JPH09271A - 哺乳類のｇｍ−ｃｓｆポリペプチドとその産生方法および顆粒球とマクロファージの産生を刺激する方法 - Google Patents

哺乳類のｇｍ−ｃｓｆポリペプチドとその産生方法および顆粒球とマクロファージの産生を刺激する方法

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JPH09271A
JPH09271A JP8095743A JP9574396A JPH09271A JP H09271 A JPH09271 A JP H09271A JP 8095743 A JP8095743 A JP 8095743A JP 9574396 A JP9574396 A JP 9574396A JP H09271 A JPH09271 A JP H09271A
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ダン・アシュレー・ロジャー
Nicholas M Gough
グー・ニコラス・マーチン
Donald Metcalf
メトカーフ・ドナルド
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 臨床目的に十分な量の顆粒球・マクロファー
ジ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を生産するため
の方法を提供する。 【解決手段】 宿主内で作用するプロモーターフラグメ
ントとＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡセグメント（た
だし、当該ＤＮＡセグメントはＧＭ−ＣＳＦ・ＤＮＡが
宿主内で非天然ＧＭ−ＣＳＦ蛋白として発現されるよう
に上記プロモータと共に配向されている。）を含む発現
ベクターによって形質転換された宿主器官を培養するこ
とから成る顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子
（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ＤＮＡ配列、組
換え体ＤＮＡ分子および特定の血液細胞の産生を制御す
る蛋白分子の特異性をもつ蛋白群またはポリペプタイド
群の製法に関するものである。さらに具体的には、この
発明は顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ）として知られている蛋白分子に関する遺伝
暗号を指定するか、あるいは遺伝暗号を指定するフラグ
メントを包含することを特徴とするＤＮＡ配列および組
換えＤＮＡ分子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】赤血球（赤色血液細胞）、顆粒球、マク
ロファージおよびリンパ球などのような血液細胞の産生
は、骨髄中の多能性前駆体または幹細胞を刺激する一組
の蛋白分子の制御下に行われる。造血過程において、こ
れらの多能性細胞は、始動前駆細胞、コロニー形成細胞
または個々の血液細胞に対するＣＦＣ群等の様々の名で
呼ばれる限定された分化能を有する細胞を形成する。フ
ュング、エム．シー．等著、ネイチャー３０７巻、２３
３−２３７頁（１９８４年）およびヨコタ、ティ等著、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（アメリカ）８１巻、１０７０−１０７
４頁（１９８４年）に記載のいわゆるマルチーＣＳＦ
（インターロイキン３）の様な前駆体幹細胞またはＣＦ
Ｃ群の非特異的刺激因子も存在し得るが、一方では個々
の異種細胞系に対する特異的調節遺伝子が存在する。特
に、それぞれのＣＦＣ群からの顆粒球およびマクロファ
ージの産生は、ブルゲル、エイ．ダブル．等著、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー ２５２
巻、１９９８−２００３頁（１９７７年）に記載の顆粒
球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）、スタンレイ、イー．アール．およびハード、ピ
ー．エム．著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー ２５２巻、４３０５−４３１２頁（１９７
７年）に記載の顆粒球コロニー刺激因子およびニコラ、
エヌ．エイ．著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー ２５８巻、９０１７−９０２１頁（１９
８３年）に記載のマクロファージ・コロニー刺激因子
（Ｍ−ＣＳＦ）の様な糖蛋白の制御下で行われる。これ
らの糖蛋白は体内での発生量が少ないにもかかわらず、
一部分のアミノ酸配列分析および生物的特徴づけのため
に少量のねずみＧＭ−ＣＳＦを精製することが可能であ
った。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの蛋白
の代替源を発見できるまでは、このような少量では臨床
的応用には不十分である。しかしながら、もしこれらの
コロニー刺激因子が化学的にまたは生合成的に産生でき
れば、これらの因子を使用することによって生体内の血
液細胞産生を向上し、実験室において輸血用の血液細胞
を産生し、白血病細胞が熟成するのを促進することが可
能になるであろう。これら各々の応用について、血液細
胞の型が制限されるのは避けられない。特に、リンパ球
および／またはそれらの前駆体を産生または活性化する
のを制限することは重要である。従ってマルチ−ＣＳＦ
の様な分子が、血液細胞産生の一般的増大を要するある
種の疾患に応用できると同時に、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ
ＳＦおよびＭ−ＣＳＦの様な糖蛋白の用途も、これらの
糖蛋白が一次感染に対抗しまたは破壊された組織を除去
するために必要な細胞の産生のみを刺激するという理由
で特に重要である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この発明は、宿主内で作
用するプロモーターフラグメントとＧＭ−ＣＳＦの遺伝
暗号を指定するＤＮＡ断片を含み、ＤＮＡ断片はＣＭ−
ＣＳＦ・ＤＮＡが宿主内で非天然ＧＭ−ＣＳＦ蛋白とし
て発現されるようにプロモーターと共に配向されている
発現ベクターによって形質転換された宿主器官を培養す
ることから成る顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生方法を提供する。またこの
発明は刺激に効果的な量の顆粒球・マクロファージ刺激
因子を上記顆粒球およびマクロファージの各々の前駆細
胞と接触させることから成る顆粒球およびマクロファー
ジの産生を刺激する方法を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】この発明は、特異的血液細胞調節
遺伝子である顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因
子（ＧＭ−ＣＳＦ）を産生するための組換え体ＤＮＡ分
子の産生および特徴づけに関するものである。特にこの
発明は、細菌および動物細胞のような代替宿主中におけ
るＧＭ−ＣＳＦ産生に基礎を与える点で特に重要である
ことを示し得るねずみＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指定す
るＤＮＡ分子の産生を包含する。例として、この発明の
ＤＮＡ分子は、ヒトの顆粒球およびマクロファージの産
生に使用するための等価ヒトＧＭ−ＣＳＦに対する遺伝
