡터, 즉 서로 다른 포유동물 프로모터상에 기초하는 pD-11 및 pBD 구조물내로 삽입하였다.
플라스미드 형질발현 벡터 pDll는 전술한 플라스미드(Nucleic Acids Research 13 : 841∼857, 1985 ; 본원에서 참고로 인용됨)로부터 유도되었으며, 이는 아데노바이러스-2의 주요 후기 프로모터 및 3부분의 리더 서열 뿐만 아니라, 시미안 바이러스 40(SV-40) 촉진인자 서열 및 복제 오리진을 함유한다. 사람 에리트로포이에틴 게놈 서열의 Apa I 단편(제1도)를 겔-정제한 후, T4 DNA 중합효소로 처리하여 단일가락의 말단부를 평편화시켰다. Bam HI 링커를 양쪽 평편말단부에 결찰하고 생성된 구조물을 pDll의 고유한 B-Bam HI 제한 부위에 삽입하여 강력한 프로모터로 부터 에리트로포이에틴 유전자가 직접 전사되도록 하였다.
이렇게하여 생성된 Apa I 단편(Ep)을 함유하는 형질발현 플라스미드 pDll-Ep의 구조는 제2도에 나타나있다. 플라스미드 pDll은, 350 bp의 아데노바이러스 좌측말단(0-1), SV-40(E)으로부터의 오리진 및 촉진인사 서열, 아데노바이러스-2의 주요 후기 프로모터(MLP), 아데노바이러스-3 세부분의 리더(L 1-3), 및 세번째 리더 5' 스플라이스(splice) 부위(5'ss), 면역글로블린 3' 스플라이스 부위(3' ss) 및 pML의 Eco RI(RI) 제한 부위내의 후기 SV-40 폴리아데닐화 시그날(pA)을 함유한다. 재조합 플라스미드는 E. coli HB 101 내에서 클론되었고 염화세슘내의 등밀도(isopycnic) 원심분리에 의해 정제되었다. 형질발현 플라스미드인 pDll-Ep의 길이는 약 6500 bp이다. 제한 지도 및 부분적인 디데옥시누클레오타이드 서열화 방법에 의해 구조를 확인하였다.
pBD는 MT-I 프로모터 서열(본원에 참고로 인용된 글란빌, 더함 및 팔미터, Nature 292 : 267∼269, 1981) 및 pUC 플라스미에 존재하는 DHFR 선별가능한 표지서열을 함유한다. 제3도와 관련하여, 2426 bp Apa I 제한효소(EP)를 pBD내의 고유한 Sma I 제한 부위에 삽입하여 형질 발현 플라스미드 pBD-EP를 제조하였다. pBD-EP 내의 DHFR 서열은 SV40에서 유래하는 촉진인자 서열 및 오리진과 관련되어 있고, B형 간염 표면 항원 폴리아데닐화 서열과 관련되어 있다. 상기 pDll-EP의 경우와 마찬가지로 pBD-EP는 실질적으로 프로세싱되었다.
플라스미드 벡터를 사용하여 이러한 확인 실험을 수행하는 한편, 바이러스 또는 레트로바이러스 형질 발현 벡터를 사용하여 Apa 에리트로포이에틴 유전자 단편을 숙주 세포주내로 도입할 수 있다. 이런 목적을 위해 적합한 DNA 바이러스는 아데노바이러스 또는 BPV(소 유두종 바이러스)를 포함한다. 적합한 레스트로바이러스 벡터들도 공지되어 있고 시판된다. 이러한 레트로바이러스(RNA) 벡터는 Apa I 제한 단편의 안티-센스 스트랜드, 즉 제1도에 도시된 센스 스트랜드로부터 전사된 RNA에 상응하는 서열 또는 대립형질의 서열을 지니는 스트랜드를 수반하는 것으로 이해된다. 레트로바이러스 벡터는 또한, 바이러스이 DNA를 숙주 게놈내로 통합하고 바이러스 게놈을 역전사시키는데 필요한 전이-작용 인자를 서열을 포함한다.
