NO303398B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av rekombinant biologisk aktivt humant erytropoietin, ekspresjonsvektor samt cellelinje til bruk ved fremstillingen - Google Patents
FremgangsmÕte for fremstilling av rekombinant biologisk aktivt humant erytropoietin, ekspresjonsvektor samt cellelinje til bruk ved fremstillingen Download PDFInfo
- Publication number
- NO303398B1 NO303398B1 NO880863A NO880863A NO303398B1 NO 303398 B1 NO303398 B1 NO 303398B1 NO 880863 A NO880863 A NO 880863A NO 880863 A NO880863 A NO 880863A NO 303398 B1 NO303398 B1 NO 303398B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- erythropoietin
- cell line
- cells
- sequence
- apa
- Prior art date
Links
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 title claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 91
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 78
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 64
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 56
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 14
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 claims description 3
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 abstract description 10
- 239000005556 hormone Substances 0.000 abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000000581 polycythemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UAHFGYDRQSXQEB-PWPYQVNISA-N 4-nle-α-msh Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 UAHFGYDRQSXQEB-PWPYQVNISA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10311—Siphoviridae
- C12N2795/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2795/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Denne oppfinnelsen ble delvis gjort med statsstøtte under "Research Grants" HL 16919, AM 19410, AM 01418 og CA 31615 tildelt av "National Institutes of Health". Staten har visse rettigheter i denne oppfinnelsen.
Denne oppfinnelsen gjelder generelt området genetisk teknikk, særlig når det gjelder ekspresjon av glykoprotein-" produkter fra rekombinante gener, og mer spesielt ekspresjon av høye nivåer av biologisk aktivt humant erytropoietin fra stabilt transfekterte celler.
Hormonet erytropoietin spiller en vesentlig rolle ved regulering av erytropoiese, dannelsen av røde blodceller, og mangel på erytropoietin resulterer i anemi. Detaljerte under-søkelser av hormonet og forsøk på erstatningsterapi har vært vanskelig på grunn av knapphet på renset materiale.
Normal produksjon av humane røde blodceller krever utskillelse av erytropoietin fra nyrene, tilsynelatende som det modne glykoprotein. Ved likevekt sirkulerer dette hormon i blodet i en konsentrasjon på 10-18 millienheter (128-230 picogram) pr. ml, og med stimulanse av alvorlig vevshypoksi (oksygenmangel) kan nivåene øke så mye som tusen ganger. Det forhøyede hormonnivå starter rask celledeling og differensiering av en populasjon av mottagelige stammeceller i benmargen, stimulerer hemoglobinsyntese i modnende erytroide celler og aksellererer frigjøring av røde celler fra margen til sirkulasjon, og øker derved den røde cellemasse og bedrer den hypoksiske tilstand. Pasienter med mangel på erytropoietin, såsom de med kronisk nyresvikt, lider ofte av alvorlig anemi.
Erytropoietin er et glykoprotein på 34-38 kd med omtrent 40% av sin molekylvekt gitt av karbohydrat. I det minste en disulfid-bro er nødvendig for aktivitet. Lite er kjent når det gjelder strukturen til dette hormon, og detaljene ved dets syntese er ikke helt forstått. Nylig isolering av cDNA og genomiske kloner gir mulighet til å analysere kontroll av erytropoietindannelse, men ekspresjon av biologisk aktivt humant erytropoietin i tilstrekkelige mengder til erstatningsterapi er ikke oppnådd.
Ifølge denne utredning kan biologisk aktivt humant erytropoietin uttrykkes i høye nivåer (ved nominelle titre som overskrider to millionenheter pr. liter supernatant) fra stabilt transfekterte pattedyrcellelinjer. Således gis rik kilde til renset humant erytropoietin til klinisk anvendelse. Overraskende høy ekspresjon av erytropoietin oppnås ved å transfektere vertscellelinjer med Apa I restriksjonsfragmentet fra det humane" erytropoietingen. Apa I restriksjonsfragmentet har en nukleotidsekvens som tilsvarer den som er vist i fig. 1.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1A-C er en skjematisk fremstilling av det aktuelle 2426 bp Apa I restriksjonsfragment som inneholder de humane erytropoietingensekvenser som indikert; Fig. 2 viser en representativ plasmidekspresjonsvektor (pDll-Ep) som inneholder 2426 bp Apa I restriksjonsfragmentet; og Fig. 3 viser en annen ekspresjonsvektor (pBD-EP) som bærer det aktuelle Apa I restriksjonsfragment.
Detaljert beskrivelse av den foretrukne utforming
I den foretrukne utforming av fremgangsmåten føres en gen-teknisk konstruksjon av Apa I restriksjonsfragmentet som vist i fig. 1 eller den komplementære RNA-sekvens derav inn i en sirkulær DNA-plasmidvektor, og hvor vektoren inneholder en andre nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av: en valgbar markørsekvens, en forsterkersekvens, en promotersekvens eller genet som koder for dihydrofolatreduktase, vektoren benyttes til transformering av en pattedyrcellelinje omfattende celler i stand til å glykosylere polypeptidet pattedyrnyreceller eller BHK-celler. Videre dyrkes cellelinjen i et inkubasjons medium for ekspresjon av erytropoietin, nevnte erytropoietin separeres fra cellene og mediet og utvinnes. Apa I restriksjonsfragmentet fra det humane erytropoietingen ble valgt for å gjøre størst mulig effektiv transkripsjon av erytropoietin "messenger"-RNA og effektiv translasjon og modifisering etter translasjon av RNA til modent biologisk aktivt erytropoietinglykoprotein. Spesifikt, ved 5'-enden av erytropoietingenet, var det viktig å fjerne forstyrrende sekvenser, men beholde forsterkende sekvenser. Introner ble beholdt i Apa I restriksjonsfragmentet for å inkludere mulige betydningsfulle forsterkende sekvenser.
Ved 3'-enden på genet ble noen 3'-ikke-translaterte sekvenser beholdt for å optimalisere mulige regulerende sekvenser. Den forsterkede ekspresjon gitt av Apa I fragmentet er vist ved de sammenfallende høye nivåer av erytropoietinekspresjon beskrevet i de følgende arbeidseksempler, med bruk av dette fragment sammen med to aktivatorer og to cellelinjer.
Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er en ekspresjonsvektor som er en sirkulær DNA-plasmidvektor som inneholder en nukleotidsekvens svarende til 2.4 kb Apa I restriksjonsfragmentet av et humant erytropoietingen som vist i fig. 1 eller den komplementære RNA-sekvens derav.
Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en cellelinje omfattende pattedyrnyreceller med evne til å glykosylere polypeptidet, pattedyrnyreceller og/eller BHK-celler som er transformert med nevnte vektor. Cellelinjen kan foretrukket være behandlet med 1 mmol konsentrasjon av metotreksat i ett enkelt trinn for å oppnå stabil ekspresjon. Mer foretrukket er cellelinjen en babyhamsternyrecellelinje (BHK) eller en apenyre (COS-7) cellelinj e.
De følgende eksempler er gitt for å illustrere fordelene ved den foreliggende oppfinnelse og for å hjelpe en med vanlig fag-kunnskap ved fremstilling og bruk av denne.
EKSEMPEL 1
Isolering av genomiske kloner
En human genomisk samling i bakteriofag lambda ( Ce11 15:1157-1174, 1978) ble undersøkt med bruk av lite strenge hybridiseringsbetingelser og blandinger av oligonukleotidprober som beskrevet i Cell 38.: 287-297, 1984, innlemmet her ved referatet.
Oligonukleotidblandinger ble fremstilt ved bruk av en "Applied Biosystems synthesizer" og ende-merket med bruk av<32>p-ATP og T4 polynukleotidkinase. De syntetiske oligonukleotider ble utformet til å korrespondere til deler av den aminoterminale aminosyresekvens til:
gitt av Yanagawa et al. ( J. Biol. Chem. 259:2707-2710, 1984) for humant protein renfremstilt fra urin fra pasienter med aplastisk anemi. For å redusere degenerasjonen av kodonene for aminosyre-sekvensene i dette området ble kodonbruksreglene til Grantham et al. ( Nucleic Acids Research 8:43-59, 1981) og Jaye et al. (Nucleic Acids Research 11:2325-2335, 1983) benyttet. Disse regler tar i betraktning den relativt sjeldne forekomst av CpG dinukleotider i DNA fra vertebrater og unngår, der det passer, mulige A:G umake parringer. Ved aminosyreposisjon 24 ble et asparagin plassert som mest sannsynlig ( J. Biol. Chem. 259:2702-2710, 1984). For aminosyrene Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn, ble to puljer på 72 sekvenser hver syntetisert så de tilsvarer de forutsagte kodoner. Således var en pulje TT(c/t)TC(a/g/t)GC(c/t)TC(c/t)TT(a/g/t)GCTTC for 20 nukleotidsonden, og den andre pulje erstattet en T med en C på plass 18. For aminosyrene Glu-Asn-Ile-Thr-Asp-Gly ble en pulje sekvenser (AGC TCC TCC ATC AGT ATT ATT T[c/t]) konstruert"for 23 nukleot idproben.
Plakk som hybridiserte til oligonukleotidprobene ble igjen adskilt ved lavere tetthet inntil de var rene. Etter at til å begynne med positive fagkloner ble plakkrenset, ble ytterligere sekvensinformasjon for erytropoietingenet publisert av Jacobs et al. ( Nature 313:806-310, 1985). Oligonukleotider ble konstruert ut fra denne informasjon og brukt til å bekrefte identiteten av de positive kloner. Etter Eco RI-restriksjonsenzymoppløsning av de positive kloner, ble innskudd-DNA gelrenset og ligert ved standardteknikker til pUC 13 plasmid som tidligere var fordøyd med Eco RI. DNA-sekvensen ble bestemt ved dideoksynukleotidkjedé-avslutning ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977) med bruk av dATP (a-<35>S) og den 17-mer universelle primer eller, i utvalgte regioner, spesifikke oligonukleotidprimere.
Ca. 4,8 xIO<6>bakteriofag ble adskilt ved hybridisering av gjentatte nitrocellulosefiltere. Tre forskjellige kloner forble positive gjennom plakkrensing, og DNA-innskuddet blekarakterisertved restriksjonskartlegging og partiell dideoksynukleotid-sekvensering. To av de tre kloner inneholdt tilsynelatende fullstendig informasjon for erytropoietingenet. Restriksjonskartet og sekvensen for 24 26 bp Apa I fragmentet i disse klonene er vist i fig. 1 og var hovedsakelig det samme som det som nylig er publisert av Jacobs et al. ( Nature 313:806-810, 1985) for genet for humant erytropoietin. Den lave forekomst av fagisolater som inneholder erytropoietingenet i dette utvidede bibliotek, en på omtrent 2 x IO<6>bakteriofag, er i samsvar med forslaget at erytropoietin eksisterer som en enkel kopi i det humane genom. "Southern-blot"-hybridisering av totalt humant genomisk DNA med Apa I fragmentet eller andre restriksjonsfragmenter av erytropoietingenet indikerer bare et enkelt hybridiseringsbånd uten noen ytterligere regioner av meget homologt DNA.
EKSEMPEL 2
Utvelgelse av Apa I restriksjonsfragmentet
Til konstruksjon av ekspresjonsvektorer ble Apa I restriksjonsfragmentet fra erytropoietingenet dannet ved bruk av teknikker beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467, 1967, innlemmet her ved referanse. Kort, ble isolert fag-DNA oppløst med restriksjonsenzymet med Apa I (Bethesda Research Laboratories), fulgt av adskillelse på en 1% agarosegel og isolering ved elektroeluering, fenolekstraksjon og etanol-utfelling. Fragmentet ble bekreftet ved partiell sekvensdannelse som i eksempel 1.
