FI95393B - Oleellisesti puhdas DNA ja RNA ja menetelmä erytropoietiinin ekspressoimiseksi - Google Patents

Oleellisesti puhdas DNA ja RNA ja menetelmä erytropoietiinin ekspressoimiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI95393B
FI95393B FI880899A FI880899A FI95393B FI 95393 B FI95393 B FI 95393B FI 880899 A FI880899 A FI 880899A FI 880899 A FI880899 A FI 880899A FI 95393 B FI95393 B FI 95393B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
erythropoietin
cells
sequences
dna
rna
Prior art date
Application number
FI880899A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI880899A (fi
FI95393C (fi
FI880899A0 (fi
Inventor
Jerry S Powell
Original Assignee
Univ Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25374134&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI95393(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Washington filed Critical Univ Washington
Publication of FI880899A publication Critical patent/FI880899A/fi
Publication of FI880899A0 publication Critical patent/FI880899A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI95393B publication Critical patent/FI95393B/fi
Publication of FI95393C publication Critical patent/FI95393C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

95393
Oleellisesti puhdas DNA ja RNA ja menetelmä erytropoietiinin ekspressoimiseksi - Väsentligen rent DNA eller RNA och för-farande för expression av erytropoietin Tämä keksintö tehtiin osittain hallituksen tuella National Institutes of Health-instituutin myöntämällä tutkimusmäärärahoilla HL 16919, AM 19410, AM 01418 ja CA 31615. Hallituksella on määrätyt oikeudet tähän keksintöön.
Tämän keksinnön kohteena on yleisesti geneettinen manipulointi, erityisesti rekombinantti-geenien glykoproteiinituotteiden ekspressoiminen ja tarkemmin sanoen biologisesti aktiivisen ihmisertyropoeitiinin suurten määrien ekspressointi stabiilista transfektoiduissa soluissa.
Erytropoietiin-hormoonilla on tärkeä osuus erytropoieesin säätelyssä eli punaisten verisolujen muodostumisen säätelyssä, ja erytropoietiinin puutostilat johtavat anemiaan. Yksityiskohtaiset hormonin tutkimukset ja yritykset löytää korvaava hoitokeino ovat olleet vaikeita johtuen puhdistetun materiaalin niukkuudesta.
Ihmisen punaisten verisolujen normaalin tuoton edellytyksenä on, että munuainen erittää erytropoietiinia, ilmeisestikin valmiina glykoproteiinina. Tätä hormonia kiertää vakiotilassa « < veressä konsentraatiossa 10 - 18 milliyksikköä (128-230 piko-grammaa) millilitrassa, ja nämä määrät voivat nousta jopa 1000-kertaisesti, kun kiihotetaan voimakkaan kudoshypoksian (hapenpuute) avulla. Kohonnut hormonitaso käynnistää reseptiivisten verisolujen populaation lisääntymisen ja erikoistumisen luuytimessä, kiihottaa hemoglobiinin synteesiä kypsyvis- « sä erytroidisoluissa ja nopeuttaa punaisten verisolujen vapautumista luuytimestä verenkiertoon ja näin lisää punaisten verisolujen massaa ja lievittää hypoksiätiloja. Potilaat, jotka kärsivät erytropoietiinin puutostiloista, kuten potilaat, joilla on krooninen munuaisen toimintavajavuus, kärsivät usein vaikeasta anemiasta.
2 95393
Erytropoietiini on 34 - 38 kd glykoproteiini, jonka molekyyli-painosta noin 40 % muodostuu hiilihydraatista. Aktiivisuus edellyttää vähintään yhtä disulfidisiltaa. Tämän hormonin rakenteesta tiedetään vain vähän eikä sen synteesin yksityiskohtia tunneta kovin hyvin. Viimeaikaiset cDNA- ja genomikloo-nien eristämiset antavat mahdollisuuden analysoida erytropoi-etiinin tuoton säätelyä, mutta biologisesti aktiivista ihmis-erytropoieteenia ei ole kyetty ekspressoimaan niin paljon, että se riittäisi korvausterapiaan.
Tämän kuvauksen perusteella voidaan ekspressoida biologisesti aktiivista ihmiserytropoietiinia suuret määrät (nimellistiit-teri yli kaksi miljoonaa yksikköä supernatanttilitraa kohti) stabiilisti transfektoiduista nisäkässolulinjöistä. Kliinisiä sovellutuksia varten on siten olemassa puhdistetun ihmiseryt-ropietiinin riittävä lähde. Erytropoietiini saadaan yllättäen ekspressoitumaan voimakkaasti transfektoimalla isäntäsolulin-jat ihmisen erytropoietiinigeenin Apa I-restriktiopalalla.
Apa I-restriktiopalan sensejuosteella on kuviossa 1 esitettyä sekvenssiä vastaava nukleotidisekvenssi.
Kuvio 1 esittää kaaviollisesti kohteena olevaa 2426 bp Apa I-^estriktiopalaa, joka sisältää ihmisen erytropoietiinigeenin sekvenssit.
• ! Kuvio 2 kuvaa tyypillistä plasmidi-ekspressiovektoria (pDll-Ep), joka sisältää 2426 bp Apa I-restriktio-fragmentin.
Kuvio 3 kuvaa toista ekspressiovektoria (pBD-EP), jossa on kohteena oleva Apa I-restriktiopala.
• ·
Parhaana pidetyssä suoritusmuodossa kuviossa 1 esitetty, geneettisesti rakennettu Apa I-restriktiofragmentti insertoi-daan nisäkäs-ekspressiovektoriin, kuten kuvioissa 2 ja 3 esitettyihin vektoreihin ja viedään nisäkässolulinjoihin tarkoituksella kehittää stabiilisti transfektoituja soluja, I «H t MU I * i e* : : ; 3 95393 jotka tuottavat suuria määriä biologisesti aktiivista ihmis-erytropoietiinia. ihmisen erytropoietiini-geenin Apa I-res-triktiopala valittiin, jotta voitaisiin saada aikaan mahdollisimman tehokas erytropoietiini-lähetti-RNA:n transkriptio ja RNA:n mahdollisimman tehokas translaatio ja translaation jälkeinen modifiointi valmiiksi, biologisesti aktiiviseksi erytropoietiini-glykoproteiiniksi. Tarkemmin sanoen oli tärkeää poistaa etyropoietiini-geenin 5'-päästä häiritsevät sekvenssit, mutta samalla säilyttää lisäävät sekvenssit Apa I-restriktiopalassa säilytettiin intronit, jotta potentiaalisesti merkitsevästi parantavat sekvenssit jäisivät mukaan.