子配列を単離するプローブとして使用できる。
【０００６】一つの実施態様において、この発明は少な
くともその一部が、ねずみＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性
を示している蛋白またはポリペプチドの遺伝暗号を指定
することを特徴としたＤＮＡ配列を提供する。この発明
に係る特異的なヌクレオチド配列を第２（ｂ）図に示
す。この発明を実施する上で有用なヌクレオチド配列を
宿すクローンは以下に示すクローン化法によって得られ
る。
【０００７】［ねずみＧＭ−ＣＳＦのcＤＮＡのクロー
ンの単離］最良のＧＭ−ＣＳＦ供給源の一つは、刺激さ
れたはつかねずみの肺である。エンドトキシンで処理し
たはつかねずみ由来の肺のmＲＮＡに対する１０5個より
大きいcＤＮＡの相補的クローンのライブラリーは実施
例Ｉで詳細に述べる。
【０００８】組換え体を含むＧＭ−ＣＳＦは、蛋白の一
部のアミノ酸配列から予測される、ＧＭ−ＣＳＦのmＲ
ＮＡ配列の内２つの部分に相補的な、短い合成オリゴヌ
クレオチドをプローブとして使用するこのライブラリー
で同定された。図１は、残基７と１６の間のＧＭ−ＣＳ
Ｆアミノ酸配列、このペプチドを暗号化することのでき
るヌクレオチド配列の可能な組合せ、およびハイブリダ
イゼイション・プローブとして使用されたオリゴヌクレ
オチドの領域を示している。アミノ酸残基９の指定がは
っきりしない（ヒスチジンまたはシステインのいずれ
か）ので、この領域を包含する異なった２組のオリゴヌ
クレオチドが生成される。９の位置にプローブ１はヒス
チジン残基を採り、プローブ２はシステインを採る。ア
ミノ酸配列をその中に伴う第２の領域は、４８の部分か
らなる変性した２組として合成される、極端に変性した
１組のオリゴヌクレオチドを必要とする（プローブ３お
よび４）。
【０００９】ＧＭ−ＣＳＦ組換え体を同定するために、
コロニー・ハイブリダイゼイション・アッセイを行っ
た。寒天平板上でcＤＮＡクローン群のライブラリーを
単一コロニー群として生育させ、コロニー群の複製を、
ニトロセルロース・フィルターに移植し、そこでコロニ
ーを溶解しプラスミドＤＮＡをその場所で固定する。こ
れらのフィルターを32Ｐで標識した総ての合成オリゴヌ
クレオチド・プローブの混合物でハイブリダイゼイショ
ンすることによってスクリーニングする。
【００１０】ハイブリダイゼイション後フィルターを洗
浄しプローブでハイブリダイズされたコロニー群をオー
トラジオグラフィーで同定する。この方法を用いて、プ
ローブの混合物でハイブリダイズした２２の独立組換え
体を同定する。これらの内のいくつかはオリゴヌクレオ
チドの内の１つと偶然相同である不適当な配列を発現さ
せ得るが、真生のＧＭ−ＣＳＦ配列がプローブ３／４と
１もしくは２の両者とハイブリダイズしなければならな
いので、不適当な配列が独立に２つの異なったプローブ
とハイブリダイズすることは起りそうにない。それで両
方の２２クローン由来のプラスミドＤＮＡを単離し、３
枚のアガロースゲルで電気泳動させた。ＤＮＡをサザン
法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー９
８巻、５０３頁（１９７５年）によってニトロセルロー
スに移植し、３枚のフィルターを３つの異なったプロー
ブを独立に用いて、ハイブリダイズする。実験した２２
のクローンの内２つ（クローン３７および３８）をプロ
ーブ１と３／４の両方でハイブリダイズし、それからＧ
Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡと成るための強力な候補を現した。
【００１１】［クローンの同一性の確認］２つの実験系
はクローン３７および３８が実際にＧＭ−ＣＳＦ遺伝子
配列に関与していることを示している。最初に、クロー
ン群のヌクレオチド配列を決定し、遺伝暗号の指定され
たアミノ酸配列と共に第２（ｂ）図に示した。クローン
のヌクレオチド配列によって予測されるアミノ酸配列は
蛋白を分析して決定したＮ末端アミノ酸配列と実質的に
一致する。ただし、比較した２９の位置の内両者の食い
違いがたった４つだけある。食い違いの内２つは、蛋白
配列に仮に指定されただけの位置に起る。さらに、クロ
ーンのヌクレオチド配列は、ＧＭ−ＣＳＦ蛋白に対して
予期されるのと極めて近い分子量（１３，５００ダルト
ン）をもつペプチドを予告する。
【００１２】二番目に、クローン３８は生物学的に活性
なＧＭ−ＣＳＦのmＲＮＡを特異的に選択できる。クロ
ーン３８のＤＮＡ（および親のプラスミドpＪＬ３由来
のＤＮＡ）をニトロセルロース上に固定し、細胞をcon
Ａで刺激した後、はつかねずみの肺およびＧＭ−ＣＳＦ
および関連（但し別個の）調節因子ＩＬ３を造るＴセル
ラインからのＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダ
イゼイション後、フィルターを洗浄しハイブリダイズさ
れていないＲＮＡを取り除き、その後特異的にハイブリ
ダイズしたＲＮＡを溶出する。このＲＮＡをつめがえる
の卵母細胞に注射し（外来のmＲＮＡを置換する能力が
よく記録されている）、その培養基のＧＭ−ＣＳＦおよ
びＩＬ３の存在を３−５日後測定する。数回の実験結果
は、（ａ）ベクターＤＮＡはそれ一つではＧＭ−ＣＳＦ
のmＲＮＡを選択しないし、（ｂ）クローン３８のＤＮ
Ａは肺のＲＮＡからとＬＢ３からの両方から由来のＧＭ
−ＣＳＦを選択し、および（ｃ）クローン３８は特異性
を内部制御するＬＢ３のＲＮＡ由来のＩＬ３のmＲＮＡ
を選択しないということを示している（実施例IIを参
照）。
【００１３】３番目の実験は、クローン３８を同定する
ための強力で付加的な支持を提供する。ノーザン・ブロ
ッティング法でハイブリダイゼイション・プローブとし
て使用されると、クローン３８は、ＧＭ−ＣＳＦを合成
しないリンパ細胞のある骨髄の範囲でなく、conＡで刺
激されないＬＢ３細胞由来のＲＮＡ中でもなくて、ＧＭ
−ＣＳＦを合成する細胞（はつかねずみの肺およびcon
Ａで刺激したＬＢ３）から由来するＲＮＡ中にある長さ
約１．２kbのmＲＮＡ種を検出する。従って、ＬＢ３の
場合にはクローン３８に対応するmＲＮＡがＧＭ−ＣＳ
Ｆ蛋白と共に誘導できる（実施例III参照）。
【００１４】［この発明を実施するのに有用な株の寄
託］以下に記載する株の生物学的に純粋な培養物の寄託
は、１９８５年２月２１日付でアメリカ合衆国メリーラ
ンド、ロックビル、パークローン・ドライブ １２３０
１番のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に行った。生存試験後指示された取得番号が与えられ、
必要な料金を支払った。上述の培養の入手は、本特許出
願が係属中、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５
Ｖ．Ｓ．Ｃ．§１２２の下に長官によって決められた方
法で入手可能である。公衆に対する上述の培養の入手の
可能性における全ての制限は本出願の特許後に不可逆的
に取り除かれる。そして、上述の培養は、備え付けの標
本を最も最近に請求してから少なくとも５年間、または
いかなる場合にも寄託の日から少なくとも３０年の終り
まで不変的に入手可能にしてある。もしその培養が生存
不可能になったり不注意にもそこなわれた場合には、同
じ分類学的内容の生存可能な培養（Ｓ）で置き換える。
【００１５】［pＧＭ３７およびpＧＭ３８の有用性］ね
ずみＧＭ−ＣＳＦのクローン化可能な遺伝子情報源を提
供することに加えて、ここに記載するハイブリッドＤＮ
Ａ分子も、他の哺乳類のＤＮＡライブラリーから関連遺
伝子配列を検出または分離するためのプローブとして有
用である。関連遺伝子配列を検出する用途では、このプ