실시예 4
포유동물 세포의 형질감염
2종류의 포유동물 세포주 각각을 pDll-EP 및 pBO-EP 구조물 각각으로 형질 감염시켰다. 포유동물 세포주, COS-7(원숭이 신장) 및 BHK(어린 햄스터의 신장)을 10% 소 태아 혈청을 함유하는 덜베코의 변형된 필수 배지에서 배양시켰다. 세포를 계대(passage)배양한 후, 50∼70% 융합물(confluent)을 인산칼슘법으로 형질감염시켰다(Virology 52 : 456∼467, 1973), BHK는 일반적으로는 포유동물이 빈혈증이 있거나 저산소증에 걸려 있는 자연 상태에서 에리트로포이에틴을 생산할 가능성이 가장 높은 세포로 여겨지는 신장 살피세포에서 유도된다. 그러므로 이들 세포는 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 단편이 중요한 조절서열을 인지한 후 에리트로포이에틴 당단백질을 효율적으로 프로세싱하고 생산할 수 있다.
세포의 일시적 형질발현을 위해, 에리트로포이에틴 유전자를 함유하는 10㎍의 pDll-Ep 플라스미드 및 10㎍의 담체 연어 정자 DNA, 총 20㎍의 DNA를 100mm의 배양액 접시내에서 사용하였다. 48시간 후에 상청액을 수집하고, 10분동안 400g에서 원심분리하여 세포 및 파편을 제거하고, -20℃에서 냉동시켰다. 세포를 별도로 수집하였다. 일시적 형질발현을 위해 pDll-EP 만으로 형질감염시킨 결과는 표 1에서 나타나 있다. 각각의 세포 유형에 대해 3번의 실험을 반복한 결과가 기재되어 있다.
Figure kpo00004
COS-7 또는 BHK 포유동물 세포주의 상청원액내로 분비된 에리트로포이에틴의 측정 수지는, 에리트로포이에틴을 암호화하는 cDNA의 일시적 형질발현에 대해 또는 완전한 에리트로포이에틴 유전자를 사용한 다른 구조물의 일시적 형질발현에 대해 예전에 보고된 것보다 약 80배나 높은 것이다.
에리트로포이에틴을 고농도로 생산하는 안정한 세포주를 생성하기 위해 COSl-7 또는 BHK 세포를 pDll-Ep 플라스미드 및 pDHER-1a(유사한 포유동물 형질발현 벡터내에서 디히드로플레이트 환원효소에 대한 cDNA를 함유하는 플라스미드)로 공동형질감염시켰다. 형질감염 방법을 변형시켜 5㎍의 pDll-Ep 플라스미드, 5㎍의 pDHFR-1a 플라스미드 및 10㎍의 담체 DNA로 공동형질감염시켰다. 18∼24시간동안 추가로 항온배양한 후에, 다양한 농도의 메토트렉세이트(10nM-1mM)를 배양액에 첨가했다. DHFR 유전자가 삽입된 세포는 선택배지에서 생존할 것이다. 며칠더 항온배양한 후에 메토트렉세이트에 내성인 생존 군집(colony)을 분리하고 계대시킨 후 상청액을 검색하여 에리트로포이에틴 생물활성의 존재여부를 확인하였다. 분석된 매트토렉세이트-내성인 군집의 대략 절반에서 분리된 에리트로포이에틴은 검출가능한 정도의 에리트로포이에틴 활성을 갖는 것으로 나타났다.
형질발현 벡터 pBD-EP와 함께 안정한 세포주를 형성하기 위해, BHK 세포를 인산칼슘법으로 형질 감염시켰다. 18!24시간후에, 이 배양액을 다양한 농도(1μ M-1 mN)의 메토트렉세이트에 노출시켰다. 며칠 더 항온배양한 후에, 비교적 고농도의 메토트렉세이트에 내성인 생존 군집을 분리하고 계대시킨 후 검색했다. 이 일련의 과정에서, 검사된 메토트랙세이트-내성인 군집 모두는 검출가능한 활성을 지닌 에리트로포이에틴을 분리했다.