Geenin 3'-päähän jätettiin jäljelle joitakin 3'-translatoimat-tomia sekvenssejä, jotta optimoitaisiin oletetut säätelysek-venssit. Apa I-palan avulla saadusta kohonneesta ekspressiosta on osoituksena yhdenmukaisesti korkeat erytropoietiinin ilmen-tymistasot, joita on kuvattu seuraavissa työesimerkeissä, kun tätä palaa käytettiin yhdessä kahden promoottorin ja kahden solulinjan kanssa.
Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on havainnollistaa esillä olevan keksinnön etuja ja auttaa taidoltaan normaalia henkilöä niiden toteuttamisessa ja käyttämisessä. Näiden esimerkkien tarkoituksena ei ole millään muulla tavoin rajoittaa tämän kuvauksen piiriä tai patentin antamaa suojaa.
• · ESIMERKKI 1
Genomikloonien eristäminen
Ihmisen genomikirjasto lambda-bakteerifaagissa (Cell 15:1157-1174, 1978) seulottiin käyttämällä alhaisen stringenttiyden ' hybridisointiolosuhteita ja oligonukleotidikoettimien seoksia, kuten on kuvattu tässä yhteydessä viitteenä mainitussa julkaisussa, Cell 38:287-297. 1984.
Oligonukleotidiseokset valmistettiin käyttämällä Applied Biosystems-syntetisointilaitetta ja pääte leimattiin käyttä- 4 95393 maila 32p-ATP ja T4 polynukleotidikinaasia. Synteettiset oligonukleotidit suunniteltiin vastaamaan osia amino-terminaa-lisesta aminohapposekvenssistä: H2N-Ala-Pro-?-Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-
Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-?-Ile-Thr-Asp-Gly-Gly-Ala 24 jonka Yanagawa et ai. (J.Biol.Chem. 259:2707-2710. 1984) selvittivät ihmisproteiinille, joka oli puhdistettu aplastisesta anemiasta kärsivien potilaiden virtsasta. Tämän alueen aminohapposekvenssin kodonien degeneroitumisen pienentämiseksi käytettiin Grantham'in et ai. (Nucleic Acids Research 8:43-59.
1981) ja Jaye et ai. (Nucleic Acids Research 11:2325-2335.
1983) kodonin käyttösääntöjä. Nämä säännöt ottavat huomioon CpG-dinukleotidin suhteellisen harvinaisen esiintymisen selkärankaisten DNA:ssa ja välttävät kyseeseen tulevassa kohdassa potentiaalisen virheellisen parinmuodostuksen A:G. Aminohappoasemaan 24 korvattiin asparagiini kaikkein todennäköisimpänä aminohappona (J.Biol.Chem. 259:2707-2710. 1984) . Aminohappoja Gly-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn varten syntetisoitiin ennustettuja kodoneja vastaamaan kaksi poolia, joissa kummassakin oli 72 sekvenssiä. Toinen pooli oli siten TT(c/t)TC(a/g/t)GC(c/t)TC(c/t)TT(a/g/t)GCTTC 20 nukleotidin koettimelle ja toisessa poolissa T oli korvattu C:lla asemas-;; sa 18. Aminohappoja Glu-Asn-Ile-Thr-Asp-Gly varten rakennettiin yksi sekvenssipooli (AGC TCC TCC ATC AGT ATT ATT T/c/t/) 23 nukleotidin koetinta varten.
Plakit, jotka hybridisoituivat oligonukleotidikoettimien kanssa, seulottiin uudelleen alhaisemmalla tiheydellä, kun-*.· nes ne olivat puhtaita. Sen jälkeen, kun alussa positiiviset faagikloonit plakki-puhdistettiin Jacobs et ai. (Nature 313:806-310. 1985) julkaisi lisää sekvenssi-informaatiota erytropoietiini-geenistä. Tämän informaation perusteella rakennettiin oligonukleotidejä, joita käytettiin vahvistamaan positiivisten kloonien identtisyys. Sen jälkeen, kun positiiviset kloonit oli pilkottu Eco RI-restriktioentsyymil-
Il Ift ) Hill I ;; ft : ! 5 95393 lä insertti-DNA-geeli puhdistettiin ja liitettiin standardi-menetelmillä pUC 13-plasmidiin, joka jo oli restriktiopilkottu Eco RI:lla. DNA-sekvenssi määritettiin dideoksinukleotidi-ket-junpäättämismenetelmällä (Proc.Natl.Acad.Sei.USA 74:5463-5467, 1977) käyttämällä dATP (ar-35S) :a ja 17-mer yleisprimeeriä tai käyttämällä valituilla alueilla spesifisiä oligonukleotidi-primeerejä. 32p-ATP saatiin ICN:sta; entsyymit saatiin New England Biolabs tai Bethesda Research Laboratories-laitok-sesta.
Noin 4,8 x 106 bakteerifaagia seulottiin hybridisoimalla nitroselluloosasuodatin-kopiot. Plakkipuhdistuksen läpi pysyi positiivisina kolme eri kloonia. DNA-insertti karakterisoitiin restriktiokartoittamalla ja osittaisen dideoksinukleotidisek-venssoinnin avulla. Näistä kolmesta kloonista näytti kaksi kloonia sisältävän täydellisen informaation erytropoietiini-geenilla. Kuviossa 1 on esitetty restriktiokartta ja -sekvenssi näiden kloonien 2426 bp Apa I-palalle. Se oli oleellisesti sama kuin minkä Jacobs et ai. (Nature 313:806. 1985) äskettäin julkaisi ihmiserytropoietiinin geenille. Erytropoietiini-
• I I
geenin sisältävien faagieristeiden alhainen esiintymistaajuus tässä vahvistetussa kirjastossa, yksi noin 2 x 106 bakteeri-faagissa, sopii yhteen sen ehdotuksen kanssa, että erytropoietiini esiintyy ihmisgenomissa yhtenä ainoana kopiona. Koko ihmisgenomin DNA:n Southern blot-hybridisointi etyropoietiini-geenin Apa I-palan tai muiden restriktiopalojen kanssa antoi vain yhden ainoan hybridisoituvan vyöhykkeen ilman mitään muita kovin homologisia DNA-alueita.