ローブは分析的に検出可能な試薬で適当に標識される。
しかしながら、本発明は標識するいかなる特定手段によ
っても限定されるべきでない。実施例は、検出のため放
射線標識を使うが、他の検出法は当業者に公知であり簡
単に代用してもよい。代替系としては、ビオナン・アビ
ジン、蛍光染料、蛋白、誘導したプローブ分子に対する
抗体が使用されるかまたはＤＮＡ・ＤＮＡハイブリッド
自体に対する抗体が使われるＥＬＩＳＡのような免疫学
的アッセイ、およびその中で一本鎖のＤＮＡか酵素の不
活性サブユニットで標識され、およびプローブが、ハイ
ブリダイゼイションにおいてサブユニットが再結合し酵
素活性が復活するように第２の不活性サブユニットで標
識されるアッセイが含まれるが、これらに限定されるも
のではない。
【００１６】クローン化した配列は発現ベクター中へサ
ブクローン化されてもよい。遺伝子配列が一部の配列を
欠失しているかもしれない場合にはそのような配列を化
学的に合成し、クローン化した配列と連結して発現ベク
ター中に導入できる。適切な発現ベクターの選択は、こ
の分野の技術者の技術の範囲内にある。最小限として、
この発現ベクターが形質転換される宿主内で作用するプ
ロモータ・フラグメントと適当なエンドヌクレアーゼ開
裂部位をＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指定する遺伝子配列
が結合できるように含んでいる。
【００１７】
【実施例】
［実施例Ｉ］この実施例は、この発明を実施するのに有
益なＧＭ−ＣＳＦのcＤＮＡクローン群の単離を示す。
【００１８】［はつかねずみの肺のmＲＮＡの単離］Ｃ
５７ ＢＬ／６はつかねずみ９０匹に細菌性内毒素（５
μｇ／一匹）を注射する。３時間後、肺を摘出し、血清
非含有ダルベック改良イーグル培地（セリダン・ジェ
イ．およびディ．メカルフ著、ジャーナル・オブ・セル
ラル・フィジオロジー ８１巻、１１−２４頁（１９７
３年））中で試験管内でインキュベイトする。０．５お
よび１５時間後、一群３０組の肺を６０秒間、１モル
トリス（ｐＨ７．５）、１モル ＮａＣｌ、１モルＥＤ
ＴＡ、０．５％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌプロティナー
ゼ Ｋを含む１５０ｍｌ溶液中でホモジナイズする。３
７℃で１時間インキュベイトした後、ホモジナイズ液を
７モル 尿素、０．３５モル ＮａＣｌ、１０ミリモル
ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳおよび１０ミリモル トリス−Ｃ
ｌ（ｐＨ７．４）を含む同量溶液と混合し、その後フェ
ノール／クロロフォル ム／イソアミルアルコールで抽
出する。エタノールを加えて水相からＲＮＡを沈降させ
る。２段階のオリゴーｄＴセルロース・クロマトグラフ
ィによって全ＲＮＡからポリＡ+のＲＮＡを選択する。
別に３回試験管中で培養して産生したＲＮＡを保存す
る。
【００１９】［cＤＮＡクローン群の合成および構造］
標準の技術［エブストラティダス、エイ等著、セル ７
巻、２７９−２８８頁（１９７６年）およびマニアティ
ス、ティ等著、「モレキュラル・クローニング」（コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボ刊、ニューヨーク
（１９８２年））］を用い、第一鎖を合成するためのに
わとり骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素および第二鎖を合
成するためのエッシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（クレノー・フラグメント）を用いて、保存した肺の
mＲＮＡの二重鎖コピーを合成する。Ｓ1ヌクレアーゼで
ヘアピンループを開裂した後、ターミナルジオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼ（ミッチェルソン、エ
イ．エムおよびエヌ．オーキン・ジェイ．著、バイオロ
ジカル・ケミストリー ２５７巻、１４７７３−１４７
８２頁（１９８２年））を用いて、オリゴ（ｄＣ）末端
を付加する。連結したcＤＮＡを１．５％アガロース上
で電気泳動して分画し、長さが５００塩基以上の長い分
子を採取し、ｄＧ連結ＤＮＡプラスミドにアニール化す
る。用いたプラスミド（pＪＬ３）は、β−ラクタマー
ゼ遺伝子、pＡＴ１５３由来のＤＮＡ複製の起点、ＤＮ
Ａ複製およびＴ抗原暗号を指定する配列ＳＶ４０起点お
よびＳＶ４０の後期プロモータに隣接する複合クローニ
ング部位を含むＳＶ４０に基づく発現ベクターである
（図３参照）。ＤＮＡベクター１μｇ当り１０8転換体
を得るかなり効果的な形質転換によってエッシェリヒア
・コリ（Ｅ．coli）ＭＣ１０６１（カサダボン、エムお
よびエス．コーエン著、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー １３８巻、１７９−２０７頁（１９
８０年））をアニール化cＤＮＡプラスミド混合物で形
質転換する。約２，０００−３，０００のアンピシリン
耐性クローンを包含する４６の独立プールを−７０℃で
１０％グリセロール中に保存する。
【００２０】［cＤＮＡクローンのスクリーニング］コ
ロニー・ハイブリダイゼイションによってスクリーニン
グするため、各プールから約４，０００個の細菌コロニ
ーを寒天平板（４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）上
に形成し、これをニトロセルロースフィルターディスク
に移し、プラスミドＤＮＡを２００μｇ／ｍｌ クロラ
ムフェニコール（ハナハン、ディ・およびエム．メセル
ソン著、ジーン １０巻、６３−６７頁（１９８０
年））を含む寒天平板上でフィルターをインキュベイト
して増殖する。元の平板でコロニーを再生した後、第２
のニトロセルロースフィルターを造る。マスタープレー
トを２回再生した後、４℃で保存する。プラスミドＤＮ
Ａを細菌コロニーから溶離し、ニトロセルロースフィル
ターに固定する（ニコラ・エヌ．およびディ．メカルフ
著、ジャーナル・オブ・セルラル・フィジオロジー １
１２巻、２５７−２６４頁（１９８２年））。ハイブリ
ダイゼイションする前に、そのフィルターを数時間、３
７℃で、６×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５モルＮａＣｌ、
０．０１５モルクエン酸ナトリウム）、０．２％フィコ
ール、０．２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および
変性さけ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）と変性エッシェ
リヒア・コリＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）を含む０．２％
うし血清アルブミン（ＢＳＡ）中でインキュベイトす
る。０．１％ＮＰ４０を含む上記と同様の溶液で、３７
℃で約１８時間ハイブリダイゼイションする。［γ−32
Ｐ］ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて、
上記合成オリゴヌクレオチドプローブを放射性標識す
る。各々は１．５ｎｍ／ｍｌでハイブリダイゼイション
反応物中に存在する。ハイブリダイゼイション後、フィ
ルターを６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用い４２℃
で隅々まで洗浄しオートラジオグラフに付す。複製フィ
ルター上の完全なコロニーを取り、前と同様にして密度