에리트로포이에틴 유전자 및 DHFR 유전자를 함유하는 전사 단위의 형질발현을 최적화하기 위해, pBD-Ep 또는 pDlll-Ep를 함유하며 고농도의 에리트로포이에틴을 분비하는 BHK 세포주를 여러번 계대시켜 메토트렉세이트 농도를 증가시킨다(Nature, 316 : 271-273, 1985). 메토트렉세이트 농도를 조금씩 단계별로 증가시켜 세포주에대한 선별 압력을 점진적으로 증가시키기보다는 매우 고농도의 메토트렉세이트(즉, 1mM)를 사용하여 세포가 즉각적으로 도전(challenge)을 받도록 하였다. 오직 몇몇의 세포만이 생존하나, 이들 세포는 형질발현에 특히 유리한 DNA 영역(소위 hot spot)에 삽입된 플라스미드 구조물을 보유하고/하거나 구조물 전사 단위의 높은 카피(copy)수를 갖게된다. 이렇게하여, 가장 생산성이 높은 세포주가 한단계로 선별되었다. 메토트렉세이트 선별 압력의 부재하에서 15번 이상의 계대기간동안 에리트로포이에틴 생산이 높은 상태로 유지된다면, 세포주(표 2에 기재된 F 7.2 및 S 5.2)는 안정한 것으로 추정된다.
세포추출물의 분석시에 중요한 저해요소가 존재하므로 세포 펠릿내의 활성 에리트로포이에틴의 양은 결정될 수 없었다. 결과적으로 표 2에 제시된 결과는 세포내 에리트로포이에틴 단백질 수치가 아니라, 세포주에 의해 생산되고 상청액으로 분비된 에리트로포이에틴 단백질양을 분석한 결과이다.
Figure kpo00005
측정된 에리트로포이에틴 분리량은 약 7백만 유니트/리터 이하의 명목 비율에 해당한다. 1ml당 측정량에 1000을 곱하여 이러한 명목 비율을 결정하여 리터당 예측되는 확대(scale-up) 생산량을 얻는다.
Apa I 단편을 이용하여 측정된 에리트로포이에틴 분비량은, 사람 에리트로포이에틴 유전자의 이와 다른 게놈 단편을 함유하는 안정하게 형질전환된 CHO 세포주에 대해 보고된 양(Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 : 7580∼7584, 1985)보다 300배나 큰 것이다.
이들 형질감염 분석을 위한 대조 실험에는 비-형질감염된 세포의 상청액 및 다른 단백질(박테리아 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제 및 사람 응집 단백질 인자 IX 포함)을 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드로 형질감염된 세포의 평행배양액이 포함된다. 대조용 배양액, 모의 형질감염 또는 다른 유전자로 형질감염된 배양세포중 어느 것도 검출가능한 에리트로포이에틴 활성을 가지지 않았다. 또한 에리트로포이에틴 유전자와 관련된 상기 일련의 실험에서, 선별된 세포주에서 얻어진 형질발현 수치는 선별가능한 표지가 에리트로포이에틴 유전자와 공동형질감염되었는지 또는 형질감염전에 Apa I 단편-함유 플라스미드내로 삽입되었는지와 관련이 없는 것으로 밝혀졌다(자료는 나타내지 않음)
본 발명을 실험하는데 적합한 다른 대표적인 형질감염 방법은 DEAE-텍스트란 매개된 형질감염기법, 리소자임 융합 또는 적혈구 융합, 스크랩핑, 직접 흡수법(uptake), 삼투 또는 수크로스 쇼크, 직접적인 마이크로주사, 간접적인 마이크로주사(적혈구 매개 기법을 이용함) 및/또는 숙주세포에 전류를 가하는 방법등을 포함한다. 형질감염이란 용어는 유전 정보의 이동 및 구체적으로는 사람 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 제한 단편에 의해 암호화되는 정보를 분리된 DNA, RNA 또는 합성 누클레오타이드 중합체를 사용하여 세포로 이동시키는 것을 의미한다. 유전정보를 세포로 도입시키기 위해 다른 방법들이 개발될 것이므로, 상기 나열된 형질감염기법은 전부가 아니며 이것으로 제한되는 것은 아니다. Apa I 제한 단편은 통상적으로 형질감염전에 프로모터, 촉진인자 및 폴리아데닐화 서열과 같은 다른 헥산 서열에 연결(결찰)될 것이다. 포유동물 기원의 숙주세포주에 대하여 기술되어 있고, 신장 상피세포가 특히 바람직한 것으로 지여겨지지만, 본 발명의 실시를 위하는 진핵 숙주세포주 및 다른 원핵 숙주세포주(박테리아 또는 효모)도 사용될 수 있다. 최근 실시된 포유동물 유전자의 식물세포로의 도입에 의하여 식물 또는 조류(algal) 세포도 사용될 수 있는 가능성이 있다.