ESIMERKKI 2 • ** Ana I-restriktiopalan selektoiminen
Ekspressiovektoreiden rakentamista varten valmistettiin etyro-poietiini-geenin Apa I-restriktiopala käyttämällä tässä yhteydessä viitteenä mainitussa julkaisussa Proc.Natl.Acad.Sei.USA 74:5463-5467, 1967, kuvattuja tekniikoita. Lyhyesti sanottuna 6 95393 eristetty faagi-DNA pilkottiin restriktioentsyymillä Apa I (Bethesda Research Laboratories), minkä jälkeen erotettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä ja eristettiin elektroelu-oimalla, uuttamalla fenolilla ja saostamalla etanolilla.
Fragmentti vahvistettiin osittaissekvenssoimalla esimerkin 1 mukaisesti.
Seuraavassa viitataan kuvioon 1. Insertoitu Apa I-restriktio-pala sisälsi 58 bp 5' translatoimattomia sekvenssejä (nukleotidit 00010058), joita seurasivat sekvenssit, jotka koodaavat oletettua 27 aminohapon signaalipeptidiä, valmista proteiinia, neljää oletettua välisekvenssiä, ja 222 bp 3' ei-koodaava DNA-sekvenssi. Geenin 5'-päässä sijaitsee Apa I-kohta 58-emäsparin verran ylävirtaan päin katsottuna proteiinisekvenssin ATG-aloituskodonista (0058). Tämä 5'-kohta (0001) valittiin, jotta vältettäisiin väärä aloituskohta välittömästi ylävirtaan päinkatsottuna Apa I-restriktiokohdasta samalla, kun mukaan otettiin oletetut säätelysekvenssit, joita pidettiin tärkeinä tehokkaalle sibosomaaliselle sitoutumiselle ja prosessoinnille. Apa I-kohta 3' päässä (2426) valittiin, jotta saataisiin mukaan oletetut prosessointisignaalit useimmissa 3' transla-toimattomissa sekvensseissä samalla, kun poistettiin kauempana alavirtaa sijaitsevat sekvenssit. Täydellisen erytropoietiini-geenin, mukaanlukien intronisekvenssien, käytön tarkoituksena oli saada mukaan introneissa sijaitsevat potentiaaliset sääte-v, lysekvenssit tai parantavat sekvenssit, jotka saattavat vaikuttaa erytropoietiini-geenin ilmentymiseen tai proteiinin modifioitumiseen tai erittymiseen.
ESIMERKKI 3
Ekspressioplasmidien. joissa on Apa I-restriktiopala. rakentaminen 2426 bp Apa I-restriktiopala, joka sisälsi ihmisen ehjän erytropoietiini-geenin, insertoitiin kahteen ekspressiovekto- ia at*-» ana i,i « u 7 95393 riin, rakennelmiin pDll ja pBD, joiden kummankin pohjana oli erilainen nisäkäspromoottori.
Plasmidi-ekspressiovektori pDll saatiin jo kuvatusta plasmi-dista (Nucleic Acids Research 13:841-857. 1985, joka tässä yhteydessä on mainittu nimenomaan viitteenä). Tämä sisälsi SV-40 (simian virus 40) tehostussekvenssejä ja replikaation alkamiskohdan sekä adenovirus-2:n MDL (major late promoter)-promoottori- ja kolmiosaisen leader-sekvenssin. Ihmiserytro-poietiinin genomisekvenssien Apa I-pala (kuvio 1) geelipuhdis-tettiin ja yksisäikeiset päät täytettiin käsittelemällä T4 DNA-polymeraasilla. Molempiin tylppiin päihin liitettiin Bam Hi-linkkerit ja rakenne insertoitiin pDll:n ainutkertaiseen B-Bam HI-restriktiokohtaan, jotta voitaisiin ohjata eryt-ropoietiini-geenin transkriptio voimakkaasta promoottorista.
Saadun ekspressioplasmidin pDll-Ep, jossa on Apa I-pala (Ep), rakenne on kuvattu kuviossa 2. Plasmidi pDll sisältää 350 bp pitkän adenoviruksen left-pään (0-1). SV-40-viruksesta saadut aloitus- ja tehostussekvenssit (E), adenoviruksen MLP (major • · < late promoter) promoottorin, adenovirus-2:n kolmiosaisen leader-osan (Ll-3) ja kolmannen leader 5'-katkaisukohdan (5' ss) , imm\inoglobuliinin 3' -katkaisukohdan (3' ss) ja myöhäisen SV-40 polyadenylaatiosignaalin (pA9 (pML:n Eco Rl (RI)-restriktiokohdassa. Rekombinanttiplasmidit kloonattiin E.coli .v. HB101 -kantaan ja puhdistettiin sentrifugoimalla isopyknisesti kesiumkloridissa. Ekspressioplasmidin pDll-Ep pituus on noin 6500 bp. Rakenne vahvistettiin restriktiokartoituksen ja osittaisen dideoksinukleotidisekvenssoinnin avulla.
Plasmidissa pBD on MT-I-promoottorisekvenssi (Glanville, ' *' Durham & Palmiter, Nature 292:267-269. 1981, mainittu tässä yhteydessä nimenomaan viitteenä) ja selektoitavan DNFR-markke-risekvenssin pUC-plasmidissa. Seuraavassa viitataan kuvioon 3.
2426 bp Apa I-restriktiopala (EP) insertoitiin ainutkertaiseen Sma I-restriktiokohtaan plasmidissa pBD, jolloin saatiin eks-pressioplasmidi pBD-EP. DHFR-sekvenssi plasmidissa pBD-EP
3 95393 liittyi SV40-viruksesta saatuun alku- ja tehostussekvensseihin ja hepatiitti B pinta-antigeeni-polyadenylaatiosekvensseihin. pBD-EP prosessoitiin oleellisesti samalla tavoin kuin edellä on kuvattu plasmidille Pdll-EP.
Vaikkakin näissä vahvistavissa kokeissa käytettiin plasmidi-vektoreita, Apa I-erytropoietiini-geenipalan viemiseen isän-täsolulinjoihin voidaan käyttää samalla tavoin virus- tai retrovirus-ekspressiovektoreita. Sopivia DNA-viruksia tähän tarkoitukseen saattaisivat olla adenovirus tai BPD (Bovine Papilloma Virus). Myös sopivia retrovirusvektoreita tunnetaan ja niitä on saatavissa. Huomattakoon, että tällaisessa RNA (retrovial)-vektorissa olisi Apa I-restriktiopalan anti-sense- juoste, so. juoste, jonka sekvenssi vastaa kuviossa 1 esitetystä sense-juosteesta transkriptoitua RNA:ta tai sen allyyliä. Retrovirusvektori sisältäisi myös sekvenssit trans-toimiville faktoreille, jotka tarvitaan virusgenomin käänteis-transkriptioon ja viruksen DNA-muodon integroimiseen insäntä-genomiin.