を下げて再スクリーニングする。
【００２１】１００，０００以下のcＤＮＡクローンを
スクリーニングし、２２の陽性物を得、そのうち２つ
（pＧＭ３７およびpＧＭ３８）をプローブ１およびプロ
ーブ３＋４と別々にハイブリダイズし、したがってＧＭ
−ＣＳＦ暗号化配列を含むための有力候補となった。
【００２２】［実施例II］この実施例はＧＭ−ＣＳＦの
合成を指令する力のあるmＲＮＡを選択するpＧＭ３８の
能力を立証する。
【００２３】［ＧＭ−ＣＳＦの検定］ＧＭ−ＣＳＦ m
ＲＮＡをつめかえる卵母細胞中で同定し、この培養基が
３種のミクロ培養系、（１）４種全てのコロニー・刺激
因子に直接応答する精製胎児肝臓造血前駆細胞を含む液
体培地（ブルゲス、エイ．ダブル．等著、ブラッド６０
巻、１２１９−２３頁（１９８２年））、（２）４種全
ての刺激因子によって刺激されうる形態学的に同一とみ
なし得る顆粒球、マクロファージ・コロニーを形成する
骨髄細胞を含むミクロ寒天培地および（３）複合ＣＳＦ
に応答しＧＭ−ＣＳＦには応答しない因子従属マストセ
ルライン３２Ｄ Ｃ１３を含む液体培地での顆粒球／マ
クロファージ増殖を刺激する能力を検定する。この組の
検定から見て、ＣＭ−ＣＳＦおよび複合ＣＳＦは疑いな
しに識別できる。
【００２４】［種々の細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ mＲ
ＮＡの検出］初めに、種々の細胞型においてpＧＭ３８
に関連する転写の発生量がＧＭ−ＣＳＦを合成するそれ
らの細胞の能力と平行して表れるかどうかを決める。は
つかねずみの肺（ＧＭ−ＣＳＦを合成する）からとＧＭ
−ＣＳＦを生成しない種々の細胞から由来するメッセン
ジャーＲＮＡ mＲＮＡをホルムアルデヒド寒天ゲル上
で分画し、ニトロセルロースに移し、上に詳説したpＧ
Ｍ３８から誘導したプローブでハイブリダイゼイション
する。図４はこのプローブが、はつかねずみの肺由来の
mＲＮＡ上に約１．２キロ塩基（kb）という低い発生量
を検出したこ とを示している（レーン３）が、ＧＭ−
ＣＳＤを合成しない任意に選択した数種の細胞系由来の
mＲＮＡには胸腺腫由来の細胞系であるティカウト（Ｔ
ＩＫＡＵＴ）（レーン１）およびプラズマ細胞腫（レー
ン２）では検出しないことを示している。さらにこのプ
ローブを行なって、複合ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−
ＣＳＦをそれぞれ合成するＷＥＨ１−３Ｂ Ｄ-（レー
ン６）、ＲＩＩＩ（レーン７）およびＬ細胞（レーン
８）由来のmＲＮＡに転写していることを検出しなかっ
た。肺の mＲＮＡにpＧＭ３８に関連する転写の発生が
かなり低いのは意外なもので、肺のcＤＮＡライブラリ
ーのpＧＭ３８関連cＤＮＡクローンでまれにしか見られ
ないものである（５０，０００中１以内）。
【００２５】pＧＭ８３に対して相補的な転写がＧＭ−
ＣＳＦ産生に関連しているかどうかについてのさらに重
要な試験として、ＧＭ−ＣＳＦおよび複合ＣＳＦの両方
の合成がコンカナバリンＡによってその中で誘発される
クローン化したＴリンパ球セルライン（ＬＢ３）を用い
た。図４は、pＧＭ３８追跡プローブはコンカナバリン
Ａで刺激されたＬＢ３細胞中に豊富にmＲＮＡを検出す
る（レーン５）が非刺激のＬＢ３細胞由来のmＲＮＡで
は転写を検出しないことを示している（レーン４）。用
いたプローブが、ＷＥＨ１−３Ｂ Ｄ-1中の複合ＣＳＦ
mＲＮＡにハイブリダイゼイションしていないので、
このことはpＧＭ３８がＬＢ３細胞中ＧＭ−ＣＳＦ mＲ
ＮＡにハイブリダイゼイションしたことのいっそうの証
拠になる。
【００２６】種々の細胞中のＧＭ−ＣＳＦ mＲＮＡの
検出は以下のように行なわれる。ＴＩＫＡＵＴ（レーン
１）、Ｐ３（レーン２）、はつかねずみの肺（レーン
３）、非刺激ＬＢ３（レーン４）、コンカナバリンＡ刺
激ＬＢ３（レーン５）、ＷＥＨ１３Ｂ Ｄ-1（レーン
６）、ＲＩＩＩ（レーン７）およびＬ細胞（レーン８）
由来のポリ（Ａ）５μｇをそれぞれ１％ホルムアルデヒ
ド／寒天ゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移
し、ニック・トランスレーション（nick-translation）
法（リグビー、ピー．ダブル．ジェイ．等著、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー １１３巻、２
３７−２５１頁（１９７７年））によって、３２Ｐ標識
されたｐＧＭ３８の完全挿入をスパンするＤＮＡフラグ
メントと、ハイブリダイゼイションする。６５℃で１６
時間、２xＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２％フィコー
ル、０．２％ＰＶＰおよび変性さけ精子のＤＮＡ５０μ
ｇ／ｍｌを含む０．２％ＢＳＡ中でハイブリダイゼイシ
ョンする。ＬＢ３（以前はＢ３）は、白血球培養を混合
したＢＡＬＢ／Ｃ抗ＤＢＡ／２から誘導し、インターロ
イキン−２の存在下で被照射ＤＢＡ／２脾臓細胞（１５
００Ｒ）と一週間継代で維持されたクローン化Ｔhy−１
+、Ｌyt−２-、ＭＴ4 + ＋リンパ球である。コンカナバ
リンＡ刺激ＬＢ３細胞は、５％子うし胎児の血清を含ん
だ組織培養基中で、５時間、コンカナバリンＡ５μｇ／
ｍｌと共に、１ｍｌ中に１０6の割で細胞を培養するこ
とによって産生する。分子量マーカーを用いると、推定
分子量は、哺乳類２８および１８５のrＲＮＡは、４７
００および１８００ヌクレオチド、エッシェリヒア・コ
リ２３および１６ＳのrＲＮＡは、２９０４および１５
４１ヌクレオチドである。長時間オートラジオグラフィ
にかけた後では、残りの２８ＳrＲＮＡに低水準のハイ
ブリダイゼイションしているのが明らかである（トラッ
ク１−３）。
【００２７】［ＧＭ−ＣＳＦ mＲＮＡのハイブリッド
選択およびつめがえるの卵母細胞中への移殖］ハイブリ
ッド選択は、基本的にミラー、ジェイ．エス．等著、
（メソッド・オブ・エンチモロジー １０１巻、６５０
−６７４頁（１９８３年））に記載のように形成され
た。pＧＭ３８またはベクター（pＪＬ３）ＤＮＡ（５−
μｇ部分標本）をニトロセルロースの小さな四角い片上
に付けて、コンカナバリンＡ刺激ＬＢ３（５０％ホルム
アミド中）のmＲＮＡの一部１−２μｇ、０．５モルト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．７５モルＮａＣｌ、
０．００２モルＥＤＴＡ、０．４％ ＳＤＳおよび１０
μｇ／ｍｌエッシェリヒア・コリのtＲＮＡと共に、反
応容量３０μｌ、３７℃で１６時間培養する。培養後、
濾紙をハイブリダイゼイション用緩衝液中、３７℃で念
入りに洗浄し、その後５２℃で１０ミリモルトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）および２ミリモルＥＤＴＡを用いて
洗浄する。結合したＲＮＡをエッシェリヒア・コリのt
ＲＮＡ１．５μｇを含む１０ミリモルトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）および２ミリモルＥＤＴＡ３００μｌ中
で１分間煮沸して溶出する。酢酸ナトリウムおよびエタ
ノールを加えてＲＮＡを沈殿させ、１６時間、−２０℃
で冷やす。遠心分離後、沈降したＲＮＡを冷７０％エタ
ノールで洗浄し、乾燥後、１ミリモルトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）および０．１ミリモルＥＤＴＡ １．５
μｌに溶かす。各々のＲＮＡ標品に対して、つめがえる
卵母細胞３０個ごとの集団に一卵当りＲＮＡ５０ｎｌの
割合で注射する。非分画ＬＢ３のｍＲＮＡは一投与につ