Med referanse til fig. 1 inneholdt det innskutte Apa I restriksjonsfragment 58 bp av 5' ikke oversatte sekvenser (nukleotider 0001-0058), fulgt av sekvenser som koder for et antatt 27 aminosyresignalpeptid, det modne protein, fire antatte mellomliggende sekvenser og 222 bp av 3' ikke-kodende DNA-sekvens. Ved 5'-enden på genet er Apa I-setet lokalisert 58 basepar opp-strøms fra ATG startkodonet (0058) for proteinsekvensen. Denne 5'-plass (0001) ble valgt for å unngå en falsk startplass akkurat oppstrøms fra Apa I restriksjonssetet, mens den omfatter formodede reguleringssekvenser som anses å være viktige for virksom ribosomal binding og bearbeiding. Apa I-plassen på 3'-enden (2426) ble valgt for å omfatte formodede bearbeidelsessignaler i de fleste av de 3' ikke oversatte sekvenser under fjerning av videre sekvenser nedover i strømmen. Det komplette erytropoietingen, inkludert intronsekvenser, ble brukt for å omfatte potensielle regulerende eller forsterkende sekvenser, lokalisert i introner som kunne bidra til erytropoietingenekspresjon eller protein-modifisering og utskillelse.
EKSEMPEL 3
Konstruksjon av ekspresjonsplasmider
som bærer Apa I restriksjonsfragmentet
2426 bp Apa I restriksjonsfragmentet som inneholder det intakte humane erytropoietingen ble innskutt i to ekspresjonsvektorer, pD-11 og pBD-konstruksjonene, hvor begge er basert på forskjellige pattedyrsaktivatorer.
Plasmidekspresjonsvektor pDll ble avledet fra et tidligere beskrevet plasmid ( Nucleic Acids Research 13_:841-857, 1985, spesielt innlemmet her ved referanse) og inneholdt apevirus 40 (SV-40) forsterkersekvenser og opphav til replikasjon samt
adenovirus-2's sene hovedpromotor og tredelte førersekvenser.
Apa I fragmentet av humant erytropoietingenomiske sekvenser
(fig. 1) ble gel-renset, og enkeltstrengede ender ble fylt ut ved behandling med T4 DNA polymerase. Barn HI-linkere ble forbundet til begge butte ender, og konstruksjonen ble innskutt i en eneste B-Bam HI-restriksjonssete på pDll for å dirigere avskrift av erytropoietingenet fra en sterk promoter.
Strukturen av det resulterende ekspresjonsplasmid pDll-Ep som bærer Apa I-fragmentet (Ep) er vist i fig. 2. Plasmidet pDll inneholder 3 50 bp av adenovirusets venstre ende (0-1), opphavs-og forsterkersekvenser fra SV-4 0 (E), adenovirusets sene hovedpromotor (MLP), adenovirus-2 tredelte leder (Ll-3) og tredje leder 5' skjøtesete (5' ss), et immunoglubulin 3' skjøtesete (3 'ss) og det sene SV-4 0 polyadenyleringssignal (pA) i Eco RI
(RI) restriksjonssetet på pML. Det rekombinante plasmidet ble klonet i E. coli HB 101 og renset ved isopyknisk sentrifugering i cesium-klorid. Ekspresjonsplasmidet pDll-Ep er ca. 6 500 bp i lengde. Konstruksjonen ble bekreftet ved restriksjonskartlegging og partiell dideoksynukleotidsekvensbestemmelse.
pBD inneholder MT-I promotersekvens (Glanville, Durham&Palmiter, Nature 292:267-269, 1981, spesielt innlemmet her ved referanse) og en DHFR selekterbar markørsekvens båret i pUC plasmid. Med referanse til fig. 3, ble 2426 bp Apa I restriksjonsfragment (EP) skutt inn i et eneste Sma I restriksjonssete i pBD for å lage ekspresjonsplasmid pBD-EP. DHFR-sekvensen i pBD-EP ble forbundet med opphavs- og forsterkersekvenser fra SV4 0 og med hepatitt B-overflateantigen polyadenyleringssekvenser. pBD-EP ble behandlet i alt vesentlig som beskrevet ovenfor for pDll-EP.
Mens plasmidvektorer ble brukt i disse bekreftende eksperimenter, overveies det at virale eller retrovirale ekspresjonsvektorer på samme måte kan benyttes for å introdusere Apa I erytropoietingenfragmentet i vertscellelinjer. Egnede DNA-virus til dette formål ville omfatte adenovirus eller BPV (Bovine Papilloma Virus). Egnede retrovirale vektorer er også kjente og tilgjengelige. Det sier seg selv at en slik retroviral (RNA) vektor ville bære antisensetråden av Apa I restriksjonsfragmentet, dvs. et som har en sekvens som tilsvarer RNA transkribert fra sensetråden vist i fig. 1 eller til et allel av denne. Retrovirus-vektoren ville også omfatte sekvenser til trans-aktiverende faktorer som kreves for revers transkripsjon av det virale genom og innlemmelse av DNA-formen fra viruset fra vertsgenomet.
EKSEMPEL 4
Transfeksjon av pattedyrceller
Hver av to pattedyrcellelinjer ble transfektert med hver
av pDll-EP- og pBD-EP-konstruksjonene. Pattedyrcellelinjer,
COS-7 (apenyre) og BHK (hamsterungenyre) ble holdt i Dulbeccos modifiserte essensielle medium som inneholder 10% kalvefoster-serum. Celler ble overført og ble ved 50-70% sammenflytingtransfektert ved kalsiumfosfatmetoden ( Virology 5_2:456-467, 1973) . BHK dannes fra epitelceller fra nyrer og anses generelt som de mest sannsynlige celler som danner erytropoietin i naturlig tilstand når et pattedyr er anemisk eller hypoksisk. Således kunne disse celler gjenkjenne kritiske regulerende sekvenser i Apa I-fragmentet på erytropoietingenet, og deretter effektivt behandle og fremstille erytropoietinglykoprotein.
Til transient ekspresjon av celler i en 100 mm dyrkningsskål ble totalt 20/xg DNA brukt: 10 ug pDll-EP plasmid som inneholder erytropoietingenet og 10/ig bærende laksesperma DNA. Etter 48 timer ble supernatanten samlet, sentrifugert ved 400 g i
10 minutter for å fjerne celler og nedbrutt materiale, og frosset ved -20°C. Cellene ble høstet separat. Resultatet av transfek-sjonen med pDll-EP alene til transient ekspresjon er vist i tabell 1. Data er fra 3 eksperimenter for hver celletype.