실시예 5
형질감염된 세포주로부터의 에리트로포이에틴 형질발현
형질감염된 세포주의 상청액으로 분리된 재조합 에리트로포이에틴 단백질은 생물학적 활성을 지니며, 다량의 호르몬이 7000유니트/ml까지 분비되었다.
에리트로포이에틴의 생물학적 활성에 대한 시험관 분석법은 응괴 혈장중의 마우스 골수세포 배양물내에서 에리트로이드 군집(CFU-E ; 에리트로이드 군집-형성세포로부터 수득됨)의 형성 여부에 기초하고 있다(Blood Cells 4 : 89-103, 1978). 이 분석에서의 감도는 약 5밀리유니트/ml이다. 분석법의 표준으로 사용된 에리트로포이에틴은 빈혈증이 있는 양의 혈장으로부터 부분적으로 정제한 제제(Connaught, Step 3 Ep, Lot 3026)였다. 메토트렉세이트가 없는 신선한 배지에서 24시간동안 계대성장한 세포주로부터 상청액을 분석했다. 상청액을 배지로 1 : 200으로 희석시킨후, 2×10 골수 세포, 10% 소구연산염 혈장, 20% 소 태아 혈청, 1% 소 혈청 알부민 및 1.6% 소 태아(embryo) 추출물(Gibco 제품)을 함유하는 분석 배양액 1ml에 1∼10㎕양의 상청액을 첨가시켰다. 36∼48시간동안 항온배양한 후 혈장 응고물을 현미경 슬라이드상에 고정시키고 헤모글로빈용 벤지딘으로 염색한 후 에리트로이드 군집을 계산했다. 에리트로포이에틴이 첨가되지 않은 경우, CFU-E 유도된 군집이 검출되지 않았다. 최적 에리트로이드 군집의 성장정도(2×10 골수 세포당 100∼150의 CFU-E가 검출됨)는 통상적으로 50mU(0.64ng)의 에리트로포이에틴/ml 배양액으로 관찰되었다. 다량의 에리트로포이에틴 호르몬이 형질감염된 세포주의 상청액으로 7000유니트/ml까지 분비되었다(표 1 및 2참고). 재조합 에리트로포이에틴이 천연 에리트로포이에틴과 등가의 고유활성(단백질 mg당 78,000유니트)을 가진다고 가정하면, 생물학적 분석 결과는 약 80㎍의 에리트로포이에틴 단백질/ml에 상응한다.
또한 다가의 항-사람-에리트로포이에틴 토끼 항-혈청을 사용한 경쟁적 방사면 역분석법(J. Cell. Physiol. 118 : 87∼96, 1984)에 의해, 선별된 세포주로부터의 상청액을 면역학적으로 반응성을 에리트로포이에틴에 대해 분석했다. 방사면역분석법에 의해 측정된 단백질양은 생물학적 분석법에 의해 측정한 단백질 수치와 동일하였다. 이러한 자료는, 형질감염된 세포주가 98% 이상의 활성도를 지닌 에리트로포이에틴 단백질을 형질발현하고 분비했다는 것을 나타낸다.