き１μｇ／ｍｌであり、一卵当り５０ｎｌ注射した。注
射した卵母細胞を４日間培養した後、卵母細胞培養基を
５％子うし胎児の血清を含む培養基で１：２に希釈し、
濾過し、５μｌ容量を、１４日ＣＢＡ胎仔肝臓前駆細胞
分画蛍光活性化細胞ソーター２００を含む１５μｌ培養
中で系列希釈して２００・３２ＤＣ１３細胞についてア
ッセイした。図５の各点はインキュベーション２日後の
２培養からの平均細胞カウントを示す。
【００２８】初めに、pＧＭ３８のＤＮＡがはつかねず
みの肺のＲＮＡからＧＭ−ＣＳＦ mＲＮＡを選択でき
るかどうかを決定するために試験した。非分画の肺のm
ＲＮＡまたはpＧＭ３８のＤＮＡとハイブリダイズして
選別したmＲＮＡをつめがえるの卵母細胞の中に注射す
ると、きわめて低いレベルのＣＳＦ活性が培養基中に検
出されるが、この知見は、はつかねずみの肺にあるpＧ
Ｍ３８に対応しているmＲＮＡが極めて少ないことから
予測されたものである（図４）。対照的に、コンカナバ
リンＡで刺激したＬＢ３細胞群（ＧＭ−ＣＳＦおよび複
合ＣＳＦの両方を合成する）由来のmＲＮＡはpＧＭ３８
に対応するmＲＮＡに富んでおり（図４）、つめがえる
の卵母細胞の中に注射したとき、胎児肝臓および３２Ｄ
Ｃ１３細胞の増殖を刺激する物質で高濃度に生成する
よう再指示する（図５）。それで、pＧＭ３８またはベ
クターＤＮＡ群のいずれかを含んだ３枚の濾紙を上述と
同様のハイブリッド選択実験によって、コンカナバリン
Ａ刺激ＬＢ３のmＲＮＡを作用させた。図５は、pＧＭ３
８のＤＮＡによって選択したmＲＮＡを用いて注射した
卵母細胞由来の培養基が胎児前駆細胞の増殖を強力に刺
激し、成熟途中の顆粒球とマクロファージの成長を刺激
したこと（図６）を示している。これらのつめがえる調
製培養基も微量寒天培養（１８％顆類球、５３％顆粒球
・マクロファージ混合物および２９％マクロファージの
コロニー）で典型的な顆粒球・マクロファージ・コロニ
ー形成を刺激する。他のどんな検出においても、これら
の卵母細胞調製培養基が赤血球細胞、巨大核細胞または
好酸性細胞の増殖を刺激し、したがって活性因子が複合
ＣＳＦではなくＧＭ−ＣＳＦであるという証拠はなかっ
た。この結論の確認として、これらの卵母細胞調製培養
基が３２Ｄ Ｃ１３細胞の増殖を刺激することができな
いということが分かった。ベクターＤＮＡだけではＧＭ
−ＣＳＦまたは複合ＣＳＦに対応するmＲＮＡを選択し
ない（図５のａ，ｂ）。以上のことを合せると、これら
のデータは、pＧＭ３８が、ＧＭ−ＣＳＦおよび複合Ｃ
ＳＦのmＲＮＡ群をどちらも含む混合物からＧＭ−ＣＳ
Ｆの独特の生物学的特徴を持つ因子の暗号配列を指令す
るmＲＮＡを特異的に選択できることを示している。
【００２９】［実施例III］この実施例はＧＭ−ＣＳＦ
遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。pＧＭ３７およ
びpＧＭ３８のcＤＮＡ部についてのヌクレオチド配列分
析は、同じmＲＮＡの重複部分に相補的な配列を含んで
いるこれら２つのクローンが推定ＧＭ−ＣＳＦのmＲＮ
Ａ配列を有していることを示している。この２つのクロ
ーンのcＤＮＡ部とmＲＮＡの関係を図２（ａ）に示す。
図２（ｂ）に与えられたヌクレオチド配列は両方のクロ
ーンから誘導した複合物である。mＲＮＡのポリ（Ａ）
末端に対応しており、ヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡ
（ほとんどの真核生物のmＲＮＡの３′末端の近くで見
られる）より前に置かれる２０アデノシン残基の区間が
pＧＭ３８の一方の末端に現れる。これはcＤＮＡクロー
ンの配列とmＲＮＡの配列の配向を可能にする。図２
（ｂ）に表した配列は一本の３５４ヌクレオチドの長い
オープン・リーディング・フレームを含む。そしてこの
領域によって予告されたアミノ酸配列は成熟蛋白の最初
の残基から発現し、ヌクレオチド配列の上方に示す。残
基２から２９まではアミノ酸配列が、cＤＮＡによって
予告された上記配列を示すＧＭ−ＣＳＦに対する部分的
なＮＨ2末端アミノ酸配列と一致する（ただし４つの残
基については一致しない。）４つの食い違いのうち２つ
の残基（２０および２４）は蛋白の配列においてただ仮
に指定されただけである。蛋白配列内で位置を決定でき
ない成熟ペプチド上の最初の残基は、ヌクレオチド配列
によってイソロイシンと予測される。ヌクレオチド配列
から導き出された一次構造の蛋白は、分子量１３，５０
０、エンドグリコシダーゼＦで広範囲に脱グリコシル化
したＧＭ−ＣＳＦの見かけの分子量１６，８００とよく
一致する。予告されたアミノ酸配列の内で起こるＮ−グ
リコシル化の２つの強い部位（Ａsn−Ｘ−Ｔhr）を図２
（ｂ）に星印で示す。
【００３０】pＧＭ３７は図２（ｂ）に示される最初の
位置まで２０のヌクレオチド５′を伸ばすが、開始コド
ンを含まない。このコドンは数種の疎水性アミノ酸をこ
の範囲内に含み（図示しない）、分泌された蛋白のシグ
ナル・ペプチドの特徴を示さない。ＧＭ−ＣＳＦのmＲ
ＮＡの大きさは１，２００ヌクレオチド以内であり（図
４）、その内の１５０ヌクレオチド以内のものはたぶん
ポリ（Ａ）末端の寄与による。３′非移殖領域は３１９
ヌクレオチドで成熟蛋白の暗号を指令する領域は３５４
ヌクレオチドである。（図２（ｂ））。それで約３５０
のヌクレオチドが、推定されるＮＨ2 - 末端シグナル・
ペプチドのために５′側の翻訳されない領域を残した。
２つのcＤＮＡクローン（位置、２３７、３４６および
５０７）から導びかれたヌクレオチド配列には３箇所食
い違うところがある。その内の１つ（位置 ３４６）は
アミノ酸配列のあいまいさによるものである（１１６番
目のアミノ酸残基にＧlyまたはＳer）。cＤＮＡクロー
ンが単離されたはつかねずみ（Ｃ５７ＢＬ／６）は高度
に同系交配しているのでそのためＧＭ−ＣＳＦの座では
ホモ接合になるはずである。また、はつかねずみの生殖
細胞系上のＧＭ−ＣＳＦの暗号を指令するのは唯一の遺
伝子であるらしいので、これら３つの配列の食い違いは
cＤＮＡ合成の間に造られた人為構造を反映しているよ
うだ。そして実際には逆転写は６００ヌクレオチド中に
約１個の合成ポリヌクレオチド誤謬頻度である。
【００３１】図２に現わした配列を決定するのには標準
の方法を使用した。簡単に述べると、Ｍ１３ベクター中
でサブクローン化したＤＮＡフラグメントをジデオキサ
・ヌクレオシドトリスフォスフェイトを使用するチェー
ン・ターミネイション法によって配列した（サンガー、
エフ．等著、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（アメリカ）７４巻、５４
６３−６７頁（１９７７年））。配列した反応物は、厚
さ０．２ｍｍにした８％（重量比）ポリアクリルアミド
ゲル上で温度を調節して電気泳動にかける。図２に関し
て上で述べたようにmＲＮＡに同調する鎖のストランド
は上で得たＧＭ−ＣＳＦの予測されるアミノ酸配列をも
ち、５′から３′まで列挙される。列の一番終りにある
数は、その列での最終残基（アミノ酸またはヌクレオチ
ド）の位置を示す。ＧＭ−ＣＳＦを決定する部分的なア
ミノ酸配列はクローンから導いた配列の上に示してあ
る。二者の間に食い違いのない位置には「棒線」を付け
た。蛋白分析によって決定した最初のアミノ最初残基は
同定できず疑問符で示す。強いＮ−グリコシル化部位は
星印で示し、推定されるポリアデニル化シグナルは下線
で示してある。
【００３２】［実施例IV］この実施例はＧＭ−ＣＳＦが
１個の特定の遺伝子によって暗号を指定されることを示
す。種々のはつかねずみの器官から単離したＧＭ−ＣＳ
Ｆの多分子形態が知られているので、どれだけの数の遺
伝子を成熟ゲノム中でＧＭ−ＣＳＦのcＤＮＡが検出で