««< ESIMERKKI 4
Nisäkässoluien transfektointi
Kumpikin kahdesta nisäkässolulinjasta transfektoitiin kummal-lakin pDll-EP ja pBD-EP-rakenteella. Nisäkässolulinjat, COS-7 (apinan munuaiset) ja BHK (hamsterinpoikasen munuaiset) ylläpidettiin Dulbecco'n MEM-alustassa, joka sisälsi 10 % vasikan-sikiöseerumia. Solut kasvatettiin ja kun yhtenäisyys oli 50 - 70 %, ne transfektoitiin kalsiumfosfaattimenetelmällä (Virology 52:456-467. 1973). BHK on peräisin munuaisten epite-lisoluista, joita yleisesti pidetään kaikkein todennäköisimpi-nä soluina, jotka tuottavat erytropoietiinia luonnontilassa, kun nisäkäs on aneeminen tai hypoksinen. Nämä solut saattavat siten tunnistaa kriittisiä säätelysekvenssejä erytropoietiini-geenin Apa I-palassa ja sen jälkeen tehokkaasti prosessoida ja tuottaa erytropoietiini-glykoproteiinia.
il . ad.L Diili 1.1 1 lei 9 95393
Solujen väliaikaista ekspressointia varten 100 mm viljelymal-jassa käytettiin yhteensä 20 μg DNA:a 10 μg pDll-EP-plasmidia, jossa oli erytropoietiini-geeni, ja 10 μg kantajana toimivaa lohensiittiö-DNA:a. Supernatantit otettiin talteen 48 tunnin kuluttua, sentrifugoitiin 10 minuuttia 400 g voimalla solujen ja jäännösten poistamiseksi ja pakastettiin -20°C:ssa. Solut otettiin talteen erikseen. Taulukossa 1 on annettu väliaikaisen ekspressoinnin tulokset kokeista, joissa transfektointi suoritettiin vain plasmideilla pDll-EP. Arvot ovat peräisin 3 kokeesta kullakin solutyypillä.
TAULUKKO 1
Erytropoietiini/ml viljelmää
Nisäkässolut Proteiini, ttq Yks, (in vitro-biomääritvs) BHK 3,4±0,2 270±16 COS-7 3,2±0,4 255±32
Havaitut erytropoietiini-määrät, jotka erittyivät joko COS-7 tai BHK-nisäkässolulinjojen supernatanttiin, olivat 80 kertaa ’·' korkeammat kuin mitä aikaisemmin on raportoitu erytropoietii-nia koodaavan cDNA:n väliaikaiselle ekspressoimiselle tai muiden rakenteiden väliaikaiselle ekspressoimiselle käytettäessä ehjiä erytropoietiini-geenejä.
Stabiilien solulinjojen, jotka tuottavat suuria määriä erytro-·* poietiinia, kehittämiseksi kotransfektoitiin joko COS-7 tai BHK-solut pDll-plasmidin ja pDHFR-la-plasmidin, joka sisältää cDNA:n dihydrofolaattireduktaasin, kanssa samanlaiseen nisä-kässoluvektoriin. Transfektointimenettelyä modifioitiin siten, että kotransfektoitiin 5 μg pDll-EP-plasmidia, 5 μg pDHFR-la-plasmidia ja 10 μg kantaja-DNA:ta. Sen jälkeen, kun oli vielä " inkuboitu 18 - 24 tuntia, viljelmiin lisättiin eri konsentraa- tiot metotreksaattia (10 nM - ImM). DHFR-geenin sisältämien solujen tulisi jäädä eloon selektiivisessä alustassa. Usean lisäpäivän inkuboimisen jälkeen eristettiin metotreksaatille resistentit elävät pesäkkeet, kasvatettiin ja pesäkkeet seulottiin supernatantin erytropoietiini-bioaktiivisuuden perus- 10 95393 teella. Noin puolet metotreksaatille resistenteistä pesäkkeistä, jotka määritettiin, erittivät havaittavan määrän erytro-poietiini-aktiivisuutta.
Stabiilien solulinjojen, joissa on ekspressiovektori pBD-EP, kehittämiseksi transfektoitiin BHK-solut kalsiumfosfaatti-menetelmällä. 18 - 24 tunnin kuluttua näihin viljelmiin lisättiin metotreksaattia sen konsentraatioiden vaihdellessa välillä 1 /im - 1 mM. Usean lisäpäivän inkuboimisen jälkeen eristettiin elävät pesäkkeet, jotka olivat resistenttejä näille suhteellisen korkeille metotreksaattimäärille, kasvatettiin ja seulottiin. Tässä koesarjassa kaikki metotreksaatille resistentit pesäkkeet, jotka määritettiin, erittivät havaittavissa olevan määrän erytropoietiini-aktiivisuutta.
Etyropoietiinigeenin ja DHFR-geenin sisältämän transkriptio-naalisen yksikön ilmentymisen optimoimiseksi kasvatettiin BHK-solulinjoja, jotka sisälsivät joko plasmidin pBD-Ep tai plas-midin pDll-Ep ja jotka erittivät suuria määriä erytropoietii-·'; ne ja, useita kertoja kasvavien metotreksaattikonsentraatioiden kautta (Nature 325:271-273. 1985). Sen sijaan, että olisi vähitellen lisätty solulinjohin kohdistuvaa selektiivistä painetta lisäämällä metotreksaatin konsentraatiota pienin askelin, soluihin kohdistettiin välittömästi erittäin korkeat metotreksaattimäärät (so. 1 mM). Vain muutama solu jäi eloon, ·’·' mutta nämä solut olivat oletettavasti liittäneet plasmidira- kenteen ilmentymiselle erityisen edulliseen DNA-alueeseen (nk.
"hot spot"-alue) ja/tai niillä ole oletettavasi monta kopiota rakennetusta transkriptionaalisesta yksiköstä. Tällä tavoin valittiin yhden vaiheen avulla eniten tuottavat solulinjat. Solulinjoja (mukaan lukien taulukossa 2 ovat F, 7,2 ja S 5,2) *.* pidettiin stabiileina, jos erytropoietiinin tuottokyky pysyi korkeana yli 15 kasvatuksen ajan ilman selektiivistä metotrek-saattipainetta.