De observerte nivåer av erytropoietin utskilt i supernatanten fra enten pattedyrcellelinje COS-7 eller BHK, var omtrent 8 0 ganger større enn de tidligere er rapportert for transient ekspresjon av en cDNA-kode for erytropoietin eller for transient ekspresjon av andre konstruksjoner ved bruk av intakte erytro-poietingener.
For å etablere stabile cellelinjer som danner høye nivåer av erytropoietin, ble enten COS-7- eller BHK-celler transfektert sammen med pDll-Ep plasmid og pDHFR-la, et plasmid som inneholder et cDNA for dihydrofolat reduktase i en tilsvarende pattedyreks-presjonsvektor. Transfeksjonsprosedyren ble endret slik at 5/ig pDll-Ep plasmid, 5/xg pDHFR-la plasmid og 10/ig bære-DNA ble transfektert sammen. Etter ytterligere inkubering i 18-24 timer ble varierende konsentrasjoner av metotreksat (10 nM til 1 mM) tilsatt til kulturene. Celler som omfatter DHFR-genet ville være levedyktige i det selektive medium. Etter inkubering i mange flere dager ble levedyktige kolonier som var motstandsdyktige overfor metotreksat isolert, overført og undersøkt med henblikk på tilstedeværelse av erytropoietinbioaktivitet i supernatanten. Omtrent halvparten av de metotreksatresistente kolonier som ble analysert utskilte påviselig erytropoietinaktivitet.
For å etablere stabile cellelinjer med ekspresjonsvektor pBD-EP, ble BHK-celler transfektert ved kalsiumfosfatmetoden. Etter 18-24 timer ble disse kulturer utsatt for konsentrasjoner av metotreksat som varierte fra 1 xxM opp til 1 mM. Etter inkubering i enda flere dager ble levedyktige kolonier som var resistente for disse relativt høye nivåer av metotreksat isolert, overført og undersøkt. I denne serien utskilte alle de metotreksatresistente kolonier som ble undersøkt påviselig erytropoietinaktivitet.
For å optimalisere ekspresjon av transkripsjonsenheten som inneholder erytropoietingenet og DHFR-genet ble BHK-cellelinjer som inneholder enten pBD-Ep eller pDll-Ep og som utskiller høye nivåer av erytropoietin overført flere ganger til økende konsentrasjoner av metotreksat ( Nature 316: 271-273, 1985). Imidlertid, istedet for en gradvis økning i den selektive belastning på cellelinjene ved små økende trinn i konsentrasjonen av metotreksat, ble cellene øyeblikkelig utfordret med meget høye nivåer av metotreksat
(dvs. 1 mM). Bare noen få celler overlevde, men disse celler ville ha innlemmet plasmidkonstruksjonen i et område av DNA særlig fordelaktig for ekspresjon (en såkalt "hot-spot") og/eller ville ha mange kopier av den konstruerte transkripsjonsenhet. Således ble de høyest produserende cellelinjer valgt ut i ett trinn. Cellelinjer (inkludert F 7.2 og S 5.2 oppført i tabell 2) ble betraktet som stabile hvis erytropoietinproduksjonen forble høy i mer enn 15 overføringer i fravær av den selektive metotreksat-belastning.
Mengden av erytropoietinaktivitet i cellepellets kunne ikke bestemmes på grunn av tilstedeværelse av vesentlig hemmende midler for analysen i celleekstraktene. Som en følge av dette analyserer resultatene vist i tabell 2 ikke de intracellulære nivåer av erytropoietinprotein, men istedet mengden av erytropoietinprotein dannet og utskilt i supernatanten av cellelinjene.
De observerte mengder av erytropoietinutskillelse tilsvarer nominelle verdier på opptil ca. 7 millioner enheter pr. liter. Slike nominelle verdier bestemmes ved å multiplisere det observerte utbytte pr. ml med ettusen for å gi et forventet oppskalert produksjonsutbytte pr. liter.
De observerte mengder av erytropoietinutskillelse ved bruk av Apa I fragmentet var i størrelsesorden 300 ganger større~enn de som tidligere er rapportert (Lin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:7580-7584, nov. 1985) for en stabilt transformert CHO-cellelinje som inneholder et avvikende genomisk fragment fra det humane erytropoietingen.
Kontrolleksperimenter for disse transfeksjonsanalyser inkluderte supernatanter fra ikke-transfekterte celler og parallelle kulturer av celler transfektert med plasmider som inneholder DNA som koder andre proteiner, inkludert bakterielt kloramfenikolacetyltransferase og humant koaguleringsprotein, faktor IX. Ingen av kontrollkulturene, de falske transfeksjoner eller dyrkede celler transfektert med andre gener hadde påviselig erytropoietinaktivitet. Det ble også bemerket i serien av eksperimenter ovenfor med erytropoietingenet at ekspresjonsnivåene oppnådd for utvalgte cellelinjer ikke hadde forbindelse med hvorvidt markøren som kunne velges ble transfektert sammen med erytropoietingenet eller ble innskutt i plasmidet som inneholder Apa I-fragmentet før transfeksjon (data ikke vist).
Andre representative transfeksjonsmetoder egnet til anvendelse av denne oppfinnelse omfatter DEAE-dekstra-formidlede transfeksjonsteknikker, lysozymfusjon eller erytrocytt-fusjon, skraping, direkte opptak, osmotisk eller sukrosesjokk, direkte mikroinjeksjon, indirekte mikroinjeksjon, såsom via erytrocytt-formidlede teknikker, og/eller ved å utsette vertscellene for elektrisk strøm. Ved transfeksjon menes overføring av genetisk informasjon, og spesifikt informasjonen kodet av Apa I restriksjonsfragmentet i et humant erytropoietingen, til en celle ved bruk av isolert DNA, RNA, eller syntetisk nukleotidpolymer. Listen ovenfor over transfeksjonsteknikker anses ikke å være uttømmende, etter som andre fremgangsmåter for å introdusere genetisk informasjon i celler uten tvil vil utvikles. Apa I restriksjonsfragmentet blir typisk virksomt forbundet (ligert) med andre nukleinsyresekvenser såsom aktivator-, forsterker- og polyadenyleringssekvenser, før transfeksjon. Mens vertscellelinjer av patte-dyropprinnelse er beskrevet', og nyreepitelceller anses å være særlig foretrukket, vurderes det hvorvidt andre eukaryote celler og også prokaryote (bakterie eller gjær) vertscellelinjer kan benyttes ved bruk av denne oppfinnelse; meget nylig innføring av pattedyrgener i planteceller gir muligheten for å anvende plante-eller algeceller også.