きるかを試験した。種々の制限エンドヌクレアーゼによ
って消化されたＢＡＬＢ／ｃの胚またはＣ５７ＢＬ／６
の肝のＤＮＡをアガロースゲルで分画し、ニトロセルロ
ースに移してから、pＧＭ３８に完全cＤＮＡ挿入を含ん
だフラグメントとハイブリダイズする。両方のはつかね
ずみの系統には、単一ＥcoＲＩフラグメント（図７、第
１および第２レーン）、単一ＰstＩフラグメント（第３
および第４レーン）および単一ＢamＨＩフラグメント
（図示しない）が検出される。ＰstＩフラグメントは、
僅か２．５kbの長さしかないので、このフラグメントは
一つより多い遺伝子に適応しそうにない。それで、２個
（またはそれ以上）の遺伝子を、同位置のＥcoＲＩ、Ｐ
stＩおよびＢamＨＩ制限部位で囲まれているという可能
性は低いから除いて、はつかねずみの生殖系において肺
型のＧＭ−ＣＳＦを暗号化しているのは唯一の遺伝子で
あると結論する。
【００３３】図７は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が胚のＤＮＡ
中と同様にコンカナバリンＡ刺激ＬＢ３細胞（レーン
６）由来のＤＮＡ中にも同じＥcoＲＩフラグメント中に
含まれていることを示している。ＬＢ３ＤＮＡ中に別の
バンドはなく、胚ＤＮＡと異なるハイブリダイゼイショ
ン強度もないので、大量のＧＭ−ＣＳＦを合成する細胞
中のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子脈中におけるコピー数変化また
は総体的変化はないと推論される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＧＭ−ＣＳＦクローンを同定するために
用いた合成オリゴヌクレオチドを示している。ねずみＧ
Ｍ−ＣＳＦ（残基７〜１６）のアミノ酸配列の一部が一
番上の段に、このペプチド断片の遺伝暗号を指定できる
ヌクレオチド（mＲＮＡ）配列の可能な組合せを中央
に、mＲＮＡの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチ
ドプローブの４つの異なる組を下に示す。
【図２】図２（ａ）は、ＧＭ−ＣＳＦのmＲＮＡの、お
よびpＧＭ３７とpＧＭ３８のクローンの、遺伝子地図で
ある。このmＲＮＡは鎖長１２００ヌクレオチドにな
る。成熟蛋白を暗号指令するmＲＮＡの領域を太い線で
示す。非翻訳領域はＵＴで表し、推定される前駆体ペプ
チドはＰで表す。pＧＭ３７クローンおよびpＧＭ３８ク
ローンを中に含む領域を棒線で示す。pＧＭ３８は図２
（ｂ）に表示された配列のヌクレオチド１４からポリＡ
末端まで延びており、一方pＧＭ３７はヌクレオチド配
列５′から位置５７４に表示された配列まで延びてい
る。図２（ｂ）は、ＧＭ−ＣＳＦのmＲＮＡのヌクレオ
チド配列およびＧＭ−ＣＳＦの内包されたアミノ酸配列
を示している。示されたヌクレオチド配列はpＧＭ３７
およびpＧＭ３８のクローンから由来する複合配列であ
る。そして、pＧＭ３７のヌクレオチド配列がpＧＭ３８
のヌクレオチド配列およびpＧＭ３７オルターナテイブ
と異なる３点が線の下に与えられている。mＲＮＡ−同
義ストランドは上で与えられたＧＭ−ＣＳＦアミノ酸配
列ともに５′から３′にリストされている。列の終端に
ある数字は、その列の最終残基（アミノ酸またはヌクレ
オチド）の位置を示す。ＧＭ−ＣＳＦについて決定した
部分のアミノ酸配列はクローン由来の配列上に示され
る。また、二者の間に一致しない所がない位置にダッシ
ュを付す。蛋白分析による最初のアミノ酸残基は同定で
きず、疑問符で示す。
【図３】図３は、pＪＬ３ベクターの地図を示してい
る。ＳＶ−４０由来の部分を斜線部分で示し、pＡＴ１
５３プラスミド由来の部分を白抜き部分で示す。複合ク
ローン化部位を上部に表示する。表わされた数字は親の
ＳＶ４０またはpＡＴ１５３の配列を示している。
【図４】図４は、pＧＭ由来の32Ｐで標識したＤＮＡを
用いてハイブリダイゼイションさせた種々の細胞中のＧ
Ｍ−ＣＳＦのmＲＮＡの検出を表示している。
【図５】図５は、胎児の肝臓の造血前駆細胞（上のプレ
ート）および複合−ＣＳＦ依存性３２Ｄ Ｃ１２細胞
（下のプレート）の培養懸濁液での細胞の増殖を、mＲ
ＮＡを注射したつめがえるの卵母細胞の培養基を用いて
刺激したものを表示する。非分画ＬＢ３のmＲＮＡは太
線で示され、pＧＭ３８のＤＮＡにハイブリダイゼイシ
ョンして選択したmＲＮＡは○−○で示され、ベクター
ＤＮＡのみによって 選択したものは○−○で示され
る。３つの異なる曲線は、３つの実験を現わしている。
【図６】図６は、ＬＢ３細胞由来のpＧＭ３８選択mＲＮ
Ａで注射した卵母細胞から得た培養基で刺激後の精製胎
児肝臓造血前駆細胞の４日培養懸濁液の写真である。分
裂活性および成熟中の顆粒球とマクロファージの産生が
注目される。
【図７】図７は、pＧＭ３８由来の32Ｐ標識ＤＮＡでハ
イブリダイゼイションしたＥcoＲ１またはＰstＩ消化Ｄ
ＮＡ由来のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を検出したものを表示す
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 グー・ニコラス・マーチン オーストラリア国・ビクトリア・ノース・ バルウィン・レインジ・ビュー・グロー ブ・20番 (72)発明者 メトカーフ・ドナルド オーストラリア国・ビクトリア・バルウィ ン・ユニオン・ロード・268番

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 宿主内で機能するプロモーターフラグメ
    ントと哺乳類のＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡセグメ
    ント（ただし、当該ＤＮＡセグメントはＧＭ−ＣＳＦ・
    ＤＮＡが宿主内で非天然ＧＭ−ＣＳＦ蛋白として発現さ
    れるように上記プロモータと共に配向されている。）を
    含む発現ベクターによって形質転換された宿主を培養す
    ることから成る哺乳類の顆粒球・マクロファージ・コロ
    ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生方法であって、 上記ＤＮＡセグメントが、天然源、合成源、または半合
    成源に由来し、 登録番号ＡＴＣＣ５３０３２で同定される微生物が保持
    している組換えプラスミドｐＧＭ３７のＤＮＡ挿入物で
    あって、５’から３’の方向に以下に示すＤＮＡ配列を
    有するＤＮＡ挿入物 ＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣ
    ＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴ
    ＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣ
    ＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧ
    ＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡ
    ＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧ
    ＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧ
    ＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣ
    ＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ
    ＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣ
    ＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴ
    ＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣ
    ＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡ
    ＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ
    （Ｇ）ＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡ（ただし上記配列中（）
    内の塩基は前の塩基と置換可能であることを示す）、 および登録番号ＡＴＣＣ５３０３６で同定される微生物
    が保持している組換えプラスミドｐＧＭ３８のＤＮＡ挿
    入物であって、５’から３’の方向に以下に示すＤＮＡ
    配列を有するＤＮＡ挿入物 ＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣ
    ＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴ
    ＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣ
    ＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧ
    ＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡ
    ＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧ
    ＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧ
    ＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣ
    ＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ
    ＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣ
    ＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴ
    ＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣ
    ＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡ
    ＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ
    （Ｇ）ＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧ
    ＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡ
    ＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧ
    ＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴ
    ＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡ
    ＧＣＣＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＣＣ
    ＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧＣＴＡ（Ｇ）ＡＣＴＣＡＧＣＴ
    ＴＧＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＡ
    ＴＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡ
    ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴ
    ＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡ
    ＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡ
    ＴＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴ
    ＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
    ＡＡＡ．（ただし上記配列中（）内の塩基は前の塩基と
    置換可能であることを示す）；および／または上記ＤＮ
    Ａ挿入物のうちの、一または複数の塩基が置換、欠失、
    挿入および／または逆転されているＤＮＡ配列であっ
    て、哺乳類の顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因
    子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードするＤＮＡ配列を含むこと
    を特徴とするＧＭ−ＣＳＦの産生方法。
  2. 【請求項２】 宿主内で機能するプロモーターフラグメ
    ントと哺乳類のＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡセグメ
    ント（ただし、当該ＤＮＡセグメントはＧＭ−ＣＳＦ・
    ＤＮＡが宿主内で非天然ＧＭ−ＣＳＦ蛋白として発現さ
    れるように上記プロモータと共に配向されている。）を
    含む発現ベクターによって形質転換された宿主を培養す
    ることから成る哺乳類の顆粒球・マクロファージ・コロ
    ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生方法であって、 上記ＤＮＡセグメントが、天然源、合成源、または半合
    成源に由来し、 登録番号ＡＴＣＣ５３０３２で同定される微生物が保持
    している組換えプラスミドｐＧＭ３７のＤＮＡ挿入物で
    あって、５’から３’の方向に以下に示すＤＮＡ配列を
    有するＤＮＡ挿入物 ＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣ
    ＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴ
    ＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣ
    ＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧ
    ＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡ
    ＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧ
    ＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧ
    ＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣ
    ＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ
    ＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣ
    ＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴ
    ＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣ
    ＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡ
    ＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ
    （Ｇ）ＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡ（ただし上記配列中（）
    内の塩基は前の塩基と置換可能であることを示す）、 および登録番号ＡＴＣＣ５３０３６で同定される微生物
    が保持している組換えプラスミドｐＧＭ３８のＤＮＡ挿
    入物であって、５’から３’の方向に以下に示すＤＮＡ
    配列を有するＤＮＡ挿入物 ＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣ
    ＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴ
    ＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣ
    ＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧ
    ＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡ
    ＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧ
    ＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧ
    ＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣ
    ＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣ
    ＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣ
    ＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴ
    ＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣ
    ＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡ
    ＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ
    （Ｇ）ＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧ
    ＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡ
    ＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧ
    ＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴ
    ＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡ
    ＧＣＣＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＣＣ
    ＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧＣＴＡ（Ｇ）ＡＣＴＣＡＧＣＴ
    ＴＧＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＡ
    ＴＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡ
    ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴ
    ＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡ
    ＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡ
    ＴＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴ
    ＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
    ＡＡＡ．（ただし上記配列中（）内の塩基は前の塩基と
    置換可能であることを示す）；からなる群より選択され
    た上記ＤＮＡ挿入物にハイブリダイズし、哺乳類の顆粒
    球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
    Ｆ）をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＧ
    Ｍ−ＣＳＦの産生方法。
  3. 【請求項３】 組換え哺乳類顆粒球・マクロファージ・
    コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 哺乳類がマウスまたはヒトである請求項
    ３記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドが下記のアミ
    ノ酸配列 IleIleValThrArgProTrpLysHisValGluAlaIleLysGluAlaLe
    uAsnLeuLeuAspAspMetProValThrLeuAsnGluGluValGluValV
    alSerAsnGluPheSerPheLysLysLeuThrCysValGlnThrArgLeu
    LysIlePheGluGlnGlyLeuArgGlyAsnPheThrLysLeuLysGlyAl
    aLeuAsnMetThrAlaSerTyrTyrGlnThrTyrCysProProThrProG
    luThrAspCysGluThrGlnValThrThrTyrAlaAspPheIleAspSer
    LeuLysThrPheLeuThrAspIleProPheGluCysLysLysProSerGl
    nLys を含むものである請求項３記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 １１６番目のグリシンアミノ酸残基がセ
    リンで置換された請求項３記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 顆粒球およびマクロファージのそれぞれ
    の前駆細胞を刺激有効量の顆粒球・マクロファージ刺激
    因子と接触させることから成る哺乳類の顆粒球およびマ
    クロファージの産生を刺激する方法。
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