Solupellettien sisältämän erytropoietiinin aktiivisuusmääriä ei voitu määrittää, koska solu-uutteissa oli mukana merkittä- ia au( n iti li i «i u 95393 västi määritysinhibiittoreita. Taulukossa 2 esitetyt tulokset eivät siten ole analyysejä erytropoietiini-proteiinin solun-sisäisistä määristä vaan pikemminkin solulinjojen tuottaman ja supernatanttiin erittämän erytropoietiini-proteiinin määrästä.
TAULUKKO 2
Rekombinantti-erytropoietiinin ekspressio stabiilisti transfektoiduista BHK-solulinjoista Erytropoietiini/ml supernatantti Solulinia Proteiini, ua Yks, (in vitro-biomääritvs)
pBD-EP
F 1,1 12,4 970 F 3,4 32,0 2500 F 6,1 79,6 6210 F 7,2 84,1 6728
PD11-EP
S 1,2 6,4 500 S 2,4 64,2 5000 ‘i S 5,2 82,1 6400
Havaitut erytropoietiinin erittymismäärät vastaavat nimellis-määrinä lähes seitsemää miljoonaa yksikköä litraa kohti.
Tällaiset nimellismäärät määritetään kertomalla ml kohti havaittu saanto tuhannella, jolloin saadaan suuremmassa mitäs-
' I I
* ’ sa odotettavissa oleva saanto litraa kohti.
Havaitut erytropoietiinin erittymismäärät, kun käytettiin Apa I-palaa, olivat suuruusluokaltaan 300 kertaa suurempia kuin mitä aikaisemmin on raportoitu (Lin et ai., Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 82: 7580-7584, marraskuu 1985) stabiilisti transfor-' " moidulla CHO-solulinjalle, joka sisältää ihmiserytropoietiini- geenin eri genomipalan.
Näiden transfektiomääritysten kontrollikokeisiin sisältyivät supernatantit transfektoimattomista soluista ja solujen, jotka oli transfektoitu muita proteiineja, mukaan lukien bakteeripe- 12 95393 räistä kloramfeenikoli-asetyylitransferaasia ja ihmisen koagu-lointiproteiinia, faktoria IX, koodaavaa DNA:ta sisältävillä plasmideilla, rinnakkaisviljelmät. Millään kontrolliviljelmil-lä, valetransfektoinneilla tai viljellyillä soluilla, jotka oli transfektoitu muilla geeneillä, ei ollut havaittavissa olevaa erytropoietiini-aktiivisuutta. Edellä olevissa erytro-poietiini-geenillä suoritetuissa koesarjoissa havaittiin myös, että selektoiduille solulinjoille saadut ilmentymistasot eivät riippuneet siitä, oliko selektoitu markkeri kotransfektoitu yhdessä erytropoietiini-geenin kanssa tai oliko se insertoitu Apa I-palan sisältämään plasmidiin ennen transfektointia (arvoja ei ole annettu).
Muihin tyypillisiin transfektointimenetelmiin, jotka sopivat tämän keksinnön toteuttamiseen, kuuluvat DEAE-dekstraanivälit-teiset transfektointitekniikat, lysotsyymifuusio tai eryt-rosyyttifuusio, raapiminen, suora sisäänvienti, osmoottinen shokki tai sakkaroosishokki, suora mikroinjisointi, epäsuora mikroinsijointi, kuten erytrosyyttivälitteisten tekniikoiden avulla ja/tai sähkövirtojen kohdistaminen isäntäsoluihin. Transfektoinnilla tarkoitetaan geneettisen informaation siirtämistä ja erityisesti ihmisen erytropoietiinigeenin Apa I-restriktiopalan koodaaman informaation siirtämistä soluun eristetyn DNA:n, RNA:n tai synteettisen nukleotidipolymeerin avulla. Edellä olevaa luetteloa transfektointitekniikoista ei ·’· tule pitää kattavana, sillä epäilemättä tullaan kehittämään myös muitakin menetelmiä, jolla geneettinen informaatio viedään soluihin. Apa I-restriktiopala yhdistetään tyypillisesti (ligatoidaan) toiminnallisesti ennen transfektointia muihin nukleiinihapposekvensseihin, kuten promoottori-, tehostus- ja polyadenylaatiosekvensseihin. Vaikkakin kuvatut isäntäsolulin-’’ jät ovat nisäkäsperäisiä ja munuaisen epitelisoluja pidetään erityisen hyvinä, tätä keksintöä toteutettaessa voidaan käyttää myös muita eukaryoottisia sekä prokaryoottisia (bakteerit tai hiivat) isäntäsolulinjoja; nisäkäsgeenien aivan äskettäiset viemiset kasvisoluihin antavat mahdollisuuden käyttää myös kasvi- tai leväsoluja.
13 95393 ESIMERKKI 5
Erytropoietiinin ilmentäminen transfektoiduista soluliniöistä
Rekombinantti-erytropoietiiniproteiini, joka erittyi transfek-toitujen solulinjojen supernatanttiin, oli biologisesti aktiivista. Hormonia erittyi suuret määrät: 7000 yksikköön asti millilitraa kohti.
Erytropoietiinin biologisen aktiivisuuden in vitro määrittäminen perustui erytroidipesäkkeiden (CFU-E:sta; erytroidipesäk-keitä muodostavat solut) hiiren luuydinsolujen viljelmissä plasmahyytymässä (Blood Cells 4:89-103. 1978). Tämän määrityksen herkkyys on noin 5 milliyksikköä/ml. Määrityksen standardina käytetty erytropoietiini oli aneemisen lampaan plasmasta saatu, osittain puhdistettu valmiste (Connaught, vaihe 3 Ep, erä 3026). Supernatantit määritettiin kasvatetuista solulin-joista, joita oli kasvatettu 24 tuntia tuoreessa alustassa ilman metotreksaattia. Supernatantti laimennettiin 1:200 \ alustalla ja lisättiin 1-10 mikrolitraa määritysviljelmän millilitraa kohti viljelmän sisältäessä 2 x 105 luuydinsolua, 10 % sitratoitua naudanplasmaa, 20 % vasikansikiöseerumia, 10 % naudanseerumialbumiinia ja 1,6 % naudanalkiouutetta (Gibco). 36 - 48 tunnin inkuboinnin jälkeen plasmahyytymät kiinnitettiin mikroskooppilevyille, niiden hemoglobiini vär- « ( ' jättiin bentsidiinillä ja erytroidipesäkkeet laskettiin. Kun erytropoietiinia ei oltu lisätty, ei havaittu mitään CFU-E-peräisiä pesäkkeitä. Optimaalinen erytroidipesäkkeiden kasvu (havaittuja CFU-E-soluja 100 - 150 x 104 luuydinsolua kohti) havaittiin rutiininomaisesti käyttämällä 50 mU (0,64 nanogram-maa) erytropoietiinia viljelmän ml kohti. Erytropoietiini-* · hormoneja erittyi suuria määriä transfektoitujen solulinjojen supernatanttiin, kts. taulukot 1 ja 2, 7000 yksikköön asti ml kohti. Olettamalla, että rekombinantti-erytropoietiinilla on yhtä suuri spesifinen aktiivisuus kuin luonnon erytropoi-etiinilla (78.000 yksikköä/mg proteiinia) biologinen määritys 14 95393 vastaa noin 80 μg erytropoietiini-proteiinia millilitraa kohti.