형질감염된 세포에 의해 생산된 재조합 에리트로포이에틴은, 이 세포들이 진짜 호르몬을 분비하는 점을 설명해 준다. 저산소중이고 다혈구중인 마우스의 생체내 에리트로포이에틴 활성을 기준으로 선별된 세포주를 분석했다(Nature, 191 : 1069∼1087, 1961). 저산소증이고 다혈구증인 마우스에 대해 분석했을때 세포주로부터 분비된 상청액은 생체내 생물학적 활성이 강했다. 부분적으로 정제된 천연 에리트로포이에틴을 사용한 실험에서, 완전한 동물내에서 분석했을 때 뉴라미니다제 처리는 에리트로포이에틴 활성을 완전히 없앤다는 것이 알려져 있다(J. Biol. Chem. 247 : 5159∼5160, 1958). 뉴라미나다제(neuraminidase)-처리된 에리트로포이에틴이 시험관내에서는 완전히 활성인 상태로 남아있으므로, 활성이 상실되는 것은 간에 의해 탈시알산(desialated) 호르몬의 클리어런스가 증가하기 때문이다. 생체내 생물학적 활성이 강하다는 것은, 형질감염된 포유동물 세포주가 해독후 변형과정을 통하여 탄수화물 및 말단 시알산을 에리트로포이에틴 단백질에 적절하게 부가한다는 것을 나타낸다.
별도의 실험에서 시험관내 생물학적 분석시 에리트로포이에틴의 활성은, 배양액에 첨가된 중화용 항-사람 에리트로포이에틴 항체에 의해 중화되었다.
또한 대표적인 형질감염된 세포주의 상청액으로 분리된 에리트로포이에틴을 다른 골수 전구(progenitor) 세포에 대한 증식효과에 대해 분석했다. 에리트로이드 군집-형성세포(CFU-E), 에리트로이드 파열-형성 세포(BFU-E), 과립구-마크로파지전구체(CFU-GM) 및 혼합-세포 군집-형성 세포(CFU-Mix)를 포함하는 마우스 및 사람 골수로부터의 다양한 전구체에 대한 영향에 대해 재조합 에리트로포이에틴을 분석했다(J. Cell. Physiol. Suppl. 1 : 79∼85, 1982 ; J. Cell. Physiol. 118 : 87∼96, 1984). 에리트로이드 간 세포는, 천연 에리트로포이에틴에서 발견되는 용량-반응 관계와 평행한 재조합 에리트로포이에틴에 대한 증식 반응을 나타냈다. CFU-GM 또는 CFU-Mix 어느 것도 분석 세포 배양액 1ml당 10단위까지의 농도에서 재조합 에리트로포이에틴에 대해 증식반응을 나타내지 않았다.
환원 또는 비환원 상태하에서 SDS-PAGE에 의해 분석했을 때, 정제된 재조합 에리트로포이에틴은 재생불량성 빈혈환자의 소변에서 정제된 에리트로포이에틴과 동일한 패턴으로 전기영동되었다. 단백질의 유사한 소형이종성(microheterogeneity)이 관찰되었다. 우성 종은 34kD로서 동일한 분자량을 가졌다.
본 발명이 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었지만, 상기 명세서를 읽은 당없자는 상기 조성물 및 방법에 대해 다양한 변형, 등가물의 치환 및 변형을 가할 수 있을 것이다. 그러므로 특허공보에 의해 부여될 보호범위는 상기 특허청구와 그 균등범위에 포함되는 정의에 의해서만 제한될 것이다.

Claims (4)

  1. 사람의 에리트로포이에틴 유전자의 Apa I 제한단편을 함유하는 제1도에 나타난 누클레오티드 서열을 플라스미드에 삽입하여 벡터를 얻는 단계, 그 벡터로 포유동물 숙주 세포주를 형질감염시키는 단계, 이 형질감염된 세포주를 배지와 접촉시켜 세포주가 에리트로포이에틴을 발현할 수 있도록 하는 단계 및 형질발현된 에리트로포이에틴을 회수하는 단계를 포함하는, 생물학적 활성을 지닌 사람의 재조합 에리트로포이에틴을 형질발현시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드는 pDll 또는 pBD인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 숙주 세포주가 COS-7 세포 또는 BHK 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 배양배지 1리터당 200만 유니트(Unit) 이상의 에리트로포이에틴 명목 수율을 제공할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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