EKSEMPEL 5
Erytropoietinekspresjon fra transfekterte cellelinjer
Det rekombinante erytropoietinprotein utskilt i supernatanten fra transfekterte cellelinjer var biologisk aktivt, og store mengder av hormonet ble utskilt: opp til 7000 enheter pr. ml.
In vitro-analysen med hensyn på erytropoietinbiologisk aktivitet var basert på dannelse av erytroide kolonier (fra CFU-E; erytroide kolonidannende celler) i kulturer av benmargceller fra mus i plasmalevring ( Blood Cells 4:89-103, 1978). Følsomheten av denne analyse er rundt 5 millienheter/ml. Erytropoietinet som benyttes som standard for analysen var et delvis renset preparat fra plasma fra anemiske sauer (Connaught, Step 3 Ep, Lot 3026). Supernatanten ble analysert fra overførte cellelinjer dyrket i
24 timer i nytt medium uten metotreksat. Supernatanten ble fortynnet 1:200 med medium, og mengder mellom 1 og 10 mikrolitere ble tilsatt pr. ml analysekultur som inneholdt 2 x IO<5>margceller, 10% okseplasma tilsatt citrat, 20% føtalt kalveserum, 1% okse-serumalbumin og 1,6% "beef embryo extract" (Gibco). Etter inkubering i 36-48 timer ble plasmaproppene fiksert på mikroskop-objektglass, farget med benzidin for hemoglobin, og erytroide kolonier ble tellet. I fravær av tilsatt erytropoietin ble ingen CFU-E-avledede kolonier påvist. Optimal erytroid kolonivekst (100-150 CFU-E påvist pr. 2 x 10<4>margceller) ble observert rutinemessig med 50 mU (0,64 nanogram) erytropoietin pr. ml kultur. Store mengder av erytropoietinhormoner ble utskilt i supernatanten fra transfekterte cellelinjer, se tabellene 1 og 2, opp til 7000 enheter pr. ml. Ved å anta at det rekombinante erytropoietin har en spesifikk aktivitet som tilsvarer den i naturlig erytropoietin (78 000 enheter pr. mg protein), tilsvarer den biologiske analyse nær 80 iig erytropoietinprotein pr. ml.
I tillegg ble supernatant fra utvalgte cellelinjer analysert med hensyn på immunologisk reaktivt erytropoietin ved konkurrerende radioimmunoanalyse ved bruk av et flerverdig anti-humant-erytropoietin kanin anti-serum ( J. Cell. Physiol. 118:87-96, 1984). Mengden protein målt ved radioimmunoanalysen tilsvarte protein-nivået anslått ved biologisk analyse. Disse data indikerer at de transfekterte cellelinjer uttrykte og utskilte erytropoietinprotein som var mer enn 98% aktivt.
Det rekombinante erytropoietin dannet av de transfekterte celler ble viderekarakterisertfor å vise at disse celler utskilte autentisk hormon. Utvalgte cellelinjer ble analysert med hensyn på in vivo erytropoietinaktivitet i ekshypoksiske polycytemiske mus ( Nature 191:1069-1087, 1961). Supernatanter utskilt fra cellelinjene hadde sterk in vivo biologisk aktivitet når de ble analysert i de ekshypoksiske polycytemiske mus. Ved eksperimenter som bruker delvis renset naturlig erytropoietin, hadde det tidligere blitt lagt merke til at neuraminidasebehandling fullstendig motvirket erytropoietinaktivitet når det ble analysert i det intakte dyr ( J. Biol. Chem. 247:5159-5160, 1958). Tapet av aktivitet skyldtes antagelig øket fjerning med leveren av det "desialated" hormon ettersom neuraminidasebehandlet erytropoietin forble fullstendig aktivt in vitro. Observasjonen av sterk in vivo biologisk virkning indikerer at de transfekterte pattedyrcelle-linj er på riktig måte adderer karbohydrat og de terminale sialin-syrer til erytropoietinproteinet under den post-translasjonelle modifikasj on.
I adskilte eksperimenter ble aktiviteten til erytropoietin i in vitro biologisk analyse nøytralisert ved et nøytraliserende anti-humant erytropoietinantistoff tilsatt til kulturen.
Erytropoietinet som ble utskilt i supernatanten til representative transfekterte cellelinjer ble også analysert med hensyn på formerende virkninger på andre progenitorceller fra margen. Rekombinant erytropoietin ble analysert med hensyn på dets virkning på en rekke progenitorer fra mus og human marg, inkludert erytroid kolonidannende celler (CFU-E), erytroide grendannende celler (BFU-E), granulocyttmakrofag forløpere (CFU-GM) og blandede celler kolonidannende celler (CFU-Mix) ( J. Cell. Phvsiol. Suppl. 1:79-85, 1982; J. Cell. Phvsiol. 118:87-96, 1984). Erytroide stilkceller viste en formeringsrespons på det rekombinante erytropoietin som var parallell med den doseavhengige forbindelse funnet med naturlig erytropoietin. Hverken CFU-GM eller CFU-Mix viste noen formeringsrespons på det rekombinante erytropoietin ved konsentrasjoner opptil 10 enheter pr. ml celleanalysekultur.
Analysert med SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende forhold reagerte det rensede rekombinante erytropoietin identisk ved elektroforese som erytropoietin renfremstilt fra urin til pasienter med aplastisk anemi. Tilsvarende mikrohetero-genitet når det gjaldt proteinene ble observert, og de frem-herskende spesier hadde identiske molekylvekter på 34 kD.