Valituista solulinjoista saaduista supernatanteista määritettiin lisäksi immunologisesti reaktiivinen erytropoietiini kompetetiivisen radioimmunomäärityksen avulla käyttämällä polyvalenttista anti-ihmis-erytropoietiini-kaniini-anti-seerumia (J.Cell.Phvsiol. 118:87-96. 1984). Radioimmunomäärityksel-lä mitattu proteiinimäärä vastasi biologisen määrityksen avulla arvioitua proteiinimäärää. Nämä arvot osoittavat, että transfektoidut solulinjat ekspressoivat ja erittävät erytropoietiini-proteiinia, joka oli yli 98-prosenttisesti aktiivista .
Transfektoitujen solujen tuottama rekombinantti-erytropoietii-ni karakterisoitiin edelleen sen osoittamiseksi, että nämä solut erittivät autenttista hormonia. Valituista solulinjoista määritettiin in vivo erytropoietiini-aktiivisuus ekshypoksi-sessa polysyateemisessä hiiressä. Kokeissa, joissa käytettiin osittain puhdistettua natiivia erytropoietiinia, oli aikaisem- : min havaittu, että neuramidinaasikäsittely hävitti täydelli sesti erytropoietiini-aktiivisuuden koskemattomassa eläimessä määritettynä (J.Biol.Chem. 247:5159-5160. 1958). Aktiivisuuden häviäminen johtui luultavasti siitä, että maksa poisti tehokkaammin desialoidun hormonin, koska neuramidinaasilla käsitelty erytropoietiini pysyi täysin aktiivisena in vitro. Tehokkaan in vivo biologisen aktiivisuuden havaitseminen osoittaa, että transfektoidut nisäkässolulinjat lisäävät asianmukaisella tavalla hiilihydraattia ja terminaalisia sialiinihappoja erytropoietiini-proteiiniin post-translaationaalisen modifioi-misen aikana.
• Erytropoietiinin aktiivisuus in vitro biologisessa määrityksessä neutraloitiin erillisissä kokeissa neutraloimalla viljelmään lisätty anti-ihmiserytropoietiini-vasta-aine.
Tyypillisten transfektoitujen solulinjojen supernatanttiin erittämästä erytropoietiinista määritettiin myös sen muihin
Il : ' Utit lllll 114 1·* ! 15 95393 luuytimen kantasoluihin kohdistuvat proliferatiiviset vaikutukset. Rekombinantti-erytropoietiinista määritettiin sen vaikutus erilaisiin hiiren ja ihmisen luuytimestä saatuihin kantasoluihin, mukaanlukien CFU-E (erythroid colony-formin cells)-soluihin, BFU-E (erythroid burst-formin cells)-soluihin, CFU-GM (granulocyte-macrophage precursors)-prekursorei-hin ja CFU-Mix (mixed-cell colony-formin cells)-soluihin (J.Cell.Phusiol-Suppl. 1:79-85, 1982; J.Cell.Phvsiol. 118: 87-96, 1984). Reaktiona rekombinantti-erytropoietiiniin esiintyi erytroidi-kantasoluilla lisääntymisreaktio, joka oli verrattavissa luonnon erytropoietiinilla havaittuun annos-reaktio-suhteeseen. CFU-GM- eikä myöskään CFU-Mix-soluilla ollut mitään lisääntymisreaktiota rekombinantti-erytropoietii-nin suhteen tämän konsentraatiossa, jotka ulottuivat 10 yksikköön asti per ml määrityksen soluviljelmää.
Kun puhdistettu rekombinantti-erytropoietiini analysoitiin SDS-PAGE-menetelmällä pelkistävissä tai ei-pelkistävissä olosuhteissa, se käyttäytyi elektroforeesissa identtisesti 1 · · : erytropoietiinin kanssa, joka oli eristetty aplastisesta anemiasta kärsivien potilaiden virtsasta. Proteiinien mikrohe-terogeenisyyden havaittiin olevan samanlainen ja valtalajeilla oli identtiset molekyylipainot 34 kD.
Vaikkakin esillä olevaa keksintöä on kuvattu parhaana pidettyjen suoritusmuotojen avulla, taidoiltaan keskimääräinen henkilö kykenee edellä olevan selityksen luettuaan tekemään tässä esitettyihin seoksiin ja menetelmiin erilaisia muutoksia, suorittamaan vastaavia korvauksia tai tekemään muita muutoksia. Patentin antamaa suojaa rajoittaa siten vain oheisista patenttivaatimuksista ja vastaavista muodostuva määrittely.
* ·

Claims (14)

16 95393
1. Oleellisesti puhdas DNA tai RNA, tunnettu siitä, että se muodostuu ihmisen erytropoietiini-geenin 2,4 kb Apa I-restriktiopalaa vastaavasta nukleotidisekvenssistä (kuvio 1).
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA tai RNA, tunnet -t u siitä, että Apa I-restriktiopala muodostuu oleellisesti joko kuviossa 1 esitetyn sense-juosteen tai sen komplementti-sen RNA-sekvenssin nukleotidisekvenssistä.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA- tai RNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on toiminnallisesti yhdistetty heterologiseen toiseen nukleiinihapposekvenssiin, joka kykenee saamaan aikaan sen ilmentymisen.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA tai RNA, tunnet -t u siitä, että tämä toinen nukleiinihapposekvenssi on valit- i1 tu yhdestä tai useammasta seuraavista: promoottorisekvenssit, tehostussekvenssit, polyadenylaatiosekvenssit, selektoitavat markkerisekvenssit, plasmidit, virus- ja retrovirus-ekspres-siovektorit ja trans-vaikutteiset retrovirusfaktorit.
5. Nisäkässolulinja, tunnettu siitä, että se käsittää *' patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaista DNA:ta tai RNA:ta sisältäviä soluja.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen nisäkässolulinja, tunnettu siitä, että se käsittää soluja, jotka on stabiilis-ti transfektoitu mainitulla DNA-sekvenssillä. • ·
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että solut ovat peräisin munuaisista. 2 2 Patenttivaatimuksen 7 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että munuaissolut ovat epiteelisoluja. 17 95393
9. Menetelmä biologisesti aktiivisen rekombinantti-ihmiseryt-ropoietiinin ekspressoimiseksi, tunnettu siitä, että inkuboidaan ihmiserytropoietiinigeenin 2,4 kb Apa I-restrik-tiopala (kuvio 1) ekspressiovektoriin, transfektoidaan nisä-käsisäntäsolulinja ihmisen erytropoietiinigeenin 2,4 kb Apa I-restriktiopalan sisältävällä vektorilla, isäntäsolulinjan transfektoituja soluja saatetaan kosketukseen viljelyalustan kanssa, joka sallii solujen ekspressoivan erytropoietiinin, ja otetaan ekspressoitunut erytropoietiini talteen.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että solulinja kykenee mahdollistamaan nimellis-tuoton, joka on vähintään kaksi miljoonaa yksikköä erytropoi-etiinia inkubointialustan litraa kohti.
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Apa I-restriktiopala on plasmidissa tai viruksessa. • « «
12. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkäsisäntäsolulinja on valittu ryhmästä, johon kuuluvat eukaryoottiset solut.
13. Jonkun patenttivaatimuksen 9-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transfektoidut solut pysyvästi ’ ' ekspressoivat erytropoietiinin.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että pysyvä ekspressio aikaansaadaan altistamalla solut metotreksaatin suurelle konsentraatille. 1 · • · 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet - t u siitä, että käytetyn metotreksaatin pitoisuus on suuruusluokkaa 1 mM. 18 95393
FI880899A 1986-06-27 1988-02-26 Oleellisesti puhdas DNA ja RNA ja menetelmä erytropoietiinin ekspressoimiseksi FI95393C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87942386A 1986-06-27 1986-06-27
US87942386 1986-06-27
US8701459 1987-06-23
PCT/US1987/001459 WO1988000241A1 (en) 1986-06-27 1987-06-23 Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI880899A FI880899A (fi) 1988-02-26
FI880899A0 FI880899A0 (fi) 1988-02-26
FI95393B true FI95393B (fi) 1995-10-13
FI95393C FI95393C (fi) 1996-01-25

Family

ID=25374134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI880899A FI95393C (fi) 1986-06-27 1988-02-26 Oleellisesti puhdas DNA ja RNA ja menetelmä erytropoietiinin ekspressoimiseksi

Country Status (17)

Country Link
US (3) US5688679A (fi)
EP (1) EP0255231B1 (fi)
JP (1) JPS63126488A (fi)
KR (1) KR970009935B1 (fi)
CN (2) CN1044133C (fi)
AT (1) ATE76431T1 (fi)
AU (1) AU611088B2 (fi)
BR (1) BR8703269A (fi)
CA (1) CA1341361C (fi)
DE (1) DE3779206D1 (fi)
DK (1) DK173067B1 (fi)
ES (1) ES2037083T3 (fi)
FI (1) FI95393C (fi)
GR (1) GR3004707T3 (fi)
NO (1) NO303398B1 (fi)
PT (1) PT85193B (fi)
WO (1) WO1988000241A1 (fi)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US6048729A (en) 1987-05-01 2000-04-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US4974929A (en) * 1987-09-22 1990-12-04 Baxter International, Inc. Fiber optical probe connector for physiologic measurement devices
US6054288A (en) * 1991-11-05 2000-04-25 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US6692737B1 (en) 1991-11-05 2004-02-17 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6531124B1 (en) 1992-07-10 2003-03-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6153407A (en) * 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
EP0737252A1 (en) * 1993-11-10 1996-10-16 Amgen Inc. Gene therapy vector for the treatment of low or defective red blood cell production
US5919758A (en) * 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5888774A (en) * 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
US5952226A (en) * 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
US6187564B1 (en) 1997-07-10 2001-02-13 Beth Israel Deaconess Medical Center DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US6699672B1 (en) * 1997-09-02 2004-03-02 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use research and medical applications
US6177545B1 (en) * 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
US20020088019A1 (en) * 1997-09-02 2002-07-04 Oron Yacoby-Zeevi Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos
US20040213789A1 (en) * 1997-09-02 2004-10-28 Oron Yacoby-Zeevi Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
US20030161823A1 (en) * 1998-08-31 2003-08-28 Neta Ilan Therapeutic and cosmetic uses of heparanases
US6897066B1 (en) * 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
DE69824039T2 (de) 1997-12-08 2005-08-18 Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
BR9905868A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
AU2878600A (en) * 1999-03-01 2000-09-21 Hadasit Medical Research Services & Development Company Ltd Polynucleotide encoding a polypeptide having heparanase activity and expression of same in genetically modified cells
IL145816A0 (en) * 1999-04-09 2002-07-25 Ortho Mcneil Pharm Inc Pharmaceutical compositions of erythropoietin
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US6617135B1 (en) 1999-08-09 2003-09-09 Emd Lexigen Research Center Corp. Multiple cytokine protein complexes
AU2154401A (en) 1999-11-12 2001-05-30 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
WO2001058957A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US7259146B2 (en) 2000-05-26 2007-08-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
MXPA02012734A (es) * 2000-06-29 2003-04-25 Merck Patent Gmbh Mejoramiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citocina, mediante tratamiento combinado con agentes mejoradores de la captacion de inmunocitocina.
US7078376B1 (en) 2000-08-11 2006-07-18 Baxter Healthcare S.A. Therapeutic methods for treating subjects with a recombinant erythropoietin having high activity and reduced side effects
WO2002024899A2 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Valentis, Inc. Improved system for regulation of transgene expression
ATE361089T1 (de) 2001-02-02 2007-05-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Behandlung von neurologischen funktionsstörungen mit fructopyranosesulfamaten und erythropoetin
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
CN100503639C (zh) 2001-05-03 2009-06-24 默克专利有限公司 重组肿瘤特异性抗体及其应用
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
US6671189B2 (en) * 2001-11-09 2003-12-30 Minebea Co., Ltd. Power converter having primary and secondary side switches
JP2005530678A (ja) * 2001-11-28 2005-10-13 オーソーマクニール ファーマシューティカル， インコーポレイテッド 貧血治療用のエリスロポエチン投与療法
WO2003048334A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
WO2003078959A2 (en) * 2002-03-11 2003-09-25 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
DE10234192B4 (de) * 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
CA2498319A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
WO2004108065A2 (en) * 2003-06-09 2004-12-16 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Heparanase activity neutralizing anti- heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
US7141544B2 (en) * 2003-10-10 2006-11-28 Baxter International, Inc. Stabilization of pharmaceutical protein formulations with small peptides
WO2005063808A1 (en) 2003-12-31 2005-07-14 Merck Patent Gmbh Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
US7423139B2 (en) * 2004-01-20 2008-09-09 Insight Biopharmaceuticals Ltd. High level expression of recombinant human erythropoietin having a modified 5′-UTR
US20050238628A1 (en) * 2004-04-08 2005-10-27 Blau Carl A Methods for treating cancer
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
US7772182B2 (en) * 2004-08-05 2010-08-10 Alza Corporation Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
CN101062407A (zh) 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
EP2120998B1 (en) 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
US20090143255A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Funkhouser Gary P Methods and Compositions for Improving Well Bore Stability in Subterranean Formations
CA2712606A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
CA2736141C (en) 2008-09-23 2018-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Purification of erythropoietin
CN102232085A (zh) 2008-09-26 2011-11-02 Ambrx公司 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
MX2011005910A (es) 2008-12-04 2011-06-17 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas con eritropoyetina (epo) mediante inhibicion del transcrito antisentido natural a eritropoyetina.
WO2010108503A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Life & Brain Gmbh Promotion of neuronal integration in neural stem cell grafts
WO2013120500A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
EP2970420A4 (en) 2013-03-15 2016-08-17 Apotex Inc STABILITY OF THE ENHANCED LIQUID FORMULATION OF ERYTHROPOIETIN ALPHA VIA A PURIFICATION TREATMENT
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
JP6245299B2 (ja) * 2016-04-27 2017-12-13 バクスアルタ ゲーエムベーハー 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6045849B2 (ja) * 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
IT1185503B (it) * 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
IL77081A (en) * 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
ATE89314T1 (de) * 1985-02-13 1993-05-15 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US4751084A (en) * 1986-02-26 1988-06-14 Monsanto Company Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
DE3789678T2 (de) * 1986-02-27 1994-08-11 Snow Brand Milk Prod Co Ltd Herstellung von erythropoietinproduzierenden Zellen und Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin mit Verwendung dieser Zellen.
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition

Also Published As

Publication number Publication date
US20020045255A1 (en) 2002-04-18
PT85193B (pt) 1990-08-31
CN87104424A (zh) 1988-04-27
FI880899A (fi) 1988-02-26
BR8703269A (pt) 1988-03-15
US6867020B2 (en) 2005-03-15
WO1988000241A1 (en) 1988-01-14
NO880863D0 (no) 1988-02-26
NO880863L (no) 1988-04-26
KR970009935B1 (ko) 1997-06-19
JPS63126488A (ja) 1988-05-30
US6682910B2 (en) 2004-01-27
DK309387A (da) 1987-12-28
FI95393C (fi) 1996-01-25
AU7475787A (en) 1988-01-07
DK173067B1 (da) 1999-12-13
CN1044133C (zh) 1999-07-14
DE3779206D1 (de) 1992-06-25
PT85193A (en) 1987-07-01
CA1341361C (en) 2002-05-21
FI880899A0 (fi) 1988-02-26
CN101041819A (zh) 2007-09-26
DK309387D0 (da) 1987-06-17
EP0255231B1 (en) 1992-05-20
US20020137145A1 (en) 2002-09-26
ES2037083T3 (es) 1993-06-16
US5688679A (en) 1997-11-18
ATE76431T1 (de) 1992-06-15
EP0255231A1 (en) 1988-02-03
GR3004707T3 (fi) 1993-04-28
NO303398B1 (no) 1998-07-06
KR880007726A (ko) 1988-08-29
AU611088B2 (en) 1991-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI95393B (fi) Oleellisesti puhdas DNA ja RNA ja menetelmä erytropoietiinin ekspressoimiseksi
Powell et al. Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells and chromosome localization.
KR100257457B1 (ko) 인간응집인자 viii 단백질 복합체의 제조방법
JP3126348B2 (ja) 組換えにより生産されたヒトｌｈ
AU647732B2 (en) DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
US5639639A (en) Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
EP0275305A1 (en) Dna sequences coding for modified factor viii:c and modified factor viii:c-like polypeptides and processes for producing these polypeptides in high yields
CA2160034C (en) Gibbon ape leukemia virus-based retroviral vectors
JP2000270883A (ja) 感染性タンパク質デリバリーシステム
WO1993013119A1 (en) Hematopoietic cell specific transcriptional regulatory elements of serglycin and uses thereof
JPH0655136B2 (ja) ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａにより形質転換されている細胞
WO2004074439A9 (en) An expression cassette and vector for transient or stable expression of exogenous molecules
US5710037A (en) Retroviral vector particles
WO1995034639A9 (en) Novel retroviral envelope and ltr and retroviral vector particles including such envelope and/or ltr
US5707865A (en) Retroviral vectors for expression in embryonic cells
EP0162319B1 (en) Method of joining heterologous genes
US6852507B1 (en) Recombinant baculovirus and use thereof in the production of monoclonal antibodies
US20020177544A1 (en) Adenoviral transfer vector for the gene transport of a dna sequence
US7629160B2 (en) Vectors and methods for enhanced cell longevity and protein expression
KR100288389B1 (ko) 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스 gp64의 프로모터와 다각체 프로모터의 융합 프로모터로 구성된 새로운 발현 시스템에 의한 재조합 단백질의 대량 생산방법
KR0121322B1 (ko) 백혈병 억제 인자 제조를 위한 재조합 dna 분자 및 숙주 세포
CN113677800A (zh) 包含用于结合结构域和可分泌肽的基因的重组载体
KR0139168B1 (ko) 에리스로포이에틴의 제조방법
JPH0463594A (ja) 成長ホルモンレセプターのホルモン結合領域蛋白の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF

MA Patent expired