Mens den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i samsvar med foretrukne utforminger, er den nærmere definert i patentkravene.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant biologisk aktivt human erytropoietin,karakterisert vedtrinnene: a) transformering av en pattedyrcellelinje omfattende celler i stand til å glykosylere polypeptidet, pattedyrnyreceller eller BHK-celler, med en sirkulær DNA-plasmidvektor inne-holdende en nukleotidsekvens svarende til 2,4 kb Apa I restriksjonsfragmentet av et humant erytropoietingen som vist i fig. 1, eller den komplementære RNA-sekvens derav, og hvori vektoren inneholder en andre nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av: en velgbar markørsekvens, en forsterkersekvens, en promotorsekvens eller genet som koder for dihydrofolat-reduktase, b) dyrking av cellelinjen i et inkubasjonsmedium for ekspresjon av erytropoietin; separasjon av nevnte erytropoietin fra cellene og mediet; og c) utvinning av nevnte erytropoietin.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat cellelinjen med evne til stabil ekspresjon av erytropoietinet oppnås ved å behandle cellene med 1 mmol konsentrasjon metotreksat i et enkelt trinn.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedanvendelse av en cellelinje som er istand til å muliggjøre et nominelt utbytte på minst 2 millioner enheter erytropoietin pr. 24 timer målt med in-vitro bioassay.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3,
karakterisert vedat det anvendes en babyhamster-cellelinj e.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3,
karakterisert vedat det anvendes en apenyre (COS-7) cellelinje.
6. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den er en sirkulær DNA-plasmidvektor som inneholder en nukleotidsekvens svarende til 2,4 kb Apa I restriksjonsfragmentet av et humant erytropoietingen som vist i fig. 1, eller den komplementære RNA-sekvens derav, og hvori vektoren inneholder en andre nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av: en velgbar markørsekvens, en forsterkersekvens, en promotorsekvens eller genet som koder for dihydrofolatreduktase.
7. Cellelinje omfattende pattedyrceller med evne til å glykosylere polypeptidet, pattedyrnyreceller og/eller BHK-celler,karakterisert vedat den er transformert med en vektor i henhold til krav 6 på en måte som setter cellen istand til å uttrykke og glykosylere erytropoietin-polypeptid når- cellene dyrkes i et vekstmedium.
8. Cellelinje ifølge krav 7,
karakterisert vedat cellelinjen for stabil ekspresjon er oppnådd ved å behandle cellene med 1 mmol konsentrasjon av metotreksat i ett enkelt trinn.
9. Cellelinje ifølge krav 7 og 8,
karakterisert vedat den er en babyhamsternyrecellelinje (BHK).
10. Cellelinje ifølge krav 7 og 8,
karakterisert vedat den er en apenyre (COS-7) cellelinj e.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87942386A | 1986-06-27 | 1986-06-27 | |
| PCT/US1987/001459 WO1988000241A1 (en) | 1986-06-27 | 1987-06-23 | Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO880863D0 NO880863D0 (no) | 1988-02-26 |
| NO880863L NO880863L (no) | 1988-04-26 |
| NO303398B1 true NO303398B1 (no) | 1998-07-06 |
Family
ID=25374134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO880863A NO303398B1 (no) | 1986-06-27 | 1988-02-26 | FremgangsmÕte for fremstilling av rekombinant biologisk aktivt humant erytropoietin, ekspresjonsvektor samt cellelinje til bruk ved fremstillingen |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5688679A (no) |
| EP (1) | EP0255231B1 (no) |
| JP (1) | JPS63126488A (no) |
| KR (1) | KR970009935B1 (no) |
| CN (2) | CN1044133C (no) |
| AT (1) | ATE76431T1 (no) |
| AU (1) | AU611088B2 (no) |
| BR (1) | BR8703269A (no) |
| CA (1) | CA1341361C (no) |
| DE (1) | DE3779206D1 (no) |
| DK (1) | DK173067B1 (no) |
| ES (1) | ES2037083T3 (no) |
| FI (1) | FI95393C (no) |
| GR (1) | GR3004707T3 (no) |
| NO (1) | NO303398B1 (no) |
| PT (1) | PT85193B (no) |
| WO (1) | WO1988000241A1 (no) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK173067B1 (da) * | 1986-06-27 | 1999-12-13 | Univ Washington | Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa |
| US6048729A (en) * | 1987-05-01 | 2000-04-11 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
| US4974929A (en) * | 1987-09-22 | 1990-12-04 | Baxter International, Inc. | Fiber optical probe connector for physiologic measurement devices |
| US6692737B1 (en) | 1991-11-05 | 2004-02-17 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
| US5968502A (en) * | 1991-11-05 | 1999-10-19 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
| US5641670A (en) * | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
| US6054288A (en) * | 1991-11-05 | 2000-04-25 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
| PT101031B (pt) | 1991-11-05 | 2002-07-31 | Transkaryotic Therapies Inc | Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica |
| US6063630A (en) | 1991-11-05 | 2000-05-16 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy |
| US6531124B1 (en) | 1992-07-10 | 2003-03-11 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy |
| US6670178B1 (en) | 1992-07-10 | 2003-12-30 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy |
| US6153407A (en) * | 1992-07-28 | 2000-11-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
| EP0737252A1 (en) * | 1993-11-10 | 1996-10-16 | Amgen Inc. | Gene therapy vector for the treatment of low or defective red blood cell production |
| US5919758A (en) * | 1994-03-22 | 1999-07-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Modified polypeptides with altered biological activity |
| US5888774A (en) * | 1994-12-19 | 1999-03-30 | Cangene Corporation | Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| US6187564B1 (en) | 1997-07-10 | 2001-02-13 | Beth Israel Deaconess Medical Center | DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
| US20040213789A1 (en) * | 1997-09-02 | 2004-10-28 | Oron Yacoby-Zeevi | Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies |
| US6177545B1 (en) * | 1997-09-02 | 2001-01-23 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications |
| US20020088019A1 (en) * | 1997-09-02 | 2002-07-04 | Oron Yacoby-Zeevi | Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos |
| US20030161823A1 (en) * | 1998-08-31 | 2003-08-28 | Neta Ilan | Therapeutic and cosmetic uses of heparanases |
| US6699672B1 (en) * | 1997-09-02 | 2004-03-02 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use research and medical applications |
| US6897066B1 (en) * | 1997-09-26 | 2005-05-24 | Athersys, Inc. | Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes |
| EP1037927B1 (en) * | 1997-12-08 | 2004-05-19 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
| US6777205B1 (en) | 1998-11-06 | 2004-08-17 | Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. | Host cells expressing recombinant human erythropoietin |
| BR9905868A (pt) | 1998-11-06 | 2001-01-23 | Bio Sidus S A | Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| BR9917606A (pt) | 1998-11-06 | 2002-12-31 | Bio Sidus S A | Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| EP1157118A4 (en) * | 1999-03-01 | 2002-07-17 | Insight Strategy & Marketing | POLYNUCLEOTID ENCODING A POLYPEPTIDE WITH HEPARANASE ACTIVITY AND ITS EXPRESSION IN GENETICALLY MODIFIED CELLS |
| IL145816A0 (en) * | 1999-04-09 | 2002-07-25 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Pharmaceutical compositions of erythropoietin |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| MXPA02001417A (es) | 1999-08-09 | 2002-08-12 | Lexigen Pharm Corp | Complejos multiples de citosina-anticuerpo. |
| CA2391080A1 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Erythropoietin forms with improved properties |
| ES2269366T3 (es) * | 2000-02-11 | 2007-04-01 | Merck Patent Gmbh | Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos. |
| US7259146B2 (en) | 2000-05-26 | 2007-08-21 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Neuroprotective peptides |
| DE60129695T2 (de) | 2000-06-29 | 2008-06-05 | Merck Patent Gmbh | Steigerung von durch antikörper-zytokin-fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme |
| US7078376B1 (en) | 2000-08-11 | 2006-07-18 | Baxter Healthcare S.A. | Therapeutic methods for treating subjects with a recombinant erythropoietin having high activity and reduced side effects |
| WO2002024899A2 (en) | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Valentis, Inc. | Improved system for regulation of transgene expression |
| PT1471871E (pt) * | 2001-02-02 | 2007-06-05 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Tratamento de disfunção neurológica compreendendo sulfamatos de frutopiranose e eritropoietina |
| CN1330664C (zh) | 2001-03-07 | 2007-08-08 | 默克专利有限公司 | 用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术 |
| US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| CN100503639C (zh) | 2001-05-03 | 2009-06-24 | 默克专利有限公司 | 重组肿瘤特异性抗体及其应用 |
| US6818613B2 (en) | 2001-11-07 | 2004-11-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Aqueous sustained-release formulations of proteins |
| US6671189B2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-12-30 | Minebea Co., Ltd. | Power converter having primary and secondary side switches |
| NZ532988A (en) * | 2001-11-28 | 2008-04-30 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Erythropoietin dosing regimen for treating anemia |
| MXPA04005266A (es) | 2001-12-04 | 2004-10-11 | Merck Patent Gmbh | Inmunocitocinas con selectividad modulada. |
| US7129267B2 (en) * | 2002-03-11 | 2006-10-31 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Methods for SHP1 mediated neuroprotection |
| DE10234192B4 (de) * | 2002-07-26 | 2009-11-26 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Verwendung von Erythropoetin |
| EP1539960B1 (en) * | 2002-09-09 | 2010-04-28 | Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. | Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides |
| US7169904B2 (en) | 2002-12-17 | 2007-01-30 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Immunocytokine sequences and uses thereof |
| EP2338333B1 (en) | 2003-04-09 | 2017-09-06 | ratiopharm GmbH | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| WO2004108065A2 (en) * | 2003-06-09 | 2004-12-16 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | Heparanase activity neutralizing anti- heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies |
| US7141544B2 (en) * | 2003-10-10 | 2006-11-28 | Baxter International, Inc. | Stabilization of pharmaceutical protein formulations with small peptides |
| DK1699821T3 (da) | 2003-12-31 | 2012-07-16 | Merck Patent Gmbh | Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER |
| US7423139B2 (en) * | 2004-01-20 | 2008-09-09 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | High level expression of recombinant human erythropoietin having a modified 5′-UTR |
| US20050238628A1 (en) * | 2004-04-08 | 2005-10-27 | Blau Carl A | Methods for treating cancer |
| US7588745B2 (en) * | 2004-04-13 | 2009-09-15 | Si Options, Llc | Silicon-containing products |
| US7772182B2 (en) * | 2004-08-05 | 2010-08-10 | Alza Corporation | Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists |
| US7597884B2 (en) | 2004-08-09 | 2009-10-06 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
| CN101062407A (zh) | 2006-04-29 | 2007-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途 |
| EP2120998B1 (en) | 2006-11-28 | 2013-08-07 | HanAll Biopharma Co., Ltd. | Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment |
| US20090143255A1 (en) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Funkhouser Gary P | Methods and Compositions for Improving Well Bore Stability in Subterranean Formations |
| SG188143A1 (en) | 2008-02-08 | 2013-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| WO2010034442A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-04-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Purification of erythropoietin |
| PL2342223T3 (pl) | 2008-09-26 | 2017-09-29 | Ambrx, Inc. | Zmodyfikowane polipeptydy zwierzęcej erytropoetyny i ich zastosowania |
| KR101829469B1 (ko) | 2008-12-04 | 2018-03-30 | 큐알엔에이, 인크. | Ｅｐｏ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 에리트로포에틴(ｅｐｏ) 관련된 질환의 치료 |
| WO2010108503A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Life & Brain Gmbh | Promotion of neuronal integration in neural stem cell grafts |
| WO2013120500A1 (en) * | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Curevac Gmbh | Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen |
| EP2970420A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-08-17 | Apotex Inc | STABILITY OF THE ENHANCED LIQUID FORMULATION OF ERYTHROPOIETIN ALPHA VIA A PURIFICATION TREATMENT |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| JP6245299B2 (ja) * | 2016-04-27 | 2017-12-13 | バクスアルタ ゲーエムベーハー | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| IT1185503B (it) * | 1984-01-11 | 1987-11-12 | Univ New York | Cloni di odna di eritropietina umana |
| IL77081A (en) * | 1984-12-04 | 1999-10-28 | Genetics Inst | AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin |
| DE3688418T2 (de) * | 1985-02-13 | 1993-08-26 | Scios Nova Inc | Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen. |
| US4751084A (en) * | 1986-02-26 | 1988-06-14 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator from normal human colon cells |
| DE3789678T2 (de) * | 1986-02-27 | 1994-08-11 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | Herstellung von erythropoietinproduzierenden Zellen und Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin mit Verwendung dieser Zellen. |
| DK173067B1 (da) * | 1986-06-27 | 1999-12-13 | Univ Washington | Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa |
| US4835260A (en) * | 1987-03-20 | 1989-05-30 | Genetics Institute, Inc. | Erythropoietin composition |
-
1987
- 1987-06-17 DK DK198703093A patent/DK173067B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 CA CA000616544A patent/CA1341361C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-23 WO PCT/US1987/001459 patent/WO1988000241A1/en active IP Right Grant
- 1987-06-25 ES ES198787305672T patent/ES2037083T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-25 AT AT87305672T patent/ATE76431T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-25 DE DE8787305672T patent/DE3779206D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-25 EP EP87305672A patent/EP0255231B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-26 CN CN87104424A patent/CN1044133C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-26 CN CNA2006101006871A patent/CN101041819A/zh active Pending
- 1987-06-26 AU AU74757/87A patent/AU611088B2/en not_active Expired
- 1987-06-26 PT PT85193A patent/PT85193B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-06-26 BR BR8703269A patent/BR8703269A/pt not_active Application Discontinuation
- 1987-06-27 KR KR1019870006561A patent/KR970009935B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-06-27 JP JP62160799A patent/JPS63126488A/ja active Pending
-
1988
- 1988-02-26 FI FI880899A patent/FI95393C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 NO NO880863A patent/NO303398B1/no not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-05-26 GR GR920401043T patent/GR3004707T3/el unknown
-
1993
- 1993-10-06 US US08/132,489 patent/US5688679A/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-10 US US09/975,063 patent/US6867020B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-11-05 US US10/011,858 patent/US6682910B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT85193A (en) | 1987-07-01 |
| EP0255231A1 (en) | 1988-02-03 |
| US5688679A (en) | 1997-11-18 |
| ES2037083T3 (es) | 1993-06-16 |
| BR8703269A (pt) | 1988-03-15 |
| CN101041819A (zh) | 2007-09-26 |
| US6682910B2 (en) | 2004-01-27 |
| AU611088B2 (en) | 1991-06-06 |
| US20020045255A1 (en) | 2002-04-18 |
| DE3779206D1 (de) | 1992-06-25 |
| DK173067B1 (da) | 1999-12-13 |
| CN87104424A (zh) | 1988-04-27 |
| JPS63126488A (ja) | 1988-05-30 |
| CN1044133C (zh) | 1999-07-14 |
| DK309387A (da) | 1987-12-28 |
| CA1341361C (en) | 2002-05-21 |
| WO1988000241A1 (en) | 1988-01-14 |
| FI880899A (fi) | 1988-02-26 |
| EP0255231B1 (en) | 1992-05-20 |
| NO880863D0 (no) | 1988-02-26 |
| PT85193B (pt) | 1990-08-31 |
| DK309387D0 (da) | 1987-06-17 |
| NO880863L (no) | 1988-04-26 |
| KR970009935B1 (ko) | 1997-06-19 |
| GR3004707T3 (no) | 1993-04-28 |
| US20020137145A1 (en) | 2002-09-26 |
| AU7475787A (en) | 1988-01-07 |
| ATE76431T1 (de) | 1992-06-15 |
| US6867020B2 (en) | 2005-03-15 |
| FI95393B (fi) | 1995-10-13 |
| KR880007726A (ko) | 1988-08-29 |
| FI95393C (fi) | 1996-01-25 |
| FI880899A0 (fi) | 1988-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO303398B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av rekombinant biologisk aktivt humant erytropoietin, ekspresjonsvektor samt cellelinje til bruk ved fremstillingen | |
| JP3126348B2 (ja) | 組換えにより生産されたヒトｌｈ | |
| AU628069B2 (en) | Lymphokine production and purification | |
| JP3276933B2 (ja) | エリスロポエチン活性を有する糖蛋白質の製造方法 | |
| US5639639A (en) | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof | |
| WO1993013119A1 (en) | Hematopoietic cell specific transcriptional regulatory elements of serglycin and uses thereof | |
| JPH04505104A (ja) | 相同組換え法を用いてのタンパク質の生成 | |
| JPH0217156B2 (no) | ||
| KR20000048511A (ko) | 단백질의 고농도 발현 | |
| NO323853B1 (no) | Renset og isolert hamster-EF-1alpha-transkripsjonsregulatorisk DNA, kimaert polynukleotid omfattende dette, vertceller og plasmid omfattende disse og fremgangsmate for okning av transkripsjon av et gen av interesse i en vertcelle | |
| EP0160699A1 (en) | MANUFACTURE OF HETERODIMER HUMAN FERTILITY HORMONES. | |
| EP0516787B1 (en) | Expression systems | |
| KR20220121844A (ko) | 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법 | |
| KR20230031929A (ko) | 고릴라 아데노바이러스 핵산 서열 및 아미노산 서열, 이들을 함유하는 벡터, 및 이의 용도 | |
| NO862383L (no) | Klonings- eller utstoetningsvektorer omfattende genomet av viruset av fugle-erythroblastose samt celler modifisert av vektorene. | |
| BRPI0616533A2 (pt) | polinucleotìdeo isolado, fragmento de ácido nucléico isolado, construções de dna recombinante, plantas, sementes, células vegetais, tecidos vegetais, método de isolamento de fragmentos de ácidos nucléico, método de mapeamento de variações genéticas, método de cultivo molecular, plantas de milho, métodos de alteração do transporte de nitrogênio das plantas e variantes de hat de plantas alteradas | |
| EP0162319B1 (en) | Method of joining heterologous genes | |
| CN113564145B (zh) | 用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用 | |
| EP0369458A2 (en) | Bovine metallothionein regulatory region | |
| Nishimori et al. | Establishment of composite DNA derived from L factor as a plasmid in mouse embryonal carcinoma (F9) cells | |
| TW202309288A (zh) | 調節基因表現之組合物及方法 | |
| EP0160091A1 (en) | Production of heterodimeric human fertility hormones |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |